TW201902514A - Ｐｄ－１抗體與ｖｅｇｆ配體或ｖｅｇｆ受體抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及PD-1抗體與VEGF配體或VEGF受體抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途。本發明涉及的PD-1抗體與VEGF配體或VEGF受體抑制劑聯合使用，不僅能夠起到協同使用，增強抗腫瘤效果；還能夠減少或消除抗PD-1抗體引起的毛細血管瘤等不良反應。

Description

PD-1抗體與VEGF配體或VEGF受體抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途

本發明屬於醫藥領域，涉及一種PD-1抗體與VEGF配體抑制劑或VEGF受體抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途。

腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域一個長時間的熱點，其中T細胞的腫瘤免疫治療又處於其核心位置。腫瘤免疫治療是充分利用、調動腫瘤患者體內的殺傷性T細胞，對腫瘤進行殺傷作用，它可能是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途徑。與此同時，腫瘤逃逸是腫瘤免疫治療面臨的一個巨大障礙，腫瘤細胞利用其自身對免疫系統的抑制作用促進了腫瘤的快速生長。腫瘤的免疫逃逸機制與機體對腫瘤的免疫反應之間存在著極為複雜的關係。腫瘤免疫治療早期腫瘤特異性的細胞毒性T細胞是有其生物活性的，但隨著腫瘤生長後期失去了殺傷的功能。所以腫瘤免疫治療 是為了最大限度的提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，它不但要在體內啟動原有的免疫系統反應，更要維持免疫系統反應的持續時間和反應強度，才是免疫治療腫瘤的關鍵。

程式性死亡分子1(programmed death-1,PD-1)屬於CD28家族，與細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T Iymphocyte antigen 4,CTLA-4)具有23%的胺基酸同源性，但其表達卻與CTLA不同，主要表達在活化的T細胞、B細胞和髓系細胞上。PD-1有兩個配體，分別為PD-L1和PD-L2。PD-L1的主要表達於T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cell,DC)上，在活化後細胞上的表達能夠進行上調。新的研究發現乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤等人類腫瘤組織中檢測到高PD-L1蛋白的表達，且PD-L1的表達水準和患者的臨床及預後緊密相關。在免疫檢查點中，PD-1及其配體PD-L1抑制了T淋巴細胞的活性，PD-1與PD-L1的結合導致活化免疫細胞的凋亡和耗竭。由於PD-L1起到著第二信號通路抑制T細胞增殖的作用，所以阻斷PD-L1/PD-1之間結合成為了腫瘤免疫治療領域一個非常有潛力的新興靶點，薈萃分析顯示人類PD-L1蛋白表達陽性率均值為44.72%，因此PD-L1/PD-1相關免疫治療成為惡性膠質瘤治療的方向之一([J].Journal of Hematology & Oncology,2017,10(1)：81)，Kathy Boltz報導了Pembrolizumab用於多形性膠質母細胞瘤的臨床研究，結果顯示部分患者獲益，但仍有40% 的患者疾病進展(Neuro-Oncology.2016；18：abstract ATIM-35)，故PD-1抗體單藥用於腫瘤的治療仍存在諸多不足。

雖然針對PD-1靶點的抗體對腫瘤的抑制已取得了顯著的療效，但對某些患者療效不佳，甚至出現無效的情況，此外還會出現與免疫相關的嚴重不良反應。Xia Bu等人的研究發現對PD-1免疫治療耐藥的黑色素瘤患者表現出諸如免疫抑制、血管生成、單核細胞和巨噬細胞趨化性、細胞外基質重塑、和上皮-間充質轉換等基因上調的特徵，因此PD-1免疫治療結合上述靶點治療的方法可產生有效的抗腫瘤免疫效果([J].Trends in molecular medicine,2016,22(6)：448-451)。S.Yasuda等人的研究公開了VEGF單抗可以聯合抗PD-1抗體進行免疫治療([J].Clinical & Experimental Immunology,2013,172(3)：500-506)；此外，因升高的VEGF抑制了DC成熟，從而導致免疫抑制([J].Current treatment options in oncology,2014,15(1)：137-146)。

