BR112020018981A2 - Combinação de anticorpo anti-hgfr e hegfr para o tratamento de um tumor e/ou metástase - Google Patents

Combinação de anticorpo anti-hgfr e hegfr para o tratamento de um tumor e/ou metástase Download PDF

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Abstract

fragmento de anticorpo anti-hgfr em combinação com uma porção extracelular do hgfr humano para o uso no tratamento de um paciente sofrendo de um tumor e/ou metástase, em que: (i) o fragmento de anticorpo anti-hgfr tem apenas um parátopo capaz de se ligar a um epítopo da porção extracelular de hgfr humano e tem atividade antagonística para hgfr, (ii) a porção extracelular de hgfr humano é capaz de ligação ao hgf em uma maneira estável e contém pelo menos uma mutação de aminoácido no epítopo reconhecido pelo fragmento de anticorpo anti-hgfr para impedir a ligação do fragmento de anticorpo anti-hgfr ao mesmo, e (iii) o fragmento de anticorpo anti-hgfr e a porção extracelular de hgfr humano são adequados para a administração ao paciente (a) em uma forma de proteína ou (b) em uma forma de ácido nucléico.

Description

“COMBINAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-HGFR E HEGFR PARA O TRATAMENTO DE UM TUMOR E/OU METÁSTASE” Campo da invenção
[0001] A divulgação se refere a uma nova combinação de agentes terapêuticos para o tratamento de um tumor e/ou metástase, preferivelmente metástase. Fundamentos da invenção
[0002] A propagação metastática está fundamentada na capacidade das células cancerosas para romper as interações de célula para célula, migrarem através da matriz celular, sobreviver e proliferar em tecidos outros que não seu sítio de origem. A contraparte fisiológica deste programa complexo - conhecido como ‘crescimento invasivo’ - está na base da embriogênese e é responsável pela cicatrização de ferimento e regeneração de órgão durante a vida adulta. O crescimento invasivo é firmemente regulado pelos sinais extracelulares específicos, um dos quais é o Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF), o ligante para o receptor codificado pelo oncogene MET. Em condições de ativação aberrante, a sinalização de HGF/MET leva ao início, progressão e metástase do tumor em um amplo espectro de malignidades humanas. Em uma minoria de eventos, MET se comporta como um oncogene ‘condutor’ e as células de tumor são dependentes da sinalização de MET constitutiva para o crescimento e sobrevivência (‘dependência de MET). Esta condição conta com a presença de lesões genéticas, principalmente o número de cópia de gene aumentado ou - menos frequentemente - mutações2 que resultam na ativação de receptor constitutiva independente de ligante. Neste contexto, o tratamento com inibidores de MET é altamente eficaz, induzindo o bloco de proliferação de célula e a parada do ciclo celular in vitro e a inibição do crescimento do tumor in vivo. A coexpressão de ligante e receptor dentro da mesma célula é uma outra estratégia explorada pelo câncer para obter ativação de MET contínua, e foi descrita principalmente em cânceres humanos não epiteliais, tais como osteossarcomas, glioblastomas e mielomas múltiplos. Na maioria dos casos, entretanto, a ativação aberrante de MET nos tumores se origina da superexpressão do receptor, devido à suprarregulagem transcricional do gene do tipo selvagem, deflagrando a sensibilização da célula cancerosa para o estímulo de ligante 3. No último caso, a sinalização de MET - que resulta nas respostas pró-invasivas e antiapoptóticas - é explorada pelas células cancerosas como uma estratégia para desviar as condições estressantes e reforça o fenótipo maligno (‘oportunismo de MET’6). Na ausência de lesões genéticas específicas, MET não é estritamente necessário para o crescimento de tumor, mas a presença do ligante sustenta a ativação de receptor, realçando o fenótipo maligno. Finalmente, MET se comporta como um marcador funcional de células ‘tronco-progenitoras’ cancerosas em glioblastomas8, e sustenta o fenótipo ‘tronco’ nos cânceres colorretal e mamário12,15. Além disso, foi mostrado que HGF derivado de estroma sustenta o caminho da autorrenovação de WNT das células tronco do câncer colorretal e promove a proliferação de células iniciadoras do câncer colônico, deflagrando a resistência à terapia anti-EGFR27.
[0003] Várias estratégias alvejando MET ou HGF - inibidores de molécula pequena, anticorpos ou proteínas recombinantes - foram concebidas e estão correntemente sob investigação. Entre elas, o anticorpo MvDN30 é um fragmento Fab quimérico monovalente que se liga ao domínio extracelular de MET, induzindo a clivagem proteolítica (‘desprendimento’) do receptor da superfície celular 21, 28.
DecoyMET é um receptor solúvel recombinante abrangendo a região extracelular inteira de MET; o mesmo liga HGF com alta afinidade e inibe as atividades biológicas dirigidas ao ligante in vitro e in vivo quando expresso pela tecnologia de vetor lentiviral17 ou como proteína de fusão de Fc7,26. Como na maioria dos sistemas biológicos, acertar um único elemento de uma cadeia de transdução de sinal improvavelmente resulta na interrupção completa da resposta. Assim, no caso de MET, cada molécula nunca alcançará 100% de inibição, deixando atividade residual sensível para a estimulação de HGF. Sumário da invenção
[0004] O objetivo desta divulgação é prover nova combinação de agente antitumor úteis no tratamento de pacientes oncológicos.
[0005] De acordo com a invenção, o objetivo acima é obtido graças à matéria objeto lembrada especificamente nas reivindicações subsequentes, que são entendidas como formando uma parte integral desta divulgação.
[0006] A presente invenção provê um fragmento de anticorpo do Receptor do Fator de Crescimento Anti-Hepatócito (HGFR) em combinação com uma porção extracelular do HGFR humano para o uso no tratamento de um paciente sofrendo de um tumor e/ou metástase, preferivelmente metástase, em que: (i) o fragmento de anticorpo anti-HGFR tem apenas um parátopo capaz de se ligar a um epítopo da porção extracelular do HGFR humano e tem atividade antagonística contra HGFR, (ii) a porção extracelular do HGFR humano é capaz de se ligar ao fator de Crescimento de Hepatócito (HGF) em uma maneira estável e contém pelo menos uma mutação de aminoácido dentro do epítopo reconhecido pelo fragmento de anticorpo anti-HGFR para impedir a ligação do fragmento de anticorpo anti-HGFR ao mesmo, e (iii) o fragmento de anticorpo anti-HGFR e a porção extracelular do HGFR humano são adequados para a administração ao paciente (a) em uma forma de proteína ou (b) em uma forma de ácido nucléico. Breve descrição dos desenhos
[0007] A invenção será agora descrita em detalhes, puramente por via de exemplo ilustrativo e não limitante, com referência às figuras anexas, em que: - Figura 1. Geração de um receptor de decoyMET mutado que não se liga ao anticorpo DN30. (A) Comparação das sequências de aminoácido do terceiro e quarto domínios IPT de MET de ser humano, camundongo, rato e cão. Os resíduos que são trocados exclusivamente na sequência de camundongo são salientados em negrito, branco no fundo preto, os aminoácidos que também (ou apenas) são trocados nas sequências de rato ou cão são salientados em negrito. Apenas os limites IPT-3/IPT-4 são mostrados. (B) os receptores DecoyMET carregando substituições de aminoácido únicas foram incubados com o anticorpo DN30. Os complexos foram imunoprecipitados com proteína A - que se liga ao anticorpo - e revelados com estreptactina rotulada a HRP - que se liga à etiqueta estrep na isca (painel esquerdo). 30 μl de sobrenadantes normalizados usados para a imunoprecipitação foram conduzidos na SDS PAGE para verificar a carga de receptores decoyMET (painel direito). (C) análise de ligação de ELISA. mAb DN30 foi na fase líquida, decoyMET tipo selvagem ou decoyMET K842E na fase sólida.
A ligação de anticorpo foi detectada usando um anticorpo anticamundongo.
OD, densidade óptica a 450 nm.
Cada ponto é a média de valores em triplicata ± SD. - Figura 2. DecoyMETK842E liga HGF em alta afinidade e inibe a fosforilação de MET induzida por HGF. (A) Análise de ligação de ELISA.
DecoyMET tipo selvagem ou decoyMETK842E foram na fase sólida; concentrações crescentes de HGF foram adicionados na fase líquida.
A ligação de HGF foi detectada usando um anticorpo anti-HGF biotinilado.
Cada ponto é a média de valores em triplicata ± SD. (B) fosforilação de MRT induzida por HGF.
As células A549 foram incubadas com decoyMET tipo selvagem ou decoyMETK842E (2 μM) e estimulada com HGF (50 ng/ml). Os lisados de célula total foram imunomanchados com anti-fosfoMET (painel superior), anticorpos anti-MET (painel intermediário) ou com anticorpos antivinculina (painel inferior). p145, a forma madura de MET; p190, precursor de cadeia única de MET; p117, vinculina. - Figura 3. MvDN30 e DecoyMETK842E coopera na fosforilação de MET induzido por HGF redutor e atividades biológicas dirigidas por MET. (A) fosforilação de MET induzida por HGF.
As células de adenocarcinoma pulmonar humano A549 foram incubadas com 2 μM de decoyMET K842E, 125 nM de MvDN30 ou a combinação dos dois e estimuladas ou não com 50 ng/ml de HGF.
Os lisados de célula total foram imunomanchados com anti-fosfoMET (painel superior), anticorpos anti- MET (painel intermediário) ou antivinculina (painel inferior). p145, forma madura de MET; p190, precursor de cadeia única de MET; p117, vinculina. (B) ERK induzida por HGF e fosforilação de AKT. Células de adenocarcinoma pulmonar humano A549 foram incubados com 500 nM de MvDN30, 2 μM de decoyMETK842E ou a combinação dos dois, e estimulado ou não com 100 ng/ml de HGF. Os lisados de célula total foram imunomanchados com anti-fosfoERK, anti-ERK, anti-fosfoAKT, anti-AKT, anti-GAPDH. p42/44, ERK; p60, AKT; p36, GAPDH. (C) Crescimento independente de ancoragem sustentado pela estimulação de HGF autócrino. Células de glioblastoma humano U87-MG, expressando tanto a proteína HGF quanto a MET, foram tratadas com 0,5 μM de MvDN30 ou 1 μM de decoyMETK842E, sozinho ou em combinação. O gráfico representa a porcentagem de crescimento de colônia médio para cada tratamento comparado com o controle não tratado. (D) Crescimento independente de ancoragem sustentado pela estimulação de parácrino de HGF. As células A549 foram estimuladas com 30 ng/ml de HGF e tratadas com 1 μM de MvDN30 ou 1 μM de decoyMETK842E, sozinhos ou em combinação. O gráfico representa a porcentagem do crescimento de colônia médio para cada tratamento comparado ao controle estimulado com HGF. (E) Ensaio de invasão de Transwell. As células de adenocarcinoma pancreático humano HPAF-II foram estimuladas com 12,5 ng/ml de HGF e tratadas com 0,5 μM de MvDN30 ou 1 μM de decoyMETK842E, sozinhos ou em combinação. O gráfico representa a porcentagem de invasão em comparação com o controle estimulado com HGF. O painel direito, uma imagem/grupo representativo das células migradas através da camada de matrigel. n.t., células não tratadas. Ampliação, 200x. Cada ponto é a média de valores em triplicata ± SD. ***= P ≤ 0,001; **= P ≤ 0,01; * = P ≤ 0,05. - Figura 4. MvDN30 e decoyMETK842E em combinação inibem a fosforilação de MET dependente de HGF.
