JP7381555B2 - 腫瘍および／または転移の治療のための抗－ｈｇｆｒ抗体およびｈｅｇｆｒの組み合わせ - Google Patents

Description

本開示は、腫瘍および／または転移、好ましくは転移の治療のための、治療的薬剤の新規の組み合わせに関する。

転移拡散は、がん細胞が細胞間相互作用を破壊し、細胞外マトリックスを通って遊走し、それらの起源部位以外の組織において生存および増殖する能力に基づく。この複雑なプログラム（「浸潤性増殖」として知られる）の生理学的対応物は、胚形成の根底にあり、成人期中の創傷治癒および臓器再生の要因となる。浸潤性増殖は特異的な細胞外シグナルによって厳密に制御されていて、そのうちの１つが、ＭＥＴがん遺伝子によってコードされる受容体に関するリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である。異常な活性化の状態では、ＨＧＦ／ＭＥＴシグナリングが、広範なヒト悪性腫瘍において、腫瘍の発症、進行および転移を引き起こす（ｄｒｉｖｅ）。少数事象では、ＭＥＴは「ドライバー」がん遺伝子として挙動し、腫瘍細胞は、増殖および生存に関して構成的なＭＥＴシグナリングに依存している（「ＭＥＴ依存性（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）」）。この状態は、遺伝子障害、主に遺伝子コピー数の増大、または、（より頻度が低い）構成的なリガンド非依存性の受容体活性化をもたらす突然変異^２の存在に依拠する。このコンテキストにおいて、ＭＥＴ阻害剤を用いた治療は非常に効果的であり、細胞増殖の阻止および細胞周期停止をインビトロで誘導し、腫瘍増殖の阻害をインビボで誘導する。同一細胞内でのリガンドおよび受容体の共発現は、連続的なＭＥＴ活性化を達成するためにがんによって利用される別のストラテジーであり、主に、非上皮ヒトがん、例えば骨肉腫、グリア芽腫および多発性骨髄腫において説明されている。しかしながら、ほとんどの場合において、腫瘍における異常なＭＥＴ活性化は、野生型遺伝子の転写上方調節に起因した受容体過剰発現が原因となっていて、リガンド刺激に対するがん細胞感作をトリガーする^３。後者の場合では、ＭＥＴシグナリング（浸潤促進性および抗－アポトーシス性の応答をもたらす）は、ストレス状態を迂回するためのストラテジーとしてがん細胞によって利用されていて、悪性表現型をブーストする（「ＭＥＴ好都合性（ＭＥＴ ｅｘｐｅｄｉｅｎｃｅ）」^６）。特有の遺伝子障害が存在しない場合は、ＭＥＴは腫瘍増殖に厳密に必要なものではないが、リガンドの存在は受容体活性化を維持して、悪性表現型を高める。最終的に、ＭＥＴは、グリア芽腫におけるがん「幹－前駆」細胞の機能性マーカーとして挙動して^８、結腸直腸がんおよび乳がんにおける「幹」表現型を支持する^{１２、１５}。さらに、間質由来ＨＧＦは、結腸直腸がん幹細胞のＷＮＴ自己再生経路を維持し、結腸がんを発生させる細胞の増殖を促進させて、抗－ＥＧＦＲ療法に対する抵抗性をトリガーすることが示されている^２７。

ＭＥＴまたはＨＧＦを標的化する複数のストラテジー（小分子インヒビター、抗体または組み換えタンパク質のいずれか）が設計されていて、現在研究中である。それらのうち、ＭｖＤＮ３０抗体は、ＭＥＴの細胞外ドメインに結合する一価キメラＦａｂフラグメントであり、細胞表面から受容体のタンパク質分解切断（「シェディング」）を誘導する^{２１、２８}。ＤｅｃｏｙＭＥＴは、ＭＥＴの細胞外領域全体を包含する組み換え可溶性受容体であり；高い親和性でＨＧＦに結合し、リガンド主導の（ｄｒｉｖｅｎ）生物学的活性をインビトロおよびインビボで阻害する（レンチウイルスベクター技術によって^１７またはＦｃ－融合タンパク質として^７、２６発現された場合）。生体系の大部分と同様に、シグナル伝達鎖の単一の要素を攻撃しても、応答の完全な遮断を生じさせることはあまりない。したがって、ＭＥＴの場合、全ての分子が１００％阻害を達成するわけでは決してなく、残りの活性はＨＧＦ刺激に感受性のままである。

本開示の目的は、腫瘍患者の治療において有用な抗－腫瘍薬剤の新規の組み合わせを提供することである。

本発明によれば、上記目的は、次のクレームにおいて明確に呼び起こされる（ｒｅｃａｌｌｅｄ）要旨により達成されて、それらは本開示の不可欠な部分を形成するものとして理解される。

本発明は、腫瘍および／または転移、好ましくは転移を患っている患者の治療における使用のための、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分と組み合わせた抗－肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）抗体フラグメントを提供し、ここで：
（ｉ）抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分のエピトープに結合することが可能なパラトープを１つのみ有し、ＨＧＦＲへ向けたアンタゴニスト活性を有し
（ｉｉ）ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、安定した様式で肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に結合することが可能であり、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントによって認識されるエピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントがそれに結合するのを防ぎ、および
（ｉｉｉ）抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、（ａ）タンパク質形態で、または（ｂ）核酸形態で、患者へ投与するのに適切である。

