ES2938714T3 - Fab-Fc anti-Met para el tratamiento de un tumor y/o metástasis - Google Patents

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Abstract

Un fragmento de anticuerpo anti-Met que comprende un único brazo de unión a antígeno y una región Fc, en el que el brazo de unión a antígeno está definido por las regiones variables que tienen secuencias de aminoácidos como se establece en SEQ ID No.: 7, 8 y en el que el anti-Met fragmento de anticuerpo es útil en el tratamiento de un tumor y/o metástasis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Fab-Fc anti-Met para el tratamiento de un tumor y/o metástasis
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a un nuevo agente terapéutico derivado de anticuerpos para el tratamiento de un tumor y/o metástasis.
Antecedentes
El cáncer es una enfermedad genética en la que los genes endógenos somáticos sufren mutaciones. Solo un puñado de genes, conocidos como oncogenes y genes de supresión de tumores, se alteran en las células cancerosas e impulsan la tumorigénesis. Los oncogenes activados son aceleradores y los genes supresores de tumores inactivados carecen de frenos para el crecimiento de células cancerosas. Posteriormente al descubrimiento de los genes mutados que causan cáncer, surgió un nuevo concepto para los oncogenes: la "adicción a los oncogenes", que indica que una célula cancerosa, a pesar de su abundancia de alteraciones genéticas, todavía depende de una sola proteína oncogénica para su proliferación sostenida o supervivencia. Por lo tanto, se emprendieron nuevos avances terapéuticos para desarrollar una "terapia diana" para curar el cáncer. En los últimos 20 años, la focalización farmacológica de proteínas codificadas por genes mutados causantes de cáncer, a través de fármacos químicos o anticuerpos, ha representado el armamento de vanguardia para eliminar las células mutadas y combatir la enfermedad del cáncer. Las terapias dirigidas prometen ser más efectivas que las quimioterapias citotóxicas convencionales, a menudo con menos efectos secundarios. Sin embargo, es probable que sólo los pacientes que portan en sus tumores el gen diana específico alterado se beneficien de la terapia diana. Por lo tanto, la medicina personalizada se requiere en paralelo para evaluar las lesiones genéticas farmacológicas a través de un perfil genómico completo del tumor del paciente.
El oncogén MET codifica para un receptor único de tirosina quinasa dotado de funciones pleiotrópicas. Cuando se modifica genéticamente (mediante mutaciones puntuales, fusión de genes, translocación y/o amplificación), MET inicia la transformación de las células en virtud de su capacidad para activar el programa de crecimiento invasivo. Por lo tanto, las lesiones genéticas de MET que conducen a la hiperactivación constitutiva de Met quinasa inician y mantienen el fenotipo transformado ("adicción a MET")1.
Las lesiones genéticas de MET ocurren en la mayoría de los tumores sólidos con una frecuencia general de 1-4% y son capaces de sobrerregular su actividad quinasa1. Las mutaciones puntuales se concentran en dominios críticos para la unión al ligando del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o la señalización del receptor (dominio SEMA, dominio yuxtamembrana y dominio catalítico). Más recientemente, la secuenciación de próxima generación reveló mutaciones en el sitio de empalme del exón 14 en el 3 % de los cánceres de pulmón de células no pequeñas2, que conducen a la omisión del exón y la eliminación de la región yuxtamembrana de la transcripción de MET, donde un residuo de serina (Ser985) regula negativamente la actividad de la quinasa Met3 y se requiere un residuo de tirosina (Tyr1003) para la internalización y degradación de Met4.
En el programa de "crecimiento invasivo" provocado por MET, la respuesta proliferativa se combina con la migración, la supervivencia, la degradación de la matriz extracelular y la inducción de la polaridad celular5. Las células luchan por estas respuestas biológicas para adaptarse a condiciones adversas y/o escapar para encontrar un entorno más conveniente. En un contexto hostil, Met se sobreexpresa, a través de la sobrerregulación transcripcional, por una variedad de estímulos tales como la hipoxia, las citocinas inflamatorias, los factores proangiogénicos, los mitógenos e incluso el propio HGF. Por último, Met se sobreexpresa en condiciones de daño del ADN inducido por la radiación y contribuye a la resistencia a la radioterapia al promover la activación de la reparación del ADN y la evasión de la muerte celular programada de las células cancerosas.
Se han desarrollado varias moléculas dirigidas a Met para borrar la señalización hiperactiva de Met de una manera selectiva, robusta y altamente efectiva. Estos medicamentos incluyen: antagonistas de HGF (ya sea anticuerpos bloqueadores o señuelos), mAb dirigidos al receptor de Met e inhibidores químicos de la tirosina quinasa (TKI). Los mAb anti-Met representan potencialmente una etapa importante en la batalla contra los cánceres impulsados por MET. En la actualidad, cuatro mAb anti-Met han entrado en ensayos clínicos tempranos: MetMab (Onartuzumab, Roche), LY2875358 (Emibetuzumab, Eli Lilly & Company), ARGX-111 (Argenx), SAIT301 (Samsung) y Sym015 (Symphogen A/S), una mezcla de dos anticuerpos. Actúan bloqueando la unión de HGF a MET de forma competitiva (Onartuzumab, ARGX-111) y/o subregulando m Et (Emibetuzumab, SAIT301, Sym015).
El mAb DN30 murino (divulgado en el documento WO 2007/090807) es una IgG2A que se une al dominio extracelular del receptor de Met humano e induce solo algunos de los efectos biológicos desencadenados por Met6. Activa parcialmente la fosforilación del receptor debido a su naturaleza bivalente que permite la unión simultánea a dos moléculas de antígeno distintas, lo que da como resultado la estabilización de los complejos del receptor de una manera similar a la que se logra con los ligandos naturales. Esta actividad agonista parcial no deseada en Met no se observó en el fragmento Fab DN30 monovalente (MvDN30)7. La conversión del anticuerpo parental DN30 bivalente en el fragmento Fab monovalente libera el potencial terapéutico del anticuerpo anti-Met DN30, lo que conduce a una molécula antagonista completa. Sin embargo, la corta vida media del Fab, debido a su bajo peso molecular, es una severa limitación para el despliegue en terapia. Los presentes inventores desarrollaron por lo tanto nuevas moléculas diseñadas denominadas DCD (Fab de dominio constante dual) caracterizadas por la duplicación de los dominios constantes presentes en el Fab DN30: DCD-1, en el que la duplicación se realizó en tándem, y DCD-2, en el que los dominios constantes de la cadena ligera y pesada se intercambiaron recíprocamente (divulgado en el documento WO 2014/108829). Ambas moléculas recombinantes nuevas muestran propiedades bioquímicas in vitro comparable al Fab original, actuando como antagonistas completos de Met. In vivo, tras la administración sistémica, las nuevas moléculas recombinantes reducen el crecimiento de tumores adictos a Met. DCD-1 y DCD-2 muestran un perfil farmacocinético mejorado respecto al Fab DN30 original, sin embargo, ninguno de los dos alcanza el comportamiento comparable al mAb de origen8.
Se informó anteriormente que la conversión de una forma bivalente a una monovalente de un anticuerpo también se puede lograr mediante la eliminación, a través de un enfoque de ingeniería molecular, de uno de los dos brazos del anticuerpo (divulgado en el documento WO 2005/063816). Los datos reportaron una mejora en la estabilidad in vivo de la molécula, principalmente debido a la actividad del dominio Fc, que se une al receptor de Fc expresado en los órganos.
Sumario de la invención
El objeto de esta divulgación es proporcionar un nuevo agente antitumoral derivado de un anticuerpo monoclonal útil en el tratamiento de pacientes oncológicos, a saber, el anticuerpo monoclonal DN30.
De acuerdo con la invención, el objetivo anterior se consigue gracias al objeto recordado específicamente en las reivindicaciones siguientes, que se entiende que forman parte integrante de esta divulgación.
La presente invención se refiere a un fragmento de anticuerpo anti-Met que comprende un único brazo de unión a antígeno y una región Fc, en el que la región Fc comprende un complejo de un primer y un segundo polipéptido de Fc. El fragmento de anticuerpo comprende:
(i) un primer polipéptido que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) humanizado y un dominio constante de cadena ligera (CL) humano, en el que el dominio variable de cadena ligera (VL) humanizado está fusionado con el dominio constante de cadena ligera (CL) humano en la dirección del extremo terminal N al C, y en el que el dominio variable de cadena ligera (VL) humanizado contiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID No.: 1,2 y 3, y en el que el dominio VL humanizado tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 7;
(ii) un segundo polipéptido que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) humanizado, un dominio CH1 constante de cadena pesada humano y el primer polipéptido de Fc, en el que el primer polipéptido de Fc comprende una región bisagra humana, un dominio CH2 constante humano y un dominio CH3 constante humano, en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) humanizado se fusiona con el dominio CH1 constante de cadena pesada humano, que se fusiona con la región bisagra humana, que se fusiona con el dominio CH2 constante humano, que se fusiona con el dominio CH3 constante humano en la dirección del extremo terminal N a C, y en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) humanizado contiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID No.: 4, 5 y 6, y en el que el dominio VH humanizado tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 8;
(iii) un tercer polipéptido que comprende el segundo polipéptido de Fc humano, en el que el segundo polipéptido de Fc humano comprende una región bisagra, un dominio CH2 constante humano y un dominio CH3 constante humano, en el que la región bisagra está fusionada con el dominio constante CH2 humano que se fusionado con el dominio constante CH3 humano en la dirección del extremo terminal N a C, en los que la región bisagra está truncada en el extremo terminal N.
Las propiedades terapéuticas mejoradas del fragmento de anticuerpo descrito anteriormente dependen de la estructura de las regiones variables y no se deben simplemente a la forma monovalente del anticuerpo y/o la presencia de la región Fc.
La presente invención también se refiere a un producto que comprende, en una sola botella o en dos botellas, (a) el fragmento de anticuerpo anti-Met como se definió anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y (b) una porción extracelular de Met humana y una sustancia farmacéuticamente aceptable, en el que la porción extracelular de Met humana es capaz de unirse al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) de manera estable y contiene al menos una mutación de aminoácido dentro del epítopo reconocido por el fragmento de anticuerpo anti-Met para evitar la unión del fragmento de anticuerpo anti-Met del mismo.
Breve descripción de los dibujos
La invención se describirá ahora en detalle, únicamente a modo de ejemplo ilustrativo y no limitativo y, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
- FIGURA 1: Representación esquemática del anticuerpo DN30 y sus derivados monovalentes. (A) el mAb bivalente murino original; (B) MvDN30, el Fab quimérico; (C) chOA-DN30, el anticuerpo quimérico monovalente 'One-Arm'; (D) hOA-DN30, el anticuerpo monovalente humanizado 'One-Arm'; (E) Los anticuerpos OA-DN30 se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. El gel se tiñó con Gel Code blue.
- FIGURA 2: Unión a Met de las moléculas monovalentes derivadas de DN30. (A) Análisis de unión por ELISA de anticuerpos MvDN30, chOA-DN30, hOA-DN30 (fase líquida) a una quimera Met-Fc humana (fase sólida). (B) Análisis de unión por ELISA de hOA-DN30-cl03E08 (fase líquida) a la quimera Met-Fc (fase sólida); Met de origen humano, murino, rata, mono se incluyeron en el ensayo. La unión se reveló utilizando anticuerpos anti-cadena k humana. O. D.: Densidad Óptica; AU: unidades arbitrarias. Cada punto es la media de valores por triplicado; las barras representan las desviaciones estándar. Las tablas debajo de los gráficos reportan los valores de Kd, los valores máximos de unión (Bmáx) y la puntuación de ajuste (R2). (C) Análisis por citometría de flujo de la unión de hOA-DN30-cl03E08 a Met expresada en la superficie de un panel de líneas celulares derivadas de diferentes especies (EBC-1, cáncer de pulmón humano; mioblastos de músculo de ratón C2C12; mioblastos cardíacos de rata H9C2; MDCK células de riñón de perro; células de riñón de mono Cos-7). Las nuevas moléculas se unen a Met-Fc humana con gran afinidad; el anticuerpo reacciona de forma cruzada con Met humana, de rata, de perro y de mono.
- FIGURA 3: Actividad agonista de las moléculas monovalentes derivadas de DN30. Ensayo de dispersión.
Las células HPAF-II se incubaron durante 24 h con la concentración indicada de HGF (ligando Met), mAb DN30 (agonista parcial), MvDN30 (antagonista completo) y los anticuerpos One-Arm quiméricos o humanizados. Todas las moléculas monovalentes derivadas de DN30 no inducen la dispersión celular, una respuesta biológica mediada por Met.
- FIGURA 4: Desprendimiento de Met y subregulación en células tratadas con moléculas monovalentes derivadas de DN30. Las células A549 se incubaron durante 48 h en medio sin suero con la concentración creciente indicada de derivados de MvDN30, chOA-DN30 o hOA-DN30. Los niveles de Met total se determinaron mediante análisis de transferencia Western de extractos celulares utilizando anticuerpos anti-Met. Las bandas detectadas corresponden a la forma madura del receptor (p145 Met). Como control de carga, el filtro se sondeó con una proteína no relacionada (vinculina). El desprendimiento de Met se determinó mediante análisis de transferencia Western del medio acondicionado utilizando anticuerpos anti-Met. Las bandas detectadas corresponden al dominio extracelular desprendido del receptor (ectodominio Met p80). La tabla reporta la cuantificación de la intensidad de píxeles de cada banda de transferencia Western normalizada en la señal de vinculina correspondiente, medida por densitometría con el software ImageJ. Todos los anticuerpos monovalentes One-Arm subregulan Met e inducen el desprendimiento de Met.
