ES2674491T3 - Nuevos fragmentos de anticuerpos, composiciones y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un fragmento de anticuerpo que comprende un primer polipéptido que comprende un dominio variable de cadena ligera y dos dominios constantes y un segundo polipéptido que comprende un dominio variable de cadena pesada y dos dominios constantes, en donde dos dominios constantes son dominios constantes de cadena ligera y dos dominios constantes son dominios constantes de cadena pesada CH1, en donde dicho fragmento de anticuerpo tiene la semivida in vivo prolongada con respecto a una fragmento de Fab que comprende dichos dominios variables de cadena ligera y pesada, en donde el primer polipéptido comprende un dominio variable de cadena ligera y dos dominios constantes de cadena ligera humana, en donde el dominio variable de cadena ligera se fusiona al primer dominio constante de cadena ligera que se fusiona al segundo dominio constante de cadena ligera en la dirección del N-terminal al Cterminal, generando así una cadena ligera quimérica VL-CL-CL, y en donde el segundo polipéptido comprende un dominio variable de cadena pesada y dos dominios constantes de cadena pesada humana, en donde el dominio variable de cadena pesada se fusiona al primer dominio constante de cadena pesada CH1 humano que se fusiona al segundo dominio constante de cadena pesada CH1 humano en la dirección del N-terminal al C-terminal, generando así una cadena pesada quimérica VH-CH1-CH1.

Description

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En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende una célula que expresa HGFR, comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de un fragmento de anticuerpo antagonista de HGFR de la invención, tratando por lo tanto, eficazmente, dicho mamífero.

En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular asociado con la mayor expresión o actividad de HGFR, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad efectiva de un fragmento de anticuerpo antagonista de HGFR de la invención, tratando o previniendo de este modo eficazmente dicho trastorno proliferativo celular.

En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento de dicho tumor es al menos en parte dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de HGFR, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula tumoral con una cantidad efectiva de un fragmento de anticuerpo antagonista de HGFR de la invención, tratando de este modo eficazmente dicho tumor. El tumor celular puede ser uno seleccionado de cáncer de mama, colorectal, pulmón, colon, páncreas, próstata, ovario, cervical, sistema nervioso central, renal, hepatocelular, de vejiga, gástrico, de cabeza y cuello, carcinoma papilar (por ejemplo la glándula tiroides), melanoma, linfoma, mieloma, glioma/glioblastoma (por ejemplo, astrocitoma anaplásico, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma anaplásico, oligodendroastrocitoma anaplásico), células de leucemia. En una realización, una célula que es objetivo en un método de la invención es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica. En una realización, una célula que es objetivo en un método de la invención es una célula displásica. En otra realización más, una célula que es objetivo en un método de la invención es una célula metastásica. En una realización adicional, una célula que es objetivo en un método de la invención es una célula que expresa HGFR que pertenece al microambiente que mantiene el tumor y/o la metástasis.

Los métodos de la invención pueden comprender además etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una realización, un método comprende además una etapa en donde una célula y/o tejido tumoral diana se expone a un tratamiento por radiación o un agente quimioterapéutico. En otra realización, una célula y/o tejido tumoral diana se trata, además de con el fragmento de anticuerpo antagonista de la invención, con inhibidores de HGF (es decir, anticuerpos anti-HGF) u otros compuestos anti-HGFR (es decir, inhibidores de quinasa microcíticos). En una realización adicional, una célula y/o tejido tumoral diana se trata, además de con el fragmento de anticuerpo antagonista de la invención, con moléculas que golpean específicamente otras dianas relevantes en el mantenimiento del fenotipo transformado (es decir, moléculas anti-EGFR).

La activación de HGFR es un importante proceso biológico; su desregulación conduce a numerosas afecciones patológicas. Por consiguiente, en una realización de métodos de la invención, una célula que es diana (por ejemplo, una célula cancerígena) es una en la que la activación de HGFR se mejora en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. En una realización, un método de la invención provoca la muerte o la detención del crecimiento de una célula diana. Por ejemplo, el contacto con un fragmento de anticuerpo antagonista de la invención puede dar como resultado la incapacidad de la célula para señalizar a través de la vía de HGFR, lo que da como resultado la muerte celular o la detención del crecimiento celular.