本発明はここに、純粋に例示的および非例示的な例として、添付の図面を参照して詳細に説明される。

ＤＮ３０抗体に結合しない突然変異ｄｅｃｏｙＭＥＴ受容体の産生。 （Ａ）ヒト、マウス、ラットおよびイヌＭＥＴの３番目および４番目のＩＰＴドメインのアミノ酸配列の比較。もっぱらマウス配列においてのみで変更された残基を黒背景に白の太字で強調し、ラットまたはイヌの配列においても（またはラットまたはイヌの配列においてのみ）変更されたアミノ酸を太字で強調している。ＩＰＴ－３／ＩＰＴ－４境界のみを示す。（Ｂ）単一アミノ酸置換を保有するＤｅｃｏｙＭＥＴ受容体を、ＤＮ３０抗体とともにインキュベートした。プロテインＡ（抗体に結合する）を用いて複合体を免疫沈降させて、ＨＲＰコンジュゲート・ストレプトアクチン（ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ）（ｄｅｃｏｙ内のｓｔｒｅｐタグに結合する）を用いて明らかにした（左パネル）。免疫沈降に用いた標準化上清の３０μｌをＳＤＳ ＰＡＧＥに用いて、ｄｅｃｏｙＭＥＴ受容体のローディングを確認した（右パネル）。（Ｃ）ＥＬＩＳＡ結合分析。ＤＮ３０ ｍＡｂは液相内であり、野生型ｄｅｃｏｙＭＥＴまたはｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}は固相内であった。ＨＲＰ－コンジュゲート抗－マウス抗体を用いて抗体結合を検出した。ＯＤ，４５０ｎｍでの光学濃度。各ポイントはトリプリケートでの値の平均±ＳＤである。 ｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} は、高い親和性でＨＧＦに結合し、ＨＧＦによって誘導されるＭＥＴリン酸化を阻害する。 （Ａ）ＥＬＩＳＡ結合分析。野生型ｄｅｃｏｙＭＥＴまたはｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}は固相内であった；増加する濃度のＨＧＦを液相内に添加した。ビオチン化抗－ＨＧＦ抗体を用いてＨＧＦ結合を検出した。各ポイントは、トリプリケートでの値の平均±ＳＤである。（Ｂ）ＨＧＦによって誘導されるＭＥＴリン酸化。Ａ５４９細胞を野生型ｄｅｃｏｙＭＥＴまたはｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}（２μＭ）とともにインキュベートして、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。抗－ホスホＭＥＴ（上パネル）、抗－ＭＥＴ抗体（中央パネル）または抗－ビンキュリン抗体（下パネル）を用いて、全細胞溶解物を免疫ブロットした。ｐ１４５，ＭＥＴの成熟型；ｐ１９０，ＭＥＴの単鎖前駆体；ｐ１１７，ビンキュリン。 ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} は、ＨＧＦによって誘導されるＭＥＴリン酸化およびＭＥＴ主導の生物学的活性の減少において協同する。 （Ａ）ＨＧＦによって誘導されるＭＥＴリン酸化。Ａ５４９ヒト肺腺がん細胞を、２μＭ ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}、１２５ｎＭ ＭｖＤＮ３０または２つの組み合わせとともにインキュベートして、５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦを用いて刺激した（またはしなかった）。抗－ホスホＭＥＴ（上パネル）、抗－ＭＥＴ抗体（中央パネル）または抗－ビンキュリン（下パネル）を用いて全細胞溶解物を免疫ブロットした。ｐ１４５，ＭＥＴの成熟型；ｐ１９０，ＭＥＴの単鎖前駆体；ｐ１１７，ビンキュリン。（Ｂ）ＨＧＦによって誘導されるＥＲＫおよびＡＫＴリン酸化。Ａ５４９ヒト肺腺がん細胞を、５００ｎＭ ＭｖＤＮ３０、２μＭ ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}または２つの組み合わせとともにインキュベートして、１００ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦを用いて刺激した（またはしなかった）。抗－ホスホＥＲＫ、抗－ＥＲＫ、抗－ホスホＡＫＴ、抗－ＡＫＴ、抗－ＧＡＰＤＨを用いて全細胞溶解物を免疫ブロットした。ｐ４２／４４，ＥＲＫ；ｐ６０，ＡＫＴ；ｐ３６，ＧＡＰＤＨ。（Ｃ）オートクリンＨＧＦ刺激によって維持される足場非依存性増殖。Ｕ８７－ＭＧヒト膠芽腫細胞（ＨＧＦおよびＭＥＴタンパク質の両方を発現する）を、０．５μＭ ＭｖＤＮ３０または１μＭ ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を、単独または組み合わせで用いて処理した。グラフは、処理なしコントロールと比較した各処理に関する平均コロニー増殖のパーセンテージを表わす。（Ｄ）パラクリンＨＧＦ刺激によって維持される足場非依存性増殖。Ａ５４９細胞を、３０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦを用いて刺激して、１μＭ ＭｖＤＮ３０または１μＭ ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を、単独または組み合わせで用いて処理した。グラフは、ＨＧＦによって刺激されたコントロールと比較した各処理に関する平均コロニー増殖のパーセンテージを表わす。（Ｅ）トランスウェル浸潤アッセイ。ＨＰＡＦ－ＩＩヒト膵臓腺がん細胞を、１２．５ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦを用いて刺激して、０．５μＭ ＭｖＤＮ３０または１μＭ ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を、単独または組み合わせで用いて処理した。グラフは、ＨＧＦによって刺激されたコントロールと比較した浸潤のパーセンテージを表わす。右パネル，マトリゲル層を通って遊走した細胞の１つの代表的な画像／グループ。ｎ．ｔ．，処理されなかった細胞。倍率，２００×。各ポイントは、トリプリケートでの値の平均±ＳＤである。^＊＊＊＝Ｐ≦０．００１；^＊＊＝Ｐ≦０．０１；^＊＝Ｐ≦０．０５。 ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} の組み合わせは、ＨＧＦ－依存性ＭＥＴリン酸化を阻害する。 Ｕ８７ＭＧ（Ａ）、Ａ５４９（Ｂ）およびＨＰＡＦ－ＩＩ（Ｃ）細胞を、ＭｖＤＮ３０、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}または２つの組み合わせ（ＣＯＭＢＯ）を用いて処理した。ＨＰＡＦ－ＩＩおよびＡ５４９細胞を、ＨＧＦを用いて刺激した（またはしなかった）；ｎ．ｔ．，処理されなかった細胞。左パネル：抗－ホスホＭＥＴ（上列）およびファロイジン（下列）を示す代表的な共焦点断面。右のグラフは、バックグラウンドが差し引かれてファロイジンに対して標準化された、ホスホＭＥＴの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を報告する。各ポイントは、５つの値の平均±ＳＥＭである。バーは５０μｍである。^＊＊＊＝Ｐ≦０．００１；^＊＊＝Ｐ≦０．０１；^＊＝Ｐ≦０．０５。 ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} は、協同してＨＧＦ－依存性の細胞分散を阻害する。 （Ａ）細胞運動の分析。ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞を異なる濃度（０．０６、０．２５、１または４μＭ）のＭｖＤＮ３０またはｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}（単独または１：１の組み合わせ）とともに事前にインキュベートして、それから、６．２５ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦを用いて刺激した。細胞分散は、Ｘ－ＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ装置を用いてリアルタイムで監視されて、標準化された細胞指標（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌ Ｉｎｄｅｘ）として表される。各グラフは１つの処理濃度を指す。（Ｂ）１μＭ ＭｖＤＮ３０または１μＭ ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}（単独または組み合わせ）とともに事前インキュベートされて、それから６．２５ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦを用いて刺激された、ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞の代表的な画像。ｎ．ｔ．，処理されなかった細胞。（Ｃ）細胞運動曲線。効果＝各投与量の処理に関して実験の最後に測定されて、ＨＧＦ単独で得られた値に対して標準化されて、［１－ｘ］として表された、細胞指標の値。（Ｄ）薬物の組み合わせの分析。細胞運動曲線からの値を、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェアを用いて作成して（ｅｌａｂｏｒａｔｅ）、各濃度のＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}に関する組み合わせ指標（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）を計算した。ＣＩ＝１，協同作用（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）；ＣＩ＜１，相乗作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ）；ＣＩ＞１，拮抗作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）。 ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} の組み合わせは、皮下Ｕ８７－ＭＧ腫瘍の浸潤性表現型を減少させる。 Ｕ８７－ＭＧ細胞をＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス内に皮下注入した。腫瘍が８０～１００ｍｍ^３の体積に到達したときに、マウスを４つの同質なグループに階層化した：ビヒクル（ｎ＝１０）；ＭｖＤＮ３０（ｎ＝９）；Ｋ８４２Ｅ（ｎ＝９）；２つの組み合わせ（ｎ＝１０）。（Ａ）増加倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）として表された屠殺時の腫瘍体積。各バーはグループの平均±ＳＥＭである。（Ｂ）腫瘍負荷の組織化学的分析。ヘマトキシリン－エオシン染色された腫瘍断面の代表的な画像。矢印は、腫瘍と周囲組織の間の境界を指す。倍率１００×。 ｈＨＧＦ－Ｋｉマウス内へ同所性に注入された膵がん細胞の増殖およびアポトーシスに対する、ＭｖＤＮ３０またはｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} （単独および組み合わせ）の効果。 ルシフェラーゼ発現ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞をｈＨＧＦ－Ｋｉマウスの膵臓内に注入して、４つの同質なグループに階層化した：ビヒクル（ｎ＝１０）、ＭｖＤＮ３０（ｎ＝６）、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}（ｎ＝６）、２つの組み合わせ（ｎ＝６）。（Ａ）ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍによって検出された腫瘍生物発光。数字は、各実験グループの生物発光の全流束の平均値（光子／秒×１０^８）±ＳＥＭを示す。（Ｂ）Ｋｉ６７免疫組織化学によって測定された腫瘍細胞増殖の分析。左パネル，各実験グループの代表的な画像。倍率，２００×。右のグラフは、腫瘍あたり５つの画像の分析によって得られた平均値±ＳＥＭを報告する。増殖指標は、Ｋｉ６７陽性細胞／細胞合計数として計算される。（Ｃ）ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３の免疫蛍光によって測定された腫瘍細胞アポトーシスの分析。左パネル，各実験グループの代表的な画像。バーは５０μｍである。右のグラフは、腫瘍あたり８個の画像の分析によって得られた平均値±ＳＥＭを報告する。アポトーシス指標は、ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３陽性細胞／細胞合計数として計算される。バーは５０μｍである。^＊＊＊＝ｐ値＜０．００１；^＊＊＝ｐ値＜０．０１；^＊＝ｐ値＜０．０５。 ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} は、ｈＨＧＦ－Ｋｉマウスにおける膵がん細胞の転移伝播およびＭＥＴリン酸化を減少させる。 ルシフェラーゼ発現ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞をｈＨＧＦ－Ｋｉマウスの膵臓内に注入して、４つの同質なグループに階層化した：ビヒクル（ｎ＝１０）、ＭｖＤＮ３０（ｎ＝６）、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}（ｎ＝６）、２つの組み合わせ（ｎ＝６）。（Ａ）免疫蛍光によって測定された腫瘍内のホスホＭＥＴの状態。左パネル，抗－ホスホＭＥＴを示す各実験グループの代表的な共焦点断面。右のグラフは、バックグラウンドが差し引かれてＤＡＰＩに対して標準化された、ホスホＭＥＴの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を報告する。各ポイントは、１２個の値の平均±ＳＥＭである。バーは５０μｍである。（Ｂ）Ｅ－カドヘリンおよびビメンチン発現の免疫蛍光分析によるＨＰＡＦ－ＩＩ腫瘍のＥＭＴ表現型の評価。左パネル，各実験グループの代表的な画像。抗－Ｅ－カドヘリン（上列）、抗－ビメンチン（下列）。バーは５０μｍである。右のグラフは、各腫瘍あたり６個の画像の分析によって得られた平均値±ＳＥＭを報告する。ＥＭＴ表現型は、ビメンチン／Ｅ－カドヘリン比として表される。（Ｃ）組織化学的ＨＥ染色によって評価された、肺における転移小結節（ｎｏｄｕｌｅｓ）。左のグラフ：転移病変の数；各ポイントは、各マウスに関してスコア化された病変数を表わす。右のグラフ：転移病変の面積；各ポイントは、各マウスに関して測定された転移の平均面積を表わす。１０枚のスライド／マウスを分析した；転移病変をスコア化して、それらの面積をＩｍａｇｅＪで定量化した。^＊＊＊＝Ｐ≦０．００１；^＊＊＝Ｐ≦０．０１；^＊＝Ｐ≦０．０５。 抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む融合タンパク質の１つの実施態様の略図。 （Ａ）Ｎ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}およびＣ末にｓｃＭｖＤＮ３０のインフレーム融合によって生産された分子の図。（Ｂ）Ｎ末にｓｃＭｖＤＮ３０およびＣ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}のインフレーム融合によって生産された分子の図。２つの部分の間にリンカーが挿入されている。リンカーの配列は、（Ｃ）に挙げたものから選択することができる。ＳＥＭＡ、ＰＳＩ、ＩＰＴ １－４は、ｄｅｃｏｙＭＥＴの領域である。ＩＰＴ ４にある星は、８４２位における突然変異Ｋ→Ｅを表わす。抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、第２のリンカーによって接合された２つの鎖によって構成される。ＶＬ，可変軽領域；ＣＬ，定常軽領域；ＶＨ，可変重領域；ＣＨ，定常重領域。黒い四角は、精製／検出目的のために組み換えタンパク質内に含まれるＳｔｒｅｐｔ－Ｈｉｓタグを表わす。 抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む融合タンパク質の、ＭＥＴまたはＨＧＦに対する結合分析。 （Ａ）ＥＬＩＳＡによる、ＨＧＦに対する結合分析。左パネル，Ｎ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}およびＣ末にｓｃＭｖＤＮ３０を含む融合タンパク質の結合。右パネル，Ｎ末にｓｃＭｖＤＮ３０およびＣ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を含む融合タンパク質の結合。融合タンパク質またはｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}（ポジティブコントロール）は固相内であった。増加する濃度のＨＧＦを液相内に添加した。ビオチン化抗－ＨＧＦ抗体を用いてＨＧＦ結合を検出した。各ポイントは、トリプリケートでの値の平均±ＳＤである。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによる、ＭＥＴに対する結合分析。左パネル，Ｎ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}およびＣ末にｓｃＭｖＤＮ３０を含む融合タンパク質の結合。右パネル，Ｎ末にｓｃＭｖＤＮ３０およびＣ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を含む融合タンパク質の結合。野生型ｄｅｃｏｙＭＥＴは固相内であり、増加する濃度の異なる融合タンパク質は液相内であった；ポジティブコントロールとしてｓｃＭｖＤＮ３０をアッセイ内に含めた。ＨＲＰ－コンジュゲート抗－ヒトｋ鎖抗体を用いて抗体結合を検出した。ＯＤ，４５０ｎｍでの光学濃度。各ポイントは、トリプリケートでの値の平均±ＳＤである。 抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む融合タンパク質を用いた処理の際の腫瘍細胞増殖の阻害。 （Ａ）増加する濃度の、Ｎ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}およびＣ末にｓｃＭｖＤＮ３０を含む融合タンパク質を用いて処理されたＥＢＣ－１肺癌腫細胞の増殖。（Ｂ）増加する濃度の、Ｎ末にｓｃＭｖＤＮ３０およびＣ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を含む融合タンパク質を用いて処理されたＥＢＣ－１肺癌腫細胞の増殖。ポジティブコントロールとして、ｓｃＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の等モルの組み合わせ（Ｃｏｍｂｏ）をアッセイ内に含めた。細胞は、処理の３日後に分析された。サンプルはトリプリケートであり、バーはＳＤを表わす。（Ｃ）ＭｖＤＮ３０／ｄｅｃｏｙＫ８４２Ｅの組み合わせによって発揮される阻害活性と比較した、少なくとも３つの独立した実験による平均値として計算された各融合タンパク質に関するＩＣ_５０値を示す表。 抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む融合タンパク質を用いた処理の際の、腫瘍細胞運動の阻害。 ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞を、異なる融合タンパク質（３μＭ）とともに事前インキュベートして、それから、６．２５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを用いて刺激した。細胞分散を、Ｘ－ＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ装置を用いてリアルタイムで監視した（標準化された細胞指標として表される）。サンプルはトリプリケートであった。（Ａ）Ｎ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}およびＣ末にｓｃＭｖＤＮ３０を含む融合タンパク質を用いて処理された細胞。（Ｂ）Ｎ末にｓｃＭｖＤＮ３０およびＣ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を含む融合タンパク質を用いて処理された細胞。ポジティブコントロールとして、ｓｃＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の等モルの組み合わせ（ＣＯＭＢＯ）をアッセイ内に含めた。（Ｃ）ＨＧＦを用いて処理された細胞に対する、２つの独立した実験による平均値として計算された細胞運動のパーセンテージを示す表。 抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む融合タンパク質は、ｈＨＧＦ－Ｋｉマウスにおける膵がん細胞の転移伝播を減少させる。 ルシフェラーゼ発現Ｃａｐａｎ－１細胞をｈＨＧＦ－Ｋｉマウスの膵臓内に注入して、７個の同質なグループに階層化した：ビヒクル（ｎ＝１４）、１：１の組み合わせでのｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}およびｓｃＭｖＤＮ３０（２グループ）、および、Ｎ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}およびＣ末にｓｃＭｖＤＮ３０を含むか、または、Ｎ末にｓｃＭｖＤＮ３０およびＣ末にｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を含む、異なる融合タンパク質を試験するための４つのグループ。２つの異なるリンカー（Ｌ６０およびＬ１３４）を分析した。ＣＯＭＢＯ １（ｎ＝４）：ＭｖＤＮ３０は７ｘ週の送達およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}は２ｘ週の送達；ＣＯＭＢＯ ２（ｎ＝６）：ＭｖＤＮ３０は４ｘ週の送達およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}は２ｘ週の送達；Ｋ８４２Ｅ＿ｓｃＭｖＤＮ３０＿Ｌ６０（ｎ＝４）；ｓｃＭｖＤＮ３０＿Ｋ８４２Ｅ＿Ｌ６０（ｎ＝５）；Ｋ８４２Ｅ＿ｓｃＭｖＤＮ３０＿Ｌ１３４（ｎ＝５）；Ｋ８４２Ｅ＿ｓｃＭｖＤＮ３０＿Ｌ１３４（ｎ＝６）。全ての融合は２ｘ週の送達だった。（Ａ）分析された全てのマウスに対する、肝臓転移を保有するマウスの数を示す表。マウスは、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍによって肝臓において検出される生物発光が１０^５光子／秒よりも高い場合に陽性と考えられた。（Ｂ）ビヒクルによって処理されたグループに対する、各実験グループの肝臓においてＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍによって検出された生物発光のパーセンテージを示すグラフ。

