CN113861273A - 一种肉豆蔻酰五肽-4的合成方法 - Google Patents

一种肉豆蔻酰五肽-4的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种肉豆蔻酰五肽‑4的合成方法，属于生物化学材料合成领域，包括用二甲基酰胺和蓖麻油酸活化树脂；将Fmoc保护的氨基酸与缩合剂，消旋试剂混合，加入有机溶剂溶解，再加入活化剂活化后，与脱保护的树脂反应，连接到树脂上，采用此方法依次连接Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH﹑Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑OH，得到五肽树脂，加入肉豆蔻酰氯、活化剂、二氯甲烷反应，对得到的肽树脂进行切割、纯化，得到肉豆蔻酰五肽‑4。本发明提供的一种肉豆蔻酰五肽‑4的合成方法具有操作简单，成本较低，产率和纯度较高的优点。

Description

一种肉豆蔻酰五肽-4的合成方法
技术领域
本发明属于生物化学材料合成领域，具体涉及一种肉豆蔻酰五肽-4的合成方法。
背景技术
肉豆蔻酰五肽-4（Myristoyl Pentapeptide-4），又称肉豆蔻酰五肽-17，是一种能够明显促进睫毛生长的美容肽，它能直接激活角质蛋白基因的表达，进而使睫毛生长，变得浓密。
目前，多肽的化学合成主要分为液相合成和固相合成两种方法，多肽固相合成法因具有操作简便，副产物少，易于纯化等优点，自创立以来被广泛应用到多肽的合成研究中。多肽固相合成C端向N端延伸的原理为：将目标肽链的首个氨基酸的羧基和固相载体以共价键结合，然后下一个氨基保护氨基酸在化学试剂下于之发生缩合反应，反复重复如此反应，直到目标肽链连接完成为止。最后将该肽链切割下来，纯化得到所需多肽。固相多肽合成中一般要先将氨基酸的α-氨基和侧链活性基团保护。Boc（叔丁氧羰）和Fmoc（9-芴亚甲氧羰）两种基团被广泛使用来保护α-氨基。Fmoc保护与Boc保护相比，Fmoc在酸性条件下比较稳定，反应条件温和，副产物少，切割条件温和，合成效率高。
现有技术如授权公告号为CN 103897053 B的中国发明专利，公开了一种化学修饰的胸腺肽α1及其合成方法，其具有以下结构：A-Ser-Asp-AlaAla-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-ThrLys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-ValGlu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH或Ac-Ser-Asp-AlaAla-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-ThrLys(A)-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-ValVal-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，所述A为与人血清白蛋白亲和性结合的脂肪酸，或与人血清白游离巯基偶联的马来酰亚胺衍生物。本发明的化学修饰的胸腺肽α1修饰位点精确，化学结构明确，合成方法工艺简练，经化学修饰的胸腺肽α1在静脉注射后立即特异性地与人体自身的血清白蛋白结合，将以人体自身的血清白蛋白作为缓释载体，从而大大延长其半衰期，显著增加有效药物浓度的持续时间，生物利用度高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肉豆蔻酰五肽-4的合成方法，该方法能够促进树脂的溶胀，提高首个氨基酸的连接率，提高Fmoc基团的脱除率，降低生产成本，提高产品的产率。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种肉豆蔻酰五肽-4的制备方法，该肉豆蔻酰五肽-4的结构为Myristoyl-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-NH2，其制备方法包括以下步骤：
S1、将Rink Amide AM树脂溶于有机溶剂二甲基甲酰胺和蓖麻油酸中浸泡10-25min后，抽滤，得到活化的树脂；上述有机溶剂包括二甲基甲酰胺和蓖麻油酸；上述RinkAmide AM树脂与有机溶剂的质量体积比为1g:5-9mL；
S2、向活化的树脂中加入脱保护剂进行脱保护基反应（即脱除Fmoc-保护基），反应结束后，抽滤、洗涤树脂，得到脱保护的树脂；将Fmoc-Lys(Boc)-OH，缩合剂，消旋试剂混合，加入二甲基甲酰胺完全溶解，再加入活化剂，20-28℃下，避光静置活化4-8min，得到活化的氨基酸溶液；将活化的氨基酸溶液加入脱保护的树脂中，用N2吹动搅拌，20-28℃下反应2-4h后，抽滤、洗涤，得到Fmoc-Lys(Boc)-树脂；
S3、按照上述步骤S2的方法对Fmoc-Lys(Boc)-树脂进行脱保护、洗涤后，连接Fmoc-Lys(Boc)-OH，之后用同样的方法依次连接Fmoc-Ala-OH﹑Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，得到Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂；
