KR102155392B1

KR102155392B1 - 신규한 항체 단편, 조성물 및 이의 이용방법

Info

Publication number: KR102155392B1
Application number: KR1020157021325A
Authority: KR
Inventors: 엘리사 비그나; 파올로 미쉘리; 파올로 마리아 코모글리오
Original assignee: 메티스 프리시젼 메디슨 에스비 에스.알.엘.
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2020-09-11
Also published as: HRP20180917T1; RS57286B1; US20160017044A1; MX360258B; ES2674491T3; SG11201505114VA; HUE037843T2; US20180237527A1; ITTO20130012A1; PT2943510T; JP2016503069A; DK2943510T3; KR20150103283A; CN104968684B; TR201808826T4; IL239704B; SI2943510T1; ME03080B; EA201591279A1; LT2943510T

Abstract

경쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 중쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 항체 단편으로서, 2쇄 불변 도메인은 경쇄 불변 도메인이고, 2개의 불변 도메인은 CH1 중쇄 불변 도메인인, 항체 단편.

Description

신규한 항체 단편, 조성물 및 이의 이용방법{NEW ANTIBODY FRAGMENTS, COMPOSITIONS AND USES THEREOF}

본 개시내용은 개선된 생체내 안정성을 지니는 신규한 항체 단편에 관한 것이다.

암 치료의 새로운 영역인 표적 치료는 형질전환된 표현형을 지탱하는 중대한 유전자 산물을 특이적으로 차단하는 약학적 도구(약물 또는 항체)를 사용한다. 현재, 암 표적 치료는 타이로신 키나제 분자 ABL에 중독된 만성 골수성 백혈병(CML)의 치료를 위해, 표피성장인자 수용체(EGFR/HER-1) 활성화에 의존하는 비소세포 폐암(NSCLC) 및 결장-직장 암종(CRC)의 하위집단의 치료를 위해 및 BRAF-의존적 흑색종의 치료를 위해, 임상에서 사용되고 있다.

타이로신 키나제 활성(tyrosine kinase activity: RTK)을 지니는 수용체는, 그들이 종종 몇몇 유형의 종양에서 과활성화되기 때문에 표적 치료를 위한 흥미로운 후보이다. 그들은 수용체의 세포밖 부분과 상호작용 시, 수용체-유도 세포내 신호전달을 교란시킬 수 있는 상이한 유형의 표적화 분자, 예컨대 항체, 및 수용체 촉매 활성을 방해하는 화학적으로-합성된 소분자에 의해 저해될 수 있다.

상이한 RTK 중에서도, c-met 원암유전자의 산물인 간세포 성장 인자 수용체(HGFR/Met)는 암에서 가장 중요한 활성화된 발암유전자 중 하나로서 생겨났다. Met는 전-미토겐성(pro-mitogenic), 전-침습성 및 항-세포자멸사적 신호를 포함하는 '침습성 성장'으로서 알려진 유전자 프로그램을 제어한다. 이들 생리학적 신호를 통해, Met는 더 양호한 종양 적합성을 구비하는데, 이는 암 진행에서의 선택적 장벽을 극복하게 한다. 게다가, Met는 종양 신생혈관형성을 촉진하는 그의 능력에 의해 종양 성장을 계속하게 한다. 지난 몇 년간, Met는 또한 항-혈관생성제로 처리한 종양에 의해 발생된 공격성 및 전통적인 방사선치료에 대한 내성을 초래하였다. 추가적으로, MET 유전자 변용(alteration)은 형질전환의 주된 원인일 수 있는데, 모든 해당 경우에서 이는 1차 형질전환 표현형의 장기간 유지를 위해 유전적으로 선택되었다.

모든 상기 열거한 발견들은 HGF의 경쟁적 저해제, 화학적 Met 키나제 저해제, 항-HGF 및 항-Met 항체를 포함하는, Met 신호전달을 저해하는데 적합한 몇몇 분자의 발생을 촉진하였다. 지금까지, 일부 이들 분자는 단지 연구 목적을 위해 시험되었다. 중화 항-HGF 항체, 항-Met 항체 및 몇몇 소분자를 이용하는 임상 시험이 현재 진행중이다.

몇몇 관점으로부터, Met 신호전달을 저해할 수 있는 항-Met 항체가 바람직할 수 있다. 항체는 고도로 특이적이며, 안정하고, 그들의 자연적 설계 덕분에, 그들은 일반적으로 숙주에 의해 잘 용인된다. 지난 몇 년간, 치료적 항-Met 항체를 생성하기 위한 몇몇 노력이 제안되었다. 그러나, 대부분의 항-Met 항체는 효현제(agonist)로서 거동하고, HGF 작용을 모방하기 때문에, 다수의 실패가 나타났다. 이는 주로, 그들의 2가 구조 덕분에, 항체가 수용체 이합체를 안정화시켜서 Met의 인산기전이반응을 허용할 수 있고, 그 결과 활성화된다는 사실에 기인한다. 일 경우에, 효현제 항-Met 항체(5D5)는 HGF 결합과 경쟁하여 치료적 가능성을 부여받은 1가 형태(1 암(Armed)-5D5)로 유전자 조작 및 전환되었다(1,2). 이 분자는 비소세포폐암 환자의 하위집단의 치료를 위한 III상 임상 연구를 최근에 시작하였고, 에를로티닙과 조합하여 종양에서의 고수준의 Met 발현을 특징으로 한다(3).

단클론성 항체 DN30은 인간 Met 수용체의 세포밖 모이어티로 향하는 마우스 IgG2A이다(4). 이는 Met 수용체 세포 밖 영역의 네 번째 IPT 도메인에 나노몰보다 적은 친화도로 결합한다. 처음에, 이는 일부이지만 모두는 아닌 Met-매개 생물학적 세포 반응을 촉진할 수 있는 Met의 부분적 효현제로서 특성규명되었다. 이후에, 이는 수용체 '쉐딩(shedding)'의 메커니즘을 통해 종양 성장 및 전이의 저해제로서 작용할 수 있는 것으로 입증되었다(5). 수용체 쉐딩은 다양한 성장인자, 사이토카인, 수용체 및 부착분자 상에서 작용하는 단백질 분해의 생리학적 세포 메커니즘이다. Met 쉐딩은 2 단계로 표현된다: 첫 번째로 메탈로프로테아제인 ADAM-10이 막관통 영역에 대한 바로 상류에 위치된 특이적 서열을 인식하는 Met의 세포 밖 도메인을 절단하고; 이어서, 남아있는 막관통 단편은 막으로부터 키나제-함유 부분을 분리시키고 그것을 프로테아제 분해 경로를 향해 빠르게 처리하는 제2 프로테아제(γ-세크레타제)의 기질이 된다(6,7). DN30에 의해 발휘되는 이 메커니즘의 향상은 세포 기질에 노출된 Met 수용체 수의 감소를 야기한다. 동시에, 이는 세포밖 공간에서 가용성 '미끼' 엑토-도메인을 방출한다. 후자는 리간드 결합을 위해 무결함 막관통 수용체와 경쟁하고, 진짜 Met와 함께 이형이합체 복합체를 형성함으로써 수용체 동형-이합체화를 저해한다. 모든 이들 작용은 Met-매개 신호전달을 강하게 손상시키며, 하류의 생물학적 효과의 방지를 초래한다.

최근에 본 발명자들은 DN30 항-Met 단클론성 항체(DN30 Fab)의 1가 Fab 단편이 임의의 효현제 활성이 없고 쉐딩을 유도하는 능력을 유지하며, 따라서 강한 Met 저해제를 초래한다는 것을 입증하였다(8). DN30-Fab에 의한 Met 쉐딩의 유도는 민감한 항체-항원 상호작용에 의존하지만, 수용체 활성화로부터 독립적이다. 세포 표면으로부터 Met의 단순한 제거에 기반한 이 작용 메커니즘은, 그것이 HGF-의존적이든 아니든 과발현, 돌연변이 또는 유전자 증폭에 의해 유도되는 모든 형태의 Met 활성화에 대해 효과적일 수 있기 때문에, DN30-Fab에 다른 저해제 이상의 강한 이점을 제공한다.

재조합 DN30-Fab는 임상 적용에 매우 매력적이지만, 짧은 Fab 혈장 반감기-대부분 신장 클리어런스(clearance)에 기인함-는 환자 치료를 위한 그의 용도가 심하게 제한된다.

현재, Fab 단편의 약학적 특성을 개선시키기 위한 가장 통합된 기법은 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)과의 컨쥬게이션에 의해 그의 분자량을 증가시키는 것이다(PEG). Fab 페길화는 임상에서 Fab를 사용하는 대부분의 경우에 추구된 경로이다. 효율적으로 얻어지고 항원 결합 특성의 상실이 없는 항체 단편에 대한 중합체 쇄의 공유적 부착은 분명한 과정이 아니며, 확립하는데 강한 노력을 필요로 한다.

