RU2788606C2

RU2788606C2 - Комбинация антитела против hgfr и hegfr для лечения опухоли и/или метастаза

Info

Publication number: RU2788606C2
Application number: RU2020129465A
Authority: RU
Inventors: Кристина Базилико; Элиза Винья; Паоло Мария Комольо
Original assignee: Вертикаль Био АГ
Priority date: 2018-03-22
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2023-01-23

Abstract

Группа изобретений относится к новой комбинации терапевтических агентов для лечения опухоли и/или метастаза. Предложено применение комбинации фрагмента антитела против рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR) и внеклеточной части HGFR человека в лечении пациента, страдающего от секретирующей HGF опухоли и/или метастаза, предпочтительно секретирующего HGF метастаза. Также предложены слитый белок, обладающий активностью одновременного антагонизма HGFR и связывания HGF, содержащий в направлении от N- к C-концу (i) фрагмент антитела против HGFR, линкер и внеклеточную часть HGFR человека; или (ii) внеклеточную часть HGFR человека, линкер и фрагмент антитела против HGFR, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, и фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретения позволяют осуществлять двойное нацеливание на фактор роста гепатоцитов (HGF) и рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR), действуя одновременно на MET-экспрессирующие раковые клетки и на секретирующую HGF строму опухоли и оказывая синергетический эффект в лечении опухолей и/или метастаза. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 13 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее описание относится к новой комбинации терапевтических агентов для лечения опухоли и/или метастаза, предпочтительно метастаза.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Метастатическое распространение основано на способности раковых клеток нарушать межклеточные взаимодействия, мигрировать через внеклеточный матрикс, выживать и размножаться в тканях, отличных от места их происхождения. Физиологический аналог этой сложной программы - известный как «инвазивный рост» - лежит в основе эмбриогенеза и отвечает за заживление ран и регенерацию органов во взрослой жизни. Инвазивный рост жестко регулируется специфическими внеклеточными сигналами, одним из которых является фактор роста гепатоцитов (HGF), лиганд рецептора, кодируемого онкогеном MET. В условиях аберрантной активации передача сигналов HGF/MET управляет возникновением, прогрессированием и метастазированием опухоли в широком спектре злокачественных новообразований человека. В меньшинстве случаев MET ведет себя как «драйвер» онкогена, а рост и выживание опухолевых клеток зависит от конститутивной передачи сигналов MET («зависимость от MET»). Это состояние зависит от наличия генетических повреждений, в основном увеличения числа копий гена или, реже, мутаций², которые приводят к конститутивной лиганд-независимой активации рецептора. В этом контексте лечение ингибиторами МЕТ является высокоэффективным, вызывая блокировку пролиферации клеток и остановку клеточного цикла in vitro и ингибирование роста опухоли in vivo. Совместная экспрессия лиганда и рецептора в одной и той же клетке является другой стратегией, используемой раком для достижения непрерывной активации MET, и она была описана в основном при неэпителиальных раковых заболеваниях человека, таких как остеосаркомы, глиобластомы и множественные миеломы. Однако в большинстве случаев аберрантная активация МЕТ в опухолях происходит из-за сверхэкспрессии рецептора из-за усиления транскрипции гена дикого типа, запускающего сенсибилизацию раковой клетки к стимуляции лигандом³. В последнем случае передача сигналов MET, которая приводит к проинвазивным и антиапоптотическим ответам, используется раковыми клетками в качестве стратегии обхода стрессовых условий и усиления злокачественного фенотипа («уместность MET»⁶). В отсутствие специфических генетических повреждений МЕТ не является строго необходимым для роста опухоли, но присутствие лиганда поддерживает активацию рецептора, усиливая злокачественный фенотип. Наконец, МЕТ действует как функциональный маркер раковых «стволовых клеток-предшественников» в глиобластомах⁸ и поддерживает «стволовой» фенотип при колоректальном раке и раке молочной железы^12,15. Более того, было показано, что происходящий из стромы HGF поддерживает путь самообновления WNT стволовых клеток колоректального рака и способствует пролиферации клеток, инициирующих рак толстой кишки, вызывая устойчивость к терапии против EGFR²⁷.

Был разработан и в настоящее время исследуется ряд стратегий, нацеленных на MET или HGF – низкомолекулярные ингибиторы, антитела или рекомбинантные белки. Среди них антитело MvDN30 представляет собой моновалентный химерный Fab-фрагмент, который связывается с внеклеточным доменом MET, вызывая протеолитическое отщепление («шеддинг») рецептора с поверхности клетки^{21, 28}. DecoyMET представляет собой рекомбинантный растворимый рецептор, охватывающий всю внеклеточную область MET; он связывает HGF с высоким сродством и ингибирует лиганд-зависимую биологическую активность in vitro и in vivo при экспрессии с помощью технологии лентивирусных векторов¹⁷ или в виде слитого с Fc белка^7,26. Как и в большинстве биологических систем, удар по единственному элементу цепи передачи сигнала вряд ли приведет к полному отключению ответа. Таким образом, в случае MET каждая молекула никогда не достигнет 100 % ингибирования, оставляя остаточную активность чувствительной к стимуляции HGF.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является создание новой комбинации противоопухолевых агентов, полезных для лечения онкологических пациентов.

В соответствии с изобретением указанная выше цель достигается благодаря предмету, конкретно упомянутому в приложенной формуле изобретения, которая понимается как составляющая неотъемлемая часть настоящего описания.

Настоящее изобретение относится к фрагменту антитела против рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR) в сочетании с внеклеточной частью человеческого HGFR для использования при лечении пациента, страдающего от опухоли и/или метастаза, предпочтительно метастаза, при этом:

(i) фрагмент антитела против HGFR имеет только один паратоп, способный связываться с эпитопом внеклеточной части HGFR человека, и обладает антагонистической активностью в отношении HGFR,

(ii) внеклеточная часть HGFR человека способна стабильно связываться с фактором роста гепатоцитов (HGF) и содержит по крайней мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR, для предотвращения связывания с ним фрагмента антитела против HGFR, и

(iii) фрагмент антитела против HGFR и внеклеточная часть HGFR человека подходят для введения пациенту (a) в форме белка или (b) в форме нуклеиновой кислоты.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Далее изобретение будет описано подробно исключительно в качестве иллюстративного и неограничивающего примера со ссылкой на прилагаемые фигуры.

Фиг. 1. Создание мутированного рецептора decoyMET, который не связывает антитело DN30.

(А) Сравнение аминокислотных последовательностей третьего и четвертого доменов IPT MET человека, мыши, крысы и собаки. Остатки, которые изменены исключительно в последовательности мыши, выделены жирным шрифтом, белым на черном фоне, аминокислоты, которые также (или только) изменены в последовательностях крысы или собаки, выделены жирным шрифтом. Показаны только границы IPT-3/IPT-4. (B) Рецепторы decoyMET, несущие одиночные аминокислотные замены, инкубировали с антителом DN30. Комплексы подвергали иммунопреципитации с белком А, который связывается с антителом, и выявляли с помощью конъюгированного с HRP стрептактина, который связывается со стреп-меткой в ловушке (левая панель). 30 мкл нормализованных супернатантов, используемых для иммунопреципитации, обрабатывали на SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) для проверки загрузки рецепторов decoyMET (правая панель). (C) Анализ связывания ELISA (ИФА, иммуноферментный анализ). MAb DN30 находилось в жидкой фазе, decoyMET дикого типа или decoyMET^K842E – в твердой фазе. Связывание антител детектировали с использованием конъюгированного с HRP мышиного антитела. OD, оптическая плотность при 450 нм. Каждая точка представляет собой среднее значение трех измерений ± стандартное отклонение SD.

Фиг. 2. DecoyMET^K842E связывает HGF с высоким сродством и ингибирует HGF-индуцированное фосфорилирование MET.

(A) Анализ связывания ELISA. DecoyMET дикого типа или decoyMET^K842E находились в твердой фазе; увеличивающиеся концентрации HGF добавляли в жидкую фазу. Связывание HGF детектировали с использованием биотинилированного антитела против HGF. Каждая точка представляет собой среднее значение трех измерений ± SD. (B) HGF-индуцированное фосфорилирование МЕТ. Клетки A549 инкубировали с decoyMET дикого типа или decoyMET^K842E (2 мкМ) и стимулировали HGF (50 нг/мл). Тотальные клеточные лизаты подвергали иммуноблоттингу с использованием антифосфоМЕТ (верхняя панель), антител против МЕТ (средняя панель) или антител к винкулину (нижняя панель), p145, зрелой формы MET; p190, одноцепочечного предшественника МЕТ; p117, винкулина.

Фиг. 3. MvDN30 и DecoyMET^K842E совместно вносят вклад в снижение индуцированного HGF фосфорилирования MET и биологической активности, обусловленной MET.

(A) HGF-индуцированное фосфорилирование МЕТ. Клетки аденокарциномы легких человека A549 инкубировали с 2 мкМ decoyMET^K842E, 125 нМ MvDN30 или их комбинацией и стимулировали или не стимулировали 50 нг/мл HGF. Тотальные клеточные лизаты подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против фосфоМЕТ (верхняя панель), антител против МЕТ (средняя панель) или антител к винкулину (нижняя панель), p145, зрелой формы MET; p190, одноцепочечного предшественника МЕТ; p117, винкулина. (B) HGF-индуцированное фосфорилирование ERK и AKT. Клетки аденокарциномы легких человека A549 инкубировали с 500 нМ MvDN30, 2 мкМ decoyMET^K842E или их комбинацией и стимулировали или не стимулировали 100 нг/мл HGF. Тотальные клеточные лизаты подвергали иммуноблоттингу с анти-фосфоЕРК, анти-ERK, анти-фосфоАКТ, анти-AKT, анти-GAPDH, p42/44, ERK; р60, АКТ; p36, GAPDH. (C) Независимый от закрепления рост, поддерживаемый аутокринной стимуляцией HGF. Клетки глиобластомы человека U87-MG, экспрессирующие белки HGF и MET, обрабатывали 0,5 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E по отдельности или их комбинацией. График представляет процент среднего роста колоний для каждой обработки по сравнению с необработанным контролем. (D) Независимый от закрепления рост, поддерживаемый паракринной стимуляцией HGF. Клетки A549 стимулировали 30 нг/мл HGF и обрабатывали 1 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, по отдельности или их комбинацией. График показывает процент среднего роста колоний для каждой обработки по сравнению с контролем, стимулированным HGF. (E) Трансвел-анализ инвазии. Клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II стимулировали 12,5 нг/мл HGF и обрабатывали 0,5 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, по отдельности или их комбинацией. График показывает процент инвазии по сравнению с контролем, стимулированным HGF. Правая панель, одно репрезентативное изображение / группа клеток, мигрировавших через слой матригеля; n.t. - необработанные клетки. Увеличение 200×. Каждая точка представляет собой среднее значение в трех экземплярах ± SD. *** означает P ≤ 0,001; ** означает P ≤ 0,01; * означает P ≤ 0,05.

Фиг. 4. MvDN30 и decoyMET^K842E в комбинации ингибируют HGF-зависимое фосфорилирование MET.

Клетки U87MG (A), A549 (B) и HPAF-II (C) обрабатывали MvDN30, decoyMET^K842E или их комбинацией (COMBO). Клетки HPAF-II и A549 стимулировали или не стримулировали HGF; n.t. - необработанные клетки. Слева: репрезентативные конфокальные срезы, показывающие анти-фосфоМЕТ (верхние ряды) и фаллоидин (нижние ряды). На графиках справа показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) фосфоМЕТ, вычтенная и нормализованная для фаллоидина. Каждая точка представляет собой среднее из 5 значений ± SEM (стандартная ошибка среднего). Масштаб 50 мкм. *** означает P ≤ 0,001; ** означает P ≤ 0,01; * означает P ≤ 0,05.

Фиг. 5. MvDN30 и DecoyMET^K842E действуют синергично, подавляя HGF-зависимое рассеяние клеток.

(А) Анализ подвижности клеток. Клетки HPAF-II предварительно инкубировали с различными концентрациями (0,06, 0,25, 1 или 4 мкМ) MvDN30 или decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации 1:1, а затем стимулировали 6,25 нг/мл HGF. Распределение клеток отслеживали в реальном времени с помощью устройства X-CELLigence RTCA и выражали как нормализованный индекс клеток. Каждый график относится к одной концентрации обработки. (B) Репрезентативные изображения клеток HPAF-II, предварительно инкубированных с 1 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации, а затем стимулированных 6,25 нг/мл HGF; n.t. - необработанные клетки. (C) Кривая подвижности клеток. Эффект – это значение индекса клеток, измеренное в конце эксперимента для каждой дозы обработки, нормализованное по значениям, полученным только с HGF, и выраженное как [1-x]. (D) Анализ комбинаций лекарственных средств. Значения кривой подвижности клеток были получены с помощью программного обеспечения Calcusyn для расчета индекса комбинации (CI) для каждой концентрации MvDN30 и decoyMET^K842E. CI = 1, взаимодействие; CI < 1, синергизм; CI > 1, антагонизм.

Фиг. 6 Комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E снижает инвазивный фенотип подкожных опухолей U87-MG.

Клетки U87-MG вводили подкожно мышам NOD-SCID. Когда опухоли достигли объема 80-100 мм³, мыши были разделены на четыре однородные группы: носитель (n = 10); MvDN30 (n = 9); K842E (n = 9); комбинация двух лекарственных средств (n = 10).(A) Объем опухоли при умерщвлении, выраженный как кратное увеличение. Каждая полоса представляет собой среднее значение группы ± SEM. (B) Гистохимический анализ опухолевой нагрузки. Репрезентативные изображения срезов опухоли, окрашенных гематоксилином-эозином. Стрелки указывают на границу между опухолью и окружающей тканью. Увеличение 100×.

Фиг. 7. Влияние MvDN30 или decoyMET^K842E, по отдельности или в комбинации, на пролиферацию и апоптоз клеток рака поджелудочной железы, ортотопически инъецированных мышам hHGF-Ki.

Клетки HPAF-II, экспрессирующие люциферазу, вводили в поджелудочную железу мышей hHGF-Ki и разделяли на четыре гомогенные группы: носитель (n = 10), MvDN30 (n = 6), decoyMET^K842E (n = 6), комбинация лекарственных средств (n = 6). (A) Биолюминесценция опухоли, обнаруженная IVIS Spectrum. Цифры означают средние значения общего потока биолюминесценции (фотонов/секунду × 10⁸) каждой экспериментальной группы ± SEM. (B) Анализ пролиферации опухолевых клеток, измеренный иммуногистохимическим методом Ki67. Левая панель – репрезентативные изображения каждой экспериментальной группы. Увеличение 200×. График справа показывает средние значения, полученные при анализе пяти изображений на опухоль ± SEM. Индекс пролиферации рассчитывается как отношение Ki67-положительных клеток к общему количеству клеток. (C) Анализ апоптоза опухолевых клеток, измеренный с помощью иммунофлуоресценции расщепленной каспазы-3. Левая панель – репрезентативные изображения каждой экспериментальной группы. Масштаб 50 мкм. График справа показывает средние значения, полученные при анализе 8 изображений на опухоль ± SEM. Индекс апоптоза рассчитывают как отношение количества клеток, положительных на расщепленную каспазу-3, к общему количеству клеток. Масштаб 50 мкм. *** означает значение P < 0,001; ** означает значение P < 0,01; * означает значение P < 0,05.

Фиг. 8. MvDN30 и DecoyMET^K842E снижают фосфорилирование МЕТ и метастатическое распространение раковых клеток поджелудочной железы у мышей hHGF-Ki.

Клетки HPAF-II, экспрессирующие люциферазу, вводили в поджелудочную железу мышей hHGF-Ki и разделяли на четыре гомогенные группы: носитель (n = 10), MvDN30 (n = 6), decoyMET^K842E (n = 6), комбинация лекарственных средств (n = 6). (A) Статус фосфоMET в опухолях, измеренный с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Левая панель, репрезентативные конфокальные срезы каждой экспериментальной группы, показывающие антифосфоМЕТ. График справа показывает среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) фосфоMET, фон вычтен и нормализован по DAPI. Каждая точка представляет собой среднее из 12 значений ± SEM. Масштаб 50 мкм. (B) Оценка фенотипа EMT опухолей HPAF-II с помощью иммунофлуоресцентного анализа экспрессии E-кадгерина и виментина. Левая панель, репрезентативные изображения каждой экспериментальной группы. Анти-Е-кадгерин (верхний ряд), антивиментин (нижний ряд). Масштаб 50 мкм. График справа показывает средние значения, полученные при анализе 6 изображений на опухоль ± SEM. Фенотип ЕМТ выражается соотношением виментин/Е-кадгерин. (C) Метастатические узелки в легких, оцениваемые с помощью гистохимического окрашивания HE. График слева: количество метастатических очагов; каждая точка представляет количество поражений, оцененных для каждой мыши. График справа: область метастатического поражения; каждая точка представляет собой среднюю площадь метастазов, измеренную для каждой мыши. Было проанализировано десять слайдов/мышь; метастатические поражения оценивали, а их площадь количественно определяли с помощью ImageJ. *** означает P ≤ 0,001; ** означает P ≤ 0,01; * означает P ≤ 0,05.