[0008] As células U87MG (A), A549 (B) e HPAF-II (C) foram tratadas com
MvDN30, decoyMETK842E ou a combinação dos dois (COMBO). As células HPAF-II e A549 foram estimuladas ou não com HGF; n.t., células não tratadas. Painéis esquerdos: seções confocais representativas mostrando anti-fosfoMET (fileiras de topo) e faloidina (fileiras de baixo). Os gráficos na direita relatam a Intensidade de Fluorescência Média (MFI) de fosfoMET, subtraído o fundo e normalizado na faloidina. Cada ponto é a média de 5 valores ± SEM. Bar é 50 μm. ***= P ≤ 0,001; **= P ≤ 0,01; * = P ≤ 0,05. - Figura 5. MvDN30 e DecoyMETK842E sinergizam para inibir o espalhamento de célula dependente de HGF. (A) Análise da motilidade da célula. As células HPAF-II foram pré- incubadas com concentrações diferentes (0,06, 0,25, 1 ou 4 μM) de MvDN30 ou decoyMETK842E, sozinhas ou em combinação 1:1, e depois estimuladas com 6,25 ng/ml de HGF. O espalhamento de célula foi monitorado em tempo real usando um dispositivo RTCA da X- CELLigence e é expresso como Índice de Célula Normalizada. Cada gráfico se refere a uma concentração de tratamento. (B) Imagens representativas de células HPAF-II pré-incubadas com 1 μM de MvDN30 ou 1 μM de decoyMETK842E, sozinho ou em combinação e depois estimuladas com 6,25 ng/ml de HGF. n.t., células não tratadas. (C) Curva de motilidade celular. Efeito = Valores de índice celular medido no final do experimento para cada dose de tratamento, normalizados nos valores obtidos com HGF sozinho e expressos como [1-x]. (D) Análise de combinação de fármaco. Os valores da curva de motilidade celular foram elaborados com o software Calcusyn para calcular o Índice de Combinação (CI) para cada concentração de MvDN30 e decoyMETK842E. CI = 1, cooperação; CI <1, sinergismo; CI>1, antagonismo. - Figura 6. MvDN30 e decoyMETK842E em combinação reduzem o fenótipo invasivo de tumores U87-MG subcutâneo.
[0009] As células U87-MG foram injetadas subcutaneamente em camundongos
NOD-SCID. Quando os tumores atingiram um volume de 80 a 100 mm 3, os camundongos foram estratificados em quatro grupos homogêneos: VEÍCULO (n=10); MvDN30 (n=9); K842E (n = 9); a combinação dos dois (n = 10). (A) Volume de tumor no sacrifício, expresso como aumento de aumento de dobra. Cada barra é a média do grupo ± SEM. (B) Análise histoquímica de carga tumoral. As imagens representativas de seções de tumor tingidas com hematoxilina-eosina. As setas apontam para o limite entre o tumor e o tecido circundante. Magnificação 100x. - Figura 7. Efeito de MvDN30 ou decoyMET K842E, sozinhos e em combinação, sobre a proliferação e apoptose de células cancerosas pancreáticas injetadas ortotopicamente em camundongos hHGF-Ki.
[0010] As células HPAF-II expressando Luciferase foram injetadas no pâncreas de camundongos hHGF-Ki e estratificadas em quatro grupos homogêneos: VEÍCULO (n = 10), MvDN30 (n = 6), decoyMETK842E (n = 6), a combinação dos dois (n = 6). (A) A bioluminescência do tumor detectada pelo IVIS Spectrum. Os números indicam os valores médios de fluxo total de bioluminescência (fótons/segundo x 108) de cada grupo experimental ± SEM. (B) Análise da proliferação de célula de tumor medida pela imuno-histoquímica Ki67. Painel esquerdo, imagens representativas de cada grupo experimental. Ampliação, 200x. O gráfico na direita relata valores médios obtidos pela análise de cinco imagens por tumor ± SEM. O Índice de Proliferação é calculado como células positivas em Ki67/número total de células. (C) Análise da apoptose de célula de tumor medida pela imunofluorescência da Caspase-3 clivada. Painel esquerdo, imagens representativas de cada grupo experimental. Bar é 50 μm. O gráfico na direita relata valores médios obtidos pela análise de 8 imagens por tumor ± SEM. O índice apoptótico é calculado como células positivas em Caspase-3 clivadas/número total de células das células. Bar é 50 μm. *** = valor P < 0,001; ** = valor P < 0,01; * = valor P < 0,05. - Figura 8. MvDN30 e DecoyMETK842E reduzem a fosforilação de MET e disseminação metastática de células cancerosas pancreáticas em camundongos hHGF-Ki.
[0011] As células HPAF-II expressando a Luciferase foram injetadas no pâncreas de camundongos hHGF-Ki e estratificadas em quatro grupos homogêneos: VEÍCULO (n = 10), MvDN30 (n = 6), decoyMETK842E (n = 6), a combinação dos dois (n = 6). (A) situação de FosfoMET dentro dos tumores medida pela imunofluorescência. Painel esquerdo, seções confocais representativas de cada grupo experimental mostrando anti-fosfoMET. O gráfico na direita relata a Intensidade de Fluorescência Média (MFI) de fosfoMET, fundo subtraído e normalizado no DAPI. Cada ponto é a média de 12 valores ± SEM. Bar é 50 μm. (B) Avaliação do fenótipo EMT de tumores HPAF-II pela análise de imunofluorescência da expressão de E-caderina e vimentina. Painel esquerdo, imagens representativas de cada grupo experimental. Anti-E-caderina (fileira de topo), antivimentina (fileira inferior). Bar é 50 μm. O gráfico na direita relata valores médios obtidos pela análise de 6 imagens para cada tumor ± SEM. O fenótipo EMT é expresso como a razão de Vimentina/E-caderina. (C) os nódulos metastáticos nos pulmões avaliados pela coloração histoquímica com HE. O gráfico na esquerda: número de lesões metastáticas; cada ponto representa o número de lesões marcadas para cada camundongo. O gráfico na direita: área de lesões metastáticas; cada ponto representa a área média de metástases medida para cada camundongo. Dez lâminas/camundongo foram analisadas; as lesões metastáticas foram contadas e a sua área quantificada com ImageJ. *** = P ≤ 0,001; ** = P ≤ 0,01; * = P ≤ 0,05. - Figura 9. Representação esquemática de uma modalidade das proteínas de fusão contendo um fragmento de anticorpo anti-HGFR e uma porção extracelular do HGFR humano. (A) Desenho de uma molécula gerada pela fusão no quadro de decoyMETK842E no terminal N e scMvDN30 no terminal C. (B) Desenho de uma molécula gerada pela fusão no quadro de scMvDN30 no terminal N e decoyMETK842E no terminal C. Entre as duas porções um ligador foi inserido. A sequência do ligador pode ser selecionado daquelas listadas em (C). SEMA, PSI, IPT 1-4 são as regiões de decoyMET. A estrela no IPT 4 representa a mutação KÆE na posição
842. O fragmento de anticorpo anti-HGFR é constituído por duas cadeias unidas por um segundo ligador. VL, região leve variável; CL,
região leve constante; VH, região pesada variável; CH, região pesada constante.
O quadrado preto representa as ETIQUETAS Strept-His incluídas na proteína recombinante para os propósitos de purificação/detecção. - Figura 10. Análise de ligação das proteínas de fusão contendo um fragmento de anticorpo anti-HGFR e uma porção extracelular do HGFR humano a MET ou a HGF. (A) Análise da ligação a HGF pelo ELISA.
Painel esquerdo, ligação das proteínas de fusão contendo decoyMETK842E no terminal N e scMvDN30 no terminal C.
Painel direito, ligação das proteínas de fusão contendo scMvDN30 no terminal N e decoyMETK842E no terminal C.
As proteínas de fusão ou decoyMETK842E (controle positivo) foram na fase sólida.
Concentrações crescentes de HGF foram adicionadas na fase líquida.
A ligação de HGF foi detectada usando um anticorpo anti-HGF biotinilado.
Cada ponto é a média de valores em triplicata ± SD. (B) Análise da ligação a MET pelo ELISA.
Painel esquerdo, ligação das proteínas de fusão contendo decoyMETK842E no terminal N e scMvDN30 no terminal C.
Painel direito, ligação das proteínas de fusão contendo scMvDN30 no terminal N e decoyMET K842E no terminal C. decoyMET tipo selvagem foi na fase sólida e as concentrações crescentes das proteínas de fusão diferentes foram na fase líquida; como controle positivo scMvDN30 foi incluído no ensaio.
A ligação de anticorpo foi detectada usando um anticorpo de cadeia k anti-ser humano conjugada a HRP.
OD, densidade óptica a 450 nm.
Cada ponto é a média dos valores em triplicata ± SD. - Figura 11. Inibição do crescimento de célula de tumor no tratamento com as proteínas de fusão contendo um fragmento de anticorpo anti-HGFR e uma porção extracelular do HGFR humano. (A) Crescimento das células de carcinoma pulmonar EBC-1 tratadas com concentrações crescentes das proteínas de fusão contendo decoyMETK842E no terminal N e scMvDN30 no terminal C. (B) Crescimento de células de carcinoma pulmonar EBC-1 tratadas com concentrações crescentes das proteínas de fusão contendo scMvDN30 no terminal N e decoyMETK842E no terminal C. Como controle positivo combinações equimolares de scMvDN30 e decoyMET K842E (Combo) foram incluídas no ensaio. As células foram analisadas depois de 3 dias de tratamento. As amostras estão em triplicatas, as barras representam SD. (C) A tabela mostrando os valores IC50 para cada proteína de fusão calculada como o valor médio de pelo menos três experimentos independentes, em comparação com a atividade inibidora exercida por MvDN30/decoyK842E em combinação. - Figura 12. Inibição da motilidade de célula de tumor no tratamento com as proteínas de fusão contendo um fragmento de anticorpo anti-HGFR e uma porção extracelular do HGFR humano.
[0012] As células HPAF-II foram pré-incubadas com as proteínas de fusão diferentes (3 μM) e depois foram estimuladas com 6,25 ng/ml de HGF. O espalhamento de célula foi monitorado em tempo real usando um dispositivo RTCA X-CELLigence e é expresso como Índice de Célula Normalizada. As amostras foram em triplicatas. (A) Células tratadas com as proteínas de fusão contendo decoyMETK842E no terminal N e scMvDN30 no terminal C. (B) Células tratadas com as proteínas de fusão contendo scMvDN30 no terminal N e decoyMET K842E no terminal C. Como controle positivo combinações equimolares de scMvDN30 e decoyMET K842E (COMBO) foram incluídas no ensaio. (C) A Tabela mostrando a porcentagem da motilidade de célula calculada como o valor médio de dois experimentos independentes, versus as células tratadas com HGF. - Figura 13. Proteínas de fusão contendo um fragmento de anticorpo anti- HGFR e uma porção extracelular do HGFR humano reduzem a disseminação metastática de células cancerosas pancreáticas em camundongos hHGF-Ki.
[0013] As células Capan-1 expressando a Luciferase foram injetadas no pâncreas de camundongos hHGF-Ki e estratificadas em sete grupos homogêneos: VEÍCULO (n = 14), decoyMETK842E e scMvDN30 na combinação 1:1 (dois grupos) e quatro grupos para testar proteínas de fusão diferentes, contendo decoyMET K842E no terminal N e scMvDN30 no terminal C ou contendo scMvDN30 no terminal N e decoyMET K842E no terminal C. Dois ligadores diferentes (L60 e L134) foram analisados. COMBO 1 (n = 4): MvDN30 liberado 7x por semana e decoyMET K842E liberado 2x por semana; COMBO 2 (n = 6): MvDN30 liberado 4x por semana e decoyMET K842E liberado 2x por semana; K842E_scMvDN30_L60 (n = 4); scMvDN30_K842E_L60 (n = 5); K842E_scMvDN30_L134 (n = 5); K842E_scMvDN30_L134 (n = 6). Todas as fusões foram liberadas 2x por semana. (A) A Tabela mostrando o número de camundongos portando metástase hepáticas versus camundongos totais analisados. Os camundongos foram considerados positivos quando a bioluminescência detectada no fígado pelo IVIS Spectrum foi mais alta do que 105 fótons/segundo. (B) O gráfico mostrando a porcentagem de bioluminescência detectada pelo IVIS Spectrum no fígado de cada grupo experimental versus grupo tratado com veículo. Descrição detalhada da invenção
[0014] Na descrição seguinte, numerosos detalhes específicos são dados para prover um entendimento completo das modalidades. As modalidades podem ser praticadas sem um ou mais dos detalhes específicos ou com outros métodos, componentes, materiais, etc. Em outros casos, estruturas bem conhecidas, materiais ou operações não são mostradas ou descritas em detalhes para evitar obscurecer aspectos das modalidades.
[0015] Referência por todo este relatório descritivo a “uma modalidade” significa que um traço, estrutura ou características particulares descritas em conexão com a modalidade são incluídos em pelo menos uma modalidade. Assim, os aparecimentos da frase “em uma modalidade” em vários lugares por todo este relatório descritivo não estão necessariamente todos se referindo à mesma modalidade. Além disso, os traços, estruturas ou características particulares podem ser combinados em qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades.
[0016] Os cabeçalhos aqui providos são apenas por conveniência e não interpretam o escopo ou significado das modalidades.
[0017] A presente divulgação se refere a uma nova combinação de agentes terapêuticos para o tratamento de um tumor e/ou metástase.