Fab 단편의 약학적 특성을 개선시키기 위해 사용되는 다른 기법은 유럽 특허 A-1 718 677호에 개시된 것이다. 상기 언급한 단클론성 항체 5D5의 1암 형태를 생성하기 위해 사용되는 그러한 절차는 -재조합체 기반에서- 동일 세포에서의 3가지 상이한 항체쇄, 즉, 경쇄(VL-CL), 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3) 및 중쇄(CH2-CH3)의 Fc 부분의 생성이다. CH2-CH3 도메인은 야생형이 아니며: 특이적 3차원 구조에 대해 생기는 돌연변이가 포함된다. 하나의 폴리펩타이드에서, CH2-CH3 영역은 돌기를 형성하는 서열을 포함하는 반면, 다른 폴리펩타이드에서, CH2-CH3 영역은 돌기가 삽입될 수 있는 공동을 형성하는 서열을 함유한다(정공 구조 내로의 노브(Knob)). 이들 3차원 구조의 존재는 중쇄가 Fc 단편과 이황화결합을 형성하는 이형이합체를 바람직하게 형성하게 하지만, 동형이합체의 형성을 전혀 배제하지 않는다(즉, 2개의 중쇄가 함께 연결되고, 2개의 Fc가 함께 연결됨). 원하는 이형이합체로부터 원치않는 동형이합체를 분리시키는 정제는 필수적이다. 따라서 "1 암 절차"는, 매우 명쾌함에도 불구하고, 그것이 제조를 복잡하게 하고 재조합 항체의 수율을 감소시키는 전반적 과정에서의 추가 단계를 필요로 하기 때문에, 번거롭다.

따라서 생체내 치료 용도를 위해 Fab 혈장 반감기를 증가시키는 상이한 용액의 필요성을 느낀다.

본 개시내용의 목적은 개선된 생체내 안정성을 지니는 항체 단편을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 목적은 본 개시내용의 필수적 부분을 형성하는 것으로 이해되는 다음의 청구범위에서 구체적으로 상기되는 종속항 덕분에 달성된다.

본 개시내용의 실시형태는 경쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 중쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 항체 단편을 제공하되, 2쇄 불변 도메인은 경쇄 불변 도메인이고, 2개의 불변 도메인은 중쇄 CH1 불변 도메인이며, 가변 도메인에 대해 상이한 조합으로 융합된다.

본 개시내용의 추가 실시형태는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab 분자보다 생체내에서 더 안정한 상기 정의한 바와 같은 항체 단편에 관한 것이다.

또한 추가 실시형태는 간세포 성장 인자 수용체(HGFR/Met)에 특이적으로 결합하는 상기 정의된 바와 같은 항체 단편에 관한 것이다.

본 발명은 이제 순수하게 예시적 및 비제한적 예로서, 수반하는 도면을 참고하여 상세하게 기재될 것이다:
- 도 1: 키메라 MvDN30 또는 뮤린 DN30 Fab에 의해 처리된 Met-중독 세포에서의 Met 쉐딩 및 하향 조절을 도시한 도면 . A SNU-5 인간 위 암종 세포주; B H1993-NCl 비소세포폐암종 세포주. 세포를 DN30 mAb로부터 유래된 2개의 항체 단편의 표시 농도에 의해 무혈청 배지에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 총 Met 수준을 항-Met 항체를 사용하는 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다. 2개 Met 밴드는 수용체의 미가공(p190 Met) 및 성숙(p145 Met) 형태에 대응한다. 항-Met 항체를 이용하여 조건화된 배지의 웨스턴 블롯에 의해 Met 쉐딩을 결정하였다. 분자는 둘 다 Met-쉐딩/하향조절을 효율적으로 유도한다.
- 도 2: 키메라 MvDN30 또는 뮤린 DN30 Fab에 의해 처리한 Met-중독 세포의 성장 분석을 도시한 도면 . A EBC-1 비소세포 폐암종 세포주; B Hs746T 인간 위 암종 세포주. 세포를 10% FCS 배지 내 96 웰 접시(1000개/웰)에서 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 추가 72시간 동안 항체 농도를 증가시키면서 처리하였다. 셀 타이터-글로(Cell titer-glo)(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에 의해 세포수를 평가하였다. 각각의 점은 3회 중복 값의 평균이며; 막대는 표준 편차를 나타낸다. 분자는 둘 다 Met-중독 세포의 세포 성장을 효율적으로 저해한다.
- 도 3: 새로운 DN30 유래 분자의 개략적 표현을 도시한 도면. 상부: 키메라 DN30 Fab(MvDN30); 중간: 나란히 중복된 불변 도메인을 지니는 이중 불변 도메인 Fab(DCD-MvDN30.1); 하부: 서로 교환되는 중복된 불변 도메인을 지니는 이중 불변 도메인 Fab(DCD-MvDN30.2). VH: DN30 중쇄의 가변 도메인. VL: DN30 경쇄의 가변 도메인. CH1: 인간 IgG1 중쇄로부터의 불변 도메인 1. CL: 인간 카파 경쇄로부터 유래된 불변 도메인. 스트렙(Strep) 및 His 태그: 단백질 정제 및 면역-검출을 허용하도록 포함된 서열.
- 도 4: 새로운 DN-30 유래 분자의 분석을 도시한 도면. 표시된 정제된 단백질에 환원 조건 하에 SDS-PAGE를 실시하였다. 겔을 겔 코드 블루(Gel Code blue)(피어스(Pierce))로 염색하였다. 모든 분자는 예상 분자량을 지니는 2개의 밴드를 나타낸다.
- 도 5: DCD-MvDN30 분자에 대한 Met의 결합을 도시한 도면 . Met-Fc 키메라(고체상)에 대한 MvDN30, DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2(액체상)의 ELISA 결합 분석. 항-스트렙태그를 사용하여 결합을 나타내었다. O.D.: 광학밀도; A.U.: 임의의 단위. 각각의 점은 3회 중복 값의 평균이고; 막대는 표준 편차를 나타낸다. 새로운 분자는 동일한 높은 친화도로 Fc-Met에 결합한다.
- 도 6: DCD-MvDN30 분자의 효현성 활성을 도시한 도면. A549 세포를 24시간 동안 굶긴 다음, 표시 농도에서 상이한 분자를 이용하여 37℃에서 10분 동안 자극하였다. 항-Met 항체를 이용하는 면역-침전법 다음에, 주요 인산화 부위인 인산화된 Tyr 1234/1235 Met 잔기에 특이적인 항-Met 항체를 이용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 Met 활성화를 결정하였다(상부). 동일한 블롯을 항-Met 항체를 이용하여 재프로빙하였다(하부). 새로운 분자는 Met 수용체를 상당하게 활성화시키지 않는다.
- 도 7: DCD-MvDN30 분자의 효현성 활성을 도시한 도면. A549 세포를 24시간 동안 굶긴 다음, 표시 농도에서 상이한 분자를 이용하여 37℃에서 10분 동안 자극하였다. AKT 및 ERK-1,2의 활성화를 인산화된 형태에 특이적인 항-AKT 또는 항-ERK 항체를 이용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 결정하였다. 단백질 장입을 제어하기 위해 항-빈쿨린 항체(하부)를 이용하여 동일한 블롯을 재프로빙하였다. 새로운 분자는 Met-의존적 신호전달을 상당하게 활성화시키지 않는다.
- 도 8: DCD-MvDN30에 의해 처리되는 세포 내 Met 쉐딩 및 하향조절을 도시한 도면 . A549 세포를 표시한 분자(500mM)를 이용하여 무혈청 배지에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 총 Met 수준을 항-Met 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다. 2개의 Met 밴드는 수용체의 미가공(p190 Met) 및 성숙(p145 Met) 형태에 대응한다. 장입 대조군으로서, 관련없는 단백질(액틴)을 이용하여 필터를 프로빙하였다. 항-Met 항체를 이용하는 조건화 배지의 웨스턴 블롯 분석에 의해 Met 쉐딩을 결정하였다. 새로운 분자는 Met 쉐딩을 효율적으로 유도한다.
- 도 9: DCD- MvDN30 분자에 의한 HGF -유도 Met-활성화의 저해를 도시한 도면 . A549 세포를 무혈청 배지 + 표시 분자(1000nM) 중에서 24시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 10분 동안 HGF(100ng/㎖)로 자극하였다. Met 활성화를 주요 인산화 부위인 인산화된 Tyr 1234/1235 Met 잔기에 특이적인 항-Met 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 총 세포 용해물에서 결정하였다. 항-Met 항체를 이용하여 동일한 블롯을 재프로빙하였다. 항-포스포AKT 또는 항-포스포ERK 항체를 이용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 AKT 및 ERK-1,2의 활성화를 결정하였다. 항-AKT 또는 ERK-1,2 항체를 이용하여 동일한 블롯을 재프로빙하였다. 단백질 장입을 제어하기 위해, 필터를 또한 항-빈쿨린 항체를 이용하여 프로빙하였다. 새로운 분자는 HGF-유도 Met-활성화 및 Met-의존적 신호전달을 강하게 저해한다.
- 도 10: DCD-MvDN30.1 또는 DCDMvDN30.2 또는 MvDN30으로 처리한 Met-중독 세포의 앵커리지-의존적 성장을 도시한 도면. A, B, C, D 인간 위 암종 세포주; E, F 비소세포 폐암종 세포주. 세포를 5% FCS 배지 중의 96 웰 코스타(1000개/웰)에서 플레이팅하였다. 24시간 후에, 추가 72시간 동안 상이한 분자를 농도를 증가시키면서 처리하였다. 셀 타이터-글로(프로메가)에 의해 세포수를 평가하였다. 플롯은 미처리 대조군에 대한 살아있는 세포의 백분율을 나타낸다. 각각의 점은 3회 중복 값의 평균이다. 새로운 분자는 Met-중독 세포의 세포 성장을 효율적으로 저해한다.
- 도 11: DCD- MvDN30 .1 또는 DCD- MvDN30 .2 또는 MvDN30으로 처리한 세포의 앵커리지-의존적 성장을 도시한 도면. A549 세포를, 1.5mM의 DCD-MvDN30.1, 또는 DCD-MvDN30.2 또는 MvDN30의 존재하에 HGF(50ng/㎖)와 함께 또는 HGF 없이 반고체 배지(5% 아가로스) 중에서 플레이팅하였다. 21일 후에, 콜로니를 테트라졸륨 염으로 염색하였다. 메타모르프오프라인 소프트웨어(MetaMorphOffline Software)를 이용하여 각각의 웰 면적에서의 픽셀을 계수화함으로써 콜로니를 정량화하였다. 각각의 점은 3회 중복 값의 평균이다. 새로운 분자는 HGF-의존적 앵커리지-독립적 세포 성장을 효율적으로 저해한다.
- 도 12: DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 및 MvDN30의 생체내 약동학적 프로파일. 면역결핍 마우스에 DCD-MvDN30.1, 또는 DCD-MvDN30.2 또는 MvDN30의 단일 용량(100㎍)을 복막내로 주사하였다. 상이한 시점에 말초 혈액을 수집하였다. 치료 분자의 혈청 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 그래프는 시간의 함수로 순환 분자의 양을 나타낸다. 샘플은 3회 중복이며, 막대는 표준 편차를 나타낸다.
- 도 13: 본 개시내용에 따른 항체 단편의 제1 폴리펩타이드의 제1 실시형태의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한 도면. 서열은 경쇄, VL-CL-CL로부터 유래된 폴리펩타이드에 대응한다. CDR 영역은 뉴클레오타이드와 아미노산 서열 둘 다에서 밑줄 표시되어 있다.
- 도 14: 본 개시내용에 따른 항체 단편의 제2 폴리펩타이드의 제1 실시형태의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한 도면. 서열은 경쇄, 중쇄, VH-CH1-CH1-태그로부터 유래된 폴리펩타이드에 대응한다. CDR 영역은 뉴클레오타이드와 아미노산 서열 둘 다에서 밑줄 표시되어 있다. 스트렙 및 히스티딘 태그는 대문자 이탤릭체임.
- 도 15: 본 개시내용에 따른 항체 단편의 제1 폴리펩타이드의 제2 실시형태의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한 도면. 서열은 경쇄, VL-CL-CH1-태그로부터 유래된 폴리펩타이드에 대응한다. CDR 영역은 뉴클레오타이드와 아미노산 서열 둘 다에서 밑줄 표시되어 있다. 스트렙 및 히스티딘 태그는 대문자 이탤릭체임.
- 도 16: 본 개시내용에 따른 항체 단편의 제2 폴리펩타이드의 제2 실시형태의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한 도면. 서열은 중쇄, VH-CH1-CL로부터 유래된 폴리펩타이드에 대응한다. CDR 영역은 뉴클레오타이드와 아미노산 서열 둘 다에서 밑줄 표시되어 있다.
- 도 17: DN30 경쇄 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한 도면. CDR 영역은 뉴클레오타이드와 아미노산 서열 둘 다에서 밑줄 표시되어 있다.
- 도 18: DN30 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 . CDR 영역은 뉴클레오타이드와 아미노산 서열 둘 다에서 밑줄 표시되어 있다.