Фиг. 9. Схематическое изображение одного из вариантов слитых белков, содержащих фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть HGFR человека.

(A) Изображение молекулы, образованной слиянием в рамке считывания decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. (B) Изображение молекулы, образованной слиянием в рамке считывания scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. Между двумя группами был вставлен линкер. Последовательность линкера может быть выбрана из последовательностей, перечисленных в (C). SEMA, PSI, IPT 1-4 представляют собой участки decoyMET. Звездочка в IPT 4 показывает мутацию K→Е в позиции 842. Фрагмент антитела против HGFR состоит из двух цепей, соединенных вторым линкером. VL – вариабельная область легкой цепи; CL – константная область легкой цепи; VH – вариабельная область тяжелой цепи; CH – константная область тяжелой цепи. Черный квадрат представляет собой метки Strept-His, включенные в рекомбинантный белок для целей очистки/обнаружения.

Фиг. 10. Анализ связывания слитых белков, содержащих фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть HGFR человека, с MET или HGF.

(A) Анализ связывания с HGF с помощью ELISA. Левая панель, связывание слитых белков, содержащих decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. Правая панель, связывание слитых белков, содержащих scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. Слитые белки или decoyMET^K842E (положительный контроль) находились в твердой фазе. В жидкую фазу добавляли возрастающие концентрации HGF. Связывание HGF детектировали с использованием биотинилированного антитела против HGF. Каждая точка представляет собой среднее значение в трех экземплярах ± SD. (B) Анализ связывания с MET с помощью ELISA. Левая панель, связывание слитых белков, содержащих decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. Правая панель, связывание слитых белков, содержащих scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. DecoyMET дикого типа находился в твердой фазе, а возрастающие концентрации различных слитых белков находились в жидкой фазе; в качестве положительного контроля в анализ был включен scMvDN30. Связывание антител определяли с использованием конъюгированного с HRP антитела против k-цепи человека. OD, оптическая плотность при 450 нм. Каждая точка представляет собой среднее значение в трех измерениях ± SD.

Фиг. 11. Ингибирование роста опухолевых клеток при обработке слитыми белками, содержащими фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR.

(A) Рост клеток карциномы легких EBC-1, обработанных увеличивающимися концентрациями слитых белков, содержащих decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. (B) Рост клеток карциномы легких EBC-1, обработанных увеличивающимися концентрациями слитых белков, содержащих scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. В качестве положительного контроля в анализ были включены эквимолярные комбинации scMvDN30 и decoyMET^K842E (Combo). Клетки анализировали через 3 дня после обработки. Образцы представлены в трех экземплярах, столбцы представляют собой стандартное отклонение. (C) Таблица, показывающая значения IC₅₀ для каждого слитого белка, рассчитанные как среднее значение по меньшей мере из трех независимых экспериментов, по сравнению с ингибирующей активностью, проявляемой MvDN30/decoyK842E в комбинации.

Фиг. 12. Ингибирование роста опухолевых клеток при обработке слитыми белками, содержащими фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR.

Клетки HPAF-II предварительно инкубировали с различными слитыми белками (3 мкМ), а затем стимулировали 6,25 нг/мл HGF. Распределение клеток отслеживали в реальном времени с помощью устройства X-CELLigence RTCA и выражали как нормализованный индекс клеток. Испытания образцов проводят в трехкратной повторности. (A) Клетки, обработанные слитыми белками, содержащими decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. (B) Клетки, обработанные слитыми белками, содержащими scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. В качестве положительного контроля в анализ были включены эквимолярные комбинации scMvDN30 и decoyMET^K842E (Combo). (C) Таблица, показывающая процент подвижности клеток, рассчитанный как среднее значение из двух независимых экспериментов, по сравнению с клетками, обработанными HGF.

Фиг. 13. Слитые белки, содержащие фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR, уменьшают метастатическое распространение клеток рака поджелудочной железы у мышей hHGF-Ki.

Экспрессирующие люциферазу клетки Capan-1 вводили в поджелудочную железу мышей hHGF-Ki и разделяли на семь гомогенных групп: носитель (n = 14), decoyMET^K842E и scMvDN30 в комбинации 1:1 (две группы) и четыре группы для тестирования различных слитых белков, либо содержащие decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце, либо содержащие scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. Анализировали два разных линкера (L60 и L134). Combo 1 (n = 4): MvDN30 доставляли 7 раз в неделю, а decoyMET^K842E доставляли 2 раза в неделю; combo 2 (n = 6): MvDN30 доставляли 4 раза в неделю, а decoyMET^K842E доставляли 2 раза в неделю; K842E_scMvDN30_L60 (n = 4); scMvDN30_K842E_L60 (n = 5); K842E_scMvDN30_L134 (n = 5); K842E_scMvDN30_L134 (n = 6). Все слитые белки доставляли 2 раза в неделю. (A) Таблица, показывающая количество мышей, несущих метастазы в печени, по сравнению с общим количеством проанализированных мышей. Мышей считали положительными, когда биолюминесценция, обнаруженная в печени с помощью IVIS Spectrum, превышала 10⁵ фотонов в секунду. (B) График, показывающий процент биолюминесценции, обнаруженной с помощью IVIS Spectrum в печени каждой экспериментальной группы по сравнению с группой, обработанной носителем.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В нижеследующем описании приведены многочисленные конкретные детали изобретения, чтобы обеспечить полное понимание вариантов осуществления. Варианты осуществления могут быть реализованы без одной или нескольких конкретных деталей или с другими методами, компонентами, материалами и т. д. В других случаях хорошо известные структуры, материалы или операции не показаны или не описаны подробно, чтобы не затруднить понимание аспектов изобретения.

Используемая в настоящем документе отсылка на «один вариант осуществления» или «вариант осуществления» означает, что конкретный элемент, признак, структура или характеристика, описанная в связи с вариантом осуществления, включена в по меньшей мере один вариант осуществления. Таким образом, употребление выражения «в соответствии с одним вариантом осуществления» или «в соответствии с вариантом осуществления» в различных местах настоящего описания не обязательно всегда относится к одному и тому же варианту осуществления. Кроме того, отдельные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом в одном или более вариантах осуществления.

Названия, представленные здесь, предназначены только для удобства и не интерпретируют объем или значение вариантов осуществления.

Настоящее изобретение основывается на идее, что более высокая терапевтическая устойчивость при лечении опухолей и/или метастаза, предпочтительно метастаза, может быть достигнута за счет воздействия как на HGF, так и на HGFR. Экспериментальные данные, представленные здесь, на самом деле показывают, что вертикальное ингибирование оси MET/HGF эффективно препятствует росту, подвижности и инвазии опухолевых клеток in vitro и значительно снижает метастатическое распространение in vivo, обеспечивая комбинированную таргетную терапию для широкого спектра раковых заболеваний, экспрессирующих MET дикого типа.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к комбинации фрагмента антитела против рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR) с внеклеточной частью человеческого HGFR для использования в лечении пациента, страдающего от опухоли и/или метастаза, предпочтительно метастаза, при этом:

(ii) внеклеточная часть человеческого HGFR способна стабильно связываться с фактором роста гепатоцитов (HGF) и содержит по крайней мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR, для предотвращения связывания с ним фрагмента антитела против HGFR, и

(iii) фрагмент антитела против HGFR и внеклеточная часть HGFR человека подходят для введения пациенту (а) в форме белка или (b) в форме нуклеиновой кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления пациент, подвергаемый терапевтическому лечению с помощью описанной здесь комбинированной терапии, несет онкоген MET дикого типа (т. е. он/она не несет генетических изменений в онкогене MET).

В одном или нескольких вариантах реализации фрагмент антитела против HGFR содержит один вариабельный домен легкой цепи (VL) и один вариабельный домен тяжелой цепи (VH), причем вариабельные домены легкой цепи и тяжелой цепи являются нечеловеческими или гуманизированными, и где вариабельный домен легкой цепи (VL) содержит области, определяющие комплементарность (CDR), имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1-3, и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) содержит CDR, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 4-6.

В еще одном варианте осуществления фрагмент антитела против HGFR дополнительно содержит один константный домен легкой цепи человека (CL) и один константный домен CH1 тяжелой цепи человека (CH1), причем вариабельный домен легкой цепи (VL) слит с константным доменом легкой цепи человека (CL) в направлении от N- к C-концу (таким образом образуя легкую цепь VL-CL), причем вариабельный домен тяжелой цепи (VH) слит с константным доменом CH1 тяжелой цепи человека в направлении от N- к C-концу (образуя таким образом тяжелую цепь VH-CH1). В предпочтительном варианте осуществления легкая цепь VL-CL содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, а тяжелая цепь VH-CH1 содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8.

В различных вариантах осуществления, охватываемых настоящим изобретением, фрагмент антитела против HGFR находится в форме нуклеиновой кислоты. В таком случае фрагмент антитела против HGFR кодируется первой и второй молекулами нуклеиновой кислоты, где:

(i) первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует один вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDR, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты, указанные в SEQ ID NO: 9, 10 и 11, и где легкая цепь является нечеловеческой или гуманизированной; и

(ii) вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует один вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDR, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты, указанные в SEQ ID NO: 12, 13 и 14, и где тяжелая цепь является нечеловеческой или гуманизированной.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления фрагмент антитела против HGFR кодируется первой и второй молекулами нуклеиновой кислоты, где:

(i) первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует (а) один вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDR, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты, указанные в SEQ ID NO: 9, 10 и 11, где легкая цепь является нечеловеческой или гуманизированной, и (b) один константный домен легкой цепи человека (CL) в направлении от 5'- к 3'-концу (т. е. легкую цепь VL-CL); и

(ii) вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует (а) один вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDR, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты, указанные в SEQ ID NO: 12, 13 и 14, где тяжелая цепь является нечеловеческой или гуманизированной, и (b) один константный домен CH1 тяжелой цепи человека (CH1) в направлении от 5'- к 3'-концу (т. е. тяжелую цепь VH-CH1).

В предпочтительном варианте осуществления первая молекула нуклеиновой кислоты (кодирующая легкую цепь VL-CL) содержит, предпочтительно состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 15, и вторая молекула нуклеиновой кислоты (кодирующая тяжелую цепь VH-CH1) содержит, предпочтительно состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 16.

В дополнительном варианте осуществления, охватываемом настоящим изобретением, фрагмент антитела против HGFR представляет собой одноцепочечный Fab-фрагмент против HGFR. Одноцепочечный Fab-фрагмент против HGFR содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 17, или одноцепочечный Fab-фрагмент против HGFR кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей, предпочтительно состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 18.

В одном или нескольких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к внеклеточной части человеческого HGFR, содержащей домены SEMA, PSI, IPT-1, IPT-2, IPT-3 и IPT-4.

В предпочтительном варианте осуществления внеклеточная часть человеческого HGFR содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19, где одна или несколько аминокислот между положениями 797 и 875, указанными в SEQ ID NO: 19, мутированы. Согласно настоящему описанию внеклеточная часть человеческого HGFR имеет последовательность, мутированную в соответствии со знаниями, касающимися антител против HGFR и сайтов связывания HGF на HGFR, таким образом, что антитело не взаимодействует с HGFR, в то время как HGF сохраняет свою способность связывания с внеклеточной частью HGFR человека. В другом предпочтительном варианте осуществления внеклеточная часть человеческого HGFR имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20.

В дополнительном варианте осуществления, охватываемом настоящим изобретением, внеклеточная часть человеческого HGFR находится в форме молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит, предпочтительно состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 21, где одна или несколько нуклеиновых кислот между положениями 2391 и 2625, указанными в SEQ ID NO: 21, являются мутированными. Согласно настоящему описанию молекула нуклеиновой кислоты кодирует внеклеточную часть человеческого HGFR, которая имеет последовательность, мутированную в соответствии со знаниями, касающимися антител против HGFR и сайтов связывания HGF на HGFR, таким образом, что антитело не взаимодействует с HGFR, в то время как HGF сохраняет свою способность связывания с внеклеточной частью HGFR человека. В другом предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутированную внеклеточную часть человеческого HGFR, имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

В различных вариантах осуществления, охватываемых настоящим изобретением, фрагмент антитела против HGFR конъюгирован с помощью линкера с внеклеточной частью HGFR человека в направлении от N- к C-концу, таким образом образуя слитый белок фрагмент антитела против HGFR – линкер – внеклеточная часть HGFR человека. Альтернативно, внеклеточная часть человеческого HGFR конъюгирована с помощью линкера с фрагментом антитела против HGFR в направлении от N- к C-концу, таким образом образуя слитый белок внеклеточная часть HGFR человека – линкер – фрагмент антитела против HGFR.

В различных вариантах осуществления, охватываемых настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая фрагмент антитела против HGFR, связана с помощью молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей линкер, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточную часть HGFR человека, в направлении от 5'- к 3'-концу, таким образом кодируя слитый белок фрагмент антитела против HGFR – линкер – внеклеточная часть HGFR человека. Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточную часть HGFR человека, связана посредством молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей линкер, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент антитела против HGFR, в направлении от 5'- к 3'-концу, таким образом кодируя слитый белок внеклеточная часть HGFR человека – линкер – фрагмент антитела против HGFR.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен слитый белок, содержащий в направлении от N- к C-концу:

(i) фрагмент антитела против HGFR, линкер и внеклеточную часть HGFR человека; или

(ii) внеклеточную часть HGFR человека, линкер и фрагмент антитела против HGFR.

В предпочтительном варианте осуществления слитый белок, как определено выше, содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 23-28.

Таким образом, настоящее изобретение охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитый белок, содержащий в направлении от N- к C-концу:

В предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, как определено выше, содержит, предпочтительно состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из любой из SEQ ID NO: 29-34.

В дополнительном варианте осуществления настоящее описание касается фармацевтического продукта, содержащего в одном флаконе или в двух флаконах (а) фрагмент антитела против рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR) и фармацевтически приемлемый носитель, и (б) внеклеточную часть человеческого HGFR и фармацевтически приемлемый носитель, где:

(ii) внеклеточная часть человеческого HGFR способна стабильно связываться с фактором роста гепатоцитов (HGF) и содержит по крайней мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR, для предотвращения связывания фрагмента антитела против HGFR с эпитопом,

(iii) фрагмент антитела против HGFR и внеклеточная часть человеческого HGFR находятся либо в форме белка, либо в форме нуклеиновой кислоты.

Таким образом, фармацевтический продукт содержит фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть HGFR человека, имеющую признаки, отдельные или в любой соответствующей комбинации, описанные выше.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения опухоли и/или метастаза у субъекта, который включает введение субъекту эффективного количества комбинации фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части HGFR человека, посредством чего лечат указанное состояние.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей HGFR, который включает контактирование указанной клетки с комбинацией фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части человеческого HGFR по изобретению, вызывая тем самым ингибирование роста указанной клетки.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ терапевтического лечения млекопитающего, имеющего злокачественную опухоль и/или метастаз, где способ включает введение указанному млекопитающему эффективного количества комбинации фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части HGFR человека, обеспечивая тем самым эффективное лечение указанного млекопитающего.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения нарушения пролиферации клеток, который включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества комбинации фрагмента анти-HGFR-антитела и внеклеточной части человеческого HGFR, обеспечивая тем самым эффективное лечение или профилактику указанного нарушения пролиферации клеток.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ терапевтического лечения опухоли и/или метастазов у млекопитающего, где рост указанной опухоли по меньшей мере частично зависит от потенцирующего рост эффекта системы HGFR/HGF, обеспечивая таким образом либо увеличение пролиферации клеток, либо защиту от апоптоза, либо и то, и другое. Указанный способ включает контактирование опухолевой клетки с эффективным количеством фрагмента анти-HGFR-антитела в комбинации с эффективным количеством внеклеточной части человеческого HGFR по изобретению, обеспечивая таким образом эффективное лечение указанной опухоли и/или метастаза.

Опухоль, которую можно эффективно лечить с помощью комбинированной терапии по настоящему изобретению, выбирают из опухоли молочной железы, толстой и/или прямой кишки, легких, толстой кишки, поджелудочной железы, предстательной железы, яичников, шейки матки, центральной нервной системы, почек, гепатоцеллюлярной системы, мочевого пузыря, желудка, клетки опухоли головы и шеи, папиллярной карциномы (например, щитовидной железы), меланомы, лимфомы, миеломы, глиомы/глиобластомы (например, анапластической астроцитомы, мультиформной глиобластомы, анапластической олигодендроглиомы, анапластической олигодендроастроцитомы), лейкемической клетки, саркомы, рабдомиосаркомы или опухоли неизвестного первичного происхождения (CUP).

В одном варианте осуществления клетка, которая является терапевтической мишенью в способе по изобретению, представляет собой гиперпролиферативную и/или гиперпластическую клетку. В одном варианте осуществления клетка, на которую нацелен способ по изобретению, представляет собой диспластическую клетку. В еще одном варианте осуществления клетка, на которую нацелен способ по настоящему изобретению, представляет собой метастатическую клетку. В другом варианте осуществления клетка, на которую нацелен способ по настоящему изобретению, представляет собой экспрессирующую HGFR клетку, принадлежащую к микроокружению, поддерживающему опухоль и/или метастаз.