目前已有在研或上市的PD-1/PD-L1抗體聯合以VEGF為靶點的抗腫瘤藥物的臨床試驗正在開展中，Nivolumab與Sunitinib或Pazopanib聯合用於治療轉移性腎細胞癌(mRCC)顯示了良好效果(ASCO meeting,(2014)：5010-5010)；Pembrolizumab聯合貝伐珠單抗用於治療復發型膠質瘤的臨床結果顯示具有治療效果且耐受良好(ASCO meeting,(2016)：2041-2041)，但Blumenthal等人 報導了Pembrolizumab聯合貝伐單抗用於進展性原發性腦腫瘤的臨床研究顯示二者聯合無效，不推薦二者聯用治療進展性原發性腦腫瘤([J].Journal of neuro-oncology,2016,129(3)：453-460)，因此PD-1抗體與VEGF抑制劑聯合治療腫瘤仍具有很多不確定性，值得深入研究。

WO2013181452公開了一種PD-1拮抗劑、奧沙利鉑、亞葉酸、5-FU聯合或不聯合貝伐珠單抗治療腫瘤的用途；WO2016100561公開了一種PD-1抗體用於膠質瘤的用途；WO2016170039、WO2016170040公開了貝伐珠單抗與PD-1/PD-L1抗體聯合用於癌症及介導免疫反應的用途。

專利申請WO2017054646A提供一種新的具有高親和力、高選擇性、高生物活性的PD-1抗體，其包含：抗體輕鏈可變區，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6；和抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列該HCDR：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。在2017年ASCO會議上，文章《Phase I study of the antiPD-1 antibody SHR-1210 in patients with advanced solid tumors》公開了該PD-1抗體治療實體瘤患者I期臨床的實驗結果，結果顯示其對多種腫瘤有抑制效果，但是約79.3%的受試者出現了反應性毛細血管瘤的症狀。

貝伐珠單抗(Bevacizumab，Avastin^®)是2004年2 月26日於美國上市的VEGF抑制劑，用於治療如肺癌、卵巢癌等多種腫瘤，WO9845331公開了其序列和製備方法，本發明提供專利申請WO2017054646A該PD-1單抗或其抗原結合片段與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物的用途。

本發明要解決的技術問題是提供一種PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途。

其中，該PD-1抗體包含：抗體輕鏈可變區，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6；和抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列該HCDR：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3；該VEGF受體抑制劑選自呱加他尼鈉、凡德他尼、索拉非尼、阿西替尼、卡博替尼、普納替尼、尼達尼布、瑞戈非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、Puquitinib、Rebastinib、Lucitanib hydrochloride、Necuparanib、Ningetinib、Altiratinib。

在本發明的一個較佳具體實施例方案中，該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2、如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；該 抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQ ID NO：2所示的HCDR2、如SEQ ID NO：3所示的HCDR3。

其中，前面該各CDR序列如下表所示：

在本發明的一個較佳具體實施例方案中，本發明的PD-1抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。

在本發明的一個較佳具體實施例方案中，本發明的PD-1抗體或其抗原結合片段的人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO：8所示的序列或其變體；該變體較佳在輕鏈可變區有0至10個胺基酸變化；更佳為A43S的胺基酸變化。

在本發明的一個較佳具體實施例方案中，本發明的PD-1抗體或其抗原結合片段的人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO：7所示的序列或其變體；該變體較佳在重鏈可變區有0至10個胺基酸變化；更佳為G44R的胺基酸變化。

特別較佳的該人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO：8所示的序列，重鏈序列為如SEQ ID NO：7所示的序列。

前述的人源化抗體重、輕鏈的序列如下所示：

重鏈 SEQID NO：7

輕鏈 SEQID NO：8

在本發明該PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF配 體抑制劑或VEGF受體抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途，其中，該VEGF配體抑制劑選自貝伐珠單抗、雷莫蘆單抗、雷珠單抗、阿柏西普、康柏西普、Abicipar pegol、Brolucizumab、LMG-324、Nesvacumab、Sevacizumab、Tanibirumab、Navicixizumab、RG-7716、LHA-510、OPT-302、TK-001、GZ-402663、VGX-100、PG-545、BI-836880、GNR-011、BR-55、OTSGC-A24、PAN-90806、AVA-101、ODM-203、TAS-115、X-82、MP-0250、Sitravatinib、4SC-203、AL-2846、ABT-165、SIM-010603、BI-836880、HL-217、CS-2164、RGX-314、AMC-303、VXM-01、較佳貝伐珠單抗、雷莫蘆單抗。