[0018] A presente invenção se baseia na ideia de que uma robustez terapêutica mais alta no tratamento de tumores e/ou metástase, preferivelmente metástase, pode ser alcançada pelo alvejamento tanto de HGF quanto do HGFR. Os dados experimentais aqui atestados de fato mostram que a inibição vertical do eixo MET/HGF eficazmente impede o crescimento, motilidade e invasão da célula de tumor in vitro e significantemente reduz a propagação metastática in vivo, provendo uma terapia alvejada combinada em um amplo espectro de canceres expressando MET tipo selvagem.
[0019] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um fragmento de anticorpo antifator de Crescimento de Hepatócito Receptor (HGFR) em combinação com uma porção extracelular do HGFR humano para o uso no tratamento de um paciente sofrendo de um tumor e/ou metástase, preferivelmente metástase, em que: (i) o fragmento de anticorpo anti-HGFR tem apenas um parátopo capaz de se ligar a um epítopo da porção extracelular do HGFR humano e tem atividade antagonística para HGFR, (ii) a porção extracelular do HGFR humano é capaz de ligação ao Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF) em uma maneira estável e contém pelo menos uma mutação de aminoácido dentro do epítopo reconhecido pelo fragmento de anticorpo anti-HGFR para impedir a ligação do fragmento de anticorpo anti-HGFR ao mesmo, e (iii) o fragmento de anticorpo anti-HGFR e a porção extracelular do HGFR humano são adequados para a administração ao paciente (a) em uma forma de proteína ou (b) em uma forma de ácido nucléico.
[0020] Em uma modalidade preferida, o paciente submetido ao tratamento terapêutico com a terapia de combinação aqui divulgada porta um oncogene MET tipo selvagem (isto é, ele/ela não porta alterações genéticas no oncogene MET).
[0021] Em uma ou mais modalidades, o fragmento de anticorpo anti-HGFR contém um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de cadeia pesada (VH), em que a cadeia leve e os domínios variáveis de cadeia pesada são não humanas ou humanizadas e em que o domínio variável de cadeia leve (VL) contém Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) tendo as sequências de aminoácido apresentada na SEQ ID No.: 1 a 3 e o domínio variável de cadeia pesada (VH) contém CDRs tendo as sequências de aminoácido apresentadas nas SEQ ID Nos.: 4 a 6.
[0022] Em uma modalidade adicional, o fragmento de anticorpo anti-HGFR contém adicionalmente um domínio constante de cadeia leve humana (CL) e um domínio constante de cadeia pesada humana CH1 (CH1), o domínio variável de cadeia leve (VL) sendo fundido ao domínio constante de cadeia leve humana (CL) na direção do terminal N para C (gerando assim uma cadeia leve VL-CL), o domínio variável de cadeia pesada (VH) sendo fundido ao domínio constante de cadeia pesada humana CH1 na direção do terminal N para C (gerando assim uma cadeia pesada VH-CH1). Em uma modalidade preferida, a cadeia leve VL-CL contém, preferivelmente consiste de, uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No.: 7 e a cadeia pesada VH-CH1 contém, preferivelmente consiste de, uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No.: 8.
[0023] Nas modalidades diferentes abrangida pela presente invenção, o fragmento de anticorpo anti-HGFR está em uma forma de ácido nucléico. Em um tal caso, o fragmento de anticorpo anti-HGFR está codificado por uma primeira e uma segunda moléculas de ácido nucléico, em que: (i) a primeira molécula de ácido nucléico codifica um domínio variável de cadeia leve (VL) contendo CDRs tendo as sequências de ácido nucléico apresentadas na SEQ ID No.: 9, 10 e 11 e em que a cadeia leve não é humana ou humanizada; e (ii) a segunda molécula de ácido nucléico codifica um domínio variável de cadeia pesada (VH) contendo CDRs tendo as sequências de ácido nucléico apresentadas nas SEQ ID Nos.: 12, 13 e 14 e em que a cadeia pesada é não humana ou humanizada.
[0024] Em uma modalidade adicional preferida, o fragmento de anticorpo anti-
HGFR é codificado por uma primeira e uma segunda moléculas de ácido nucléico, em que: (i) a primeira molécula de ácido nucléico codifica (a) um domínio variável de cadeia leve (VL) contendo CDRs tendo as sequências de ácido nucléico apresentadas na SEQ ID No.: 9, 10 e 11, em que a cadeia leve é não humana ou humanizada e (b) um domínio constante de cadeia leve humana (CL) na direção do terminal 5’ a 3’ (isto é, uma cadeia leve VL-CL); e (ii) a segunda molécula de ácido nucléico codifica (a) um domínio variável de cadeia pesada (VH) contendo CDRs tendo as sequências de ácido nucléico apresentadas na SEQ ID No.: 12, 13 e 14, em que a cadeia pesada não é humana ou humanizada e (b) um domínio constante de cadeia pesada humana CH1 (CH1) na direção do terminal 5’ a 3’ (isto é, uma cadeia pesada VH-CH1).
[0025] Em uma modalidade preferida, a primeira molécula de ácido nucléico (codificando a cadeia leve VL-CL) contém, preferivelmente consiste de, uma sequência de ácido nucléico como apresentada na SEQ ID No.: 15 e a segunda molécula de ácido nucléico (codificando a cadeia pesada VH-CH1) contém, preferivelmente consiste de, uma sequência de ácido nucléico como apresentada na SEQ ID No.: 16.
[0026] Em uma modalidade adicional abrangida pela presente invenção, o fragmento de anticorpo anti-HGFR é um fragmento Fab de cadeia única anti-HGFR. O fragmento Fab anti-HGFR único contém, preferivelmente consiste de, uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No.: 17 ou o fragmento Fab anti-HGFR único é codificado por uma molécula de ácido nucléico contendo, preferivelmente consistindo de, uma sequência de ácido nucléico como apresentada na SEQ ID No.: 18.
[0027] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção provê a porção extracelular do HGFR humano contendo os domínios SEMA, PSI, IPT-1, IPT-2, IPT-3 e IPT-4.
[0028] Em uma modalidade preferida, a porção extracelular do HGFR humano contém, preferivelmente consiste de, uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID No.: 19, em que um ou mais dos aminoácidos entre a posição 797 e posição 875 da SEQ ID No.: 19 são mutados. De acordo com a presente divulgação, a porção extracelular do HGFR humano tem uma sequência mutada de acordo o conhecimento concernente ao anticorpo anti-HGFR e sítios de ligação de HGF no HGFR, em um modo que o anticorpo não interage com o HGFR, enquanto HGF retém a sua capacidade de ligação à porção extracelular do HGFR humano. Em uma modalidade adicional preferida, a porção extracelular do HGFR humano tem a sequência como ajustada na SEQ ID No.: 20.
[0029] Em uma modalidade adicional abrangida pela presente invenção, a porção extracelular do HGFR humano está na forma de uma molécula de ácido nucléico, em que a molécula de ácido nucléico contém, preferivelmente consiste da sequência de ácido nucléico como apresentada na SEQ ID No.: 21 em que uma ou mais dos ácidos nucléicos entre a posição 2391 e a posição 2625 da SEQ ID No.: 21 são mutados. de acordo com a presente divulgação, a molécula de ácido nucléico codifica uma porção extracelular do HGFR humano tendo uma sequência mutada de acordo com o conhecimento concernente ao anticorpo anti-HGFR e sítios de ligação de HGF no HGFR, em um modo que o anticorpo não interaja com o HGFR, enquanto HGF retém a sua capacidade de ligação à porção extracelular do HGFR humano. Em uma modalidade adicional preferida, a molécula de ácido nucléico codificando a porção extracelular mutada do HGFR humano tem a sequência como apresentada na SEQ ID No.: 22.
[0030] Em modalidades diferentes abrangidas pela presente invenção, o fragmento de anticorpo anti-HGFR é conjugado por meio de um ligador à porção extracelular do HGFR humano na direção do terminal N a C, gerando assim um fragmento-ligador-porção extracelular de anticorpo anti-HGFR de proteína de fusão de HGFR humana. Alternativamente, a porção extracelular do HGFR humano é conjugada por meio de um ligador ao fragmento de anticorpo anti-HGFR na direção de terminal N a C gerando assim uma proteína de fusão da porção extracelular de fragmento HGFR humano-ligador-fragmento de anticorpo anti-HGFR.
[0031] Em modalidades diferentes abrangidas pela presente invenção, a molécula de ácido nucléico codificando o fragmento de anticorpo anti-HGFR é ligado por meio de uma molécula de ácido nucléico codificando um ligador à molécula de ácido nucléico codificando a porção extracelular do HGFR humano na direção do terminal 5’ a 3’, codificando assim um fragmento-ligador-porção extracelular de anticorpo anti- HGFR de proteína de fusão de HGFR humana. Alternativamente, a molécula de ácido nucléico codificando a porção extracelular do HGFR humano é ligado por meio de uma molécula de ácido nucléico codificando um ligador à molécula de ácido nucléico codificando o fragmento de anticorpo anti-HGFR na direção do terminal 5’ para 3’, codificando assim uma porção extracelular da proteína de fusão HGFR humano- ligador-fragmento de anticorpo anti-HGFR.
[0032] A presente invenção, portanto, provê uma proteína de fusão compreendendo na direção do terminal N para C: (i) um fragmento de anticorpo anti-HGFR, um ligador e uma porção extracelular do HGFR humano; ou (ii) uma porção extracelular do HGFR humano, um ligador e um fragmento de anticorpo anti-HGFR.
[0033] Em uma modalidade preferida, a proteína de fusão como definida acima contém, preferivelmente consiste de, uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 23 a 28.
[0034] A presente invenção, portanto, abrange as moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína de fusão compreendendo na direção do terminal de N para C: (i) um fragmento de anticorpo anti-HGFR, um ligador e uma porção extracelular do HGFR humano; ou (ii) uma porção extracelular do HGFR humano, um ligador e um fragmento de anticorpo anti-HGFR.
[0035] Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico codificando a proteína de fusão como definida acima contém, preferivelmente consiste de, uma sequência de ácido nucléico selecionada de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 29 a 34.
[0036] Em uma modalidade adicional, a presente divulgação se refere a um produto farmacêutico compreendendo, em uma única garrafa ou em duas garrafas, (a) um fragmento de anticorpo anti-Receptor do Fator de Crescimento de Hepatócito (HGFR) e um veículo farmaceuticamente aceitável e (b) uma porção extracelular do HGFR humano e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que: (i) o fragmento de anticorpo anti-HGFR tem apenas um parátopo capaz de se ligar a um epítopo da porção extracelular do HGFR humano e tem atividade antagonística para HGFR, (ii) a porção extracelular do HGFR humano é capaz de ligação ao Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF) em uma maneira estável e contém pelo menos uma mutação de aminoácido dentro do epítopo reconhecido pelo fragmento de anticorpo anti-HGFR para impedir a ligação do fragmento de anticorpo anti-HGFR ao mesmo, (iii) o fragmento de anticorpo anti-HGFR e a porção extracelular do HGFR humano estão em uma forma de proteína ou em uma forma de ácido nucléico.
[0037] O produto farmacêutico, portanto, compreende o fragmento de anticorpo anti-HGFR e a porção extracelular do HGFR humano tendo os traços, sozinhos ou em qualquer combinação respectiva, divulgados acima.
[0038] Em um aspecto, a invenção provê um método de tratar um tumor e/ou metástase em um sujeito, o dito método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com uma porção extracelular do HGFR humano, deste modo a dita condição é tratada.
[0039] Em um aspecto, a invenção provê um método de inibir o crescimento de uma célula que expressa HGFR, o dito método compreendendo contatar a dita célula com um fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com uma porção extracelular do HGFR humano da invenção causando deste modo uma inibição do crescimento da dita célula.
[0040] Em um aspecto, a invenção provê um método de tratar terapeuticamente um mamífero tendo um tumor canceroso e/ou metástase, o dito método compreendendo administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz de um fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com uma porção extracelular do HGFR humano, tratando eficazmente deste modo o dito mamífero.
[0041] Em um aspecto, a invenção provê um método para tratar um distúrbio de célula proliferativa, o dito método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com uma porção extracelular do HGFR humano, tratando ou prevenindo deste modo eficazmente o dito distúrbio de célula proliferativa.
[0042] Em um aspecto, a invenção provê um método de tratar terapeuticamente um tumor e/ou metástase em um mamífero, em que o crescimento do dito tumor é pelo menos em parte dependente de um efeito potenciador do crescimento do sistema HGFR/HGF, como a consequência de um aumento na proliferação de célula, uma proteção da apoptose ou ambos. O dito método compreende contatar uma célula de tumor com uma quantidade eficaz de um fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com uma quantidade eficaz de uma porção extracelular do HGFR humano da invenção, tratando eficazmente deste modo o dito tumor e/ou metástase.