La invención también se refiere a inmunoconjugados, o conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), que comprenden un fragmento de anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente de inhibición del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de bacterias, origen fúngico, vegetal, o animal, o fragmentos de los mismos), o un isotopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

El uso de conjugados anticuerpo-fármaco para el suministro local de agentes citotóxicos o citostásicos, es decir, fármacos para matar o inhibir el crecimiento de células tumorales en el tratamiento del cáncer, permite la administración dirigida del resto del fármaco a los tumores, y la acumulación intracelular en el mismo, donde la administración sistemática de estos agentes farmacológicos no conjugados puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales así como para las células tumorales que se pretende eliminar.

Las formulaciones terapéuticas que comprenden un fragmento de anticuerpo de la invención se preparan para el almacenamiento mezclando el fragmento de anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol,

A. Ed. (1980)), en forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones secas. Los vehículos, excipientes,

o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones; antioxidantes; conservantes; polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas; tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos; agentes quelantes; azúcares; contraiones que forman sales; complejos metálicos y/o tensioactivos no iónicos.

La formulación aquí puede contener también más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se va a tratar, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

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Los ingredientes activos pueden también quedar atrapados en microcápsulas preparadas por medio de técnicas descritas en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones que se van a utilizar para administración in vivo deben ser estériles.

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el fragmento de anticuerpo de la invención, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas.

Un fragmento de anticuerpo de la presente invención se puede utilizar en métodos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo. La invención proporciona varios métodos basados en el uso de fragmentos de anticuerpo que tienen propiedades superiores en comparación con anticuerpos monovalentes convencionales.

La presente invención proporciona fragmentos de anticuerpo, que se pueden utilizar para una variedad de fines, por ejemplo como fines terapéuticos, profilácticos y diagnósticos.

Los fragmentos de anticuerpo de la invención se pueden utilizar solos o en combinación con otras composiciones en una terapia. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de la invención se puede co-administrar con otro anticuerpo, agente (s) quimioterapéutico (s) (incluyendo mezclas de agentes quimioterapéuticos), otro (s) agente (s) citotóxico (s), agente (s) anti-angiogénico (s), citoquinas, y/o agente (s) inhibidor (es) del crecimiento. Tales terapias combinadas indicadas anteriormente incluyen administración combinada (en la que los dos o más agentes se incluyen en la misma formulación o formulaciones separadas), y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede ocurrir antes de, y/o después, de la administración de la terapia

o terapias adjuntas.

El fragmento de anticuerpo de la invención (y agente terapéutico adjunto) se administra por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, administración intralesional. El fragmento de anticuerpo se administra adecuadamente por infusión de pulsos, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte si la administración es breve o crónica. El fragmento de anticuerpo de la invención se puede administrar también mediante transferencia génica por medio de vectores virales (por ejemplo, vectores lentivirales) administrados localmente o sistemáticamente.

El fragmento de anticuerpo de la invención se formulará, dosificará, y administrará de una manera consistente con una buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se va a tratar, el mamífero particular que se va a tratar, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los médicos. El anticuerpo no necesita ser, pero se formula opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpos de la invención presentes en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con las vías de administración que se utilizaron anteriormente o aproximadamente del 1 al 99% de las dosis empleadas hasta ahora.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un fragmento de anticuerpo de la invención (cuando se utiliza solo o en combinación con otros agentes tales como agentes quimioterapéuticos) dependerán del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y curso de la enfermedad, si el fragmento de anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, historial clínico del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. El fragmento de anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 mg/kg a 15 mg/kg de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar de aproximadamente 1 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis ejemplar del fragmento de anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) se pueden administrar al paciente. Tales dosis se pueden administrar intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de manera que el paciente reciba aproximadamente de dos a aproximadamente veinte, por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis inicial de mayor carga, seguida de una

o más dosis más bajas. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

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Resultados

Generación del Fab DN30 quimérico y caracterización de sus propiedades bioquímicas y biológicas.