上述方案中，該PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑具有治療腫瘤的協同藥效作用；較佳的，該人源化PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑具有治療腫瘤的協同藥效作用；更佳的，包含如序列SEQ ID NO：8所示的輕鏈序列和如SEQ ID NO：7所示的重鏈序列的人源化PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑具有治療腫瘤的協同藥效作用。

在本發明中，提供了一種治療腫瘤的辦法，包括向患者施用上述PD-1抗體或其抗原結合片段和VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑，其中該VEGF受體抑制劑選自呱加他尼鈉、凡德他尼、索拉非尼、阿西替尼、卡博替尼、普納替尼、尼達尼布、瑞戈非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、 Puquitinib、Rebastinib、Lucitanib hydrochloride、Necuparanib、Ningetinib、Altiratinib。

較佳的，該腫瘤選自乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、食管癌、肝癌、膽道癌、胰腺癌、頭頸部癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、骨肉瘤、軟組織肉瘤、神經母細胞瘤、腦瘤、內分泌器官腫瘤、膀胱癌、皮膚癌、鼻咽癌、橫紋肌肉瘤；較佳為乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、胰腺癌、子宮頸癌、肝癌、白血病、卵巢癌、淋巴瘤、腦瘤、食管癌；最佳為肺癌、胃癌、腸癌、肝癌、食管癌、淋巴瘤、腎癌、黑色素瘤、子宮頸癌、卵巢癌、腦瘤。

較佳的，該肺癌選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌，較佳為非小細胞肺癌；該腸癌選自小腸癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌，較佳為結腸癌、直腸癌、結直腸癌；該淋巴瘤選自霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤，較佳為霍奇金淋巴瘤。

較佳地，該腦瘤選自神經上皮組織腫瘤、顱神經和脊髓神經腫瘤、腦膜組織腫瘤；該神經上皮組織腫瘤選自星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、毛細胞型星形細胞瘤、多形性黃色星形細胞瘤、室管膜下巨細胞星形細胞瘤、少枝膠質細胞瘤、室管膜細胞瘤、混合性膠質瘤、脈絡叢腫瘤、松果體細胞瘤、胚胎性腫瘤，最佳微星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、膠質母細胞瘤。

較佳地，上述腫瘤由PD-1介導和/或表達表達PD-L1。

本發明所述的用途，其中，該PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑的聯用重量比例範圍為0.01-100，選自5：1、3：1、5：2、5：3、2：1、2：3、3：2、4：3、5：4、1：1、5：6、4：5、3：4、3：5、1：2、2：5、1：3、3：10、4：15、1：4、1：5、1：6、2：9、2：15、1：10、2：25、3：8；較佳為5：3、4：3、5：4、1：1、3：4、2：3、3：5、1：2、2：5、1：3、3：10、1：4、2：9、1：5、1：10、2：15、3：8。

上述PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑的聯用重量比例範圍較佳為自PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF配體抑制劑的聯用重量比例範圍，更佳為自PD-1抗體或其抗原結合片段與貝伐珠單抗或雷莫盧單抗的聯用重量比例範圍。

本發明所述的用途，其中，該PD-1抗體或其抗原結合片段的劑量選自0.1至100mg/kg，較佳為0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、17.5mg/kg、20mg/kg，最佳為1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg；貝伐珠單抗的劑量選自0.1至100mg/kg，較佳為0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、17.5mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg，最佳為5mg/kg、7.5mg/kg、 10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg；雷莫盧單抗的劑量選自0.1至100mg/kg，較佳0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、18mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg，最佳為5mg/kg、6mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg。

本發明該用途，在另一個較佳的具體實施例中，本發明該PD-1抗體或其抗原結合片段的劑量選自1-2000mg，較佳為25mg、40mg、50mg、60mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg、500mg、750mg、800mg、1000mg，最佳為40mg、60mg、100mg、200mg、400mg。