- FIGURA 5: Inhibición de la activación de Met por Moléculas monovalentes derivadas de DN30. Se incubaron GTL-16 (células adictas a MET que portan una Met constitutivamente activa debido a la sobreexpresión del receptor sostenida por la amplificación del gen MET) durante 24 horas en medio libre de suero más anticuerpos hOA-DN30 o chOA-DN30 (1000 o 250 nM). La activación de Met se determinó en lisados celulares totales mediante transferencia Western con anticuerpos anti-Met específicos para los residuos de Met Tyr1234/1235 fosforilados, el principal sitio de fosforilación. La misma transferencia se reprobó con anticuerpos anti-Met. Para controlar la carga de proteínas, el filtro también se sondeó con anticuerpos anti-vinculina. Los anticuerpos One-Arm quiméricos y humanizados inhiben la fosforilación de Met.
- FIGURA 6: Vitalidad de células adictas a MET tratadas con moléculas monovalentes derivadas de DN30. Se sembraron células de carcinoma gástrico humano GTL-16 en placas de 96 pocillos en medio FCS al 10%. Después de 24 horas, las células se trataron con concentraciones crecientes de anticuerpos MvDN30, chOA-DN30 o hOA-DN30 durante 72 horas más. El número de células se evaluó mediante CellTiter-Glo. El gráfico representa el porcentaje de células vivas con respecto al control no tratado. Cada punto es la media de valores por triplicado. La tabla reporta los valores calculados de IC50 y la puntuación de ajuste (R2). Las moléculas One-Arm inhiben el crecimiento celular de las células adictas a MET.
- FIGURA 7: Proliferación y muerte de células adictas a MET inducidas por tratamiento con moléculas monovalentes derivadas de DN30. (A) Ensayo de proliferación: se sembraron células de carcinoma gástrico humano GTL-16 en placas de 6 pocillos en medio FCS al 10 %. Después de 24 horas, las células se trataron con una concentración fija (1 pM) de MvDN30, chOA-DN30 o hOA-DN30-cl03E08 durante 48 horas más. A continuación, se añadió EdU (10n pM) al medio de cultivo durante 2 h más. El porcentaje de células en fase S se determinó mediante análisis citofluorimétrico siguiendo el procedimiento del ensayo de citometría de flujo EdU ClicK-iT. Los gráficos representan las células negativas y positivas para la tinción de APC (EdU+, células en fase S). La tabla reporta el porcentaje de células en fase S. (B) Ensayo de citotoxicidad: se sembraron células de carcinoma gástrico humano GTL-16 en placas de 96 pocillos en medio FCS al 10%. Después de 24 horas, las células se trataron con concentraciones crecientes de MvDN30, chOA-DN30 o hOA-DN30-cl03E08 durante 48 horas más. La citotoxicidad celular se evaluó mediante el ensayo con CellTox Green. Los gráficos representan el incremento de citotoxicidad respecto al control no tratado. Cada punto es la media de valores por triplicado. La tabla reporta los valores de EC50 calculados y la puntuación de ajuste (R2). La molécula One-Arm bloquea eficazmente la proliferación e induce la citotoxicidad en las células adictas a MET.
- FIGURA 8: Motilidad celular inducida por HGF en células tratadas con hOA-DN30-cl03EO8. Las células HPAF-II se pretrataron durante 18 horas con las concentraciones indicadas de hOA-DN30-cl03E08 solo o en combinación con DecoyMetK842E (la misma cantidad que hOA-DN30-cl03E08) y luego se incubó durante 24 h con HGF (6.25 ng/ml). hOA-DN30-cl03E08 inhibe la motilidad celular inducida por HGF; la combinación con DecoyMetK842E contrarresta más eficientemente la respuesta celular.
- FIGURA 9: Invasión de células tratadas con hOA-DN30-cl03E08. Las células HPAF-II se colocaron en placas en la cámara superior de filtros T ranswell recubiertos con matrigel en medio sin suero con 0.5 pM de hOA-DN30-cl03E08 solo o en combinación con 1 pM de DecoyMetK842E. Se añadió medio con HGF (25 ng/ml) en la cámara inferior. Después de 24 horas, las células que migraron en la parte inferior del filtro se evaluaron mediante tinción y observación al microscopio. hOA-DN30-cl03E08 inhibe la invasión celular inducida por HGF; la combinación con DecoyMetK842E bloquea la respuesta biológica.
- FIGURA 10: Modulación de la expresión de PD-L1 por hOA-DN30-cl03EO8. Las células GTL-16 se trataron con 50 ng/ml de IFN-gamma solo o en combinación con 250 nM de hOA-DN30-cl03E08. Después de 48 horas, se lisaron las células; la expresión de PD-L1 y la activación de Met en extractos de proteínas total se evaluaron mediante transferencia Western. Como control de carga, los filtros se probaron con anticuerpos anti-GAPDH.
- FIGURA 11: Perfil farmacocinético in vivo de MvDN30, mAb DN30 y hOA-DN30-cl03EO8. A los ratones inmunodeficientes se les inyectó por vía intravenosa una dosis única (100 pg) de MvDN30, mAb DN30 o hOA-DN30. La sangre periférica se recogió en diferentes momentos. Las concentraciones en suero de las moléculas terapéuticas se midieron por ELISA. El gráfico representa la cantidad de moléculas circulantes en función del tiempo. Las muestras están por triplicado; las barras representan las desviaciones estándar.
- FIGURA 12: Inhibición del crecimiento tumoral adicto a MET in vivo mediante tratamiento con los derivados monovalentes de DN30. Se inocularon 1x106 células de carcinoma gástrico adictas a MET GTL-16 en el flanco de ratones NOD-SCID inmunodeficientes. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de 68.4 ± 5.4 mm3 , los ratones se dividieron aleatoriamente en 4 grupos homogéneos y se trataron con 30 mg/kg de MvDN30, chOA-DN30 o hOA-DN30-cl03E08 mediante inyección intravenosa 2 veces por semana. Como control, se trató un grupo con el mismo volumen de PBS (vehículo). El crecimiento tumoral se controló periódicamente con un calibrador. Después de 15 días, se sacrificaron los ratones. (A) Cinética del crecimiento tumoral; (B) Volúmenes tumorales al final del experimento reportados como porcentaje del grupo no tratado. hOA-DN30-cl03E08 inhibe el crecimiento tumoral adicto a MET de manera más eficiente que chOA-DN30.
- FIGURA 13: Inhibición de respuesta a la dosis del crecimiento tumoral adicto a MET in vivo por tratamiento con hOA-DN30-cl03E08. Se inocularon 1 x106 células de carcinoma gástrico adictas a MET GTL-16 en el flanco de ratones inmunodeficientes NOD-SCID. Después de 8 días, los tumores alcanzaron un volumen promedio de 80.7 ± 2 mm3 y los ratones se dividieron aleatoriamente en 5 grupos homogéneos y se trataron con concentraciones crecientes de hOA-DN30-cl03E08 mediante inyección intravenosa. Como control, se trató un grupo con el mismo volumen de PBS (vehículo). El crecimiento tumoral se controló periódicamente con un calibrador. Después de 17 días, se sacrificaron los ratones y se extirparon y pesaron los tumores. (A) cinética del crecimiento tumoral; (B) Pesos tumorales. hOA-DN30-cl03E08 inhibe el crecimiento tumoral adicto a MET con un perfil de respuesta a la dosis.
- FIGURA 14: Secuencias de aminoácidos de los dominios VL, VH, CL y CH1 de los anticuerpos chOA-DN30 y hOA-DN30-cl03E08. Las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad están resaltadas con un carácter subrayado en negrita.
- FIGURA 15: Secuencias de aminoácidos del primer y segundo polipéptido de Fc de OA-DN30. Las mutaciones de aminoácidos dentro de los dominios CH3 del primer y segundo polipéptido de Fc, necesarias para generar el botón y el agujero, respectivamente, están resaltadas con un carácter subrayado en negrita.
- FIGURA 16: Secuencia de aminoácidos de la forma mutada de DecoyMet. La mutación del aminoácido K842E está resaltada con un carácter subrayado en negrita.
Descripción detallada de la invención
En la siguiente descripción, se dan numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de las realizaciones. Las realizaciones se pueden practicar sin uno o más de los detalles específicos, o con otros métodos, componentes, materiales, etc. En otros casos, las estructuras, materiales u operaciones conocidas no se muestran ni describen en detalle para evitar oscurecer aspectos de las realizaciones.
La referencia a lo largo de esta especificación a "una realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización. Por lo tanto, la aparición de la frase "en una realización" en varios lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no necesariamente se refieren a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.
Los encabezados proporcionados en este documento son solo por conveniencia y no interpretan el alcance o el significado de las realizaciones.
La presente divulgación se refiere a un nuevo agente terapéutico para el tratamiento de un tumor y/o metástasis.
Se estima que más de 200,000 pacientes al año son "adictos a MET" y la inhibición de Met puede resultar potencialmente en la remisión de la enfermedad. Teniendo en cuenta que las mutaciones se acumulan con el envejecimiento y que en los próximos 20 años la población que envejece aumentará, se espera que la carga del cáncer aumente y tenga un gran impacto en los recursos sanitarios mundiales para el tratamiento de los pacientes. Se han encontrado alteraciones genéticas responsables de la "adicción a MET" en carcinoma gástrico, esofágico, colorrectal, renal y pulmonar, melanoma y tumores cerebrales (véase la base de datos COSMIC: www.sanger.ac.uk). Además, la selección de lesiones genéticas de MET se ha encontrado como un mecanismo adquirido de resistencia a una serie de otras terapias dirigidas en cáncer colorrectal y de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)9.
El papel de Met en la metástasis también está asociado con la capacidad de Met para ayudar a las células a adaptarse a un entorno hostil. Las capacidades metastásicas impulsadas por Met no solo dependen de alteraciones genéticas y epigenéticas, sino también de la secreción paracrina de HGF por parte del tejido del estroma tumoral que está compuesto por una gran variedad de tipos de células, incluidos fibroblastos, células epiteliales residentes, pericitos, miofibroblastos, células endoteliales vasculares y linfovasculares y células infiltrantes del sistema inmunitario.
Met se reconoce hoy en día como un objetivo específico del cáncer para: (i) el tratamiento personalizado de tumores con mutaciones/amplificaciones de MET ('adictas a MET'); (ii) para la prevención/reversión de la resistencia primaria y secundaria impulsada por Met a otras terapias dirigidas contra el cáncer; y (iii) para la prevención/reversión del fenotipo invasivo/metastásico impulsado por Met1.
La actividad inhibidora de DN30 radica en su capacidad para promover la actividad fisiológica de la metaloproteasa ADAM-10 que actúa en la superficie celular10, que libera de la membrana plasmática la porción extracelular intacta del receptor (desprendimiento de Met), seguida de la rápida degradación del dominio quinasa intracelular de Met11. Como consecuencia de estos procesos, Met se elimina físicamente de la superficie celular y el dominio extracelular actúa como "señuelo" soluble, evitando la unión del ligando secuestrando el HGF. Por lo tanto, la ventaja de DN30 es inhibir la activación de Met tanto dependiente como independiente de Met12.
En comparación con otros anticuerpos anti-Met, DN30 bloquea las funciones del receptor mediante un mecanismo único que da lugar a actividades diferentes y sinérgicas: (i) eliminación de Met de la superficie celular mediante "desprendimiento" del ectodominio; (ii) secuestro del ligando HGF; (iii) inhibición de la homodimerización o heterodimerización del receptor de Met en la membrana; (iv) estimulación de la degradación del receptor. Por lo tanto, DN30 ofrece la oportunidad de matar dos pájaros de un tiro, lo que permite un bloqueo óptimo de la vía de Met, ya que puede actuar potencialmente no solo en las células cancerosas sino también en el microambiente tumoral (respuestas biológicas impulsadas por HGF de células endoteliales, fibroblastos, y macrófagos).
La presente invención se basa en la idea de que, para alcanzar el mayor potencial terapéutico contra un tumor por medio de un anticuerpo anti-Met, es obligatorio aplicar una molécula que: i) no esté provocando, ni siquiera en parte, las respuestas intracelulares evocadas tras la activación de Met, es decir, no es un agonista ni un agonista parcial; ii) perjudica la activación de Met a través de un mecanismo de acción diferente del desplazamiento del ligando (HGF); iii) tiene un perfil farmacocinético favorable, adecuado para su implementación en la clínica; iv) razonablemente no ejerce una respuesta inmune en humanos. Para cumplir con todas las consideraciones anteriores, los inventores convirtieron el anticuerpo murino DN30, que bloquea la activación de Met mediante un mecanismo de desprendimiento, en una molécula altamente estable, monovalente y totalmente humanizada, formateándola en la forma "One-Arm", denominada en lo sucesivo como "hOA-DN30".
