EA031536B1 - Новые фрагменты антител, их композиции и способы применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области лечения рака. Предложен антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащий первый полипептид, содержащий химерную легкую цепь VL-CL-CL, и второй полипептид, содержащий химерную тяжелую цепь VH-CH1-CH1. Также предложен антигенсвязывающий фрагмент антитела, в котором первый полипептид содержит химерную легкую цепь VL-CL-CH1 и второй полипептид содержит химерную тяжелую цепь VH-CH1-CL. Заявленные фрагменты имеют увеличенный период полувыведения in vivo относительно фрагмента Fab, содержащего указанные вариабельные области легкой и тяжелой цепей. Также предложены выделенная нуклеиновая кислота и вектор, кодирующие указанные фрагменты антитела, композиция, содержащая две и более указанные нуклеиновые кислоты, продукт, содержащий указанные фрагменты антитела совместно с ингибиторами фактора роста гепатоцитов и его рецептора, и применение указанного вектора для лечения пациента, страдающего от опухоли и/или метастазов.

Description

Изобретение относится к области лечения рака. Предложен антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащий первый полипептид, содержащий химерную легкую цепь VL-CL-CL, и второй полипептид, содержащий химерную тяжелую цепь VH-CH1-CH1. Также предложен антигенсвязывающий фрагмент антитела, в котором первый полипептид содержит химерную легкую цепь VL-CL-CH1 и второй полипептид содержит химерную тяжелую цепь VH-CH1CL. Заявленные фрагменты имеют увеличенный период полувыведения in vivo относительно фрагмента Fab, содержащего указанные вариабельные области легкой и тяжелой цепей. Также предложены выделенная нуклеиновая кислота и вектор, кодирующие указанные фрагменты антитела, композиция, содержащая две и более указанные нуклеиновые кислоты, продукт, содержащий указанные фрагменты антитела совместно с ингибиторами фактора роста гепатоцитов и его рецептора, и применение указанного вектора для лечения пациента, страдающего от опухоли и/или метастазов.

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым фрагментам антител с улучшенной стабильностью в условиях in vivo.

Уровень техники

В направленной терапии, являющейся новым передовым подходом к лечению рака, используются фармакологические средства (лекарственные препараты или антитела), специфично блокирующие важнейшие генные продукты, которые необходимы для поддержания трансформированного фенотипа. В настоящее время направленная противоопухолевая терапия используется в клинической практике для лечения хронических миелолейкозов (ХМЛ), зависящих от активности молекулы тирозинкиназы ABL, лечения ряда разновидностей немелкоклеточной карциномы легких (НМКЛ) и карциномы толстой и прямой кишки (КРК), зависящих от активации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR/HER-1), а также для лечения BRAF-зависимых меланом.

Рецепторы, обладающие активностью тирозинкиназы (RTK), представляют интерес в качестве кандидатов для направленной терапии, поскольку они зачастую сверхактивированы в нескольких типах опухолей. Их можно ингибировать с помощью различных типов нацеленных молекул, например, антител, которые при взаимодействии с внеклеточной частью рецептора могут нарушать рецепториндуцированную передачу сигналов внутри клеток, и химически синтезированных малых молекул, которые нарушают каталитическую активность рецептора.

Среди различных RTKs все большее внимание в качестве одного из наиболее важных активируемых при раке онкогенов привлекает продукт протоонкогена c-met-рецептор фактора роста гепатоцитов (РФРГ/Met). Met контролирует генетическую программу, известную как инвазивный рост, которая включает промитогенные, проинвазивные и антиапоптотические сигналы. С помощью этих физиологических сигналов Met обеспечивает опухоли максимальную приспособляемость, тем самым помогая ей преодолеть селективные барьеры при прогрессировании рака. Кроме того, Met поддерживает рост опухоли благодаря его способности усиливать ангиогенез опухоли. В последние годы стало известно, что Met также ответственен за агрессивность опухолей, подвергаемых лечению с использованием противоангиогенных агентов, а также устойчивости опухолей к стандартной радиотерапии. Изменение гена МЕТ также может быть основной причиной трансформации, во всех тех случаях, в которых он подвергся генетическому отбору для длительного поддержания первичного трансформированного фенотипа.

Все перечисленные выше обнаруженные факты стимулировали разработку нескольких молекул, пригодных для ингибирования передачи сигналов с участием Met, включая конкурентные ингибиторы ФРГ, химические ингибиторы киназы Met, антитела к ФРГ и антитела к Met. До настоящего времени некоторые из этих молекул были испытаны только в исследовательских целях. На данный момент ведутся клинические исследования, в которых используются нейтрализующие антитела к ФРГ, антитела к Met и несколько малых молекул.

С нескольких точек зрения предпочтительными будут антитела к Met, которые способны ингибировать передачу сигналов с участием Met. Антитела являются высокоспецифичными, стабильными молекулами и благодаря их природной структуре обычно хорошо переносятся хозяином. В последние годы ряд усилий был сосредоточен на разработке терапевтических антител к Met. Тем не менее, было описано много неудачных попыток, поскольку большинство антител к Met функционируют как агонисты, имитируя действие ФРГ. Это явление обусловлено, главным образом, тем фактом, что ввиду своей двухвалентной структуры антитела могут стабилизировать димеры рецептора, обеспечивая трансфосфорилирование Met с последующей его активацией. В одном случае антитело-агонист к Met (5D5) было разработано и преобразовано в одновалентную форму (одноплечевое антитело-5D5), которая обладает терапевтическим потенциалом за счет конкурирования за связывание с ФРГ (1, 2). Эта молекула при использовании в комбинации с эрлотинибом (3) недавно вступила в клиническое исследование III фазы, направленное на лечение пациентов, страдающих разновидностью немелкоклеточной карциномы легких, которая характеризуется высоким уровнем экспрессии Met в опухоли.

Моноклональное антитело (мАт) DN30 представляет собой IgG2a мыши, направленный против внеклеточного фрагмента рецептора Met человека (4). Это антитело связывается с доменом IPT-4 внеклеточной области рецептора Met с величиной аффинности, находящейся в субнаномолярном диапазоне. Изначально, это антитело было охарактеризовано как частичный агонист Met, который способен стимулировать некоторые, но не все, из Met-опосредованных биологических ответов клеток. В дальнейшем было показано, что это антитело может выступать в качестве ингибитора роста опухоли и образования метастазов за счет механизма отщепления рецептора (5). Отщепление рецептора представляет собой физиологический клеточный механизм разрушения белка, который воздействует на различные факторы роста, цитокины, рецепторы и молекулы адгезии. Отщепление рецептора Met осуществляется в две стадии: сначала металлопротеаза, ADAM-10, отщепляет внеклеточный домен Met, распознавая определенную последовательность, локализованную непосредственно перед трансмембранной областью; затем оставшийся трансмембранный фрагмент становится субстратом для второй протеазы (γ-секретазы), которая отделяет часть, содержащую киназу, от мембраны и быстро направляет ее для деградации в протеасомы (6, 7). Усиление этого механизма, вызванное DN30, приводит к снижению количества рецепто

- 1 031536 ров Met, экспонированных на поверхности клеток. Одновременно с этим происходит высвобождение во внеклеточное пространство растворимого эктодомена-приманки. Последний конкурирует с интактным трансмембранным рецептором за связывание лиганда и ингибирует гомодимеризацию рецептора, образуя гетеродимерные комплексы с интактным Met. Все эти реакции существенно ухудшают Metопосредованную передачу сигналов и приводят к предотвращению последующего биологического действия.

Некоторое время назад авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что одновалентный фрагмент Fab моноклонального антитела к Met DN30 (Fab DN30) не имеет какой-либо агонистической активности и сохраняет способность индуцировать отщепление, что делает его эффективным ингибитором Met (8). Индукция отщепления Met под действием Fab DN30 зависит от селективного взаимодействия антитело-антиген, но не зависит от активации рецептора. Этот механизм действия, основанный на простом устранении Met с клеточной поверхности, придает Fab DN30 существенное преимущество по сравнению с другими ингибиторами, поскольку данный фрагмент может быть эффективным против всех форм активации Met, независимо от того, зависят они от ФРГ или нет, например, активации, индуцированной сверхэкспрессией, мутацией или амплификацией гена.

Несмотря на то что рекомбинантный фрагмент Fab DN30 является очень привлекательной молекулой для клинического применения, короткий период полувыведения фрагмента Fab из сыворотки крови, главным образом посредством почечного клиренса, серьезно ограничивает его использование для лечения пациентов.

В настоящее время наиболее обоснованной методикой улучшения фармакологических свойств фрагмента Fab является повышение его молекулярной массы путем конъюгации с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Пегилирование Fab является путем, который в большинстве случаев обеспечивает использование Fab в клинической практике. Ковалентное присоединение полимерных цепей к фрагменту антитела, полученному эффективным способом и без потери антигенсвязывающих свойств, не является очевидным приемом и требует больших усилий для его осуществления.

Другая методика, использованная для улучшения фармакологических свойств фрагмента Fab, раскрыта в ЕР-А-1718677. Данный способ, использованный для получения одноплечевой формы моноклонального антитела 5D5, рассмотренного выше, представляет собой получение с использованием рекомбинантных способов трех разных цепей антитела в одной и той же клетке: легкой цепи (VL-CL), тяжелой цепи (VH-CH1-CH2-CH3) и части Fc тяжелой цепи (CH2-CH3). Области CH2-CH3 не являются областями дикого типа: они содержат мутации, которые обеспечивают формирование специфичных трехмерных структур. В одном полипептиде область CH2-CH3 содержит последовательность, образующую выступ, в то время как в другом полипептиде область CH2-CH3 содержит последовательность, образующую полость, в которую может вставляться выступ (структура выступ-во-впадину). Наличие таких трехмерных структур обеспечивает предпочтительное образование гетеродимеров, в которых тяжелая цепь образует дисульфидные связи с фрагментом Fc, но не исключает полностью возможность образования гомодимеров (т.е. две тяжелые цепи связаны друг с другом, и два Fc связаны друг с другом). Обязательной является очистка, которая позволяет отделить нежелательные гомодимеры от целевых гетеродимеров. Таким образом, способ получения одноплечевого антитела, несмотря на его элегантность, является громоздким, поскольку он требует наличия дополнительных стадий в общем способе производства, что усложняет получение и уменьшает выход рекомбинантного антитела.

Следовательно, существует потребность в другом решении, которое позволило бы увеличить период полувыведения Fab из плазмы крови для терапевтического применения в условиях in vivo.

Сущность изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в обеспечении фрагмента антитела с улучшенной стабильностью в условиях in vivo.

В соответствии с настоящим изобретением описанная выше задача решена благодаря объекту изобретения, который также конкретно описан в последующей формуле изобретения, которая, как следует понимать, является неотъемлемой частью настоящего изобретения.

Вариант реализации настоящего изобретения обеспечивает фрагмент антитела, содержащий первый полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи и две константные области, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и две константные области, при этом две константные области цепей представляют собой константные области легкой цепи, и две константные области представляют собой константные области тяжелой цепи CH1, гибридизованные в различных комбинациях с вариабельными областями.

