CN114230633B - 具有修复氧化应激损伤的多肽及其制备方法与应用 - Google Patents

具有修复氧化应激损伤的多肽及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有修复氧化应激损伤的多肽及其制备方法与应用；该多肽的氨基酸序列为：Pal‑Gly‑His‑Lys‑Thr‑His‑Arg‑Ser；其制备步骤包括：Fmoc‑Ser(tBu)‑树脂的制备、肽树脂A的制备、Fmoc‑Lys(Cbz)‑树脂的制备、肽树脂B的制备、多肽片段b的制备、肽树脂C的制备以及多肽的制备；制得的多肽具有优良的抗氧化性、对皮肤损伤具有较好的修复作用，愈合率较高；同时具有优良的抗皮肤光老化性以及吸湿保湿性能，以延缓衰老，且对皮肤无刺激，其在化妆品护肤与美容领域具有广泛的应用。

Description

具有修复氧化应激损伤的多肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种多肽，具体涉及一种具有修复氧化应激损伤的多肽及其制备方法与应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，人们对皮肤护理的注重、对产品的要求越来越高，同时不良的生活习惯、恶劣环境、紫外线、各种精神压力、不正确的皮肤护理等众多因素对皮肤的伤害导致越来越多的人皮肤干裂、水肿、起痘、皮肤失去弹性，被粗糙老化等皮肤状况紊乱的综合问题困扰。
皮肤衰老是皮肤组织内一系列复杂的生物学过程，是所有内源性生理因素和外源性环境因素共同作用的结果。遗传基因密码程序性调控和相关老化基因及蛋白表达水平影响，以及长期大剂量的日光紫外线照射等均是导致皮肤自然衰老和光老化的重要因素之一。然而无论是何种因素主导的皮肤老化以及损伤，不仅可影响正常皮肤组织结构和生理功能，而且也可直接影响皮肤外层的外观和容貌。
多肽是一种涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，具有降血压、降胆固醇、抗氧化和抗衰老等生理功能；基因重组多肽因子和化学合成多肽等成功在皮肤美容化妆品中应用以来，人们对活性生物多肽与面部美容的研究与应用日益深入，并不断研究和证实了它们在皮肤美容护肤保健和皮肤抗衰老等方面所具有的积极作用和重要应用价值。目前，有许多研究者都在致力于活性生物多肽在皮肤美容和抗衰老、皮肤损伤修复产品中的研究和开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有优良抗氧化性、对皮肤损伤具有较好的修复作用、愈合率较高、同时具有优良的抗皮肤光老化性以及吸湿保湿性能、可延缓衰老且对皮肤无刺激的活性多肽，其在化妆品护肤与美容领域具有广泛的应用。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种多肽，其中，多肽的氨基酸序列为：Pal-Gly-His-Lys-Thr-His-Arg-Ser。
本发明制得一种氨基酸序列为Pal-Gly-His-Lys-Thr-His-Arg-Ser的多肽，其具有优良的抗氧化作用，即具有较高的DPPH自由基清除率，对于皮肤损伤具有较好的修复作用，愈合率较高；另一方面，该多肽能够减缓光老化引起的皮肤增厚，同时能够减缓胶原蛋白的流失，具有优良的抗皮肤光老化、延缓衰老的作用；同时，该多肽具有优良的吸湿保湿作用，且对皮肤无刺激作用，能够更好地应用于化妆品护肤与美容领域。
优选地，在本发明的一些实施例中，多肽由Pal-Gly-His-Lys偶联Thr-His-Arg-Ser。
本发明还公开了多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1：以Rink树脂或王树脂为载体合成Fmoc-Ser(tBu)-树脂，然后采用固相合成法将其从C端到N端逐一偶联氨基酸，然后脱除Fmoc保护基，得到肽树脂A：H-Thr(tBu)-His-Arg(pbf)-Ser(tBu)-树脂；
S2：以Rink树脂为载体合成Fmoc-Lys-树脂，然后采用固相合成法将其从C端到N端逐一偶联氨基酸，得到肽树脂B：Fmoc-Pal-Gly-His-Lys-树脂；
S3：将肽树脂B裂解，得到多肽片段b：Fmoc-Pal-Gly-His-Lys-OH；
S4：将多肽片段b与肽树脂A进行固相偶联，脱除Fmoc保护基，得到肽树脂C： H-Pal-Gly-His-Lys-Thr(tBu)-His-Arg(pbf)-Ser(tBu)-树脂；
S5：将肽树脂C裂解、纯化，得到多肽：H-Pal-Gly-His-Lys-Thr-His-Arg-Ser-OH。
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤S1中，王树脂的替代度为0.473~0.629mmol/g；步骤S2中，Rink树脂的替代度为0.55~0.75 mmol/g。
优选地，在本发明的一些实施例中，固相合成法中使用偶联剂发生偶联反应；偶联剂组成为HOBt；HBTU；HOAt和DIPCDI；HBTU和DIPEA；HOBt和DIPCDI；PyBOP和DIPCDI中的一种。
更优选地，在本发明的一些实施例中，偶联剂为HOBt和DIPCDI的组合物；HOBt和DIPCDI的摩尔比为1.0~1.5∶1.2~1.8。