以下の説明において、非常に多くの具体的な詳細が、実施態様の徹底的な理解を提供するために与えられる。実施態様は、その具体的な詳細の１つまたは複数を用いずに実施することができ、または、他の方法、構成要素、材料などを用いて実施することができる。他の例では、よく知られた構造、材料、または操作は、実施態様の態様を不明瞭にすることを避けるために、示されずまたは詳細に説明されない。

本明細書全体を通した言及「１つの実施態様（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一実施態様（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」は、実施態様に関連して記載される特定の特色、構造、または特徴が、少なくとも１つの実施態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通した様々な箇所における、語句「１つの実施態様では」または「一実施態様では」という表現は、必ずしも全てが同一の実施態様を指しているわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴は、任意の適切な様式で１つまたは複数の実施態様において組み合わされてよい。

本明細書中に提供される見出しは、便宜のためのみであり、実施態様の範囲または意味と解釈されない。

本開示は、腫瘍および／または転移の治療のための治療的薬剤の新規の組み合わせに関する。

本発明は、腫瘍および／または転移、好ましくは転移の治療における、より高い治療的ロバスト性が、ＨＧＦおよびＨＧＦＲの両方を標的化することによって達成され得るというアイディアに基づく。本明細書において証明される実験的データは、ＭＥＴ／ＨＧＦ軸の垂直阻害（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）が、腫瘍細胞増殖、運動性および浸潤をインビトロで効果的に妨げること、および、転移拡散をインビボで著しく減少させて、広範ながん発現野生型ＭＥＴにおける組み合わせの標的化療法を提供することを実際に示す。

一実施態様では、本発明は、腫瘍および／または転移、好ましくは転移を患っている患者の治療における使用のための、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分と組み合わせた抗－肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）抗体フラグメントに関し、ここで：
（ｉ）抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分のエピトープに結合することが可能なパラトープを１つのみ有し、ＨＧＦＲへ向けたアンタゴニスト活性を有し、
（ｉｉ）ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、安定した様式で肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に結合することが可能であり、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントによって認識されるエピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントがそれに結合するのを防ぎ、および
（ｉｉｉ）抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、（ａ）タンパク質形態で、または（ｂ）核酸形態で、患者へ投与するのに適切である。

好ましい実施態様では、本明細書中に開示される組み合わせ療法を用いた治療的処置の対象となる患者は、野生型ＭＥＴがん遺伝子を保有する（すなわち、彼／彼女は、ＭＥＴがん遺伝子内に遺伝子変異を保有しない）。

１つまたは複数の実施態様では、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、ここで軽鎖および重鎖可変ドメインは、非ヒトまたはヒト化であり、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は配列番号１～３に示されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含み、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は配列番号４～６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓを含む。

さらなる実施態様では、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、１つのヒト軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および１つのヒト重鎖ＣＨ１定常ドメイン（ＣＨ１）をさらに含み、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）はヒト軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）にＮ末からＣ末の方向で融合されて（その結果、ＶＬ－ＣＬ軽鎖を生じさせる）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）はヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインにＮ末からＣ末の方向で融合される（その結果、ＶＨ－ＣＨ１重鎖を生じさせる）。好ましい実施態様では、ＶＬ－ＣＬ軽鎖は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、ＶＨ－ＣＨ１重鎖は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

本発明に包含される異なる実施態様では、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは核酸形態である。そのような場合では、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、第１および第２の核酸分子によってコードされて、ここで：
（ｉ）第１の核酸分子は、配列番号９、１０および１１に示される核酸配列を有するＣＤＲｓを含む１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードし、ここで軽鎖は非ヒトまたはヒト化である；および
（ｉｉ）第２の核酸分子は、配列番号１２、１３および１４に示される核酸配列を有するＣＤＲｓを含む１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をコードし、ここで重鎖は非ヒトまたはヒト化である。

さらに好ましい実施態様では、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、第１および第２の核酸分子によってコードされて、ここで：
（ｉ）第１の核酸分子は、（ａ）配列番号９、１０および１１に示される核酸配列を有するＣＤＲｓを含む１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ここで軽鎖は非ヒトまたはヒト化である）、および（ｂ）１つのヒト軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を、５’から３’末の方向でコードし（すなわちＶＬ－ＣＬ軽鎖）；および
（ｉｉ）第２の核酸分子は、（ａ）配列番号１２、１３および１４に示される核酸配列を有するＣＤＲｓを含む１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ここで重鎖は非ヒトまたはヒト化である）、および（ｂ）１つのヒト重鎖ＣＨ１定常ドメイン（ＣＨ１）を、５’から３’末の方向でコードする（すなわちＶＨ－ＣＨ１重鎖）。

好ましい実施態様では、第１の核酸分子（ＶＬ－ＣＬ軽鎖をコードする）は、配列番号１５に記載の核酸配列を含み、好ましくはそれからなり、第２の核酸分子（ＶＨ－ＣＨ１重鎖をコードする）は、配列番号１６に記載の核酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

本発明によって包含されるさらなる実施態様では、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、抗－ＨＧＦＲ単鎖Ｆａｂフラグメントである。抗－ＨＧＦＲ単－Ｆａｂフラグメントは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、または、抗－ＨＧＦＲ単－Ｆａｂフラグメントは、配列番号１８に記載の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる、核酸分子によってコードされる。

１つまたは複数の実施態様では、本発明は、ＳＥＭＡ、ＰＳＩ、ＩＰＴ－１、ＩＰＴ－２、ＩＰＴ－３およびＩＰＴ－４ドメインを含むヒトＨＧＦＲの細胞外部分を提供する。

好ましい実施態様では、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、ここで配列番号１９の７９７位と８７５位の間のアミノ酸の１つまたは複数は突然変異している。本開示によれば、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、抗体はＨＧＦＲと相互作用しないがＨＧＦはヒトＨＧＦＲの細胞外部分に対するその結合能力を保持するような方法で、抗－ＨＧＦＲ抗体およびＨＧＦＲ上のＨＧＦ結合部位に関する知識に従って突然変異した配列を有する。さらに好ましい実施態様では、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、配列番号２０に示される配列を有する。

本発明によって包含されるさらなる実施態様では、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は核酸分子の形態であり、ここで核酸分子は、配列番号２１に記載の核酸配列を含み、好ましくはそれからなり、ここで配列番号２１の２３９１位と２６２５位の間の核酸の１つまたは複数は突然変異している。本開示によれば、核酸分子は、抗体はＨＧＦＲと相互作用しないがＨＧＦはヒトＨＧＦＲの細胞外部分に対するその結合能力を保持するような方法で、抗－ＨＧＦＲ抗体およびＨＧＦＲ上のＨＧＦ結合部位に関する知識に従って突然変異した配列を有するヒトＨＧＦＲの細胞外部分をコードする。さらに好ましい実施態様では、ヒトＨＧＦＲの突然変異した細胞外部分をコードする核酸分子は、配列番号２２に示される配列を有する。

本発明によって包含される異なる実施態様では、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、リンカーを用いて、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分にＮ末からＣ末の方向でコンジュゲートされて、その結果、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント－リンカー－ヒトＨＧＦＲの細胞外部分の融合タンパク質を生じさせる。あるいは、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、リンカーを用いて、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントにＮ末からＣ末の方向でコンジュゲートされて、その結果、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分－リンカー－抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントの融合タンパク質を生じさせる。

本発明によって包含される異なる実施態様では、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントをコードする核酸分子は、リンカーをコードする核酸分子を用いて、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分をコードする核酸分子に、５’から３’末の方向で連結されて、その結果、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント－リンカー－ヒトＨＧＦＲの細胞外部分の融合タンパク質をコードする。あるいは、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分をコードする核酸分子は、リンカーをコードする核酸分子を用いて、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントをコードする核酸分子に、５’から３’末の方向で連結されて、その結果、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分－リンカー－抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントの融合タンパク質をコードする。

本発明はしたがって、Ｎ末からＣ末の方向で：
（ｉ）抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント、リンカー、およびヒトＨＧＦＲの細胞外部分；または
（ｉｉ）ヒトＨＧＦＲの細胞外部分、リンカー、および抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント
を含む融合タンパク質を提供する。

好ましい実施態様では、上記に定義される融合タンパク質は、配列番号２３～２８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

本発明はしたがって、Ｎ末からＣ末の方向で：
（ｉ）抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント、リンカー、およびヒトＨＧＦＲの細胞外部分；または
（ｉｉ）ヒトＨＧＦＲの細胞外部分、リンカー、および抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント
を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を包含する。

好ましい実施態様では、上記に定義される融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２９～３４のいずれか１つから選択される核酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

さらなる実施態様では、本開示は、単一のボトルまたは２つのボトル内に、（ａ）抗－肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）抗体フラグメントおよび薬学的に許容できるビヒクル、および（ｂ）ヒトＨＧＦＲの細胞外部分および薬学的に許容できるビヒクルを含む医薬製品に関し、ここで：
（ｉ）抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分のエピトープに結合することが可能なパラトープを１つのみ有し、ＨＧＦＲへ向けたアンタゴニスト活性を有し、
（ｉｉ）ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、安定した様式で肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に結合することが可能であり、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントによって認識されるエピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントがそれに結合するのを防ぎ、
（ｉｉｉ）抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、タンパク質形態または核酸形態のいずれかである。

医薬製品はしたがって、単独または任意のそれぞれの組み合わせで、上記に開示される特色を有する抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む。

１つの態様では、本発明は、対象における腫瘍および／または転移を治療する方法を提供し、前記方法は、対象に、有効量の抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントをヒトＨＧＦＲの細胞外部分と組み合わせて投与するステップを含み、それにより、前記状態が治療される。

１つの態様では、本発明は、ＨＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害する方法を提供し、前記方法は、前記細胞を、本発明のヒトＨＧＦＲの細胞外部分と組み合わせた抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントと接触させるステップを含み、それにより、前記細胞の増殖の阻害を生じさせる。

１つの態様では、本発明は、がん性腫瘍および／または転移を有する哺乳類を治療的に処置する方法を提供し、前記方法は、前記哺乳類に、有効量の抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントをヒトＨＧＦＲの細胞外部分と組み合わせて投与するステップを含み、それにより、前記哺乳類を効果的に治療する。