Другой вариант реализации настоящего изобретения относится к фрагменту антитела, определенному выше, который является более стабильным в условиях in vivo, чем молекула Fab, содержащая вариабельные области легкой и тяжелой цепей.

Еще один вариант реализации настоящего изобретения относится к фрагменту антитела, определенному выше, которое специфично связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (РФРГ/Met).

- 2 031536

Краткое описание чертежей

Настоящее изобретение будет далее описано более подробно с помощью исключительно иллюстративного и неограничивающего примера и со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых изображено следующее.

Фиг. 1: отщепление и ингибирование Met в Met-зависимых клетках, обработанных химерным фрагментом MvDN30 или мышиным Fab DN30. A: SNU-5 - линия клеток карциномы желудка человека; В: H1993-NC1 - линия клеток немелкоклеточной карциномы легких. Клетки инкубировали в течение 48 ч в бессывороточной среде с указанными концентрациями двух фрагментов антител, полученных из мАт DN30. Общие уровни Met определяли в клеточных экстрактах с помощью метода Вестерн-блоттинга с использованием антител к Met. Две полосы Met соответствуют полноразмерной (р190) и зрелой форме рецептора Met (p145 Met). Отщепление Met определяли в кондиционированной среде с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител к Met. Обе молекулы эффективно индуцируют отщепление и ингибирование Met.

Фиг. 2: количественное исследование роста Met-зависимых клеток, обработанных химерным фрагментом MvDN30 или мышиным Fab DN30. А: ЕВС-1 - линия клеток немелкоклеточной карциномы легких; В: Hs746T - линия клеток карциномы желудка человека. Клетки высевали в 96-луночные планшеты (1000/лунку) в среду с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ). Через 24 ч клетки обрабатывали увеличивающимися концентрациями антител и инкубировали еще 72 ч. Количество клеток оценивали с помощью люминесцентного метода определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Perkin Elmer). Каждая точка представляет собой среднее арифметическое трех значений; планки ошибок представляют стандартное отклонение среднего. Обе молекулы эффективно ингибируют рост Metзависимых клеток.

Фиг. 3: схематическое представление новых молекул, полученных из DN30. Верхняя панель: Химерный фрагмент Fab DN30 (MvDN30); средняя панель: фрагмент Fab с двойными константными областями, содержащий удвоенные константные области в тандеме (DCD-MvDN30.1); Нижняя панель: Fab с двойными константными областями, содержащий удвоенные константные области, взаимно переставленные местами (DCD-MvDN30.2). VH: вариабельная область тяжелой цепи DN30. VL: вариабельная область легкой цепи DN30. CH1: константная область 1, полученная из тяжелой цепи IgG1 человека. CL: константная область, полученная из легкой каппа-цепи человека. Стрептавидиновая метка (Strep-Tag®) и полигистидиновая метка (His): последовательности, которые были включены, чтобы обеспечить очистку белка и детектирование иммунологическими методами.

Фиг. 4: исследование новых молекул, полученных из DN-30. Указанные очищенные белки подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Гель окрашивали с использованием Gel Code blue (Pierce). Все молекулы имеют две полосы с ожидаемой молекулярной массой.

Фиг. 5: связывание молекул DCD-MvDN30 с Met. Исследование связывания MvDN30, DCDMvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 (жидкая фаза) с химерным белком Met-Fc (твердая фаза) проводили с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Связывание выявляли с помощью антител к метке Strep-Tag®. OD: оптическая плотность; AU: относительные единицы. Каждая точка представляет собой среднее арифметическое трех значений; планки ошибок представляют стандартное отклонение среднего. Новые молекулы связываются с Fc-Met с аналогичной высокой аффинностью.

Фиг. 6: агонистическая активность молекул DCD-MvDN30. Клетки А549 подвергали голоданию в течение 24 ч и затем стимулировали в течение 10 мин при 37°С, используя различные молекулы в указанных концентрациях. Активацию Met определяли с помощью иммунопреципитации с антителами к Met и последующим исследование методом Вестерн-блоттинга, используя антитела к Met, специфичные в отношении фосфорилированных остатков Tyr 1234/1235 Met, основных сайтов фосфорилирования (верхняя панель). Этот же блот повторно исследовали с использованием антител к Met (нижняя панель). Новые молекулы не вызывают существенной активации рецептора Met.

Фиг. 7: агонистическая активность молекул DCD-MvDN30. Клетки А549 инкубировали в бессывороточной среде в течение 24 ч и затем стимулировали в течение 10 мин при 37°С, используя различные молекулы в указанных концентрациях. Активацию AKT и ERK-1,2 определяли с помощью Вестернблоттинга, используя антитела к AKT или ERK, специфичные в отношении фосфорилированной формы. Этот же блот повторно исследовали с использованием антител к винкулину (нижняя панель), чтобы контролировать нагрузку белка. Новые молекулы не вызывают существенной активации Met-зависимой передачи сигналов.

Фиг. 8: отщепление и ингибирование Met в клетках, обработанных молекулами DCD-MvDN30. Клетки А549 инкубировали в течение 72 ч в бессывороточной среде с указанными молекулами (500 нМ). Общие уровни Met определяли в клеточных экстрактах с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител к Met. Две полосы Met соответствуют полноразмерной (р190) и зрелой форме (р145 Met) рецептора Met. Для контроля нагрузки белка фильтр исследовали с использованием неродственного белка (актин). Отщепление Met определяли с помощью Вестерн-блоттинга кондиционированной среды с использованием антител к Met. Новые молекулы эффективно индуцируют отщепление Met.

- 3 031536

Фиг. 9: ингибирование ФРГ -индуцированной активации Met под действием молекул DCD-MvDN30. Клетки А549 инкубировали в течение 24 ч в бессывороточной среде с добавлением указанных молекул (1000 нМ) и затем стимулировали в течение 10 мин ФРГ (100 нг/мл). Активацию Met определяли в общих клеточных лизатах с помощью Вестерн-блоттинга, используя антитела к Met, специфичные в отношении фосфорилированных остатков Tyr 1234/1235 Met, основного сайта фосфорилирования. Этот же блот повторно исследовали с использованием антител к Met. Активацию AKT и ERK-1,2 определяли с помощью Вестерн-блоттинга, используя антитела к фосфо-AKT или фосфо-ERK. Этот же блот повторно исследовали с использованием антител к AKT или ERK-1,2. Чтобы контролировать нагрузку белка фильтр исследовали с использованием антител к винкулину. Новые молекулы значительно ингибируют ФРГ-индуцированную активацию Met и Met-зависимую передачу сигналов.

Фиг. 10: субстратзависимый рост Met-зависимых клеток, обработанных DCD-MvDN30.1 или DCDMvDN30.2, или MvDN30. А, В, С, D линии клеток карциномы желудка человека; Е, F линии клеток немелкоклеточной карциномы легких. Клетки высевали в 96-луночные микропланшеты Costar® (1000/лунку) в среду с добавлением 5% ФСТ. Через 24 ч клетки обрабатывали возрастающими концентрациями различных молекул и инкубировали еще 72 часа. Количество клеток оценивали с помощью люминесцентного метода определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega). На графиках представлен процент живых клеток в сравнении с необработанным контролем. Каждая точка представляет собой среднее арифметическое трех значений. Новые молекулы эффективно ингибируют рост Metзависимых клеток.

Фиг. 11: субстратнезависимый рост клеток, обработанных DCD-MvDN30.1 или DCD-MvDN30.2, или MvDN30. Клетки А549 высевали в полутвердую среду (5% агароза) с добавлением или без ФРГ (50 нг/мл) в присутствии 1,5 мМ DCD-MvDN30.1 или DCD-MvDN30.2, или MvDN30. Через 21 день колонии окрашивали с использованием соли тетразолия. Количество колоний оценивали, подсчитывая число пикселей в области каждой лунки с использованием программного обеспечения MetaMorphOffline. Каждая точка представляет собой среднее арифметическое трех значений. Новые молекулы эффективно ингибируют ФРГ-зависимый субстратнезависимый рост клеток.

Фиг. 12: фармакокинетический профиль DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 и MvDN30 в условиях in vivo. Мышам с ослабленным иммунитетом вводили внутрибрюшинно (в/б) однократную дозу (100 мкг) DCD-MvDN30.1 или DCD-MvDN30.2, или MvDN30. Образцы периферической крови собирали в различные моменты времени. Концентрации терапевтических молекул в сыворотке крови измеряли с помощью ИФА. На графиках представлено количество циркулирующих молекул в зависимости от времени. Образцы исследовали в трех повторах, планки погрешностей представляют собой величины стандартного отклонения среднего.

Фиг. 13: нуклеотидная и аминокислотная последовательности для первого варианта реализации первого полипептида фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением. Последовательности соответствуют полипептиду, полученному из легкой цепи, VL-CL-CL. Области, определяющие комплементарность (CDR), подчеркнуты в обеих нуклеотидной и аминокислотной последовательностях.

Фиг. 14: нуклеотидная и аминокислотная последовательности для первого варианта реализации второго полипептида фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением. Последовательности соответствуют полипептиду, полученному из тяжелой цепи, VH-CH1-CH1-метки. Области CDR подчеркнуты в обеих нуклеотидной и аминокислотной последовательностях. Маркерные последовательности Strep-Tag® и полигистидина выделены прописными буквами курсивом.

Фиг. 15: нуклеотидная и аминокислотная последовательности для второго варианта реализации первого полипептида фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением. Последовательности соответствуют полипептиду, полученному из легкой цепи, VL-CL-CH 1-метки. Области CDR подчеркнуты в обеих нуклеотидной и аминокислотной последовательностях. Маркерные последовательности Strep-Tag® и полигистидина выделены прописными буквами курсивом.

Фиг. 16: нуклеотидная и аминокислотная последовательности для второго варианта реализации второго полипептида фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением. Последовательности соответствуют полипептиду, полученному из тяжелой цепи, VH-CH1-CL. Области CDR подчеркнуты в обеих нуклеотидной и аминокислотной последовательностях.

Фиг. 17: нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельной области легкой цепи DN30. Области CDR подчеркнуты в обеих нуклеотидной и аминокислотной последовательностях.

Фиг. 18: нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельной области тяжелой цепи DN30. Области CDR подчеркнуты в обеих нуклеотидной и аминокислотной последовательностях.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже с помощью неограничивающего примера, со ссылкой на фрагменты антител, которые способны специфично связываться с рецептором фактора роста гепатоцитов.

Следует понимать, что объем настоящего изобретения не ограничивается указанным антигеноммишенью, поскольку фрагменты антител, описанные в настоящем изобретении, могут характеризоваться

- 4 031536 специфичным связыванием с другими антигенами-мишенями.

Многочисленные конкретные элементы в последующем описании приведены для того, чтобы обеспечить исчерпывающее понимание вариантов реализации. Варианты реализации могут быть применены на практике без одного или нескольких конкретных элементов или с помощью других способов, компонентов, материалов и т.д. В других случаях, хорошо известные структуры, материалы или операции не приведены или не описаны подробно, чтобы не затруднять понимание аспектов указанных вариантов реализации.