S4、按照上述步骤S2的方法对Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-RinkAmide AM树脂进行脱保护、洗涤后，加入肉豆蔻酰氯、活化剂、二氯甲烷，20-28℃下搅拌反应15-40min后，抽滤、洗涤、干燥，得到Myristoyl-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂；
S5、切割Myristoyl-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂，得到肉豆蔻酰五肽-4产品。进一步地，上述二甲基甲酰胺和蓖麻油酸的体积比为8-10:1-2。二甲基甲酰胺和蓖麻油酸按照体积比8-10:1-2的比例对树脂进行活化，能够促进树脂的溶胀，有利于待反应的基团进出树脂的空隙，提高树脂与第一个保护氨基酸的连接效率，进而能够提高肉豆蔻酰五肽-4的产率。
在某些实施方案中，上述Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH﹑Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂的摩尔比均为2-5:1。在本发明中提及的Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH﹑Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、肉豆蔻酰氯、活化剂与树脂的摩尔比，指的是Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH﹑Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、肉豆蔻酰氯、活化剂与制备肉豆蔻酰五肽-4时所使用的Rink Amide AM树脂的总取代度的比值。
在某些实施方案中，上述洗涤树脂的具体步骤包含：取反应溶剂已经被抽干的树脂，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别洗涤2-4次，每次不少于5min。
在某些实施方案中，上述S2脱保护的具体步骤包含：向活化的树脂中加入14-16v/v%哌啶的二甲基甲酰胺溶液，20-28℃下N2吹动搅拌反应8-12min。优选地，上述二甲基甲酰胺溶液中还含有乙酰丙酮。进一步地，上述二甲基甲酰胺溶液中哌啶与乙酰丙酮的体积比为13-15:2-3。含有一定比例的哌啶与乙酰丙酮的脱保护剂，在较短的时间和较少的脱保护剂下能够促进Fmoc基团的脱除，有利于树脂上氨基酸的氨基的暴露，与羧基反应形成肽键，提高偶联氨基酸的产率，从而提高肉豆蔻酰五肽-4的产率。
在某些实施方案中，上述活化剂为DIEA（二异丙基乙胺）、缩合剂为HATU（2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯）、HBTU（O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯）和TBTU（O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯）其中任何一种、消旋试剂为HOBT（1-羟基苯并三唑）或HOAT（1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑）。
优选地，上述活化剂为DIEA、缩合剂为HBTU、消旋试剂为HOBT。进一步地，上述Fmoc-Lys(Boc)-OH、DIEA、HBTU、HOBT的摩尔比为1:1-3:1-2:1-2。
在某些实施方案中，上述树脂、肉豆蔻酰氯、活化剂的摩尔比为1:1.5-3:2-4。
在某些实施方案中，上述切割Myristoyl-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂所使用的切割液为高酸TFA（三乙氟酸）-H2O溶液。进一步地，上述高酸TFA-H2O溶液包括95v/v% TFA和5v/v% H2O。
在某些实施方案中，在上述切割Myristoyl-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂后还进行纯化。
在某些实施方案中，上述S5的具体步骤包含：向Myristoyl-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂中加入切割液，放入冰水浴中搅拌反应2-4h，过滤，滤液在35-38℃下浓缩至体积不再减少，加入无水乙醚沉淀多肽，3-5℃静置30-60min，4000r/min离心2-4min，弃去上清，得到沉淀，沉淀用纯水溶解后，冷冻干燥，采用反向高效液相色谱法进行纯化，得到肉豆蔻酰五肽-4纯品。进一步地，上述无水乙醚与滤液的体积比为25-45:1。
本发明还提供一种肉豆蔻酰五肽-4的制备方法在制备一种促进睫毛生长的产品中的用途。
本发明由于使用体积比为8-10:1-2的二甲基甲酰胺和蓖麻油酸对树脂进行活化，因而具有如下有益效果：能够促进树脂的溶胀，有利于待反应的基团进出树脂的空隙，提高树脂与第一个保护氨基酸的连接效率，进而能够提高肉豆蔻酰五肽-4的产率。
本发明由于使用含有体积比为13-15:2-3的哌啶与乙酰丙酮的脱保护剂，在较短的时间和较少的脱保护剂下能够促进Fmoc基团的脱除，有利于树脂上氨基酸的氨基的暴露，与羧基反应形成肽键，提高氨基酸偶联率，从而提高肉豆蔻酰五肽-4的产率。