Терапевтические способы по изобретению могут дополнительно включать дополнительные этапы лечения. Например, в одном варианте осуществления терапевтический способ дополнительно включает этап, на котором целевую опухолевую клетку и/или ткань подвергают лучевой терапии или химиотерапевтическому лечению. В дополнительном варианте осуществления в дополнение к фрагменту антитела против HGFR в комбинации с внеклеточной частью человеческого HGFR по изобретению целевую опухолевую клетку и/или ткань обрабатывают молекулами, специфически поражающими другие мишени, имеющие отношение к поддержанию трансформированного фенотипа (т. е. молекулы против EGFR).

Выражение «антагонистическая активность» фрагмента антитела против HGFR в контексте настоящего описания относится к антителу, которое способно гасить внутриклеточную передачу сигналов, вызванную в клетке при активации HGFR. Антагонистическая активность указанного антитела может быть измерена путем оценки уровня экспрессии и/или фосфорилирования HGFR обычными методами, такими как вестерн-блоттинг, иммунофлуоресценция, иммуногистохимия, ELISA, цитофлуориметрический анализ или любой другой метод, который включает использование антитела, которые специфически распознают HGFR, или остатки HGFR Tyr^1234-1235, если они фосфорилированы (то есть основной сайт фосфорилирования MET⁹, или остатки HGFR Tyr^1349/1356, если они фосфорилированы (то есть сайт стыковки MET²²).

Используемое здесь выражение «внеклеточная часть человеческого HGFR способна стабильно связываться с человеческим HGF» означает, что внеклеточная часть человеческого HGFR связывается с HGF с расчетной Kd не выше 100 нМ.

Выражение «внеклеточная часть человеческого HGFR содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR» в контексте настоящего описания означает наличие одной или нескольких мутаций (т. е. аминокислотных замен, и/или делеций, и/или вставки) во внеклеточной части HGFR, способной индуцировать модификацию во внеклеточной части HGFR, которая предотвращает вовлечение вышеуказанной области вариабельными доменами антитела. Специалист с учетом его общих знаний (представленных, в частности, возможностью создания кДНК, включая изменение одного нуклеотида в заданной последовательности ДНК с использованием специфических праймеров во время дупликации ДНК, см. Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) не нуждается в дополнительных подробностях отностиельно реализации мутантной формы внеклеточной части HGFR человека, сохраняющей способность связываться с HGF человека, но не с фрагментом антитела против HGFR.

Таким образом, настоящее изобретение не следует интерпретировать как охватывающее только мутированную внеклеточную часть человеческого HGFR, как раскрыто в данном документе (т. е. SEQ ID NO: 8), поскольку квалифицированный специалист с точки зрения общих знаний может получить дополнительные мутированные версии внеклеточной части человеческого HGFR, содержащие SEQ ID NO: 19, что предотвращает связывание с ним антитела против HGFR.

Используемый здесь термин «одноцепочечный Fab-фрагмент» относится к одноцепочечному полипептиду, кодирующему домены VL, CL, VH, CH1 антитела, где VL и CL могут быть расположены на N-конце указанного полипептида и присоединены к доменам VH и CH1 с помощью гибкого линкера, или домены VH и CH1 могут быть расположены на N-конце указанного полипептида и связаны с доменами VL и CL гибким линкером.

Термины «SEMA», «PSI», «IPT-1», «IPT-2», «IPT-3» и «IPT-4» относятся к доменам HGFR, составляющим внеклеточную область HGFR. Такие доменные имена лежат в рамках общих знаний специалиста, например, ^{4, 13}. Домен SEMA представляет собой модуль взаимодействия с белками, общий для семафоринов и плексинов, охватывающий область, заключенную между аминокислотами 25-516 MET (SEQ ID NO: 19); PSI является общим доменом с плексинами, семафоринами, интегринами, охватывающим область между аминокислотами 519-561 MET (SEQ ID NO: 19); домен IPT, повторяющийся четыре раза, представляет собой область иммуноглобулина, как и в целом с плексинами и факторами транскрипции, охватывающую область, содержащуюся между аминокислотами 563-934 MET (SEQ ID NO: 19). Более подробно, повтор IPT-1 охватывает аминокислотные положения 563-656 в SEQ ID NO: 19, повтор IPT-2 охватывает аминокислотные положения 657-740 в SEQ ID NO: 19, повтор IPT-3 охватывает аминокислотные положения 741-837 в SEQ ID NO: 19, повтор IPT-4 охватывает аминокислотные положения 838-934 в SEQ ID NO: 19.

Слитые белки, раскрытые в данном документе, могут быть легко изготовлены квалифицированным специалистом либо в форме белков, либо в форме молекул нуклеиновых кислот, кодирующих указанные слитые белки, с учетом общих знаний в области, связанной с технологией рекомбинантной ДНК, как представлено, например, в Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory (1982). В качестве примера можно использовать следующую стандартную процедуру: (i) синтез соответствующей последовательности кДНК, (ii) вставка кДНК в плазмиду, подходящую для экспрессии у млекопитающих, с помощью обычных методов рекомбинантной ДНК, (iii) временная или стабильная трансфекция линии клеток млекопитающих с помощью упомянутой выше плазмиды, (iv) сбор культурального супернатанта, (v) очистка слитого белка с помощью аффинной хроматографии. Линкеры, используемые для конъюгирования двух белковых последовательностей, то есть фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части человеческого HGFR, могут иметь разную длину и/или аминокислотный состав, быть гибкими, жесткими или представлять собой комбинацию гибких и жестких областей. Линкеры, используемые в получении слитых белков, могут быть выбраны, но не ограничиваются ими, из любой из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 35, 36 и 37. Линкеры, используемые для получения молекул нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки, могут быть выбраны, но не ограничиваются ими, из любой из последовательностей нуклеиновых кислот, указанных в SEQ ID NO: 38, 39 и 40.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано ссылкой на комбинацию фрагмента антитела против HGFR, содержащего CDR с SEQ ID NO: 1-6, принадлежащих моноклональному антителу DN30, раскрытому в WO 2007/090807, и внеклеточной части HGFR, содержащей домены SEMA, PSI, IPT-1 - IPT-4, кратко далее обозначенные DecoyMET.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что моновалентный фрагмент антитела DN30 (MvDN30) и DecoyMET, используемые в комбинации, позволяют осуществлять двойное нацеливание на лиганд и рецептор, действуя одновременно на MET-экспрессирующие раковые клетки и на секретирующую HGF строму опухоли и оказывая синергетический эффект в лечении опухолей и/или метастаза.

Фармакологическое ингибирование рецептора тирозинкиназы MET в раковых клетках, «зависимых» от онкогенов, подавляет пролиферацию и инвазию клеток. Соответственно, пациенты с усиленным метастазирующим NSCLC (немелкоклеточный рак легких), метастатическим раком желудка или пищевода реагируют на анти-MET терапию^{5, 14, 19}. С другой стороны, раковые клетки без генетических изменений MET используют «физиологическую» программу, запускаемую онкогеном, как «средство» для усиления злокачественного фенотипа⁶. «Уместность» требует стимуляции МЕТ дикого типа его лигандом HGF. В этом отношении вклад микросреды опухоли в прогрессирование и метастазирование рака становится все более актуальным, поскольку экспериментальные данные показывают, что злокачественный фенотип развивается не строго клеточно-автономным образом, а в довольно сложном взаимодействии между раковыми клетками и стромой хозяина. Микроокружение опухоли является важным источником HGF, секретируемого стромальными клетками мезенхимального происхождения в качестве неактивного предшественника (proHGF). Последний запасается во внеклеточном матриксе благодаря своей авидности к гепарансульфатам и активируется специфическими протеазами, продуцируемыми опухолевыми или стромальными клетками. Следовательно, избыток биологически активного лиганда легко доступен для связывания рецептора MET и запускает инвазивный сигнальный каскад роста в «независимых» клетках. Приведенные здесь данные показывают, что в условиях «уместности» МЕТ сопутствующее вмешательство, затрагивающее обе стороны оси МЕТ/HGF, приводит к улучшенной ингибирующей активности. Одновременное нацеливание было достигнуто путем комбинирования моновалентного антитела против MET, MvDN30, с рекомбинантным растворимым рецептором, decoyMET^K842E. Приведенные здесь данные указывают на отсутствие избыточности нацеливания взаимодополняющих средств на один и тот же путь. Два ингибитора были выбраны с учетом их механизмов действия: антитело индуцирует физическое удаление МЕТ с поверхности клетки путем «отщепления» эктодомена. Последний выпускается во внеклеточную среду и действует как «ловушка» для HGF. Экзогенная поставка рекомбинантного decoyMET усиливает HGF-связывающую активность эндогенного decoyMET, генерируемого MvDN30. Чтобы сделать возможным одновременное использование MvDN30 и decoyMET, был создан модифицированный растворимый рецептор (decoyMET^K842E), дефицитный по взаимодействию с MvDN30, но наделенный высокими аффинными свойствами связывания с HGF. Эти два агента в комбинации взаимодействуют в различных раковых клетках, что снижает эффективную терапевтическую дозу. Более того, эта «двойная стратегия» демонстрирует сильный синергетический эффект, потенциально проявляя превосходную противоопухолевую эффективность. Экспрессия MET в субпопуляции стволовых/предшественников раковых клеток была определена как «естественная роль» MET, то есть физиологический (естественно присутствующий) HGF-индуцированный внутриклеточный ответ, активированный в раковых стволовых клетках, в отсутствие генетических повреждений ответственен за устойчивость к таргетным способам лечения, таким как использование ингибиторов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) при колоректальном раке. Идея связи раковых стволовых клеток и резистентности к традиционным способам лечения в широко признана, и роль HGF в микросреде в поддержании стволового фенотипа клеток-предшественников, экспрессирующих MET, становится все более и более установленной. Эффективное лечение, нацеленное на MET, в виде комбинации MvDN30 и decoyMET^K842E представляет собой терапевтическую поддержку для ослабления раковых стволовых клеток и противодействия возникновению устойчивости к таргетным способам лечения.

Роль микроокружения хозяина трудно исследовать в ксенотрансплантатах мыши из-за ограниченной перекрестной реактивности между факторами, происходящими из стромы мыши, и специфическими мишенями на раковых клетках человека. Это особенно важно в случае системы HGF/MET, поскольку мышиный HGF не активирует человеческий MET. Разработка генетически модифицированных линий мышей, экспрессирующих нокин-ген HGF человека (мыши hHGF-Ki), решила эту проблему. В этой трансгенной модели показано, что сопутствующее нацеливание HGF из окружающей среды и его рецептора на раковые клетки может быть эффективной терапевтической стратегией для предотвращения злокачественного прогрессирования и метастазирования.

Ксенотрансплантаты аденокарциномы поджелудочной железы характеризуются преждевременным метастатическим распространением, возникающим на очень ранней стадии развития опухоли, и поддерживаются обильным стромальным компартментом. Недавно HGF, секретируемый звездчатыми клетками поджелудочной железы, был идентифицирован как фактор, играющий важную роль во взаимодействии опухоль-строма при этом типе злокачественных новообразований. В ортотопической мышиной модели аденокарциномы поджелудочной железы человека, трансплантированной мышам hHGF-Ki, комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E немного задерживала рост опухоли, как и ожидалось в модели «уместности», где МЕТ не является драйверным онкогеном. С другой стороны, комбинированное лечение оказалось очень эффективным в уменьшении метастатического распространения, что предполагает возможное терапевтическое применение в раковых клетках, независимых от МЕТ, где МЕТ представлен диким типом. Эпидемиологические данные показывают, что только 2-3 % эпителиальных раковых заболеваний основаны на онкогенной зависимости от МЕТ вследствие амплификации, перестройки или мутации генов²⁹. По этой причине ряд клинических испытаний, направленных на неотобранные группы больных раком, провалился. С другой стороны, подавляющее большинство карцином используют лиганд-зависимую активацию МЕТ дикого типа, чтобы запустить инвазивный метастатический фенотип в ответ на гипоксию, ионизирующее излучение или химиотерапию. Таким образом, эти результаты предполагают, что большая группа пациентов, которые в настоящее время не подходят для таргетной терапии MET из-за отсутствия специфического генетического поражения, должны получать пользу от лечения, включающего стратегию двойного антитела-ловушки, которая позволяет оптимально блокировать передачу сигналов MET, управляемую HGF.

Терапевтические композиции, содержащие активные ингредиенты по настоящему изобретению, то есть фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR, могут быть приготовлены либо в виде одного препарата, содержащего два активных ингредиента, смешанных вместе, либо в виде отдельных препаратов, один из которых содержит фрагмент антитела против HGFR и другой - внеклеточный фрагмент человеческого HGFR. Активные ингредиенты готовят для хранения путем смешивания активного ингредиента (-ов), имеющего желаемую степень чистоты, с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме водных растворов, лиофилизированных или других высушенных составов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы; антиоксиданты; консерванты; полипептиды с низкой молекулярной массой (менее примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты; моносахариды, дисахариды и другие углеводы; хелатирующие агенты; сахара; солеобразующие противоионы; комплексы металлов и/или неионные поверхностно-активные вещества. Составы, раскрытые в настоящем документе, могут также содержать другое активное соединение (-я), если это необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно соединения с комплементарной активностью, которые не оказывают негативного влияния на терапевтическую активность фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части человеческого HGFR. Такие молекулы соответственно присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для предполагаемого назначения.

Активный (-е) ингредиент (-ы) также может быть заключен в микрокапсулы, полученные с помощью методик, раскрытых, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Составы для введения in vivo должны быть стерильными.

Можно приготовить препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие активные ингредиенты по изобретению, причем эти матрицы имеют форму изделий определенной формы, например пленок или микрокапсул.

Активные ингредиенты по настоящему изобретению можно использовать либо отдельно, либо в комбинации с другим антителом, химиотерапевтическим агентом (-ми) (включая коктейли химиотерапевтических агентов), другим цитотоксическим агентом (-ми), антиангиогенным агентом (-ми), цитокинами и/или агентом (-ы), ингибирующим рост. Такие комбинированные способы лечения, указанные выше, включают комбинированное введение (когда два или более агента включены в один и тот же или отдельные составы) и раздельное введение, и в этом случае введение антитела по изобретению может происходить до и/или после введения дополнительной терапии или способов лечения.

Активные ингредиенты по настоящему изобретению (и дополнительное терапевтическое средство (-а)) вводят любыми подходящими способами, включая парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и интраназальный, и внутриочаговое введение, если это желательно для местного лечения. Активные ингредиенты по настоящему изобретению можно подходящим образом вводить пульсирующей инфузией, особенно с уменьшающимися дозами активных ингредиентов. Введение дозы может быть осуществлено любым пригодным способом, например, с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным. Активные ингредиенты по изобретению также можно доставлять путем переноса генов с помощью вирусных векторов (т. е. лентивирусных векторов), вводить местно или системно, или посредством клеточной терапии, то есть путем внутривенной местной инъекции клеток человека, генетически модифицированных с помощью трансдукции вирусными векторами (т. е. лентивирусными векторами) для экспрессии фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части HGFR человека.

Активные ингредиенты по изобретению будут составляться, дозироваться и вводиться в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые следует учитывать в данном контексте, включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину заболевания, область доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные врачам-практикам. Активные ингредиенты по изобретению необязательно могут быть включены в фармацевтический состав вместе с одним или несколькими агентами, используемых в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого заболевания. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества активных ингредиентов по изобретению, присутствующих в составе, типа заболевания или лечения и других факторов, обсуждаемых выше. Их обычно используют в тех же дозах и с путями введения, которые были указаны здесь ранее, или примерно от 1 до 99 % от используемых до настоящего момента дозировок.

Для лечения заболевания подходящая дозировка активных ингредиентов по изобретению (при использовании отдельно или в комбинации с другим агентом (-ми), таким как химиотерапевтический агент (-а)), будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, степени тяжести и течения заболевания, независимо от того, вводятся ли активные ингредиенты в профилактических или терапевтических целях, при этом должным образом принимается во внимание история болезни пациента и реакция на активные ингредиенты по изобретению, и на усмотрение лечащего врача.

Антитело или иммуноконъюгат соответствующим образом вводят пациенту однократно или в ходе серии сеансов лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания от около 1 до 15 мг/кг антитела является начальной тестовой дозой для введения пациенту, например, путем одного или нескольких отдельных введений или путем непрерывной инфузии. Типичная ежедневная доза может находиться в диапазоне от около 1 до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. При повторном введении в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение обычно следует продолжать до желаемого подавления симптомов заболевания. Одна типичная дозировка фрагмента антитела находится в диапазоне от около 0,05 до около 20 мг/кг. Так, пациенту можно вводить одну или более из доз, составляющих около 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации). Такие дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, что пациент получает от приблизительно двух до приблизительно двадцати, например, приблизительно шесть доз антитела). Можно вводить начальную повышенную нагрузочную дозу, за которой следует одна или более пониженные дозы. Типичный режим дозирования включает введение начальной нагрузочной дозы около 4 мг/кг с последующей еженедельной поддерживающей дозой около 2 мг/кг антитела. Однако, могут быть пригодны другие схемы лечения. Ход такого лечения можно контролировать с помощью обычных методик и анализов. Внеклеточная часть человеческого HGFR должна доставляться одновременно с фрагментом антитела и должна быть дозирована пропорционально фрагменту антитела, предпочтительно, но не ограничиваясь, с молярным соотношением фрагмента антитела к decoyMET 1:1, в зависимости от типа и тяжести заболевания.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сайт-направленный мутагенез ДН30-связывающего эпитопа в decoyMET.