[0043] O tumor, que pode ser eficazmente tratado com a terapia de combinação da presente invenção, é selecionado de mamário, colorretal, pulmonar, cólon, pancreático, prostático, ovariano, cervical, do sistema nervoso central, renal, hepatocelular, da bexiga, gástrico, célula de tumor da cabeça e pescoço, carcinoma papilar (por exemplo, a glândula da tireóide), melanoma, linfoma, mieloma, glioma/glioblastoma (por exemplo, astrocitoma anaplástico, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma anaplástico, oligodendroastrocitoma anaplástico), célula de leucemia, sarcoma, rabdomiossarcoma ou um tumor de um câncer de Origem Primária Desconhecida (CUP).
[0044] Em uma modalidade, uma célula que é terapeuticamente alvejada em um método da invenção é uma célula hiperproliferativa e/ou hiperplástica. Em uma modalidade, uma célula que é alvejada em um método da invenção é uma célula displástica. Ainda em uma outra modalidade, uma célula que é alvejada em um método da invenção é uma célula metastática. Em uma modalidade adicional, uma célula que é alvejada em um método da invenção é uma célula expressando HGFR pertencente ao microambiente sustentando o tumor e/ou a metástase.
[0045] Os métodos terapêuticos da invenção podem compreender ainda etapas de tratamento adicionais. Por exemplo, em uma modalidade, o método terapêutico compreende ainda uma etapa em que uma célula de tumor e/ou tecido alvejada é exposta a um tratamento de radiação ou um tratamento quimioterapêutico. Em uma modalidade adicional, uma célula de tumor e/ou tecido alvejada é tratada, além de um fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com uma porção extracelular do HGFR humano da invenção, com moléculas especificamente atingindo outros alvos relevantes na manutenção do fenótipo transformado (isto é, moléculas anti-EGFR).
[0046] A expressão “atividade antagonística” do fragmento de anticorpo anti- HGFR como aqui usado se refere ao anticorpo que é capaz de extinguir a sinalização intracelular evocada em uma célula na ativação do HGFR. A atividade antagonística do dito anticorpo pode ser medida pela avaliação do nível do HGFR de expressão e/ou fosforilação pelas técnicas convencionais tais como western blot, imunofluorescência, imuno-histoquímica, ELISA, análise de citofluorímetro ou qualquer outro método que inclua o uso de um anticorpo que reconheça especificamente HGFR ou os resíduos HGFR Tyr1234-1235 se fosforilados (isto é, o sítio de fosforilação principal de MET9 ou os resíduos do HGFR Tyr 1349/1356 se fosforilados (isto é, o sítio de encaixe de MET 22.
[0047] Como aqui usada, a expressão “a porção extracelular do HGFR humano é capaz de ligação ao HGF humano em uma maneira estável” significa que a porção extracelular do HGFR humano se liga ao HGF com um Kd calculado não mais alto do que 100 nM.
[0048] A expressão “a porção extracelular do HGFR humano contém pelo menos uma mutação de aminoácido no epítopo reconhecido pelo fragmento de anticorpo anti- HGFR”, como aqui usado, significa a presença de uma ou mais mutações (isto é, substituições e/ou deleções e/ou inserções de aminoácido) dentro da porção extracelular do HGFR, capaz de induzir uma modificação dentro da porção extracelular do HGFR que impede o entrosamento da região acima pelos domínios variáveis de anticorpo. A pessoa habilitada em vista do seu conhecimento geral comum (representado i.a. pela possibilidade de gerar um cDNA incluindo uma única mudança de nucleotídeo em uma dada sequência de DNA usando iniciadores específicos durante a duplicação de DNA ver Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) não precisa de detalhes adicionais acerca da realização de uma forma mutada da porção extracelular do HGFR humano retendo a capacidade para ligar ao HGF humano mas não ao fragmento de anticorpo anti-HGFR.
[0049] A presente invenção não deve, portanto, ser interpretada como abrangendo apenas a porção extracelular mutada do HGFR humano como aqui divulgado (isto é, a SEQ ID NO.: 8), visto que a pessoa versada em vista do conhecimento geral comum pode produzir versões mutadas adicionais da porção extracelular do HGFR humano tendo a SEQ ID No.: 19 que impede a ligação do anticorpo anti-HGFR às mesmas.
[0050] Como aqui usado, o termo “fragmento Fab de cadeia única” se refere a um polipeptídeo único codificando os domínios VL, CL, VH, CH1 de um anticorpo, em que VL e CL podem ser posicionados no terminal N do dito polipeptídeo e unidos aos domínios VH e CH1 por um ligador flexível ou os domínios VH e CH1 podem ser posicionados no terminal N do dito polipeptídeo e ligados aos domínios VL e CL por um ligador flexível.
[0051] Os termos “SEMA”, “PSI”, “IPT-1”, “IPT-2”, “IPT-3” e “IPT-4” se referem aos domínios do HGFR constituindo a região extracelular do HGFR. Tais nomes de domínios pertencem ao conhecimento geral comum de uma pessoa versada como representado i.a. por 4, 13. O domínio SEMA é um módulos que interagem com proteína em comum com as semaforinas e plexinas abrangendo a região compreendida entre os aminoácidos 25 e 516 de MET (SEQ ID No.: 19); PSI é um domínio em comum com plexinas, semaforinas, integrinas abrangendo a região compreendida entre os aminoácidos 519 e 561 de MET (SEQ ID No.: 19); o domínio IPT - repetido quatro vezes - é uma região Semelhante à Imunoglobulina em comum com plexinas e fatores de transcrição, abrangendo a região compreendida entre os aminoácidos 563 e 934 de MET (SEQ ID No.: 19. Em detalhes, a repetição IPT 1 abrange as posições de aminoácido 563 a 656 da SEQ ID No.: 19, a repetição IPT 2 abrange as posições de aminoácido 657 e 740 da SEQ ID No.: 19, a repetição IPT 3 abrange as posições de aminoácido 741 e 837 da SEQ ID No.: 19, a repetição IPT 4 abrange as posições de aminoácido 838 e 934 da SEQ ID No.: 19.
[0052] As proteínas de fusão aqui divulgadas podem ser facilmente fabricadas na forma de proteínas ou na forma de moléculas de ácido nucléico codificando as proteínas de fusão por uma pessoa versada em vista do conhecimento geral comum do campo relacionado com a tecnologia de DNA recombinante, como representado i.a. por Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Como exemplo o seguinte procedimento padrão pode ser seguido: (i) síntese da sequência de cDNA correspondente, (ii) inserção do cDNA dentro de um plasmídeo adequado para a expressão em mamíferos pelos métodos de DNA recombinante, convencional (iii) transfecção transitória ou estável com o plasmídeo mencionado acima de uma linhagem de célula de mamífero, (iv) coleta do sobrenadante de cultura, (v) purificação pela cromatografia da proteína de fusão. Os ligadores usados para conjugar as duas sequências de proteína, isto é, o fragmento de anticorpo anti-HGFR e a porção extracelular do HGFR humano, podem ter comprimentos e/ou composição de aminoácido diferentes, sendo flexíveis, rígidas ou uma combinação de regiões flexíveis e rígidas. Os ligadores utilizados na produção das proteínas de fusão podem ser selecionados de, mas não limitados a, qualquer uma das sequências de aminoácidos como apresentada na SEQ ID No.: 35, 36 e 37. Os ligadores utilizados na produção das moléculas de ácido nucléico codificando as proteínas de fusão podem ser selecionados de, mas não limitados a, qualquer uma das sequências de ácido nucléico como apresentadas na SEQ ID No.: 38, 39 e 40.
[0053] No que segue a presente invenção será exemplificada referindo-se a uma combinação do fragmento de anticorpo anti-HGFR contendo as CDRs das SEQ ID NOs.: 1 a 6 pertencentes ao anticorpo monoclonal DN30 divulgado na WO 2007/090807 e a porção extracelular do HGFR contendo os domínios SEMA, PSI, IPT-1 a IPT-4, resumidamente denominados no seguinte DecoyMET.
[0054] Os presentes inventores inesperadamente descobriram que o fragmento de anticorpo DN30 monovalente (MvDN30) e DecoyMET, usado em combinação, permite o alvejamento duplo de ligante e receptor, atuando simultaneamente nas células cancerosas expressando MET e no estroma de tumor secretando HGF e exercendo um efeito sinergístico no tratamento de tumores e/ou metástase.
[0055] A inibição farmacológica do receptor da tirosina cinase de MET nas células cancerosas ‘habituadas’ ao oncogene extingue a proliferação e invasão celular. Consequentemente, pacientes com câncer gástrico ou esofágico com NSCLC avançado amplificado por MET, metastático respondem à terapia anti-MET5, 14, 19. Por outro lado, as células cancerosas sem alterações genéticas de MET exploram o programa ‘fisiológico’ deflagrado pelo oncogene como um ‘expediente’ para reforçar o fenótipo maligno6. A ‘conveniência’ requer estimulação de MET tipo selvagem pelo seu ligante HGF. A este respeito, a contribuição do microambiente tumoral para a progressão de câncer e metástase está se tornando crescentemente relevante, conforme evidências experimentais sugerem que o fenótipo maligno não se desenvolve em um modo estritamente autônomo da célula, mas em uma interação bastante complexa entre as células cancerosas e o estroma hospedeiro. O microambiente do tumor é uma fonte significante de HGF, secretada pelas células estrômica de origem mesenquimatosa como um precursor inativo (proHGF). O último é armazenado na matriz celular, graças à sua avidez para os sulfatos de heparana e é ativada pelas proteases específicas produzidas pelo tumor ou células estrômicas. Portanto, um excesso de ligante biologicamente ativo está prontamente disponível para a ligação do receptor de MET e deflagra a cascata de sinalização do crescimento invasivo em células ‘não habituadas’. Os dados aqui providos mostram que nas condições de ‘conveniência’ de MET, uma intervenção concomitante atingindo ambos os lados do eixo de MET/HGF resulta na atividade inibidora melhorada. O alvejamento simultâneo foi obtido combinando um anticorpo MET monovalente, MvDN30, com um receptor solúvel recombinante, decoyMETK842E. Os dados aqui providos indicam que não há nenhuma redundância no alvejamento do mesmo caminho com ferramentas complementares. Os dois inibidores foram selecionados com base nos seus mecanismos de ação: o anticorpo induz a remoção física de MET da superfície celular pelo ‘desprendimento’ do ectodomínio. O último é liberado no ambiente extracelular e atua como ‘isca’ para HGF. O suprimento exógeno de decoyMET recombinante reforça a atividade sequestrante de HGF da decoyMET endógena gerada por MvDN30. Para permitir o uso concomitante de MvDN30 e decoyMET, um receptor solúvel modificado foi gerado (decoyMETK842E), deficiente na interação de MvDN30 mas dotado com propriedades de ligação de alta afinidade ao HGF. Os dois agentes em combinação cooperam em uma variedade de células cancerosas, reduzindo a dose terapêutica eficaz. Além disso esta ‘estratégia dual’ exibe um efeito sinergístico forte, potencialmente exercendo uma eficácia antitumor superior. A expressão de MET em uma subpopulação de células cancerosas tronco/progenitoras foi definida como ‘inerência’ MET, isto é, a resposta intracelular fisiológica (inerente) induzida por HGF ativada nas células tronco cancerosas - na ausência de lesões genéticas - responsáveis pela resistência às terapias alvejadas, tais como os inibidores do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) no câncer colorretal. O conceito ligando as células tronco cancerosas e a resistência às terapias convencionais é amplamente aceito e o papel do HGF microambiental na manutenção do fenótipo tronco das células progenitoras expressando MET está se tornando cada vez mais estabelecido. Um tratamento anti-MET eficaz, como a combinação de MvDN30 e decoyMETK842E, representa um suporte terapêutico para células tronco cancerosas enfraquecidas e para se opor ao início de resistência às terapias alvejadas.
[0056] O papel do microambiente hospedeiro é difícil de investigar em xenoenxertos de camundongo devido à reatividade cruzada limitada entre fatores derivados de estroma de murino e alvos específicos nas células cancerosas humanas. Isto é particularmente significante no caso do sistema HGF/MET, porque o HGF de murino não ativa MET humano. O desenvolvimento de cepas de camundongo geneticamente modificadas expressando o gene HGF humano Knocked-in (camundongos hHGF-Ki) contornam este problema. Neste modelo transgênico, é mostrado que o alvejamento concomitante de HGF ambiental e do seu receptor nas células cancerosas pode ser uma estratégia terapêutica eficaz para retardar a progressão maligna e metástase.