优选地，在本发明的一些实施例中，裂解用裂解液为TFE和DCM的混合物；混合物中TFE和DCM的体积比为1~3∶97~99。
优选地，在本发明的一些实施例中，多肽的纯化步骤采用反向高效液相色谱法，以C18、C8中的一种为固定相；以0.22~0.25%三氟乙酸/乙腈为流动相。
本发明还公开了一种多肽在制备修复氧化应激损伤产品中的用途。
本发明还公开了一种多肽混合物，包括多肽和甜菊醇-19-葡萄糖苷。
本发明还公开了甜菊醇-19-葡萄糖苷在提高多肽抗皮肤光老化中的用途；在使用时，所用甜菊醇-19-葡萄糖苷与多肽的重量比为0.05~0.15∶1，即得到多肽混合物；甜菊醇-19-葡萄糖苷的添加，进一步提高了多肽的抗氧化作用以及对皮肤损伤的修复作用，同时提高了多肽的抗皮肤光老化作用，延缓皮肤衰老。
本发明还公开了一种具有修复氧化应激损伤的化妆品组合物，其包括：
按重量份计，多肽为2.5~5.5份、六肽-9为1~3份、棕榈酰三肽-5为1~2份、棕榈酰四肽-7为2~5份、甘油为5~10份、聚山梨醇酯-20为2~4份、甘油辛酸酯为0.2~0.5份、甘露糖醇为1~3份、水为60-75份。
本发明制得一种氨基酸序列为Pal-Gly-His-Lys-Thr-His-Arg-Ser的多肽，因而具有如下有益效果：该多肽具有优良的抗氧化作用，即具有较高的DPPH自由基清除率，对于皮肤损伤具有较好的修复作用，愈合率较高；另一方面，该多肽能够减缓光老化引起的皮肤增厚，同时能够减缓胶原蛋白的流失，具有优良的抗皮肤光老化、延缓衰老的作用；同时，该多肽具有优良的吸湿保湿作用，且对皮肤无刺激作用，能够更好地应用于化妆品护肤与美容领域。因此，本发明是一种具有优良抗氧化性、对皮肤损伤具有较好的修复作用、愈合率较高、同时具有优良的抗皮肤光老化性以及吸湿保湿性能、可延缓衰老且对皮肤无刺激的活性多肽，其在化妆品护肤与美容领域具有广泛的应用。
附图说明
图1为实施例1中多肽的红外光谱图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的多肽进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
需要说明地是，在本发明的实施例中，所用带保护基的氨基酸购自上海吉至生化科技有限公司；其他试剂无特殊说明，均为市场购买。
需要说明地是，在本发明的一些实施例中，Fmoc-Ser(tBu)-树脂的制备方法为：
将110~155份替代度为1.0~1.5 mmol/g的王树脂加入固相反应柱中，DMF洗涤3~5次，用DMF溶胀树脂30~40 min，然后称取40~50份Fmoc-Ser(tBu)-OH、20~30份HBTU、20~30份DIPEA、2.5~4.5份DMAP溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1~3），然后加入固相反应柱中，在室温下反应2.5~3.5 h，反应结束后用DMF洗涤3~5次，DCM洗涤2~4次；再加入160~185份吡啶和220~240份乙酸酐混合封闭树脂4~5 h，用DMF洗涤3~5次，DCM洗涤2~4次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Ser(tBu)-树脂，测定树脂的替代度为0.473~0.629 mmol/g。
需要说明地是，在本发明的一些实施例中，肽树脂A的制备方法为：
将150-180份替代度为0.473~0.629 mmol/g的Fmoc-Ser(tBu)-树脂加入至固相反应柱中，用DMF洗涤3~5次，用DMF溶胀树脂30~40 min，再加入15~25%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；抽干反应液，用DMF洗涤树脂3~5次；将135~145份Fmoc-Arg(pbf)-OH、40~45份HOBt和DIPCDI的组合物（HOBt和DIPCDI的摩尔比为1.0~1.5∶1.2~1.8）溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1~3）；在30~35℃下反应2.5~3.5 h，反应结束后用DMF洗涤3~5次，DCM洗涤2~4次，加入15~25%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；重复相应氨基酸偶联步骤，按肽顺序结构依次偶联80~100份Fmoc-His(Boc)-OH、60~80份Fmoc-Thr(tBu)-OH，脱除Fmoc保护基，得到肽树脂A。
需要说明地是，在本发明的一些实施例中，Fmoc-Lys(Cbz)-树脂的制备方法为：
按重量份计，将100~150份替代度为1.35~1.85 mmol/g的Rink树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤3~5次，用DMF溶胀树脂30~40 min，然后称取65~80份Fmoc-Lys(Cbz)-OH、25~35份HOBt、2.2~3.2份DMAP溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1~3），然后加入固相反应柱中，在室温下反应2.5~3.5 h，反应结束后用DMF洗涤3~5次，DCM洗涤2~4次；再加入160~185份吡啶和220~240份乙酸酐混合封闭树脂4~5 h，用DMF洗涤3~5次，DCM洗涤2~4次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Cbz)-树脂，测定树脂的替代度为0.55~0.75 mmol/g。