在本發明中，提供上述PD-1抗體或其抗原結合片段聯合VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑作為治療腫瘤的藥物，其中該VEGF受體抑制劑選自呱加他尼鈉、凡德他尼、索拉非尼、阿西替尼、卡博替尼、普納替尼、尼達尼布、瑞戈非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、Puquitinib、Rebastinib、Lucitanib hydrochloride、Necuparanib、Ningetinib、Altiratinib。

本發明之聯合的給藥方式選自：同時給藥、獨立地配製並共給藥或獨立地配製並相繼給藥。

本發明之PD-1抗體或其抗原結合片段、貝伐珠單抗或雷莫盧單抗的給藥途徑較佳胃腸外給藥途徑，更佳為靜脈注射、肌肉注射、皮下注射。

本發明進一步涉及上述PD-1抗體或其抗原結合片段 與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑聯合在製備治療腫瘤藥物中的用途，其中，PD-1抗體或其抗原結合片段的給藥頻次為一日一次、一週兩次、一週三次、一週一次、二週一次、三週一次、一月一次、二月一次、三月一次、六月一次，較佳為二週一次、三週一次、一月一次、三月一次；VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑的給藥頻次為一日一次、一日二次、一日三次、一週兩次、一週三次、一週一次、二週一次、三週一次、一月一次、二月一次、三月一次、六月一次，較佳一日一次、二週一次、三週一次、一月一次。

顯著的，本發明的PD-1抗體或其抗原結合片段與貝伐珠單抗或雷莫盧單抗聯合應用具有協同藥效作用。

本發明還提供一種降低抗PD-1抗體所導致的不良反應的方法，包括將抗PD-1抗體與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑聯合使用。在一個具體實施例中，該不良反應為血管相關不良反應，例如毛細血管瘤。本發明進一步提供一種醫藥組成物，其含有根據本發明之有效量的PD-1抗體或其抗原結合片段、VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑和可藥用的賦形劑、稀釋或載體，其中該VEGF受體抑制劑選自呱加他尼鈉、凡德他尼、索拉非尼、阿西替尼、卡博替尼、普納替尼、尼達尼布、瑞戈非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、Puquitinib、Rebastinib、Lucitanib hydrochloride、Necuparanib、Ningetinib、Altiratinib。

將本發明的抗PD-1抗體與VEGF受體抑制劑或VEGF 配體抑制劑聯合使用，不僅能夠起到協同使用，增強抗腫瘤效果；還能夠減少或消除抗PD-1抗體引起的毛細血管瘤等不良反應。

在本申請的說明書和申請專利範圍中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。然而，為了更好地理解本發明，下面提供了部分相關術語的定義和解釋。另外，當本申請所提供的術語的定義和解釋與本領域技術人員所通常理解的含義不一致時，以本申請所提供的術語的定義和解釋為準。

第1圖為貝伐珠單抗與PD-1抗體A單用或聯用對人類惡性膠質瘤U-87MG小鼠移植瘤的療效。

第2圖為在U87+PBMC腫瘤模型中貝伐珠單抗與PD-1抗體A聯用的藥效學結果。

第3圖為貝伐珠單抗與PD-1抗體A單用或聯用對人類惡性膠質瘤U-87MG小鼠腫瘤重量的影響。

第4圖為貝伐珠單抗與PD-1抗體A單用或聯用對人類惡性膠質瘤U-87MG小鼠體重的影響。

一、術語

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本檔中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中該。

本發明該抗體指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈，δ鏈γ，α鏈，ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。輕鏈通過恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

在本發明中，本發明之抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恒定區，該輕鏈恒定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本發明中，本發明之抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恒定區，該重鏈恒定區包含人源或鼠源的IgG1,2,3,4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恒定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR 區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1，HCDR2和HCDR3。本發明之抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA資料庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列資料庫(在網際網路www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。在本發明一個較佳的具體實施例中，該PD-1人源化抗體小鼠的CDR序列選自SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6。

本發明中之“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及與人PD-1結合的Fv片段sFv片段；包含本發明該抗體的選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中的一個或多個CDR區。Fv片段含 有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恒定區，並具有全部抗原結合位元點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。本發明的術語“與PD-1結合”，指能與人PD-1相互作用。本發明的術語“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指通過試劑、診斷、結合組成物或通過另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的任一種結合化合物的組成物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是通過誘導這類症狀退化還是 抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。通過醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本發明的具體實施例(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫字病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活 性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1至3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