[0057] Xenoenxertos de adenocarcinoma pancreático são caracterizados pela disseminação metastática precoce, ocorrendo muito cedo durante o desenvolvimento de tumor e são sustentados por um compartimento estrômico abundante. Recentemente, HGF secretado pelas células estreladas pancreáticas foi identificado como um fator desempenhando uma função relevante na interação tumor-estroma neste tipo de malignidade. Em um modelo de camundongo ortotópico de adenocarcinoma pancreático humano enxertado em camundongos hHGF-Ki, MvDN30 e decoyMETK842E em combinação levemente retardaram o crescimento de tumor, como esperado em um modelo de ‘conveniência’ onde MET não é o oncogene condutor. Por outro lado, o tratamento combo provou ser muito eficaz na redução do espalhamento metastático, sugerindo uma aplicação terapêutica possível em células cancerosas não habituadas caracterizando MET tipo selvagem. Os dados epidemiológicos mostram que apenas 2 a 3% dos cânceres epiteliais contam com a habituação oncogênica de MET, por causa da amplificação, rearranjo ou mutação de gene29. Por esta razão, vários testes clínicos - tratando populações não selecionadas de pacientes com câncer - falharam. Por outro lado, a vasta maioria de carcinomas exploram a ativação de MET tipo selvagem dependente de ligante para desencadear o fenótipo metastático invasivo em resposta à hipoxia, radiação ionizante ou quimioterapia. Assim estas descobertas sugerem que um grande grupo de pacientes -correntemente inadequados para a terapia alvejada de MET devido à ausência de uma lesão genética específica - devem se beneficiar de tratamentos abrangendo uma estratégia dupla de anticorpo-isca, que permite bloqueio ótimo da sinalização de MET dirigida por HGF.
[0058] As composições terapêuticas compreendendo os ingredientes ativos da presente invenção, isto é, um fragmento de anticorpo anti-HGFR e uma porção extracelular do HGFR humano, podem ser preparadas como uma preparação única contendo os dois ingredientes ativos misturados juntos ou como preparações separadas, uma contendo um fragmento de anticorpo anti-HGFR e a outra uma porção extracelular do HGFR humano. Os ingredientes ativos são preparados para armazenagem misturando-se o(s) ingrediente(s) ativo(s) tendo o grau desejado de pureza com carreadores, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de soluções aquosas, formulações liofilizadas ou de outro modo secas. Os carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões; antioxidantes; preservantes; polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos; agentes queladores; açúcares; contraíons formadores de sal; complexos metálicos e/ou tensoativos não iônicos. As formulações aqui divulgadas também podem conter outro(s) composto(s) ativo(s) como necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetem adversamente a atividade terapêutica do fragmento de anticorpo anti-HGFR e da porção extracelular do HGFR humano. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[0059] O(s) ingrediente(s) ativo(s) também pode(m) ser aprisionado(s) em microcápsulas preparadas por meio de técnicas divulgadas i.a. em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
[0060] As formulações a serem usadas para a administração in vivo devem ser estéreis.
[0061] As preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo os ingredientes ativos da invenção, cujas matrizes estão na forma de artigos formados, por exemplo, películas ou microcápsula.
[0062] Os ingredientes ativos da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com um outro anticorpo, agente(s) quimioterapêuticos (incluindo coquetéis de agentes quimioterapêuticos), outros agente(s) citotóxico(s), agente(s) antiangiogênico(s), citocinas, e/ou agente(s) inibidor(es) de crescimento. Tais terapias combinadas mencionadas acima incluem a administração combinada (onde os dois ou mais agentes são incluídos na mesma ou em formulações separadas) e administração separada, em cujo caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes e/ou a seguir, da administração da terapia ou terapias adjuvante(s).
[0063] Os ingredientes ativos da presente invenção (e agente(s) terapêutico(s) adjunto(s)) são administrados por quaisquer meios adequados, incluindo parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para local tratamento, intralesional administração. Os ingredientes ativos da presente invenção podem ser adequadamente administrados pela infusão de pulso, particularmente com doses declinantes dos ingredientes ativos. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, pelas injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é transitória ou cônica. Os ingredientes ativos da invenção também podem ser liberados pela transferência de gene por meio de vetores virais (isto é, vetores lentivirais), local ou sistemicamente administrados ou por meio da terapia de célula, isto é, entrega pela injeção intravenosa ou local de células humanas geneticamente modificadas pela transdução de vetores virais (isto é, vetores lentivirais) para expressar um fragmento de anticorpo anti-HGFR e uma porção extracelular do HGFR humano.
[0064] Os ingredientes ativos da invenção serão formulados, dosados e administrados em uma maneira compatível com boas práticas médicas. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de entrega do agente, o método de administração, a programação de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. Os ingredientes ativos da invenção não precisam ser, mas podem opcionalmente ser formulados com um ou mais agentes correntemente usados para impedir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de ingredientes ativos da invenção presentes na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e outros fatores debatidos acima. Estes são geralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração como usadas mais acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens utilizadas até agora.
[0065] Para o tratamento de doença, a dosagem apropriada dos ingredientes ativos da invenção (quando usados sozinhos ou em combinação com outro(s) agente(s) tal(is) como agente(s) quimioterapêutico(s)) dependerá do tipo de doença a ser tratada, da severidade e curso da doença, se os ingredientes ativos são administrados para propósitos preventivos ou terapêuticos, o histórico clínico do paciente e resposta aos ingredientes ativos da invenção são devidamente levados em consideração e no critério do médico atendente.
[0066] O fragmento de anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em um tempo ou sobre uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 mg/kg a 15 mg/kg de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para a administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou pela infusão contínua. Uma dosagem diária típica variaria de cerca de 1 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para as administrações repetidas em vários dias ou mais longo, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que uma supressão desejada dos sintomas de doença ocorra. Uma dosagem exemplar do fragmento de anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo tal que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, por exemplo cerca de seis doses do anticorpo). Uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas pode ser administrada. Um regime de dosagem exemplar compreende administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por uma dose de manutenção semanalmente de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado pelas técnicas e ensaios convencionais. A porção extracelular do HGFR humano deve ser liberada ao mesmo tempo do fragmento de anticorpo e deve ser dosada em proporção ao fragmento de anticorpo, preferencialmente, mas não limitada à razão molar de 1:1 de fragmento de anticorpo:decoyMET, dependendo do tipo e severidade da doença.
RESULTADOS Mutagênese locodirigida do epítopo de ligação de DN30 no decoyMET
[0067] Para explorar a atividade do anticorpo MvDN30 e decoyMET em combinação, é mandatário para impedir a interação entre as duas moléculas que resultaria em neutralização mútua. Foi mostrado anteriormente que MvDN30 reconhece um epítopo dentro do domínio IPT-4 da região extracelular de MET na fronteira com o domínio de IPT-3 28. Estudos anteriores mostraram que o anticorpo DN30 parental, que liga o receptor humano com afinidade picomolar, também interage com MET de cão e rato11,23, enquanto não reage cruzado com camundongo 21. No alinhamento das sequências de aminoácidos IPT-3 e IPT-4 das espécies de mamífero mencionadas acima, vários resíduos foram identificados que são seletivamente trocados no camundongo (Fig. 1A). Para testar se a permuta de ser humano para camundongo de resíduos únicos de aminoácido prejudicaria a ligação de anticorpo, receptores solúveis carregando mutações pontuais no domínio IPT 3-4 foram gerados e testados contra o anticorpo DN30. A substituição de lisina 842 com ácido glutâmico gerou decoyMETK842E, um receptor solúvel modificado já não reconhecido pelo anticorpo, enquanto todas as outras mutações não afetaram a interação (Fig. 1B). A incapacidade do anticorpo para interagir com decoyMETK842E foi confirmada nos ensaios de ELISA, realizados com iscas purificadas por afinidade na fase sólida e anticorpo DN-30 na fase líquida (Fig. 1C). Consequentemente, a substituição de um aminoácido básico na posição 842 com um resíduo ácido resultou na perturbação crítica do sítio de ligação, dificultando a interação de decoyMET K842E-anticorpo. DecoyMETK842E liga HGF com alta afinidade
[0068] Os presentes inventores depois investigaram se a substituição de aminoácido K842E interfere com a ligação de HGF. Nos ensaios de ligação ELISA, a constante de afinidade de decoyMETK842E para HGF (Kd = 1,04 ± 0,05 nM) foi sobreposta com o Kd de 1,44 ± 0,07 nM medido para o decoyMET tipo selvagem (Fig. 2A). Finalmente, a atividade inibidora de decoyMET K842E foi testada em um ensaio de fosforilação de MET induzido por HGF. Como mostrado na Fig. 2B, decoyMET tipo selvagem e decoyMETK842E inibiu a fosforilação de MET dependente de HGF em células cancerosas pulmonares A549 com potência comparável. Assim, a substituição K842E não interfere com a formação de um complexo estável com HGF e deixa a atividade inibidora da isca não afetada. MvDN30 e decoyMETK842E cooperam na inibição da fosforilação de MET e respostas biológicas a jusante
[0069] Para avaliar a atividade inibidora evocada pelo alvejamento concomitante do ligante e do receptor sobre a transdução de sinal MET, a fosforilação de MET foi testada na presença de MvDN30 e decoyMETK842E, sozinhos ou em combinação. Para esta finalidade, as células A549, expressando um receptor de MET do tipo selvagem, foram estimuladas com concentrações nanomolares de HGF e a ativação de MET foi medida pelos anticorpos fosfoMET. Ambas as moléculas demonstraram atividade inibidora e a combinação das duas foi mais eficiente (Fig. 3A). A análise de transdutores de sinalização a jusante confirmou que a combinação obteve a inibição de ERK e ativação de AKT mais eficazes (Fig. 3B).
[0070] Por razões biológicas, MvDN30 e decoyMET K842E em combinação fortemente inibiram o crescimento de colônia independente de ancoragem, em modelos celulares de estimulação de HGF tanto autócrina quanto parácrina. No primeiro, o crescimento de colônia muito eficiente - exibindo células de glioblastoma U87-MG em ágar mole devido a uma alça autócrina MET/HGF - foi inibido em 75% quando MvDN30 e decoyMETK842E foram usados em combinação, enquanto que a inibição do crescimento de colônia nunca excedeu 40% quando as duas moléculas foram usadas como agentes únicos (Fig. 3B). Do mesmo modo, o tratamento combo completamente bloqueou a formação de colônias de A549 em ágar mole induzidas pelas concentrações nanomolares de HGF exogenamente administrada, enquanto MvDN30 e decoyMETK842E sozinhos alcançaram uma inibição parcial embora significante do crescimento de colônia (65% e 74%, respectivamente, Fig. 3C). Resultados similares foram obtidos em ensaios de invasão realizados em câmaras revestidas com Matrigel: MvDN30 e decoyMETK842E em combinação reduziram a invasão dirigida por HGF de células de adenocarcinoma pancreático humanas HPAF- II em 85%, enquanto como agentes únicos alcançaram apenas 59% e 52% de inibição, respectivamente (Fig. 3D). Em todos estes sistemas biológicos, a combinação MvDN30 e decoyMETK842E comunicou a fosforilação de MET mais eficazmente do que os tratamentos únicos (Fig. 4).
[0071] Para avaliar se o efeito dos dois inibidores é aditivo ou sinergístico, um ensaio de motilidade quantitativa foi realizado. As células de adenocarcinoma pancreático humanas HPAF-II, expressando MET tipo selvagem, foram induzidas a se espalharem pelo HGF. O espalhamento de célula foi quantificado medindo-se as variações de impedância elétrica de eletrodos cobertos pelas células (X-CELLigence Real Time Cell Analyzer). As duas moléculas em combinação reduziram o espalhamento de célula dependente de HGF na maneira dependente da dose, começando a inibição a 250 nM e alcançando o bloqueio completo na faixa micromolar (Figs. 5 A e B). Os valores de índice celular medidos no final do experimento (tempo = 48 horas) foram normalizados em HGF (Fig. 5C) e elaborados com o software CalcuSYN para avaliar sinergismo (Fig. 5D): para todas as concentrações examinadas, o Índice de Combinação (CI) calculado foi bem abaixo de 0,5 (CI = 0,1, 0,09, 0,17 e 0,38 para 0,06, 0,25, 1 e 4 μM, respectivamente), indicando que MvDN30 e decoyMETK842E exibem um comportamento sinergístico10. MvDN30 e decoyMETK842E atenuam o fenótipo invasivo e reduzem o espalhamento metastático
[0072] A atividade inibitória de MvDN30 e decoyMET K842E em combinação foi avaliada in vivo em modelos de camundongo de estimulação de MET dirigida por ligante.