需要说明地是，在本发明的一些实施例中，肽树脂B的制备方法为：
将140-160份替代度为0.55~0.75 mmol/g的Fmoc-Lys(Cbz)-树脂加入至固相反应柱中，用DMF洗涤3~5次，用DMF溶胀树脂30~40 min，再加入15~25%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；抽干反应液，用DMF洗涤树脂3~5次；将120~130份Fmoc-His(Boc)-OH、40~45份HOBt溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1~3）；在30~35℃下反应2.5~3.5 h，反应结束后用DMF洗涤3~5次，DCM洗涤2~4次，加入15~25%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；重复相应氨基酸偶联步骤，按肽顺序结构依次偶联100~120份Fmoc-Gly(Bzl)-OH、150~170份Fmoc-D-3-Pal-OH，得到肽树脂B。
需要说明地是，在本发明的一些实施例中，多肽片段b的制备方法为：
将115~125份肽树脂B置于裂解反应瓶中，将肽树脂B与裂解液按比例10~15 mL∶1~2 g加入裂解液，其中裂解液为TFE和DCM混合物（TFE∶DCM[v/v]=1~3∶97~99），在室温下搅拌反应2~3 h；反应结束后，将反应物过滤，收集滤液，用DCM洗涤树脂3~5次，合并滤液后减压浓缩，然后加入乙酸乙酯将析出物溶解完全，将溶解液加入8~12倍体积冰冻无水乙醚沉淀，并用无水乙醚洗涤3~5次，真空干燥，得到多肽片段b。
需要说明地是，在本发明的一些实施例中，肽树脂C的制备方法为：
将30~50份肽树脂A加入至固相反应柱中，用DMF洗涤3~5次，用DMF溶胀树脂30~40min；然后将25~50份多肽片段b、2.5~4.5份HBTU用50~70份DMF溶解完全，并在冰水浴下加入3.5~6.5份DIPEA活化6~8 min后加入固相反应柱中，然后在30~35℃下反应2~4 h，以茚三酮法检测是否反应完全，反应结束后，加入15~25%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；用DMF洗涤3~5次，用甲醇收缩，真空干燥，得到肽树脂C，其收率为84.7~89.2%。
需要说明地是，在本发明的一些实施例中，多肽的制备方法为：
将肽树脂C置于裂解反应瓶中，将肽树脂C与裂解液按比例10~15 mL∶1~2 g加入裂解液，其中裂解液为TFA、TIS与水混合物（TFA∶TIS∶水[v/v]=90~94∶3~5∶3~5），在室温下搅拌反应2~3 h；反应结束后，将反应物过滤，收集滤液，用TFA洗涤树脂3~5次，合并滤液后减压浓缩，然后加入乙酸乙酯将析出物溶解完全，将溶解液加入8~12倍体积冰冻无水乙醚沉淀，并用无水乙醚洗涤3~5次，真空干燥，得到多肽粗肽；将多肽粗肽溶解于2500~3500份水中，采用反向高效液相色谱法纯化，分离，收集馏分，蒸发浓缩，冻干，得到多肽，其收率为53.6~55.8%。
实施例1：
一种多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1：将125份替代度为1.0 mmol/g的王树脂加入固相反应柱中，DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂30 min，然后称取40份Fmoc-Ser(tBu)-OH、25份HBTU、20份DIPEA、2.5份DMAP溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1），然后加入固相反应柱中，在室温下反应3 h，反应结束后用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；再加入160份吡啶和230份乙酸酐混合封闭树脂4 h，用DMF洗涤3次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Ser(tBu)-树脂，测定树脂的替代度为0.607 mmol/g；
将160份替代度为0.607 mmol/g的Fmoc-Ser(tBu)-树脂加入至固相反应柱中，用DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂30 min，再加入20%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；抽干反应液，用DMF洗涤树脂5次；将135份Fmoc-Arg(pbf)-OH、40份HOBt和DIPCDI的组合物（HOBt和DIPCDI的摩尔比为1.0∶1.5）溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1）；在32℃下反应3 h，反应结束后用DMF洗涤5次，DCM洗涤3次，加入20%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；重复相应氨基酸偶联步骤，按肽顺序结构依次偶联80份Fmoc-His(Boc)-OH、80份Fmoc-Thr(tBu)-OH，脱除Fmoc保护基，得到肽树脂A；