因而，本发明是一种操作简单，成本较低，产率和纯度较高的肉豆蔻酰五肽-4的合成方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中多肽产品的RP-HPLC谱图；
图2为本发明实施例1中多肽纯品的质谱图；
图3为本发明试验例1中树脂膨胀度的测定结果；
图4为本发明试验例1中实施例1-7中树脂和首个氨基酸连接率的测定结果；
图5为本发明试验例1中Fmoc基团的脱除率的测定结果；
图6为本发明试验例1中实施例1、8-13中树脂和首个氨基酸连接率的测定结果；
图7为本发明试验例1中实施例1-7肉豆蔻五肽-4的产率的测定结果；
图8为本发明试验例1中实施例1、8-13肉豆蔻五肽-4的产率的测定结果。
附图标记说明：A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为实施例5，F为实施例6，G为实施例7，H为实施例8，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12，M为实施例13，a为795.63，b为796.64，c为797.63，d为798.64。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
1.一种肉豆蔻酰五肽-4，结构为Myristoyl-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-NH2，分子式为C41H81N9O6，其制备方法包括以下步骤：
脱保护剂：含有15v/v%哌啶和2.5v/v%乙酰丙酮的二甲基甲酰胺溶液；
切割液：95v/v% TFA和5v/v% H2O；
1.1称取2g Rink Amide AM树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度为0.5mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司），放入多肽合成管中，加入13mL二甲基甲酰胺和2mL蓖麻油酸浸泡15min后，将多肽合成管连在真空泵上抽干溶液，得到活化的树脂；
1.2向活化的树脂中加入10mL脱保护剂，25℃下，N2吹动搅拌反应10min，抽滤去除溶液，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到脱保护的树脂；
1.3将5mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH，6mmol HBTU，6mmol HOBT混合，加入25mL二甲基甲酰胺完全溶解，再加入10mmol DIEA，25℃下，避光静置活化5min，得到活化的氨基酸溶液；将活化的氨基酸溶液加入脱保护的树脂中，用N2吹动搅拌，25℃下反应3h后，抽滤去除溶液，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到Fmoc-Lys(Boc)-树脂；
1.4向Fmoc-Lys(Boc)-树脂中加入10mL脱保护剂，25℃下，N2吹动搅拌反应10min，抽滤去除溶液，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到脱保护的Lys(Boc)-树脂；
1.5将5mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH，6mmol HBTU，6mmol HOBT混合，加入25mL二甲基甲酰胺完全溶解，再加入10mmol DIEA，25℃下，避光静置活化5min，得到活化的氨基酸溶液；将活化的氨基酸溶液加入脱保护的Lys(Boc)-树脂中，用N2吹动搅拌，25℃下反应3h后，抽滤去除溶液，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到Fmoc-Lys(Boc)- Lys(Boc)-树脂；
1.6 按照1.4和1.5的步骤依次连接Fmoc-Ala-OH﹑Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，得到Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂；
1.7向Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂中加入10mL脱保护剂，25℃下，N2吹动搅拌反应10min，抽滤去除溶液，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到脱保护的Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂；
1.8向Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂中加入2.5mmol肉豆蔻酰氯、3mmol DIEA、30mL二氯甲烷，25℃下，N2吹动搅拌反应20min后，抽滤去除溶液，依次用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺各40mL洗涤树脂3次，每次5min，用N2吹干，得到Myristoyl-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂；