Ссылка в тексте данного описания на один вариант реализации или вариант реализации означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с указанным вариантом реализации, включены по меньшей мере в один вариант реализации. Таким образом, фразы в одном варианте или в варианте реализации, присутствующие в различных местах текста данного описания, не обязательно все относятся к одному варианту реализации изобретения. Также конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом в одном или более вариантов реализации.

Заголовки, представленные в настоящем изобретении, предназначены исключительно для удобства понимания и не играют роли в интерпретации объема или смысла вариантов реализации настоящего изобретения.

Антитела представляют собой сложные тетрамеры, в которых как тяжелые, так и легкие цепи состоят из нескольких областей Ig, фолдинг каждой из которых не зависит друг от друга. В самом начале эры антител было показано, что с помощью ферментативной обработки из антител могут быть получены фрагменты, которые сохраняют первоначальную структуру и антигенсвязывающие свойства.

Впоследствии с помощью способов белковой инженерии было получено множество различных модифицированных фрагментов антител. В соответствии со структурой молекулы каждый новый фрагмент антитела характеризуется конкретными признаками (т.е. повышенной авидностью, поливалентностью, полиспецифичностью, отсутствием способности вызывать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), химерностью и т.д.).

Тем не менее, ни в одном из предыдущих исследований не был изучен вопрос, касающийся почечного клиренса, с целью увеличения периода полувыведения фрагментов антител в условиях in vivo.

В этой связи авторы настоящего изобретения разработали рекомбинантный фрагмент антитела, содержащий первый полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи и две константные области, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и две константные области, в котором две константные области цепей представляют собой константные области легкой цепи и две константные области представляют собой константные области тяжелой цепи CH1, гибридизованные в различных комбинациях с вариабельными областями.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фрагмент антитела, раскрытый в настоящем изобретении, более стабилен в условиях in vivo, чем молекула Fab, содержащая указанные вариабельные области легкой и тяжелой цепей.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фрагмент антитела имеет более длительный период полувыведения в условиях in vivo при введении пациенту-человеку, чем молекула Fab, содержащая указанные вариабельные области легкой и тяжелой цепей, вследствие сниженного почечного клиренса.

Такие фрагменты антител были названы фрагменты Fab с двойными константными областями (DCD-Fabs).

Согласно предпочтительному варианту реализации в настоящем изобретении предложен фрагмент антитела, содержащий первый полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи и две константные области, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и две константные области, в котором две константные области представляют собой константные области легкой цепи человека и две константные области представляют собой константные области тяжелой цепи человека CH1, гибридизованные в различных комбинациях с вариабельными областями, при этом фрагмент антитела является более стабильным в условиях in vivo, чем молекула Fab, содержащая указанные вариабельные области легкой и тяжелой цепей, и специфично связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (РФРГ/Met).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вариабельная область легкой цепи гибридизована на своем С-конце с одной константной областью легкой цепи, которая гибридизована на своем С-конце с одной константной областью легкой цепи.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вариабельная область легкой цепи гибридизована на своем С-конце с константной областью легкой цепи, которая гибридизована на своем С-конце с одной константной областью тяжелой цепи CH1.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вариабельная область тяжелой цепи гибридизована на своем С-конце с одной константной областью тяжелой цепи CH1, которая гибридизована на своем С-конце с одной константной областью тяжелой цепи CH1.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вариабельная область тяжелой це

- 5 031536 пи гибридизована на своем С-конце с константной областью тяжелой цепи CH1, которая гибридизована на своем С-конце с константной областью легкой цепи.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения константные области, содержащиеся в первом и втором полипептидах, в том случае, если они связаны друг с другом в составе указанного фрагмента антитела, способны образовывать дисульфидные мостики.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации в настоящем изобретении предложены фрагменты антител, раскрытые выше, в которых антигенная специфичность обеспечивается за счет использования, в качестве вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, вариабельных областей легкой и тяжелой цепей DN30 или гуманизированных вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, содержащих области, определяющие комплементарность (CDR), из моноклонального антитела DN30. Моноклональное антитело DN30 было раскрыто в международной заявке на патент \νϋ-Λ-2007/090807.

Фрагмент антитела согласно настоящему изобретению в целом представляет собой терапевтическое антитело. Например, антитело согласно настоящему изобретению может представлять собой антагонистическое антитело, блокирующее антитело или нейтрализующее антитело.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложены способы лечения или задержки прогрессирования заболевания путем введения субъекту, имеющему указанное заболевание, эффективного количества фрагмента антитела согласно настоящему изобретению, которое эффективно лечит или задерживает прогрессирование указанного заболевания.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанное заболевание представляет собой опухоль или метастазы опухоли.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанное заболевание связано с нарушением регуляции передачи сигналов с участием рецептора фактора роста гепатоцитов и/или его активации.

Фрагмент антитела согласно настоящему изобретению является подходящим для лечения или предупреждения патологических состояний, связанных с нарушениями передачи сигналов с участием ФРГ/РФРГ.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антагонист РФРГ.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фрагмент антитела содержит антигенсвязывающие последовательности от донора, не являющегося человеком, привитые к не являющейся человеческой гетерологичной последовательности, человеческой гетерологичной последовательности или гуманизированной гетерологичной последовательности (например, последовательности каркаса и/или константных областей). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения донор, не относящийся к человеку, представляет собой мышь.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие последовательности содержат все последовательности областей CDR и/или вариабельных областей мышиного антитела к РФРГ.

Согласно одному предпочтительному варианту реализации вариабельная область легкой цепи мыши гибридизована на своем С-конце с одной константной областью легкой каппа-цепи человека, которая гибридизована на своем С-конце с одной константной областью легкой каппа-цепи человека. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вариабельная область легкой цепи мыши гибридизована на своем С-конце с константной областью легкой каппа-цепи человека, которая гибридизована на своем С-конце с одной константной областью тяжелой цепи CH1 человеческого IgG1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вариабельная область тяжелой цепи мыши гибридизована на своем С-конце с одной константной областью тяжелой цепи CH1 человеческого IgG1, которая гибридизована на своем С-конце с одной константной областью тяжелой цепи CH1 человеческого IgG1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вариабельная область тяжелой цепи мыши гибридизована на своем С-конце с константной областью тяжелой цепи CH1 человеческого IgG1, которая гибридизована на своем С-конце с константной областью легкой каппа-цепи человека.

Согласно одному предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения фрагмент антитела согласно настоящему изобретению содержит первый полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR из мышиного антитела к РФРГ, более предпочтительно CDR из DN30, и две константные области, которые представляют собой: две константные области легкой цепи или одну константную область легкой цепи и одну константную область тяжелой цепи CH1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения две константные области представляют собой константные области антитела человека.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фрагмент антитела согласно настоящему изобретению содержит второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR из мышиного антитела к РФРГ, более предпочтительно CDR из DN30, и две константные области, которые представляют собой: две константные области тяжелой цепи CH1 или одну константную область тяжелой цепи CH1 и одну константную область легкой цепи. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения две константные области представляют

- 6 031536 собой константные области антитела человека.

В настоящем изобретении предложен, в наиболее предпочтительном варианте реализации, фрагмент гуманизированного антитела, который связывается с РФРГ человека, причем указанное антитело эффективно ингибирует активность ФРГ/РФРГ в условиях in vivo и содержит: i) три последовательности CDR вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела DN30 (SEQ ID NO: 19, 20, 21) в вариабельной области тяжелой цепи (VH) и по существу консенсусную последовательность человека, например, по существу остатки консенсусного каркаса человека (FR) из подгруппы тяжелых цепей человека и ii) три последовательности CDR вариабельной области легкой цепи из моноклонального антитела DN30 (SEQ ID NO: 25, 26, 27) в вариабельной области легкой цепи (VL) и по существу остатки консенсусного каркаса человека (FR) из подгруппы I легких каппа-цепей человека (VkI).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фрагмент антитела согласно настоящему изобретению содержит первый полипептид, содержащий в качестве вариабельной области легкой цепи последовательность вариабельной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 12 (вариабельная область легкой цепи DN30), и второй полипептид, содержащий в качестве вариабельной области тяжелой цепи последовательность вариабельной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 4 (вариабельная область тяжелой цепи DN30).

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложено применение фрагмента антитела согласно настоящему изобретению (например, фрагмента антитела-антагониста РФРГ согласно настоящему изобретению) в получении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль, пролиферативное клеточное заболевание.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения патологического состояния, связанного с нарушением регуляции активации РФРГ у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества фрагмента антитела-антагониста РФРГ согласно настоящему изобретению, с обеспечением тем самым лечения указанного состояния.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей РФРГ, включающий приведение указанной клетки в контакт с фрагментом антителаантагониста РФРГ согласно настоящему изобретению, с обеспечением тем самым ингибирования роста указанной клетки.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ терапевтического лечения млекопитающего, имеющего раковую опухоль, содержащую клетку, экспрессирующую РФРГ, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества фрагмента антителаантагониста РФРГ согласно настоящему изобретению, с обеспечением тем самым эффективного лечения указанного млекопитающего.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения или предотвращения пролиферативного клеточного заболевания, связанного с повышенной экспрессией или активностью РФРГ, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества фрагмента антитела-антагониста РФРГ согласно настоящему изобретению, с обеспечением тем самым эффективного лечения или предотвращения указанного пролиферативного клеточного заболевания.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ терапевтического лечения опухоли у млекопитающего, в случае если рост указанной опухоли, по меньшей мере, частично зависит от стимулирующего рост действия РФРГ, включающий приведение клетки опухоли в контакт с эффективным количеством фрагмента антитела-антагониста РФРГ согласно настоящему изобретению, с обеспечением тем самым эффективного лечения указанной опухоли. Указанная опухолевая клетка может быть выбрана из клетки рака молочной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака легких, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака шейки матки, рака центральной нервной системы, рака почек, гепатоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, рака желудка, рака головы и шеи, папиллярной карциномы (например, щитовидной железы), меланомы, лимфомы, миеломы, глиомы/глиобластомы (например, анапластической астроцитомы, глиобластомы, анапластической олигодендроглиомы, анапластической олигодендроастроцитомы), лейкоза. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения клетка, которая является мишенью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой гиперпролиферативную и/или гиперпластическую клетку. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения клетка, которая является мишенью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой диспластическую клетку. Согласно другому варианту реализации клетка, которая является мишенью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой клетку метастазы. Согласно другому варианту реализации клетка, которая является мишенью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой клетку, экспрессирующую РФРГ, которая принадлежит к микросреде, поддерживающей опухоль и/или метастазы.

Способы согласно настоящему изобретению могут также включать дополнительные этапы лечения. Например, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, способ дополнительно включает стадию, на которой опухолевую клетку-мишень и/или ткань подвергают воздействию лучевой терапии или химиотерапевтического агента. В другом варианте реализации настоящего изобретения опухолевую клетку-мишень и/или ткань обрабатывают, в дополнение к фрагменту антитела-антагониста со

- 7 031536 гласно настоящему изобретению, ингибиторами ФРГ (т.е. антителами к ФРГ) или другими соединениями, направленными против РФРГ (т.е. низкомолекулярными ингибиторами киназы). В другом варианте реализации настоящего изобретения опухолевую клетку-мишень и/или ткань обрабатывают, в дополнение к фрагменту антитела-антагониста согласно настоящему изобретению, молекулами, которые специфично воздействуют на другие мишени, которые важны для поддержания трансформированного фенотипа (например, молекулы, направленные против EGFR).