１つの態様では、本発明は、細胞増殖性障害を治療する方法を提供し、前記方法は、そのような治療を必要とする対象に、有効量の抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントをヒトＨＧＦＲの細胞外部分と組み合わせて投与するステップを含み、それにより、前記細胞増殖性障害を効果的に治療または予防する。

１つの態様では、本発明は、哺乳類における腫瘍および／または転移を治療的に処置する方法を提供し、ここで前記腫瘍の増殖は、細胞増殖における増加、アポトーシスからの防御のいずれかまたは両方の結果としての、系ＨＧＦＲ／ＨＧＦの増殖増強効果に少なくとも部分的に依存する。前記方法は、腫瘍細胞を、本発明の有効量のヒトＨＧＦＲの細胞外部分と組み合わせた有効量の抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントと接触させるステップを含み、それにより、前記腫瘍および／または転移を効果的に治療する。

本発明の組み合わせ療法で効果的に治療することのできる腫瘍は、胸部、結腸直腸、肺、結腸、膵臓、前立腺、卵巣、頸部、中枢神経系、腎臓、肝細胞、膀胱、胃、頭頚部の腫瘍細胞、乳頭がん（例えば甲状腺）、黒色腫、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫／膠芽腫（例えば未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、退形成性乏突起膠腫、退形成性乏突起星細胞腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ））、白血病細胞、肉腫、横紋筋肉腫、または、原発不明がん（ＣＵＰ）由来の腫瘍から選択される。

１つの実施態様では、本発明の方法において治療的に標的化される細胞は、過剰増殖性および／または過形成性の細胞である。１つの実施態様では、本発明の方法において標的化される細胞は、形成異常の細胞である。さらに別の実施態様では、本発明の方法において標的化される細胞は、転移細胞である。さらなる実施態様では、本発明の方法において標的化される細胞は、腫瘍および／または転移を維持している微小環境に属するＨＧＦＲ発現細胞である。

本発明の治療的方法は、追加の治療ステップをさらに含むことができる。例えば、１つの実施態様では、治療的方法は、標的化される腫瘍細胞および／または組織が、放射線治療または化学療法の治療に曝されるステップをさらに含む。さらなる実施態様では、標的化される腫瘍細胞および／または組織は、本発明のヒトＨＧＦＲの細胞外部分と組み合わせた抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントに加えて、形質転換された表現型の保持において関連のある他の標的を特異的に攻撃する分子（すなわち抗－ＥＧＦＲ分子）を用いて処理される。

本明細書において用いられる抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントの「アンタゴニスト活性」という表現は、ＨＧＦＲ活性化の際に細胞内で誘発される細胞内シグナリングをクエンチングすることが可能な抗体を指す。前記抗体のアンタゴニスト活性は、従来の技術、例えば、ウエスタンブロット、免疫蛍光、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、細胞蛍光計（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）分析、または、ＨＧＦＲ、またはリン酸化される場合はＨＧＦＲ残基Ｔｙｒ^{１２３４－１２３５}（すなわちＭＥＴの主なリン酸化部位^９）、もしくはリン酸化される場合はＨＧＦＲ残基Ｔｙｒ^{１３４９／１３５６}（すなわちＭＥＴのドッキング部位^２２）を特異的に認識する抗体の使用を含む任意の他の方法による、ＨＧＦＲの発現レベルおよび／またはリン酸化の評価によって測定され得る。

本明細書において用いられる、「ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、安定した様式でヒトＨＧＦに結合することが可能」という表現は、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分が、１００ｎＭよりも高くない計算されたＫｄでＨＧＦに結合することを意味する。

本明細書において用いられる「ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントによって認識されるエピトープにおいて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む」という表現は、抗体可変ドメインによる上記領域の結合を防ぐＨＧＦＲの細胞外部分内の改変を誘導することが可能な、ＨＧＦＲの細胞外部分内の１つまたは複数の突然変異（すなわちアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入）の存在を意味する。当業者は、その共通の一般的知識を考慮して（とりわけ、ＤＮＡ複製中の特異的プライマーを用いた、所定のＤＮＡ配列内の単一のヌクレオチドの変更を含むｃＤＮＡを産生する可能性により表される Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）を参照）、ヒトＨＧＦに対して結合する能力を保持するが抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントに対して結合する能力は保持しないヒトＨＧＦＲの細胞外部分の突然変異形態の認識についてさらなる詳細は必要ではない。

当業者は、共通の一般的知識を考慮して、配列番号１９を有するヒトＨＧＦＲの細胞外部分の、抗－ＨＧＦＲ抗体がそれに結合するのを防ぐさらなる突然変異バージョンを生産することができるので、本発明は、本明細書中に開示されるヒトＨＧＦＲの突然変異した細胞外部分（すなわち配列番号８）のみを包含すると解釈されるべきでない。

本明細書において用いられる用語「単鎖Ｆａｂフラグメント」は、抗体のＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１ドメインをコードする単一ポリペプチドを指し、ここでＶＬおよびＣＬが前記ポリペプチドのＮ末に位置してフレキシブルリンカーによってＶＨおよびＣＨ１ドメインに連結されてよく、または、ＶＨおよびＣＨ１ドメインが前記ポリペプチドのＮ末に位置してフレキシブルリンカーによってＶＬおよびＣＬドメインに連結されてよい。

用語「ＳＥＭＡ」、「ＰＳＩ」、「ＩＰＴ－１」、「ＩＰＴ－２」、「ＩＰＴ－３」および「ＩＰＴ－４」は、ＨＧＦＲの細胞外領域を構成するＨＧＦＲドメインを指す。そのようなドメイン名は、とりわけ^４、１３によって示されるように当業者の共通の一般的知識に属する。ＳＥＭＡドメインは、セマフォリンおよびプレキシンと共通した、ＭＥＴ（配列番号１９）のアミノ酸２５～５１６の間に含まれる領域を包含するタンパク質相互作用モジュールであり；ＰＳＩは、プレキシン、セマフォリン、インテグリンと共通した、ＭＥＴ（配列番号１９）のアミノ酸５１９～５６１の間に含まれる領域を包含するドメインであり；ＩＰＴドメイン（４回繰り返される）は、プレキシンおよび転写因子と共通した、ＭＥＴ（配列番号１９）のアミノ酸５６３～９３４の間に含まれる領域を包含する免疫グロブリン様領域である。詳しくは、ＩＰＴリピート１は、配列番号１９のアミノ酸５６３位～６５６位をカバーし、ＩＰＴリピート２は、配列番号１９のアミノ酸６５７位～７４０位をカバーし、ＩＰＴリピート３は、配列番号１９のアミノ酸７４１位～８３７位をカバーし、ＩＰＴリピート４は、配列番号１９のアミノ酸８３８位～９３４位をカバーする。

本明細書中に開示される融合タンパク質は、とりわけＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）によって示される組み換えＤＮＡ技術に関連する分野の共通の一般的知識を考慮して、当業者によって、タンパク質の形態、または、融合タンパク質をコードする核酸分子の形態のいずれかで容易に製造され得る。例として、以下の標準的な手順に従うことができる：（ｉ）対応するｃＤＮＡ配列の合成、（ｉｉ）従来の組み換えＤＮＡ方法による、哺乳類における発現に適切なプラスミド内へのｃＤＮＡの挿入、（ｉｉｉ）上述のプラスミドを用いた哺乳類の細胞株の一過的または安定したトランスフェクション、（ｉｖ）培養上清の回収、（ｖ）アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製。２つのタンパク質配列、すなわち抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分をコンジュゲートするために用いられるリンカーは、異なる長さおよび／またはアミノ酸組成を有してよく、フレキシブル、リジッド、またはフレキシブルおよびリジッド領域の組み合わせである。融合タンパク質の生産に用いられるリンカーは、制限されないが、配列番号３５、３６および３７に記載のアミノ酸配列のいずれか１つから選択することができる。融合タンパク質をコードする核酸分子の生産に用いられるリンカーは、制限されないが、配列番号３８、３９および４０に記載の核酸配列のいずれか１つから選択することができる。

以下において、本発明は、ＷＯ２００７／０９０８０７に開示されるＤＮ３０モノクローナル抗体に属する配列番号１～６のＣＤＲｓを含む抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント、および、ＳＥＭＡ、ＰＳＩ、ＩＰＴ－１～ＩＰＴ－４ドメイン（以下においてＤｅｃｏｙＭＥＴと短縮して呼ぶ）を含むＨＧＦＲの細胞外部分の組み合わせを参照することによって例示される。

本発明者らは、予期せずに、一価ＤＮ３０抗体フラグメント（ＭｖＤＮ３０）およびＤｅｃｏｙＭＥＴは、組み合わせて用いられると、リガンドおよび受容体のデュアル標的化を可能にし、ＭＥＴ発現がん細胞およびＨＧＦ分泌腫瘍間質に対して同時に作用して、腫瘍および／または転移の治療において相乗効果を発揮することを発見した。

がん遺伝子「依存性（ａｄｄｉｃｔｅｄ）」がん細胞におけるＭＥＴチロシンキナーゼ受容体の薬理学的阻害は、細胞の増殖および浸潤を失わせる。したがって、ＭＥＴによって増幅される進行性ＮＳＣＬＣ、転移性の胃がんまたは食道がんを有する患者は、抗－ＭＥＴ療法に反応する^{５、１４、１９}。一方で、ＭＥＴ遺伝子変異のないがん細胞は、「好都合性（ｅｘｐｅｄｉｅｎｔ）」としてがん遺伝子によってトリガーされる「生理学的」プログラムを利用して悪性表現型をブーストする^６。「好都合性（ｅｘｐｅｄｉｅｎｃｅ）」は、そのリガンドＨＧＦによる野生型ＭＥＴの刺激を必要とする。この点で、がんの進行および転移に対する腫瘍微小環境の寄与は、ますます関連してくる（悪性表現型は、厳密に細胞自律的な方法では発生しないが、がん細胞と宿主間質の間のむしろ複雑な相互作用において発生することを実験的証拠が示唆しているので）。腫瘍微小環境は、ＨＧＦの重大な源であり、間葉起源の間質細胞によって不活性の前駆体（ｐｒｏＨＧＦ）として分泌される。後者は、ヘパラン硫酸に関するその結合性のおかげで細胞外マトリックス内に保存されて、腫瘍または間質細胞のいずれかによって産生される特異的なプロテアーゼによって活性化される。したがって、過剰の生物学的に活性のリガンドは、ＭＥＴ受容体に結合するのに容易に利用可能であり、「非依存性（ｎｏｎ－ａｄｄｉｃｔｅｄ）」細胞における浸潤性増殖シグナリングカスケードをトリガーする。本明細書において提供されるデータは、ＭＥＴ「好都合性（ｅｘｐｅｄｉｅｎｃｅ）」の状態において、ＭＥＴ／ＨＧＦ軸の両側を攻撃する同時性の（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）介入が、阻害活性の改善をもたらすことを示す。同時の（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）標的化は、一価ＭＥＴ抗体（ＭｖＤＮ３０）を組み換え可溶性受容体（ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}）と組み合わせて達成された。本明細書において提供されるデータは、補足的なツールを用いた同一パスウェイの標的化における重複性は存在しないことを示す。２つのインヒビターは、それらの作用メカニズムに基づいて選択された：抗体は、外部ドメインの「シェディング」により細胞表面からのＭＥＴの物理的除去を誘導する。後者は細胞外環境内に放出されて、ＨＧＦに関する「デコイ（ｄｅｃｏｙ）」として作用する。組み換えｄｅｃｏｙＭＥＴの外因的な供給は、ＭｖＤＮ３０によって生産される内因性ｄｅｃｏｙＭＥＴのＨＧＦ隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）活性を強化する。ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴの同時性の使用を可能にするために、ＭｖＤＮ３０相互作用が欠損しているがＨＧＦに対する高アフィニティ結合特性を備え持つ改変された可溶性受容体が生産された（ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}）。２つの薬剤は組み合わせて様々ながん細胞において協同し、効果的な治療的用量を減少させる。さらに、この「デュアルのストラテジー」は、強い相乗効果を示し、優れた抗－腫瘍有効性を潜在的に発揮する。幹／前駆がん細胞の亜集団におけるＭＥＴ発現は、ＭＥＴ「固有（ｉｎｈｅｒｅｎｃｅ）」、すなわち、がん幹細胞（遺伝子障害の不存在下）において活性化される生理学的な（固有の（ｉｎｈｅｒｅｎｔ））ＨＧＦによって誘導される細胞内応答として定義されていて、結腸直腸がんにおける上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）インヒビターのような標的化療法に対する抵抗性の要因である。がん幹細胞に関連する概念および従来の治療に対する抵抗性は広く認められていて、ＭＥＴ発現前駆細胞の幹表現型（ｓｔｅｍ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の維持における微小環境ＨＧＦの役割が、ますます確立されてきている。ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の組み合わせとしての効果的な抗－ＭＥＴ治療は、がん幹細胞を鈍らせて（ｂｌｕｎｔ）標的化療法に対する抵抗性の発現に対抗するための、治療的サポートを表わす。