En una realización, la presente invención se refiere a un fragmento de anticuerpo anti-Met que comprende un solo brazo de unión a antígeno y una región Fc, en el que la región Fc comprende un complejo de un primer y un segundo polipéptido de Fc. El fragmento de anticuerpo comprende, preferiblemente consta de:
(i) un primer polipéptido que comprende, preferiblemente que consta de, un dominio variable de cadena ligera (VL) humanizado y un dominio constante de cadena ligera (CL) humano, en el que el dominio variable de cadena ligera (VL) humanizado está fusionado con el dominio constante de cadena ligera (CL) humano en la dirección del extremo terminal N al C, y en el que el dominio variable de cadena ligera (VL) humanizado contiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID No.: 1,2 y 3, y en el que el dominio variable de cadena ligera (VL) humanizado tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 7;
(ii) un segundo polipéptido que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) humanizado, un dominio CH1 constante de cadena pesada humano y el primer polipéptido de Fc, en el que el primer polipéptido de Fc comprende una región bisagra humana, un dominio CH2 constante humano y un dominio CH3 constante humano, en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) humanizado se fusiona con el dominio CH1 constante de cadena pesada humana, que se fusiona con la región bisagra humana, que se fusiona con el dominio CH2 constante humano, que se fusiona con el dominio CH3 constante humano en la dirección del extremo terminal N al C, y en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) humanizado contiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID No.: 4, 5 y 6, y en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) humanizado tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 8;
(iii) un tercer polipéptido que comprende, preferiblemente que consiste en, el segundo polipéptido de Fc humano, en el que el segundo polipéptido de Fc humano comprende, preferiblemente consiste en, una región bisagra humana, un dominio CH2 constante humano y un dominio CH3 constante humano, en el que la región bisagra se fusiona con el dominio constante CH2 humano, que se fusiona con el dominio constante CH3 humano en la dirección del extremo terminal N al C, en el que la región bisagra se trunca en el extremo terminal N.
En una realización, el dominio constante de cadena ligera (CL) humano es un dominio de tipo kappa ligero humano.
En una realización, la región bisagra humana y los dominios constantes humanos CH1, CH2 y CH3 son de una IgG1 humana.
En una realización, los dos polipéptidos de Fc están unidos a través de enlaces disulfuro intermoleculares en la región bisagra.
En una realización, el primer polipéptido de Fc y el segundo polipéptido de Fc se encuentran en una interfaz, y uno entre el primer y el segundo polipéptido de Fc comprende un botón en la interfaz, y el otro entre el primer y el segundo polipéptido de Fc comprende un orificio en la interfaz, en la que el botón se puede colocar en el orificio.
En una realización preferida, uno entre el primer y el segundo polipéptido de Fc comprende un dominio constante CH3 mutado, en el que el dominio constante CH3 mutado porta una mutación de aminoácido en la posición 389, en la que el aminoácido original en la posición 389 ha sido mutado para importar un aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el aminoácido original, para crear un botón en la interfaz entre los polipéptidos de Fc; y en el que el otro entre el primer y el segundo polipéptido de Fc comprende un dominio constante CH3 mutado, en el que el dominio constante CH3 mutado porta tres mutaciones de aminoácidos en las posiciones 389, 391 y 438, en el que los aminoácidos originales han sido mutados para importar aminoácidos que tiene volúmenes de cadena lateral más pequeños que los aminoácidos originales, para crear un agujero en la interfaz entre los polipéptidos de Fc, en el que el botón se puede colocar en el agujero, y en el que la numeración de aminoácidos está de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat (páginas 688-696 en Sequences of proteins of immulogical interest , 5.a ed., Vol. 1, 1991; NIH, Bethesda, MD).
En una realización todavía preferida, los aminoácidos originales en las posiciones 389, 391 y 438 son treonina, leucina y tirosina, respectivamente; y en la que en uno entre el primer y el segundo polipéptido de Fc la treonina en la posición 389 ha sido mutada a triptófano; y en la que en el otro entre el primer y el segundo polipéptido de Fc, la treonina en la posición 389 se ha mutado a serina, la leucina en la posición 391 se ha mutado a alanina y la tirosina en la posición 438 se ha mutado a valina.
En una realización preferida, el dominio constante de cadena ligera (CL) humano tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 9 y el dominio CH1 constante de cadena pesada humana tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 10.
En una realización preferida, el primer polipéptido de Fc humano tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 11, y el segundo polipéptido de Fc humano tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 12.
En una realización, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica el fragmento de anticuerpo anti-Met como se divulgó anteriormente.
En una realización, la presente invención se refiere a una composición que comprende dos o más ácidos nucleicos recombinantes que codifican colectivamente el fragmento de anticuerpo anti-Met como se divulgó anteriormente.
El fragmento de anticuerpo anti-Met divulgado en el presente documento, cuando se une a Met, induce el desprendimiento del dominio extracelular de Met. El fragmento de anticuerpo anti-Met cuando se une a Met no ejerce una actividad agonista hacia Met. El fragmento de anticuerpo anti-Met cuando se une a Met inhibe la fosforilación de Met. El fragmento de anticuerpo anti-Met, cuando se une a Met, bloquea aún más la proliferación e induce citotoxicidad en las células adictas a MET. El fragmento de anticuerpo anti-Met, cuando se une a Met, inhibe aún más la motilidad celular y la invasión celular inducida por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Las propiedades antes mencionadas del fragmento de anticuerpo anti-Met objeto de la presente descripción dotan a dicho fragmento de anticuerpo de actividad antitumoral y/o antimetástasis.
La expresión "brazo de unión a antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una parte componente de un fragmento de anticuerpo de la invención que tiene la capacidad de unirse específicamente a una molécula diana de interés. El brazo de unión al antígeno es un complejo de secuencias de dominio variable (VL y VH), que incluyen las CDR y las regiones marco de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina, y secuencias de dominio constante (CL y CH) de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos recombinantes no naturales que contienen residuos de aminoácidos mínimos derivados de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor (es decir, las regiones determinantes de complementariedad - CDR) se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) que tiene la especificidad, afinidad y propiedades deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana pueden reemplazarse por residuos no humanos correspondientes.
Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donante. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar aún más el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá dos dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los residuos del marco (FR) son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprende una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase13-15. Véanse también los siguientes artículos de revisión y las referencias citadas en ellos: 16-18.
El término "región Fc", como se usa en este documento, generalmente se refiere a un complejo dimérico que comprende las secuencias polipeptídicas del extremo terminal C de una cadena pesada de inmunoglobulina, en la que una secuencia polipeptídica del extremo terminal C es la que se puede obtener mediante la digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fc puede comprender secuencias Fc nativas o variantes. Aunque los límites de la secuencia Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la secuencia de Fc de cadena pesada de IgG1 humana generalmente se define para extenderse desde un residuo de aminoácido incluido entre Asp 234 y Thr 238, hasta el extremo carboxilo de la secuencia de Fc de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat. La secuencia de Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende una región bisagra, dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Por "polipéptido de Fc" en el presente documento se entiende uno de los polipéptidos que forman una región Fc. La región Fc aumenta la estabilidad del fragmento de anticuerpo en comparación con una molécula Fab que comprende un brazo de unión a antígeno.
La "región de bisagra", "secuencia de bisagra" y variaciones de la misma, como se usa en este documento, incluye el significado conocido en la técnica, que se ilustra, por ejemplo, en Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4.a ed., 1999) y en 1920.
La frase "región bisagra truncada", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende partes, pero no la totalidad, de una secuencia de bisagra. La región bisagra truncada es capaz de unirse al "primer" polipéptido de Fc. Si la secuencia de bisagra de tipo silvestre no está presente, la secuencia restante en el "segundo" polipéptido de Fc comprendería un componente que es capaz de unirse al "primer" polipéptido de Fc. Por ejemplo, dicho componente puede ser un residuo modificado o un residuo de cisteína añadido capaz de formar un enlace disulfuro.
Un "botón" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que se proyecta desde la interfaz de un primer polipéptido de Fc y, por lo tanto, se puede colocar en un orificio compensatorio en la interfaz adyacente (es decir, la interfaz de un segundo polipéptido de Fc) para estabilizar el heteromultímero, y por lo tanto favorece la formación del heteromultímero sobre la formación del homomultímero, por ejemplo. El botón puede existir en la interfaz original o puede introducirse sintéticamente (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfaz). Normalmente, un ácido nucleico que codifica la interfaz del primer polipéptido se altera para codificar el botón. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "original" en la interfaz del primer polipéptido se reemplaza con el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "importado" que tiene un volumen de cadena lateral mayor que el residuo de aminoácido original. Se apreciará que puede haber más de un residuo de importación original y correspondiente. El límite superior para el número de residuos originales que se reemplazan es el número total de residuos en la interfaz del primer polipéptido.
Un "agujero" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que está hundida en la interfaz de un segundo polipéptido de Fc y, por lo tanto, acomoda un botón correspondiente en la interfaz adyacente de un primer polipéptido de Fc. El agujero puede existir en la interfaz original o puede introducirse sintéticamente (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfaz). Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfaz del segundo polipéptido se altera para codificar el agujero. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "original" en la interfaz del segundo polipéptido se reemplaza con ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "importado" que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo de aminoácido original. Se apreciará que puede haber más de un residuo de importación original y correspondiente. El límite superior para el número de residuos originales que se reemplazan es el número total de residuos en la interfaz del segundo polipéptido.
El botón es "posicionable" en el orificio, lo que significa que la ubicación espacial del botón y el orificio en la interfaz de un primer polipéptido de Fc y un segundo polipéptido de Fc respectivamente y los tamaños del botón y el orificio son tales que el botón se puede ubicar en el agujero sin perturbar significativamente la asociación normal del primer y segundo polipéptido en la interfaz. Dado que los botones normalmente no se extienden perpendicularmente desde el eje de la interfaz y tienen conformaciones preferidas, la alineación de un botón con un orificio correspondiente se basa en el modelado del par botón/agujero en base a una estructura tridimensional como la que se obtiene por cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear (RMN). Esto se puede lograr utilizando técnicas ampliamente aceptadas en el arte.
La expresión "actividad no agonista" del fragmento de anticuerpo anti-Met como se usa en este documento se refiere al fragmento de anticuerpo anti-Met que no ejerce ninguna actividad que provoque, incluso en parte, respuestas celulares evocadas tras la activación de Met. La actividad no agonista del fragmento de anticuerpo anti-Met se puede medir mediante la evaluación del nivel de fosforilación de Met por técnicas convencionales tales como transferencia Western, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, ELISA, análisis de citofluorimetría o cualquier otro método que incluya el uso de un anticuerpo que reconoce específicamente Met, o los residuos de Met, Tyr1234-1235 si está fosforilado (es decir, el principal sitio de fosforilación de Met21), o los residuos de Met Tyr 1349/1356 si está fosforilado (es decir, el sitio de acoplamiento de Met22) tras la incubación de las células con dicho anticuerpo no agonista. Como alternativa, se puede aplicar la evaluación de las respuestas biológicas celulares tras el tratamiento con anticuerpos en comparación con las respuestas inducidas por el tratamiento con HGF.
La presente invención se refiere además a un producto que comprende, en un solo frasco o en dos frascos, (a) el fragmento de anticuerpo anti-Met como se divulga en este documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y (b) una porción extracelular de Met humana y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que la porción extracelular de Met humana es capaz de unirse al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) de manera estable y contiene al menos una mutación de aminoácido dentro del epítopo reconocido por el fragmento de anticuerpo anti-Met para evitar la unión del fragmento de anticuerpo anti-Met al mismo.
En una realización, la porción extracelular de Met humana contiene dominios SEMA, PSI, IPT-1, IPT-2, IPT-3 e IPT-4.
En una realización preferida, la porción extracelular de Met humana tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 13, en la que al menos uno de los aminoácidos entre la posición 797 y la posición 875 de la SEQ ID No.: 13 está mutada para evitar la unión del fragmento de anticuerpo anti-Met al mismo.
En una realización más preferida, la porción extracelular de Met humana tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 14.
La presente descripción también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica la porción extracelular de Met humana capaz de unirse al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) de manera estable y que contiene al menos una mutación de aminoácido dentro del epítopo reconocido por el fragmento de anticuerpo anti-Met para prevenir la unión del fragmento de anticuerpo anti-Met al mismo, preferiblemente la porción extracelular de Met humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 14.
Como se usa en el presente documento, la expresión "la porción extracelular de Met humana es capaz de unirse a HGF humano de manera estable" significa que la porción extracelular de Met humana se une a HGF con una Kd calculada no superior a 100 nM.