Активация РФРГ является важным биологическим процессом; отмена его регулирования приводит к развитию многочисленных патологических состояний. Соответственно, в одном варианте реализации способов согласно настоящему изобретению клетка-мишень (например, раковая клетка) представляет собой клетку, в которой активация РФРГ усилена, по сравнению с нормальной клеткой аналогичного тканевого происхождения. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ согласно настоящему изобретению приводит к гибели или задержке роста клетки-мишени. Например, контакт с фрагментом антитела-антагониста согласно настоящему изобретению может привести к утрате способности клетки передавать сигналы с участием РФРГ, что приводит к гибели клеток или задержке роста клеток.

Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгатам или конъюгатам антителолекарственное средство (ADC), содержащим фрагмент антитела, конъюгированный с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, лекарственный препарат, ингибирующий рост агент, токсин (например, обладающий ферментативной активностью токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).

Использование конъюгатов антитело-лекарственное средство для локальной доставки цитотоксических или цитостатических агентов, например лекарственных препаратов для уничтожения или ингибирования роста опухолевых клеток при лечении рака, обеспечивает направленную доставку фрагмента лекарственного средства к опухолям и их накопление в опухолевых клетках, в тех случаях, когда системное введение таких неконъюгированных лекарственных препаратов может привести к неприемлемым уровням токсичности в отношении нормальных клеток, а также клеток опухоли, которые пытаются устранить.

Терапевтические составы, содержащие фрагмент антитела согласно настоящему изобретению, получают для хранения в виде водных растворов, лиофилизированных или высушенных другими способами составов путем смешивания фрагмента антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы; антиоксиданты; консерванты; низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты; моносахариды, дисахариды и другие углеводы; хелатирующие агенты; сахара; солеобразующие противоионы; комплексы металлов и/или неионные поверхностно-активные вещества.

Состав согласно настоящему изобретению может содержать также более одного активного соединения, необходимого для лечения конкретного показания, предпочтительно соединения, обладающие комплементарными видами активности, которые не оказывают нежелательного влияния друг на друга. Такие молекулы могут быть надлежащим образом добавлены в комбинации в количествах, которые эффективны в соответствии с предполагаемым назначением.

Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, полученные с помощью методик, раскрытых в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Составы, которые предназначены для использования в условиях in vivo, должны быть стерильными.

Могут быть получены препараты с пролонгированным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с пролонгированным высвобождением включают полупроницаемые носители из твердых гидрофобных полимеров, содержащих фрагмент антитела согласно настоящему изобретению, в которых носители находятся в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул.

Фрагмент антитела согласно настоящему изобретению можно применять для терапевтических методов в условиях in vitro, ex vivo и in vivo. В настоящем изобретении предложены различные способы, основанные на использовании фрагментов антител, свойства которых обеспечивают преимущества по сравнению с обычными одновалентными антителами.

В настоящем изобретении предложены фрагменты антител, которые можно использовать для различных целей, например, терапевтических, профилактических и диагностических целей.

Фрагменты антител согласно настоящему изобретению могут быть использованы по отдельности или в комбинации с другими композициями в терапии. Например, фрагмент антитела согласно настоящему изобретению можно вводить совместно с другим антителом, химиотерапевтическим агентом(ами) (включая комбинации химиотерапевтических агентов), другим цитотоксическим агентом(ами), антиангиогенным агентом(ами), цитокинами и/или ингибирующим рост агентом(ами). Такие комбинированные

- 8 031536 виды терапии, отмеченные выше, включают комбинированное введение (когда два или более агентов включены в один и тот же или в отдельные составы) и раздельное введение, в случае которого введение антитела согласно настоящему изобретению может происходить до и/или после применения вспомогательной терапии или нескольких видов такой терапии.

Фрагмент антитела согласно настоящему изобретению (и агент для вспомогательной терапии) вводят любыми подходящими способами, включая парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочной и интраназальный и, при необходимости местного лечения, внутриочаговый путь введения. Фрагмент антитела соответствующим образом вводят путем импульсной инфузии, в частности, при уменьшении доз антитела.

Дозирование может быть осуществлено любым подходящим путем, например, с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является введение краткосрочным или хроническим. Фрагмент антитела согласно настоящему изобретению также может быть доставлен с помощью переноса гена посредством вирусных векторов (например, лентивирусных векторов), вводимых локально или системно.

Фрагмент антитела согласно настоящему изобретению будет приготовлен, дозирован и введен способом, который соответствует требованиям надлежащей медицинской практики. Факторы, которые необходимо учитывать применительно к введению указанного фрагмента, включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, вид конкретного млекопитающего, подлежащего лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину заболевания, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело, возможно, может быть приготовлено с добавлением одного или более агентов, используемых в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого заболевания, либо может быть приготовлено без них. Эффективное количество других агентов зависит от количества антител согласно настоящему изобретению, присутствующих в составе, типа заболевания или лечения и других факторов, описанных выше. Такие агенты, как правило, используют в тех же дозах и вводят с помощью способов введения, описанных выше в настоящем изобретении, или в количестве приблизительно от 1 до 99% от использованных ранее дозировок.

Для предотвращения или лечения заболевания соответствующая дозировка фрагмента антитела согласно настоящему изобретению (при использовании отдельно или в комбинации с другими агентами, такими как химиотерапевтические агенты) будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, степени тяжести и течения заболевания, введения фрагмента антитела для профилактических или терапевтических целей, предыдущей терапии, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также от решения лечащего врача. Фрагмент антитела соответствующим образом вводят пациенту в виде однократной дозы или многократных доз. В зависимости от типа и степени тяжести заболевания приблизительно от 1 до 15 мг/кг антитела составляют начальную потенциальную дозировку для введения пациенту, независимо от того, будет она доставлена, например, с помощью одного или более отдельных введений или путем непрерывной инфузии. Примерная суточная доза может варьироваться от приблизительно 1 до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. В случае многократных введений в течение нескольких дней или более длительного периода, в зависимости от состояния, лечение продолжают до достижения желаемой степени подавления симптомов заболевания. Примерная дозировка фрагмента антитела может находиться в диапазоне от приблизительно 0,05 до приблизительно 10 мг/кг. Следовательно, пациенту может быть введена одна или более доз равных приблизительно 0,5, 2,0, 4,0 или 10 мг/кг (или любая их комбинация). Указанные дозы могут быть введены с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, что пациент получает от приблизительно двух до приблизительно двадцати доз, например, приблизительно шесть доз антитела). Пациенту может быть введена более высокая начальная нагрузочная доза, с последующим введением одной или нескольких более низких доз. Примерная схема дозирования включает введение начальной нагрузочной дозы приблизительно 4 мг/кг, с последующим введением еженедельной поддерживающей дозы антитела 2 мг/кг. Однако другие схемы дозирования также пригодны для использования. Прогресс этой терапии легко контролировать с помощью обычных методик и подходов.

Результаты

Получение химерного фрагмента Fab DN30 и характеристика его биохимических и биологических свойств.

Как и в случае других моноклональных антител с терапевтическим потенциалом, DN30 было выработано у мышей. Следовательно, его непосредственное использование у человека для терапевтических целей невозможно, поскольку мышиная молекула может распознаваться антителами человека к антителам мыши (НАМА), что вызывает опосредованный иммунной системой клиренс активности антитела. Замена константных областей мышиного антитела последовательностями, полученными из человеческих иммуноглобулинов (химеризация антитела), достаточно сильно уменьшает ответ НАМА. В настоящее время в клинической практике используются химерные моноклональные антитела и фрагменты Fab. С помощью классических методов молекулярной биологии авторы настоящего изобретения замещали константные области тяжелой и легкой цепей Fab DN30 константными областями, полученными из человеческих иммуноглобулинов: константная область легкой цепи была замещена константной областью лег

- 9 031536 кой каппа-цепи человека, которая является наиболее распространенной в природных антителах человека, тогда как константная область тяжелой цепи CH1 была замещена гомологичной областью, полученной из человеческого IgG1. Эта комбинация является эффективной: химеризованный Fab DN30 (MvDN30) связывается с Met с высокой аффинностью, индуцирует отщепление Met и ингибирует пролиферацию Met-зависимых клеток, что перекрывает свойства соответствующей мышиной молекулы (фиг. 1 и 2).

Дизайн молекулы Fab с двойными константными областями.

Используя последовательность MvDN30 в качестве матрицы, авторы настоящего изобретения удвоили константные области в каждой из легкой и тяжелой цепей (фрагмент Fab, содержащий двойные константные области). Новая модифицированная молекула имеет предсказанную молекулярную массу 75 кДа. Авторы настоящего изобретения получили две разные молекулы DCD-Fabs. В первой молекуле константные области человека были удвоены в тандеме, с получением тем самым химерной тяжелой цепи VH-CH1-CH1 и химерной легкой цепи VL-CL-CL. Во второй молекуле концевые области были взаимно переставлены местами, с получением тем самым химерной тяжелой цепи VH-CH1-CL и химерной легкой цепи VL-CL-CH1 (фиг. 3). Соответствующие димерные рекомбинантные молекулы были названы DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2. кДНК, кодирующие эти новые молекулы, были клонированы в плазмиды экспрессии и затем экспрессированы в эукариотических клетках. Белок очищали от надосадочной культуральной жидкости с помощью метки Strep-Tag®, которая была вставлена на С-конце последовательности. На фиг. 4 приведены результаты разделения очищенных рекомбинантных молекул, имеющих правильную молекулярную массу, методом электрофореза в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях.

DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 связываются с Met с высокой аффинностью.

Очищенные молекулы DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 характеризовали в отношении их способности связываться с рецептором Met. С этой целью авторы настоящего изобретения провели количественные исследования методом ИФА с использованием эктодомена Met в твердой фазе и MvDN30, DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 в жидкой фазе. Связывание выявляли с помощью антител к StrepTag® (фиг. 5). Результаты этого исследования показали, что три одновалентные молекулы, полученные из DN30, связываются с Met с сопоставимыми величинами аффинности (MvDN30, K_d = 0,141±0,03 нМ; DCD-MvDN30.1, K_d = 0,133±0,02 нМ; DCD-MvDN30.2, K_d = 0,130±0,03 нМ).

DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 не индуцируют фосфорилирование Met.