1.9向Myristoyl-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂中加入切割液，放入冰水浴中搅拌反应3h，使用砂芯漏斗过滤除去树脂，将滤液在38℃下浓缩至体积不再减少，加入35倍滤液体积的无水乙醚沉淀多肽，4℃静置40min，4000r/min离心3min，弃去上清，得到沉淀，沉淀用纯水溶解后，冷冻干燥，得到多肽产品。利用反向高效液相色谱（RP-HPLC）检测合成的多肽产品，分析多肽的纯度，并利用质谱检测多肽粗品的分子量，确定合成的多肽是否为肉豆蔻酰五肽-4。RP-HPLC检测的方法：取多肽样品置于15mL离心管中，加入流动相A相，置于超声震荡机中震荡使多肽样品溶解，制成10mg/mL的待检测粗多肽溶液，检测用C18分析柱，柱温为35℃，进行RP-HPLC分析，其中流动相：A相：水，0.1％TFA；B相：乙腈，0.1％TFA，洗脱梯度：B相的溶度从5％到95％，洗脱速度为1ml/min，洗脱时间为35min，检测波长为215nm。收集目标峰的多肽溶液，经浓缩、冻干，得到多肽的纯品。多肽产品的RP-HPLC谱图见图1。由图1可以看出多肽产品的主要峰很高，保留时间在18.087min，用峰面积归一法来计算多肽产品的纯度，纯度为98.7%。用Thermo Scientific LCQ Fleet离子肼对多肽的纯品进行质谱鉴定，分析计算质谱结果，确定目的产物所在峰。质谱条件如下：离子源：ESI；鞘气流速：20psi；辅气流速：8psi；扫气流速：5psi；喷雾电压：4.5KV；毛细管温度：275℃；毛细管电压：35V；套管透镜电压：110V。多肽纯品的质谱图见图2。由图2可以看出，多肽的纯品的相对分子量为795.63，与肉豆蔻酰五肽-4理论相对分子量796.14基本一致，证实多肽纯品为肉豆蔻酰五肽-4。
实施例2：
1.1称取2g Rink Amide AM树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度为0.5mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司），放入多肽合成管中，加入12.5mL二甲基甲酰胺和2.5mL蓖麻油酸浸泡15min后，将多肽合成管连在真空泵上抽干溶液，得到活化的树脂；其余部分和实施例1完全一致。
实施例3：
1.1称取2g Rink Amide AM树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度为0.5mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司），放入多肽合成管中，加入13.5mL二甲基甲酰胺和1.5mL蓖麻油酸浸泡15min后，将多肽合成管连在真空泵上抽干溶液，得到活化的树脂；其余部分和实施例1完全一致。
实施例4：
1.1称取2g Rink Amide AM树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度为0.5mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司），放入多肽合成管中，加入11mL二甲基甲酰胺和4mL蓖麻油酸浸泡15min后，将多肽合成管连在真空泵上抽干溶液，得到活化的树脂；其余部分和实施例1完全一致。
实施例5：
1.1称取2g Rink Amide AM树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度为0.5mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司），放入多肽合成管中，加入14mL二甲基甲酰胺和1mL蓖麻油酸浸泡15min后，将多肽合成管连在真空泵上抽干溶液，得到活化的树脂；其余部分和实施例1完全一致。
实施例6：
1.1称取2g Rink Amide AM树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度为0.5mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司），放入多肽合成管中，加入13mL二甲基甲酰胺浸泡15min后，将多肽合成管连在真空泵上抽干溶液，得到活化的树脂；其余部分和实施例1完全一致。
实施例7：
1.1称取2g Rink Amide AM树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度为0.5mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司），放入多肽合成管中，加入15mL二氯甲烷浸泡15min后，将多肽合成管连在真空泵上抽干溶液，得到活化的树脂；其余部分和实施例1完全一致。
实施例8：
脱保护剂：含有15v/v%哌啶和2v/v%乙酰丙酮的二甲基甲酰胺溶液；其余部分和实施例1完全一致。
实施例9：
脱保护剂：含有15v/v%哌啶和3v/v%乙酰丙酮的二甲基甲酰胺溶液；其余部分和实施例1完全一致。
实施例10：
脱保护剂：含有15v/v%哌啶和1.5v/v%乙酰丙酮的二甲基甲酰胺溶液；其余部分和实施例1完全一致。
实施例11：
脱保护剂：含有15v/v%哌啶和4v/v%乙酰丙酮的二甲基甲酰胺溶液；其余部分和实施例1完全一致。
实施例12：
脱保护剂：含有15v/v%哌啶的二甲基甲酰胺溶液；其余部分和实施例1完全一致。
实施例13：
脱保护剂：含有20v/v%哌啶的二甲基甲酰胺溶液；脱保护时间为20min。其余部分和实施例1完全一致。
试验例1：