La expresión "la porción extracelular de Met humana contiene al menos una mutación de aminoácido en el epítopo reconocido por el fragmento de anticuerpo anti-Met", como se usa en el presente documento, significa la presencia de una o más mutaciones (es decir, sustituciones y/o eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos) dentro de la porción extracelular de Met, capaz de inducir una modificación dentro de la porción extracelular de Met que previene el acoplamiento de la región anterior por los dominios variables del anticuerpo anti-Met. El experto en la materia en vista de su conocimiento general común (representado, entre otros, por la posibilidad de generar un ADNc que incluya un solo cambio de nucleótido en una secuencia de ADN determinada utilizando cebadores específicos durante la duplicación del ADN; véase Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) no necesita más detalles sobre la realización de una forma mutada de la porción extracelular de Met humana que conserva la capacidad de unirse al HGF humano pero no al fragmento de anticuerpo anti-Met. Por lo tanto, la presente invención no debe interpretarse como que abarca solo la porción extracelular mutada de Met humana como se divulga en este documento (es decir, la SEQ ID No.: 14), ya que el experto en la materia en vista del conocimiento general común puede producir más versiones mutadas de la porción extracelular de Met humana que tiene la SEQ ID No.: 13 que previene la unión del anticuerpo anti-Met a la misma.
Los términos "SEMA", "PSI", "IPT-1", "IPT-2", "IPT-3" e "IPT-4" se refieren a los dominios Met que constituyen la región extracelular de Met. Dichos nombres de dominio pertenecen al conocimiento general común de un experto tal como se representa entre otros por 2324. El dominio SEMA es un módulo de interacción con proteínas en común con semaforinas y plexinas que abarca la región comprendida entre los aminoácidos 25-516 de Met (SEQ ID No.: 13); PSI es un dominio en común con plexinas, semaforinas e integrinas que abarca la región comprendida entre los aminoácidos 519-561 de Met (SEQ ID No.: 13); el dominio IPT -repetido cuatro veces- es una región similar a inmunoglobulina en común con plexinas y factores de transcripción, que abarca la región comprendida entre los aminoácidos 563-934 de MET (SEQ ID No.: 13). En detalle, la repetición IPT 1 cubre las posiciones de aminoácidos 563-656 de la SEQ ID No.: 13, la repetición IPT 2 cubre las posiciones de aminoácidos 657-740 de la SEQ ID No.: 13, la repetición IPT 3 cubre las posiciones de aminoácidos 741-837 de la SEQ ID No.: 13, la repetición IPT 4 cubre las posiciones de aminoácidos 838-934 de la SEQ ID No.: 13.
La presente invención se refiere además al uso terapéutico del fragmento de anticuerpo anti-Met como se describe en el presente documento, opcionalmente en combinación con una porción extracelular de Met humana como se divulga en el presente documento, para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un tumor y/o metástasis en el que el paciente porta alteraciones genéticas del gen MET.
La presente invención se refiere además al uso terapéutico del fragmento de anticuerpo anti-Met como se divulga en este documento en combinación con una porción extracelular de Met humana como se divulga en este documento para su uso en el tratamiento de un paciente que padece un tumor y/o metástasis, en el que el paciente porta un gen MET de tipo silvestre.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar un tumor y/o metástasis en un sujeto, comprendiendo dicho método la administración al sujeto de una cantidad eficaz del fragmento de anticuerpo anti-Met, opcionalmente en combinación con una porción extracelular de Met humana, mediante el cual se trata dicha condición.
En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa Met, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con el fragmento de anticuerpo anti-Met divulgado en el presente documento, opcionalmente en combinación con una porción extracelular de Met humana de la invención, provocando así una inhibición del crecimiento de dicha célula.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente a un mamífero que tiene un tumor canceroso y/o metástasis, comprendiendo dicho método la administración a dicho mamífero de una cantidad eficaz del fragmento de anticuerpo anti-Met divulgado en el presente documento, opcionalmente en combinación con una porción extracelular de Met humana, tratando de ese modo eficazmente a dicho mamífero.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar un trastorno de proliferación celular, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que necesita dicho tratamiento de una cantidad eficaz del fragmento de anticuerpo anti-Met objeto de la presente divulgación, opcionalmente en combinación con una porción extracelular de Met humana, tratando o previniendo de este modo de forma eficaz dicho trastorno de proliferación celular.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente un tumor y/o metástasis en un mamífero, en el que el crecimiento de dicho tumor depende al menos en parte de un efecto potenciador del crecimiento del sistema Met/HGF, como consecuencia de ya sea un aumento en la proliferación celular, una protección contra la apoptosis, o ambos. Dicho método comprende poner en contacto una célula tumoral con una cantidad eficaz del fragmento de anticuerpo anti-Met, opcionalmente en combinación con una cantidad eficaz de una porción extracelular de Met humana de la invención, tratando así eficazmente dicho tumor y/o metástasis.
El tumor, que se puede tratar eficazmente con el anticuerpo anti-Met, opcionalmente en combinación con una porción extracelular de Met humana, se selecciona de mama, colorrectal, pulmón, colon, páncreas, próstata, ovario, cuello uterino, sistema nervioso central, riñón, células hepatocelular, vejiga, de vesícula, gástrico, células tumorales de cabeza y cuello, carcinoma papilar (p. ej., la glándula tiroides), melanoma, linfoma, mieloma, glioma/glioblastoma (p. ej., astrocitoma anaplásico, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma anaplásico, oligodendroastrocitoma anaplásico), células leucémicas, sarcoma, rabdomiosarcoma o un tumor de un cáncer de origen primario desconocido (CUP).
En una realización, una célula que es un objetivo terapéutico en un método de la invención es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica. En una realización, una célula que es el objetivo de un método de la invención es una célula displásica. En otra realización más, una célula que es el objetivo de un método de la invención es una célula metastásica. En una realización adicional, una célula que se direcciona en un método de la invención es una célula que expresa Met que pertenece al microentorno que sustenta el tumor y/o la metástasis.
Los presentes inventores demostraron que la estructura One-Arm, obtenida mediante mutaciones puntuales seleccionadas del dominio CH3 y que da como resultado una heterodimerización de Fc eficiente, origina un anticuerpo en una forma monovalente.
La monovalencia es esencial para evitar la eventual actividad agonista del DN30 debido a la estructura nativa bivalente del anticuerpo.
De manera inesperada y sorprendente, los presentes inventores descubrieron que uno del formato One-Arm humanizado del DN30 (es decir, hOA-DN30-cl03E08) muestra fuertes propiedades inhibidoras in vitro e in vivo.
hOA-DN30-cl03E08 in vitro muestra una actividad superior en comparación con la forma quimérica correspondiente (denominada a continuación como "chOA-DN30") y con todos los demás derivados de One-Arm humanizados divulgados en este documento (denominados "anticuerpos hOA-DN30") (véase la sección Material y métodos para obtener una descripción detallada de todos los anticuerpos One-Arm derivados de DN30). Inesperadamente, hOA-DN30-cl03E08 se une a Met con una mayor afinidad en comparación con los otros anticuerpos OA-DN30 probados, ya sean quiméricos o humanos. De forma impredecible, los inventores descubrieron que la respuesta de desprendimiento se potencia al aumentar la afinidad del anticuerpo DN30 por Met. En consecuencia, la inhibición de la activación de Met, medida como cantidad de receptores de Met fosforilados, fue más fuerte. Estas actividades se traducen en una represión de las respuestas biológicas mediadas por Met. El deterioro del crecimiento de células tumorales adictas a MET se produce a dosis muy bajas; la IC50 de hOA-DN30-cl03E08 es la más baja entre todas las medidas para los anticuerpos OA-DN30 incluidos en el análisis, ya sea quimérico o humano. Una mejor inhibición del crecimiento de las células tumorales puede deberse a un bloqueo más extenso de la proliferación celular y/o a un incremento más pronunciado de la citotoxicidad.
El hOA-DN30-cl03E08 también muestra un potencial terapéutico mejorado in vivo. Esto es de esperar si la comparación se hace con MvDN30, una molécula que, por su bajo peso molecular, está sujeta a una alta eliminación renal. Las malas propiedades farmacocinéticas de MvDN30 afectan considerablemente el desempeño de la molécula en los modelos experimentales in vivo.
Se puede considerar que alcanzar un peso molecular superior al punto de corte de la eliminación renal es en si misma suficiente para obtener la mejor respuesta terapéutica, pero este no es el caso. De hecho, los resultados obtenidos con los derivados DCD-1 y DCD-2 del mAb DN30 - moléculas recombinantes de mayor tamaño con respecto a MvDN30 - muestran claramente que el perfil farmacocinético solo mejora parcialmente y la respuesta terapéutica se limita a una reducción de la velocidad de crecimiento del tumor8.
La actividad superior de hOA-DN30-cl03E08 puede deberse en parte a la presencia de la región Fc que genera diferencias en la distribución de tejido/órgano del anticuerpo debido a la unión al receptor de Fc, proporcionando así un perfil farmacocinético muy favorable.
Los aspectos positivos relacionados con la estabilidad in vivo debida a la presencia de la región Fc ya se ha discutido y divulgado durante la aplicación de Onartuzumab. Este es un anticuerpo anti-Met diseñado en el formato One-Arm25. Sin embargo, este anticuerpo se produce en bacterias, por lo que no está glicosilado. En consecuencia, carece de la capacidad de activar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por el contrario, hOA-DN30-cl03E08 se produce en células de mamífero y, por lo tanto, debe considerarse completamente capaz de provocar funciones efectoras de Fc.
hOA-DN30-cl03E08 es diferente de Onartuzumab también por el mecanismo de acción. Mientras que el primer anticuerpo induce el desprendimiento del receptor de Met, eliminando Met de la superficie celular y absorbiendo el HGF en el entorno extracelular, el segundo compite con el HGF por la unión de Met. Como resultado, hOA-DN30 inhibe a Met independientemente de los mecanismos que sustentan la activación aberrante del oncorreceptor, mientras que Onartuzumab es efectivo solo en los casos de activación dependiente de ligando.
La presencia de la región Fc no puede ser responsable de la notable mejora de la respuesta terapéutica in vivo obtenida por el hOA-DN30-cl03E08, ya que este dominio está presente en todos los anticuerpos One-Arm humanizados y quiméricos probados. Lo que no comparten los anticuerpos One-Arm humanizados y quiméricos son las regiones variables, en las que se encuentra el sitio de unión de los anticuerpos. En particular, las CDR de DN30, idénticas en todos los derivados, se insertan en las regiones marco. Estas partes del anticuerpo, incluso si no están directamente involucradas en la formación del bolsillo de unión, incluyen aminoácidos particulares, llamados residuos de Vernier26, que podría influir en la conformación final de las estructuras de CDR y por tanto podría determinar la afinidad final del anticuerpo por el antígeno. Las CDR de DN30 en combinación con las secuencias marco, es decir, las secuencias de los dominios variables pesado y ligero, del cl03E08 originan un anticuerpo anti-Met con una afinidad más fuerte, probablemente porque la combinación de secuencias genera un bolsillo de unión que se ajusta mejor al epítopo correspondiente en el receptor de Met. Una interacción más robusta entre el anticuerpo y Met implementa aún más el desprendimiento del receptor y el consiguiente deterioro de las respuestas biológicas mediadas por Met. Esto, conjugado con la estabilidad mejorada en plasma debido al formato One-Arm, da lugar a un anticuerpo, es decir, el cl03E08, con una actividad superior inesperada contra los cánceres adictos/impulsados por MET.
Los datos reportados en Basilico et al. 27 muestran que el direccionamiento concomitante de HGF y Met da lugar a una mayor solidez terapéutica en el tratamiento de tumores y/o metástasis. Los datos experimentales observados en este documento muestran inesperadamente que la inhibición del eje MET/HGF por medio de hOA-DN30 en combinación con DecoyMetK842E es superior al obtenido con la aplicación de MvDN30 en combinación con DecoyMetK842E. De hecho, comparando los resultados obtenidos en el ensayo de invasión (en este documento reportado en la Fig. 9) con los publicados en Basilico et al. 27, hOA-DN30 anula la invasión de células cancerosas impulsada por HGF, mientras que todavía está presente una actividad residual si MvDN30 es parte de la combinación.
Las células cancerosas sin alteraciones genéticas de MET explotan el programa 'fisiológico' desencadenado por el oncogén MET como un 'expediente' para impulsar el fenotipo maligno y desencadenar el fenotipo metastásico invasivo en respuesta a condiciones de estrés como la hipoxia, la radiación ionizante o la quimioterapia. La 'conveniencia' requiere la estimulación de MET de tipo silvestre por su HGF ligando. Los datos proporcionados en este documento muestran que, en condiciones de 'conveniencia' de MET, una intervención concomitante que afecta a ambos lados del eje m Et /HGF da como resultado una actividad inhibitoria mejorada. El hOA-DN30-cl03E08 induce la eliminación física de MET de la superficie celular mediante el "desprendimiento" del ectodominio. Este último se libera en el entorno extracelular y actúa como 'señuelo' para el HGF. El suministro exógeno de DecoyMet recombinante refuerza la actividad secuestrante de HGF del DecoyMet endógeno generado por hOA-DN30-cl03E08. La combinación de hOA-DN30-cl03E08 y DecoyMetK842E actúa simultáneamente sobre las células cancerosas que expresan Met y sobre el estroma tumoral secretor de HGF. Esto permite un bloqueo óptimo de la señalización de Met impulsada por HGF y, por lo tanto, representa una opción terapéutica confiable para una gran cohorte de pacientes portadores de tumores que expresan MET de tipo silvestre que dependen de MET para mantener el fenotipo invasivo/metastásico.