術語“協同藥效作用”包含藥效相加作用、藥效增強作用、藥效增敏作用，本發明的“協同藥效作用”包括但不限於減少單獨使用本發明之PD-1抗體或其抗原結合片段、VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑時的耐受現象，減少單獨使用本發明之PD-1抗體或其抗原結合片段、VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑時的劑量，減少單獨使用本發明之PD-1抗體或其抗原結合片段、VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑時的不良反應，二者聯合使用增強單獨使用時VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑、本發明之PD-1抗體或其抗原結合片段的療效。

術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

本發明PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF受體抑制劑或VEGF配體抑制劑組成物可以有效解決腫瘤異質性，發揮顯著的抑制腫瘤細胞作用，有效抑制腫瘤細胞的增殖、 遷移或侵襲。

以下提供本發明的組成物在治療腫瘤用途中的示例性試驗方案，以顯示本發明組成物的有利活性或有益技術效果。但是應當理解，下述試驗方案僅僅是對本發明內容的示例，而不是對本發明範疇的限制。本領域技術人員在本說明書的教導下，能夠對本發明的技術方案進行適當的修改或改變，而不背離本發明的精神和範圍。

實施例1、本發明該PD-1抗體或其抗原結合片段與貝伐珠單抗聯合對人類惡性膠質瘤U-87MG小鼠皮下移植瘤的療效

供試品

PD-1抗體A(本發明該由如序列SEQ ID NO：8所示的輕鏈和如SEQ ID NO：7所示的重鏈組成的人源化PD-1抗體，定義為PD-1抗體A，為WO2017054646A中的PD-1抗體)、貝伐珠單抗(按照WO9845331該方法製備)。

試驗動物

NOD/SCID雌性小鼠購自卡文斯(批號：201703849)，合格證號：SCXK(蘇)2016-0010，購入時4-6週齡，體重約19g，5只/籠飼養，12/12小時光/暗週期調節，溫度23±1℃恒溫，濕度50至60%，自由進食進水。

供試品溶液配製

將PD-1抗體A在無菌條件下用PBS稀釋至20mg/mL，分裝為10管；將貝伐珠單抗打開後無菌分裝為4管。取上述分裝抗體1管在無菌條件下用PBS稀釋至0.63mg/mL， 並分裝為2.4mL/管，共10管，置於4℃保存，每次注射時取用1管。

實驗方法

一、PBMC提取

實施例所使用PBMCs從2名志願者新鮮血液中提取，提取方法如下：1、將用肝素抗凝處理的靜脈血與同體積含2%FBS的PBS混合稀釋；2、無菌轉移15mL分離液1077到50mL分離管中(之前輕輕顛倒容器使1077充分混合)；3、仔細將25mL稀釋血液加入至含分離液1077的分離管中(室溫，緩慢加入，在血液和分離液1077中形成一個明顯的分層，不要將稀釋血液混合入分離液1077中)；4、室溫下1200g離心10分鐘，離心可以導致紅細胞和多核白細胞沉澱，同時在分離液1077上形成一層單核淋巴細胞；5、吸出淋巴細胞上方4至6cm的血漿；6、吸取淋巴細胞層以及其下面一半的分離液1077轉移到另外的一個離心管中。加入等體積的PBS，室溫下300g離心8分鐘；7、用PBS或RPMI-1640培養基清洗細胞，用含血清的RPMI-1640培養基重懸細胞。

二、CD3抗體包被及PBMCs啟動

1、將用PBS稀釋的CD3抗體(40ng/mL)加入6孔 細胞培養板中，1mL/孔，37℃孵育一小時；2、在加PBMC之前，移除CD3抗體稀釋液，每孔加入2mL的PBS洗滌兩遍；3、分別加入2名志願者的PBMCs(RPMI-1640培養基懸浮)：每孔約2×10⁶個細胞，2mL/孔；4、置於37℃培養箱中培養4天。