S2： 按重量份计，将115份替代度为1.5 mmol/g的Rink树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂35 min，然后称取75份Fmoc-Lys(Cbz)-OH、30份HOBt、2.5份DMAP溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1），然后加入固相反应柱中，在室温下反应3 h，反应结束后用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；再加入170份吡啶和230份乙酸酐混合封闭树脂4.5 h，用DMF洗涤4次，DCM洗涤3次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Cbz)-树脂，测定树脂的替代度为0.586 mmol/g；
将150份替代度为0.586 mmol/g的Fmoc-Lys(Cbz)-树脂加入至固相反应柱中，用DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂35 min，再加入25%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；抽干反应液，用DMF洗涤树脂3次；将125份Fmoc-His(Boc)-OH、40份HOBt溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶2）；在32℃下反应2.5 h，反应结束后用DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，加入25%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；重复相应氨基酸偶联步骤，按肽顺序结构依次偶联115份Fmoc-Gly(Bzl)-OH、150份Fmoc-D-3-Pal-OH，得到肽树脂B；
S3：将115份肽树脂B置于裂解反应瓶中，将肽树脂B与裂解液按比例15 mL∶2 g加入裂解液，其中裂解液为TFE和DCM混合物（TFE∶DCM[v/v]=1∶99），在室温下搅拌反应2 h；反应结束后，将反应物过滤，收集滤液，用DCM洗涤树脂3次，合并滤液后减压浓缩，然后加入乙酸乙酯将析出物溶解完全，将溶解液加入9倍体积冰冻无水乙醚沉淀，并用无水乙醚洗涤5次，真空干燥，得到多肽片段b；
S4：将35份肽树脂A加入至固相反应柱中，用DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂35 min；然后将30份多肽片段b、2.5份HBTU用50份DMF份溶解完全，并在冰水浴下加入3.5份DIPEA活化6 min后加入固相反应柱中，然后在32℃下反应2 h，以茚三酮法检测是否反应完全，反应结束后，加入20%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；用DMF洗涤3次，用甲醇收缩，真空干燥，得到肽树脂C，其收率为85.4%；
S5：将肽树脂C置于裂解反应瓶中，将肽树脂C与裂解液按比例10 mL∶1 g加入裂解液，其中裂解液为TFA、TIS与水混合物（TFA∶TIS∶水[v/v]=94∶3∶3），在室温下搅拌反应2 h；反应结束后，将反应物过滤，收集滤液，用TFA洗涤树脂3次，合并滤液后减压浓缩，然后加入乙酸乙酯将析出物溶解完全，将溶解液加入10倍体积冰冻无水乙醚沉淀，并用无水乙醚洗涤5次，真空干燥，得到多肽粗肽；将多肽粗肽溶解于2500份水中，采用反向高效液相色谱法，波长为230 nm，以40×300 mm反相C18为固定相，以0.22%三氟乙酸/乙腈为流动相纯化，分离，收集馏分，蒸发浓缩，冻干，得到多肽，其收率为54.9%。
实施例2：
一种多肽的制备方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：
步骤S1：Fmoc-Ser(tBu)-树脂的制备方法同实施例1；
将160份替代度为0.607 mmol/g的Fmoc-Ser(tBu)-树脂加入至固相反应柱中，用DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂30 min，再加入20%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；抽干反应液，用DMF洗涤树脂5次；将145份Fmoc-Arg(pbf)-OH、45份HOBt和DIPCDI的组合物（HOBt和DIPCDI的摩尔比为1.0∶1.5）溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1）；在32℃下反应3 h，反应结束后用DMF洗涤5次，DCM洗涤3次，加入20%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；重复相应氨基酸偶联步骤，按肽顺序结构依次偶联95份Fmoc-His(Boc)-OH、75份Fmoc-Thr(tBu)-OH，脱除Fmoc保护基，得到肽树脂A。