Чтобы использовать активность антитела MvDN30 и decoyMET совместно, необходимо предотвратить взаимодействие между двумя молекулами, которое могло бы привести к взаимной нейтрализации. Ранее было показано, что MvDN30 распознает эпитоп в домене IPT-4 внеклеточной области MET на границе с доменом IPT-3²⁸. Предыдущие исследования показали, что исходное антитело DN30, которое связывает человеческий рецептор с пикомолярным сродством, также взаимодействует с МЕТ собак и крыс^11,23, хотя оно не реагирует перекрестно с мышью²¹. После выравнивания аминокислотных последовательностей IPT-3 и IPT-4 вышеупомянутых видов млекопитающих был идентифицирован ряд остатков, которые избирательно изменены у мышей (фиг. 1A). Чтобы проверить, может ли замена отдельных аминокислотных остатков от человека к мыши нарушать связывание антитела, были созданы растворимые рецепторы, несущие точечные мутации в домене IPT 3-4, и протестированы против антитела DN30. Замена лизина 842 на глутаминовую кислоту привела к образованию decoyMET^K842E, модифицированного растворимого рецептора, больше не распознаваемого антителами, в то время как все другие мутации не влияли на взаимодействие (фиг. 1B). Неспособность антитела взаимодействовать с decoyMET^K842E была подтверждена в анализах ELISA, проведенных с афинно очищенными ловушками в твердой фазе и антителом DN-30 в жидкой фазе (фиг. 1С). Таким образом, замена основной аминокислоты в положении 842 на кислотный остаток приводила к критическому нарушению сайта связывания, препятствуя взаимодействию decoyMET^K842E с антителом.

DecoyMET^K842E связывает HGF с высоким сродством

Затем авторы настоящего изобретения исследовали, мешает ли аминокислотная замена K842E связыванию HGF. В анализах связывания ELISA константа аффинности decoyMET^K842E к HGF (K_d = 1,04 ± 0,05 нМ) совмещалась с K_d = 1,44 ± 0,07 нМ, измеренной для decoyMET дикого типа (фиг. 2A). Наконец, ингибирующая активность decoyMET^K842Eбыла протестирована с помощью анализа HGF-индуцированного фосфорилирования МЕТ. Как показано на фиг. 2B, decoyMET дикого типа и decoyMET^K842E ингибировали HGF-зависимое фосфорилирование MET в клетках рака легкого A549 с сопоставимой эффективностью. Таким образом, замена K842E не препятствует образованию стабильного комплекса с HGF и не влияет на ингибирующую активность ловушки.

MvDN30 и decoyMET^K842E взаимодействуют при ингибировании фосфорилирования MET и последующих биологических ответов

Для оценки ингибирующей активности, вызываемой одновременным нацеливанием лиганда и рецептора на трансдукцию сигнала MET, фосфорилирование MET тестировали в присутствии MvDN30 и decoyMET^K842E, по отдельности или в комбинации. С этой целью клетки A549, экспрессирующие МЕТ-рецептор дикого типа, стимулировали наномолярными концентрациями HGF, а активацию МЕТ измеряли с помощью антител к фосфоМЕТ. Обе молекулы проявляли ингибирующую активность, и их комбинация была более эффективной (фиг. 3А). Анализ последующих сигнальных трансдукторов подтвердил, что эта комбинация обеспечивает наиболее эффективное ингибирование активации ERK и AKT (фиг. 3B).

С биологической точки зрения, комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E сильно ингибировала безъякорный рост колоний в клеточных моделях как аутокринной, так и паракринной стимуляции HGF. В первом случае клетки глиобластомы U87-MG, демонстрирующие очень эффективный рост колоний на мягком агаре за счет аутокринной петли MET/HGF, подавлялись на 75 %, когда MvDN30 и decoyMET^K842E использовались в комбинации, тогда как подавление роста колоний никогда не превышало 40 %, когда две молекулы были использованы как отдельные агенты (фиг. 3B). Аналогичным образом, комбинированная обработка полностью блокировала образование колоний A549 на мягком агаре, вызванное наномолярными концентрациями экзогенно введенного HGF, в то время как только MvDN30 и decoyMET^K842E обеспечивали частичное, хотя и значительное ингибирование роста колоний (65 % и 74 % соответственно, фиг. 3C). Аналогичные результаты были получены в анализах инвазии, проведенных в камерах, покрытых матригелем: комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E снижала вызванную HGF инвазию в клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II на 85 %, в то время как в качестве отдельных агентов было достигнуто только 59 % и 52 % ингибирования соответственно (фиг. 3D). Во всех этих биологических системах комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E нарушала фосфорилирование МЕТ более эффективно, чем обработка по отдельности (фиг. 4).

Чтобы оценить, является ли эффект двух ингибиторов аддитивным или синергетическим, был проведен количественный анализ подвижности. Клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II, экспрессирующие МЕТ дикого типа, индуцировали для рассеяния действием HGF. Рассеяние клеток определяли количественно путем измерения вариаций электрического импеданса покрытых ячейками электродов (X-CELLigence Real Time Cell Analyzer). Комбинация двух молекул снижала HGF-зависимое рассеяние клеток дозозависимым образом, начиная ингибирование при 250 нМ и достигая полного блокирования в микромолярном диапазоне (фиг. 5 A и B). Значения индекса клеток, измеренные в конце эксперимента (время - 48 ч), были нормализованы по HGF (фиг. 5C) и обработаны с помощью программного обеспечения CalcuSYN для оценки синергизма (фиг. 5D): для всех исследованных концентраций рассчитанный индекс комбинации (CI) был значительно ниже 0,5 (CI = 0,1, 0,09, 0,17 и 0,38 для 0,06, 0,25, 1 и 4 мкМ, соответственно), что указывает на синергетическое отношение MvDN30 и decoyMET^K842E10.

MvDN30 и decoyMET^K842E ослабляют инвазивный фенотип и уменьшают распространение метастазов

Ингибирующую активность комбинации MvDN30 и decoyMET^K842E оценивали in vivo на мышиных моделях лиганд-управляемой стимуляции MET.

Исследовали модель аутокринной стимуляции HGF ксенотрансплантата глиобластомы U87-MG. Клетки вводили подкожно мышам NOD-SCID; когда объем опухолей достигал 80-100 мм³, мышей разделяли на гомогенные группы и случайным образом распределяли по 4 группам обработки: носитель, MvDN30, decoyMET^K842E или комбинация последних. После 22 дней обработки мышей умерщвляли и вырезали первичные опухоли для гистологического исследования. В то время как комбинированная обработка вызывала только краевое ингибирование роста (фиг. 6A), наблюдали снижение фенотипических признаков опухолевой инвазии (фиг. 6B).

Комбинированная обработка также была проверена на паракринной модели стимуляции HGF. Как сообщалось ранее, мышиный HGF не активирует человеческий рецептор МЕТ^{24, 30}. Следовательно, чтобы проверить ингибирующую активность decoyMET^K842E в ксенотрансплантатах опухолей человека, мы использовали трансгенную мышь SCID, у которой ген HGF мыши был заменен геном человека (hHGF-Ki)²⁰. Клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека (HPAF-II) метили путем трансдукции геном люциферазы и вводили ортотопически в поджелудочную железу мышей hHGF-Ki. Приживление проверяли анализом общей люминесценции тела; мышей разделяли на гомогенные группы на основе значений биолюминесценции и случайным образом распределяли на 4 группы обработки: носитель, MvDN30, decoyMET^K842E или их комбинация. Рост опухоли контролировали по общей люминесценции тела (фиг. 7A). При умерщвлении через 5 недель после инъекции клетки опухоли вырезали и анализировали на фосфорилирование МЕТ, пролиферацию, апоптоз и экспрессию виментина/Е-кадгерина (маркеры эпителиально-мезенхимального перехода). Одновременно собирали легкие для гистохимической оценки метастатических узелков. Фосфорилированный статус MET по тирозинам 1234-1235 ингибировался обоими агентами, и комбинированная обработка вызывала драматический эффект (фиг. 8A). Как и ожидалось в этой модели «уместности» онкогена MET (т. е. экспрессии MET дикого типа), пролиферация, а также апоптоз были умеренно затронуты, и только при комбинированной обработке (фиг. 7B и C). Анализ соотношения между виментином и Е-кадгерином показал, что комбинированная обработка подтолкнула раковые клетки к более эпителиальному фенотипу (фиг. 8B). Соответственно, одновременное введение MvDN30 и decoyMET^K842E значительно ингибировало опосредованное MET метастатическое распространение метастазов в легкие (фиг. 8C).

Создание панели слитых белков, содержащих фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть HGFR человека

Для создания одной кДНК, кодирующей слитые белки, содержащие фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR, авторы настоящего изобретения сначала разработали одноцепочечный MvDN30 (ScMvDN30), внедрив линкер между легкой цепью (VL-CL) и тяжелая цепь (VH-CH1). Линкер был гибким, богатым остатками глицина/серина и имел длину, которая позволяла предпочтительно генерировать мономерные молекулы, состоящие из ассоциации легкой и тяжелой цепей антитела, принадлежащих одному и тому же полипептиду, а не из отдельных полипепдитов, таким образом генерируя димеры и/или мультимеры. Предпочтительная аминокислотная последовательность линкера представлена в SEQ ID NO: 36; соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 39. Затем кДНК ScMvDN30 сливали в одной рамке считывания с DecoyMET^K842E. Были созданы две группы слитых белков: i) decoyMET^K842E был расположен на N-конце, а ScMvDN30 - на C-конце, и ii) scMvDN30 был расположен на N-конце, а decoyMet^K842E - на C-конце. Чтобы гарантировать высокую степень свободы для всей структуры, авторы настоящего изобретения ввели второй линкер между двумя группами. Использовали три разных линкера, модифицированных по аминокислотному составу и/или длине: i) L45: жесткий линкер из 45 аминокислот, состоящий из двух повторов последовательности, богатой аланином и заряженными остатками, SEQ ID NO: 35, соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 38; ii) L60, гибкий линкер, богатый остатками глицина/серина из 60 аминокислот SEQ ID NO: 36, соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 39; iii) L134, комбинация гибких и жестких областей из 134 аминокислот SEQ ID NO: 37, соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 40. Схематическое изображение слитых белков представлено на фиг. 9.

Слитые белки, содержащие scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце, связываются с высокой аффинностью как с MET, так и с HGF.

Авторы настоящего изобретения исследовали с помощью анализов ELISA, сохраняют ли новые созданные гибридные белки способность связывать как HGF, так и MET. Все слитые белки взаимодействовали с HGF с аффинностью, совпадающей с аффинностью decoyMET^K842E (фиг. 10A), в то время как слитые белки, содержащие scMvDN30 на С-конце, распознавали MET с более низким сродством по сравнению со слитыми белками с антителом, расположенным на N-конце. Значения Kd, измеренные для этой последней группы молекул, были сопоставимы со значениями, измеренными для одного scMvDN30 (фиг. 10B).

Слитые белки эффективно ингибировали рост опухолевых клеток.

Авторы настоящего изобретения оценивали ингибирующие свойства слитых белков, измеряя нарушение роста клеток после трех дней обработки, по сравнению с scMvDN30 в сочетании с decoyMET^K842E в эквимолярном соотношении. Все слитые белки проявляли ингибирующие свойства в зависимости от дозы. В описанном эксперименте слитые с линкером L60 белки были менее эффективны, чем другие молекулы, тогда как белки L45 и L134 проявляли активность, аналогичную комбинации scMvDN30-decoyMET^K842E (фиг. 11).

Слитые белки эффективно ингибировали индуцированную HGF подвижность клеток.

Чтобы оценить влияние слитых белков на ингибирование подвижности клеток, управляемой HGF, авторы настоящего изобретения выполнили количественный анализ подвижности с помощью анализатора клеток в реальном времени X-CELLigence, используя в качестве модели клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II, обработанные HGF. Все слитые белки были способны снижать HGF-зависимое распространение клеток (фиг. 12).

Слитые белки снижали распространение метастазов сильнее, чем комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E

Ингибирующую активность слитых белков оценивали in vivo на мышиной модели hHGF-Ki SCID. Клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека (Capan-I) метили путем трансдукции геном люциферазы и вводили ортотопически в поджелудочную железу мышей. Приживление проверяли анализом общей люминесценции тела; мыши были разделены на гомогенные группы на основе значений биолюминесценции и обработаны слитыми белками, включающими линкеры L60 или L134. В качестве референсов в экспериментальные группы были включены MvDN30 и decoyMET^K842E в комбинации 1:1 и носитель. При умерщвлении через 5 недель после инъекции клеток вырезали печень и анализировали с помощью IVIS Spectrum для подсчета метастазов. Одновременное введение MvDN30 и decoyMET^K842E значительно ингибировало метастатическое распространение метастазов в печень; была отмечена высокая эффективность, если введение MvDN30 проводилось ежедневно (группа COMBO 1), тогда как терапевтический ответ был значительно снижен, если применялись менее частые введения (группа COMBO 2). Это ограничение не оценивалось у мышей, получавших слитые белки. Фактически, все они с высокой эффективностью снижали метастатическое распространение в печень, даже если доставку проводили дважды в неделю (фиг. 13).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток

Клетки аденокарциномы легких человека A549, клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II и Capan-1 и клетки глиобластомы человека U87-MG были получены от ATCC/LGC Standards S.r.l. (Sesto San Giovanni, Италия); клетки карциномы легких человека EBC-1 были из японской исследовательской коллекции биоресурсов. Все клетки культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика. Все клеточные культуры были протестированы на заражение микоплазмами.

Создание, экспрессия и очистка фрагмента антитела против HGFR

КДНК, кодирующие легкую цепь (VL-CL) и тяжелую цепь (VH-CH1) фрагмента антитела против HGFR, способного распознавать эпитоп внеклеточной части HGFR, были получены путем синтеза генов, выполненного на аутсорсинге Invitrogen GeneArt. Синтез гена (ThermoFisher) в соответствии с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8. Фрагменты антител получали временной трансфекцией клеток HEK-293T плазмидами pcDNA3.1 (кат.# V79020 Invitrogen Corporation, Camarillo, CA), экспрессирующими кДНК, кодирующие легкую цепь (VL-CL) и тяжелую цепь (VH-CH1). Трансфицированные клетки подвергали голоду в течение трех дней и собирали супернатанты клеточных культур, содержащие растворимые рецепторы. Очистку рекомбинантных белков проводили аффинной хроматографией с использованием колонок HisTrap HP (кат.# 17524701 GE Healthcare, Freiburg, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Крупномасштабное производство и очистку белка выполняла компания U-Protein Express BV (Утрехт, Нидерланды).

Создание, экспрессия и очистка мутированных эктодоменов MET

Последовательности кДНК эктодоменов человеческого MET (decoyMET), несущие одиночные аминокислотные замены, были получены с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuickChange II (кат.# 200524 Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Процедура требует разработки смысловых и антисмысловых олигонуклеотидов, которые включают желаемую точечную мутацию. Были задействованы следующие олигонуклеотиды:

- мутация K842E:

sn. (смысловой)5'-gtacataatcctgtgtttgagccttttgaaaagccagtg-3' (SEQ ID NO: 41)

as. (антисмысловой) 5'-cactggcttttcaaaaggctcaaacacaggattatgtac-3' (SEQ ID NO: 42)

- мутация Q807K:

sn. 5'-ccactccttccctgaaacagctgaatctgcaactcc-3' (SEQ ID NO: 43)

as. 5'-ggagttgcagattcagctgtttcagggaaggagtgg-3' (SEQ ID NO: 44)

- мутация D864N:

sn. 5'-ctggaaattaagggaaataatattgaccctgaagcagttaaagg-3' (SEQ ID NO: 45)

as. 5'-cctttaactgcttcagggtcaatattatttcccttaatttccag-3' (SEQ ID NO: 46).

Сконструированные растворимые рецепторы были получены путем временной трансфекции клеток HEK-293T плазмидами pcDNA3.1 (кат.# V79020 Invitrogen Corporation, Camarillo, CA), экспрессирующие кДНК, кодирующие мутанты decoyMET или decoyMET дикого типа. Трансфицированные клетки подвергали голоду в течение трех дней и собирали супернатанты клеточных культур, содержащие растворимые рецепторы. Очистку рекомбинантных белков проводили аффинной хроматографией с использованием колонок HisTrap HP (кат.# 17524701 GE Healthcare, Freiburg, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Крупномасштабное производство и очистку белка выполняла компания U-Protein Express BV (Утрехт, Нидерланды).