三、給藥方法及動物處理

將100μL的U-87MG細胞(1.5×10⁶個細胞/小鼠)接種於NOD/SCID小鼠右肋部皮下，10天後去除腫瘤體積過大或過小的動物，按平均腫瘤體積約65mm³將小鼠隨機分為4組：溶媒對照組、貝伐珠單抗3mg/kg單用組、PD-1抗體A 3mg/kg單用組和貝伐珠單抗3mg/kg+PD-1抗體A 3mg/kg聯用組。每組9只，分組當天記為第0天。於分組當天(第0天)將經CD3抗體刺激的兩名志願者的PBMCs以1：1比例混合，以5×10⁵個細胞/小鼠注射到荷瘤小鼠的腫瘤組織中。剩餘的PBMCs停止刺激並繼續培養，於第7天以5×10⁶個細胞/小鼠腹腔注射到荷瘤鼠體內，於第11、14、17天重複第0天操作。於分組當天(第0天)分別腹腔注射PD-1抗體A和/或尾靜脈注射貝伐珠單抗，之後每週注射2次，共給藥6次。每週2次監測腫瘤體積、動物體重並記錄資料。實驗結束時將動物進行安樂死，剝取腫瘤並稱取腫瘤重量。

資料表達和統計學處理

所有資料使用Excel和GraphPad Prism 5軟體進行作 圖及統計分析。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b²其中a、b分別表示長、寬。

相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T₀)/(C-C₀)×100，其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T₀、C₀為實驗開始時的腫瘤體積。

抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。

實驗結果

實驗結果顯示：貝伐珠單抗單藥組(3mg/kg,I.V.,BIW×6)和貝伐珠單抗+PD-1抗體A聯合用藥組(3+3mg/kg,I.V.+I.P.,BIW×6)與溶媒對照組相比能顯著抑制人類惡性膠質瘤U-87MG小鼠皮下移植瘤的生長，抑瘤率分別為為66.38%和78.71%(p<0.001 vs溶媒對照)；而PD-1抗體A單藥組(3mg/kg,I.P.,BIW×6)第20天抑瘤率僅為9.79%，與溶媒對照組無顯著差異。貝伐珠單抗+PD-1抗體A聯用組與貝伐珠單抗單用組相比，第20天抑瘤效果也有統計學差異(p<0.05)，表現出顯著的藥效協同作用(表1及第1圖)。

離體的腫瘤重量與腫瘤體積變化趨勢基本一致，貝伐珠單抗+PD-1抗體A聯用組與貝伐珠單抗單用組的腫瘤重量都明顯低於溶媒對照組，且具有統計學差異(P<0.001)。貝伐珠單抗+PD-1抗體A聯用組與貝伐珠單抗單用組之間腫瘤重量雖然沒有統計學差異(p=0.0779)，但兩組腫瘤重量在<0.5g的比例分別為67%(6/9)vs.11%(1/9)，也可以看 出聯用組的優勢(第2圖及第3圖)。

荷瘤小鼠對貝伐珠單抗和PD-1抗體A單用或聯用均能很好的耐受，在整個給藥過程中體重平穩上升，只有溶媒對照組和PD-1抗體A組在末次測量時體重輕微下降，可能是由於後期人類惡性膠質瘤U-87MG在小鼠皮下生長過快導致小鼠體質下降，無明顯藥物致體重減輕等症狀發生(第4圖)。

實驗結論

貝伐珠單抗+PD-1抗體A聯合用藥(3mg/kg,I.V.+I.P.,BIW×6)能顯著抑制人類惡性膠質瘤U-87MG小鼠皮下移植瘤的生長(TGI 78.71%)，且抑瘤效果優於+PD-1抗體A單藥組(3mg/kg,I.P.,BIW×6)及貝伐珠單抗單藥組(3 mg/kg,I.V.,BIW×6)，荷瘤小鼠對以上藥物均能很好耐受

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司

<120> PD-1抗體與VEGF配體或VEGF受體抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途

<130> 780039CPCT

<150> CN201710412282.X

<151> 2017-06-05

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 6

<210> 7

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(443)

<223> 重鏈序列

<400> 7

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(214)

<223> 輕鏈序列

<400> 8

<210> 9

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(116)

<223> 重鏈可變區

<400> 9

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 輕鏈可變區

<400> 10

Claims (22)