实施例3：
一种多肽的制备方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：
步骤S1：将125份替代度为1.0 mmol/g的王树脂加入固相反应柱中，DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂30 min，然后称取45份Fmoc-Ser(tBu)-OH、30份HBTU、25份DIPEA、3份DMAP溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1），然后加入固相反应柱中，在室温下反应3 h，反应结束后用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；再加入160份吡啶和230份乙酸酐混合封闭树脂4h，用DMF洗涤3次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Ser(tBu)-树脂，测定树脂的替代度为0.536 mmol/g；肽树脂A的制备方法同实施例1。
实施例4：
一种多肽的制备方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：
步骤S2：按重量份计，将115份替代度为1.5 mmol/g Rink树脂加入固相反应柱中，用DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂35 min，然后称取65份Fmoc-Lys(Cbz)-OH、27份HOBt、2.2份DMAP溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶1），然后加入固相反应柱中，在室温下反应3 h，反应结束后用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；再加入170份吡啶和230份乙酸酐混合封闭树脂4.5 h，用DMF洗涤4次，DCM洗涤3次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Cbz)-树脂，测定树脂的替代度为0.557 mmol/g；肽树脂B的制备方法同实施例1。
实施例5：
一种多肽的制备方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：
步骤S2：Fmoc-Lys(Cbz)-树脂的制备方法同实施例1；
将160份替代度为0.586 mmol/g的Fmoc-Lys(Cbz)-树脂加入至固相反应柱中，用DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂35 min，再加入25%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；抽干反应液，用DMF洗涤树脂3次；将122份Fmoc-His(Boc)-OH、43份HOBt溶于DCM和DMF混合溶液中（DCM∶DMF[v/v]=1∶2）；在32℃下反应2.5 h，反应结束后用DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，加入25%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；重复相应氨基酸偶联步骤，按肽顺序结构依次偶联110份Fmoc-Gly(Bzl)-OH、160份Fmoc-D-3-Pal-OH，得到肽树脂B。
实施例6：
一种多肽的制备方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：
步骤S3：将125份肽树脂B置于裂解反应瓶中，将肽树脂B与裂解液按比例10 mL∶1g加入裂解液，其中裂解液为TFE和DCM混合物（TFE∶DCM[v/v]=1∶99），在室温下搅拌反应2h；反应结束后，将反应物过滤，收集滤液，用DCM洗涤树脂3次，合并滤液后减压浓缩，然后加入乙酸乙酯将析出物溶解完全，将溶解液加入9倍体积冰冻无水乙醚沉淀，并用无水乙醚洗涤5次，真空干燥，得到多肽片段b。
实施例7：
一种多肽的制备方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：
步骤S4：将40份肽树脂A加入至固相反应柱中，用DMF洗涤3次，用DMF溶胀树脂35min；然后将38份多肽片段b、3份HBTU用60份DMF份溶解完全，并在冰水浴下加入5.5份DIPEA活化7 min后加入固相反应柱中，然后在30℃下反应3h，以茚三酮法检测是否反应完全，反应结束后，加入20%哌啶/DMF，脱除Fmoc保护基；用DMF洗涤3次，用甲醇收缩，真空干燥，得到肽树脂C，其收率为88.7%。
实施例8：
一种多肽的制备方法，其他步骤均与实施例1相同，与实施例1不同的是：