1.1树脂的活化情况的测试：分别称量上述实施例1.1中树脂浸泡后抽去的溶液的体积，计算树脂吸收的溶液，以树脂吸收的溶液/树脂(mL/g)表示树脂的膨胀情况。树脂膨胀度的测定结果见图3。
1.2 Fmoc吸光法标准曲线的建立；
首先制作Fmoc浓度的标准曲线：称取Fmoc-Gly-OH 59.3mg，溶于20v/v%哌啶的DMF溶液，混匀振荡40min，过滤，合并滤液定容于10mL容量瓶内，Fmoc保护基的浓度为20mmol/L。取此溶液稀释成0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L标准液，使用紫外分光光度计于290nm处测定标准液吸光度并根据数据绘制标准曲线。根据数值得到回归方程。以吸光度为y轴，浓度为x轴，建立的Fmoc标准曲线方程为y=6.58x+0.23，R2=0.996。
1.3 Fmoc基团脱除率的测定：
Fmoc基团量的测定：首先准确称量0.0005g实施例1中的活化的树脂，加入20v/v%哌啶的二甲基甲酰胺溶液8mL反应40min，然后甲醇反复洗涤，收集所有滤液，滤液体积为V1。将滤液290nm下的吸光度代入上述Fmoc的标准曲线方程，得到Fmoc基团的浓度n1。
Fmoc基团量（mmol/g）=n1×V1/0.0005；
分别称取上述实施例1.2步骤前活化树脂的质量，记为m，分别取树脂脱保护后抽滤得到的溶液，滤液体积为V2，将滤液290nm下的吸光度代入上述Fmoc的标准曲线方程，得到脱除的Fmoc基团的浓度n2。
脱除的Fmoc基团量=(n2×V2)/m
Fmoc的脱除率=（脱除的Fmoc基团量/ Fmoc基团量）×100%。Fmoc基团的脱除率的测定结果见图5。
1.4树脂和首个氨基酸连接率的测定：
首先准确称量一定量（0.0050g）上述实施例中的Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide AM树脂样品，加入20v/v%哌啶的二甲基甲酰胺溶液8mL反应40min，然后甲醇反复洗涤，收集所有滤液，定容至10mL，290nm下测紫外吸收值。根据下式计算树脂的实际担载量、理论担载量、连接率。
1）树脂的实际担载量（mmol/g）=(W 2 -W)/[(MW a -MW b )×W 2 ]
其中，W2为Fmoc氨基酸-树脂重量，g；
W为树脂的重量，g；
MWa为Fmoc氨基酸的分子量；
MWb为H2O的分子量；
2）树脂的理论担载量（mmol/g）=M×W/[W+M×W×(MW a -MW b )/1000]
其中，M为树脂的取代度，mmol/g；
W为树脂的重量，g；
MWa为Fmoc氨基酸的分子量；
MWb为H2O的分子量；
3）连接率=（树脂的实际担载量/树脂的理论担载量）×100%。实施例1-7中树脂和首个氨基酸连接率的测定结果见图4。实施例1、8-13中树脂和首个氨基酸连接率的测定结果见图6。
1.5肉豆蔻五肽-4的产率的测定：分别采用RP-HPLC法对上述实施例得到的产品进行纯化，收集目标峰的多肽溶液，经浓缩、冻干，得到多肽的纯品，称重，为肉豆蔻五肽-4的实际产量。根据上述树脂的取代度计算理论产量，肉豆蔻五肽-4的实际产量与理论产量的比值即为肉豆蔻五肽-4的产率。实施例1-7肉豆蔻五肽-4的产率的测定结果见图7。实施例1、8-13肉豆蔻五肽-4的产率的测定结果见图8。
由图3、图4、图7可以看出，实施例1、实施例2、实施例3的树脂的膨胀度、树脂和首个氨基酸连接率、肉豆蔻五肽-4的产率均明显大于实施例4、实施例5、实施例6、实施例7，这说明：二甲基甲酰胺和蓖麻油酸按照体积比8-10:1-2的比例对树脂进行活化，能够促进树脂的溶胀，有利于待反应的基团进出树脂的空隙，提高树脂与第一个保护氨基酸的连接效率，进而能够提高肉豆蔻酰五肽-4的产率。
由图5、图6、图8可以看出，实施例8、实施例9的Fmoc基团的脱除率明显大于实施例10、实施例11、实施例12、实施例13，实施例1、实施例8、实施例9的树脂和首个氨基酸连接率、肉豆蔻五肽-4的产率均明显大于实施例10、实施例11、实施例12、实施例13，这说明：含有体积比为13-15:2-3的哌啶与乙酰丙酮的脱保护剂，在较短的时间和较少的脱保护剂下能够促进Fmoc基团的脱除，有利于树脂上氨基酸的氨基的暴露，与羧基反应形成肽键，提高氨基酸偶联率，从而提高肉豆蔻酰五肽-4的产率。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江湃肽生物有限公司深圳分公司
<120> 一种肉豆蔻酰五肽-4的合成方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Leu Ala Lys Lys
1 5

Claims (7)

1.一种肉豆蔻酰五肽-4的制备方法，其特征在于：所述肉豆蔻酰五肽-4的结构为Myristoyl-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-NH2，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将Rink Amide AM树脂溶于有机溶剂二甲基甲酰胺和蓖麻油酸中浸泡10-25min后，抽滤，得到活化的树脂；所述有机溶剂包括二甲基甲酰胺和蓖麻油酸；所述Rink Amide AM树脂与有机溶剂的质量体积比为1g:5-9mL；