1. 一種PD-1抗體或其抗原結合片段與VEGF配體抑制劑或VEGF受體抑制劑聯合用於在製備治療腫瘤的藥物中的用途，其中，該PD-1抗體或其抗原結合片段包含：抗體輕鏈可變區，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6；和抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列該HCDR：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3；其中，該VEGF受體抑制劑選自呱加他尼鈉、凡德他尼、索拉非尼、阿西替尼、卡博替尼、普納替尼、尼達尼布、瑞戈非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、Puquitinib、Rebastinib、Lucitanib hydrochloride、Necuparanib、Ningetinib、Altiratinib。
2. 根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2、如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；該抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQ ID NO：2所示的HCDR2、如SEQ ID NO：3所示的HCDR3。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中，該PD-1抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中，該PD-1抗 體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO：8所示的序列或其變體。
5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中，該變體在輕鏈可變區有0至10個的胺基酸變化。
6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中，該變體在輕鏈可變區有A43S的胺基酸變化。
7. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中，該PD-1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈序列為如SEQ ID NO：7所示的序列或其變體。
8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中，該變體在重鏈可變區有0至10個胺基酸變化。
9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中，該變體在重鏈可變區有G44R的胺基酸變化。
10. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中，該人源化PD-1抗體或其抗原結合片段的輕鏈序列為如SEQ ID NO：8所示的序列或其變體，重鏈序列為如SEQ ID NO：7所示的序列或其變體。
11. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該VEGF配體抑制劑選自貝伐珠單抗、雷莫蘆單抗、雷珠單抗、阿柏西普、康柏西普、Abicipar pegol、Brolucizumab、LMG-324、Nesvacumab、Sevacizumab、Tanibirumab、Navicixizumab、RG-7716、LHA-510、OPT-302、TK-001、GZ-402663、VGX-100、PG-545、BI-836880、GNR-011、BR-55、OTSGC-A24、PAN-90806、AVA-101、ODM-203、 TAS-115、X-82、MP-0250、Sitravatinib、4SC-203、AL-2846、ABT-165、SIM-010603、BI-836880、HL-217、CS-2164、RGX-314、AMC-303、VXM-01。
12. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中，該VEGF配體抑制劑選自貝伐珠單抗和雷莫蘆單抗。
13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中，該VEGF配體抑制劑選自貝伐珠單抗。
14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之用途，其中，該腫瘤選自乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、食管癌、肝癌、膽道癌、胰腺癌、頭頸部癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、骨肉瘤、軟組織肉瘤、神經母細胞瘤、腦瘤、內分泌器官腫瘤、膀胱癌、皮膚癌、鼻咽癌及橫紋肌肉瘤。
15. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中，該腫瘤選自乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、胰腺癌、子宮頸癌、肝癌、白血病、卵巢癌、淋巴瘤、腦瘤及食管癌。
16. 如申請專利範圍第15項所述之用途，其中，該腫瘤選自肺癌、胃癌、腸癌、肝癌、食管癌、淋巴瘤、腎癌、黑色素瘤、子宮頸癌、卵巢癌及腦瘤。
17. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中，該肺癌選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌；該腸癌選自小腸癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌；以及該淋巴瘤選自非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。
18. 如申請專利範圍第17項所述之用途，其中，該肺癌為非小細胞肺癌；該腸癌選自結腸癌、直腸癌、結直腸癌；以及該淋巴瘤為霍奇金淋巴瘤。
19. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中，該腦瘤選自神經上皮組織腫瘤、顱神經和脊髓神經腫瘤、腦膜組織腫瘤；該神經上皮組織腫瘤選自星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、毛細胞型星形細胞瘤、多形性黃色星形細胞瘤、室管膜下巨細胞星形細胞瘤、少枝膠質細胞瘤、室管膜細胞瘤、混合性膠質瘤、脈絡叢腫瘤、松果體細胞瘤、及胚胎性腫瘤。
20. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中，該神經上皮組織腫瘤選自星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、及膠質母細胞瘤。
21. 如申請專利範圍第14至20項中任一項所述之用途，其中，該腫瘤由PD-1介導和/或表達表達PD-L1。
22. 一種醫藥組成物，包含申請專利範圍第1-13項中任意一項所述之該有效量的PD-1抗體或其抗原結合片段和VEGF配體抑制劑或VEGF受體抑制劑，以及一種或多種可藥用的賦型劑、稀釋劑或載體。