[0073] O modelo de tumor de xenoenxerto de glioblastoma U87-MG de estimulação de HGF autócrina foi investigado. As células foram injetadas subcutaneamente em camundongos NOD-SCID; quando os tumores atingiram um volume de 80 a 100 mm3, os camundongos foram estratificados em grupos homogêneos e aleatoriamente designados a 4 ramos de tratamento: Veículo, MvDN30, decoyMETK842E ou a combinação dos dois. Depois de 22 dias de tratamento, os camundongos foram sacrificados e os tumores primários excisado para o exame histológico. Embora o tratamento combo induza apenas uma inibição marginal de crescimento (Fig. 6A), a redução de características distintivas fenotípicas da invasão de tumor foi observada (Fig. 6B).
[0074] O tratamento combo também foi inoculado em um modelo parácrino de estimulação de HGF. Como anteriormente relatado, HGF de camundongo não ativa o receptor de MET humano24, 30. Consequentemente, para testar a atividade inibidora de decoyMETK842E em xenoenxertos de tumores humanos, nós utilizamos um camundongo SCID transgênico onde o gene HGF de camundongo foi substituído pelo gene humano (hHGF-Ki)20. As células de adenocarcinoma pancreático humano (HPAF-II) foram rotuladas pela transdução com o gene da luciferase e injetadas ortotopicamente no pâncreas de camundongos hHGF-Ki. O enxerto foi checado pela análise da luminescência de corpo total; os camundongos foram estratificados em grupos homogêneos com base nos valores de bioluminescência e aleatoriamente designado a 4 grupos de tratamento: VEÍCULO, MvDN30, decoyMET K842E ou a combinação dos dois. O crescimento de tumor foi monitorado pela luminescência de corpo total (Fig. 7A). No sacrifício, 5 semanas depois da injeção de célula, os tumores foram excisados e analisados quanto à fosforilação, proliferação, apoptose e expressão de vimentina/E-caderina de MET (marcadores de transição epitelial- mesenquimatosa). Concorrentemente, os pulmões foram coletados para a avaliação pela histoquímica de nódulos metastáticos. A situação fosforilada de MET nas Tirosinas 1234-1235 foi inibida por cada um dos agentes e o tratamento combo evocou um efeito dramático (Fig. 8A). Como esperado neste modelo de ‘conveniência’ de oncogene MET (isto é, expressão de MET tipo selvagem), a proliferação assim como a apoptose foram modestamente afetadas e apenas pelo tratamento combo (Fig. 7B e C). A análise da razão entre vimentina e E-caderina mostrou que o tratamento de combinação empurrou as células cancerosas para um fenótipo mais epitelial (Fig. 8B).
Consequentemente, a administração concomitante de MvDN30 e decoyMETK842E significantemente inibiu a disseminação metastática dirigida por MET para o pulmão (Fig. 8C). Geração de um painel de proteínas de fusão contendo um fragmento de anticorpo anti-HGFR e uma porção extracelular do HGFR humano
[0075] Para gerar um único cDNA codificando as proteínas de fusão contendo um fragmento de anticorpo anti-HGFR e uma porção extracelular do HGFR humano os presentes inventores primeiro planejaram uma cadeia única MvDN30 (ScMvDN30), introduzindo um ligador entre a cadeia leve (VL-CL) e a cadeia pesada (VH-CH1). O ligador foi flexível, rico em resíduos de glicina/serina e teve um comprimento que permitiu preferencialmente a geração de moléculas monoméricas, constituídas pela associação de cadeias leves e pesadas de anticorpo pertencentes ao mesmo polipeptídeo e não de polipeptídeos separados gerando assim dímeros e/ou multímeros. A sequência de aminoácido preferida do ligador é relatada na SEQ ID No.: 36; a sequência de nucleotídeo correspondente é relatada na SEQ ID No.: 39. Depois o cDNA ScMvDN30 foi fundido na estrutura com DecoyMET K842E. Dois grupos de proteínas de fusão foram gerados: i) decoyMET K842E foi localizado no terminal N e ScMvDN30 no terminal C e ii) scMvDN30 foi localizado no terminal N e decoyMet K842E no terminal C. Para garantir um alto grau de liberdade para a estrutura inteira os presentes inventores introduziram um segundo ligador entre as duas porções. Três ligadores diferentes, modificados na composição de aminoácido e/ou comprimento, foram utilizados: i) L45: um ligador rígido de 45 aminoácidos constituído de duas repetições de uma sequência rica em alanina e resíduos carregados, SEQ ID No.: 35, a sequência de nucleotídeo correspondente é relatada na SEQ ID No.: 38; ii) L60, um ligador flexível rico em resíduos de glicina/serina de 60 aminoácidos da SEQ ID No.: 36, a sequência de nucleotídeo correspondente é relatada na SEQ ID No.: 39; iii) L134, uma combinação de regiões flexíveis e rígidas de 134 aminoácidos da SEQ ID No.:37, a sequência de nucleotídeo correspondente é relatada na SEQ ID No.: 40. Uma representação esquemática das proteínas de fusão é relatada na Fig. 9. Proteínas de fusão contendo scMvDN30 no terminal N e decoyMET K842E no terminal
C se ligam com alta afinidade tanto a MET quanto a HGF.
[0076] Os presentes inventores investigaram pelos ensaios de ELISA se as novas proteínas de fusão gerada mantiveram a capacidade de ligação tanto a HGF quanto a MET. Todas as proteínas de fusão interagiram com HGF com uma afinidade sobreponível com aquela de decoyMETK842E (Fig. 10A), enquanto as proteínas de fusão contendo scMvDN30 no terminal C reconheceram MET com uma afinidade mais baixa com respeito às fusões com o anticorpo localizado no terminal N. Os valores Kd medidos para este último grupo de moléculas foram comparáveis aqueles medido para scMvDN30 sozinho (Fig. 10B). As proteínas de fusão eficientemente inibiram o crescimento da célula de tumor.
[0077] Os presentes inventores avaliaram as propriedades inibidoras das proteínas de fusão medindo a deterioração do crescimento da célula depois de três dias de tratamento em comparação com scMvDN30 combinado com decoyMET K842E na razão equimolar. Todas as proteínas de fusão exibiram propriedades inibidoras em uma maneira dependente da dose. No experimento relatado as fusões com ligador L60 foram menos potentes do que as outras moléculas, enquanto que as proteínas L45 e L134 exibiram uma atividade similar ao scMvDN30-decoyMETK842E em combinação (Fig. 11). As proteínas de fusão eficientemente inibiram a motilidade de célula induzida por HGF.
[0078] Para avaliar o efeito das proteínas de fusão na inibição da motilidade da célula dirigida por HGF os presentes inventores realizaram o ensaio de motilidade quantitativa com o Analisador de Célula em Tempo Real X-CELLigence usando como modelo as células de adenocarcinoma pancreático humano o HPAF-II tratadas com HGF. Todas as fusões foram capazes de reduzir o espalhamento de célula dependente de HGF (Fig. 12). As proteínas de fusão reduziram o espalhamento metastático mais potentemente do que MvDN30 e decoyMETK842E em combinação
[0079] A atividade inibidora das proteínas de fusão foi avaliada in vivo no modelo de camundongo hHGF-Ki SCID. As células de adenocarcinoma pancreático humano
(Capan-I) foram rotuladas pela transdução com o gene da luciferase e injetados ortotopicamente no pâncreas dos camundongos. O enxerto foi checado pela análise de luminescência de corpo total; os camundongos foram estratificados em grupos homogêneos com base nos valores de bioluminescência e tratados com as proteínas de fusão incluindo os ligadores L60 ou L134. Como referências MvDN30 e decoyMETK842E em combinação 1:1 e veículo foram incluídos nos grupos experimentais. No sacrifício, 5 semanas depois da injeção de célula, os fígados foram excisados e analisados pelo IVIS Spectrum para classificar a metástase. A administração concomitante de MvDN30 e decoyMET K842E significantemente inibiu a disseminação metastática dirigida por MET para o fígado; uma alta eficácia foi contada se a administração de MvDN30 foi feita diariamente (grupo COMBO 1), enquanto a resposta terapêutica foi significantemente reduzida se administrações menos frequentes foram aplicadas (grupo COMBO 2). Esta limitação não foi contada nos camundongos tratados com as proteínas de fusão. De fato, todos deles reduziram a disseminação metastática para o fígado com alta eficácia, mesmo se a liberação foi feita duas vezes por semana (Fig.13).
MATERIAL E MÉTODOS Cultura de célula
[0080] As células de adenocarcinoma pulmonar humano A549, as células de adenocarcinoma pancreático humano HPAF-II e Capan-1 e as células de glioblastoma humano U87-MG foram obtidos da ATCC/LGC Standards S.r.l. (Sesto San Giovanni, Itália); as células de carcinoma pulmonar humano EBC-1 foram da Japanese Collection of Research Bioresources. Todas as células foram cultivadas como sugerido pelo fornecedor. Todas as culturas de célula foram testadas quanto à contaminação de micoplasma. Geração, expressão e purificação do fragmento de anticorpo anti-HGFR
[0081] Os cDNAs codificando a cadeia leve (VL-CL) e a cadeia pesada (VH-CH1) do fragmento de anticorpo anti-HGFR capaz de reconhecer um epítopo da porção extracelular do HGFR foram geradas pela síntese de gene realizada na terceirização pela Invitrogen GeneArt Gene Synthesis (ThermoFisher) de acordo com as sequências relatadas na SEQ ID No.: 7 e SEQ ID No.: 8. Os fragmentos de anticorpo foram produzidos pela transfecção transitória de células HEK-293T com plasmídeos pcDNA3.1 (cat.# V79020 Invitrogen Corporation, Camarillo, CA) expressando cDNAs codificando a cadeia leve (VL-CL) e a cadeia pesada (VH-CH1). As células transfectadas foram privadas de alimento por três dias transfretadas e os sobrenadantes da cultura de célula contendo os receptores solúveis foram coletados. A purificação das proteínas recombinantes foi feita pela cromatografia de afinidade usando colunas HisTrap HP (cat.# 17524701 GE Healthcare, Freiburg, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A produção e purificação de proteína em larga escala foram realizadas pela U-Proteína Express BV (Utrecht, Países Baixos). Geração, expressão e purificação de ectodomínios MET mutados
[0082] As sequências de cDNA de ectodomínios MET humanos (decoyMET) carreando substituições de aminoácido únicas foram geradas usando o kit de Mutagênese Locodirigida QuickChange II (cat.# 200524 Agilent Technologies, Santa Clara, CA), seguindo as instruções do fabricante. O procedimento requer o planejamento de oligonucleotídeos de sentido e antissentido, que incluem a mutação pontual desejada. Os seguintes oligos foram utilizados: - mutação K842E:
[0083] sn. 5’-gtacataatcctgtgtttgagccttttgaaaagccagtg-3’ (SEQ ID No.: 41)
[0084] as. 5’-cactggcttttcaaaaggctcaaacacaggattatgtac-3’ (SEQ ID No.: 42) - mutação Q807K:
[0085] sn. 5’-ccactccttccctgaaacagctgaatctgcaactcc-3’ (SEQ ID No.: 43)
[0086] as. 5’-ggagttgcagattcagctgtttcagggaaggagtgg-3’ (SEQ ID No.: 44) - mutação D864N:
[0087] sn. 5’-ctggaaattaagggaaataatattgaccctgaagcagttaaagg-3’ (SEQ ID No.: 45)
[0088] as. 5’-cctttaactgcttcagggtcaatattatttcccttaatttccag-3’ (SEQ ID No.: 46).