Анализы фосфорилирования МЕТ

A549 после сывороточного голодания инкубировали в течение 24 ч с 125 нМ MvDN30 или 2 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации, а затем стимулировали 50 нг/мл HGF (кат.# 294-HG-025 R&D Systems) в течение 2 часов при 4 °C. Общие клеточные лизаты анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием следующих первичных антител: фосфо-Tyr^1234/1235 против MET (D26, кат.# 3077 Cell Signaling Technology, Беверли, Массачусетс); anti-MET (3D4, кат.№ 08-1366 Invitrogen Corporation); антивинкулин (клон hVIN-1, кат.# V9131 Sigma Life Science, Сент-Луис, Миссури). IgG1 против мыши (кат.# JI115035003) и IgG против кролика (кат.# JI111035003) вторичные антитела, конъюгированные с HRP, были получены от Jackson ImmunoResearch. (West Grove, PA).

Анализы связывания ELISA

Для анализа взаимодействия между decoyMET и mAb DN30 очищенные аффинно-очищенные растворимые рецепторы (decoyMET дикого типа или decoyMET^K842E, 100 нг/лунку) иммобилизовали на планшетах для ELISA и добавляли возрастающие концентрации антитела (0-100 нМ) в жидкую фазу. Связывание выявляли с использованием конъюгированных с HRP антител против мыши (кат.# NA931 GE Healthcare). Для анализа взаимодействия между ними и слитыми белками аффинно очищенный decoyMET дикого типа (100 нг/лунку) иммобилизовали на планшетах для ELISA и добавляли возрастающие концентрации слитых белков или scMvDN30 (0-1000 нМ) в жидкой фазе. Связывание выявляли с использованием конъюгированного с HRP антитела против k-цепи человека (кат.# A7164 Sigma-Aldrich). Для анализа связывания decoyMET или слитых белков с HGF растворимые рецепторы (100 нг/лунку) иммобилизовали на планшетах для ELISA и инкубировали с возрастающими концентрациями HGF (0-11 нМ) в растворе. Связывание детектировали с использованием биотинилированного антитела против HGF (кат.# BAF294 R&D Systems) и выявлено с помощью конъюгированного с стрептавидином HRP (кат.№ RPN 1231 GE Healthcare).

Колориметрический анализ был проведен с помощью считывающего устройства для планшетов с несколькими метками VICTOR-X4 (Perkin Elmer Instruments INC., Whaltman, MA). Данные были проанализированы и аппроксимированы с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad).

Биологические анализы in vitro

Для анализов роста, не зависящего от закрепления, клетки суспендировали в соответствующей культуральной среде с добавлением 2 % FBS (фетальная бычья сыворотка) и 0,5 % агарозы Seaplaque (кат.# 50100 BMA, Rockland, ME) и высевали в 48-луночные планшеты (500 клеток/лунку) поверх 1 % агарозы. Свежую среду, содержащую препараты, вносили дважды в неделю. Клетки A549 обрабатывали 1 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации, в присутствии 30 нг/мл HGF. Клетки U87-MG обрабатывали 0,5 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации. Колонии окрашивали солями тетразолия (кат.# T01380 Sigma-Aldrich) через 12 дней культивирования. Рост колоний определяли с использованием программного обеспечения Metamorph (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Для анализа клеточной инвазии клетки HPAF-II (1,5 × 10⁵/на лунку) суспендировали в бессывороточной культуральной среде в присутствии 0,5 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации, и высевали в верхний отсек камер системы Трансвелл, предварительно покрытых 30 мкг/лунку Matrigel Matrix (кат.# 354234 Corning Incorporated, Нью-Йорк). Культуральная среда с добавлением 2 % FBS и 12,5 нг/мл HGF была добавлена в нижнее отделение камеры. Через 24 ч клетки на верхней стороне фильтров трансвелл механически удаляли, в то время как клетки, мигрировавшие через мембрану, фиксировали 11 % глутаральдегидом (кат.# 340855 Sigma-Aldrich) и окрашивали 0,1 % кристаллическим фиолетовым (кат. # C3886 Sigma-Aldrich). Инвазию клеток количественно оценивали с помощью программного обеспечения Image-J. Для анализа клеточного рассеяния клетки HPAF-II (8000 на лунку) высевали в 96-луночные планшеты в полную культуральную среду. Через 6 ч добавляли увеличивающиеся концентрации (0-4 мкМ) MvDN30 или decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации 1:1. Еще через 24 часа клетки стимулировали 6,25 нг/мл HGF в течение 20 часов. Клетки фиксировали 11 % глутаровым альдегидом и окрашивали 0,1 % кристаллическим фиолетовым. Для анализа подвижности клеток в реальном времени клетки HPAF-II высевали в E-планшеты (8000 на лунку; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) и обрабатывали, как указано выше; при нанесении слитые белки тестировали в концентрации 3 мкМ. Электрический импеданс контролировали непрерывно в течение 48 часов с записью данных каждые десять минут с использованием устройства X-Celligence RTCA (Roche Diagnostic). Значения выражены в виде индекса клеток, нормализованного в момент добавления HGF.

Для роста клеток, зависимого от закрепления, клетки EBC-1 высевали по 2000 клеток/лунку в 96-луночный планшет в 5 % культуральной среде FBS. Через 24 часа среду заменяли свежей средой с 5 % FBS и тестируемыми молекулами (возрастающие концентрации - от 0,001 до 3 мкМ). Жизнеспособность клеток оценивали через 72 часа с помощью CellTiter-Glo (кат.# G7573 Promega Corp., Мэдисон, Висконсин) в соответствии с инструкциями производителя. Хемолюминесценцию детектировали с помощью VICTOR X4.

Иммунофлуоресцентный анализ

Иммунофлуоресцентный анализ опухолевых клеток и тканей выполняли, как описано^16,25. Окрашивание проводили первичным антителом против фосфо-Tyr^1234/1235 против MET (D26) и выявляли вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 555 (кат.# A31570 Thermo Fisher Scientific). Клетки контрастировали с 488-конъюгированным фаллоидином (кат.# A12379 Thermo Fisher Scientific). Все изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SP5 AOBS (Leica Microsystems). Параметры получения иммунофлуоресценции оставались постоянными для каждой клеточной линии или опухолевой ткани. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) оценивалась с помощью программного обеспечения ImageJ, измеряли среднюю интенсивность пикселей в каждом канале, за вычетом фона. Для клеточных линий MFI фосфоМЕТ нормализовали по фаллоидину, тогда как для опухолей все сигналы нормализовали по DAPI.

Эксперименты in vivo

Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по этике экспериментов на животных Fondazione Piemontese per la Ricerca sul Cancro и Министерством здравоохранения Италии. Мыши NOD-SCID были приобретены у Charles River (Calco, Италия); hHGF-Ki SCID мышей) были получены от AVEO Pharmaceuticals, Кембридж, Массачусетс.

Клетки U87-MG вводили подкожно (2 × 10⁶/мышь) в правый бок самок мышей NOD-SCID. Рост опухоли контролировали измерением штангенциркулем дважды в неделю. Объем опухоли рассчитывали по формуле: V = 4/3 π (x/2)(y/2)(z/2), где x, y и z - высота, ширина и глубина опухолевой массы. Когда опухоли достигли объема 80-100 мм³ (день 0), мышей разделяли на четыре гомогенные группы и дважды в неделю вводили внутриопухолевую инъекцию: носитель (n = 10); MvDN30, 12,5 мкг (n = 9); K842E, 125 мкг (n = 9); комбинация последних (n = 10). После 22 дней обработки мышей умерщвляли, опухоли вырезали и заливали парафином для гистологического анализа. Кратное увеличение объема опухоли рассчитывали как отношение между значением на 22 день и значением на 0 день.

Клетки HPAF-II или Capan-1 трансдуцировали 100 нг/мл p24 лентивирусных векторов, несущих ген люциферазы под контролем промотора CMV, как описано¹. Экспрессирующие люциферазу клетки HPAF-II (10⁴/мышь) инъецировали в поджелудочную железу самок мышей hHGF-KI SCID в возрасте от 4 до 6 недель. Через два дня мышам внутрибрюшинно вводили XenoLight D-люциферин (150 мг/кг; кат.# 122799 Perkin Elmer), разделенных на гомогенные группы на основе сигнала биолюминесценции с использованием аппарата IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer) и случайным образом распределенных по 4 группам обработки: носитель (n = 10); MvDN30 (10 мг/кг, n = 6); decoyMET^K842E (10 мг/кг, n = 6); MvDN30 + decoyMET^K842E (10 + 10 мг/кг, n = 6). Обработку проводили ежедневно (MvDN30) или каждые два дня (decoyMET^K842E) путем внутрибрюшинной инъекции. При умерщвлении после пяти недель обработки опухоли и легкие были эксплантированы. Опухоли помещали в парафин или реагент ОСТ и обрабатывали для иммуногистохимического или иммунофлуоресцентного анализа соответственно. Пролиферацию опухолевых клеток определяли с использованием моноклонального антитела против Ki67 (MIB-1, кат.# M724001-2 Agilent Technologies), как описано ранее¹⁸. Легкие обрабатывали для гистохимического анализа, а микрометастазы оценивали с помощью световой микроскопии на залитых парафином и окрашенных НЕ непоследовательных срезах. Для каждой мыши было проанализировано десять срезов; подсчитывали метастатические очаги и их площадь количественно определяли с помощью программного обеспечения ImageJ.

Экспрессирующий люциферазу Capan-1 (10⁶/мышь) инъецировали в поджелудочную железу самок мышей SCID hHGF-Ki в возрасте от 4 до 6 недель. Стратификацию мышей проводили, как указано выше. Группы обработки: носитель (n= 14), MvDN30 и decoyMET^K842E в комбинации (10 + 10 мг/кг; группа 1, n = 4; группа 2, n = 6), scMvDN30_ K842E_L60 (10 мг/кг; n= 5), K842E scMvDN30_L60 (10 мг/кг; n = 4), scMvDN30_K842E_L134 (10 мг/кг; n= 6), K842E_scMvDN30_L134 (10 мг/кг; n = 5). Обработку проводили ежедневно (MvDN30) или каждые два дня (decoyMET^K842E) путем внутрибрюшинной инъекции. После пяти недель обработки животных умерщвляли и собирали печень для измерения сигналов биолюминесценции по спектру IVIS. Мышей считали метастазоположительными, когда биолюминесценция, обнаруженная в печени с помощью IVIS Spectrum, превышала 10⁵ фотонов в секунду.

Статистический анализ

Среднее, стандартное отклонение (SD) и стандартная ошибка среднего (SEM) были рассчитаны с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон). Для расчета значений K_d данные анализов ELISA были проанализированы и подогнаны в соответствии с нелинейной регрессией, кривой гиперболы связывания одного сайта, с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния). Для расчета значений IC₅₀ данные анализов пролиферации были проанализированы и подогнаны в соответствии с нелинейной регрессией, сигмоидальной кривой зависимости реакции от дозы, с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Статистическую значимость определяли с использованием двустороннего парного критерия Стьюдента. Все эксперименты повторяли не менее трех раз (биологические повторы). Эксперименты in vivo повторяли дважды. На фигурах показан один репрезентативный эксперимент.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> МЕТИС ПРИСИЖН МЕДСИН СБ С.Р.Л.

<120> КОМБИНАЦИЯ АНТИТЕЛА ПРОТИВ HGFR И HEGFR ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛИ

И/ИЛИ МЕТАСТАЗА

<130> BIT20544-CF

<150> IT 102018000003875

<151> 2018-03-22

<160> 46

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 1

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 3

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 2

Ala Ala Ser

1

<210> 3

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 3

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 5

Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 6

Ala Ser Arg Gly Tyr

1 5

<210> 7

<211> 238

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи VL-CL

<400> 7

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 8

<211> 281

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи VH-CH1

<400> 8

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gly His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

115 120 125

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

130 135 140

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

145 150 155 160

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

165 170 175

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

180 185 190

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

195 200 205

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

210 215 220

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly

225 230 235 240

Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His

245 250 255

Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

260 265 270

Gly Ala Ala His His His His His His

275 280

<210> 9

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VL-CDR1

<400> 9

caaagtgttg attatgatgg tggtagttat 30

<210> 10

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VL-CDR2

<400> 10

gctgcatcc 9

<210> 11

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VL-CDR3

<400> 11

cagcaaagtt atgaagaccc gctcacg 27

<210> 12

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VH-CDR1

<400> 12

ggctacacct tcaccagtta ctgg 24

<210> 13

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VH-CDR2

<400> 13

attaatccta gcagcggtcg tact 24

<210> 14

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VH-CDR3

<400> 14

gcaagtaggg gctac 15

<210> 15

<211> 717

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность легкой цепи VL-CL

<400> 15

atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 180

caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa ccttgaatct 240

ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 300

cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga agacccgctc 360

acgttcggtg ctggtaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 717

<210> 16

<211> 846

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи VH-CH1

<400> 16

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60

gtccaactgc aacagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240

gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300

caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360

tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagctagca cgaagggccc atcggtcttc 420

cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 480

aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540

gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600

accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 660

agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacaggt 720

gccgcatgga gccaccccca gttcgaaaaa ggggccgcat ggagccaccc ccagttcgaa 780

aaaggggccg catggagcca cccccagttc gaaaaagggg ccgcacacca tcaccatcac 840

cattag 846

<210> 17

<211> 562

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> scFab

<400> 17

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly

225 230 235 240

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr

245 250 255

Gly Thr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly

275 280 285

Thr Ala Thr Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ser Gln Leu Gln Gln Pro Gly

290 295 300

Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala

305 310 315 320

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg

325 330 335

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly

340 345 350

Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val

355 360 365

Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser

370 375 380

Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln

385 390 395 400

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

405 410 415

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

420 425 430

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

435 440 445

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

450 455 460

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

465 470 475 480

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

485 490 495

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

500 505 510

Lys Thr His Thr Thr Gly Thr Arg Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln

515 520 525

Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala

530 535 540

Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His His His

545 550 555 560

His His

<210> 18

<211> 1692

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность scFv

<400> 18

atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 180

caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa ccttgaatct 240

ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 300

cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga agacccgctc 360

acgttcggtg ctggtaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgtggtggt 720

tcttcgggtt caggctcggg ctccacaggt acatcgtcat cgggtacagg tacttcagct 780

ggcacaacgg gtacctccgc atctacttcc ggttcaggct ccggaggcgg cggcggctcg 840

ggtggtggtg gatctgccgg cggaaccgca accgcaggcg cttcttctgg ttccgtccaa 900

ctgcagcagc ctgggactga actggtgaag cctggggctt cagtgaagct gtcctgcaag 960

gcttctggct acaccttcac cagttactgg atacactggg tgaagcagag gcctggacaa 1020

ggccttgagt ggattggaga gattaatcct agcagcggtc gtactaacta caacgagaaa 1080

ttcaagaaca aggtcacagt gactgtagac aaatcttcca ccacagccta catgcaactc 1140

agcaacctga catctgagga ctctgcggtc tattactgtg caagtagggg ctactggggc 1200

caaggcacca ctctcacagt ctcctcagct agcacgaagg gcccatcggt cttccccctg 1260

gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 1320

tacttccccg aacccgtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 1380

accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 1440

ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 1500

accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac aaccggtacg 1560

cgtggtgccg catggagcca cccccagttc gaaaaagggg ccgcatggag ccacccccag 1620

ttcgaaaaag gggccgcatg gagccacccc cagttcgaaa aaggggccgc acaccatcac 1680

catcaccatt ag 1692

<210> 19

<211> 976

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<400> 19

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

755 760 765

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

770 775 780

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785 790 795 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

805 810 815

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

820 825 830

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val

835 840 845

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

850 855 860

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865 870 875 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

885 890 895

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

900 905 910

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

915 920 925

Gln Asn Phe Thr Ala Ser Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

930 935 940

Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp

945 950 955 960

Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His His His His His

965 970 975

<210> 20

<211> 976

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Мутированная внеклеточная часть HGFR человека

<400> 20

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

755 760 765

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

770 775 780

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785 790 795 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

805 810 815

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

820 825 830

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Glu Pro Phe Glu Lys Pro Val

835 840 845

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

850 855 860

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865 870 875 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

885 890 895

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

900 905 910

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

915 920 925

Gln Asn Phe Thr Ala Ser Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

930 935 940

Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp

945 950 955 960

Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His His His His His

965 970 975

<210> 21

<211> 2931

<212> ДНК

<213> homo sapiens

<400> 21

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360

gttgtggaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggttgc 1560

agacatttcc agtcttgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680

tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740

ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800

actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860

acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920

tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtcgatcc tgtaataaca 1980

agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040

tacctaaaca gtgggaactc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100

agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160

gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220

gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280

acaggtgttg ggaaaaacct gaactcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340

gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400

tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460

ttcatgttag atggcatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520

tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580

aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640

agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700

ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760

ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagcta gcggtgccgc atggagccac 2820

ccccagttcg aaaaaggggc cgcatggagc cacccccagt tcgaaaaagg ggccgcatgg 2880

agccaccccc agttcgaaaa aggggccgca caccatcacc atcaccatta g 2931

<210> 22

<211> 2931

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность мутированной внеклеточной части HGFR