Las proteínas divulgadas en el presente documento (es decir, el anticuerpo anti-Met humanizado y la porción extracelular de Met humana) pueden fabricarse fácilmente en forma de proteínas o en forma de moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas por un experto en vista del conocimiento general común del campo relacionado con la tecnología del ADN recombinante, como se representa entre otros por Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Por ejemplo, se puede seguir el siguiente procedimiento estándar: (i) síntesis de las secuencias de ADNc correspondientes, (ii) inserción de los ADNc en un plásmido adecuado para la expresión en mamíferos mediante métodos convencionales de ADN recombinante, (iii) cotransfección transitoria o estable con los plásmidos mencionados anteriormente de una línea celular de mamífero, (iv) recolección del sobrenadante del cultivo, (v) purificación por cromatografía de afinidad de la proteína recombinante.
Las composiciones terapéuticas que comprenden los ingredientes activos de la presente invención, es decir, el fragmento de anticuerpo anti-Met humanizado solo o en combinación con una porción extracelular de Met humana, se pueden preparar con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables (Remington’s Pharmaceitical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed., 1980), en forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones secas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones; antioxidantes; conservantes; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos; agentes quelantes; azúcares; contraiones formadores de sal; complejos metálicos y/o tensioactivos no iónicos. Las formulaciones también pueden contener otro u otros compuestos activos según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afecten adversamente la actividad terapéutica de hOA-DN30 solo o en combinación con la porción extracelular de Met humana. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.
El o los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas por medio de técnicas divulgadas, entre otros, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen los ingredientes activos de la invención, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcápsulas.
El o los ingredientes activos de la invención se pueden usar solos o en combinación con otro anticuerpo, inhibidores de tirosina quinasa de molécula pequeña, agentes quimioterapéuticos (incluidos cócteles de agentes quimioterapéuticos), otros agente o agentes citotóxicos, agente o agentes antiangiogénicos, citocinas y/o agente o agentes inhibidores del crecimiento. Dichas terapias combinadas mencionadas anteriormente incluyen la administración combinada (donde los dos o más agentes están incluidos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, en cuyo caso, la administración de hOA-DN30 puede ocurrir antes y/o después de la administración de la terapia o terapias complementarias.
El o los ingredientes activos de la presente invención (y el o los agentes terapéuticos adjuntos se administran por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, administración intralesional. El o los ingredientes activos de la presente invención se pueden administrar adecuadamente mediante infusión de pulsos, particularmente con dosis decrecientes de los ingredientes activos. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, p. ej., mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.
El o los ingredientes activos de la invención se formularán, dosificarán y administrarán de manera consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los médicos. El o los ingredientes activos de la invención no necesitan ser formulados, pero pueden ser opcionalmente, formulados con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad del o los ingredientes activos de la invención presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosis y con las mismas vías de administración que las usadas anteriormente o aproximadamente del 1 al 99% de las dosis empleadas hasta ahora.
Para el tratamiento de enfermedades, la dosificación adecuada del ingrediente o ingredientes activos de la invención (cuando se usan solos o en combinación con otros agentes, como agentes quimioterapéuticos) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y curso de la enfermedad, si los principios activos se administran con fines preventivos o terapéuticos, la historia clínica del paciente y la respuesta a los principios activos de la invención se toman debidamente en consideración, y a criterio del médico tratante.
hOA-DN30 se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, alrededor de 1 mg/kg a 30 mg/kg de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede oscilar entre 1 pg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que ocurre la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de dosificación del fragmento de anticuerpo estaría en el rango de alrededor de 0.05 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Tales dosis pueden administrarse de forma intermitente, p. ej., cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga inicial más alta, seguida de una o más dosis más bajas. Un ejemplo de régimen de dosificación comprende la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Con respecto a la terapia de combinación, la porción extracelular de Met humana se administra preferiblemente al mismo tiempo que hOA-DN30 y se dosifica en proporción a hOA-DN30, preferiblemente, pero sin limitarse a, la relación molar 1:1 de hOA-DN30:DecoyMetK842E, según el tipo y la gravedad de la enfermedad.
Resultados
Generación de los formatos One-Arm quimérico y humanizado del anticuerpo DN30.
A través de técnicas clásicas de biología molecular, los presentes inventores sustituyeron los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera de mAb DN30 con dominios constantes derivados de inmunoglobulinas humanas. El dominio constante de cadena ligera se sustituyó por el dominio tipo kappa humano, (el más representado en los anticuerpos humanos naturales), mientras que los dominios constantes de cadena pesada se sustituyeron por los dominios homólogos derivados de la IgG1 humana (la que puede inducir ADCC/CDC).
Fair Journey Biologics ha llevado a cabo la humanización del anticuerpo de ratón DN30 utilizando un enfoque de biblioteca de presentación de fagos. Comenzaron con la identificación de residuos de FR (marco) que se desvían y el análisis de la línea germinal V humana más cercana, elegida de líneas germinales con combinación de plegamiento canónico idéntico para CDR1-CDR2, utilizando las herramientas y bases de datos disponibles: abYsistool del Dr. Andrew Martin en UCL plus, http://www.bioc.uzh.ch/plueckthun/antibody/ y http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/. Tras la generación de bibliotecas de presentación de fagos, en las que se ha realizado la aleatorización de la región VH y VL, se han realizado cuatro rondas de selección de presentación de fagos impulsadas por afinidad. Al final del proceso, se seleccionaron las variantes humanizadas de DN30 con mayor identidad y homología humana. Las regiones variables se unieron a través de técnicas clásicas de biología molecular a las secuencias de dominio constante derivadas de inmunoglobulinas humanas, es decir, dominios constantes de cadena ligera kappa humana y cadena pesada de IgG1.
Para formatear los anticuerpos quiméricos y humanizados en la forma de cadena sencilla One-Arm, se han insertado modificaciones específicas de aminoácidos en la región CH3 para producir la estructura ‘botón en el agujero’ 2829; un dominio CH3 porta la mutación del botón: 389T ^W , el otro dominio CH3 porta las mutaciones de agujero: 389T^-S; 391L ^A ; 438Y ^V . Los ADNc que codifican las cadenas ligeras quiméricas o humanizadas, las cadenas pesadas quiméricas o humanizadas (mutadas en el dominio CH3) y el dominio Fc humano (mutado en el dominio CH3) se clonaron en plásmidos de expresión y luego se expresaron en células eucariotas. Los anticuerpos One-Arm ensamblados se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivos celulares mediante cromatografía de afinidad y filtración en gel. La Figura 1 muestra un dibujo esquemático de los derivados de DN30 y la separación por SDS-Page en condiciones reductoras y no reductoras de las moléculas OA-DN30 recombinantes purificadas.
Los anticuerpos One-Arm DN30 reconocen Met con alta afinidad.
Las formas One-Arm purificadas de los anticuerpos DN30 quiméricos o humanizados se analizaron para determinar la unión al receptor de Met mediante un ensayo ELISA. Como referencia, el Fab quimérico DN30 (MvDN30)12 se incluyó en el análisis. El ensayo se ensambló para incluir Met-Fc en fase sólida y los derivados de DN30 en fase líquida. La unión se reveló utilizando anticuerpos anti-cadena k humana. Los datos mostraron que tanto los anticuerpos quiméricos como los humanizados se unen a Met, mostrando el hOA-DN30-cl03E08 la mayor afinidad (Fig. 2A).
Análisis de reactividad cruzada de hOA-DN30-cl03E08 con receptores Met no humanos.
Los presentes inventores analizaron la reactividad cruzada de especies de hOA-DN30-cl03E08 realizando: (i) un ensayo ELISA con dominios extracelulares de Met purificados de origen humano, de ratón, de rata y de mono (Fig. 2B); (ii) un análisis de citometría de flujo de la unión del anticuerpo a la superficie de Met expresada por células de origen humano, de ratón, de rata, de perro y de mono (Fig. 2C). Los resultados de los experimentos mostraron que hOA-DN30-cl03E08 se une a Met de origen humano, de rata, de perro y de mono, mientras que la interacción con Met de ratón fue muy débil.
Los anticuerpos One-Arm DN30 no ejercen propiedades agonistas.
Los presentes inventores probaron si los nuevos derivados de DN30 podían mostrar actividad agonista de Met en un ensayo altamente sensible, el ensayo de dispersión. Las células de carcinoma pancreático humano HPAF-II, que representan un sistema estándar para determinar la motilidad celular en respuesta a la estimulación con HGF, se estimularon durante 24 horas con concentraciones crecientes del anticuerpo. Como control positivo, se incluyeron en el ensayo HGF y mAb DN30 bivalente. Mientras que las células estimuladas con los controles positivos estaban claramente dispersas, el fenotipo de las células tratadas con todos los derivados monovalentes de DN30 (anticuerpos MvDN30, chOA-DN30 y hOA-DN30) era indistinguible de las no tratadas (Fig. 3).
hOA-DN30 induce de forma potente el "desprendimiento" de Met.
Los presentes inventores también investigaron si hOA-DN30 mantenía la capacidad de promover el desprendimiento de receptores y la subregulación. Las células A549 se incubaron con concentraciones crecientes de anticuerpos chOA-DN30 y hOA-DN30. Como referencia, se incluyó MvDN30 en el ensayo. Después de 48 horas, los ectodominios de Met liberados en el medio acondicionado se puntuaron mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la porción extracelular de Met. Los niveles celulares totales de Met también se determinaron en lisados celulares usando el mismo anticuerpo. Este análisis reveló que todos los anticuerpos OA-DN30 indujeron el desprendimiento de Met, lo que dio como resultado la liberación de ectodominios solubles de Met en el espacio extracelular y la eliminación física de Met de la superficie celular (Fig. 4). Inesperadamente, la actividad de hOA-DN30-cl03E08 fue superior en comparación con todos los demás derivados de DN30 incluidos en la prueba.
hOA-DN30-cl03E08 inhibe fuertemente la fosforilación de Met.
Los presentes inventores investigaron si los anticuerpos chOA-DN30 y hOA-DN30 inhibían la fosforilación de Met en células derivadas de carcinomas humanos, es decir, GTL-16. Estas células tienen una Met activa constitutiva como consecuencia de la sobreexpresión del receptor debido a la amplificación del gen. La activación de Met se determinó mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfoMet. Como se muestra en la Fig. 5, todas las moléculas deterioraron la fosforilación/activación de Met, con una modalidad de respuesta a la dosis. hOA-DN30-cl03E08, que induce el deterioro más fuerte de los niveles de Met en las células, fue el derivado de DN30 más activo.
hOA-DN30-cl03E08 inhibe poderosamente el crecimiento celular adicto a MET.
El crecimiento celular (viabilidad) puede verse afectado por un inhibidor de Met solo en células adictas a MET, que dependen de la señalización de Met para la proliferación/supervivencia. Para probar la actividad de los derivados de DN30, se incubaron células GTL-16 de crecimiento exponencial (células de carcinoma gástrico humano adictas a MET) con concentraciones crecientes de anticuerpos chOA-DN30 o hOA-DN30. MvDN30 se incluyó en el ensayo como control positivo. Después de 72 horas, se determinó la viabilidad celular utilizando un ensayo de ATP basado en luminiscencia. Todos los derivados de DN30 inhibieron el crecimiento de células adictas a MET de manera dependiente de la dosis (Fig. 6). hOA-DN30-cl03E08 mostró la mayor inhibición, siendo la IC502.5 veces menor en comparación con MvDN30, 5.4 veces menor en comparación con chOA-DN30 y al menos 5.2 veces menor en comparación con los otros anticuerpos hOA-DN30 (véase la tabla en la Fig. 6).
hOA-DN30-cl03E08 es muy eficaz para bloquear la proliferación e inducir citotoxicidad en células adictas a MET.
Para analizar más a fondo los mecanismos que subrayan la inhibición del crecimiento celular adicto a MET ejercido por los derivados de DN30, los inventores evaluaron la proliferación celular y la citotoxicidad celular, comparando MvDN30, chOA-DN30 y hOA-DN30-cl03E08. Las células GTL-16 se incubaron con una dosis única (1 pM) de los derivados de DN30 y la proliferación celular se evaluó midiendo la incorporación de EdU, un análogo de timidina, por las células durante la fase S del ciclo celular, con el ensayo de citometría de flujo ClickIT Edu. MvDN30 se incluyó en el ensayo como control positivo. Este análisis reveló que los derivados de DN30 afectaron la proliferación, ya que el porcentaje de células tratadas en fase S se redujo drásticamente en comparación con el control. En particular, la molécula más efectiva fue hOA-DN30-cl03E08, donde solo el 4.9 % de las células seguían proliferando (84.2 % de reducción frente al control). Las células proliferantes en la población tratada con chOA-DN30 fueron el 14.97% (52% de reducción frente al control) (Fig. 7A).