[0089] Os receptores solúveis engenheirados foram produzidos pela transfecção transitória de células HEK-293T com plasmídeos pcDNA3.1 (cat.# V79020 Invitrogen Corporation, Camarillo, CA) expressando cDNAs codificando decoyMET tipo selvagem ou mutantes de decoyMET. As células transfectadas foram privadas de alimento durante três dias e os sobrenadantes de cultura celular contendo os receptores solúveis foram coletados. A purificação das proteínas recombinantes foi feita pela cromatografia de afinidade usando as colunas HisTrap HP (cat.# 17524701 GE Healthcare, Freiburg, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A produção e purificação de proteína em larga escala foram realizadas pela U-Protein Express BV (Utrecht, Países Baixos). Ensaios de fosforilação de MET
[0090] A549 privadas de soro foram incubadas durante 24 h com 125 nM de MvDN30 ou 2 μM de decoyMETK842E, sozinhos ou em combinação e depois estimuladas com 50 ng/ml de HGF (cat.# 294-HG-025 R&D Systems) durante 2 h a 4°C. Os lisados de célula totais foram analisados pela Western blot usando os seguintes anticorpos primários: anti-MET fosfo-Tyr1234/1235 (D26, cat.# 3077 Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-MET (3D4, cat.# 08-1366 Invitrogen Corporation); antivinculina (clone hVIN-1, cat.# V9131 Sigma Life Science, Saint Louis, MO). anticorpos secundários conjugados com HRP IgG1 anticamundongo (cat.# JI115035003) e IgG anticoelho (cat.# JI111035003) foram da Jackson ImmunoResearch. (West Grove, PA). Ensaios de Ligação de ELISA
[0091] Para a análise da interação entre decoyMET e o mAb DN30, receptores solúveis purificados pela afinidade (decoyMET tipo selvagem ou decoyMET K842E, 100 ng/poço) foram imobilizados nas placas de ELISA e as concentrações crescentes do anticorpo (0 a 100 nM) foram adicionadas na fase líquida. A ligação foi revelada usando anticorpos anticamundongo conjugados a HRP (cat.# NA931 GE Healthcare). Para a análise da interação entre as proteínas de fusão, decoyMET tipo selvagem purificado pela afinidade (100 ng/poço) foi imobilizado nas placas de ELISA e as concentrações crescentes das proteínas de fusão ou scMvDN30 (0 a 1000 nM) foram adicionadas na fase líquida. A ligação foi revelada usando anticorpo de cadeia k anti- ser humano conjugada a HRP (cat.# A7164 Sigma-Aldrich). Para a análise de decoyMET ou ligação das proteínas de fusão a HGF, receptores solúveis (100 ng/poço) foram imobilizados nas placas de ELISA e incubados com concentrações crescentes de HGF (0 a 11 nM) em solução. A ligação foi detectada usando o anticorpo biotinilado anti-HGF (cat.# BAF294 R&D Systems) e revelada com estreptavidina conjugada a HRP (cat.# RPN 1231 GE Healthcare).
[0092] O ensaio colorimétrico foi quantificado pela leitora de placa de rótulo múltiplo VICTOR-X4 (Perkin Elmer Instruments INC., Whaltman, MA). Os dados foram analisados e ajustados usando software Prism (GraphPad). Ensaios biológicos in vitro
[0093] Para ensaios e crescimento independente de ancoragem, as células foram colocadas em suspensão no meio de cultura apropriado suplementado com 2% de FBS e 0,5% de Seaplaque agarose (cat.# 50100 BMA, Rockland, ME) e semeadas em placas de 48 poços (500 células/poço) no topo de 1% de agarose. Meio fresco contendo os tratamentos foi suprido duas vezes semanalmente. As células A549 foram tratadas com 1 μM de MvDN30 ou 1 μM de decoyMETK842E, sozinhos ou em combinação, na presença de 30 ng/ml de HGF. As células U87-MG foram tratadas com 0,5 μM de MvDN30 ou 1 μM de decoyMETK842E, sozinhas ou em combinação. As colônias foram coradas com sais de tetrazólio (cat.# T01380 Sigma-Aldrich) depois de 12 dias de cultura. O crescimento das colônias foi determinado usando o software Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Para os ensaios de invasão de célula, as células HPAF-II (1,5 X 105/poço) foram colocadas em suspensão em meio de cultura livre de soro na presença de 0,5 μM de MvDN30 ou 1 μM de decoyMET K842E, sozinhas ou em combinação e semeadas no compartimento superior de câmaras transwell pré-revestidas com 30 μg/poço de Matrigel Matrix (cat.# 354234 Corning Incorporated, NY). O meio de cultura suplementado com 2% de FBS e 12,5 ng/ml de HGF foi adicionado ao compartimento inferior da câmara. Depois de 24 h, as células no lado superior dos filtros transwell foram mecanicamente removidas, enquanto que as células migradas através da membrana foram fixadas com 11% de glutaraldeído (cat.# 340855 Sigma-Aldrich) e tingido com 0,1 % de Violeta Cristal (cat. # C3886 Sigma-Aldrich). A invasão de célula foi quantificada com o software Image-J. Para os ensaios de dispersão de célula, as células HPAF-II (8000/poço) foram semeadas em placas de 96 poços em meio de cultura completo. Depois de 6 h, concentrações crescentes (0 a 4 μM) de MvDN30 ou decoyMET K842E, sozinhas ou em combinação 1:1, foram adicionadas. Depois de mais 24 h, as células foram estimuladas com 6,25 ng/ml de HGF por 20 h. As células foram fixadas com 11% de glutaraldeído e coradas com 0,1 % de Violeta Cristal). Para o ensaio de motilidade celular em tempo real, células HPAF-II foram semeadas em placas E (8000/poço; Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e tratadas como acima; quando aplicadas, as proteínas de fusão foram testadas em uma concentração de 3 μM. A impedância elétrica foi monitorada continuamente durante 48 h, com registro de dados a cada dez minutos, usando um dispositivo X-Celligence RTCA (Roche Diagnostic). Os valores são expressos como índice de célula normalizada no momento da adição de HGF.
[0094] Para o crescimento de célula dependente de ancoragem, as células EBC- 1 foram semeadas a 2000 células/poço em uma placa de 96 poços em meio de cultura 5% meio de cultura FBS. Depois de 24 horas, o meio foi substituído com um fresco com 5% de FBS mais as moléculas a serem testadas (concentrações crescentes - de 0,001 a 3 μM). A viabilidade celular foi avaliada depois de 72 horas usando o CellTiter- Glo (cat.# G7573 Promega Corp., Madison, WI), de acordo com as instruções do fabricante. A quimioluminescência foi detectada com VICTOR X4. Imunofluorescência
[0095] A análise de imunofluorescência nas células de tumor e tecidos foi realizada como descrito16,25. O tingimento foi feito com um anticorpo primário anti-MET fosfo-Tyr1234/1235 (D26) e revelado pelo anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 555 (cat.# A31570 Thermo Fisher Scientific). As células foram contracoradas com faloidina conjugada a 488 (cat.# A12379 Thermo Fisher Scientific). Todas as imagens foram capturadas com um microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP5 AOBS (Leica Microsystems). Os ajustes de aquisição de imunofluorescência foram mantidos constantes dentro de cada linhagem de célula ou tecido de tumor. A intensidade de Fluorescência Média (MFI) foi avaliada com software ImageJ, medindo a intensidade média de pixeis em cada canal, subtraído o fundo. Para as linhagens de célula, fosfoMET MFI foi normalizado na faloidina, enquanto que para os tumores todos os sinais foram normalizados no DAPI.
Experimentos in vivo
[0096] Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Ético para experimentação com animais da Fondazione Piemontese per la Ricerca sul Cancro e pelo Italian Ministry of Health. Camundongos NOD-SCID foram adquiridos da Charles River (Calco, Itália); camundongos hHGF-Ki SCID) foram obtidos da AVEO Pharmaceuticals, Cambridge, MA.
[0097] As células U87-MG foram injetadas subcutaneamente (2 x 106/camundongo) no flanco direito de camundongos NOD-SCID fêmeas. O crescimento de tumor foi monitorado pela medição com paquímetro duas vezes por semana. O volume de tumor foi calculado usando a fórmula: V = 4/3 π (x/2)(y/2)(z/2), onde x, y e z são altura, largura e profundidade da massa de tumor. Quando os tumores atingiram um volume de 80 a 100 mm 3 (dia 0), os camundongos foram estratificados em quatro grupos homogêneos e tratados duas vezes por semana pela injeção intratumoral com: veículo (n = 10); MvDN30, 12,5 μg (n = 9); K842E, 125 μg (n = 9); a combinação dos dois (n = 10). Depois de 22 dias de tratamento, os camundongos foram sacrificados e os tumores foram excisados e embutidos em parafina para a análise histológica. O aumento de dobra do volume de tumor foi calculado como a razão entre o valor no dia 22 e o valor no dia 0.
[0098] As células HPAF-II ou Capan-1 foram transduzidas com 100 ng/ml de p24 de vetores lentivirais carreando o gene da luciferase sob o controle do promotor de CMV como descrito1. As células HPAF-II expressando Luciferase (104/camundongo) foram injetadas no pâncreas de camundongos hHGF-KI SCID fêmeas de 4 a 6 semanas de idade. Depois de dois dias, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com D-Luciferina XenoLight (150 mg/kg; cat.# 122799 Perkin Elmer), estratificados em grupos homogêneos com base no sinal de bioluminescência usando um aparelho IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer) e aleatoriamente designados para 4 tratamento: veículo (n = 10); MvDN30 (10 mg/kg, n = 6); decoyMET K842E (10 mg/kg, n = 6); MvDN30 + decoyMETK842E (10 + 10 mg/kg , n = 6). Os tratamentos foram administrados diariamente (MvDN30) ou a cada dois dias (decoyMETK842E) pela injeção intraperitoneal. No sacrifício, depois de cinco semanas de tratamento, os tumores e pulmões foram explantados. Os tumores foram embutidos em parafina ou OCT e processados para imuno-histoquímica ou análise imunofluorescência, respectivamente. A proliferação de células de tumor foi determinada usando um anticorpo monoclonal anti-Ki67 (MIB-1, cat.# M724001-2 Agilent Technologies) como anteriormente descrito18. Os pulmões foram processados para análise histoquímica e as micrometastases foram avaliadas pela microscopia óptica em seções não sequenciais embutidas em parafina, coradas com HE. Para cada camundongo, dez lâminas foram analisadas; as lesões metastáticas foram contadas e a sua área quantificada com software ImageJ.
[0099] Capan-1 expressando Luciferase (106/camundongo) foram injetadas no pâncreas de camundongos hHGF-Ki SCID fêmeas de 4 a 6 semanas de idade. A estratificação dos camundongos foi realizada como acima. Os ramos de tratamento: Veículo (n = 14), MvDN30 e decoyMETK842E em combinação (10 + 10 mg/kg; grupo 1, n = 4; grupo 2 n = 6), scMvDN30_K842E_L60 (10 mg/kg; n = 5), K842E scMvDN30_L60 (10 mg/kg; n = 4), scMvDN30_K842E_L134 (10 mg/kg; n = 6), K842E_scMvDN30_L134 (10 mg/kg; n = 5). Os tratamentos foram administrados diariamente (MvDN30) ou a cada dois dias (decoyMETK842E e proteínas de fusão recombinantes) pela injeção intraperitoneal. Depois de cinco semanas de tratamento, os animais foram sacrificados e os fígados foram coletados para medir os sinais de bioluminescência pelo IVIS Spectrum. Os camundongos foram considerados positivos na metástase quando a bioluminescência detectada no fígado pelo IVIS Spectrum foi mais alta do que 105 fótons/segundo. Análise Estatística
[0100] O desvio padrão (SD) médio e o erro padrão da média (SEM) foram calculados usando o software Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, Washington). Para calcular valores Kd médios, os dados de ensaios ELISA foram analisados e ajustados de acordo com a regressão não linear, uma curva de hipérbole de ligação de sítio, usando software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, Califórnia). Para calcular valores IC50, os dados dos ensaios de proliferação foram analisados e ajustados de acordo com a regressão não linear, curva sigmoidal de dose-resposta, usando o software GraphPad Prism. A significância estatística foi determinada usando um teste t de Student de duas caudas. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes (réplicas biológicas). Os experimentos in vivo foram repetidos duas vezes. As Figuras mostram um experimento representativo.
REFERÊNCIAS
[0101] 1. Amendola M, Venneri MA, Biffi A, Vigna E, Naldini L. Coordinate dual- gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat Biotechnol 2005; 23: 108-116.
[0102] 2. Bertotti A, Burbridge MF, Gastaldi S, Galimi F, Torti D, Medico E et al. Only a subset of Met-activated pathways are required to sustain oncogene addiction. Sci Signal 2009; 2: er11.
[0103] 3. Blumenschein GR, Mills GB, Gonzalez-Angulo AM. Targeting the hepatocyte growth factor-cMET axis in cancer therapy. J Clin Oncol 2012; 30: 3287-
3296.
[0104] 4. Bork P, Doerks T, Springer TA, Snel B. Domains in plexins: links to integrins and transcription factors. Trends Biochem Sci 1999; 24: 261-263.
[0105] 5. Catenacci DV, Henderson L, Xiao SY, Patel P, Yauch RL, Hegde P et al. Durable complete response of metastatic gastric cancer with anti-Met therapy followed by resistance at recurrence. Cancer Discov 2011; 1: 573-579.
[0106] 6. Comoglio PM, Giordano S, Trusolino L. Drug development of MET inhibitors: targeting oncogene addiction and expedience. Nat Rev Drug Discov 2008; 7: 504-516.