步骤S5：将肽树脂C置于裂解反应瓶中，将肽树脂C与裂解液按比例10 mL∶1 g加入裂解液，其中裂解液为TFA、TIS与水混合物（TFA∶TIS∶水[v/v]=90∶5∶5），在室温下搅拌反应2 h；反应结束后，将反应物过滤，收集滤液，用TFA洗涤树脂3次，合并滤液后减压浓缩，然后加入乙酸乙酯将析出物溶解完全，将溶解液加入10倍体积冰冻无水乙醚沉淀，并用无水乙醚洗涤5次，真空干燥，得到多肽粗肽；将多肽粗肽溶解于3000份水中，采用反向高效液相色谱法，波长为230 nm，以40×300 mm反相C18为固定相，以0.25%三氟乙酸/乙腈为流动相纯化，分离，收集馏分，蒸发浓缩，冻干，得到多肽，其收率为55.6%。
实施例9：
一种多肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：肽树脂A的制备方法同实施例1；
将115份肽树脂A置于裂解反应瓶中，将肽树脂A与裂解液按比例15 mL∶2 g加入裂解液，其中裂解液为TFE和DCM混合物（TFE∶DCM[v/v]=1∶99），在室温下搅拌反应2 h；反应结束后，将反应物过滤，收集滤液，用DCM洗涤树脂3次，合并滤液后减压浓缩，然后加入乙酸乙酯将析出物溶解完全，将溶解液加入10倍体积冰冻无水乙醚沉淀，并用无水乙醚洗涤5次，真空干燥，得到多肽片段a；将多肽片段a粗肽溶解于2500份水中，采用反向高效液相色谱法，波长为230 nm，以40×300 mm反相C18为固定相，以0.22%三氟乙酸/乙腈为流动相纯化，分离，收集馏分，蒸发浓缩，冻干，即得到多肽a，其序列为Thr-His-Arg-Ser。
实施例10：
一种多肽混合物，其中甜菊醇-19-葡萄糖苷与实施例1中多肽的重量比为0.05∶1。
实施例11：
一种多肽混合物，其中甜菊醇-19-葡萄糖苷与实施例1中多肽的重量比为0.1∶1。
实施例12：
一种多肽混合物，其中甜菊醇-19-葡萄糖苷与实施例1中多肽的重量比为0.15∶1。
实施例13：
一种具有修复氧化应激损伤的化妆品组合物，其包括：
按重量份计，实施例1中的多肽为3.5份、六肽-9为2份、棕榈酰三肽-5为1.5份、棕榈酰四肽-7为2.5份、甘油为8份、聚山梨醇酯-20为3份、甘油辛酸酯为0.25份、甘露糖醇为2份、水为70份。
实施例14：
一种具有修复氧化应激损伤的化妆品组合物，其包括：
按重量份计，实施例11中的多肽混合物为3.5份、六肽-9为2份、棕榈酰三肽-5为1.5份、棕榈酰四肽-7为2.5份、甘油为8份、聚山梨醇酯-20为3份、甘油辛酸酯为0.25份、甘露糖醇为2份、水为70份。
对比例1：
一种多肽的制备方法， 多肽片段b的制备方法同实施例1，将多肽片段b粗肽溶解于2500份水中，采用反向高效液相色谱法，波长为230 nm，以40×300 mm反相C18为固定相，以0.22%三氟乙酸/乙腈为流动相纯化，分离，收集馏分，蒸发浓缩，冻干，即得到多肽b，其序列为Pal-Gly-His-Lys。
试验例1：
1. 多肽红外光谱测试
采用布鲁克EQUINOX 55型傅立叶变换红外光谱仪测试，将样品烘干，研磨成粉末，采用溴化钾压片法；测试范围为4000-400 cm-1。
图1为实施例1中多肽的红外光谱图。由图1可以看出，在3389.6 cm-1范围内出现的强且宽的特征吸收峰为-NH2的伸缩振动；在2937.2 cm-1、2845.1 cm-1附近出现的特征吸收峰为C-H的伸缩振动；在1652.8 cm-1附近出现的较强的特征吸收峰为酰胺基团中C=O的伸缩振动；在1575.9 cm-1附近出现的特征吸收峰为多肽中COO-的不对称伸缩振动；在1548.5cm-1附近出现的特征吸收峰为C=N的伸缩振动；在1476.3 cm-1附近出现的特征吸收峰为COO-的对称伸缩振动；在1251.7 cm-1附近出现的特征吸收峰为酰胺基团中N-C的伸缩振动；由此可知，本技术方案制得多肽。
试验例2：
1.多肽抗氧化测试
向试管中分别加入5 mL浓度为20 mg/mL的试样，其中5 mL浓度为20 mg/mL的市售棕榈酰三肽-1作为对照组；然后向试管中分别加入5 mL 0.1 mM的DPPH无水乙醇溶液充分混合，静置30 min，于517 nm比色。空白组为50%乙醇溶液，模拟组用50%乙醇溶液来代替样品，重复三个平行组，计算DPPH自由基的清除率，计算公式如下：
E(%)=[1-(A样品-A空白)/(A模拟-A空白)]×100%
表1 多肽的DPPH自由基清除率
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由表1可以看出，实施例1-8中的DPPH自由基清除率高于92%，对比实施例1与对比例1、对照组，实施例1中的DPPH自由基清除率高于对比例1、对照组；这说明将多肽片段b与肽树脂A偶联制得多肽，提高了多肽对DPPH自由基的清除率，即该多肽具有优良的抗氧化性能；对比实施例9与对比例1、对照组，实施例9中的DPPH自由基清除率高于对比例1、对照组，这说明本发明制得的多肽a的抗氧化性能优于对比例1、对照组；实施例10-12中的DPPH自由基清除率高于97.5%，对比实施例1与实施例10-12，实施例10-12中的DPPH自由基清除率高于实施例1，这说明在使用时添加甜菊醇-19-葡萄糖苷，其与多肽相互作用，进一步提高了多肽的抗氧化性能。
2. 多肽修复皮肤损伤测试