본 발명은 이제 간세포 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편에 대해 비제한적 예로서 상세하게 설명할 것이다.

본 설명의 범주는 이러한 표적 항원으로 제한되지 않는다는 것이 분명한데, 본 명세서에 기재된 항체 단편은 다른 표적 항원에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있기 때문이다.

다음의 설명에서, 실시형태의 철저한 이해를 제공하기 위해 수많은 구체적 상세한 설명을 제공한다. 실시형태는 하나 이상의 구체적 상세한 설명 없이, 또는 다른 방법, 성분, 물질 등과 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 모호한 양태의 실시형태를 회피하기 위한 잘 공지된 구조, 물질 또는 작동을 상세하게 나타내거나 또는 기재하고 있지 않다.

본 명세서 전체적으로 "일 실시형태" 또는 "실시형태"에 대한 언급은 실시형태와 함께 기재된 특정 특징, 구조 또는 특징이 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 위치에서 어구 "일 실시형태에서" 또는 "실시형태에서"의 출현은 필수적으로 동일한 실시형태를 모두 나타내는 것은 아니다. 더 나아가, 특정 특징, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.

본 명세서에 제공된 제목은 단지 편리함을 위한 것이며, 실시형태의 범주 또는 의미를 설명하지 않는다.

항체는 중쇄와 경쇄가 둘 다 다중 Ig 도메인에 의해 구성되고, 각각의 하나는 독립적으로 폴딩되는 복잡한 테트라머이다. 항체 시대가 처음 시작되었을 때, 효소 치료를 통해, 항체가 본래의 구조 및 항원-결합 특성을 유지하는 단편을 만들어 낼 수 있다는 것이 나타났다.

후속적으로, 단백질 유전자 조작 기법을 적용함으로써, 과잉의 상이한 유전자 조작 항체 단편이 생성되었다. 분자 설계에 따라, 각각의 새로운 항체 단편은 특정 특징(즉, 증가된 결합활성, 다가성, 다중특이성, ADCC-결여, 키메라화 등)을 특징으로 한다.

그러나, 이전의 연구 중 어떤 것도 항체 단편의 생체내 반감기를 연장시키기 위한 신장 클리어런스의 문제를 처리하지 않았다.

이를 위하여, 본 발명자들은 경쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 중쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 항체 단편을 개발하였으며, 여기서 2쇄 불변 도메인은 경쇄 불변 도메인이고, 2개의 불변 도메인은 중쇄 CH1 불변 도메인이며, 이들은 가변 도메인에 대한 상이한 조합으로 융합되었다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체 단편은 상기 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab 분자보다 생체내에서 더 안정하다.

일 실시형태에서, 항체 단편은 감소된 신장 클리어런스 때문에 상기 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab 분자보다 인간 환자에게 투여될 때 생체내 반감기가 연장되었다.

이들 항체 단편은 '이중 불변 도메인 Fab'(DCD-Fab)로 칭해진다.

바람직한 실시형태에서, 본 개시내용은 경쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 중쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 항체 단편에 관한 것이되, 2개의 불변 도메인은 인간 경쇄 불변 도메인이고, 2개의 불변 도메인은 인간 중쇄 CH1 불변 도메인이며, 이들은 가변 도메인에 상이한 조합으로 융합되어 있고, 항체 단편은 상기 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab 분자보다 생체내에서 더 안정하고, 항체 단편은 간세포 성장 인자 수용체(HGFR/Met)에 특이적으로 결합한다.

일 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 그의 C-말단에서 하나의 경쇄 불변 도메인에 융합되고, 이는 그의 C-말단에서 하나의 경쇄 불변 도메인에 융합된다.

다른 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 그의 C-말단에서 경쇄 불변 도메인에 융합되고, 이는 그의 C-말단에서 하나의 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합된다.

일 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 그의 C-말단에서 하나의 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합되고, 이는 그의 C-말단에서 하나의 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합된다.

다른 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 그의 C-말단에서 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합되고, 이는 그의 C-말단에서 경쇄 불변 도메인에 융합된다.

일 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드에 함유된 불변 도메인은 - 항체 단편과 함께 결합될 때 - 이황화 브릿지를 생성할 수 있다.