человека

<400> 22

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360

gttgtggaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggttgc 1560

agacatttcc agtcttgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680

tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740

ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800

actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860

acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920

tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtcgatcc tgtaataaca 1980

agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040

tacctaaaca gtgggaactc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100

agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160

gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220

gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280

acaggtgttg ggaaaaacct gaactcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340

gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400

tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460

ttcatgttag atggcatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520

tttgagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580

aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640

agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700

ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760

ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagcta gcggtgccgc atggagccac 2820

ccccagttcg aaaaaggggc cgcatggagc cacccccagt tcgaaaaagg ggccgcatgg 2880

agccaccccc agttcgaaaa aggggccgca caccatcacc atcaccatta g 2931

<210> 23

<211> 1518

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> decoyMET-линкер-антитело

аминокислотная последовательность K842E-линкер L45-scMvDN30

<400> 23

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

755 760 765

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

770 775 780

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785 790 795 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

805 810 815

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

820 825 830

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Glu Pro Phe Glu Lys Pro Val

835 840 845

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

850 855 860

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865 870 875 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

885 890 895

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

900 905 910

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

915 920 925

Gln Asn Phe Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

930 935 940

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala

945 950 955 960

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

965 970 975

Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu

980 985 990

Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr

995 1000 1005

Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln

1010 1015 1020

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly

1025 1030 1035

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1040 1045 1050

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr

1055 1060 1065

Cys Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

1070 1075 1080

Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

1085 1090 1095

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

1100 1105 1110

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

1115 1120 1125

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

1130 1135 1140

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

1145 1150 1155

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

1160 1165 1170

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

1175 1180 1185

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser

1190 1195 1200

Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala Gly

1205 1210 1215

Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly

1220 1225 1230

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Ala Thr

1235 1240 1245

Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ser Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr

1250 1255 1260

Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala

1265 1270 1275

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln

1280 1285 1290

Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser

1295 1300 1305

Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr

1310 1315 1320

Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

1325 1330 1335

Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg

1340 1345 1350

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser

1355 1360 1365

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

1370 1375 1380

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

1385 1390 1395

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

1400 1405 1410

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

1415 1420 1425

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

1430 1435 1440

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

1445 1450 1455

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

1460 1465 1470

Thr Thr Arg Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly

1475 1480 1485

Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser

1490 1495 1500

His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His His His His His

1505 1510 1515

<210> 24

<211> 1533

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> decoyMET-линкер-антитело

аминокислотная последовательность K842E-линкер L60-scMvDN30

<400> 24

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

755 760 765

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

770 775 780

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785 790 795 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

805 810 815

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

820 825 830

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Glu Pro Phe Glu Lys Pro Val

835 840 845

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

850 855 860

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865 870 875 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

885 890 895

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

900 905 910

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

915 920 925

Gln Asn Phe Thr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly

930 935 940

Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ser

945 950 955 960

Ala Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

965 970 975

Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ser

980 985 990

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

995 1000 1005

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr

1010 1015 1020

Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln

1025 1030 1035

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly

1040 1045 1050

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1055 1060 1065

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr

1070 1075 1080

Cys Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

1085 1090 1095

Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

1100 1105 1110

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

1115 1120 1125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

1130 1135 1140

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

1145 1150 1155

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

1160 1165 1170

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

1175 1180 1185

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

1190 1195 1200

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser

1205 1210 1215

Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala Gly

1220 1225 1230

Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly

1235 1240 1245

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Ala Thr

1250 1255 1260

Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ser Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr

1265 1270 1275

Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala

1280 1285 1290

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln

1295 1300 1305

Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser

1310 1315 1320

Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr

1325 1330 1335

Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

1340 1345 1350

Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg

1355 1360 1365

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser

1370 1375 1380

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

1385 1390 1395

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

1400 1405 1410

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

1415 1420 1425

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

1430 1435 1440

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

1445 1450 1455

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

1460 1465 1470

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

1475 1480 1485

Thr Thr Arg Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly

1490 1495 1500

Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser

1505 1510 1515

His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His His His His His

1520 1525 1530

<210> 25

<211> 1607

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> decoyMET-линкер-антитело

аминокислотная последовательность K842E-линкер L134-scMvDN30

<400> 25

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

755 760 765

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

770 775 780

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785 790 795 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

805 810 815

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

820 825 830

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Glu Pro Phe Glu Lys Pro Val

835 840 845

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

850 855 860

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865 870 875 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

885 890 895

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

900 905 910

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

915 920 925

Gln Asn Phe Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

930 935 940

Gly Gly Ser Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr Tyr Lys

945 950 955 960

Gln Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala Leu Glu

965 970 975

Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr

980 985 990

Tyr Lys Gln Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala

995 1000 1005

Leu Glu Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly

1010 1015 1020

Asn Ala Tyr Tyr Lys Gln Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Asp

1025 1030 1035

Tyr Gln Lys Ala Leu Glu Leu Asp Pro Asn Asn Gly Gly Gly Gly

1040 1045 1050

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ile

1055 1060 1065

Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

1070 1075 1080

Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

1085 1090 1095

Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

1100 1105 1110

Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile

1115 1120 1125

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

1130 1135 1140

Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

1145 1150 1155

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

1160 1165 1170

Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

1175 1180 1185

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val

1190 1195 1200

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

1205 1210 1215

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

1220 1225 1230

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr

1235 1240 1245

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

1250 1255 1260

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

1265 1270 1275

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1280 1285 1290

Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala Gly Thr

1295 1300 1305

Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly

1310 1315 1320

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala

1325 1330 1335

Gly Ala Ser Ser Gly Ser Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu

1340 1345 1350

Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

1355 1360 1365

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg

1370 1375 1380

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser

1385 1390 1395

Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val

1400 1405 1410

Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn

1415 1420 1425

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly

1430 1435 1440

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

1445 1450 1455

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

1460 1465 1470

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

1475 1480 1485

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

1490 1495 1500

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

1505 1510 1515

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

1520 1525 1530

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

1535 1540 1545

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

1550 1555 1560

Thr Arg Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala

1565 1570 1575

Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His

1580 1585 1590

Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His His His His His

1595 1600 1605

<210> 26

<211> 1514

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> антитело-линкер-decoyMET

аминокислотная последовательность scMvDN30-линкер L45-K842E

<400> 26

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly

225 230 235 240

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr

245 250 255

Gly Thr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly

275 280 285

Thr Ala Thr Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ser Val Gln Leu Gln Gln Pro

290 295 300

Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys

305 310 315 320

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln

325 330 335

Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser

340 345 350

Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr

355 360 365

Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr

370 375 380

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly

385 390 395 400

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

405 410 415

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

420 425 430

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

435 440 445

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

450 455 460

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

465 470 475 480

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

485 490 495

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

500 505 510

Asp Lys Thr His Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

515 520 525

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala

530 535 540

Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala

545 550 555 560

Lys Ala Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn

565 570 575

Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn

580 585 590

Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile

595 600 605

Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr

610 615 620

Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser

625 630 635 640

Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met

645 650 655

Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly

660 665 670

Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His

675 680 685

Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile

690 695 700

Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala

705 710 715 720

Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly

725 730 735

Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile

740 745 750

Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr

755 760 765

Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro

770 775 780

Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu

785 790 795 800

Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile

805 810 815

Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met

820 825 830

Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys

835 840 845

Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly

850 855 860

Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu

865 870 875 880

Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp

885 890 895

Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe

900 905 910

Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr

915 920 925

Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser

930 935 940

Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr

945 950 955 960

Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu

965 970 975

Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn

980 985 990

Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser

995 1000 1005

Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro

1010 1015 1020

Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly

1025 1030 1035

Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu

1040 1045 1050

Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu

1055 1060 1065

Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys

1070 1075 1080

Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

1085 1090 1095

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu

1100 1105 1110

Glu Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe

1115 1120 1125

Arg Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu

1130 1135 1140

Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn

1145 1150 1155

Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn

1160 1165 1170

Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser

1175 1180 1185

Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys

1190 1195 1200

Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn

1205 1210 1215

Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys

1220 1225 1230

Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu Cys Tyr

1235 1240 1245

Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu Lys

1250 1255 1260

Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu

1265 1270 1275

Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser

1280 1285 1290

Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val

1295 1300 1305

Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn

1310 1315 1320

Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

1325 1330 1335

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu

1340 1345 1350

Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr

1355 1360 1365

Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Glu Pro Phe Glu

1370 1375 1380

Lys Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile

1385 1390 1395

Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu

1400 1405 1410

Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu

1415 1420 1425

Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser

1430 1435 1440

Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu

1445 1450 1455

Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe Thr Ala Ser Gly

1460 1465 1470

Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser

1475 1480 1485

His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe

1490 1495 1500

Glu Lys Gly Ala Ala His His His His His His

1505 1510

<210> 27

<211> 1529

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> антитело-линкер-decoyMET

аминокислотная последовательность scMvDN30-линкер L60-K842E

<400> 27

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly

225 230 235 240

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr

245 250 255

Gly Thr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly

275 280 285

Thr Ala Thr Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ser Val Gln Leu Gln Gln Pro

290 295 300

Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys

305 310 315 320

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln

325 330 335

Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser

340 345 350

Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr

355 360 365

Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr

370 375 380

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly

385 390 395 400

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

405 410 415

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

420 425 430

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

435 440 445

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

450 455 460

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

465 470 475 480

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

485 490 495

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

500 505 510

Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr

515 520 525

Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Thr

530 535 540

Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly

545 550 555 560

Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Ser Ser Gly

565 570 575

Ser Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn Met

580 585 590

Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val

595 600 605

Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr

610 615 620

Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly

625 630 635 640

Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser

645 650 655

Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala

660 665 670

Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser

675 680 685

Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr

690 695 700

Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu

705 710 715 720

Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys

725 730 735

Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn

740 745 750

Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser

755 760 765

Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp

770 775 780

Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile

785 790 795 800

Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr

805 810 815

Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile

820 825 830

Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro

835 840 845

Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys

850 855 860

Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala

865 870 875 880

Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe

885 890 895

Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg

900 905 910

Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn

915 920 925

Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly

930 935 940

Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser

945 950 955 960

Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala

965 970 975

Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu

980 985 990

Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu

995 1000 1005

Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser

1010 1015 1020

Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro

1025 1030 1035

Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly

1040 1045 1050

Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu

1055 1060 1065

Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu

1070 1075 1080

Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys

1085 1090 1095

Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

1100 1105 1110

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu

1115 1120 1125

Glu Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe

1130 1135 1140

Arg Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu

1145 1150 1155

Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn

1160 1165 1170

Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn

1175 1180 1185

Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser

1190 1195 1200

Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys

1205 1210 1215

Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn

1220 1225 1230

Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys

1235 1240 1245

Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu Cys Tyr

1250 1255 1260

Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu Lys

1265 1270 1275

Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu

1280 1285 1290

Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser

1295 1300 1305

Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val

1310 1315 1320

Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn

1325 1330 1335

Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

1340 1345 1350

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu

1355 1360 1365

Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr

1370 1375 1380

Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Glu Pro Phe Glu

1385 1390 1395

Lys Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile

1400 1405 1410

Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu

1415 1420 1425

Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu

1430 1435 1440

Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser

1445 1450 1455

Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu

1460 1465 1470

Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe Thr Ala Ser Gly

1475 1480 1485

Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser

1490 1495 1500

His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe

1505 1510 1515

Glu Lys Gly Ala Ala His His His His His His

1520 1525

<210> 28

<211> 1603

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> антитело-линкер-decoyMET

аминокислотная последовательность scMvDN30-линкер L134-K842E

<400> 28

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly

225 230 235 240

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr

245 250 255

Gly Thr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly

275 280 285

Thr Ala Thr Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ser Val Gln Leu Gln Gln Pro

290 295 300

Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys

305 310 315 320

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln

325 330 335

Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser

340 345 350

Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr

355 360 365

Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr

370 375 380

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly

385 390 395 400

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

405 410 415

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

420 425 430

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

435 440 445

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

450 455 460

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

465 470 475 480

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

485 490 495

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

500 505 510

Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

515 520 525

Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr Tyr

530 535 540

Lys Gln Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala Leu

545 550 555 560

Glu Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala

565 570 575

Tyr Tyr Lys Gln Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys

580 585 590

Ala Leu Glu Leu Asp Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly

595 600 605

Asn Ala Tyr Tyr Lys Gln Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Asp Tyr

610 615 620

Gln Lys Ala Leu Glu Leu Asp Pro Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly

625 630 635 640

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Cys Lys Glu Ala

645 650 655

Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn

660 665 670

Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His

675 680 685

Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp

690 695 700

Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro

705 710 715 720

Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly

725 730 735

Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr

740 745 750

Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys

755 760 765

Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu

770 775 780

Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro

785 790 795 800

Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys

805 810 815

Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr

820 825 830

Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu

835 840 845

Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val

850 855 860

Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe

865 870 875 880

Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu

885 890 895

Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn

900 905 910

Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr

915 920 925

Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu

930 935 940

Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile

945 950 955 960

Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser

965 970 975

Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe

980 985 990

Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn

995 1000 1005

Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His

1010 1015 1020

Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala

1025 1030 1035

Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg

1040 1045 1050

Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser

1055 1060 1065

Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly

1070 1075 1080

Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly

1085 1090 1095

Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro Val

1100 1105 1110

Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly Tyr

1115 1120 1125

Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu Asn

1130 1135 1140

Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser

1145 1150 1155

Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val

1160 1165 1170

Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys

1175 1180 1185

Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

1190 1195 1200

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg

1205 1210 1215

Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly

1220 1225 1230

Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr

1235 1240 1245

Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met

1250 1255 1260

Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr

1265 1270 1275

Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr

1280 1285 1290

Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr

1295 1300 1305

Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr

1310 1315 1320

Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr

1325 1330 1335

Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu Lys Ile

1340 1345 1350

Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu Asp

1355 1360 1365

Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser Gly

1370 1375 1380

Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val Ser

1385 1390 1395

Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe

1400 1405 1410

Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys

1415 1420 1425

Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

1430 1435 1440

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe

1445 1450 1455

Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Glu Pro Phe Glu Lys

1460 1465 1470

Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys

1475 1480 1485

Gly Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys

1490 1495 1500

Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala

1505 1510 1515

Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu

1520 1525 1530

Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly

1535 1540 1545

Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe Thr Ala Ser Gly Ala

1550 1555 1560

Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His

1565 1570 1575

Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

1580 1585 1590

Lys Gly Ala Ala His His His His His His

1595 1600

<210> 29

<211> 4557

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> decoyMET-линкер-антитело

нуклеотидная последовательность K842E-линкер L45-scMvDN30

<400> 29

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360

gttgtggaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggttgc 1560

agacatttcc agtcttgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680

tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740

ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800

actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860

acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920

tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtcgatcc tgtaataaca 1980

agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040

tacctaaaca gtgggaactc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100

agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160

gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220

gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280

acaggtgttg ggaaaaacct gaactcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340

gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400

tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460

ttcatgttag atggcatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520

tttgagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580

aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640

agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700

ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760

ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagctg aagctgcagc caaagaagct 2820

gcagccaaag aggccgcagc taaggaagcc gcagcaaaag ctgctgctga agctgcagcc 2880

aaagaagctg cagccaaaga ggccgcagct aaggaagccg cagcaaaagc tgacattgtg 2940

ctgacccaat ctccagcttc tttggctgtg tctctagggc agagggccac catctcctgc 3000

aaggccagcc aaagtgttga ttatgatggt ggtagttata tgagttggtt ccaacagaga 3060

ccaggacagc cacccaaact cctcatctct gctgcatcca accttgaatc tggcatccca 3120

gccaggttta gtggcagtgg ctctgggaca gacttcaccc tcaatatcca tcctgtggag 3180

gaggaggatg ttgcaaccta ttactgtcag caaagttatg aagacccgct cacgttcggt 3240

gctggtacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 3300

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 3360

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 3420

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 3480

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 3540

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtggtgg ttcttcgggt 3600

tcaggctcgg gctccacagg tacatcgtca tcgggtacag gtacttcagc tggcacaacg 3660

ggtacctccg catctacttc cggttcaggc tccggaggcg gcggcggctc gggtggtggt 3720

ggatctgccg gcggaaccgc aaccgcaggc gcttcttctg gttccgtcca actgcagcag 3780

cctgggactg aactggtgaa gcctggggct tcagtgaagc tgtcctgcaa ggcttctggc 3840

tacaccttca ccagttactg gatacactgg gtgaagcaga ggcctggaca aggccttgag 3900

tggattggag agattaatcc tagcagcggt cgtactaact acaacgagaa attcaagaac 3960

aaggtcacag tgactgtaga caaatcttcc accacagcct acatgcaact cagcaacctg 4020

acatctgagg actctgcggt ctattactgt gcaagtaggg gctactgggg ccaaggcacc 4080

actctcacag tctcctcagc tagcacgaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 4140