Como otros anticuerpos monoclonales con potencial terapéutico, se ha generado DN30 en ratones. Por lo tanto, su empleo directo en humanos para fines terapéuticos no es aplicable, ya que la molécula murina sería reconocida por anticuerpos humanos antimurinos (HAMA) que conducen a la eliminación inmuno-mediada de la actividad del anticuerpo. La sustitución de las regiones constantes murinas del anticuerpo con secuencias derivadas de inmunoglobulinas humanas (quimerización de anticuerpos) es suficiente para reducir fuertemente la respuesta HAMA. Los mAbs y Fabs quimerizados se utilizan actualmente en clínica. Mediante técnicas de biología molecular clásicas, los presentes inventores han sustituido los dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras de Fab DN30 con dominios constantes derivados de inmunoglobulinas humanas: el dominio constante de cadena ligera se ha sustituido con el dominio de tipo kappa humano, el más representado en los anticuerpos humanos naturales, mientras que el dominio constante de cadena pesada CH1 se ha sustituido con el dominio homólogo derivado de IgG1 humana. Esta combinación es efectiva: el Fab DN30 quimérico (MvDN30) se une a Met con alta afinidad, induce el desprendimiento de Met e inhibe la proliferación de células adictas a Met, solapando las propiedades de la molécula murina correspondiente (Fig. 1 y Fig. 2).

Diseño molecular de Fab de doble dominio constante.

Utilizando la secuencia de MvDN30 como plantilla, los presentes inventores duplicaron los dominios constantes en cada cadena ligera y pesada (Fab de doble dominio constante). La nueva molécula modificada tiene un peso molecular predicho de 75 KD. Los presentes inventores generaron dos diferentes DCD-Fabs. En la primera molécula los dominios constantes humanos se duplicaron en tándem, generando así una cadena pesada quimérica VH-CH1-CH1 y una cadena ligera quimérica VL-CL-CL. En la segunda molécula el dominio terminal se intercambió recíprocamente, generando así una cadena pesada quimérica VH-CH1-CL y una cadena ligera quimérica VL-CL-CH1 (Fig. 3). Las moléculas recombinantes diméricas correspondientes se nombraron como DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2. Los cDNAs que codifican estas nuevas moléculas se clonaron en un plásmido de expresión y después se expresaron en células eucarióticas. Las proteínas se purificaron del sobrenadante del cultivo celular gracias a la etiqueta de Estreptomicina que se insertó en el C terminal de la secuencia. La Figura 4 muestra la separación de SDS-Page bajo condiciones reductoras de las moléculas recombinantes purificadas que tienen el tamaño de peso molecular correcto.

DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2 unidos a Met con alta afinidad.

DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2 purificados se caracterizaron por su capacidad para unirse al receptor Met. Para este fin, los presentes inventores llevaron a cabo ensayos ELISA utilizando un ectodominio de Met en fase sólida y MvDN30, DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2 en fase líquida. La unión se reveló utilizando anticuerpos anti-strepTAG (Fig. 5). Este análisis mostró que las tres moléculas monovalentes derivadas de DN30 se unen a Met con una afinidad similar (MvDN30, Kd = 0,141 ± 0,03 nM; DCD-MvDN30.1, Kd = 0,133 ± 0,02 nM, DCD-MvDN30.2, Kd = 0,130 ± 0,03 nM.

DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2 no inducen la fosforilación de Met.

Los presentes inventores probaron si las nuevas moléculas derivadas de DN30 podían mostrar una actividad agonista de Met en el ensayo de fosforilación de Met. Esto se analizó utilizando células de carcinoma de pulmón humano A459, que representan un sistema estándar para determinar la activación de Met en respuesta a la estimulación del ligando aguda. De hecho, las células A549 expresan los niveles fisiológicos de Met, inactivos en condiciones basales, pero propensos a ser activados por HGF o una molécula mimética del ligando (4, 10). Las células se estimularon durante 15 minutos con cantidades crecientes de MvDN30, DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2. Las células se estimularon también con HGF y mAb DN-30 como controles positivos. La activación de Met se determinó mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfoMet. Como se muestra en la Fig. 6, las nuevas moléculas no muestran cualquier actividad agonista significativa. DCD-MvDN30.1 era indistinguible de MvDN30, estando desprovisto de cualquier actividad agonista. DCD-MvDN30.2 retuvo una actividad agonista residual mínima, que en cualquier caso era despreciable en comparación con mAb DN30 o HGF. Los presentes inventores también verificaron la activación de moléculas que actúan como efectores posteriores de Met. Mientras que la estimulación con HGF indujo la activación de quinasas reguladas por la señal extracelular 1 y 2 (ERK-1 y ERK-2) y AKT/Proteína quinasa B (AKT), DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2, como MvDN30, no afectó al estado de fosforilación de estos traductores de señal (Fig. 7).

DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2 inducen el desprendimiento de Met.