추가의 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 정의한 바와 같은 항체 단편에 관한 것이되, 항원 특이성은 DN30 단클론성 항체로부터의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 포함하는 DN30 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는 인간화된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 경쇄 및 중쇄 가변 도메인으로서 사용함으로써 제공된다. DN30 단클론성 항체는 국제 특허 출원 WO-A-2007/090807호에 개시되어 있다.

본 발명의 항체 단편은 일반적으로 치료적 항체이다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 길항 항체, 차단 항체 또는 중화 항체일 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 질환을 갖는 대상체에게 질환을 치료하거나 또는 질환의 진행을 지연시키는데 효과적인 유효량의 본 발명의 항체 단편을 투여하는, 질환을 치료하거나 또는 질환의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.

일 실시형태에서, 질환은 종양 또는 종양 전이이다.

다른 실시형태에서, 질환은 간세포 성장인자-수용체 신호전달 및/또는 활성화의 조절장애와 관련된다.

본 발명의 항체 단편은 HGF/HGFR 신호전달 경로 내에서의 이상과 관련된 병리학적 병태를 치료 또는 예방하는데 적합하다.

일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 HGFR 길항제이다.

일 실시형태에서, 항체 단편은 이종성 비-인간, 인간 또는 인간화된 서열(예를 들어, 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열)에 접합된 비-인간 공여체로부터의 항원 결합 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 비-인간 공여체는 마우스이다.

일 실시형태에서, 항원 결합 서열은 항-HGFR 뮤린 항체의 모든 CDR 및/또는 가변 도메인 서열을 포함한다.

일 바람직한 실시형태에서, 뮤린 경쇄 가변 도메인은 그의 C-말단에서 하나의 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 융합되고, 이는 그의 C-말단에서 하나의 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 융합된다. 다른 실시형태에서, 뮤린 경쇄 가변 도메인은 그의 C-말단에서 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 융합되고, 이는 그의 C-말단에서 하나의 인간 IgGl 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합된다. 일 실시형태에서, 뮤린 중쇄 가변 도메인은 그의 C-말단에서 하나의 인간 IgGl 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합되고, 이는 그의 C-말단에서 하나의 인간 IgGl 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합된다. 다른 실시형태에서, 뮤린 중쇄 가변 도메인은 그의 C-말단에서 인간 IgGl 중쇄 CH1 불변 도메인에 융합되고, 이는 그의 C-말단에서 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 융합된다.

일 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 단편은 항-HGFR 뮤린 항체의 CDR 서열, 더 바람직하게는 DN30의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 2개의 불변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 포함하되, 2개의 불변 도메인은 2개의 경쇄 불변 도메인 또는 하나의 경쇄 불변 도메인 및 하나의 중쇄 CH1 불변 도메인이다. 일 실시형태에서, 2개의 불변 도메인은 인간 불변 도메인이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 항체 단편은 항-HGFR 뮤린 항체의 CDR 서열, 더 바람직하게는 DN30의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 2개의 불변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하되, 2개의 불변 도메인은 2개의 중쇄 CH1 불변 도메인 또는 하나의 중쇄 CH1 불변 도메인 및 하나의 경쇄 불변 도메인이다. 일 실시형태에서, 2개의 불변 도메인은 인간 불변 도메인이다.

본 발명은, 가장 바람직한 실시형태에서, 인간 HGFR에 결합되는 인간화된 항체 단편을 제공하되, 항체는 생체내 HGF/HGFR 활성을 저해하는데 효과적이며, 상기 항체는 i) 중쇄 가변 도메인(VH)에서 DN30 단클론성 항체의 중쇄 가변 도메인의 3개 CDR 서열(서열번호 19, 20, 21) 및 실질적으로 인간 공통서열, 예를 들어, 실질적으로 인간 중쇄 하위그룹의 인간 공통 프레임워크(FR) 잔기 및 ii) 경쇄 가변 도메인(VL)에서 DN30 단클론성 항체의 경쇄 가변 도메인의 3개 CDR 서열(서열번호 25, 26, 27) 및 실질적으로 인간 경쇄 하위그룹 I(VKI)의 인간 공통 프레임워크(FR) 잔기를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 항체 단편은 경쇄 가변 도메인으로서 서열번호 12에 제시된 경쇄 가변 도메인(DN30 경쇄 가변 도메인)을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 중쇄 가변 도메인으로서 서열번호 4에 제시된 중쇄 가변 도메인(DN30 중쇄 가변 도메인)을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애와 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명의 항체 단편(예를 들어, 본 발명의 HGFR 길항제 항체 단편)의 용도를 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 HGFR 활성화의 조절장애와 관련된 병리학적 병태의 치료방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 본 발명의 HGFR 길항제 항체 단편을 투여함으로써 상기 병태가 치료되는 단계를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 HGFR을 발현시키는 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 HGFR 길항제 항체 단편과 접촉시킴으로써 상기 세포의 성장의 저해를 야기하는 단계를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 HGFR을 발현시키는 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유류를 치료적으로 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유류에게 유효량의 본 발명의 HGFR 길항제 항체 단편을 투여함으로써 상기 포유류를 효과적으로 치료하는 단계를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 HGFR의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 발명의 HGFR 길항제 항체 단편을 투여함으로써 상기 세포 증식성 장애를 효과적으로 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 포유류에서 종양을 치료적으로 치료하는 방법을 제공하되, 상기 종양의 성장은 HGFR의 성장 상승 효과에 적어도 부분적으로 의존하고, 상기 방법은 종양 세포를 유효량의 본 발명의 HGFR 길항제 항체 단편과 접촉시킴으로써, 상기 종양을 효과적으로 치료하는 단계를 포함한다. 종양 세포는 유방, 결장직장, 폐, 결장, 췌장, 전립선, 난소, 자궁경부, 중추신경계, 신장, 간세포, 방광, 위, 두경부 종양 세포, 유두암(예를 들어, 갑상선 유두암), 흑색종, 림프종, 골수종, 신경교종/교모세포종(예를 들어, 성상세포종, 다형성 교모세포종, 악성 뇌교종, 악성 핍지교종 성상세포종), 백혈병 세포로부터 선택되는 하나일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 과대증식 및/또는 과형성 세포이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 이형성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 전이성 세포이다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 종양 및/또는 전이를 지탱해는 미세환경에 속하는 HGFR 발현 세포이다.

본 발명의 방법은 추가로 추가적인 치료 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 방법은 표적화된 종양 세포 및/또는 조직이 방사선 치료 또는 화학치료제에 노출되는 방법을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 표적화된 종양 세포 및/또는 조직은 본 발명의 길항제 항체 단편에 추가로 HGF 저해제(즉, 항-HGF 항체) 또는 다른 항-HGFR 화합물(즉, 소분자 키나제 저해제)을 이용하여 치료된다. 추가 실시형태에서, 표적화된 종양 세포 및/또는 조직은 본 발명의 길항제 항체 단편에 추가로, 형질전환된 표현형의 유지에 적절한 다른 표적을 특이적으로 타격하는 분자(즉, 항-EGFR 분자)를 이용하여 치료된다.

HGFR의 활성화는 중요한 생물학적 과정이며; 그의 조절완화는 수많은 병리학적 병태를 야기한다. 따라서, 본 발명의 방법의 일 실시형태에서, 표적화된 세포(예를 들어, 암 세포)는 HGFR의 활성화가 동일한 조직 유래의 정상 세포에 비해 향상된 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 표적화된 세포의 사멸 또는 세포성장 정지를 야기한다. 예를 들어, 본 발명의 길항제 항체 단편과의 접촉은 HGFR 경로를 통해 신호에 대한 세포의 불능을 초래할 수 있는데, 이는 세포사 또는 세포 성장 정지를 초래한다.

본 발명은 또한 화학치료제, 약물, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적으로 활성인 독소 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성컨쥬게이트)를 포함하는, 면역컨쥬게이트 또는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)에 관한 것이다.

세포독성제 또는 세포정지제, 즉, 암 치료에서 종양 세포 성장을 사멸 또는 저해하기 위한 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 컨쥬게이트의 사용은, 이들 컨쥬게이트되지 않은 약물 작용제의 전신 투여가 정상 세포뿐만 아니라 제거되도록 추구되는 종양 세포에 대해 허용되지 않는 수준의 독성을 초래할 경우, 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화된 전달 및 그에 대한 세포내 축적을 허용한다.

본 발명의 항체 단편을 포함하는 치료적 제형은 저장을 위해 원하는 정도의 순도를 갖는 항체 단편을 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 수용액, 동결건조 또는 다른 건조 제형의 형태로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충제; 항산화제; 보존제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트제; 당; 염 형성 반대이온; 금속 착물 및/또는 비-이온성 계면활성제를 포함한다.