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 4200

gaacccgtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 4260

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 4320

agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 4380

gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca caacgcgtgg tgccgcatgg 4440

agccaccccc agttcgaaaa aggggccgca tggagccacc cccagttcga aaaaggggcc 4500

gcatggagcc acccccagtt cgaaaaaggg gccgcacacc atcaccatca ccattag 4557

<210> 30

<211> 4602

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> decoyMET-линкер-антитело

нуклеотидная последовательность K842E-линкер L60-scMvDN30

<400> 30

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360

gttgtggaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggttgc 1560

agacatttcc agtcttgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680

tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740

ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800

actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860

acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920

tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtcgatcc tgtaataaca 1980

agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040

tacctaaaca gtgggaactc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100

agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160

gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220

gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280

acaggtgttg ggaaaaacct gaactcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340

gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400

tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460

ttcatgttag atggcatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520

tttgagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580

aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640

agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700

ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760

ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggtg gttcttcggg ttcaggctcg 2820

ggctccacag gtacatcgtc atcgggtaca ggtacttcag ctggcacaac gggtacctcc 2880

gcatctactt ccggttcagg ctccggaggc ggcggcggct cgggtggtgg tggatctgcc 2940

ggcggaaccg caaccgcagg cgcttcttct ggttccgaca ttgtgctgac ccaatctcca 3000

gcttctttgg ctgtgtctct agggcagagg gccaccatct cctgcaaggc cagccaaagt 3060

gttgattatg atggtggtag ttatatgagt tggttccaac agagaccagg acagccaccc 3120

aaactcctca tctctgctgc atccaacctt gaatctggca tcccagccag gtttagtggc 3180

agtggctctg ggacagactt caccctcaat atccatcctg tggaggagga ggatgttgca 3240

acctattact gtcagcaaag ttatgaagac ccgctcacgt tcggtgctgg taccaaggtg 3300

gagatcaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 3360

ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 3420

aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 3480

gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 3540

gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 3600

gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt ggtggttctt cgggttcagg ctcgggctcc 3660

acaggtacat cgtcatcggg tacaggtact tcagctggca caacgggtac ctccgcatct 3720

acttccggtt caggctccgg aggcggcggc ggctcgggtg gtggtggatc tgccggcgga 3780

accgcaaccg caggcgcttc ttctggttcc gtccaactgc agcagcctgg gactgaactg 3840

gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt 3900

tactggatac actgggtgaa gcagaggcct ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt 3960

aatcctagca gcggtcgtac taactacaac gagaaattca agaacaaggt cacagtgact 4020

gtagacaaat cttccaccac agcctacatg caactcagca acctgacatc tgaggactct 4080

gcggtctatt actgtgcaag taggggctac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 4140

tcagctagca cgaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 4200

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgacggtg 4260

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 4320

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 4380

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 4440

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacaacg cgtggtgccg catggagcca cccccagttc 4500

gaaaaagggg ccgcatggag ccacccccag ttcgaaaaag gggccgcatg gagccacccc 4560

cagttcgaaa aaggggccgc acaccatcac catcaccatt ag 4602

<210> 31

<211> 4824

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> decoyMET-линкер-антитело

нуклеотидная последовательность K842E-линкер L134-scMvDN30

<400> 31

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360

gttgtggaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggttgc 1560

agacatttcc agtcttgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680

tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740

ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800

actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860

acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920

tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtcgatcc tgtaataaca 1980

agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040

tacctaaaca gtgggaactc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100

agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160

gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220

gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280

acaggtgttg ggaaaaacct gaactcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340

gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400

tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460

ttcatgttag atggcatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520

tttgagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580

aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640

agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700

ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760

ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggtg gtggtggttc tggtggtggt 2820

ggttcaggcg gcggcggctc ggcagaggca tggtataatc tcgggaacgc atactacaaa 2880

cagggcgatt atcagaaggc tatcgaatac taccaaaaag cactcgaact ggaccccaat 2940

aacgcggagg catggtacaa tctcgggaat gcgtactata agcagggtga ctaccagaag 3000

gccattgaat actaccaaaa ggcgcttgaa ctggacccga acaacgccga ggcctggtat 3060

aacctgggga atgcttatta caagcagggg gattatcaaa aggcaataga agactaccag 3120

aaggccctcg aattggaccc taacaatggt ggtggtggtt ctggtggtgg tggttcaggc 3180

ggcggcggct cgggcggaga cattgtgctg acccaatctc cagcttcttt ggctgtgtct 3240

ctagggcaga gggccaccat ctcctgcaag gccagccaaa gtgttgatta tgatggtggt 3300

agttatatga gttggttcca acagagacca ggacagccac ccaaactcct catctctgct 3360

gcatccaacc ttgaatctgg catcccagcc aggtttagtg gcagtggctc tgggacagac 3420

ttcaccctca atatccatcc tgtggaggag gaggatgttg caacctatta ctgtcagcaa 3480

agttatgaag acccgctcac gttcggtgct ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg 3540

gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 3600

tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 3660

gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 3720

agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 3780

gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 3840

aggggagagt gtggtggttc ttcgggttca ggctcgggct ccacaggtac atcgtcatcg 3900

ggtacaggta cttcagctgg cacaacgggt acctccgcat ctacttccgg ttcaggctcc 3960

ggaggcggcg gcggctcggg tggtggtgga tctgccggcg gaaccgcaac cgcaggcgct 4020

tcttctggtt ccgtccaact gcagcagcct gggactgaac tggtgaagcc tggggcttca 4080

gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac accttcacca gttactggat acactgggtg 4140

aagcagaggc ctggacaagg ccttgagtgg attggagaga ttaatcctag cagcggtcgt 4200

actaactaca acgagaaatt caagaacaag gtcacagtga ctgtagacaa atcttccacc 4260

acagcctaca tgcaactcag caacctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 4320

agtaggggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagctag cacgaagggc 4380

ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 4440

ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa cccgtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 4500

ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 4560

agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 4620

aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 4680

actcacacaa cgcgtggtgc cgcatggagc cacccccagt tcgaaaaagg ggccgcatgg 4740

agccaccccc agttcgaaaa aggggccgca tggagccacc cccagttcga aaaaggggcc 4800

gcacaccatc accatcacca ttag 4824

<210> 32

<211> 4583

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> антитело-линкер-decoyMET

нуклеотидная последовательность scMvDN30-линкер L45-K842E

<400> 32

ggatcccccg gggccaccat ggagacagac acaatcctgc tatgggtgct gctgctctgg 60

gttccaggct ccactggtga cattgtgctg acccaatctc cagcttcttt ggctgtgtct 120

ctagggcaga gggccaccat ctcctgcaag gccagccaaa gtgttgatta tgatggtggt 180

agttatatga gttggttcca acagagacca ggacagccac ccaaactcct catctctgct 240

gcatccaacc ttgaatctgg catcccagcc aggtttagtg gcagtggctc tgggacagac 300

ttcaccctca atatccatcc tgtggaggag gaggatgttg caacctatta ctgtcagcaa 360

agttatgaag acccgctcac gttcggtgct ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg 420

gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480

tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 540

gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 600

agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 660

gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 720

aggggagagt gtggtggttc ttcgggttca ggctcgggct ccacaggtac atcgtcatcg 780

ggtacaggta cttcagctgg cacaacgggt acctccgcat ctacttccgg ttcaggctcc 840

ggaggcggcg gcggctcggg tggtggtgga tctgccggcg gaaccgcaac cgcaggcgct 900

tcttctggtt ccgtccaact gcagcagcct gggactgaac tggtgaagcc tggggcttca 960

gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac accttcacca gttactggat acactgggtg 1020

aagcagaggc ctggacaagg ccttgagtgg attggagaga ttaatcctag cagcggtcgt 1080

actaactaca acgagaaatt caagaacaag gtcacagtga ctgtagacaa atcttccacc 1140

acagcctaca tgcaactcag caacctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 1200

agtaggggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagcaag cacgaagggc 1260

ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 1320

ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa cccgtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 1380

ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 1440

agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 1500

aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 1560

actcacacag ctgaagctgc agccaaagaa gctgcagcca aagaggccgc agctaaggaa 1620

gccgcagcaa aagctgctgc tgaagctgca gccaaagaag ctgcagccaa agaggccgca 1680

gctaaggaag ccgcagcaaa agctgagtgt aaagaggcac tagcaaagtc cgagatgaat 1740

gtgaatatga agtatcagct tcccaacttc accgcggaaa cacccatcca gaatgtcatt 1800

ctacatgagc atcacatttt ccttggtgcc actaactaca tttatgtttt aaatgaggaa 1860

gaccttcaga aggttgctga gtacaagact gggcctgtgc tggaacaccc agattgtttc 1920

ccatgtcagg actgcagcag caaagccaat ttatcaggag gtgtttggaa agataacatc 1980

aacatggctc tagttgtgga cacctactat gatgatcaac tcattagctg tggcagcgtc 2040

aacagaggga cctgccagcg acatgtcttt ccccacaatc atactgctga catacagtcg 2100

gaggttcact gcatattctc cccacagata gaagagccca gccagtgtcc tgactgtgtg 2160

gtgagcgccc tgggagccaa agtcctttca tctgtaaagg accggttcat caacttcttt 2220

gtaggcaata ccataaattc ttcttatttc ccagatcatc cattgcattc gatatcagtg 2280

agaaggctaa aggaaacgaa agatggtttt atgtttttga cggaccagtc ctacattgat 2340

gttttacctg agttcagaga ttcttacccc attaagtatg tccatgcctt tgaaagcaac 2400

aattttattt acttcttgac ggtccaaagg gaaactctag atgctcagac ttttcacaca 2460

agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 2520

gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 2580

cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 2640

ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 2700

atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 2760

atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 2820

tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 2880

cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 2940

gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 3000

acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 3060

gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 3120

aaccaaaatg gctacacact ggttatcact gggaagaaga tcacgaagat cccattgaat 3180

ggcttgggtt gcagacattt ccagtcttgc agtcaatgcc tctctgcccc accctttgtt 3240

cagtgtggct ggtgccacga caaatgtgtg cgatcggagg aatgcctgag cgggacatgg 3300

actcaacaga tctgtctgcc tgcaatctac aaggttttcc caaatagtgc accccttgaa 3360

ggagggacaa ggctgaccat atgtggctgg gactttggat ttcggaggaa taataaattt 3420

gatttaaaga aaactagagt tctccttgga aatgagagct gcaccttgac tttaagtgag 3480

agcacgatga atacattgaa atgcacagtt ggtcctgcca tgaataagca tttcaatatg 3540

tccataatta tttcaaatgg ccacgggaca acacaataca gtacattctc ctatgtcgat 3600

cctgtaataa caagtatttc gccgaaatac ggtcctatgg ctggtggcac tttacttact 3660

ttaactggaa attacctaaa cagtgggaac tctagacaca tttcaattgg tggaaaaaca 3720

tgtactttaa aaagtgtgtc aaacagtatt cttgaatgtt ataccccagc ccaaaccatt 3780

tcaactgagt ttgctgttaa attgaaaatt gacttagcca accgagagac aagcatcttc 3840

agttaccgtg aagatcccat tgtctatgaa attcatccaa ccaaatcttt tattagtggt 3900

gggagcacaa taacaggtgt tgggaaaaac ctgaactcag ttagtgtccc gagaatggtc 3960

ataaatgtgc atgaagcagg aaggaacttt acagtggcat gtcaacatcg ctctaattca 4020

gagataatct gttgtaccac tccttccctg caacagctga atctgcaact ccccctgaaa 4080

accaaagcct ttttcatgtt agatggcatc ctttccaaat actttgatct catttatgta 4140

cataatcctg tgtttgagcc ttttgaaaag ccagtgatga tctcaatggg caatgaaaat 4200

gtactggaaa ttaagggaaa tgatattgac cctgaagcag ttaaaggtga agtgttaaaa 4260

gttggaaata agagctgtga gaatatacac ttacattctg aagccgtttt atgcacggtc 4320

cccaatgacc tgctgaaatt gaacagcgag ctaaatatag agtggaagca agcaatttct 4380

tcaaccgtcc ttggaaaagt aatagttcaa ccagatcaga atttcacagc tagcggtgcc 4440

gcatggagcc acccccagtt cgaaaaaggg gccgcatgga gccaccccca gttcgaaaaa 4500

ggggccgcat ggagccaccc ccagttcgaa aaaggggccg cacaccatca ccatcaccat 4560

taggtcgacc tcgaggcggc cgc 4583

<210> 33

<211> 4628

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> антитело-линкер-decoyMET

нуклеотидная последовательность scMvDN30-линкер L60-K842E

<400> 33

ggatcccccg gggccaccat ggagacagac acaatcctgc tatgggtgct gctgctctgg 60

gttccaggct ccactggtga cattgtgctg acccaatctc cagcttcttt ggctgtgtct 120

ctagggcaga gggccaccat ctcctgcaag gccagccaaa gtgttgatta tgatggtggt 180

agttatatga gttggttcca acagagacca ggacagccac ccaaactcct catctctgct 240

gcatccaacc ttgaatctgg catcccagcc aggtttagtg gcagtggctc tgggacagac 300

ttcaccctca atatccatcc tgtggaggag gaggatgttg caacctatta ctgtcagcaa 360

agttatgaag acccgctcac gttcggtgct ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg 420

gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480

tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 540

gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 600

agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 660

gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 720

aggggagagt gtggtggttc ttcgggttca ggctcgggct ccacaggtac atcgtcatcg 780

ggtacaggta cttcagctgg cacaacgggt acctccgcat ctacttccgg ttcaggctcc 840

ggaggcggcg gcggctcggg tggtggtgga tctgccggcg gaaccgcaac cgcaggcgct 900

tcttctggtt ccgtccaact gcagcagcct gggactgaac tggtgaagcc tggggcttca 960

gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac accttcacca gttactggat acactgggtg 1020

aagcagaggc ctggacaagg ccttgagtgg attggagaga ttaatcctag cagcggtcgt 1080

actaactaca acgagaaatt caagaacaag gtcacagtga ctgtagacaa atcttccacc 1140

acagcctaca tgcaactcag caacctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 1200

agtaggggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagcaag cacgaagggc 1260

ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 1320

ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa cccgtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 1380

ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 1440

agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 1500

aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 1560

actcacacag gtggttcttc gggttcaggc tcgggctcca caggtacatc gtcatcgggt 1620

acaggtactt cagctggcac aacgggtacc tccgcatcta cttccggttc aggctccgga 1680

ggcggcggcg gctcgggtgg tggtggatct gccggcggaa ccgcaaccgc aggcgcttct 1740

tctggttccg agtgtaaaga ggcactagca aagtccgaga tgaatgtgaa tatgaagtat 1800

cagcttccca acttcaccgc ggaaacaccc atccagaatg tcattctaca tgagcatcac 1860

attttccttg gtgccactaa ctacatttat gttttaaatg aggaagacct tcagaaggtt 1920

gctgagtaca agactgggcc tgtgctggaa cacccagatt gtttcccatg tcaggactgc 1980

agcagcaaag ccaatttatc aggaggtgtt tggaaagata acatcaacat ggctctagtt 2040

gtggacacct actatgatga tcaactcatt agctgtggca gcgtcaacag agggacctgc 2100

cagcgacatg tctttcccca caatcatact gctgacatac agtcggaggt tcactgcata 2160

ttctccccac agatagaaga gcccagccag tgtcctgact gtgtggtgag cgccctggga 2220

gccaaagtcc tttcatctgt aaaggaccgg ttcatcaact tctttgtagg caataccata 2280

aattcttctt atttcccaga tcatccattg cattcgatat cagtgagaag gctaaaggaa 2340

acgaaagatg gttttatgtt tttgacggac cagtcctaca ttgatgtttt acctgagttc 2400

agagattctt accccattaa gtatgtccat gcctttgaaa gcaacaattt tatttacttc 2460

ttgacggtcc aaagggaaac tctagatgct cagacttttc acacaagaat aatcaggttc 2520

tgttccataa actctggatt gcattcctac atggaaatgc ctctggagtg tattctcaca 2580

gaaaagagaa aaaagagatc cacaaagaag gaagtgttta atatacttca ggctgcgtat 2640

gtcagcaagc ctggggccca gcttgctaga caaataggag ccagcctgaa tgatgacatt 2700

cttttcgggg tgttcgcaca aagcaagcca gattctgccg aaccaatgga tcgatctgcc 2760

atgtgtgcat tccctatcaa atatgtcaac gacttcttca acaagatcgt caacaaaaac 2820

aatgtgagat gtctccagca tttttacgga cccaatcatg agcactgctt taataggaca 2880

cttctgagaa attcatcagg ctgtgaagcg cgccgtgatg aatatcgaac agagtttacc 2940

acagctttgc agcgcgttga cttattcatg ggtcaattca gcgaagtcct cttaacatct 3000

atatccacct tcattaaagg agacctcacc atagctaatc ttgggacatc agagggtcgc 3060

ttcatgcagg ttgtggtttc tcgatcagga ccatcaaccc ctcatgtgaa ttttctcctg 3120

gactcccatc cagtgtctcc agaagtgatt gtggagcata cattaaacca aaatggctac 3180

acactggtta tcactgggaa gaagatcacg aagatcccat tgaatggctt gggttgcaga 3240

catttccagt cttgcagtca atgcctctct gccccaccct ttgttcagtg tggctggtgc 3300

cacgacaaat gtgtgcgatc ggaggaatgc ctgagcggga catggactca acagatctgt 3360

ctgcctgcaa tctacaaggt tttcccaaat agtgcacccc ttgaaggagg gacaaggctg 3420

accatatgtg gctgggactt tggatttcgg aggaataata aatttgattt aaagaaaact 3480

agagttctcc ttggaaatga gagctgcacc ttgactttaa gtgagagcac gatgaataca 3540

ttgaaatgca cagttggtcc tgccatgaat aagcatttca atatgtccat aattatttca 3600

aatggccacg ggacaacaca atacagtaca ttctcctatg tcgatcctgt aataacaagt 3660

atttcgccga aatacggtcc tatggctggt ggcactttac ttactttaac tggaaattac 3720

ctaaacagtg ggaactctag acacatttca attggtggaa aaacatgtac tttaaaaagt 3780

gtgtcaaaca gtattcttga atgttatacc ccagcccaaa ccatttcaac tgagtttgct 3840

gttaaattga aaattgactt agccaaccga gagacaagca tcttcagtta ccgtgaagat 3900

cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa tcttttatta gtggtgggag cacaataaca 3960