宿主微小環境の役割は、ヒトがん細胞上の特異的な標的とミューリン間質由来因子の間の制限された交差反応性に起因して、マウス異種移植片において研究することが困難である。ミューリンＨＧＦはヒトＭＥＴを活性化しないので、これはＨＧＦ／ＭＥＴ系の場合において特に重大である。ノックインされたヒトＨＧＦ遺伝子を発現している遺伝子改変マウス株（ｈＨＧＦ－Ｋｉマウス）の開発はこの問題を回避した。このトランスジェニックモデルでは、環境ＨＧＦおよびがん細胞上のその受容体の同時性の標的化は、悪性進行および転移を妨げるための効果的な治療的ストラテジーであり得ることが示されている。

膵臓腺がんの異種移植片は、早発性の転移伝播によって特徴づけられ、腫瘍進行中の非常に初期に生じ、大量の間質区画によって維持される。最近になって、膵臓星細胞によって分泌されるＨＧＦは、このタイプの悪性腫瘍における腫瘍－間質相互作用において関連のある機能を果たす因子として同定された。ｈＨＧＦ－Ｋｉマウス内に移植されたヒト膵臓腺がんの同所性マウスモデルでは、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の組み合わせは、ＭＥＴがドライバーがん遺伝子でない場合に、「好都合性（ｅｘｐｅｄｉｅｎｃｅ）」のモデルにおいて予期されるように、腫瘍増殖をわずかに遅らせた。一方で、ｃｏｍｂｏ治療は転移拡散の減少において非常に効果的であることが判明し、野生型ＭＥＴを特徴とする非依存性（ｎｏｎ－ａｄｄｉｃｔｅｄ）がん細胞（ｎｏｎ－ａｄｄｉｃｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｅａｔｕｒｉｎｇ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ＭＥＴ）における可能性のある治療的適用を示唆した。疫学的データは、上皮がんのたった２～３％が、遺伝子の増幅、再配列または突然変異のいずれかが原因で、ＭＥＴがん遺伝子依存性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）に依拠することを示す^２９。この理由のため、多くの臨床試験－がん患者の非選択集団を扱う－は失敗した。一方で、癌腫の大部分は、低酸素状態、電離放射線または化学療法に応答して浸潤性転移表現型を解放する（ｕｎｌｅａｓｈ）ために、リガンド依存性の野生型ＭＥＴ活性化を利用する。したがって、これらの知見は、患者の大コホート（特有の遺伝子障害の不存在のせいでＭＥＴ標的化療法に現在のところ不適切である）は、ＨＧＦ主導のＭＥＴシグナリングの最適な遮断を可能にするデュアルの抗体－デコイのストラテジーを包含する治療により恩恵を受けるはずであることを示唆する。

本発明の活性成分、すなわち抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む治療的組成物は、一緒に混合された２つの活性成分を含む単一製剤として、または、一方が抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントを含み他方がヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む別個の製剤として、調製され得る。活性成分は、所望の程度の純度を有する活性成分（単数または複数）を、生理的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、水溶液、凍結乾燥または他の乾燥製剤の形態で、保管のために調製される。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファー；抗酸化；防腐剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；アミノ酸；単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤；糖類；塩形成対イオン；金属複合体および／または非イオン性界面活性剤を含む。本明細書中に開示される製剤はまた、治療される特定の適応症に関して、必要に応じて他の活性化合物（単数または複数）、好ましくは、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分の治療的活性に悪影響を及ぼさない補足的な活性を有するものを含んでよい。そのような分子は、意図する目的に効果的な量で、組み合わせで適切に存在する。

活性成分（単数または複数）は、とりわけＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される技術を用いて調製されるマイクロカプセル内にトラップされてもよい。

インビボ投与のために用いられる製剤は、滅菌されなければならない。

徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の適切な例は、本発明の活性成分を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、成形品の形態、例えばフィルム、またはマイクロカプセルである。

本発明の活性成分は、単独で、または、別の抗体、化学療法剤（単数または複数）（化学療法剤のカクテルを含む）、他の細胞傷害剤（単数または複数）、抗－血管新生剤（単数または複数）、サイトカイン、および／または増殖阻害剤（単数または複数）と組み合わせのいずれかで用いられ得る。上記のそのような組み合わせの治療は、組み合わせの投与（２以上の薬剤が同一または別個の製剤中に含まれる）、および別個の投与（その場合、本発明の抗体の投与は、補助の療法または治療の投与の前および／または後に生じてよい）を含む。

本発明の活性成分（および補助の治療的薬剤（単数または複数））は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与されて、局所治療のために必要な場合は、病巣内投与によって投与される。本発明の活性成分は、特に、減少する投与量の活性成分を用いて、パルスインフュージョンによって適切に投与され得る。投与は、投与が短期間または慢性的であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば静脈内または皮下注入のような注入によるものであってよい。本発明の活性成分は、局所的または全身性に投与されるウイルスベクター（すなわちレンチウイルスベクター）を用いて遺伝子導入によって送達することもでき、または、細胞療法、すなわち、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を発現するようにウイルスベクター形質導入（すなわちレンチウイルスベクター）によって遺伝子改変されたヒト細胞の静脈内の局所注入による送達を用いて送達することもできる。

本発明の活性成分は、適した医療行為と一貫した様式で処方され、投薬され、および投与される。このコンテキストにおいて考慮される因子は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医師に公知の他の因子を含む。本発明の活性成分は、問題となっている障害を予防または治療するために現在のところ用いられる１つまたは複数の薬剤とともに処方される必要はないが、処方されてもよい。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する本発明の活性成分の量、障害または治療のタイプ、および上述の他の因子に依存する。これらは、上記で用いられたのと同一の用量および投与経路で、または従前に用いられた用量の約１～９９％で一般に用いられる。

疾患の治療のために、本発明の活性成分の適切な用量は（単独、または化学療法剤（単数または複数）のような他の薬剤（単数または複数）と組み合わせて用いられる場合）、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、活性成分が予防的または治療的な目的のために投与されるのかどうかに依存して、患者の病歴および本発明の活性成分に対する応答が正当に考慮されて、主治医の裁量である。

抗体フラグメントは、１度に、または一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、約１ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇの抗体が、例えば１または複数の別個の投与によるにしても、または連続的なインフュージョンによるにしても、患者への投与のための最初の候補用量である。１つの典型的な毎日の用量は、上述の因子に応じて、約１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれよりも多い。数日またはより長くにわたる繰り返しの投与に関しては、状態に応じて、疾患症候の所望の抑制が生じるまで治療が維持される。抗体フラグメントの１つの例示的な用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）の１以上の用量が、患者に投与されてよい。そのような用量は、間欠的に、例えば毎週ごとに、または３週間ごとに（例えば、約２～約２０、例えば約６の用量の抗体を患者が受け取るように）、投与されてよい。最初のより高い負荷投与量の後に、１または複数のより低い投与量が投与されてよい。例示的な投与レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの最初の負荷投与量の後に、約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持投与量の投与を含む。しかしながら、他の投与レジメンが有用で有り得る。この療法の経過は、従来の技術およびアッセイによって簡単に監視される。ヒトＨＧＦＲの細胞外部分は、抗体フラグメントと同時に送達されなければならず、疾患のタイプおよび重症度に応じて、優先的に、制限されないが、モル比１：１（抗体フラグメント：ｄｅｃｏｙＭＥＴ）で、抗体フラグメントに比例して投与されなければならない。

［結果］
ｄｅｃｏｙＭＥＴにおけるＤＮ３０－結合エピトープの部位特異的突然変異誘発
ＭｖＤＮ３０抗体およびｄｅｃｏｙＭＥＴを組み合わせた活性を利用するために、相互中和をもたらす２つの分子間の相互作用を防ぐことが必須である。ＭｖＤＮ３０は、ＩＰＴ－３ドメインとの境界におけるＭＥＴ細胞外領域のＩＰＴ－４ドメイン内のエピトープを認識することが以前に示されている^２８。以前の研究は、ピコモルの親和性でヒト受容体に結合する親ＤＮ３０抗体が、イヌおよびラットＭＥＴとも相互作用するが^{１１、２３}、マウスとは交差反応しない^２１ことを示した。上述の哺乳類種のＩＰＴ－３およびＩＰＴ－４アミノ酸配列のアライメントの際に、マウスにおいて選択的に変化しているいくつかの残基を同定した（図１Ａ）。単一アミノ酸残基のヒトからマウスへのスワッピングが抗体結合を損なわせ得るかどうか試験するために、ＩＰＴ３－４ドメイン内に点突然変異を保有する可溶性受容体を生産してＤＮ３０抗体に対して試験した。グルタミン酸によるリジン８４２の置換は、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}（抗体によってもはや認識されない改変された可溶性受容体）を生じさせたが、他の突然変異は全て、相互作用に影響しなかった（図１Ｂ）。抗体がｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}と相互作用することができないことは、アフィニティ精製されたｄｅｃｏｙｓ（固相中）およびＤＮ－３０抗体（液相中）を用いて行われたＥＬＩＳＡアッセイにおいて確認された（図１Ｃ）。それ故に、酸性残基による８４２位の塩基性アミノ酸の置換は、結合部位の重大な摂動（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）をもたらし、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}－抗体の相互作用を妨害した。

ｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} は、ＨＧＦに高い親和性で結合する
本発明者らはそれから、Ｋ８４２Ｅアミノ酸置換がＨＧＦの結合を妨害するかどうか研究した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイでは、ＨＧＦに関するｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の親和定数（Ｋ_ｄ＝１．０４±０．０５ｎＭ）は、野生型ｄｅｃｏｙＭＥＴに関して測定されたＫ_ｄ＝１．４４±０．０７ｎＭと重ねることができた（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｂｌｅ）（図２Ａ）。最後に、ＨＧＦによって誘導されるＭＥＴリン酸化アッセイにおいて、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の阻害活性を試験した。図２Ｂに示されるように、野生型ｄｅｃｏｙＭＥＴおよびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}は、Ａ５４９肺がん細胞におけるＨＧＦ－依存性ＭＥＴリン酸化を同等の能力で阻害した。したがって、Ｋ８４２Ｅ置換は、ＨＧＦとの安定した複合体の形成を妨げず、ｄｅｃｏｙの阻害活性は影響を受けないままである。

ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} は、ＭＥＴリン酸化および下流の生物学的応答の阻害において協同する
リガンドおよび受容体の同時性の標的化によって引き起こされるＭＥＴシグナル伝達に対する阻害活性を評価するために、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の単独または組み合わせのいずれかの存在下でＭＥＴリン酸化を試験した。この目的を達成するために、野生型ＭＥＴ受容体を発現するＡ５４９細胞をナノモル濃度のＨＧＦで刺激して、ホスホＭＥＴ抗体によってＭＥＴ活性化を測定した。両方の分子が阻害活性を示し、２つの組み合わせがより効率的であった（図３Ａ）。下流のシグナリング伝達因子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）の分析は、組み合わせが、ＥＲＫおよびＡＫＴ活性化の最も効果的な阻害を達成することを確認した（図３Ｂ）。

生物学的根拠に基づき、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の組み合わせは、オートクリンまたはパラクリンのＨＧＦ刺激の両方の細胞モデルにおいて、足場非依存性コロニー増殖を強く阻害した。前者では、Ｕ８７－ＭＧ膠芽腫細胞（ＭＥＴ／ＨＧＦオートクリンループに起因して軟寒天において非常に効率的なコロニー増殖を示す）は、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}が組み合わせで用いられた場合、７５％阻害されたが、２つの分子が単一の薬剤として用いられた場合、コロニー増殖阻害は４０％を決して越えなかった（図３Ｂ）。同様に、ｃｏｍｂｏ治療は、ナノモル濃度の外因的に投与されたＨＧＦによって誘導されるＡ５４９軟寒天コロニーの形成を完全に阻止したが、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}単独では、コロニー増殖の有意であるが部分的な阻害を達成した（それぞれ、６５％および７４％、図３Ｃ）。同様の結果が、マトリゲルによってコーティングされたチャンバー内で行われた浸潤アッセイにおいて得られた：ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の組み合わせは、ＨＰＡＦ－ＩＩヒト膵臓腺がん細胞のＨＧＦ主導の浸潤を８５％減少させたが、単一の薬剤としては、それぞれ、たった５９％および５２％の阻害を達成した（図３Ｄ）。これらの生体系の全てにおいて、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の組み合わせは、単一の治療よりも効果的にＭＥＴリン酸化を損なわせた（図４）。

２つのインヒビターの効果が相加的または相乗的であるかどうか評価するために、定量的な運動性アッセイを行なった。野生型ＭＥＴを発現しているＨＰＡＦ－ＩＩヒト膵臓腺がん細胞を、ＨＧＦによって、分散するように誘導した。細胞分散を、細胞によって覆われた電極（Ｘ－ＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ）の電気インピーダンスの変動を測定することによって定量した。２つの分子の組み合わせは、ＨＧＦ－依存性の細胞分散を用量依存的な様式で減少させ、２５０ｎＭでの阻害に始まり、マイクロモルの範囲において完全な阻止を達成した（図５ＡおよびＢ）。実験の最後に測定された（時間＝４８ｈ）細胞指標の値をＨＧＦに対して標準化して（図５Ｃ）、ＣａｌｃｕＳＹＮソフトウェアを用いて作成して、相乗作用を評価した（図５Ｄ）：試験した全ての濃度に関して、計算された組み合わせ指標（ＣＩ）は、０．５を十分に下回り（０．０６、０．２５、１および４μＭについて、それぞれ、ＣＩ＝０．１、０．０９、０．１７および０．３８）、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}が相乗の挙動を示すことを示した^１０。

ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} は、浸潤性表現型を弱めて、転移拡散を減少させる
リガンド主導のＭＥＴ刺激のマウスモデルにおいて、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を組み合わせた阻害活性をインビボで評価した。

オートクリンＨＧＦ刺激のＵ８７－ＭＧ膠芽腫異種移植片腫瘍モデルを研究した。細胞をＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス内に皮下注入した；腫瘍が８０～１００ｍｍ^３の体積に到達したときに、マウスを同質なグループに階層化して、４つの処置アーム：ビヒクル、ＭｖＤＮ３０、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}または２つの組み合わせに無作為に割り当てた。処置の２２日後、マウスを屠殺して、原発性腫瘍を組織学的試験のために切除した。ｃｏｍｂｏ処置は増殖のわずかな（ｍａｒｇｉｎａｌ）阻害を誘導しただけだったが（図６Ａ）、腫瘍浸潤の表現型の特徴（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｈａｌｌｍａｒｋｓ）の減少が観察された（図６Ｂ）。

ｃｏｍｂｏ処置は、ＨＧＦ刺激のパラクリンモデルにおいてもチャレンジされた。以前に報告されたように、マウスＨＧＦはヒトＭＥＴ受容体を活性化しない^{２４、３０}。それ故に、ヒト腫瘍の異種移植片においてｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の阻害活性を試験するために、我々は、マウスＨＧＦ遺伝子がヒト遺伝子によって置き換えられたトランスジェニックＳＣＩＤマウス（ｈＨＧＦ－Ｋｉ）^２０を利用した。ヒト膵臓腺がん細胞（ＨＰＡＦ－ＩＩ）を、ルシフェラーゼ遺伝子を用いた形質導入によって標識化して、ｈＨＧＦ－Ｋｉマウスの膵臓内へ同所性に注入した。生着を全身発光の分析によって確認した；マウスを生物発光の値に基づいて同質なグループに階層化して、４つの処置グループ：ビヒクル、ＭｖＤＮ３０、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}または２つの組み合わせに無作為に割り当てた。腫瘍増殖を全身発光によって監視した（図７Ａ）。屠殺において、細胞注入の５週間後に、腫瘍を切除して、ＭＥＴリン酸化、増殖、アポトーシスおよびビメンチン／Ｅ－カドヘリン発現（上皮間葉転換のマーカー）に関して分析した。同時に、転移小結節の組織化学的評価のために肺を回収した。チロシン１２３４～１２３５におけるＭＥＴのリン酸化状態は、いずれかの薬剤によって阻害されて、ｃｏｍｂｏ処置は劇的な効果を発揮した（図８Ａ）。ＭＥＴがん遺伝子「好都合性（ｅｘｐｅｄｉｅｎｃｅ）」のこのモデルにおいて予期されるように（すなわち野生型ＭＥＴの発現）、増殖ならびにアポトーシスは、わずかに、そしてｃｏｍｂｏ処置によってのみ、影響を受けた（図７ＢおよびＣ）。ビメンチンとＥ－カドヘリンの間の比の分析は、組み合わせの処置が、がん細胞をより上皮表現型の方へ押しやることを示した（図８Ｂ）。したがって、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の同時性の投与は、肺への、ＭＥＴ主導の（ｄｒｉｖｅｎ）転移伝播を有意に阻害した（図８Ｃ）。

抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む融合タンパク質のパネルの生産
抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの細胞外部分を含む融合タンパク質をコードする単一ｃＤＮＡを産生するために、本発明者らは、単鎖ＭｖＤＮ３０（ＳｃＭｖＤＮ３０）を最初に設計して、軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）および重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）の間にリンカーを導入した。リンカーはフレキシブルであり、グリシン／セリン残基が豊富であり、そして、単量体分子（二量体および／または多量体を生じさせるように、それらは同一ポリペプチドに属する抗体軽鎖および重鎖の関連性によって構成され、別個のポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｄｉｔｅｓ）由来ではない）の産生を優先的に可能にする長さを有していた。リンカーの好ましいアミノ酸配列は、配列番号３６に報告されて；対応するヌクレオチド配列は配列番号３９に報告される。それから、ＳｃＭｖＤＮ３０ ｃＤＮＡをｄｅｃｏｙ ＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}とインフレームで融合した。２つのグループの融合タンパク質が生産された：ｉ）ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}がＮ末に位置してＳｃＭｖＤＮ３０がＣ末に位置する、およびｉｉ）ｓｃＭｖＤＮ３０がＮ末に位置してｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}がＣ末に位置する。構造全体に対して高い自由度を保証するために、本発明者らは、２つの部分の間に第２のリンカーを導入した。アミノ酸組成および／または長さが改変された３つの異なるリンカー：ｉ）Ｌ４５：アラニンおよび荷電残基が豊富な配列の２回繰り返しで構成された４５アミノ酸のリジッドリンカー（配列番号３５、対応するヌクレオチド配列は配列番号３８に報告される）；ｉｉ）Ｌ６０，６０アミノ酸のグリシン／セリン残基が豊富なフレキシブルリンカー（配列番号３６、対応するヌクレオチド配列は配列番号３９に報告される；ｉｉｉ）Ｌ１３４，１３４アミノ酸のフレキシブルおよびリジッド領域の組み合わせ（配列番号３７、対応するヌクレオチド配列は配列番号４０に報告される）を用いた。融合タンパク質の略図を図９に報告する。

ｓｃＭｖＤＮ３０をＮ末に含みｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} をＣ末に含む融合タンパク質は、ＭＥＴおよびＨＧＦの両方に高い親和性で結合する。
本発明者らは、新たに生産された融合タンパク質が、ＨＧＦおよびＭＥＴの両方に結合する能力を維持するかどうかをＥＬＩＳＡアッセイによって研究した。全ての融合タンパク質は、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}のものと重ねることができる（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓａｂｌｅ）親和性でＨＧＦと相互作用したが（図１０Ａ）、ｓｃＭｖＤＮ３０をＣ末に含む融合タンパク質は、Ｎ末に位置する抗体との融合と比較してより低い親和性でＭＥＴを認識した。この後者のグループの分子に関して測定されたＫｄは、ｓｃＭｖＤＮ３０単独に関して測定されたものと同等であった（図１０Ｂ）。

融合タンパク質は、腫瘍細胞増殖を効率的に阻害した。
本発明者らは、ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}と等モル比で組み合わせたｓｃＭｖＤＮ３０と比較して、処置の３日後の細胞増殖障害を測定して、融合タンパク質の阻害特性を評価した。全ての融合タンパク質は、用量依存的な様式で阻害特性を示した。報告された実験では、Ｌ６０リンカーを用いた融合は他の分子よりも強力でなかったが、Ｌ４５およびＬ１３４タンパク質は、ｓｃＭｖＤＮ３０－ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の組み合わせと同様の活性を示した（図１１）。

融合タンパク質は、ＨＧＦによって誘導される細胞運動を効率的に阻害した。
ＨＧＦ主導の細胞運動の阻害における融合タンパク質の効果を評価するために、本発明者らは、ＨＧＦを用いて処理されたＨＰＡＦ－ＩＩヒト膵臓腺がん細胞をモデルとして用いて、Ｘ－ＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて定量的な運動性アッセイを行なった。全ての融合は、ＨＧＦ－依存性の細胞分散を減少させることができた（図１２）。