본 명세서의 제형은 또한 치료 중인 특정 적응증에 대해 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지니는 것을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 대해 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

활성 성분은 또한 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시된 기법에 의해 제조된 마이크로캡슐에 넣을 수 있다.

생체내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균이어야 한다.

지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 항체 단편을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반침투성 매트릭스를 포함하는데, 이 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.

본 발명의 항체 단편은 시험관내, 생체밖 및 생체내 치료적 방법으로 사용될 수 있다. 본 발명은 통상적인 1가 항체에 비해 우수한 특성을 갖는 항체 단편을 사용하는 것에 기반한 다양한 방법을 제공한다.

본 발명은 다양한 목적을 위해, 예를 들어 치료제, 예방제 및 진단제로서 사용될 수 있는 항체 단편을 제공한다.

본 발명의 항체 단편은 단독으로 또는 요법에서 다른 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 단편은 다른 항체, 화학치료제(들)(화학치료제의 칵테일을 포함), 다른 세포독성제(들), 항-혈관생성제(들), 사이토카인, 및/또는 성장 저해제(들)와 공동투여될 수 있다. 상기 언급한 이러한 병용 요법은 조합 투여(2 이상의 작용제가 동일 또는 별도의 제형으로 포함되는 경우) 및 개별적 투여를 포함하는데, 이 경우에, 본 발명의 항체의 투여는 부가 요법 또는 요법들의 투여 전 및/또는 후에 생길 수 있다.

본 발명의 항체 단편(및 부가적 치료제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내, 및 국소 치료를 위해 요망된다면 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 항체 단편은 펄스 주입에 의해, 특히 감소된 용량의 항체와 함께 적합하게 투여된다. 투여는 투여가 잠시 동안인지 또는 만성적인지 여부에 부분적으로 의존하여, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 본 발명의 항체 단편은 또한 국소로 또는 전신으로 투여되는 바이러스 벡터(즉, 렌티바이러스 벡터)에 의해 유전자 전달에 의해 전달될 수 있다.

본 발명의 항체 단편은 양호한 의학적 실행과 일치되는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이 내용에서 고려하는 인자는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유류, 개개 환자의 임상적 병태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 필요하지 않지만, 선택적으로 당해 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의한 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로 이전에 사용한 바와 동일한 투약량으로 및 이전에 사용한 바와 같은 투여 경로로 또는 지금까지 사용한 투약량의 약 1 내지 99%로 사용된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 단편의 적절한 투약량(단독으로 또는 화학치료제와 같은 다른작용제와 조합될 때)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체 단편이 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상 이력 및 항체에 대한 반응 및 담당의의 재량에 의존할 것이다. 항체 단편은 한꺼번에 또는 일련의 치료를 거쳐서 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 예를 들어 하나 이상의 개별적 투여에 의하든, 또는 연속적 주입에 의하든, 약 1㎎/㎏ 내지 15㎎/㎏의 항체가 환자에게 투여를 위한 최초 후보 투약량이다. 하나의 전형적 1일 투약량은 상기 언급한 인자에 따라서, 약 1㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏ 이상의 범위일 것이다. 병태에 따라서 며칠 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해, 질환 증상의 목적으로 하는 억제가 일어날 때까지 치료는 지속된다. 항체 단편의 하나의 예시적 투약량은 약 0.05㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏의 범위에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5㎎/㎏, 2.0㎎/㎏, 4.0㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 투약량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 예를 들어 약 6회 용량의 항체를 받도록) 투여될 수 있다. 초기의 더 높은 부하 용량 후에 1 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적 투약 요법은 항체의 약 4㎎/㎏의 초기 용량 후에 약 2㎎/㎏의 1주 유지 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 그러나, 다른 투약량 요법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.

결과

키메라 DN30 Fab의 생성 및 그의 생화학적 및 생물학적 특성의 특성규명.

치료적 가능성을 지니는 다른 단클론성 항체와 같이, DN30은 마우스에서 상승되었다. 따라서, 치료적 목적을 위한 인간에서의 직접적 사용은, 뮤린 분자가 항체 활성의 면역-매개 클리어런스를 야기하는 인간 항-뮤린 항체(HAMA)에 의해 인식되기 때문에, 적용가능하지 않다. 항체의 뮤린 불변 영역의 인간 면역글로불린(항체 키메라화)으로부터 유래된 서열로의 치환은 HAMA 반응을 강하게 감소시키는데 충분하다. 키메라화된 mAb 및 Fab는 임상에서 현재 사용되고 있다. 고전적 분자생물학 기법을 통해, 본 발명자들은 DN30 Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인을 인간 면역글로불린으로부터 유래된 불변 도메인으로 치환하였고: 경쇄 불변 도메인은 인간 카파 유형 도메인(하나 이상이 천연 인간 항체에서 나타남)으로 치환한 한편, 중쇄 CH1 불변 도메인은 인간 IgG1으로부터 유래된 상동성 도메인으로 치환하였다. 이 조합은 효과적이며: 키메라화된 DN30 Fab(MvDN30)는 고 친화도로 Met에 결합하고, Met 쉐딩을 유도하며, Met-중독 세포의 증식을 저해하는데, 이는 대응하는 뮤린 분자의 특성과 중복된다(도 1 및 도 2).

이중 불변 도메인 Fab의 분자 설계.

주형으로서 MvDN30 서열을 사용하여, 본 저해제는 각각의 경쇄 및 중쇄(이중 불변 도메인-Fab)에서 불변 도메인을 복제하였다. 새로 유전자 조작된 분자는 75 kD의 예측 분자량을 가진다. 본 발명자들은 2가지 상이한 DCD-Fab를 생성하였다. 제1 분자에서, 인간 불변 도메인을 나란히 복제하였고, 따라서 VH-CH1-CH1 키메라 중쇄 및 VL-CL-CL 키메라 경쇄를 생성하였다. 제2 분자에서, 말단 도메인을 서로 교환하였고, 따라서 VH-CH1-CL 키메라 중쇄 및 VL-CL-CH1 키메라 경쇄를 생성하였다(도 3). 대응하는 이합체 재조합 분자를 DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2로 칭하였다. 이들 새로운 분자를 암호화하는 cDNA를 발현 플라스미드 내로 클로닝시킨 다음, 진핵 세포 내로 발현시켰다. 서열의 C-말단에서 삽입한 스트렙태그 덕분에 세포 배양물 상청액으로부터 단백질을 정제하였다. 도 4는 정확한 분자량 크기를 갖는 정제된 재조합 분자의 환원 조건 하의 SDS-Page 분리를 나타낸다.

DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2는 고 친화도로 Met에 결합한다.

정제된 DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2를 Met 수용체에 결합되는 그들의 능력에 대해 특성규명하였다. 이를 위하여, 본 발명자들은 고체상에서 Met 엑토도메인을 사용하고 액체상에서 MvDN30, DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2를 사용하여 ELISA 분석을 수행하였다. 항-스트렙태그 항체를 사용하여 결합을 나타내었다(도 5). 이 분석은 3개의 DN30-유래 1가 분자가 유사한 친화도로 Met에 결합한다는 것을 나타내었다(MvDN30, K_d = 0.141 ± 0.03nM; DCD-MvDN30.1, K_d = 0.133 ± 0.02nM; DCD-MvDN30.2, K_d = 0.130 ± 0.03nM).

DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2는 Met 인산화를 유도하지 않는다.

본 발명자들은 새로운 DN30-유래 분자가 Met 인산화 분석에서 Met 효현제 활성을 나타낼 수 있는지 여부를 시험하였다. 이를 급성 리간드 자극에 대한 반응에서 Met 활성화를 결정하기 위한 표준 시스템을 나타내는 A459 인간 폐암 세포를 사용하여 분석하였다. 사실, A549 세포는 기본적 조건에서 불활성이지만, HGF 또는 리간드-모방 분자에 의해 활성화되기 쉬운 Met의 생리학적 수준을 발현시킨다(4, 10). 세포를 증가된 양의 MvDN30, DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2를 이용하여 15분 동안 자극하였다. 세포를 또한 양성 대조군으로서 HGF 및 DN-30 mAb로 자극하였다. 항-포스포Met 항체를 이용하는 면역블롯팅에 의해 Met 활성화를 결정하였다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 새로운 분자는 임의의 상당한 효현제 활성을 나타내지 않았다. DCD-MvDN30.1은 임의의 효현제 활성이 없는 MvDN30과 구별가능하지 않았다. DCD-MvDN30.2는 임의의 경우에 DN30 mAb 또는 HGF에 비해 무시가능한 최소의 잔여 효현제 활성을 보유하였다. 본 발명자들은 또한 Met의 하류의 효과기로서 작용하는 분자의 활성화를 확인하였다. HGF를 이용하는 자극이 세포밖 신호-조절 키나제 1과 2(ERK-1 및 ERK-2) 및 AKT/단백질 키나제 B(AKT)의 활성화를 유발하였지만, MvDN30으로서 DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2는 이들 신호 변환기의 인산화 상태에 영향을 미치지 않았다(도 7).