Para probar si los derivados de DN30 inducían solo un bloqueo de la proliferación o si también causaban citotoxicidad, se incubaron células GTL-16 adictas a MET en crecimiento exponencial con concentraciones crecientes de chOA- DN30 o hOA-DN30-cl03E08. MvDN30 se incluyó en el ensayo como control positivo. Después de 72 horas, se determinó la citotoxicidad agregando colorante CellToxMC Green a las células y midiendo la fluorescencia de las células que es directamente proporcional al número de células muertas. Todos los derivados de DN30 indujeron citotoxicidad en células GTL-16 de manera dependiente de la dosis (Fig. 7B). hOA-DN30-cl03E08 mostró la mayor inducción, siendo la EC50 1.3 y 6.1 veces menor en comparación con MvDN30 y chOA-DN30, respectivamente.
hOA-DN30-cl03E08 inhibe la motilidad celular inducida por HGF, solo y en combinación con DecoyMet.
Los presentes inventores probaron la capacidad de hOA-DN30-cl03E08 para inhibir la motilidad celular dependiente de HGF de células de carcinoma pancreático humano HPAF-II. Las células se incubaron o no con HGF y se trataron con dosis crecientes de hOA-DN30-cl03E08. Después de 24 horas, las colonias de células se tiñeron y analizaron. En este ensayo, hOA-DN30-cl03E08 redujo fuertemente la dispersión celular dependiente de HGF (Fig. 8).
En el sistema celular anterior se ha reportado que se puede lograr una inhibición más efectiva de la respuesta biológica inducida por HGF bloqueando concomitantemente el ligando (HGF) y el receptor (Met)27. Los presentes inventores probaron por lo tanto si hOA-DN30-cl03E08 en combinación con DecoyMetK842E indujo una mayor respuesta terapéutica. DecoyMetK842E es un receptor soluble recombinante que abarca toda la región extracelular de Met que porta una mutación que suprime la interacción con DN30; se une al HGF con alta afinidad e inhibe las actividades biológicas impulsadas por ligandos esponjando y neutralizando el HGF y formando heterodímeros con receptores de Met intactos todavía presentes en la superficie celular, haciéndolos inactivos. Con una cantidad equimolar de las dos moléculas combinadas, la dosis efectiva que revirtió por completo el fenotipo disperso fue 4 veces menor que la dosis de hOA-DN30-cl03E08 sola capaz de provocar un fenotipo celular similar (Fig. 8).
hOA-DN30-cl03E08 inhibe la invasión celular inducida por HGF, solo y en combinación con DecoyMet.
Los presentes inventores probaron la capacidad de hOA-DN30-cl03E08 para inhibir la invasión de células dependiente de HGF de células HPAF-II. Las células se sembraron en las cámaras superiores de filtros Transwell recubiertos con matrigel en medio sin suero con hOA-DN30-cl03E08 (0.5 pM) solo o en combinación con DecoyMetK842E (1 pM). Las cámaras inferiores se llenaron con medio que contenía HGF (25 ng/ml). Después de 24 horas, las células que migraban en la parte inferior del filtro se evaluaron mediante tinción y observación al microscopio. En este ensayo, hOA-DN30-cl03E08 redujo fuertemente la invasión celular dependiente de HGF; la respuesta celular fue casi abolida por la combinación hOA-DN30-cl03E08 y DecoyMetK842E (Figura 9).
hOA-DN30-cl03E08 revoca la inducción de interferón-gamma de la expresión de PD-L1.
El ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1) y el receptor de muerte celular programada 1 (PD-1) son moléculas moduladoras clave, conocidas como puntos de control inmunitarios, que desempeñan un papel central en la interfaz entre la respuesta inmunitaria y el microambiente tumoral30. Pueden afectar significativamente la capacidad del sistema inmunitario para controlar la progresión del tumor. La expresión de PD-L1 por las células tumorales es inducible y el interferón gamma (IFNgamma) es el inductor más potente31.
Los presentes inventores analizaron si la inhibición de Met por parte de hOA-DN30-cl03E08 podría modular la ruta de IFNgamma y, en consecuencia, la regulación de PD-L1 (Fig. 10). Las células GTL-16 adictas a MET se trataron con IFNgamma durante 48 horas y se analizaron para determinar la expresión de PD-L1 inducible por IFNgamma. En una condición no estimulada, PD-L1 no fue detectable, mientras que tras la exposición a IFNgamma, se sobrerreguló constantemente. El tratamiento con hOA-DN30-C103E08 durante 48 horas perjudicó significativamente la regulación positiva de PD-L1 inducida por IFNgamma.
hOA-DN30-cl03E08 muestra un perfil farmacocinético favorable in vivo.
Los presentes inventores estudiaron las propiedades farmacocinéticas de hOA-DN30-Cl03E08, en comparación con MvDN30 y el mAb quimérico DN30. Se administró una dosis única de las moléculas mencionadas anteriormente mediante inyección intravenosa a ratones inmunodeficientes. Se recogió sangre periférica de los ratones tratados en diferentes momentos después del parto. Las concentraciones circulantes de las moléculas estudiadas se determinaron mediante ELISA realizado en muestras de suero. Los niveles circulantes de hOA-DN30-cl03E08 fueron comparables a los medidos para el mAb, y siempre superiores a MvDN30 (Fig. 11).
hOA-DN30-cl03E08 afecta el crecimiento de tumores adictos a MET in vivo
La capacidad de los derivados de DN30 para inhibir el crecimiento tumoral in vivo fue probado en un modelo adicto a MET. Se inyectaron de forma subcutánea 1x106 células GTL-16 en el flanco de ratones NOD-SCID. Después de 1 semana, los ratones con tumores palpables se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos de tratamiento homogéneos: Vehículo (n=6), MvDN30 (n=6), hOA-DN30-cl03E08 (n=5), chOA-DN30 (n=5). Los anticuerpos se administraron mediante inyección intravenosa dos veces por semana a razón de 30 mg/kg; para administrar la misma cantidad de moléculas, MvDN30 se administró siguiendo el mismo programa a razón de 15 mg/kg, ya que el peso molecular de los anticuerpos One-Arm es el doble con respecto a MvDN30 (es decir, alrededor de 100 KDa para formatos OA-DN30 y alrededor de 50 KDa para MvDN30). MvDN30 no fue efectivo, como se esperaba debido a su corta vida media plasmática, mientras que ambos derivados de One-Arm inhibieron el crecimiento tumoral (Fig. 12A) (P = 0.0007 y 0.05 para hOA-DN30-cl03E08 y para chOA-DN30 respectivamente frente al vehículo). Sorprendentemente, hOA-DN30-cl03E08 fue mucho más eficaz que chOA-DN30: las masas tratadas fueron, en el caso de hOA-DN30-c103E08, un 87.8 % y, en el caso de chOA-DN30, un 52.9 % más pequeñas que los controles (Fig. 12B) (P = 0.009 para hOA-DN30-cl03E08 frente a chOA-DN30). Los presentes inventores analizaron además la actividad inhibidora de hOA-DN30-cl03E08 realizando un experimento de respuesta a la dosis. Manteniendo las condiciones experimentales descritas anteriormente, los ratones se dividieron aleatoriamente en 5 grupos homogéneos y se trataron mediante inyección iv tres veces/semana con diferentes dosis de hOA-DN30-cl03E08. Las dosis de 10, 30 y 60 mg/kg fueron muy eficaces para bloquear el crecimiento tumoral, mientras que el tratamiento con 3.3 mg/kg no fue estadísticamente diferente de los controles (Fig. 13).
Material y métodos
Cultivo de células
Se obtuvieron células de adenocarcinoma de pulmón humano A549, células de adenocarcinoma de páncreas humano HPAF-II, mioblastos de músculo de ratón C2C12, mioblastos cardíacos de rata H9C2 (2-1), células de riñón de perro MDCK y células de riñón de mono Cos-7 de los ATCC/LGC Standards S.r.l. (Sesto San Giovanni, Italia); la línea celular GTL-16 es un clon derivado de células MKN-45 (células de carcinoma gástrico humano disponibles a través de la Japanese Collection of Research Bioresources, Osaka, Japón) que difiere en el número de copias del gen MET de la línea celular parental32. La línea celular GTL-16 está disponible a través del Advanced Biotechnology Center (ABC), Interlab Cell Line Collection (ICLC) Italia, con número de acceso ICLC PD 08003. EBC-1, cáncer de pulmón humano, proviene de la Japanese Collection of Research Bioresources). El hibridoma DN30 está disponible a través del Advanced Biotechnology Center (ABC), Interlab Cell Line Collection (ICLC) Italia, con número de registro ICLC PD 05006.
Todas las células se cultivaron como sugirió el proveedor. Todos los cultivos celulares se analizaron para la contaminación por micoplasma.
Generación de la forma One-Arm quimérica y humana del anticuerpo DN30.
Para el anticuerpo DN30 quimérico: mediante síntesis génica se han generado tres ADNc separados que codifican respectivamente la cadena ligera (VL-CL), la cadena pesada (VH-CH1-cH2-CH3) y el dominio Fc (CH2-CH3). Las regiones variables (secuencias de ratón) procedían del anticuerpo DN30 (SEQ ID: 15 y 16); regiones constantes de origen humano derivadas de inmunoglobulinas humanas, en particular, la cadena ligera incluye el dominio constante de tipo kappa humano (GenBank ID de secuencia n°: DI165992), y la cadena pesada incluye los dominios constantes de IgG1 humana (GenBank ID de secuencia n°: DJ392898). En el extremo terminal C de las secuencias codificantes, la cadena pesada incluye una ETIQUETA de His (SEQ ID: 38, 39) y el Fc incluye un ETIQUETA de estreptavidina (SEQ ID: 40, 41).
Para el anticuerpo DN30 humanizado: Fair Journey Biologics ha llevado a cabo la humanización mediante la detección de la línea germinal del anticuerpo de ratón DN30 utilizando un enfoque de biblioteca de presentación de fagos. Comenzaron con la identificación de residuos de FR (marco) que se desvían y el análisis de la línea germinal V humana más cercana, elegida de líneas germinales con combinación de plegamiento canónico idéntica para CDR1-CDR2, utilizando las herramientas y bases de datos disponibles: abYsistool del Dr. Andrew Martin en UCL más, http://www.bioc.uzh.ch/plueckthun/antibody/ y http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/. Tras la generación de bibliotecas de presentación de fagos, en las que se ha realizado la aleatorización de la región VH y VL, se han realizado cuatro rondas de selección de presentación de fagos impulsadas por afinidad. Al final del proceso, se seleccionaron cinco variantes humanizadas de DN30 diferentes con la mayor identidad y homología humana, a saber, los clones 03E08, 03G05, 03F04, 03H08 y 04H08. Las regiones variables se unieron a través de técnicas clásicas de biología molecular a las secuencias de dominio constante derivadas de inmunoglobulinas humanas, es decir, dominios constantes de cadena ligera kappa humana y cadena pesada de IgG1.
Para formatear los anticuerpos quiméricos y humanizados en la forma One-Arm (anticuerpos chOA-DN30 y hOA-DN30): se han insertado modificaciones específicas de aminoácidos en la región CH3 para producir la estructura de 'botón en agujero'2829. Se demostró que 'botones en agujeros' es una estrategia de diseño efectiva para mejorar la formación de heterodímeros sobre homodímeros. La estrategia se basa en la remodelación de la interfaz de dominio, introduciendo mutaciones estéricamente complementarias en la región CH3 del fragmento Fc del anticuerpo, el sitio más extenso de interacción proteína-proteína entre las cadenas H de las moléculas de IgG humana. Una cadena, el polipéptido VH-CH1-CH2-CH3, incluye el 389T ^ W (mutación de botón), en la que un aminoácido pequeño se sustituye por uno más grande; por el contrario, la otra cadena, el polipéptido CH2-CH3, incluye la sustitución de residuos grandes por otros más pequeños: 389 T ^S ; 391L ^A ; 438Y ^ V (mutaciones de agujero). Estas mutaciones se seleccionaron tras la optimización mediante tecnología de visualización de fagos33, en la que los residuos 389, 391 y 438, que están cerca del botón en el dominio asociado CH3, se sustituyeron aleatoriamente. La modificación de botones en agujeros facilita el ensamblaje de un heterodímero, incluidas las tres cadenas de aminoácidos diferentes (VL-CL VH-CH1-CH2-CH3 CH2-CH3) en lugar de homodímeros, es decir, el anticuerpo genuino (VL-CL VH-CH1-CH2-CH3)2 o solo el dominio Fc (CH2-CH3)2.
En el extremo terminal N, el polipéptido CH2-CH3 incluye una secuencia correspondiente a una región bisagra humana truncada. La eliminación es necesaria para excluir la cisteína en la posición 233 de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat que está involucrado en la formación de un enlace disulfuro entre cadenas con la cisteína en la posición de extremo terminal C del dominio constante de cadena ligera (CL) . Además, para permitir que el polipéptido CH2-CH3 entre en la vía RER/Golgi de síntesis de proteínas, como lo hacen las cadenas ligeras (VL-CL) y pesadas (VH-CH1-CH2-CH3) del anticuerpo, en el extremo terminal N, antes de la región bisagra truncada, se incluye una secuencia correspondiente al péptido señal de la cadena pesada DN30.