选用雌性成年健康新西兰大耳白兔 10只，实验前8 h禁食禁水；腹腔注射10%乌拉坦（3.5 ml/kg）对兔子进行麻醉，用剃毛推子剔去兔子背部部分毛发；待麻醉起效后，进行备皮消毒。绷紧兔子背部局部皮肤，然后人工造模，造10 mm直径的创伤标记。同一只兔子背部分为A、B、C、D、E、F、G七个处理区，区间间隔3 cm。A区给予生理盐水处理作为空白组，B、C、D、E区分别给予浓度为20 mg/mL的实施例1、实施例9、实施例11、对比例1中的样品进行外涂处理，F区给予浓度为20 mg/mL的市售棕榈酰三肽-1作为阳性对照组，G区给予浓度为20mg/mL的甜菊醇-19-葡萄糖苷溶液作为阴性对照组。每天外涂1次，每次0.15 mL；并用硫酸坐标纸记录创面大小。于术后5 d、10 d分别处死5只兔子，取A、B、C、D、E、F、G区皮肤；用半透明硫酸纸覆盖于创口表面，沿创口边缘进行画线，用正交坐标纸测量创口面积，计算其愈合率，计算公式如下：
愈合率=(造模即刻创面面积-某天创面面积)/造模即刻创面面积×100%
表2 多肽对皮肤损伤的愈合率
Figure 858257DEST_PATH_IMAGE002
由表2可以看出，在5 d、10 d后，实施例1中皮肤损伤的愈合率分别高于61%、89%；对比实施例1与实施例9、对比例1、阳性对照组，实施例1中皮肤损伤的愈合率高于实施例9、对比例1、阳性对照组，这说明将多肽片段b与肽树脂A偶联制得多肽，提高了多肽对皮肤损伤的修复作用，能够加快皮肤损伤的愈合；对比实施例9与对比例1、阳性对照组，实施例9中皮肤损伤的愈合率高于对比例1、阳性对照组，这说明本发明制得的多肽a对皮肤损伤的修复作用优于对比例1、阳性对照组（棕榈酰三肽-1）；由表2还可以看出，空白组与阴性对照组无明显差别，这说明甜菊醇-19-葡萄糖苷与生理盐水的作用几乎相同，对皮肤损伤的修复无明显效果；而在5 d、10 d后，实施例11中皮肤损伤的愈合率分别高于74.5%、92%；对比实施例1、实施例11与阴性对照组，实施例11中皮肤损伤的愈合率高于实施例1与阴性对照组，这说明将多肽与甜菊醇-19-葡萄糖苷同时使用，增强了多肽对皮肤损伤的修复作用。
3. 多肽抗皮肤光老化测试
选用健康小鼠经适应性喂养后，随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组（Vc组）、基质组（成分：蔗糖脂肪酸0.6%，甘油3%，单甘脂0.4%）、给药实验组（实施例1、实施例9、实施例11、对比例1），每组10只。全部喂食基础饲料，试验持续12周，期间，每只小鼠日投食量为5 g，自由饮水。
各组小鼠背部脱毛，使其暴露面积为3 cm×3 cm，于脱毛的第二日开始涂抹不同浓度的受试物（见表3），每日涂抹一次，每次每只的剂量为0.1 mL。从脱毛的第二周开始，除空白组外的其他各组均用80 W的UVA灯管和160的UVB灯管在距小鼠35 cm的上方进行紫外照射，照射时间以出现皮肤轻度泛红为准。每天照射一次，持续12周，累计照射剂量约为UVA304.5 J/cm2、 UVB 6.3 J/cm2。定期脱毛并观察小鼠背部皮肤的变化，每周称重并检测皮肤表面损伤程度。
皮肤生化指标测试：最后一次紫外照射后24 h，颈椎脱臼处死小鼠，剪取脱毛区受试部位的皮肤，用生理盐水漂洗，去除粘连的皮下组织，滤纸拭干后用直径为0.8 cm的打孔器钻取面积相等的4片皮肤，称重后，取两片放入中性甲醛液固定，其余皮肤放入液氮中研磨成粉末。随后称取一定质量研磨后的皮肤粉末加入10倍冷生理盐水震荡均匀。然后于3℃、4500 rpm下离心10 min。取上清液，根据试剂盒说明测定羟脯氨酸（HYP）含量（HYP是胶原蛋白特有的氨基酸之一，其含量可以间接反映出胶原蛋白含量）。
表3 各组受试物配方
Figure DEST_PATH_IMAGE003
注：√表示加入；-表示未加入。
测试结果如表4所示：
表4 各试验组的皮肤增重与HYP含量
Figure DEST_PATH_IMAGE004
由表4可以看出，在皮肤取样面积相同的条件下，与模型组相比，基质组与模型组的皮肤质量数值处于相似水平，除此之外，模型组与基质组的HYP含量也处于相似水平；这说明基质乳液对皮肤没有抗光老化的作用；相对于模型组，对照组、实施例1、实施例9、实施例11、对比例1的皮肤质量均降低，这说明本技术方案制得的多肽能够减缓光老化引起的皮肤增厚，具有优良的抗光老化、延缓衰老的作用；实施例1的皮肤质量低于239 mg，HYP含量高于0.45 ng/mg；对比实施例1与实施例9、对比例1、对照组，实施例1的皮肤质量低于实施例9、对比例1、对照组，且HYP含量高于实施例9、对比例1、对照组，这说明将多肽片段b与肽树脂A偶联制得多肽，提高了多肽的抗光老化作用，减缓胶原蛋白的流失，进而延缓皮肤衰老；实施例11的皮肤质量低于232 mg，HYP含量高于0.485 ng/mg；对比实施例1与实施例11，实施例11的皮肤质量低于实施例1，HYP含量高于实施例1，这说明在多肽使用的时候添加甜菊醇-19-葡萄糖苷，提高了多肽的抗皮肤光老化作用，具有更为优良的延缓衰老的作用。
4. 多肽吸湿保湿性能测试
吸湿性能：在室温下，分别准确称取0.50 g样品于干燥瓶中，然后置于干燥器中，其中干燥器中装有饱和硫酸铵水溶液（RH=81%），放置48 h后进行称重，将市售棕榈酰三肽-1作为对照组，计算吸湿率，计算公式如下：