DCD- MvDN30 .1 및 DCD- MvDN30 .2는 Met 쉐딩을 유도한다.

본 발명자들은 또한 MvDN30으로부터 유래된 새로운 분자가 수용체 쉐딩 및 하향조절을 촉진하는 능력을 유지하는지 여부를 조사하였다. A549 세포를 DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 및 MvDN30과 함께 인큐베이션시켰다. 48시간 후에, Met의 세포밖 부분쪽으로 향한 단클론성 항체를 사용하여 면역블롯팅함으로써 조건화 배지 내 Met 엑토도메인의 존재를 분석하였다. Met의 총 세포 수준을 또한 동일한 항체를 사용하여 세포 용해물 상에서 결정하였다. 이 분석은 DCD-MvDN30.1과 DCD-MvDN30.2가 둘 다 Met 쉐딩을 효율적으로 유도하고, Met 하향 조절을 촉진하여, 세포밖 공간 내 가용성 Met 엑토도메인의 방출을 초래하고, 세포 내 Met 수준을 감소시켰다는 것을 나타내었다(도 8). 따라서, MvDN30과 같은 새로운 MvDN30 유래 분자는 모 DN-30 mAb의 길항적 특성과 효현적 특성 간의 완전한 분리를 달성하였다.

DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2는 HGF-유도 Met 인산화 및 하류의 신호전달을 저해한다.

본 발명은 DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2가 HGF-유도 Met 인산화 및 하류 신호전달을 저해할 수 있는지 여부를 조사하였다. A549 세포를 24시간 동안 DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 및 MvDN30과 함께 인큐베이션시킨 다음, HGF를 이용하여 15분 동안 자극하였다. 항-포스포Met 항체를 이용하여 면역블롯팅함으로써 Met 활성화를 결정하였다. 도 9에서 나타내는 바와 같이, MvDN30으로서 2개의 유전자 조작 분자는 Met 수용체를 효율적으로 하향조절하였고, 그의 인산화 수준을 강하게 손상시켰다. 이는 AKT 및 ERK-1,2 활성화의 저해를 초래하였다(도 9).

DCD- MvDN30 .1 및 DCD- MvDN30 .2는 MET-중독 앵커리지-의존적 세포 성장을 저해한다.

앵커리지-의존적 성장은 증식/생존을 위한 Met-신호전달에 의존하는 세포, 소위 MET-중독 세포에서만 Met-저해제에 의해 손상될 수 있다. 본 발명자들은 MET -중독 종양 세포(GTL-16, SNU-5, Hs746T, MKN-45 - 인간 위 암종 세포 - 및 H1993, EBC-1 - 인간 폐 암종 세포)의 완전한 패널을 분석하였다. 기하급수적으로 성장하는 세포를 증가된 농도의 DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2와 함께 인큐베이션시켰다. MvDN30을 양성 대조군으로서 분석에 포함시켰다. 72시간 후에, 발광 기반 ATP 분석을 사용하여 세포 성장을 결정하였다. MvDN30-유래 분자는 둘 다 용량-의존적 방식으로 모든 MET-중독 세포 성장을 저해하였다(도 10). 두 DCD 분자의 저해 특성은 시험한 모든 세포의 MvDN30 중 하나와 비슷하였다.

DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2는 앵커리지-독립적 세포 성장을 저해한다.

본 발명자들은 A549 세포의 앵커리지 독립적 성장을 저해하는 DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2의 능력을 시험하였다. 세포를 HGF와 함께 또는 없이 인큐베이션한 반고체 배지에서 파종하였고, DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 및 MvDN30으로 처리하였다. 2주 후에, 세포 콜로니를 염색하고 정량화하였다. 마찬가지로 이 분석에서, DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2는 MvDN30의 방식와 유사한 방식으로 HFG-의존적 콜로니 형성을 감소시켰다(도 11).

DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2는 MvDN30에 비해 개선된 생체내 약동학적 프로파일을 나타낸다.

본 발명자들은 DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2의 약동학적 특성을 MvDN30과 비교하여 연구하였다. 단일 용량의 상기 언급한 분자를 면역결핍 마우스에 복강내 주사에 의해 전달하였다. 처리 마우스로부터의 말초혈액을 전달 후 상이한 시점에 수집하였다. 연구 분자의 순환 농도를 혈청 샘플 상에서 수행한 ELISA에 의해 결정하였다. DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2는 MvDN30에 비해 더 높은 순환 수준에 도달되었다. 게다가, 분자는 둘 다 증가된 반감기를 나타내었고, 순환에서 더 길게 지속되었으며, 더 긴 시간 동안 생물학적으로 이용가능하였다. DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2 클리어런스는 MvDN30에 비해 강하게 개선된다(MVDN30에 비해 클리어런스 감소: DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2에 대해 각각 9.6 및 13.7배)(도 12 및 표 1).

상이한 DN30-유래 분자의 약동학적 파라미터
	t1/2	CL (㎖/h)	Vss(㎖)	Cmax (ng/㎖)	Tmax (h)	AUCtot (ng/㎖)h	kel (1/h)
MVDN30	8.41	4.36	11.96	7595	0.5	22933	0.082
DCD-MvDN30.1	10.53	0.45	5.77	24130	4	220188	0.066
DCD-MvDN30.2	10.27	0.32	4.36	24952	4	314667	0.068
t1/2: 반감기; CL; 클리어런스; Vss: 분포 용적; Cmax: 최대 분자 농도; Tmax: Cmax에 도달하는 시간; AUCtot: 곡선하 면적; Kel: 제거상수.

재료 및 방법

세포 배양물

EBC-1 인간 폐 암종 세포 및 MKN-45 위 암종 세포주를 일본 생물공급원 수집기관(Japanese Collection of Research Bioresources)(일본 오사카 소재)으로부터 얻었다. GTL-16 인간 위 암종 세포는 설명한 바와 같이 MKN-45로부터 유래되었다(11). 모든 다른 세포주를 ATCC-LGC 표준 파트너쉽(ATCC-LGC Standards partnership)(이탈리아 세스토산조반니에 소재)로부터 얻었다. 모든 세포주를 - DMEM 중의 Hs746T 및 IMDM 중의 SNU-5를 제외하고 RPMI 중에서 유지하였다. 세포 배지를 10%(SNU-5에 대해 20%) 소태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충하였다(배지, 혈청 및 글루타민은 미조리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 라이프 사이언스(Sigma Life Science)로부터 입수하였다).

단백질 조작

DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.

DCD-MvDN30.1 중쇄(서열번호 1 및 2)는 나란히 반복된 인간 면역글로불린 G1의 CH1 도메인(서열번호 5 및 6)에 융합된 야생형 DN30 Fab의 VH 도메인(2; 서열번호 3 및 4)에 대응한다. C-말단에서, 스트렙 태그(ST, 서열번호 7) 및 폴리-히스티딘 태그(HT, 서열번호 8)를 정제 및 검출 목적을 위해 첨가하였다. 전체 구조는 (N-으로부터 C-말단까지): VH-CH1-CH1-ST-HT에 대응한다. DCD-MvDN30.1 중쇄의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 각각 도 14A 및 도 14B에서 보고한다.

DCD-MvDN30.1 경쇄(서열번호 9 및 10)는 나란히 반복된 인간 면역글로불린 카파의 CL 도메인(서열번호 13 및 14)에 융합된 야생형 DN30 Fab(서열번호 11 및12)의 VL 도메인에 대응한다. 전체 구조는 (N-으로부터 C-말단까지) VL-CL-CL에 대응한다. DCD-MvDN30.1 경쇄의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 각각 도 13A 및 도 13B에서 보고한다.

DCD-MvDN30.2 중쇄(서열번호 15 및 16)는 인간 면역글로불린 G1의 CH1 도메인(서열번호 5 및 6) + 인간 면역글로불린 카파의 CL 영역(서열번호 13 및 14)에 융합된 야생형 DN30 Fab의 VH 도메인(서열번호 3 및 4)에 대응한다. 전체 구조는 (N-으로부터 C-말단까지): VH-CH1-CL에 대응한다. DCD-MvDN30.2 중쇄의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 각각 도 16A 및 도 16B에서 보고한다.

DCD-MvDN30.2 경쇄(서열번호 17 및 18)는 인간 면역글로불린 카파의 CL 도메인(서열번호 13 및 14) + 인간 면역글로불린 G1의 CH1(서열번호 5 및 6) + 스트렙 태그(ST, 서열번호7) 및 폴리-히스티딘 태그(HT, 서열번호 8)에 융합된 야생형 DN30 Fab의 VL 도메인(서열번호 11 및 12)에 대응한다. 전반적인 구조는 (N-으로부터 C-말단까지): VL-CL-CH1-ST-HT에 대응한다. 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 각각 도 15A 및 도 15B에서 보고한 DCD-MvDN30.2의 경쇄를 가진다.

DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2를 암호화하는 cDNA는 젠아트(GeneArt)(등록상표) 서비스(영국 페이즐리에 소재한 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))에 의해 화학적으로 합성하였다. DN30 Fab 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 각각 도 17 및 도 18에서 보고한다. CDR 영역은 뉴클레오타이드와 아미노산 서열 둘 다에서 밑줄 표시되어 있으며, 여기서 중쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호 19 내지 24에 제시된 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 가지고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호 25 내지 30에 제시된 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 가진다.

모든 작제물을 5' 말단에서 BamHI 부위 및 3' 말단에서 NotI 부위를 함유하도록 유전자 조작하였다. BamHI-NotI 단편을 pUPEX 발현 벡터(네덜란드 위트레흐트에 소재한 유-프로테인 익스프레스(U-Protein Express)) 내로 서브클로닝하였다. DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2의 중규모 생성을 유-프로테인 익스프레스에 의뢰하여 그것을 HEK(인간 상피 신장) 세포 내로 일시적 형질감염에 의해 달성하였다. 단백질을 스트렙 태그 및 폴리-히스틴 태그를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 PBS + 0.02% 트윈(Tween)-80(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 중에 보존하고 나서, 4℃에서 저장하였다. 환원 및 비환원 조건 둘 다에서 SDS-PAGE에 의해 순도를 결정한 후에 쿠마씨 염색하였다.

면역침전법 및 웨스턴 블롯팅

DO-24 항-Met mAb를 사용하여(4) 설명한 바와 같이(12) 면역침전법을 수행하였다. 다음의 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다: Met의 세포밖 부분에 위치된 도메인을 인식하는 항-인간 Met mAb 클론 DL-21(4); 항-포스포타이로신 mAb 클론 4G10 mAb(캘리포니아주 테메큘라에 소재한 밀리포어(Millipore)); 항-포스포-Met(Tyr 1234/1235), 항-포스포-Met(Tyr 1349), 항-포스포-Akt(Ser 473), 항-Akt, 항-포스포-ERK(Thr 202/Tyr 204) 및 항-ERK 다클론성 Abs(매사추세츠주 비버리에 소재한 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)).

ELISA 결합 분석

MvDN30, DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2의 결합을 고체상 중에서 Met-Fc 키메라(미네소타주 미네아폴리스에 소재한 알앤디 시스템즈(R&D Systems)) 및 액체상 중의 증가된 농도의 FLAG-태그 재조합 항체를 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 호스래디쉬 페록시다제(미조리주 올리베트에 소재한 IBA)에 컨쥬게이트된 항-스트렙태그 II 항체를 사용하여 결합을 나타내었다. 데이터를 분석하였고, 프리즘 소프트웨어(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프 패드 소프트웨어(Graph Pad Software))를 사용하여 데이터를 분석하고 적합화하였다. Met-Fc 키메라는 융합 단백질이되, 인간 IgG로부터 유래된 Fc 도메인은 프레임에서 Met 세포밖 부분과 융합된다.

Met 활성화 분석

하위 합류(Subconfluent) A549 인간 폐 암종 세포를 48시간 동안 무혈청 배지에서 인큐베이션시킨 다음, 표시된 농도의 재조합 HGF(알앤디 시스템즈) 또는 기재된 바와같이 정제된 DN-30 mAb, MvDN30, DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2를 이용하여 10분 동안 자극하였다(13). 자극 후에, 세포를 즉시 용해시키고, 기재된 바와 같이 처리하였다(12). 항-Met 항체(DO-24)를 이용하여 세포 추출물을 면역침전시키고 나서, SDS-PAGE에 의해 분해하고, 항-포스포 타이로신 항체(밀리포어(Millipore))를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 동일한 블롯을 항-Met 항체(DL-21)를 이용하여 재프로빙하여 면역침전된 Met의 양을 정규화하였다.

HGF-유도의 저해를 위해, Met 인산화 A549 세포를 MvDN30, DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2를 지니는 무혈청 배지에서 24시간 동안 처리한 다음, 상기 설명한 바와 같이 HGF로 자극하였다. 세포 단일층을 램나이(Laemmli) 완충제 및 동일한 양의 총 단백질을 이용하여 용해시키고 나서, SDS-PAGE에 의해 아크릴아마이드겔로 분리시키고, 항-포스포-Met(Tyr 1234/1235) 항체를 이용하여 면역블롯팅에 의해 분석하였다.

Met 쉐딩의 분석

하위합류 A549 단일층을 PBS로 2회 세척한 다음, 표시한 농도의 DN-30 FAb 또는 mAb로 무혈청 배지에서 인큐베이션시켰다. 48시간 후에, 조건화된 배지를 수집하고 나서, 세포를 램나이 완충제로 용해시켰다. Met 단백질 수준을 항-Met DL-21 mAb를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 50㎍의 총 세포 용해물 중에서 및 50㎕의 세포 배양물 상청액 중에서 결정하였다.

시험관내 생물학적 분석

세포 성장 분석을 위해, 세포를 10% FBS를 함유하는 배지에서 96 웰-접시(1,000개 세포/웰)에 파종하였다. 24시간 후에, 배지를 표시한 농도에서 DN30-유래 분자 + 5% FCS 항체를 함유하는 새로운 배지로 대체하였다. 72시간 후에 제조업자의 설명서에 따라 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 발광 세포 생존 분석(위스콘신주 메디슨에 소재한 프로메가 코포레이션(Promega Corporation))을 사용하여 세포수를 평가하였다. 멀티라벨 리더 퍼킨엘머 2030(Multilabel Reader PerkinElmer 2030) 장치(핀란드 투르쿠에 소재한 퍼킨엘머 라이프 및 어날리티컬 사이언스(PerkinElmer Life and Analytical Sciences))를 이용하여 화학-발광을 검출하였다.

앵커리지-독립적 성장 분석에 대해, 2% FBS 및 0.5% 시플라크 아가로스(SeaPlaque agarose)(메인주 록랜드에 소재한 BMA)를 함유하는 배지에서 48 웰-접시(500개 세포/웰) 중에 파종하였다. 항체(1.5μM) 및 HGF(50ng/㎖)를 3일마다 배양 배지에 첨가하였다. 배양의 21일 후에, 콜로니를 테트라졸륨염(시그마 라이프 사이언스)에 의해 염색하고, 메타모르프오프라인 소프트웨어(MetaMorphOffline Software)(캘리포니아주 서니베일에 소재한 몰레큘러 디바이스 엘엘씨(Molecular Device LLC))에 의해 스코어링하였다.