Авторы настоящего изобретения исследовали способность новых молекул, полученных из DN30, действовать в качестве агонистов Met, используя количественное исследование степени фосфорилирования Met. Степень фосфорилирования исследовали с помощью линии клеток карциномы легких человека А459, которая представляет собой стандартную систему для определения активации Met в ответ на острую стимуляцию рецептора его лигандом. Фактически, клетки А549 экспрессируют физиологические уровни Met, который является неактивным в исходных условиях, но может быть активирован под действием ФРГ или молекулы-миметика лиганда (4, 10). Клетки стимулировали в течение 15 мин, используя увеличивающиеся количества MvDN30, DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2. Клетки также стимулировали ФРГ и мАт DN-30 в качестве положительных контролей. Активацию Met определяли с помощью иммуноблоттинга, используя антитела к фосфо-Met. Как показано на фиг. 6, новые молекулы не обладают какой-либо существенной агонистической активностью. Влияние фрагмента DCD-MvDN30.1, который не проявлял агонистической активности, было неотличимо от влияния MvDN30. Фрагмент DCDMvDN30.2 сохранил минимальную остаточную агонистическую активность, величина которой была пренебрежимо мала по сравнению с таковой для мАт DN30 или ФРГ. Авторы настоящего изобретения также изучили активацию молекул, действующих в качестве эффекторов нисходящих путей передачи сигнала с участием Met. В то время как стимуляция ФРГ индуцировала активацию обоих типов киназы, регулируемой внеклеточными сигналами, 1 и 2 (ERK-1 и ERK-2) и AKT/протеинкиназу В (AKT), DCDMvDN30.1 и DCD-MvDN30.2, аналогично MvDN30, не влияли на статус фосфорилирования этих переносчиков сигналов (фиг. 7).

DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 индуцируют отщепление Met.

Авторы настоящего изобретения также исследовали, сохраняют ли новые молекулы, полученные из MvDN30, способность усиливать отщепление рецептора и подавлять его активность. Клетки А549 инкубировали с DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 и MvDN30. Через 48 ч присутствие эктодомена Met в кондиционированной среде исследовали с помощью иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител, направленных против внеклеточной части Met. Общие клеточные уровни Met также определяли в клеточных лизатах с использованием этого же антитела. Результаты этого исследования показали, что DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 эффективно индуцировали отщепление Met и усиливали подавление активности Met, что привело к высвобождению растворимого эктодомена Met в межклеточное пространство и снижению уровня Met в клетке (фиг. 8). Следовательно, новые молекулы, полученные из MvDN30, аналогично

MvDN30, достигали полного разделения антагонистических и агонистических свойств, характерных для исходного мАт DN-30.

DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 ингибируют ФРГ-индуцированное фосфорилирование Met и

- 10 031536 нисходящую передачу сигналов.

Авторы настоящего изобретения изучили способность DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 ингибировать ФРГ-индуцированное фосфорилирование Met и нисходящую передачу сигналов. Клетки А549 инкубировали с DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 и MvDN30 в течение 24 ч и затем стимулировали ФРГ в течение 15 мин. Активацию Met определяли с помощью иммуноблоттинга, используя антитела к фосфо-Met. Как показано на фиг. 9, две модифицированные молекулы, аналогично MvDN30, эффективно подавляли активность рецептора Met и существенно нарушали уровень его фосфорилирования. Это привело к ингибированию активации AKT и ERK-1, 2 (фиг. 9).

DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 ингибируют МЕТ-зависимый субстратзависимый рост клеток.

Субстратзависимый рост может быть нарушен ингибитором Met только в клетках, которые зависят от пути передачи сигналов с участием Met для пролиферации/выживания, в так называемых МЕТзависимых клетках. Авторы настоящего изобретения исследовали полную панель МЕТ-зависимых опухолевых клеток (GTL-16, SNU-5, Hs746T, MKN-45 -линии клеток карциномы желудка человека и H1993, ЕВС-1 - линии клеток карциномы легких человека). Клетки в фазе экспоненциального роста инкубировали с увеличивающимися концентрациями DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2. MvDN30 включили в исследование в качестве положительного контроля. Через 72 часа рост клеток определяли с использованием люминесцентного метода исследования концентрации АТФ. Обе молекулы, полученные из MvDN30, ингибировали рост всех МЕТ-зависимых линий клеток дозазависимым образом (фиг. 10). Ингибиторные свойств двух молекул DCD были сопоставимы с таковыми MvDN30 во всех испытанных линиях клеток.

DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 ингибируют субстратнезависимый рост клеток.

Авторы настоящего изобретения исследовали способность DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 ингибировать субстратнезависимый рост клеток линии А549. Клетки высевали в полутвердую среду, инкубировали в присутствии или без ФРГ и обрабатывали однократной дозой DCD-MvDN30.1, DCDMvDN30.2 и MvDN30. Через две недели колонии клеток окрашивали и подсчитывали. Согласно результатам этого исследования DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 также подавляли ФРГ-зависимое образование колоний способом, который был аналогичен таковому для MvDN30 (фиг. 11).

DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 проявляют улучшенный фармакокинетический профиль в условиях in vivo по сравнению с MvDN30.

Авторы настоящего изобретения исследовали фармакокинетические свойства DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 в сравнении с MvDN30. Однократную дозу указанных выше молекул вводили мышам с ослабленным иммунитетом путем внутрибрюшинной инъекции. В различные моменты времени после введения молекул у мышей отбирали образцы периферической крови. Циркулирующие концентрации исследуемых молекул определяли методом ИФА, который проводили на образцах сыворотки крови. DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 достигали более высоких циркулирующих уровней по сравнению с MvDN30. Более того, обе молекулы имели увеличенный период полувыведения и более длительное время оставались в кровотоке, сохраняя при этом биологическую активность в течение большего промежутка времени. Клиренс DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 существенно улучшился по сравнению с MvDN30 (снижение клиренса по сравнению с MVDN30: в 9,6 и 13,7 раза для DCD-MvDN30.1 и DCDMvDN30.2, соответственно) (фиг. 12 и таблицу).

Фармакокинетические параметры различных молекул, полученных из DN30

	Tl/2	CL (мл/ч)	Vss (мл)	Стах (нг/мл)	Tmax (ч)	AUCtot (нг/мл)ч	kel (1/ч)
MVDN30	8,41	4,36	11,96	7595	0,5	22933	0,082
DCD- MvDN30.1	10,53	0,45	5,77	24130	4	220188	0,066
DCD- MvDN30.2	10,27	0,32	4,36	24952	4	314667	0,068

T1/2: период полувыведения; CL: клиренс; Vss: объем распределения; Cmax: максимальная концентрация молекулы; Tmax: время до достижения Cmax; AUCtot: площадь под кривой концентрация-время; Kel: константа выведения.

Материалы и методы

Культуры клеток.

Линию клеток карциномы легких человека ЕВС-1 и линию клеток карциномы желудка MKN-45 получили из японской коллекции исследовательских биоресурсов (Осака, Япония). Клетки карциномы желудка человека GTL-16 получали из клеток MKN-45 в соответствии с описанным способом (11). Все другие клеточные линии были получены от партнерства ATCC-LGC Standards (Sesto San Giovanni, Италия). Все клеточные линии поддерживали в RPMI, за исключением Hs746T, которую поддерживали в DMEM, и SNU-5, которую поддерживали в IMDM. Клеточные среды дополняли 10% (20% для SNU-5) фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 2 мМ глутамина (среды, сыворотка и глутамин были получены от Sigma Life

- 11 031536

Science, Сент-Луис, Миссури, США).

Белковая инженерия.

DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 состоят из тяжелой цепи и легкой цепи.

Тяжелая цепь DCD-MvDN30.1 (SEQ ID NO: 1 и 2) соответствует области VH фрагмента Fab DN30 дикого типа (2; SEQ ID NO: 3 и 4), гибридизованной с областью CH1 человеческого иммуноглобулина G1, две копии которой расположены тандемно (SEQ ID NO: 5 и 6). Метка Strep-Tag® (ST, SEQ ID NO: 7) и полигистидиновая метка (НТ, SEQ ID NO: 8.) были добавлены на С-конце, чтобы облегчить очистку и детектирование. Общая структура соответствует (от N-конца к С-концу): VH-CH1-CH1-ST-HT. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности тяжелой цепи DCD-MvDN30.1 представлены на фиг. 14А и В соответственно.

Легкая цепь DCD-MvDN30.1 (SEQ ID NO: 9 и 10) соответствует области VL фрагмента Fab DN30 дикого типа (SEQ ID NO: 11 и 12), гибридизованной с областью CL каппа-цепи человеческого иммуноглобулина (SEQ ID NO: 13 и 14), две копии которой расположены в тандеме. Общая структура соответствует (от N-конца к С-концу): VL-CL-CL. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности легкой цепи DCD-MvDN30.1 представлены на фиг. 13А и В соответственно.

Тяжелая цепь DCD-MvDN30.2 (SEQ ID NO: 15 и 16) соответствует области VH фрагмента Fab DN30 дикого типа (SEQ ID NO: 3 и 4), гибридизованной с областью CH1 человеческого иммуноглобулина G1 (SEQ ID NO: 5 и 6) и областью CL каппа-цепи человеческого иммуноглобулина (SEQ ID NO: 13 и 14). Общая структура соответствует (от N-конца к С-концу): VH-CH1-CL. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности тяжелой цепи DCD-MvDN30.2 приведены на фиг. 16А и В соответственно.

Легкая цепь DCD-MvDN30.2 (SEQ ID NO: 17 и 18) соответствует области VL фрагмента Fab DN30 дикого типа (SEQ ID NO: 11 и 12), гибридизованной с областью CL каппа-цепи человеческого иммуноглобулина (SEQ ID NO: 13 и 14) и CH1 человеческого иммуноглобулина G1 (SEQ ID NO: 5 и 6), а также с меткой Strep-Tag® (ST, SEQ ID NO: 7) и полигистидиновой меткой (НТ, SEQ ID NO: NO: 8). Общая структура соответствует (от N-конца к С-концу): VL-CL-CH1-ST-HT. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности легкой цепи DCD-MvDN30.2 приведены на фиг. 15А и В соответственно.

кДНК, кодирующие DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2, синтезировали химическим способом с помощью службы GeneArt® (Life Technologies, Пайсли, Великобритания). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей Fab DN30 приведены в фиг. 17 и 18 соответственно. Области CDR подчеркнуты в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях, в которых CDR вариабельной области тяжелой цепи имеют аминокислотные и нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 19-24, и CDR вариабельной области легкой цепи имеют аминокислотные и нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 25-30.

Все конструкции синтезировали с включением сайта рестрикции BamH1 на 5'-конце и сайта Not1 на 3'-конце. Фрагменты BamH1-Not1 субклонировали в вектор экспрессии pUPEX (U-Protein Express, Утрехт, Нидерланды). Для выполнения среднемасштабной наработки DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 привлекали компанию U-Protein Express, в которой наработка фрагментов была выполнена с помощью временной трансфекции в клетки линии HEK (линия клеток мезонефроса человека). Белки очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием Strep-Tag® и полигистидиновой метки. Очищенные белки консервировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с добавлением 0,02% Твин-80 (SigmaAldrich) и хранили при 4°С. Чистоту определяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с последующим окрашиванием Кумасси.

Иммунопреципитация и Вестерн-блоттинг.

Иммунопреципитацию проводили, как описано в указанной работе (12), используя мАт к Met, DO24 (4). Вестерн-блоттинг проводили с использованием следующих антител: клона DL-21 моноклонального антитела к Met человека, который распознает область, расположенную во внеклеточной части Met (4); клона 4G10 моноклонального антитела к фосфотирозину (Millipore, Темекула, Калифорния, США); антитела к фосфо-Met (Tyr 1234/1235), антитела к фосфо-Met (Tyr 1349), антитела к фосфо-Akt (Ser 473), антитела к Akt, антитела к фосфо-ERK (Thr 202/Tyr 204) и поликлональных антител к ERK (Cell Signaling Technology, Беверли, Массачусетс, США).