融合タンパク質は、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ ^{Ｋ８４２Ｅ} の組み合わせよりも強力に、転移拡散を減少させた
融合タンパク質の阻害活性を、ｈＨＧＦ－Ｋｉ ＳＣＩＤマウスモデルにおいてインビボで評価した。ヒト膵臓腺がん細胞（Ｃａｐａｎ－Ｉ）を、ルシフェラーゼ遺伝子を用いた形質導入によって標識化して、マウスの膵臓内へ同所性に注入した。全身発光の分析によって生着を確認した；生物発光の値に基づいてマウスを同質なグループに階層化して、リンカーＬ６０またはＬ１３４を含む融合タンパク質によって処置した。参考文献のように、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の１：１組み合わせおよびビヒクルを実験グループに含んだ。屠殺の際、細胞注入の５週間後に、肝臓を切除して、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍによって分析して転移をスコア化した。ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の同時性の投与は、肝臓への、ＭＥＴ主導の転移伝播を有意に阻害した；ＭｖＤＮ３０投与が毎日された場合は高い有効性がスコアされたが（ＣＯＭＢＯ １グループ）、より少ない頻度の投与が適用された場合は、治療的応答は有意に減少した（ＣＯＭＢＯ ２グループ）。この制限は、融合タンパク質を用いて処置されたマウスではスコア化されなかった。実際に、それらの全ては、１週間に２回の送達であっても肝臓への転移伝播を高い有効性で減少させた（図１３）。

［材料および方法］
細胞培養
Ａ５４９ヒト肺腺がん細胞、ＨＰＡＦ－ＩＩおよびＣａｐａｎ－１ヒト膵臓腺がん細胞、およびＵ８７－ＭＧヒト膠芽腫細胞は、ＡＴＣＣ／ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｓ．ｒ．ｌ．（Ｓｅｓｔｏ Ｓａｎ Ｇｉｏｖａｎｎｉ，Ｉｔａｌｙ）から得て；ＥＢＣ－１ヒト肺癌腫細胞は、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓから得た。全ての細胞は、供給元によって示唆されるとおりに培養した。全ての細胞培養をマイコプラズマ汚染に関して試験した。

抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントの産生、発現および精製
ＨＧＦＲの細胞外部分のエピトープを認識することが可能な抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントの軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）および重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）をコードするｃＤＮＡを、配列番号７および配列番号８に報告される配列に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により外部委託で行なわれる遺伝子合成によって生産した。抗体フラグメントを、軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）および重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）をコードするｃＤＮＡを発現するｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（カタログ番号Ｖ７９０２０ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の一過的トランスフェクションによって生産した。トランスフェクトされた細胞を３日間飢餓させて、可溶性受容体を含む細胞培養上清を回収した。組み換えタンパク質の精製を、製造元の説明書に従ってＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（カタログ番号１７５２４７０１ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって行なった。大スケールのタンパク質生産および精製を、Ｕ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＢＶ（Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって行なった。

突然変異ＭＥＴ外部ドメインの産生、発現および精製
単一アミノ酸置換を保有するヒトＭＥＴ外部ドメイン（ｄｅｃｏｙＭＥＴ）のｃＤＮＡ配列を、製造元の説明書に従ってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５２４ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて生産した。手順は、所望の点突然変異を含むセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドの設計を要する。以下のオリゴを用いた：

－突然変異Ｋ８４２Ｅ：
ｓｎ． ５’－ｇｔａｃａｔａａｔｃｃｔｇｔｇｔｔｔｇａｇｃｃｔｔｔｔｇａａａａｇｃｃａｇｔｇ－３’（配列番号４１）
ａｓ． ５’－ｃａｃｔｇｇｃｔｔｔｔｃａａａａｇｇｃｔｃａａａｃａｃａｇｇａｔｔａｔｇｔａｃ－３’（配列番号４２）
－突然変異Ｑ８０７Ｋ：
ｓｎ． ５’－ｃｃａｃｔｃｃｔｔｃｃｃｔｇａａａｃａｇｃｔｇａａｔｃｔｇｃａａｃｔｃｃ－３’（配列番号４３）
ａｓ． ５’－ｇｇａｇｔｔｇｃａｇａｔｔｃａｇｃｔｇｔｔｔｃａｇｇｇａａｇｇａｇｔｇｇ－３’（配列番号４４）
－突然変異Ｄ８６４Ｎ：
ｓｎ． ５’－ｃｔｇｇａａａｔｔａａｇｇｇａａａｔａａｔａｔｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｃａｇｔｔａａａｇｇ－３’（配列番号４５）
ａｓ． ５’－ｃｃｔｔｔａａｃｔｇｃｔｔｃａｇｇｇｔｃａａｔａｔｔａｔｔｔｃｃｃｔｔａａｔｔｔｃｃａｇ－３’（配列番号４６）。

改変された可溶性受容体を、野生型ｄｅｃｏｙＭＥＴまたはｄｅｃｏｙＭＥＴ突然変異体をコードするｃＤＮＡを発現するｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（カタログ番号Ｖ７９０２０ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の一過的トランスフェクションにより生産した。トランスフェクトされた細胞を３日間飢餓させて、可溶性受容体を含む細胞培養上清を回収した。組み換えタンパク質の精製は、製造元の説明書に従ってＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（カタログ番号１７５２４７０１ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてアフィニティクロマトグラフィーによって行なった。大スケールのタンパク質生産および精製を、Ｕ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＢＶ（Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって行なった。

ＭＥＴリン酸化アッセイ
血清飢餓Ａ５４９を、１２５ｎＭのＭｖＤＮ３０または２μＭのｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を単独または組み合わせで用いて２４時間インキュベートして、それから、５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（カタログ番号２９４－ＨＧ－０２５ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４℃で２時間刺激した。全細胞溶解物を、以下の一次抗体：抗－ＭＥＴホスホ－Ｔｙｒ^{１２３４／１２３５}（Ｄ２６，カタログ番号３０７７ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；抗－ＭＥＴ（３Ｄ４，カタログ番号０８－１３６６ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；抗－ビンキュリン（クローンｈＶＩＮ－１，カタログ番号Ｖ９１３１ Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてウエスタンブロットによって分析した。抗‐マウスＩｇＧ１（カタログ番号ＪＩ１１５０３５００３）および抗‐ウサギＩｇＧ（カタログ番号ＪＩ１１１０３５００３）ＨＲＰ－コンジュゲート二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ．（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）由来であった。

ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
ｄｅｃｏｙＭＥＴおよびＤＮ３０ ｍＡｂの間の相互作用の分析のために、アフィニティ精製された可溶性受容体（野生型ｄｅｃｏｙＭＥＴまたはｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}，１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）をＥＬＩＳＡプレート上に固定化して、増加する濃度の抗体（０～１００ｎＭ）を液相内に添加した。ＨＲＰ－コンジュゲート抗－マウス抗体（カタログ番号ＮＡ９３１ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結合を明らかにした。 および融合タンパク質の間の相互作用の分析のために、アフィニティ精製されたｄｅｃｏｙＭＥＴ野生型（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）をＥＬＩＳＡプレート上に固定化して、増加する濃度の融合タンパク質またはｓｃＭｖＤＮ３０（０～１０００ｎＭ）を液相内に添加した。ＨＲＰ－コンジュゲート抗－ヒトｋ鎖抗体（カタログ番号Ａ７１６４ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて結合を明らかにした。ＨＧＦに対するｄｅｃｏｙＭＥＴまたは融合タンパク質の結合の分析のために、可溶性受容体（１００ｎｇ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレート上に固定化して、溶液中で、増加する濃度のＨＧＦ（０～１１ｎＭ）とともにインキュベートした。結合を、抗－ＨＧＦビオチン化抗体（カタログ番号ＢＡＦ２９４ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出して、ＨＲＰ－コンジュゲートストレプトアビジン（カタログ番号ＲＰＮ １２３１ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて明らかにした。

比色分析法を、マルチラベルプレートリーダーＶＩＣＴＯＲ－Ｘ４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＩＮＣ．，Ｗｈａｌｔｍａｎ，ＭＡ）によって定量化した。データを分析して、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてフィットさせた。

インビトロの生物学的アッセイ
足場非依存性の増殖アッセイのために、２％ ＦＢＳおよび０．５％ Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロース（カタログ番号５０１００ ＢＭＡ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）で補充された適切な培養培地中に細胞を懸濁して、１％アガロースの上部へ４８ウェルプレート（５００細胞／ウェル）内に蒔いた。処理を含む新鮮な培地を週に２回供給した。Ａ５４９細胞を、１μＭのＭｖＤＮ３０または１μＭのｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を単独または組み合わせて用いて、３０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ存在下で処理した。Ｕ８７－ＭＧ細胞を、０．５μＭのＭｖＤＮ３０または１μＭのｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を単独または組み合わせて用いて処理した。培養の１２日後にテトラゾリウム塩（カタログ番号Ｔ０１３８０ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてコロニーを染色した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてコロニー増殖を判定した。細胞浸潤アッセイのために、ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞（１．５×１０^５／ウェル）を、０．５μＭのＭｖＤＮ３０または１μＭのｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の単独または組み合わせの存在下で、血清フリーの培養培地中に懸濁して、３０μｇ／ウェルのマトリゲルマトリックス（カタログ番号３５４２３４ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＮＹ）で事前にコーティングされたトランスウェルチャンバーの上コンパートメントに蒔いた。２％ ＦＢＳおよび１２．５ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦで補充された培養培地を、チャンバーの下コンパートメントに添加した。２４時間後、トランスウェルフィルターの上側にある細胞を機械的に除去して、一方で、膜を通って遊走した細胞を、１１％グルタルアルデヒド（カタログ番号３４０８５５ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて固定して、０．１％クリスタルバイオレット（カタログ番号Ｃ３８８６ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて染色した。Ｉｍａｇｅ－Ｊソフトウェアを用いて細胞浸潤を定量化した。細胞分散アッセイのために、ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞（８０００／ウェル）を完全培養培地内の９６ウェルプレート内に蒔いた。６時間後、増加する濃度（０～４μＭ）のＭｖＤＮ３０またはｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}を、単独または１：１の組み合わせで添加した。さらに２４時間後、６．２５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを用いて２０時間、細胞を刺激した。細胞を、１１％グルタルアルデヒドを用いて固定して、０．１％クリスタルバイオレットを用いて染色した）。リアルタイムの細胞運動アッセイのために、ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞をＥ－プレート（８０００／ウェル；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に蒔いて、上記のとおりに処理して；適用される場合（ｗｈｅｎ ａｐｐｌｉｅｄ）、融合タンパク質を３μＭの濃度で試験した。電気インピーダンスを、Ｘ－Ｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いてデータを１０分ごとに記録しながら４８時間連続的に監視した。値は、ＨＧＦ添加の瞬間に標準化された細胞指標として表される。

足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）－依存性の細胞増殖のために、ＥＢＣ－１細胞を、５％ＦＢＳ培養培地内の９６ウェルプレート内に２０００細胞／ウェルで蒔いた。２４時間後、培地を、５％ＦＢＳ＋試験される分子（０、００１から３μＭまでの増加する濃度）を含む新しいもので置き換えた。細胞生存能力を、製造元の説明書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（カタログ番号Ｇ７５７３ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて７２時間後に評価した。ＶＩＣＴＯＲ Ｘ４を用いて化学発光を検出した。

免疫蛍光
腫瘍細胞および組織に対する免疫蛍光分析を、記載^{１６、２５}のとおりに行なった。染色を、抗－ＭＥＴホスホ－Ｔｙｒ^{１２３４／１２３５}一次抗体（Ｄ２６）を用いて行ない、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５－コンジュゲート二次抗体（カタログ番号Ａ３１５７０ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって明らかにした。４８８－コンジュゲートファロイジン（カタログ番号Ａ１２３７９ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を対比染色した。全ての画像を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ ＡＯＢＳ共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてキャプチャーした。免疫蛍光取得設定は、各細胞株または腫瘍組織内で一定に維持した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて評価して、各チャンネルにおける平均ピクセル強度を測定して、バックグラウンドを差し引いた。細胞株に関してはホスホＭＥＴ ＭＦＩはファロイジンに対して標準化されたが、腫瘍に関しては全てのシグナルはＤＡＰＩに対して標準化された。