S2、向活化的树脂中加入脱保护剂进行脱保护基反应，反应结束后，抽滤、洗涤树脂，得到脱保护的树脂；将Fmoc-Lys(Boc)-OH，缩合剂，消旋试剂混合，加入二甲基甲酰胺完全溶解，再加入活化剂，20-28℃下，避光静置活化4-8min，得到活化的氨基酸溶液；将活化的氨基酸溶液加入脱保护的树脂中，用N2吹动搅拌，20-28℃下反应2-4h后，抽滤、洗涤，得到Fmoc-Lys(Boc)-树脂；
S3、按照所述步骤S2的方法对Fmoc-Lys(Boc)-树脂进行脱保护、洗涤后，连接Fmoc-Lys(Boc)-OH，之后用同样的方法依次连接Fmoc-Ala-OH﹑Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，得到Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂；
S4、按照所述步骤S2的方法对Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂进行脱保护、洗涤后，加入肉豆蔻酰氯、活化剂、二氯甲烷，20-28℃下搅拌反应15-40min后，抽滤、洗涤、干燥，得到Myristoyl-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂；
S5、切割Myristoyl-Lys(Boc)-Leu-Ala-Lys(Boc)-Lys(Boc)-树脂，得到肉豆蔻酰五肽-4产品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述二甲基甲酰胺和蓖麻油酸的体积比为8-10:1-2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2和S4中的活化剂均为DIEA，所述缩合剂为HATU、HBTU和TBTU其中任何一种，所述消旋试剂为HOBT或HOAT。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2和S4中的活化剂均为DIEA，所述缩合剂为HBTU，所述消旋试剂为HOBT。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中Rink Amide AM树脂与步骤S4中肉豆蔻酰氯、活化剂的摩尔比为1:1.5-3:2-4。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH﹑Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH与步骤1中Rink Amide AM树脂的摩尔比均为2-5:1。
7.权利要求1-6任一项中所述的制备方法在制备一种促进睫毛生长的产品中的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114230633A (zh) * 2022-01-21 2022-03-25 浙江湃肽生物有限公司深圳分公司 具有修复氧化应激损伤的多肽及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130289241A1 (en) * 2012-04-26 2013-10-31 Shanghai Ambiopharm, Inc. Method for preparing exenatide
WO2014199397A2 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Mylan Laboratories Ltd Process for the preparation of liraglutide
CN110204596A (zh) * 2019-06-06 2019-09-06 南京迪维奥医药科技有限公司 一种具有明显促进睫毛生长的肉豆蔻酰五肽-17及其固相合成方法
WO2020252883A1 (zh) * 2019-06-19 2020-12-24 深圳翰宇药业股份有限公司 胸腺肽Tα-1的合成方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130289241A1 (en) * 2012-04-26 2013-10-31 Shanghai Ambiopharm, Inc. Method for preparing exenatide
WO2014199397A2 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Mylan Laboratories Ltd Process for the preparation of liraglutide
CN110204596A (zh) * 2019-06-06 2019-09-06 南京迪维奥医药科技有限公司 一种具有明显促进睫毛生长的肉豆蔻酰五肽-17及其固相合成方法
WO2020252883A1 (zh) * 2019-06-19 2020-12-24 深圳翰宇药业股份有限公司 胸腺肽Tα-1的合成方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114230633A (zh) * 2022-01-21 2022-03-25 浙江湃肽生物有限公司深圳分公司 具有修复氧化应激损伤的多肽及其制备方法与应用
CN114230633B (zh) * 2022-01-21 2023-05-30 浙江湃肽生物股份有限公司 具有修复氧化应激损伤的多肽及其制备方法与应用

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