Исследования связывания методом ИФА.

Связывание MvDN30, DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 определяли методом ИФА с использованием химерного белка Met-Fc в твердой фазе (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) и увеличивающихся концентраций FLAG-меченого рекомбинантного антитела в жидкой фазе. Связывание выявляли с помощью антител к Strep-Tagil®, конъюгированных с пероксидазой хрена (IBA, Оливетт, Миссури, США). Полученные данные анализировали и аппроксимировали с использованием программного обеспечения Prism (Graph Pad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Химерный белок Met-Fc представляет собой гибридный белок, в котором область Fc, полученная из человеческого IgG, гибридизована в одной рамке считывания с внеклеточной частью Met.

- 12 031536

Исследование активации Met.

Субконфлюентную культуру клеток карциномы легких человека А549 инкубировали в бессывороточной среде в течение 48 ч и затем стимулировали в течение 10 мин указанными концентрациями рекомбинантного ФРГ (R&D Systems) или очищенного мАт DN-30, MvDN30, DCD-MvDN30.1 и DCDMvDN30.2, как описано в указанной работе (13). После стимуляции клетки немедленно лизировали и обрабатывали, как описано в указанной работе (12). Клеточные экстракты подвергали иммунопреципитации с использованием антител к Met (DO-24), разделяли методом электрофореза в ДСН-ПААГ и исследовали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител к фосфотирозину (Millipore). Эти же блоты повторно исследовали с использованием антител к Met (DL-21), чтобы нормировать количество Met, подвергнутого иммунопреципитации.

Для ингибирования ФРГ-индуцированного фосфорилирования Met клетки А549 обрабатывали MvDN30, DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2 в течение 24 ч в бессывороточной среде и стимулировали ФРГ, как описано выше. Клеточные монослои лизировали буфером Лэммли, и равные количества общего белка разделяли в акриламидном геле методом электрофореза в ДСН-ПААГ и исследовали с помощью иммуноблоттинга, используя антитела к фосфо-Met (Tyr 1234/1235).

Исследование отщепления Met.

Субконфлюентные монослои клеток А549 дважды промывали ФСБ и затем инкубировали в бессывороточной среде с указанными концентрациями Fab DN-30 или мАт. Через 48 ч кондиционированную среду собирали и клетки лизировали буфером Лэммли. Уровни белка Met определяли в 50 мкг общих клеточных лизатов и в 50 мкл супернатанта клеточной культуры с помощью Вестерн-блоттинга, используя мАт к Met, DL-21.

Биологические количественные исследования в условиях in vitro.

Чтобы исследовать рост клеток, клетки высевали в 96-луночные планшеты (1000 клеток/лунку) в среду, содержащую 10% ФБС. Через 24 ч среду заменяли свежей средой, содержащей молекулы, полученные из DN30, с добавлением 5% ФСТ и антител в указанных концентрациях. Количество клеток оценивали через 72 ч, используя люминесцентный метод оценки жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Интенсивность хемилюминесценции детектировали с помощью устройства Multilabel Reader PerkinElmer 2030 (PerkinElmer Life и Analytical Sciences, Турку, Финляндия).

Для исследования субстратнезависимого роста клетки высевали в 48-луночные планшеты (500 клеток/лунку) в среду, содержащую 2% ФБС и 0,5% агарозы SeaPlaque (ВМА, Рокланд, Мэн, США). Антитела (1,5 мкМ) и ФРГ (50 нг/мл) добавляли в культуральную среду каждые 3 дня. Через 21 день культивирования колонии окрашивали солями тетразолия (Sigma Life Science) и оценивали интенсивность окрашивания с помощью программного обеспечения MetaMorphOffline (Molecular Device LLC, Саннивейл, Калифорния, США).

Исследование фармакокинетических параметров.

Взрослым мышам с ослабленным иммунитетом линии NOD-SCID (масса тела от 18 до 22 г, в среднем 20 г) вводили внутрибрюшинно (в/б) 100 мкг DCD-MvDN30.1, или DCD-MvDN30.2, или MvDN30. Образцы периферической крови собирали в разные моменты времени (для MvDN30: 10, 20 и 30 мин, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48 ч; для DCD-MvDN30.1 и DCD-MvDN30.2: 30 мин, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48, 72, 96, 144 ч после введения). Концентрации терапевтических молекул оценивали с помощью ИФА, как описано выше в разделе, посвященном исследованию связывания, интерполировали значения абсорбции образцов на линейную часть калибровочной кривой, полученной с помощью серийных разведений различных очищенных молекул. Каждая временная точка представляла собой среднее арифметическое для значений, полученных по меньшей мере от 3 мышей.

- 13 031536

Список литературы

1) Martens, Т., et al. A novel one-armed anti-c-Met antibody inhibits glioblastoma growth in vivo. Clin Cancer Res. (2006); 12: 6144-52.

2) Jin, H., et al. MetMAb, the one-armed 5D5 anti-c-Met antibody, inhibits orthotopic pancreatic tumor growth and improves survival. Cancer Res. (2008); 68: 4360-8.

3) www.clinicaltrial.gov; Identifier: NCT01456325.“A study of Onartuzumab (MetMab) in combination with Tarceva (Erlotinib) in patients with Met diagnostic-positive NonSmall Cell Lung cancer who have received chemotherapy for advanced or metastatic disease (MetLung)”.

4) Prat, M., et al. Agonistic monoclonal antibodies against the Met receptor dissect the biological responses to HGF. J Cell Sci. (1998); 111: 237-47.

5) Petrelli, A., et al. Ab-induced ectodomain shedding mediates hepatocyte growth factor receptor down-regulation and hampers biological activity. Proc Natl Acad Sci USA. (2006); 103: 5090-5.

6) Foveau, B., et al. Down-regulation of the met receptor tyrosine kinase by presenilin-dependent regulated intramembrane proteolysis. Mol Biol Cell. (2009); 20: 2495-507.

7) Schelter, F, et al. A disintegrin and metalloproteinase-10 (ADAM-10) mediates DN30 antibody-induced shedding of the met surface receptor. J Biol Chem. (2010); 285: 2633540.

8) Pacchiana G, et al. Monovalency unleashes the full therapeutic potential of the DN-30 anti-Met antibody. J Biol Chem. (2010); 285: 36149-57.

9) Reichert JM. Antibody-based therapeutics to watch in 2011. MAbs. (2011); 3: 7699.

10) Michieli P, et al. An HGF-MSP chimera disassociates the trophic properties of scatter factors from their pro-invasive activity. Nat Biotechnol (2002); 20:488-495.

11) Giordano S, et al. pl45, A protein with associated tyrosine kinase activity in a human gastric carcinoma cell line. Mol Cell Biol 1988 8:3510-3517.

12) Longati P, et al. Tyrosines 1234-1235 are critical for activation of the tyrosine kinase encoded by the MET proto-oncogene (HGF receptor). Oncogene 1994 9:49-57.

13) Vigna E, et al. “Active” cancer immunotherapy by anti-Met antibody gene transfer. Cancer Res 2008 68:9176-9183

Перечень последовательностей <110> Metheresis Translational Research S.A.

<120> Новые фрагменты антител, их композиции и способы применения <130> BWO15799-CF <160> 30 <170> PatentIn версия 3.5 <210> 1 <211> 1155 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь DCD-MvDN30.1

- 14 031536

<400> 1
atgggatgga	gctatatcat	cctctttttg	gtagcaacag	ctacagatgg	ccactcccag	60
gtccaactgc	aacagcctgg	gactgaactg	gtgaagcctg	gggcttcagt	gaagctgtcc	120
tgcaaggctt	ctggctacac	cttcaccagt	tactggatac	actgggtgaa	gcagaggcct	180
ggacaaggcc	ttgagtggat	tggagagatt	aatcctagca	gcggtcgtac	taactacaac	240
gagaaattca	agaacaaggt	cacagtgact	gtagacaaat	cttccaccac	agcctacatg	300
caactcagca	acctgacatc	tgaggactct	gcggtctatt	actgtgcaag	taggggctac	360
tggggccaag	gcaccactct	cacagtctcc	tcagctagca	cgaagggccc	atcggtcttc	420
cccctggcac	cctcctccaa	gagcacctct	gggggcacag	cggccctggg	ctgcctggtc	480
aaggactact	tccccgaacc	ggtgacggtg	tcgtggaact	caggcgccct	gaccagcggc	540
gtgcacacct	tcccggctgt	cctacagtcc	tcaggactct	actccctcag	cagcgtggtg	600
accgtgccct	ccagcagctt	gggcacccag	acctacatct	gcaacgtgaa	tcacaagccc	660
agcaacacca	aggtggacaa	gaaagttgag	cccaaatctt	gtgcaagcac	gaagggccca	720
tcggtcttcc	ccctggcacc	ctcctccaag	agcacctctg	ggggcacagc	ggccctgggc	780
tgcctggtca	aggactactt	ccccgaaccg	gtgacggtgt	cgtggaactc	aggcgccctg	840
accagcggcg	tgcacacctt	cccggctgtc	ctacagtcct	caggactcta	ctccctcagc	900
agcgtggtga	ccgtgccctc	cagcagcttg	ggcacccaga	cctacatctg	caacgtgaat	960
cacaagccca	gcaacaccaa	ggtggacaag	aaagttgagc	ccaaatcttg	tgacaaaact	1020
cacacaggtg	ccgcatggag	ccacccccag	ttcgaaaaag	gggccgcatg	gagccacccc	1080
cagttcgaaa	aaggggccgc	atggagccac	ccccagttcg	aaaaaggggc	cgcacaccat	1140

caccatcacc attag 1155 <210> 2 <211> 384 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи DCD-MvDN30.1 <400> 2

Met 1

Gly Trp

Ser

Tyr 5

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu 10

Val

Ala

Thr

Ala

Thr 15

Asp

Gly

His

Ser

Gln

Val

Gln

Leu

Gln

Gln

Pro

Gly

Thr

Glu

Leu

Val

Lys

20

25

30

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

35

40

45

Thr

Ser

Tyr

Trp

Ile

His

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

- 15 031536

55 60

Glu 65

Trp

Ile

Gly Glu

Ile 70

Asn

Pro

Ser

Ser Gly Arg 75

Thr

Asn

Tyr

Asn 80

Glu

Lys

Phe

Lys

Asn

Lys

Val

Thr

Val

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Ser

Thr

85

90

95

Thr

Ala

Tyr

Met

Gln

Leu

Ser

Asn

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Ser

Arg

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

115

120

125

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

130

135

140

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

145

150

155

160

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

165

170

175

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly

180

185

190

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

195

200

205

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

210

215

220

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

225

230

235

240

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

245

250

255

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

260

265

270

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

275

280

285

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

290

295

300

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

305

310

315

320

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

325

330

335

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Gly

Ala

Ala

Trp

Ser

His

Pro

Gln

Phe

Glu

340

345

350

Lys

Gly

Ala

Ala

Trp

Ser

His

Pro

Gln

Phe

Glu

Lys

Gly

Ala

Ala

Trp

355

360

365

Ser

His

Pro

Gln

Phe

Glu

Lys

Gly

Ala

Ala

His

His

His

His

His

His

370

375

380

- 16 031536 <210> 3 <211> 334 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Область VH DN30 <400> 3

ggtccaactg	caacagcctg	ggactgaact	ggtgaagcct	ggggcttcag	tgaagctgtc	60
ctgcaaggct	tctggctaca	ccttcaccag	ttactggata	cactgggtga	agcagaggcc	120
tggacaaggc	cttgagtgga	ttggagagat	taatcctagc	agcggtcgta	ctaactacaa	180
cgagaaattc	aagaacaagg	tcacagtgac	tgtagacaaa	tcttccacca	cagcctacat	240
gcaactcagc	aacctgacat	ctgaggactc	tgcggtctat	tactgtgcaa	gtaggggcta	300
ctggggccaa	ggcaccactc	tcacagtctc	ctca			334