El fragmento de anticuerpo anti-Met quimérico (chOA-DN30) divulgado en este documento está hecho de:
(i) un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 15; (ii) un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 16; (iii) un dominio constante de cadena ligera (CL) humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 9;
(iv) un dominio CH1 constante de cadena pesada humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 10;
(v) un primer polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 11; y (vi) un segundo polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 12. El fragmento de anticuerpo anti-Met humanizado (hOA-DN30-cl03E08) objeto de la presente divulgación está compuesto por:
(i) un dominio variable de cadena ligera humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 7;
(ii) un dominio variable de cadena pesada humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 8;
(iii) un dominio constante de cadena ligera (CL) humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 9;
(iv) un dominio CH1 constante de cadena pesada humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 10;
(v) un primer polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 11; y (vi) un segundo polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 12. El fragmento de anticuerpo anti-Met humanizado (hOA-DN30-cl03G05) está hecho de:
(i) un dominio variable de cadena ligera humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 17;
(ii) un dominio variable de cadena pesada humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 18;
(iii) un dominio constante de cadena ligera (CL) humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 9;
(iv) un dominio CH1 constante de cadena pesada humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 10;
(v) un primer polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 11; y (vi) un segundo polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 12. El fragmento de anticuerpo anti-Met humanizado (hOA-DN30-cl03F04) está hecho de:
(i) un dominio variable de cadena ligera humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 19;
(ii) un dominio variable de cadena pesada humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 20;
(iii) un dominio constante de cadena ligera (CL) humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 9;
(iv) un dominio CH1 constante de cadena pesada humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 10;
(v) un primer polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 11; y (vi) un segundo polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 12. El fragmento de anticuerpo anti-Met humanizado (hOA-DN30-cl03H08) objeto de la presente divulgación está compuesto por:
(i) un dominio variable de cadena ligera humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 21;
(ii) un dominio variable de cadena pesada humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 22;
(iii) un dominio constante de cadena ligera (CL) humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 9;
(iv) un dominio CH1 constante de cadena pesada humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 10;
(v) un primer polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 11; y (vi) un segundo polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 12. El fragmento de anticuerpo anti-Met humanizado (hOA-DN30-cl04H08) objeto de la presente divulgación está compuesto por:
(i) un dominio variable de cadena ligera humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 23;
(ii) un dominio variable de cadena pesada humanizado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 24;
(iii) un dominio constante de cadena ligera (CL) humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 9;
(iv) un dominio CH1 constante de cadena pesada humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 10;
(v) un primer polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 11; y (vi) un segundo polipéptido de Fc humano que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No.: 12.
Expresión y purificación de anticuerpos One-Arm quiméricos y humanos
Los ADNc que codifican las cadenas ligeras descritas anteriormente (secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No.: 25, 26, 27, 28, 29 para las cadenas ligeras humanizadas y la SEQ ID No.: 30 para la cadena ligera quimérica), cadenas pesadas (secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID No.: 31, 32, 33, 34, 35 para la cadena pesada humanizada y la SEQ ID No.: 36 para la cadena pesada quimérica) y Fc (secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No.: 37) se clonaron en vectores de expresión comúnmente disponibles (p. ej., plásmidos pcDNA3.1, n° de catálogo V79020 Invitrogen Corporation, Camarillo, CA) y se usaron para transfectar células ExpiCHO-S (n° de catálogo: A29127, ThermoFisher Scientific). La proporción de vectores se optimizó para maximizar la producción del heterodímero de 97.5 kDa deseado (el OA-Ab) y para minimizar la presencia de cualquier homodímero bivalente de 150 kDa (Mab genuino). La relación óptima fue: 1: 1: 2 respectivamente para cadena ligera, cadena pesada de tamaño completo (vector de "botón") y Fc (vector de "agujero"). Esta condición resultó en la menor cantidad de homodímero presente, siendo el heterodímero aproximadamente el 85% de la proteína total. La expresión transitoria fue impulsada por el reactivo de transfección de CHO ExpiFectamineMC (n° de catálogo A29130, ThermoFisher Scientific). Los sobrenadantes se recogieron después de 9 días de producción. Los anticuerpos OA-DN30 se purificaron con una columna Hitrap MabSelect Sure (n° de catálogo GE29-0491-04, Sigma Aldrich) en un sistema de cromatografía ÁKTA Pure 25. Los anticuerpos OA-DN30 se eluyeron posteriormente utilizando tampón de citrato 0.1 M a pH 3.0. Las fracciones eludidas se recogieron y neutralizaron con Tris-HCl 1 M, pH 9.0 (en una proporción de 0.15 ml por ml de proteína eludida). Los anticuerpos OA-DN30 se purificaron adicionalmente en una columna de exclusión por tamaño Superdex 20026/600 equilibrada con PBS 1x (pH 7.4) (n° de catálogo GE28-9893-36, Sigma Aldrich) en un sistema de cromatografía líquida GE AKTA Prime (GE Healthcare Life Sciences), donde las fracciones que contenían el OA Ab se separaron de las fracciones homodiméricas (mAb o Fc). Las fracciones de SEC preparativa que contenían los anticuerpos OA-DN30 se agruparon y analizaron mediante SDS-PAGE para determinar la pureza. Las fracciones agrupadas también se analizaron para determinar los niveles de endotoxinas. Las fracciones agrupadas finales de las purificaciones SEC preparativa, que muestran la ausencia de cualquier homodímero bivalente y la presencia de una pequeña cantidad (< 5 %) de una banda más pequeña de =70 kDa, que corresponde al homodímero Botón-Botón Fc.
Generación, expresión y purificación del ectodominio Met mutado
La secuencia de ADNc del ectodominio MET humano (DecoyMet) que porta una sustitución de un solo aminoácido se generó sintéticamente a partir de la secuencia del ectodominio Met humano como se divulga en GenBank con el número de depósito X54559, y utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II (n° de catálogo 200524 Agilent Technologies, Santa Clara, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. El procedimiento requiere el diseño de oligonucleótidos sentido y antisentido, que incluyan la mutación puntual deseada. Se han empleado los siguientes oligos:
- mutación K842E:
sentido 5'-gtacataatcctgtgtttgagccttttgaaaagccagtg-3' (SEQ ID No.: 42);
antisentido 5'-cactggcttttcaaaaggctcaaacacaggattatgtac-3' (SEQ ID No.: 43).
El receptor soluble modificado se produjo mediante transfección transitoria de células HEK-293T con plásmidos pcDNA3.1 (n° de catálogo V79020 Invitrogen Corporation, Camarillo, CA) que expresan ADNc que codifica el mutante DecoyMet. Las células transfectadas se privaron de alimento durante tres días y se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular que contenían el receptor soluble. La purificación de las proteínas recombinantes se realizó mediante cromatografía de afinidad utilizando columnas HisTrap HP (n° de catálogo 17524701 GE Healthcare, Friburgo, Alemania) según las instrucciones del fabricante. La producción y purificación de proteínas a gran escala estuvo a cargo de U-Protein Express BV (Utrecht, Los Países Bajos).
La variante del DecoyMet humano (DecoyMETK842E) tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID No.: 14.
Análisis de las proteínas purificadas por SDS-PAGE azul de Coomassie
Los anticuerpos OA-DN30 purificados (1 pg) se separaron en un gel de gradiente de acrilamida al 4-12 % mediante SDS-PAGE en presencia o en ausencia de p-mercapto etanol siguiendo métodos estándar. Se incluyeron en el análisis, marcadores de peso molecular (n° de catálogo 1610374, Bio-Rad). Los polipéptidos separados en el gel se revelaron mediante el reactivo Gel Code Blue Stain (n° de catálogo 24590, ThermoFisher Scientific).
Ensayos de unión de ELISA
Para el análisis de la interacción entre Met y los derivados de DN30, se inmovilizaron en placas ELISA quimeras Met-Fc purificadas (n° de catálogo 358-MT-100 R&D Systems, 100 ng/pocillo). Después de la saturación con BSA al 0.5 % incubado durante 1 hora a 37 °C, se añadieron concentraciones crecientes de los anticuerpos (anticuerpos MvDN30, chOA-DN30 o hOA-DN30, 0 - 500 nM preparados en PBS-BSA al 0.5 % - Tween al 0.1 %) en fase líquida. La unión se reveló usando anticuerpo anti-cadena k humana conjugado con HRP (n° de catálogo A7164, Sigma-Aldrich) seguido de incubación con TMB (n° de catálogo T8665, Sigma Aldrich). El ensayo colorimétrico se cuantificó mediante el lector de placas de etiquetas múltiples VICTOR-X4 (Perkin Elmer Instruments INC., Whaltman, MA). Los datos se analizaron y ajustaron utilizando el software Prism (GraphPad).
Para el análisis de unión de ELISA de hOA-DN30-cl03E08 (fase líquida) a la quimera Met-Fc (fase sólida) derivada de diferentes especies, originadas en Met humana (n° de catálogo 358-MT-100 R&D Systems), murina (n° de catálogo 50622-M02H, Sino Biological), rata (n° de catálogo 80004-R02H, Sino Biological) y mono (n° de catálogo 90304-C02H, Sino Biological) se incluyeron en el ensayo. El procedimiento fue el mismo que el descrito anteriormente.
Análisis de unión por citometría de flujo
Para la unión de hOA-DN30-cl03E08 a Met expresada en la superficie de las células, se trataron 2 x 105 células EBC-1, C2C12, H9C2, MDCK o Cos-7 con reactivo de disociación celular StemProMC AccutaseMC (n° de catálogo A1110501, ThermoFisher Scientific) recogido e incubado durante 1 hora a 4 °C en PBS-FCS al 2 %. La tinción de anticuerpos se realizó incubando las células durante 30 min a 4 °C con 10 pg/ml de hOA-DN30-cl03E08 en PBS-BSA al 2 %. Después de 6 lavados con PBS-BSA al 2 %, las células se incubaron con IgG-APC antihumana (n° de catálogo 109-606-088 Jackson Immuno Research) diluidas 1:100 durante 30 min a 4 °C y luego se lavaron para eliminar los anticuerpos no unidos. Las células se tiñeron conjuntamente con DAPI (3 pl de solución de trabajo de 1 pg/ml, Sigma-Aldrich, n° de catálogo 10236276001) durante 5 min a 4 °C y se analizó la expresión de Met mediante el software Summit 4.3 (Dako). La señal de fluorescencia derivada del control de isotipo (IgG APC antihumano) se fijó como un umbral (0<MFI<101). Las células se consideraron positivas para la expresión de Met si la intensidad de fluorescencia media (MFI) era superior al umbral (MFI>101).
Análisis del desprendimiento de Met
Las monocapas de A549 subconfluentes se lavaron dos veces con PBS y luego se incubaron en medio sin suero con concentraciones crecientes (37, 111,333, 1000 nM) de derivados de DN-30. Después de 48 horas, se recogió el medio acondicionado y las células se lisaron con tampón Laemmli. Los niveles de proteína Met se determinaron en 15 gg de proteínas celulares totales mediante transferencia Western utilizando anticuerpos anti-Met (3D4, n° de catálogo 08­ 1366 Invitrogen Corporation); como control de carga, los filtros también se probaron con anticuerpos anti-vinculina (clon hVIN-1, n° de catálogo V9131 Sigma Life Science). Los niveles del ectodominio de Met se determinaron en 15 gl de sobrenadante de cultivo celular mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-HGFR/Met humano dirigido contra el dominio extracelular del receptor (n° de catálogo AF276, R&D Systems). Se utilizaron anticuerpos secundarios anti-IgG 1 de ratón conjugados con HRP (n° de catálogo JI115035003, Jackson ImmunoResearch) y el sistema ECL (n° de catálogo W1015, Promega) para la detección de proteínas. Las bandas de transferencia Western se cuantificaron utilizando el software ImageJ.
Ensayos de fosforilación de MET
Se incubaron células GTL-16 privadas de suero durante 24 h con derivados de DN30 (1000 o 250 nM). Los lisados celulares totales se analizaron mediante transferencia Western utilizando los siguientes anticuerpos primarios: anti-Met fosfo-Tyr1234/1235 (D26, n° de catálogo 3077 Cell Signalling Technology); anti-Met (3D4, n° de catálogo 08-1366 Invitrogen Corporation); y antivinculina (clon hVIN-1, n° de catálogo V9131 Sigma Life Science). Se usaron anticuerpos secundarios anti-IgG1 de ratón y anti-IgG de conejo (n° de catálogo JI111035003) conjugados con HRP y el sistema ECL para la detección de proteínas. Las bandas de transferencia Western se cuantificaron utilizando el software ImageJ.