ggtgttggga aaaacctgaa ctcagttagt gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa 4020

gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa catcgctcta attcagagat aatctgttgt 4080

accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc 4140

atgttagatg gcatcctttc caaatacttt gatctcattt atgtacataa tcctgtgttt 4200

gagccttttg aaaagccagt gatgatctca atgggcaatg aaaatgtact ggaaattaag 4260

ggaaatgata ttgaccctga agcagttaaa ggtgaagtgt taaaagttgg aaataagagc 4320

tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc gttttatgca cggtccccaa tgacctgctg 4380

aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg aagcaagcaa tttcttcaac cgtccttgga 4440

aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc acagctagcg gtgccgcatg gagccacccc 4500

cagttcgaaa aaggggccgc atggagccac ccccagttcg aaaaaggggc cgcatggagc 4560

cacccccagt tcgaaaaagg ggccgcacac catcaccatc accattaggt cgacctcgag 4620

gcggccgc 4628

<210> 34

<211> 4850

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> антитело-линкер-decoyMET

нуклеотидная последовательность scMvDN30-линкер L134-K842E

<400> 34

ggatcccccg gggccaccat ggagacagac acaatcctgc tatgggtgct gctgctctgg 60

gttccaggct ccactggtga cattgtgctg acccaatctc cagcttcttt ggctgtgtct 120

ctagggcaga gggccaccat ctcctgcaag gccagccaaa gtgttgatta tgatggtggt 180

agttatatga gttggttcca acagagacca ggacagccac ccaaactcct catctctgct 240

gcatccaacc ttgaatctgg catcccagcc aggtttagtg gcagtggctc tgggacagac 300

ttcaccctca atatccatcc tgtggaggag gaggatgttg caacctatta ctgtcagcaa 360

agttatgaag acccgctcac gttcggtgct ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg 420

gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480

tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 540

gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 600

agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 660

gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 720

aggggagagt gtggtggttc ttcgggttca ggctcgggct ccacaggtac atcgtcatcg 780

ggtacaggta cttcagctgg cacaacgggt acctccgcat ctacttccgg ttcaggctcc 840

ggaggcggcg gcggctcggg tggtggtgga tctgccggcg gaaccgcaac cgcaggcgct 900

tcttctggtt ccgtccaact gcagcagcct gggactgaac tggtgaagcc tggggcttca 960

gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac accttcacca gttactggat acactgggtg 1020

aagcagaggc ctggacaagg ccttgagtgg attggagaga ttaatcctag cagcggtcgt 1080

actaactaca acgagaaatt caagaacaag gtcacagtga ctgtagacaa atcttccacc 1140

acagcctaca tgcaactcag caacctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 1200

agtaggggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagcaag cacgaagggc 1260

ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 1320

ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa cccgtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 1380

ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 1440

agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 1500

aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 1560

actcacacag gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttcag gcggcggcgg ctcggcagag 1620

gcatggtata atctcgggaa cgcatactac aaacagggcg attatcagaa ggctatcgaa 1680

tactaccaaa aagcactcga actggacccc aataacgcgg aggcatggta caatctcggg 1740

aatgcgtact ataagcaggg tgactaccag aaggccattg aatactacca aaaggcgctt 1800

gaactggacc cgaacaacgc cgaggcctgg tataacctgg ggaatgctta ttacaagcag 1860

ggggattatc aaaaggcaat agaagactac cagaaggccc tcgaattgga ccctaacaat 1920

ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttca ggcggcggcg gctcgggcgg agagtgtaaa 1980

gaggcactag caaagtccga gatgaatgtg aatatgaagt atcagcttcc caacttcacc 2040

gcggaaacac ccatccagaa tgtcattcta catgagcatc acattttcct tggtgccact 2100

aactacattt atgttttaaa tgaggaagac cttcagaagg ttgctgagta caagactggg 2160

cctgtgctgg aacacccaga ttgtttccca tgtcaggact gcagcagcaa agccaattta 2220

tcaggaggtg tttggaaaga taacatcaac atggctctag ttgtggacac ctactatgat 2280

gatcaactca ttagctgtgg cagcgtcaac agagggacct gccagcgaca tgtctttccc 2340

cacaatcata ctgctgacat acagtcggag gttcactgca tattctcccc acagatagaa 2400

gagcccagcc agtgtcctga ctgtgtggtg agcgccctgg gagccaaagt cctttcatct 2460

gtaaaggacc ggttcatcaa cttctttgta ggcaatacca taaattcttc ttatttccca 2520

gatcatccat tgcattcgat atcagtgaga aggctaaagg aaacgaaaga tggttttatg 2580

tttttgacgg accagtccta cattgatgtt ttacctgagt tcagagattc ttaccccatt 2640

aagtatgtcc atgcctttga aagcaacaat tttatttact tcttgacggt ccaaagggaa 2700

actctagatg ctcagacttt tcacacaaga ataatcaggt tctgttccat aaactctgga 2760

ttgcattcct acatggaaat gcctctggag tgtattctca cagaaaagag aaaaaagaga 2820

tccacaaaga aggaagtgtt taatatactt caggctgcgt atgtcagcaa gcctggggcc 2880

cagcttgcta gacaaatagg agccagcctg aatgatgaca ttcttttcgg ggtgttcgca 2940

caaagcaagc cagattctgc cgaaccaatg gatcgatctg ccatgtgtgc attccctatc 3000

aaatatgtca acgacttctt caacaagatc gtcaacaaaa acaatgtgag atgtctccag 3060

catttttacg gacccaatca tgagcactgc tttaatagga cacttctgag aaattcatca 3120

ggctgtgaag cgcgccgtga tgaatatcga acagagttta ccacagcttt gcagcgcgtt 3180

gacttattca tgggtcaatt cagcgaagtc ctcttaacat ctatatccac cttcattaaa 3240

ggagacctca ccatagctaa tcttgggaca tcagagggtc gcttcatgca ggttgtggtt 3300

tctcgatcag gaccatcaac ccctcatgtg aattttctcc tggactccca tccagtgtct 3360

ccagaagtga ttgtggagca tacattaaac caaaatggct acacactggt tatcactggg 3420

aagaagatca cgaagatccc attgaatggc ttgggttgca gacatttcca gtcttgcagt 3480

caatgcctct ctgccccacc ctttgttcag tgtggctggt gccacgacaa atgtgtgcga 3540

tcggaggaat gcctgagcgg gacatggact caacagatct gtctgcctgc aatctacaag 3600

gttttcccaa atagtgcacc ccttgaagga gggacaaggc tgaccatatg tggctgggac 3660

tttggatttc ggaggaataa taaatttgat ttaaagaaaa ctagagttct ccttggaaat 3720

gagagctgca ccttgacttt aagtgagagc acgatgaata cattgaaatg cacagttggt 3780

cctgccatga ataagcattt caatatgtcc ataattattt caaatggcca cgggacaaca 3840

caatacagta cattctccta tgtcgatcct gtaataacaa gtatttcgcc gaaatacggt 3900

cctatggctg gtggcacttt acttacttta actggaaatt acctaaacag tgggaactct 3960

agacacattt caattggtgg aaaaacatgt actttaaaaa gtgtgtcaaa cagtattctt 4020

gaatgttata ccccagccca aaccatttca actgagtttg ctgttaaatt gaaaattgac 4080

ttagccaacc gagagacaag catcttcagt taccgtgaag atcccattgt ctatgaaatt 4140

catccaacca aatcttttat tagtggtggg agcacaataa caggtgttgg gaaaaacctg 4200

aactcagtta gtgtcccgag aatggtcata aatgtgcatg aagcaggaag gaactttaca 4260

gtggcatgtc aacatcgctc taattcagag ataatctgtt gtaccactcc ttccctgcaa 4320

cagctgaatc tgcaactccc cctgaaaacc aaagcctttt tcatgttaga tggcatcctt 4380

tccaaatact ttgatctcat ttatgtacat aatcctgtgt ttgagccttt tgaaaagcca 4440

gtgatgatct caatgggcaa tgaaaatgta ctggaaatta agggaaatga tattgaccct 4500

gaagcagtta aaggtgaagt gttaaaagtt ggaaataaga gctgtgagaa tatacactta 4560

cattctgaag ccgttttatg cacggtcccc aatgacctgc tgaaattgaa cagcgagcta 4620

aatatagagt ggaagcaagc aatttcttca accgtccttg gaaaagtaat agttcaacca 4680

gatcagaatt tcacagctag cggtgccgca tggagccacc cccagttcga aaaaggggcc 4740

gcatggagcc acccccagtt cgaaaaaggg gccgcatgga gccaccccca gttcgaaaaa 4800

ggggccgcac accatcacca tcaccattag gtcgacctcg aggcggccgc 4850

<210> 35

<211> 45

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> линкер L45

<400> 35

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala

20 25 30

Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

35 40 45

<210> 36

<211> 60

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> линкер L60

<400> 36

Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser

1 5 10 15

Gly Thr Gly Thr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala

35 40 45

Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ser

50 55 60

<210> 37

<211> 134

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> линкер L134

<400> 37

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala

1 5 10 15

Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr Tyr Lys Gln Gly Asp Tyr

20 25 30

Gln Lys Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala Leu Glu Leu Asp Pro Asn

35 40 45

Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr Tyr Lys Gln Gly

50 55 60

Asp Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Tyr Tyr Gln Lys Ala Leu Glu Leu Asp

65 70 75 80

Pro Asn Asn Ala Glu Ala Trp Tyr Asn Leu Gly Asn Ala Tyr Tyr Lys

85 90 95

Gln Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Asp Tyr Gln Lys Ala Leu Glu

100 105 110

Leu Asp Pro Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130

<210> 38

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> линкер L45

<400> 38

gctgaagctg cagccaaaga agctgcagcc aaagaggccg cagctaagga agccgcagca 60

aaagctgctg ctgaagctgc agccaaagaa gctgcagcca aagaggccgc agctaaggaa 120

gccgcagcaa aagct 135

<210> 39

<211> 180

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> линкер L60

<400> 39

ggtggttctt cgggttcagg ctcgggctcc acaggtacat cgtcatcggg tacaggtact 60

tcagctggca caacgggtac ctccgcatct acttccggtt caggctccgg aggcggcggc 120

ggctcgggtg gtggtggatc tgccggcgga accgcaaccg caggcgcttc ttctggttcc 180

<210> 40

<211> 402

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> линкер L134

<400> 40

ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttca ggcggcggcg gctcggcaga ggcatggtat 60

aatctcggga acgcatacta caaacagggc gattatcaga aggctatcga atactaccaa 120

aaagcactcg aactggaccc caataacgcg gaggcatggt acaatctcgg gaatgcgtac 180

tataagcagg gtgactacca gaaggccatt gaatactacc aaaaggcgct tgaactggac 240

ccgaacaacg ccgaggcctg gtataacctg gggaatgctt attacaagca gggggattat 300

caaaaggcaa tagaagacta ccagaaggcc ctcgaattgg accctaacaa tggtggtggt 360

ggttctggtg gtggtggttc aggcggcggc ggctcgggcg ga 402

<210> 41

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> праймер K842E смысловой

<400> 41

gtacataatc ctgtgtttga gccttttgaa aagccagtg 39

<210> 42

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> праймер K842E антисмысловой

<400> 42

cactggcttt tcaaaaggct caaacacagg attatgtac 39

<210> 43

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> праймер Q807K смысловой

<400> 43

ccactccttc cctgaaacag ctgaatctgc aactcc 36

<210> 44

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> праймер Q807K антисмысловой

<400> 44

ggagttgcag attcagctgt ttcagggaag gagtgg 36

<210> 45

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> праймер D864N смысловой

<400> 45

ctggaaatta agggaaataa tattgaccct gaagcagtta aagg 44

<210> 46

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> праймер D864N антисмысловой

<400> 46

cctttaactg cttcagggtc aatattattt cccttaattt ccag 44

<---

Claims

1. Применение комбинации фрагмента антитела против рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR) и внеклеточной части HGFR человека в лечении пациента, страдающего от секретирующей HGF опухоли и/или метастаза, предпочтительно секретирующего HGF метастаза, где:

(ii) внеклеточная часть HGFR человека способна стабильно связываться с фактором роста гепатоцитов (HGF) и содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR, для предотвращения связывания с ним фрагмента антитела против HGFR, и

(iii) фрагмент антитела против HGFR и внеклеточная часть HGFR человека подходят для введения пациенту в форме белка,

где фрагмент антитела против HGFR содержит один вариабельный домен легкой цепи (VL) и один вариабельный домен тяжелой цепи (VH), причем вариабельные домены легкой цепи и тяжелой цепи являются нечеловеческими или гуманизированными, и где вариабельный домен легкой цепи (VL) содержит области, определяющие комплементарность (CDR), имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1-3, и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) содержит CDR, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 4-6,

где внеклеточная часть HGFR человека содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, где по меньшей мере одна из аминокислот между положениями 797 и 875 последовательности SEQ ID NO: 19 мутирована для предотвращения связывания с ней фрагмента антитела против HGFR, и где:

(a) фрагмент антитела против HGFR конъюгирован с помощью линкера с внеклеточной частью HGFR человека в направлении от N- к C-концу, таким образом образуя слитый белок из фрагмента антитела против HGFR - линкера - внеклеточной части HGFR человека; или

(b) внеклеточная часть HGFR человека конъюгирована с помощью линкера с фрагментом антитела против HGFR в направлении от N- к C-концу, таким образом образуя слитый белок из внеклеточной части HGFR человека - линкера - фрагмента антитела против HGFR,

где пациент несет онкоген МЕТ дикого типа.

2. Применение по п. 1, где фрагмент антитела против HGFR дополнительно содержит один константный домен легкой цепи человека (CL) и один константный домен тяжелой цепи CH1 человека, причем вариабельный домен легкой цепи слит с константным доменом легкой цепи человека в направлении от N- к C-концу и вариабельный домен тяжелой цепи слит с константным доменом тяжелой цепи CH1 человека в направлении от N- к C-концу.

3. Применение по п. 2, где фрагмент антитела против HGFR представляет собой одноцепочечный Fab-фрагмент.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где внеклеточная часть HGFR человека содержит домены SEMA, PSI, IPT-1, IPT-2, IPT-3 и IPT-4.

5. Применение по любому из пп. 1-4, где внеклеточная часть HGFR человека имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20.

6. Применение по п. 1 или 5, где:

(i) слитый белок из фрагмента антитела против HGFR - линкера - внеклеточной части HGFR человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 26, 27 и 28; или

(ii) слитый белок из внеклеточной части HGFR человека - линкера - фрагмента антитела против HGFR содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23, 24 и 25.

7. Слитый белок, обладающий активностью одновременного антагонизма HGFR и связывания HGF, содержащий в направлении от N- к C-концу:

(ii) внеклеточную часть HGFR человека, линкер и фрагмент антитела против HGFR,

где фрагмент антитела против HGFR имеет только один паратоп, способный связываться с эпитопом внеклеточной части HGFR человека, и обладает антагонистической активностью в отношении HGFR,

где внеклеточная часть HGFR человека способна стабильно связываться с фактором роста гепатоцитов (HGF) и содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR, для предотвращения связывания с ним фрагмента антитела против HGFR,

где фрагмент антитела против HGFR содержит один вариабельный домен легкой цепи (VL) и один вариабельный домен тяжелой цепи (VH), причем вариабельные домены легкой цепи и тяжелой цепи являются нечеловеческими или гуманизированными, и где вариабельный домен легкой цепи (VL) содержит области, определяющие комплементарность (CDR), имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1-3, и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) содержит CDR, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 4-6, и

где внеклеточная часть HGFR человека содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, где по меньшей мере одна из аминокислот между положениями 797 и 875 последовательности SEQ ID NO: 19 мутирована для предотвращения связывания с ней фрагмента антитела против HGFR.

8. Слитый белок по п. 7, где фрагмент антитела против HGFR дополнительно содержит один константный домен легкой цепи человека (CL) и один константный домен тяжелой цепи CH1 человека, причем вариабельный домен легкой цепи слит с константным доменом легкой цепи человека в направлении от N- к C-концу и вариабельный домен тяжелой цепи слит с константным доменом тяжелой цепи CH1 человека в направлении от N- к C-концу.

9. Слитый белок по п. 7 или 8, где фрагмент антитела против HGFR представляет собой одноцепочечный Fab-фрагмент.

10. Слитый белок по любому из пп. 7-9, где внеклеточная часть HGFR человека содержит домены SEMA, PSI, IPT-1, IPT-2, IPT-3 и IPT-4.

11. Слитый белок по любому из пп. 7-10, где внеклеточная часть HGFR человека имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20.

12. Слитый белок по любому из пп. 7-11, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 23–28.

13. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп. 7-12.

14. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью одновременного антагонизма HGFR и связывания HGF, содержащая слитый белок по любому из пп. 7-12 и фармацевтически приемлемый носитель.