<210> 4 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность области VH DN30 <400> 4

Gln 1

Val

Gln Leu Gln 5

Gln Pro Gly

Thr Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

Trp

Ile

His

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Glu

Ile

Asn

Pro

Ser

Ser

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Asn

Lys

Val

Thr

Val

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Ser

Thr

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Gln

Leu

Ser

Asn 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Ser

Arg

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

100

105

110

<210>	5
<211>	315
<212>	ДНК
<213>	искусственная

<220>

<223> Область CH1 человека

- 17 031536

<400> 5
aagggcccat	cggtcttccc	cctggcaccc	tcctccaaga	gcacctctgg	gggcacagcg	60
gccctgggct	gcctggtcaa	ggactacttc	cccgaaccgg	tgacggtgtc	gtggaactca	120
ggcgccctga	ccagcggcgt	gcacaccttc	ccggctgtcc	tacagtcctc	aggactctac	180
tccctcagca	gcgtggtgac	cgtgccctcc	agcagcttgg	gcacccagac	ctacatctgc	240
aacgtgaatc	acaagcccag	caacaccaag	gtggacaaga	aagttgagcc	caaatcttgt	300

gacaaaactc acaca 315 <210> 6 <211> 105 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность области CH1 <400> 6

Lys 1

Gly

Pro

Ser

Val 5

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro 10

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr 15

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

20

25

30

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

35

40

45

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

50

55

60

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

65

70

75

80

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

85

90

95

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

100 105 <210> 7 <211> 108 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> стрептавидиновая метка <400> 7 ggtgccgcat ggagccaccc ccagttcgaa aaaggggccg catggagcca cccccagttc gaaaaagggg ccgcatggag ccacccccag ttcgaaaaag gggccgca

108 <210> 8 <211> 18 <212> ДНК

- 18 031536

<213>

искусственная

<220> <223>	Полигистидиновая метка
<400>	8

caccatcacc atcaccat

<210> 9 <211> 1035 <212> ДНК <213> искусственная
<220> <223> Легкая цепь DCD-MvDN30.1
<400> 9 atggagacag	acacaatcct	gctatgggtg	ctgctgctct	gggttccagg	ctccactggt	60
gacattgtgc	tgacccaatc	tccagcttct	ttggctgtgt	ctctagggca	gagggccacc	120
atctcctgca	aggccagcca	aagtgttgat	tatgatggtg	gtagttatat	gagttggttc	180
caacagagac	caggacagcc	acccaaactc	ctcatctctg	ctgcatccaa	ccttgaatct	240
ggcatcccag	ccaggtttag	tggcagtggc	tctgggacag	acttcaccct	caatatccat	300
cctgtggagg	aggaggatgt	tgcaacctat	tactgtcagc	aaagttatga	agacccgctc	360
acgttcggtg	ctggtaccaa	ggtggagatc	aaacgaactg	tggctgcacc	atctgtcttc	420
atcttcccgc	catctgatga	gcagttgaaa	tctggaactg	cctctgttgt	gtgcctgctg	480
aataacttct	atcccagaga	ggccaaagta	cagtggaagg	tggataacgc	cctccaatcg	540
ggtaactccc	aggagagtgt	cacagagcag	gacagcaagg	acagcaccta	cagcctcagc	600
agcaccctga	cgctgagcaa	agcagactac	gagaaacaca	aagtctacgc	ctgcgaagtc	660
acccatcagg	gcctgagctc	gcccgtcaca	aagagcttca	acaggggaga	gtgtactgtg	720
gctgcaccat	ctgtcttcat	cttcccgcca	tctgatgagc	agttgaaatc	tggaactgcc	780
tctgttgtgt	gcctgctgaa	taacttctat	cccagagagg	ccaaagtaca	gtggaaggtg	840
gataacgccc	tccaatcggg	taactcccag	gagagtgtca	cagagcagga	cagcaaggac	900
agcacctaca	gcctcagcag	caccctgacg	ctgagcaaag	cagactacga	gaaacacaaa	960
gtctacgcct	gcgaagtcac	ccatcagggc	ctgagctcgc	ccgtcacaaa	gagcttcaac	1020

aggggagagt gttaa 1035 <210> 10 <211> 344 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи DCD-MvDN30.1

- 19 031536 <400> 10

Met 1

Glu

Thr

Asp

Thr 5

Ile

Leu

Leu

Trp

Val 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Val 15

Pro

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

20

25

30

Val

Ser

Leu

Gly

Gln

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

35

40

45

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Gly

Ser

Tyr

Met

Ser

Trp

Phe

Gln

Gln

Arg

Pro

50

55

60

Gly

Gln

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Ser

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

65

70

75

80

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

85

90

95

Leu

Asn

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Val

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

100

105

110

Gln

Gln

Ser

Tyr

Glu

Asp

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Val

115

120

125

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

130

135

140

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

145

150

155

160

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

165

170

175

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

180

185

190

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

195

200

205

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

210

215

220

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

Thr

Val

225

230

235

240

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

245

250

255

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

260

265

270

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

275

280

285

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

290

295

300

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

305

310

315

320

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

- 20 031536

325 330

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

340

335 <210> 11 <211> 336 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Область VL DN30 <400> 11

gacattgtgc	tgacccaatc	tccagcttct	ttggctgtgt	ctctagggca	gagggccacc	60
atctcctgca	aggccagcca	aagtgttgat	tatgatggtg	gtagttatat	gagttggttc	120
caacagagac	caggacagcc	acccaaactc	ctcatctctg	ctgcatccaa	ccttgaatct	180
ggcatcccag	ccaggtttag	tggcagtggc	tctgggacag	acttcaccct	caatatccat	240
cctgtggagg	aggaggatgt	tgcaacctat	tactgtcagc	aaagttatga	agacccgctc	300
acgttcggtg	ctggtaccaa	ggtggagatc	aaacga			336

<210> 12 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность области VL DN30 <400> 12

Asp 1

Ile Val

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser 10

Leu Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Gln

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

20

25

30

Gly

Gly

Ser

Tyr

Met

Ser

Trp

Phe

Gln

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Ser

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

Ile

His

65

70

75

80

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Val

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Tyr

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

110

<210>	13
<211>	318
<212>	ДНК

- 21 031536 <213> искусственная <220>

<223> Область CL человека <400> 13

actgtggctg	caccatctgt	cttcatcttc	ccgccatctg	atgagcagtt	gaaatctgga	60
actgcctctg	ttgtgtgcct	gctgaataac	ttctatccca	gagaggccaa	agtacagtgg	120
aaggtggata	acgccctcca	atcgggtaac	tcccaggaga	gtgtcacaga	gcaggacagc	180
aaggacagca	cctacagcct	cagcagcacc	ctgacgctga	gcaaagcaga	ctacgagaaa	240
cacaaagtct	acgcctgcga	agtcacccat	cagggcctga	gctcgcccgt	cacaaagagc	300
ttcaacaggg	gagagtgt					318

<210> 14 <211> 106 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность области CL человека <400>14

Thr 1

Val

Ala

Ala

Pro 5

Ser

Val

Phe

Ile

Phe 10

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu 15

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

20

25

30

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

35

40

45

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

50

55

60

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

65

70

75

80

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

85

90

95

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

100

105

<210>15 <211>1023 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь DCD-MvDN30.2 <400> 15 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag gtccaactgc aacagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc

120

- 22 031536

tgcaaggctt	ctggctacac	cttcaccagt	tactggatac	actgggtgaa	gcagaggcct	180
ggacaaggcc	ttgagtggat	tggagagatt	aatcctagca	gcggtcgtac	taactacaac	240
gagaaattca	agaacaaggt	cacagtgact	gtagacaaat	cttccaccac	agcctacatg	300
caactcagca	acctgacatc	tgaggactct	gcggtctatt	actgtgcaag	taggggctac	360
tggggccaag	gcaccactct	cacagtctcc	tcagctagca	cgaagggccc	atcggtcttc	420
cccctggcac	cctcctccaa	gagcacctct	gggggcacag	cggccctggg	ctgcctggtc	480
aaggactact	tccccgaacc	ggtgacggtg	tcgtggaact	caggcgccct	gaccagcggc	540
gtgcacacct	tcccggctgt	cctacagtcc	tcaggactct	actccctcag	cagcgtggtg	600
accgtgccct	ccagcagctt	gggcacccag	acctacatct	gcaacgtgaa	tcacaagccc	660
agcaacacca	aggtggacaa	gaaagttgag	cccaaatctt	gtactgtggc	tgcaccatct	720
gtcttcatct	tcccgccatc	tgatgagcag	ttgaaatctg	gaactgcctc	tgttgtgtgc	780
ctgctgaata	acttctatcc	cagagaggcc	aaagtacagt	ggaaggtgga	taacgccctc	840
caatcgggta	actcccagga	gagtgtcaca	gagcaggaca	gcaaggacag	cacctacagc	900
ctcagcagca	ccctgacgct	gagcaaagca	gactacgaga	aacacaaagt	ctacgcctgc	960
gaagtcaccc	atcagggcct	gagctcgccc	gtcacaaaga	gcttcaacag	gggagagtgt	1020

taa 1023 <210> 16 <211> 340 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи DCD-MvDN30.2 <400> 16

Met 1

Gly

Trp

Ser

Tyr 5

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu 10

Val

Ala

Thr

Ala

Thr 15

Asp

Gly

His

Ser

Gln

Val

Gln

Leu

Gln

Gln

Pro

Gly

Thr

Glu

Leu

Val

Lys

20

25

30

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

35

40

45

Thr

Ser

Tyr

Trp

Ile

His

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Ile

Gly

Glu

Ile

Asn

Pro

Ser

Ser

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

65

70

75

80

Glu

Lys

Phe

Lys

Asn

Lys

Val

Thr

Val

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Ser

Thr

85

90

95

Thr

Ala

Tyr

Met

Gln

Leu

Ser

Asn

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

- 23 031536

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Ser

Arg

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

115

120

125

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

130

135

140

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

145

150

155

160

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

165

170

175

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly

180

185

190

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

195

200

205

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

210

215

220

Val

Asp

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

225

230

235

240

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

245

250

255

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

260

265

270

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

275

280

285

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

290

295

300

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

305

310

315

320

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

325

330

335

Arg Gly Glu Cys

340 <210> 17 <211> 1167 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> Легкая цепь DCD-MvDN30.2 <400> 17

atggagacag	acacaatcct	gctatgggtg	ctgctgctct	gggttccagg	ctccactggt	60
gacattgtgc	tgacccaatc	tccagcttct	ttggctgtgt	ctctagggca	gagggccacc	120
atctcctgca	aggccagcca	aagtgttgat	tatgatggtg	gtagttatat	gagttggttc	180