Los presentes inventores investigaron también si las nuevas moléculas derivadas de MvDN30 mantienen la capacidad para promover el desprendimiento y la posterior regulación del receptor. Las células A549 se incubaron con DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2 y MvDN30. Después de 48 horas, la presencia de ectodominio de Met en el medio acondicionado se analizó mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la porción extracelular de Met. Los niveles celulares totales de Met se determinaron también en lisados celulares

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Ensayos de unión ELISA

La unión de MvDN30, DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2 se determinó mediante ELISA utilizando una quimera Met-Fc en fase sólida (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) y concentraciones crecientes del anticuerpo recombinante etiquetado con FLAG en fase líquida. La unión se reveló utilizando un anticuerpo anti-strepTAG II conjugado peroxidasa de rábano (IBA, Olivette, Missouri). Los datos se analizaron y se ajustaron utilizando el software Prism (Graph Pad Software, San Diego, California). La quimera Met-Fc es una proteína de fusión en donde el dominio Fc derivado de una IgG humana se fusiona en la estructura con la porción extracelular de Met.

Análisis de la activación de Met

Las células de carcinoma de pulmón humano A549 subconfluentes se incubaron en medio libre de suero durante 48 horas y después se estimularon durante 10 minutos con las concentraciones indicadas de HGF recombinante (R&D System) o mAb DN-30 purificado, MvDN30, DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2 como se describe en (13). Después de la estimulación, las células se lisaron y procesaron inmediatamente como se describe en (12). Los extractos celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Met (DO-24), se resolvieron por SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia de Western utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina (Millipore). Las mismas transferencias se volvieron a probar con anticuerpos anti-Met (DL-21) para normalizar la cantidad de Met inmunoprecipitado.

Para la inhibición de la fosforilación de Met inducida por HGF las células A549 se trataron durante 24 horas en medio libre de suero con MvDN30, DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2 y se estimularon después con HGF como se describió anteriormente. Las monocapas celulares se lisaron con tampón Laemmli e iguales cantidades de proteínas totales, se separaron en gel de acrilamida mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfo-Met (Tyr 1234/1235).

Análisis del desprendimiento de Met

Las monocapas de A549 subconfluentes se lavaron dos veces con PBS y después se incubaron en medio libre de suero con las concentraciones indicadas de Fab o mAb DN-30. Después de 48 horas, el medio acondicionado se recogió y las células se lisaron con tampón Laemmli. Los niveles de proteína Met se determinaron en 50 µg de lisados celulares totales y en 50 µl de sobrenadante de cultivo celular mediante transferencia de Western utilizando mAb anti-Met DL-21.

Ensayos biológicos in vitro

Para el análisis del crecimiento celular, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (1.000 células/pocillo) en un medio que contiene FBS al 10%. Después de 24 horas, el medio se reemplazó por un nuevo que contenía las moléculas derivadas del DN30 más 5% de anticuerpos FCS en las concentraciones indicadas. El número de células se evaluó después de 72 horas utilizando el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La quimioluminiscencia se detectó con un aparato Multilabel Reader Perkin Elmer 2030 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland).

Para los ensayos del crecimiento independiente del anclaje, las células se sembraron en placas de 48 pocillos (500 células/pocillo) en un medio que contiene FBS al 2% y 0,5% de agarosa SeaPlaque (BMA, Rockland, Maine). Se añadieron anticuerpos (1,5 µM) y HGF (50 ng/ml) en el medio de cultivo cada 3 días. Después de 21 días de cultivo, las colonias se tiñeron mediante sales de tetrazolio (Sigma Life Science) y se calificaron mediante el Software MetaMorphOffline (Molecular Device LLC, Sunnyvale, California).

Análisis farmacocinético

Ratones inmunodeficientes NOD-SCID adultos (peso corporal entre 18 y 22 g, un promedio de 20 g) se inyectaron IP con 100 µg de DCD-MvDN30.1 o DCD-MvDN30.2 o MvDN30. La sangre periférica se recogió a diferentes tiempos (para MvDN30: 10, 20 y 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48 horas; para DCD-MvDN30.1 y DCD-MvDN30.2: 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48, 72, 96, 144 horas después de la administración). Las concentraciones de moléculas terapéuticas se evaluaron mediante ELISA como se describió anteriormente en la sección de ensayos de unión, interpolando los valores de absorbancia de las muestras en la parte lineal de la curva patrón obtenida mediante diluciones en serie de diferentes moléculas purificadas. Cada punto de tiempo fue el valor promedio de al menos tres ratones.

Referencias

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Claims (1)

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