약동학적 분석

성체 면역결핍 NOD-SCID 마우스(체중 18 내지 22그램, 평균 20그램)에 100㎍의 DCD-MvDN30.1 또는 DCD-MvDN30.2 또는 MvDN30으로 IP 주사하였다. 상이한 시간에(MvDN30에 대해: 10, 20 및 30분, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48시간; DCD-MvDN30.1 및 DCD-MvDN30.2에 대해: 전달 후 30분, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48, 72, 96, 144시간) 말초 혈액을 수집하였다. 결합 분석 부문에서 상기 설명한 바와 같이 ELISA에 의해 치료 분자 농도를 평가하고, 상이한 정제 분자의 단계 희석에 의해 얻은 표준 곡선의 선형 부분에 대한 샘플의 흡광도값을 보간하였다. 각각의 시점은 적어도 3마리 마우스의 평균값이었다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Metheresis Translational Research S.A. <120> New antibody fragments, compositions and uses thereof <130> BWO15799-CF <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1155 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DCD-MvDN30.1 heavy chain <400> 1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60 gtccaactgc aacagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240 gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300 caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagctagca cgaagggccc atcggtcttc 420 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 480 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 660 agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgcaagcac gaagggccca 720 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 780 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 840 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 900 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 960 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1020 cacacaggtg ccgcatggag ccacccccag ttcgaaaaag gggccgcatg gagccacccc 1080 cagttcgaaa aaggggccgc atggagccac ccccagttcg aaaaaggggc cgcacaccat 1140 caccatcacc attag 1155 <210> 2 <211> 384 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DCD-MvDN30.1 heavy chain aa <400> 2 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Gly His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 115 120 125 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 165 170 175 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 180 185 190 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 245 250 255 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 260 265 270 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 275 280 285 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 290 295 300 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 305 310 315 320 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 325 330 335 Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu 340 345 350 Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp 355 360 365 Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His His His His His 370 375 380 <210> 3 <211> 334 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DN30 VH domain <400> 3 ggtccaactg caacagcctg ggactgaact ggtgaagcct ggggcttcag tgaagctgtc 60 ctgcaaggct tctggctaca ccttcaccag ttactggata cactgggtga agcagaggcc 120 tggacaaggc cttgagtgga ttggagagat taatcctagc agcggtcgta ctaactacaa 180 cgagaaattc aagaacaagg tcacagtgac tgtagacaaa tcttccacca cagcctacat 240 gcaactcagc aacctgacat ctgaggactc tgcggtctat tactgtgcaa gtaggggcta 300 ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 334 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DN30 VH domain aa <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 5 <211> 315 <212> DNA <213> artificial <220> <223> human CH1 domain <400> 5 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 60 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 120 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 180 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 240 aacgtgaatc 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<220> <223> DCD-MvDN30.1 light chain <400> 9 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 180 caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa ccttgaatct 240 ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 300 cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga agacccgctc 360 acgttcggtg ctggtaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgtactgtg 720 gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 780 tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 840 gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 900 agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 960 gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 1020 aggggagagt gttaa 1035 <210> 10 <211> 344 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DCD-MvDN30.1 light chain aa <400> 10 Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Val 225 230 235 240 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 245 250 255 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 260 265 270 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 275 280 285 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 290 295 300 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 305 310 315 320 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 325 330 335 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 340 <210> 11 <211> 336 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DN30 VL domain <400> 11 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 120 caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa ccttgaatct 180 ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 240 cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga agacccgctc 300 acgttcggtg ctggtaccaa ggtggagatc aaacga 336 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DN30 VL domain aa <400> 12 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 13 <211> 318 <212> DNA <213> artificial <220> <223> human CL domain <400> 13 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgt 318 <210> 14 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> human CL domain aa <400> 14 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 15 <211> 1023 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DCD-MvDN30.2 heavy chain <400> 15 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60 gtccaactgc aacagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240 gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300 caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagctagca cgaagggccc atcggtcttc 420 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 480 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 660 agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtactgtggc tgcaccatct 720 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 780 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 840 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 900 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 960 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 1020 taa 1023 <210> 16 <211> 340 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DCD-MvDN30.2 heavy chain aa <400> 16 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Gly His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 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310 315 320 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 325 330 335 Arg Gly Glu Cys 340 <210> 17 <211> 1167 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DCD-MvDN30.2 light chain <400> 17 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 180 caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa ccttgaatct 240 ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 300 cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga agacccgctc 360 acgttcggtg ctggtaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgtgcaagc 720 acgaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 780 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 840 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 900 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 960 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 1020 tgtgacaaaa ctcacacagg tgccgcatgg agccaccccc agttcgaaaa aggggccgca 1080 tggagccacc cccagttcga aaaaggggcc gcatggagcc acccccagtt cgaaaaaggg 1140 gccgcacacc atcaccatca ccattag 1167 <210> 18 <211> 388 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DCD-MvDN30.2 light chain aa <400> 18 Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Ser 225 230 235 240 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 245 250 255 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 260 265 270 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 275 280 285 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 290 295 300 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 305 310 315 320 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 325 330 335 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Ala Ala Trp Ser His 340 345 350 Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 355 360 365 Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His 370 375 380 His His His His 385 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DN30 CDRH1 aa <400> 19 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DN30 CDRH1 <400> 20 ggctacacct tcaccagtta ctgg 24 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DN30 CDRH2 aa <400> 21 Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr 1 5 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DN30 CDRH2 <400> 22 attaatccta gcagcggtcg tact 24 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DN30 CDRH3 aa <400> 23 Ala Ser Arg Gly Tyr 1 5 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DN30 CDRH3 <400> 24 gcaagtaggg gctac 15 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DN30 CDRL1 aa <400> 25 Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DN30 CDRL1 <400> 26 caaagtgttg attatgatgg tggtagttat 30 <210> 27 <211> 3 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DN30 CDRL2 aa <400> 27 Ala Ala Ser 1 <210> 28 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DN30 CDRL2 <400> 28 gctgcatcc 9 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DN30 CDRL3 aa <400> 29 Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DN30 CDRL3 aa <400> 30 cagcaaagtt atgaagaccc gctcacg 27

Claims

경쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 중쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 항체 단편으로서, 2개의 불변 도메인은 경쇄 불변 도메인이고, 2개의 불변 도메인은 중쇄 CH1 불변 도메인이고, 상기 항체 단편은 상기 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab 단편보다 연장된 생체내 반감기를 가지며,
여기서 상기 제1 폴리펩타이드는 1개의 경쇄 가변 도메인과 2개의 인간 경쇄 불변 도메인을 포함하되, 상기 경쇄 가변 도메인은 제2 경쇄 불변 도메인과 융합된 제1 인간 경쇄 불변 도메인과 N-말단에서 C-말단 방향으로 융합되어, VL-CL-CL 키메라 경쇄를 생성하고,
상기 제2 폴리펩타이드는 1개의 중쇄 가변 도메인과 2개의 인간 중쇄 불변 도메인을 포함하되, 상기 중쇄 가변 도메인은 제2 인간 중쇄 CH1 불변 도메인과 융합된 제1 인간 중쇄 CH1 불변 도메인과 N-말단에서 C-말단 방향으로 융합되어, VH-CH1-CH1 키메라 중쇄를 생성하는 것인,
항체 단편.
경쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 중쇄 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 항체 단편으로서, 2개의 불변 도메인은 경쇄 불변 도메인이고, 2개의 불변 도메인은 중쇄 CH1 불변 도메인이고, 상기 항체 단편은 상기 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 Fab 단편보다 연장된 생체내 반감기를 가지며,
여기서 상기 제1 폴리펩타이드는 1개의 경쇄 가변 도메인, 1개의 인간 경쇄 불변 도메인 및 1개의 인간 중쇄 CH1 불변 도메인을 포함하되, 상기 경쇄 가변 도메인은 인간 경쇄 불변 도메인과 융합되고, 인간 경쇄 불변 도메인은 인간 중쇄 CH1 불변 도메인과 N-말단에서 C-말단 방향으로 융합되어, VL-CL-CH1 키메라 경쇄를 생성하고,
상기 제2 폴리펩타이드는 1개의 중쇄 가변 도메인, 1개의 인간 중쇄 CH1 불변 도메인 및 1개의 인간 경쇄 불변 도메인을 포함하되, 상기 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 CH1 불변 도메인과 융합되고, 인간 중쇄 CH1 불변 도메인은 인간 경쇄 불변 도메인과 N-말단에서 C-말단 방향으로 융합되어, VH-CH1-CL 키메라 중쇄를 생성하는 것인,
항체 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 경쇄 가변 도메인은, 비-인간 항체로부터의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 포함하는 비-인간 경쇄 가변 도메인 또는 인간 또는 인간화된 경쇄 가변 도메인 가운데 선택되는 것인, 항체 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은, 비-인간 항체로부터의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 비-인간 중쇄 가변 도메인 또는 인간 또는 인간화된 중쇄 가변 도메인 가운데 선택되는 것인, 항체 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 경쇄 불변 도메인은 인간 카파 경쇄 불변 도메인인, 항체 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중쇄 CH1 불변 도메인은 인간 감마 중쇄 CH1 불변 도메인인, 항체 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중쇄 CH1 불변 도메인은 인간 IgG1로부터 유래되는 것인, 항체 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 간세포 성장 인자 수용체(HGFR)에 특이적으로 결합하는, 항체 단편.
제3항에 있어서, 인간화된 경쇄 가변 도메인이 서열번호 25, 27 및 29에 제시된 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것인, 항체 단편.
제4항에 있어서, 인간화된 중쇄 가변 도메인이 서열번호 19, 21 및 23에 제시된 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것인, 항체 단편.
제1항 또는 제2항의 항체 단편 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
종양 및/또는 전이로 고통받고 있는 환자의 치료에서 사용하기 위한, 제1항 또는 제2항의 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
삭제
종양 및/또는 전이의 치료에서 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용하기 위한 병용 제제로서, 제1항 또는 제2항에 따른 항체 단편, 및 적어도 1종의 HGF 저해제 및 HGFR 저해제를 함유하는, 제품.
제14항에 있어서, 상기 적어도 1종의 저해제는 항-HGF 항체, HGF와 경쟁하는 재조합 분자, 소분자 HGFR 저해제, 항-HGFR 항체 또는 저해제로부터 선택되는 것인, 제품.
제1항 또는 제2항에 따른 항체 단편을 암호화하는 단리된 핵산.
제1항 또는 제2항에 따른 항체 단편을 암호화하는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
제1항 또는 제2항에 따른 항체 단편을 암호화하는 2 이상의 핵산을 포함하는 조성물.
제18항에 있어서, 종양 및/또는 전이로 고통받는 환자의 치료에서 사용하기 위한 조성물.
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