- 24 031536

caacagagac	caggacagcc	acccaaactc	ctcatctctg	ctgcatccaa	ccttgaatct	240
ggcatcccag	ccaggtttag	tggcagtggc	tctgggacag	acttcaccct	caatatccat	300
cctgtggagg	aggaggatgt	tgcaacctat	tactgtcagc	aaagttatga	agacccgctc	360
acgttcggtg	ctggtaccaa	ggtggagatc	aaacgaactg	tggctgcacc	atctgtcttc	420
atcttcccgc	catctgatga	gcagttgaaa	tctggaactg	cctctgttgt	gtgcctgctg	480
aataacttct	atcccagaga	ggccaaagta	cagtggaagg	tggataacgc	cctccaatcg	540
ggtaactccc	aggagagtgt	cacagagcag	gacagcaagg	acagcaccta	cagcctcagc	600
agcaccctga	cgctgagcaa	agcagactac	gagaaacaca	aagtctacgc	ctgcgaagtc	660
acccatcagg	gcctgagctc	gcccgtcaca	aagagcttca	acaggggaga	gtgtgcaagc	720
acgaagggcc	catcggtctt	ccccctggca	ccctcctcca	agagcacctc	tgggggcaca	780
gcggccctgg	gctgcctggt	caaggactac	ttccccgaac	cggtgacggt	gtcgtggaac	840
tcaggcgccc	tgaccagcgg	cgtgcacacc	ttcccggctg	tcctacagtc	ctcaggactc	900
tactccctca	gcagcgtggt	gaccgtgccc	tccagcagct	tgggcaccca	gacctacatc	960
tgcaacgtga	atcacaagcc	cagcaacacc	aaggtggaca	agaaagttga	gcccaaatct	1020
tgtgacaaaa	ctcacacagg	tgccgcatgg	agccaccccc	agttcgaaaa	aggggccgca	1080
tggagccacc	cccagttcga	aaaaggggcc	gcatggagcc	acccccagtt	cgaaaaaggg	1140
gccgcacacc	atcaccatca	ccattag				1167

<210> 18 <211> 388 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи DCD-MvDN30.2 <400> 18

Met 1

Glu

Thr

Asp

Thr 5

Ile

Leu

Leu

Trp

Val 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Val 15

Pro

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

20

25

30

Val

Ser

Leu

Gly

Gln

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

35

40

45

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Gly

Ser

Tyr

Met

Ser

Trp

Phe

Gln

Gln

Arg

Pro

50

55

60

Gly

Gln

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Ser

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

65

70

75

80

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

90 95

- 25 031536

Leu Asn

Ile

His 100

Pro

Val

Glu

Glu

Glu 105

Asp

Val

Ala

Thr

Tyr 110

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Tyr

Glu

Asp

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Val

115

120

125

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

130

135

140

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

145

150

155

160

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

165

170

175

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

180

185

190

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

195

200

205

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

210

215

220

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

Ala

Ser

225

230

235

240

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

245

250

255

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

260

265

270

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

275

280

285

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

290

295

300

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

305

310

315

320

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Val

325

330

335

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Gly

Ala

Ala

Trp

Ser

His

340

345

350

Pro

Gln

Phe

Glu

Lys

Gly

Ala

Ala

Trp

Ser

His

Pro

Gln

Phe

Glu

Lys

355

360

365

Gly

Ala

Ala

Trp

Ser

His

Pro

Gln

Phe

Glu

Lys

Gly

Ala

Ala

His

His

370

375

380

His His His His

385 <210> 19 <211> 8 <212> БЕЛОК

- 26 031536 <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH1 DN30 <400>19

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp <210> 20 <211>24 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> CDRH1 DN30 <400> 20 ggctacacct tcaccagtta ctgg

<210>	21
<211>	8
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственная
<220>
<223>	Аминокислотная последовательность CDRH2 DN30
<400>	21
Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr
1	5

<210> 22 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> CDRH2 DN30 <400> 22 attaatccta gcagcggtcg tact

<210> <211> <212> <213>

23 5 БЕЛОК искусственная

<223>

Аминокислотная последовательность

CDRH3 DN30 <400> 23

Ala Ser Arg Gly Tyr

5 <220>

- 27 031536 <210> 24 <211> 15 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> CDRH3 DN30 <400> 24 gcaagtaggg gctac

<210>	25
<211>	10
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственная
<220>
<223>	Аминокислотная последовательность CDRL1 DN30
<400>	25
Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Gly	Ser Tyr
1	5	10

<210>	26
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	искусственная
<220>
<223>	CDRL1 DN30
<400>	26
caaagtgttg attatgatgg tggtagttat	30

<210>	27
<211>	3
<212>	БЕЛОК
<213>	искусственная
<220>
<223>	Аминокислотная последовательность CDRL2 DN30
<400>	27
Ala Ala Ser
1

<210> <211> <212> <213>	28 9 ДНК искусственная
<220> <223>	CDRL2 DN30
<400>	28
gctgcatcc

- 28 031536 <210> 29 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL3 DN30 <400>29

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr

<210>	30
<211>	27
<212>	ДНК
<213>	искусственная

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL3 DN30 <400>30 cagcaaagtt atgaagaccc gctcacg

Claims (17)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антигенсвязывающий фрагмент антитела, включающий первый полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи и две константные области, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и две константные области, при этом две константные области представляют собой константные области легкой цепи и две константные области представляют собой константные области тяжелой цепи CH1, где указанный фрагмент антитела имеет увеличенный период полувыведения в условиях in vivo относительно фрагмента Fab, содержащего указанные вариабельные области легкой и тяжелой цепей, где первый полипептид содержит одну вариабельную область легкой цепи и две константные области легкой цепи человека, при этом вариабельная область легкой цепи гибридизована с первой константной областью легкой цепи человека, которая гибридизована со второй константной областью легкой цепи в направлении от N- к С-концу, таким образом образуя химерную легкую цепь VLCL-CL, и где второй полипептид содержит одну вариабельную область тяжелой цепи и две константные области тяжелой цепи человека, при этом вариабельная область тяжелой цепи гибридизована с первой константной областью тяжелой цепи человека CH1, которая гибридизована со второй константной областью тяжелой цепи человека CH1 в направлении от N- к С-концу, таким образом образуя химерную тяжелую цепь VH-CH1-CH1.
2. 2. Антигенсвязывающий фрагмент антитела, включающий первый полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи и две константные области, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и две константные области, при этом две константные области представляют собой константные области легкой цепи и две константные области представляют собой константные области тяжелой цепи CH1, где указанный фрагмент антитела имеет увеличенный период полувыведения в условиях in vivo относительно фрагмента Fab, содержащего указанные вариабельные области легкой и тяжелой цепей, где первый полипептид содержит одну вариабельную область легкой цепи, одну константную область легкой цепи человека и одну константную область тяжелой цепи человека CH1, при этом вариабельная область легкой цепи гибридизована с константной областью легкой цепи человека, которая гибридизована с константной областью тяжелой цепи человека CH1 в направлении от N- к Сконцу, таким образом образуя химерную легкую цепь VL-CL-CH1, и где второй полипептид содержит одну вариабельную область тяжелой цепи, одну константную область тяжелой цепи человека CH1 и одну константную область легкой цепи человека, при этом вариабельная область тяжелой цепи гибридизована с константной областью тяжелой цепи человека CH1, которая гибридизована с константной областью легкой цепи человека в направлении от N- к С-концу, таким образом образуя химерную тяжелую цепь VH-CH1-CL.
3. 3. Фрагмент антитела по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанная вариабельная область легкой цепи выбрана из вариабельной области легкой цепи, не являющейся человеческой, или вариабельной области легкой цепи, являющейся человеческой или гуманизированной, содержащей области, опреде

   - 29 031536 ляющие комплементарность (CDR), из антитела, не являющегося человеческим.
4. 4. Фрагмент антитела по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанная вариабельная область тяжелой цепи выбрана из вариабельной области тяжелой цепи, не являющейся человеческой, или вариабельной области тяжелой цепи, являющейся человеческой или гуманизированной, содержащей области, определяющие комплементарность (CDR), из антитела, не являющегося человеческим.
5. 5. Фрагмент антитела по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанная константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой каппа-цепи человека.
6. 6. Фрагмент антитела по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанная константная область тяжелой цепи CH1 представляет собой константную область тяжелой гамма-цепи человека CH1.
7. 7. Фрагмент антитела по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанная константная область тяжелой цепи CH1 получена из человеческого IgG1.
8. 8. Фрагмент антитела по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанный фрагмент антитела является более стабильным в условиях in vivo, чем молекула Fab, содержащая указанные вариабельные области легкой и тяжелой цепей.
9. 9. Фрагмент антитела по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что указанный фрагмент антитела специфично связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (РФРГ).
10. 10. Фармацевтическая композиция, содержащая фрагмент антитела по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель для лечения опухолей и/или метастазов.
11. 11. Фармацевтическая композиция по п.10, отличающаяся тем, что указанная опухоль и/или метастазы связаны с нарушением регуляции передачи сигналов с участием РФРГ и/или активации РФРГ.
12. 12. Продукт, содержащий фрагмент антитела по любому из пп.1-9 и по меньшей мере один ингибитор ФРГ (фактора роста гепатоцитов) и ингибитор РФРГ, представленный в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения опухолей и/или метастазов, предпочтительно опухоли и/или метастазов, связанных с нарушением регуляции передачи сигналов с участием РФРГ и/или активации РФРГ.
13. 13. Продукт по п.12, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один ингибитор выбран из антител к ФРГ, рекомбинантных молекул, которые конкурируют с ФРГ, низкомолекулярных ингибиторов РФРГ, антител к РФРГ или ингибиторов РФРГ.
14. 14. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая фрагмент антитела по любому из пп.1-9.
15. 15. Вектор, содержащий по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент антитела по любому из пп.1-9.
16. 16. Композиция, содержащая две или более нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагмент антитела по любому из пп.1-9, для лечения опухолей и/или метастазов.
17. 17. Применение вектора по п.15 для лечения пациента, страдающего от опухоли и/или метастазов, предпочтительно опухоли и/или метастазов, связанных с нарушением регуляции передачи сигналов с участием РФРГ и/или активации РФРГ.

    MvDN30 DN30 FAb MvDN30 DN30 FAb химерный мышиный химерный мышиный

    60 20 6.6 60 20 6.6 мкг/мл - 60 20 6.6 60 20 6.6 мкг/мл

    А р190 Met —> р145 Met—► _ч_р80 Met эктодомен В р190 Met —► р145 Met —► liiiil <4__р80 Met эктодомен

    Общие клеточные лизаты Надосадочная жидкость клеточных культур Вестерн-блот: Антитело к Met Вестерн-блот: Антитело к Met