吸湿率(%)=(m1-m0)/m0×100%
式中：m1为放置后样品的重量；m0为放置前样品的重量。
保湿性能：在室温下，将含水量为10%的样品置于不同的干燥瓶中，RH=20%，干燥瓶里面置入干硅胶。将市售棕榈酰三肽-1作为对照组，放置48 h后分别进行称重；计算水分残存率。
水分残存率(%)=H1/H0×100%
式中：H1为放置后样品的重量；H0为放置前样品的重量。
表5多肽的保湿率与水分残存率
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由表5可以看出，48 h内，在RH=81%条件下，实施例1的吸湿率高于74.5%；在RH=20%条件下，实施例1的水分残存率高于98%，对比实施例1与实施例9、对比例1、对照组，实施例1的保湿率与水分残存率均高于实施例9、对比例1、对照组，这说明将多肽片段b与肽树脂A偶联制得多肽，提高了多肽的吸湿与保湿性能，使其能够更好地应用于化妆品护肤领域；对比实施例1与实施例11，实施例11的保湿率与水分残存率高于实施例1，这说明将多肽与甜菊醇-19-葡萄糖苷同时使用，使多肽混合物具有更为优良的吸湿保湿性能。
5. 多肽皮肤刺激测试
选择健康、成年、皮肤无损的白色家兔4只，试验前24 h用8%硫化钠将试验动物背部脊柱两侧背毛去除，去除面积左右各约3 cm×3 cm，将0.5 mL 50% (W/V)多肽溶液涂抹于一侧，另一侧作为空白对照，每天涂抹一次，涂抹后清洗观察皮肤状态，连续涂抹观察14天。第二天开始，每次涂抹前剪毛，用水清除残留受试物。涂抹1 h后观察结果，根据2015年版《化妆品卫生规范》中皮肤刺激性反应评分标准对实验结果进行评分，计算给药动物积分均值，并对照皮肤刺激强度评分表判定皮肤刺激强度。
表6多肽皮肤刺激测试结果
Figure 561683DEST_PATH_IMAGE006
由表6可以看出，实施例1、实施例9、实施例11与对比例1中的每天每只动物积分均值均为0分，这说明本技术方案制得的多肽对皮肤无刺激性，能够适用于化妆品。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江湃肽生物有限公司深圳分公司
<120> 具有修复氧化应激损伤的多肽及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly His Lys Thr His Arg Ser
1 5

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为：Pal-Gly-His-Lys-Thr-His-Arg-Ser。
2.根据权利要求1所述的一种多肽，其特征在于：所述多肽由Pal-Gly-His-Lys偶联Thr-His-Arg-Ser。
3.权利要求1所述的一种多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1：以Rink树脂或王树脂为载体合成Fmoc-Ser(tBu)-树脂，然后采用固相合成法将其从C端到N端逐一偶联氨基酸，然后脱除Fmoc保护基，得到肽树脂A：H-Thr(tBu)-His-Arg(pbf)-Ser(tBu)-树脂；
S2：以Rink树脂为载体合成Fmoc-Lys-树脂，然后采用固相合成法将其从C端到N端逐一偶联氨基酸，得到肽树脂B：Fmoc-Pal-Gly-His-Lys-树脂；
S3：将肽树脂B裂解，得到多肽片段b：Fmoc-Pal-Gly-His-Lys-OH；
S4：将多肽片段b与肽树脂A进行固相偶联，脱除Fmoc保护基，得到肽树脂C：H-Pal-Gly-His-Lys-Thr(tBu)-His-Arg(pbf)-Ser(tBu)-树脂；
S5：将肽树脂C裂解、纯化，得到多肽：H-Pal-Gly-His-Lys-Thr-His-Arg-Ser-OH。
4.根据权利要求3所述的一种多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，王树脂的替代度为0.473~0.629 mmol/g；所述步骤S2中，Rink树脂的替代度为0.55~0.75 mmol/g。
5.根据权利要求3所述的一种多肽的制备方法，其特征在于：所述固相合成法中使用偶联剂发生偶联反应；所述偶联剂组成为HOBt；HBTU；HOAt和DIPCDI；HBTU和DIPEA；HOBt和DIPCDI；PyBOP和DIPCDI中的一种。
6.根据权利要求5所述的一种多肽的制备方法，其特征在于：所述偶联剂为HOBt和DIPCDI的组合物；所述HOBt和DIPCDI的摩尔比为1.0~1.5∶1.2~1.8。
7.根据权利要求3所述的一种多肽的制备方法，其特征在于：所述裂解用裂解液为TFE和DCM的混合物；所述混合物中TFE和DCM的体积比为1~3∶97~99。
8.根据权利要求3所述的一种多肽的制备方法，其特征在于：所述多肽的纯化步骤采用反向高效液相色谱法，以C18、C8中的一种为固定相；以0.22~0.25%三氟乙酸/乙腈为流动相。
9.权利要求1所述的一种多肽在制备修复氧化应激损伤产品中的用途。
10.一种多肽混合物，包括：权利要求1所述的多肽和甜菊醇-19-葡萄糖苷。
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