インビボ実験
全ての動物手順は、Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ Ｐｉｅｍｏｎｔｅｓｅ ｐｅｒ ｌａ Ｒｉｃｅｒｃａ ｓｕｌ Ｃａｎｃｒｏの動物実験に関する倫理委員会およびＩｔａｌｉａｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって承認されたプロトコルに従って行われた。ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入し；ｈＨＧＦ－Ｋｉ ＳＣＩＤマウス）は、ＡＶＥＯ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡから取得した。

Ｕ８７－ＭＧ細胞を、雌ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの右わき腹内に皮下注入した（２×１０^６／マウス）。腫瘍増殖を、カリパス測定によって週に２回監視した。腫瘍体積を、式：Ｖ＝４／３π（ｘ／２）（ｙ／２）（ｚ／２）（ここで、ｘ、ｙおよびｚは、腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｍａｓｓ）の高さ、幅および深さである）を用いて計算した。腫瘍が８０～１００ｍｍ^３の体積に到達したときに（０日目）、４つの同質なグループにマウスを階層化して、ビヒクル（ｎ＝１０）；ＭｖＤＮ３０，１２．５μｇ（ｎ＝９）；Ｋ８４２Ｅ，１２５μｇ（ｎ＝９）；２つの組み合わせ（ｎ＝１０）を用いて腫瘍内注入によって週に２回処置した。処置の２２日後にマウスを屠殺して、腫瘍を切除して、組織学的分析のためにパラフィン包埋した。腫瘍体積の増加倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）を、２２日目の値と０日目の値の間の比として計算した。

ＨＰＡＦ－ＩＩまたはＣａｐａｎ－１細胞を、記載されるように^１ＣＭＶプロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を保有するレンチウイルスベクターｐ２４（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて形質転換した。ルシフェラーゼ発現ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞（１０^４／マウス）を、４～６週齢雌ｈＨＧＦ－ＫＩ ＳＣＩＤマウスの膵臓内に注入した。２日後に、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ；カタログ番号１２２７９９ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）をマウスに腹腔内注入して、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ器具（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて生物発光シグナルに基づいて同質なグループに階層化して、４つの治療アーム：ビヒクル（ｎ＝１０）；ＭｖＤＮ３０（１０ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）；ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}（１０ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）；ＭｖＤＮ３０＋ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}（１０＋１０ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）に無作為に割り当てた。処置は、毎日（ＭｖＤＮ３０）または２日ごとに（ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}）、腹腔内注入によって施された。屠殺の際、処置の５週間後に、腫瘍および肺を外植した。腫瘍をパラフィンまたはＯＣＴ包埋して、それぞれ免疫組織化学または免疫蛍光分析のために処理した。腫瘍細胞の増殖を、以前に説明されるとおりに^１８、モノクローナル抗－Ｋｉ６７抗体（ＭＩＢ－１，カタログ番号Ｍ７２４００１－２ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて判定した。肺を組織化学的分析のために処理して、パラフィン包埋されてＨＥ染色された非連続部分に対して光学顕微鏡によって微小転移を評価した。各マウスについて、１０枚のスライドを分析した；転移病変をスコア化して、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてそれらの面積を定量化した。

ルシフェラーゼ発現Ｃａｐａｎ－１（１０^６／マウス）を、４～６週齢雌ｈＨＧＦ－Ｋｉ ＳＣＩＤマウスの膵臓内に注入した。マウス階層化を上記のとおりに行なった。処置アーム：ビヒクル（ｎ＝１４）、ＭｖＤＮ３０およびｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}の組み合わせ（１０＋１０ｍｇ／ｋｇ；グループ１，ｎ＝４；グループ２ ｎ＝６）、ｓｃＭｖＤＮ３０＿Ｋ８４２Ｅ＿Ｌ６０（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝５）、Ｋ８４２Ｅ ｓｃＭｖＤＮ３０＿Ｌ６０（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝４）、ｓｃＭｖＤＮ３０＿Ｋ８４２Ｅ＿Ｌ１３４（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝６）、Ｋ８４２Ｅ＿ｓｃＭｖＤＮ３０＿Ｌ１３４（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝５）。処置は、毎日（ＭｖＤＮ３０）または２日ごとに（ｄｅｃｏｙＭＥＴ^{Ｋ８４２Ｅ}および組み換え融合タンパク質）、腹腔内注入によって施された。処置の５週間後に、動物を屠殺して、肝臓を回収してＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍによって生物発光シグナルを測定した。マウスは、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍにより肝臓において検出される生物発光が１０^５光子／秒よりも高い場合に、転移陽性と考えられた。

統計分析
平均、標準偏差（ＳＤ）および平均の標準誤差（ＳＥＭ）は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２０１０ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて計算した。Ｋ_ｄ値を計算するために、ＥＬＩＳＡアッセイによるデータを分析して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、非線形回帰、１サイト結合・双曲線カーブ（ｏｎｅ ｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｙｐｅｒｂｏｌａ ｃｕｒｖｅ）に従ってフィットさせた。ＩＣ_５０値を計算するために、増殖アッセイによるデータを分析して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、非線形回帰、シグモイド型用量反応曲線（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ）に従ってフィットさせた。統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定を用いて判定した。全ての実験は少なくとも３回繰り返した（生物学的レプリケート）。インビボ実験は２回繰り返した。図は１つの代表的な実験を示す。

［参考文献］

Claims (14)

1. 腫瘍および／または転移を患っている患者の治療のための医薬組成物であって、
   ヒトＨＧＦＲの細胞外部分と組み合わせた抗－肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）抗体フラグメントを含み、
   ここで：
   （ｉ）前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分のエピトープに結合することが可能なパラトープを１つのみ有し、ＨＧＦＲへ向けたアンタゴニスト活性を有し、
   （ｉｉ）ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分は、安定した様式で肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に結合することが可能であり、前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントによって認識されるエピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントがそれに結合するのを防ぎ、および
   （ｉｉｉ）前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントおよびヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分は、（ａ）タンパク質形態で、または（ｂ）核酸形態で、前記患者へ投与するのに適切であり、
   ここで、前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
   ここで前記軽鎖および重鎖可変ドメインは、非ヒト、またはヒト化であり、
   前記軽鎖可変ドメインは配列番号１～３に示されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含み、前記重鎖可変ドメインは配列番号４～６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓを含み、
   ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分は、（ｉ）ヒトＨＧＦＲのＳＥＭＡ、ＰＳＩ、ＩＰＴ－１、ＩＰＴ－２、ＩＰＴ－３およびＩＰＴ－４ドメインを含み、（ｉｉ）配列番号１９の８４２位に対応する残基においてグルタミン酸を有し、
   ここで、
   （ｉ）前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、リンカーを用いてヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分にＮ末からＣ末の方向でコンジュゲートされて、その結果、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント－リンカー－ヒトＨＧＦＲの細胞外部分の融合タンパク質を生じさせる；または、
   （ｉｉ）ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分は、リンカーを用いて前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントにＮ末からＣ末の方向でコンジュゲートされて、その結果、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分－リンカー－抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントの融合タンパク質を生じさせる、
   医薬組成物。
2. 請求項１に記載の治療のための医薬組成物であって、
   前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、１つのヒト軽鎖定常ドメインおよび１つのヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインをさらに含み、前記軽鎖可変ドメインは、Ｎ末からＣ末の方向で前記ヒト軽鎖定常ドメインに融合されていて、前記重鎖可変ドメインは、Ｎ末からＣ末の方向で前記ヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインに融合されている、
   医薬組成物。
3. 請求項２に記載の治療のための医薬組成物であって、
   前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、単鎖Ｆａｂフラグメントである、
   医薬組成物。
4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の治療のための医薬組成物であって、
   ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分は、配列番号２０に示される配列を有する、
   医薬組成物。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載の治療のための医薬組成物であって、
   （ｉ）前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントをコードする核酸分子は、リンカーをコードする核酸分子を用いて、ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分をコードする核酸分子に、５’末から３’末の方向で連結されて、その結果、抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント－リンカー－ヒトＨＧＦＲの細胞外部分の融合タンパク質をコードする；または、
   （ｉｉ）ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分をコードする核酸分子は、リンカーをコードする核酸分子を用いて、前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントをコードする核酸分子に、５’末から３’末の方向で連結されて、その結果、ヒトＨＧＦＲの細胞外部分－リンカー－抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントの融合タンパク質をコードする、
   医薬組成物。
6. 請求項１または５のいずれか一項に記載の治療のための医薬組成物であって、
   （ｉ）前記の抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント－リンカー－ヒトＨＧＦＲの細胞外部分の融合タンパク質は、配列番号２６、２７および２８から選択されるアミノ酸配列を含む；または、
   （ｉｉ）前記のヒトＨＧＦＲの細胞外部分－リンカー－抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントの融合タンパク質は、配列番号２３、２４および２５から選択されるアミノ酸配列を含む、
   医薬組成物。
7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の治療のための医薬組成物であって、
   前記患者は、野生型ＭＥＴがん遺伝子を保有している、
   医薬組成物。
8. Ｎ末からＣ末の方向で：
   （ｉ）抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント、リンカー、およびヒトＨＧＦＲの細胞外部分；または、
   （ｉｉ）ヒトＨＧＦＲの細胞外部分、リンカー、および抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメント
   を含む、融合タンパク質であって、
   ここで前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分のエピトープに結合することが可能なパラトープを１つのみ有し、ＨＧＦＲへ向けたアンタゴニスト活性を有し、
   ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分は、前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントによって認識されるエピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントがそれに結合するのを防ぎ、
   ここで、前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
   ここで前記軽鎖および重鎖可変ドメインは、非ヒト、またはヒト化であり、
   前記軽鎖可変ドメインは配列番号１～３に示されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含み、前記重鎖可変ドメインは配列番号４～６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓを含み、
   ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分は、（ｉ）ヒトＨＧＦＲのＳＥＭＡ、ＰＳＩ、ＩＰＴ－１、ＩＰＴ－２、ＩＰＴ－３およびＩＰＴ－４ドメインを含み、（ｉｉ）配列番号１９の８４２位に対応する残基においてグルタミン酸を有する、
   融合タンパク質。
9. 請求項８に記載の融合タンパク質であって、
   前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、１つのヒト軽鎖定常ドメインおよび１つのヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインをさらに含み、前記軽鎖可変ドメインは、Ｎ末からＣ末の方向で前記ヒト軽鎖定常ドメインに融合されていて、前記重鎖可変ドメインは、Ｎ末からＣ末の方向で前記ヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインに融合されている、
   融合タンパク質。
10. 請求項８または９に記載の融合タンパク質であって、
    前記抗－ＨＧＦＲ抗体フラグメントは、単鎖Ｆａｂフラグメントである、
    融合タンパク質。
11. 請求項８から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、
    ヒトＨＧＦＲの前記細胞外部分は、配列番号２０に示される配列を有する、
    融合タンパク質。
12. 請求項８から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、
    前記融合タンパク質は、配列番号２３～２８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、
    融合タンパク質。
13. 請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、
    核酸分子。
14. 請求項８から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３に記載の核酸分子および薬学的に許容できるビヒクルを含む、
    医薬組成物。