[0107] 7. Coxon A, Rex K, Meyer S, Sun J, Chen Q, Radinsky R et al. Soluble c- Met receptors inhibit phosphorylation of c-Met and growth of hepatocyte growth factor: c-Met-dependent tumors in animal models. Mol Cancer Ther 2009; 8: 1119-1125.
[0108] 8. De Bacco F, Casanova E, Medico E, Pellegatta S, Orzan F, Albano R et al. The MET oncogene is a functional marker of a glioblastoma stem cell subtype. Cancer Res 2012; 72: 4537-4550.
[0109] 9. Ferracini R, Longati P, Naldini L, Vigna E, Comoglio PM. Identification of the major autophosphorylation site of the Met/hepatocyte growth factor receptor tyrosine kinase. J Biol Chem 1991; 266: 19558-19564.
[0110] 10. Foucquier J, Guedj M. Analysis of drug combinations: current methodological landscape. Pharmacol Res Perspect 2015; 3: e00149.
[0111] 11. Gallo S, Gatti S, Sala V, Albano R, Costelli P, Casanova E et al. Agonist antibodies activating the Met receptor protect cardiomyoblasts from cobalt chloride- induced apoptosis and autophagy. Cell Death Dis 2014; 5: e1185.
[0112] 12. Gastaldi S, Sassi F, Accornero P, Torti D, Galimi F, Migliardi G et al. Met signaling regulates growth, repopulating potential and basal cell-fate commitment of mammary luminal progenitors: implications for basal-like breast cancer. Oncogene 2013; 32: 1428-1440.
[0113] 13. Gherardi E, Love CA, Esnouf RM, Jones EY. The sema domain. Curr Opin Struct Biol 2004; 14: 669-678.
[0114] 14. Lennerz JK, Kwak EL, Ackerman A, Michael M, Fox SB, Bergethon K et al. MET amplification identifies a small and aggressive subgroup of esophagogastric adenocarcinoma with evidence of responsiveness to crizotinib. J Clin Oncol 2011; 29: 4803-4810.
[0115] 15. Luraghi P, Reato G, Cipriano E, Sassi F, Orzan F, Bigatto V et al. MET signaling in colon cancer stem-like cells blunts the therapeutic response to EGFR inhibitors. Cancer Res 2014; 74: 1857-1869.
[0116] 16. Maione F, Capano S, Regano D, Zentilin L, Giacca M, Casanovas O et al. Semaphorin 3A overcomes cancer hypoxia and metastatic dissemination induced by antiangiogenic treatment in mice. J Clin Invest 2012; 122: 1832-1848.
[0117] 17. Michieli P, Mazzone M, Basilico C, Cavassa S, Sottile A, Naldini L et al. Targeting the tumor and its microenvironment by a dual-function decoy Met receptor. Cancer Cell 2004; 6: 61-73.
[0118] 18. Migliardi G, Sassi F, Torti D, Galimi F, Zanella ER, Buscarino M et al. Inhibition of MEK and PI3K/mTOR suppresses tumor growth but does not cause tumor regression in patient-derived xenografts of RAS-mutant colorectal carcinomas. Clin
Cancer Res 2012; 18: 2515-2525.
[0119] 19. Ou SH, Kwak EL, Siwak-Tapp C, Dy J, Bergethon K, Clark JW et al. Activity of crizotinib (PF02341066), a dual mesenchymal-epithelial transition (MET) and anaplastic lymphoma kinase (ALK) inhibitor, in a non-small cell lung cancer patient with de novo MET amplification. J Thorac Oncol 2011; 6: 942-946.
[0120] 20. Pennacchietti S, Cazzanti M, Bertotti A, Rideout WM, Han M, Gyuris J et al. Microenvironment-derived HGF overcomes genetically determined sensitivity to anti-MET drugs. Cancer Res 2014; 74: 6598-6609.
[0121] 21 Petrelli A, Circosta P, Granziero L, Mazzone M, Pisacane A, Fenoglio S et al. Ab-induced ectodomain shedding mediates hepatocyte growth factor receptor down-regulation and hampers biological activity. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 5090-5095.
[0122] 22 Ponzetto C, Bardelli A, Zhen Z, Maina F, dalla Zonca P, Giordano S et al. A multifunctional docking site mediates signaling and transformation by the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor family. Cell 1994; 77: 261-271.
[0123] 23 Prat M, Crepaldi T, Pennacchietti S, Bussolino F, Comoglio PM. Agonistic monoclonal antibodies against the Met receptor dissect the biological responses to HGF. J Cell Sci 1998; 111 ( Pt 2): 237-247.
[0124] 24 Rong S, Oskarsson M, Faletto D, Tsarfaty I, Resau JH, Nakamura T et al. Tumorigenesis induced by coexpression of human hepatocyte growth factor and the human met protooncogene leads to high levels of expression of the ligand and receptor. Cell Growth Differ 1993; 4: 563-569.
[0125] 25 Serio G, Margaria V, Jensen S, Oldani A, Bartek J, Bussolino F et al. Small GTPase Rab5 participates in chromosome congression and regulates localization of the centromere-associated protein CENP-F to kinetochores. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108: 17337-17342.
[0126] 26 Tiran Z, Oren A, Hermesh C, Rotman G, Levine Z, Amitai H et al. A novel recombinant soluble splice variant of Met is a potent antagonist of the hepatocyte growth factor/scatter factor-Met pathway. Clin Cancer Res 2008; 14: 4612-4621.
[0127] 27 Vermeulen L, De Sousa E Melo F, van der Heijden M, Cameron K, de
Jong JH, Borovski T et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nat Cell Biol 2010; 12: 468-476.
[0128] 28 Vigna E, Chiriaco C, Cignetto S, Fontani L, Basilico C, Petronzelli F et al. Inhibition of ligand-independent constitutive activation of the Met oncogenic receptor by the engineered chemically-modified antibody DN30. Mol Oncol 2015; 9: 1760-1772.
[0129] 29 Vigna E, Comoglio PM. Targeting the oncogenic Met receptor by antibodies and gene therapy. Oncogene 2015; 34: 1883-1889.
[0130] 30 Zhang YW, Su Y, Lanning N, Gustafson M, Shinomiya N, Zhao P et al. Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor. Oncogene 2005; 24: 101-106.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Fragmento de anticorpo Receptor do Fator de Crescimento de anti- Hepatócito (HGFR) em combinação com uma porção extracelular de HGFR humano caracterizado pelo fato de ser para o uso no tratamento de um paciente sofrendo de um tumor e/ou metástase, preferivelmente metástase, em que: (i) o fragmento de anticorpo anti-HGFR tem apenas um parátopo capaz de se ligar a um epítopo da porção extracelular de HGFR humano e tem atividade antagonística para HGFR, (ii) a porção extracelular de HGFR humano é capaz de ligação ao fator de Crescimento de Hepatócito (HGF) em uma maneira estável e contém pelo menos uma mutação de aminoácido dentro do epítopo reconhecido pelo fragmento de anticorpo anti-HGFR para impedir a ligação do fragmento de anticorpo anti-HGFR ao mesmo, e (iii) o fragmento de anticorpo anti-HGFR e a porção extracelular de HGFR humano são adequados para a administração ao paciente (a) em uma forma de proteína ou (b) em uma forma de ácido nucléico.
2. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo anti-HGFR contém um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável de cadeia pesada (VH), em que os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada são não humanas ou humanizadas e em que o domínio variável de cadeia leve contém Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) tendo as sequências de aminoácidos apresentada na SEQ ID No.: 1 a 3 e o domínio variável de cadeia pesada contém CDRs tendo as sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID No.: 4 a 6.
3. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo anti-HGFR contém adicionalmente um domínio constante de cadeia leve humana e um domínio constante de cadeia pesada humana CH1, o domínio variável de cadeia leve sendo fundido ao domínio constante de cadeia leve humana na direção do terminal N para
C e o domínio variável de cadeia pesada sendo fundido ao domínio constante de cadeia pesada humana CH1 na direção do terminal N para C.
4. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo anti-HGFR é um fragmento Fab de cadeia única.
5. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a porção extracelular de HGFR humano contém os domínios SEMA, PSI, IPT-1, IPT-2, IPT-3 e IPT-4.
6. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a porção extracelular de HGFR humano contém uma sequência como apresentada na SEQ ID No.: 19, em que pelo menos um dos aminoácidos entre a posição 797 e a posição 875 da SEQ ID No.: 19 são mutados de modo a impedir a ligação do fragmento de anticorpo anti-HGFR ao mesmo.
7. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a porção extracelular de HGFR humano tem a sequência apresentada na SEQ ID No.: 20.
8. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que: (i) o fragmento de anticorpo anti-HGFR é conjugado por meio de um ligador à porção extracelular de HGFR humano na direção do terminal N para o C, gerando assim um fragmento-ligador-porção extracelular de anticorpo anti-HGFR de proteína de fusão de HGFR humana; ou (ii) a porção extracelular de HGFR humano é conjugada por meio de um ligador ao fragmento de anticorpo anti-HGFR na direção do terminal N para o C,
gerando assim uma porção extracelular da proteína de fusão HGFR humano-ligador- fragmento de anticorpo anti-HGFR.
9. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que: (i) a molécula de ácido nucléico codificando o fragmento de anticorpo anti- HGFR é ligada por meio de uma molécula de ácido nucléico codificando um ligador à molécula de ácido nucléico codificando a porção extracelular de HGFR humano na direção do terminal 5’ para 3’, codificando assim um fragmento-ligador-porção extracelular de anticorpo anti-HGFR de proteína de fusão de HGFR humana; ou (ii) a molécula de ácido nucléico codificando a porção extracelular de HGFR humano é ligada por meio de uma molécula de ácido nucléico codificando um ligador à molécula de ácido nucléico codificando o fragmento de anticorpo anti-HGFR na direção do terminal 5’ para o 3’, codificando assim uma porção extracelular da proteína de fusão HGFR humano-ligador-fragmento de anticorpo anti-HGFR.
10. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que: (i) o fragmento-ligador-porção extracelular de anticorpo anti-HGFR de proteína de fusão de HGFR humana contém uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID No.: 26, 27 e 28; ou (ii) a porção extracelular da proteína de fusão HGFR humano-ligador- fragmento de anticorpo anti-HGFR contém uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID No.: 23, 24 e 25.
11. Fragmento de anticorpo anti-HGFR em combinação com a porção extracelular de HGFR humano para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o paciente porta um oncogene MET tipo selvagem.
12. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que contém um fragmento de anticorpo Receptor do Fator de Crescimento de anti-Hepatócito (HGFR)
e uma porção extracelular de HGFR humano definida em qualquer uma das reivindicações precedentes e um veículo farmaceuticamente aceitável.
13. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende na direção do terminal N para o C: (i) um fragmento de anticorpo anti-HGFR, um ligador e uma porção extracelular de HGFR humano; ou (ii) uma porção extracelular de HGFR humano, um ligador e um fragmento de anticorpo anti-HGFR, em que o fragmento de anticorpo anti-HGFR tem apenas um parátopo capaz de se ligar a um epítopo da porção extracelular de HGFR humano e tem atividade antagonística para HGFR, e em que a porção extracelular de HGFR humano contém pelo menos uma mutação de aminoácido dentro do epítopo reconhecido pelo fragmento de anticorpo anti-HGFR para impedir a ligação do fragmento de anticorpo anti-HGFR ao mesmo.
14. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão contém uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das SEQ ID Nos.: 23 a 28.
15. Molécula de ácido nucléico caracterizada pelo fato de que codifica a proteína de fusão definida na reivindicação 13 ou reivindicação 14.
16. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que contém uma proteína de fusão definida na reivindicação 13 ou 14 ou uma molécula de ácido nucléico definida na reivindicação 15 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
17. Produto farmacêutico caracterizado pelo fato de que compreende, em uma única garrafa ou em duas garrafas, (a) um fragmento de anticorpo Receptor do Fator de Crescimento de anti-Hepatócito (HGFR) e um veículo farmaceuticamente aceitável e (b) uma porção extracelular de HGFR humano e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que: (i) o fragmento de anticorpo anti-HGFR tem apenas um parátopo capaz de se ligar a um epítopo da porção extracelular de HGFR humano e tem atividade antagonística para HGFR,
(ii) a porção extracelular de HGFR humano é capaz de ligação ao fator de Crescimento de Hepatócito (HGF) em uma maneira estável e contém pelo menos uma mutação de aminoácido dentro do epítopo reconhecido pelo fragmento de anticorpo anti-HGFR para impedir a ligação do fragmento de anticorpo anti-HGFR ao mesmo, (iii) o fragmento de anticorpo anti-HGFR e a porção extracelular de HGFR humano estão em uma forma de proteína ou em uma forma de ácido nucléico.
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