Ensayos biológicos in vitro
Para ensayos de dispersión de células se sembraron células HPAF-II (8000/pocillo) en placas de 96 pocillos en medio de cultivo completo. Para analizar la actividad agonística de los anticuerpos, después de 24 horas, se añadieron HGF (8 ng/ml, control positivo, n° de catálogo 294-HG-025, R&D Systems) o los anticuerpos (anticuerpos mAb DN30, MvDN30, chOA-DN30, hOA-DN30, todos a la concentración de 200 nM, al medio de cultivo. Para analizar la actividad inhibidora, fueron agregadas concentraciones crecientes (0-4 gM) de hOA-DN30-cl03E08, solo o en combinación 1:1 con DecoyMetK842E. Después de un tiempo adicional de 24 horas, las células se estimularon con 6.25 ng/ml de HGF durante 24 horas. A continuación, las células se fijaron con glutaraldehído al 11 % (n° de catálogo 340855 Sigma-Aldrich), se tiñeron con cristal violeta al 0.1 % (n° de catálogo C3886 Sigma-Aldrich) y se analizaron mediante observación microscópica (Microscopio Leica DM2000). Las imágenes fueron capturadas con la cámara digital a color QICAM Fast 1394 (QImaging).
Para ensayos de invasión celular, se suspendieron células HPAF-II (1.5 x 105/pocillo) en medio de cultivo sin suero en presencia de hOA-DN30-cl03E08 0.5 gM solo o en combinación con DecoyMetK842E 1 gM, y se sembró en el compartimento superior de las cámaras Transwell recubiertas previamente con 30 gg/pocillo de Matrigel Matrix (n° de catálogo 354234, Corning Inc.). Se añadió medio de cultivo suplementado con FBS al 2% y 6.25 ng/ml de HGF al compartimento inferior de las cámaras. Después de 24 horas, las células de la parte superior de los filtros Transwell se retiraron mecánicamente, mientras que las células que migraron a través de la membrana se fijaron con glutaraldehído al 11 % y se tiñeron con cristal violeta al 0.1 %. La invasión celular se cuantificó con el software Image-J.
Para ensayo de vitalidad, se sembraron 2000 células/pocillo de células GTL-16 en una placa de 96 pocillos en medio de cultivo FBS al 10%. Después de 24 horas, se reemplazó el medio por uno nuevo con FBS al 10 % más las moléculas a ensayar (concentraciones crecientes - de 0 a 10 gM). La viabilidad celular se evaluó después de 72 horas usando CellTiter-Glo (n° de catálogo G7573 Promega Corp), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La quimioluminiscencia se detectó con VICTOR X4.
Para ensayo de proliferación, se sembraron en placa 350000 células GTL-16 en placas de 6 pocillos en medio FCS al 10%. Después de 24 horas, las células se trataron con una concentración fija (1 gM) de derivados de DN30 durante 48 horas más. Luego, se añadió EdU 10 gM (n° de catálogo A10044, ThermoFisher) al medio de cultivo durante 2 horas más. El % de células en fase S se determinó mediante análisis de citofluorimetría siguiendo el procedimiento del ensayo de citometría de flujo Click-iTMC EdU Alexa FluorMC 488 (n° de catálogo C10425, ThermoFisher).
Para ensayo de citotoxicidad, se sembraron 2000 células GTL-16 en placas de 96 pocillos en medio FCS al 10%. Después de 24 horas, las células se trataron con concentraciones crecientes de los derivados de DN30 durante 48 horas más. La citotoxicidad celular fue evaluada por el ensayo de citotoxicidad Cell-ToxMC Green (n° de catálogo G8741, Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Análisis de expresión de PD-L1
Las células GT1-16 subconfluentes se trataron con 50 ng/ml de IFNy-1 b (Miltenyi Biotec, n° de catálogo 130-096-484) durante 48 horas (reemplazadas cada 24 horas) en combinación con hOA-DN30-cl03E08250 nM. A continuación, las monocapas se lisaron en tampón Laemmli y 45 gg de proteínas totales se sometieron a gel SDS-PAGE al 8 %. Las proteínas se transfirieron del gel a membranas de nitrocelulosa iBIot Transfer (Life Technologies, n° de catálogo IB23001) siguiendo métodos estándar. La expresión de PD-L1 se detectó mediante el anticuerpo anti-PD-L1 (E1L3N, n° de catálogo 13684, Cell Signaling Technology). Los niveles de P-Met se verificaron mediante anticuerpos anti-MET fosfo-Tyr1234/1235 (D26). Como control de carga, los filtros se probaron con anti-GAPDH (D4C6R, n° de catálogo 97166 Cell Signaling Technology). Para la detección de proteínas se utilizaron IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP secundaria (n° de catálogo JI115035003) o IgG anti-conejo (n° de catálogo JI111035144) (ambos de Jackson ImmunoResearch) y el sistema ECL.
Experimentos in vivo
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Ético para la experimentación con animales de la Fondazione Piemontese per la Ricerca sul Cancro y por el Ministerio de Salud italiano. Se adquirieron ratones NOD-SCID de Charles River (Calco, Italia).
Para análisis farmacocinético se les inyectó por vía intravenosa a los ratones NOD-SCID una dosis única (100 gg) de hOA-DN30-cl03E08. La sangre periférica se recogió en diferentes momentos: 10', 30', 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 72 h, 120 h. Las concentraciones en suero de las moléculas terapéuticas se midieron por ELISA como se describió anteriormente en la sección de ensayo de unión, interpolando los valores de absorbancia de las muestras en la parte lineal de una curva estándar obtenida por diluciones en serie de las diferentes moléculas purificadas. Cada punto de tiempo fue el valor promedio de 4 ratones.
Para el análisis de crecimiento tumoral Se inocularon 1x106 células GTL-16 en el flanco de ratones NOD-SCID. El crecimiento tumoral se controló dos veces por semana mediante medición con calibrador. El volumen del tumor se calculó usando la fórmula: V= 4/3 n (x/2)(y/2)(z/2), donde x, y y z son la altura, el ancho y la profundidad de la masa tumoral. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 70-100 mm3 (aproximadamente una semana después de la inyección de células) los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos homogéneos. En un caso se generaron 4 grupos (PBS-vehículo, MvDN30, chOA-DN30, hOA-DN30-cl03E08; todos los anticuerpos 30 mg/kg, 2 veces por semana); en el otro caso, se generaron 5 grupos (PBS-vehículo, hOA-DN30-cl03E08 60 mg/kg, 30 mg/kg, 10 mg/kg, 3.3 mg/kg; todas las dosis 3 veces por semana). Las moléculas se administraron mediante inyección intravenosa. Al final de los experimentos (15 o 17 días de tratamiento) se sacrificaron los ratones, se extirparon los tumores y se pesaron.
Análisis estadístico
El promedio y la desviación estándar (SD) se calcularon utilizando el software Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Corporation). Para calcular los valores de Kd , los datos de los ensayos ELISA se analizaron y ajustaron de acuerdo con la regresión no lineal, la curva de hipérbola de unión de un sitio, utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software). Para calcular los valores de IC50 y EC50 , los datos se analizaron y ajustaron de acuerdo con la regresión no lineal, la curva de respuesta a la dosis sigmoidal, utilizando el software GraphPad Prism. Todos los experimentos se repitieron al menos dos veces. Las figuras muestran un experimento representativo.
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un fragmento de anticuerpo anti-Met que comprende un solo brazo de unión a antígeno y una región Fc en el que la región Fc comprende un complejo de un primer y un segundo polipéptido de Fc, en el que el fragmento de anticuerpo comprende:
(i) un primer polipéptido que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) humanizado y un dominio constante de cadena ligera (CL) humano, en el que el dominio VL humanizado se fusiona con el dominio CL humano en la dirección del extremo terminal N al C, y en el que el dominio VL humanizado contiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen secuencias de aminoácidos como se expone en las SEQ ID No.: 1,2 y 3, y en el que el dominio VL humanizado tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID No: 7;
(ii) un segundo polipéptido que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) humanizado, un dominio CH1 constante de cadena pesada humano y el primer polipéptido de Fc, en el que el primer polipéptido de Fc comprende una región bisagra, un dominio CH2 constante humano y un dominio constante CH3 humano, en el que el dominio VH humanizado se fusiona con el dominio CH1 humano, que se fusiona con la región bisagra humana, que se fusiona con el dominio CH2 humano, que se fusiona con el dominio CH3 humano en la dirección del extremo terminal N al C, y en el que el dominio VH humanizado contiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen secuencias de aminoácidos como se expone en las SEQ ID No.: 4, 5 y 6, y en el que el dominio VH humanizado tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ No.: 8; y
(iii) un tercer polipéptido que comprende el segundo polipéptido de Fc humano, en el que el segundo polipéptido de Fc humano comprende una región bisagra humana, un dominio CH2 constante humano y un dominio CH3 constante humano, en el que la región bisagra humana está fusionada con el dominio CH2 que está fusionado con el dominio CH3 humano en la dirección del extremo terminal N al C, en el que la región bisagra humana está truncada en el extremo terminal N.
2. El fragmento de anticuerpo anti-Met según la reivindicación 1, en el que el dominio CL humano es un dominio de tipo kappa ligero humano.
3. El fragmento de anticuerpo anti-Met según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la región bisagra humana y los dominios constantes humanos CH1, CH2 y CH3 son de una IgG1 humana.
4. El fragmento de anticuerpo anti-Met según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los dos polipéptidos de Fc están unidos a través de enlaces disulfuro intermoleculares en la región bisagra.
5. El fragmento de anticuerpo anti-Met según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer polipéptido de Fc y el segundo polipéptido de Fc se encuentran en una interfaz, y uno entre el primer y el segundo polipéptido de Fc comprende un botón en la interfaz, y el otro entre el primer y el segundo polipéptido de Fc comprende un orificio en la interfaz, en el que el botón se puede colocar en el orificio.
6. El fragmento de anticuerpo anti-Met según la reivindicación 5, en el que uno entre el primer y el segundo polipéptido de Fc comprende un dominio constante CH3 mutado, en el que el dominio constante CH3 mutado porta una mutación de aminoácido en la posición 389, en el que el aminoácido original en la posición 389 ha sido mutado para importar un aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral mayor que el aminoácido original; y en el que el otro entre el primer y el segundo polipéptido de Fc comprende un dominio constante CH3 mutado, en el que el dominio constante CH3 mutado porta tres mutaciones de aminoácidos en las posiciones 389, 391 y 438, en el que los aminoácidos originales han sido mutados para importar aminoácidos que tiene un volumen de cadenas laterales más pequeño que los aminoácidos originales, en el que la numeración de los aminoácidos está de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat.
7. El fragmento de anticuerpo anti-Met según la reivindicación 6, en el que los aminoácidos originales en las posiciones 389, 391 y 438 son treonina, leucina y tirosina, respectivamente; y en el que en uno entre el primer y el segundo polipéptido de Fc la treonina en la posición 389 se ha mutado a triptófano; y en el que en el otro entre el primer y el segundo polipéptido de Fc, la treonina en la posición 389 se ha mutado a serina, la leucina en la posición 391 se ha mutado a alanina y la tirosina en la posición 438 se ha mutado a valina.
8. El fragmento anti-Met según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio CL humano tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID No.: 9 y el dominio CH1 humano tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ No.: 10.
9. El fragmento de anticuerpo anti-Met según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el primer polipéptido de Fc humano tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No.: 11, y el segundo polipéptido de Fc humano tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID No.: 12.
10. El fragmento de anticuerpo anti-Met según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el fragmento de anticuerpo anti-Met, cuando se une a Met, induce el desprendimiento de un dominio extracelular de Met.
11. Ácido nucleico aislado que codifica el fragmento de anticuerpo anti-Met de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Una composición que comprende dos o más ácidos nucleicos recombinantes que codifican colectivamente el fragmento de anticuerpo anti-Met de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13. Un producto que comprende, en un solo frasco o en dos frascos, (a) un fragmento de anticuerpo anti-Met según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y (b) una porción extracelular de Met humana y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que la porción extracelular de Met humana es capaz de unirse al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) de manera estable y contiene al menos una mutación de aminoácido dentro del epítopo reconocido por el fragmento de anticuerpo anti-Met para evitar la unión del fragmento de anticuerpo anti-Met al mismo.
14. El producto según la reivindicación 13, en el que la porción extracelular de Met humana contiene los dominios SEMA, PSI, IPT-1, IPT-2, IPT-3 e IPT-4.
15. El producto según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que la porción extracelular de Met humana tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No.: 13, en el que al menos uno de los aminoácidos entre la posición 797 y la posición 875 de la SEQ ID No.: 13 está mutado para evitar la unión del fragmento de anticuerpo anti-Met al mismo.
16. El producto según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la porción extracelular de Met humana tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID No.: 14.
17. Un fragmento de anticuerpo anti-Met según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o producto según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 para su uso en el tratamiento de un tumor y/o metástasis en un paciente portador de alteraciones genéticas del gen MET.
18. Un producto según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 para uso en el tratamiento de un tumor y/o metástasis en un paciente portador de un gen MET de tipo silvestre.
19. Proceso para la fabricación de un fragmento de anticuerpo anti-Met según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, proceso que comprende las siguientes etapas: (i) síntesis de secuencias de ADNc del primer, segundo y tercer polipéptidos que constituyen el fragmento de anticuerpo anti-Met, (ii) inserción de las tres secuencias de ADNc en uno o más plásmidos, en el que el o los plásmidos son adecuados para la expresión en una línea celular de mamífero, (iii) cotransfección transitoria o estable de una línea celular de mamífero con el o los plásmidos, (iv) recolección del sobrenadante del cultivo, (v) purificación por cromatografía de afinidad del fragmento de anticuerpo anti-Met.
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