CN118047837A - 一种损伤修复活性肽、核桃肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及一种损伤修复活性肽、核桃肽及其制备方法和应用。其中损伤修复活性肽的氨基酸序列为FFPGPS，具有显著晒后损伤修复功效，以此为核心原料，制备具有晒后修复的护肤品原料及其组合物具有广阔的市场需求。

Description

一种损伤修复活性肽、核桃肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及一种损伤修复活性肽、核桃肽及其制备方法和应用
背景技术
随着生态环境的不断恶化，大自然的臭氧层被破坏，使人体暴露在更多的紫外线下，而紫外线照射是引起皮肤光老化的重要因素，其中，一部分紫外线主要损伤皮肤表面，短时间便造成皮肤晒伤，而另一部分紫外线穿透力较强，作用于皮肤深层，加速促炎症细胞因子的产生，刺激基质金属蛋白酶的产生，从而加速皮肤中胶原蛋白质基质的降解。因此，如何修复紫外损伤成为了研究的热点问题。
具有紫外照射损伤修复的功能性物质是一种应用前景广阔的护肤品原料，通过为皮肤建立屏障、清除皮肤组织中多余自由基、消除炎症、改变皮肤组成胶原蛋白数量等多种途径缓解、修复紫外损伤。然而，目前市面上常见具有紫外损伤修复功效的物质主要为植物提取物、多糖、透明质酸等。而植物提取物成分复杂，紫外损伤修复活性物质不明确，存在肌肤过敏反应的风险。多糖一方面纯度不能精准控制，也可能伴随提取试剂的残留，较难去除，对皮肤造成刺激风险，另一方面多糖分子量较大(1万-百万Da不等)，存在皮肤渗透率低及吸收效率低问题。透明质酸外用于皮肤上，会激活皮肤中的透明质酸酶，导致过度降解和破坏黏结皮肤组织成分透明质酸，使其刺激加重并导致皮肤组织脱水，结果引起皮肤粗糙、皲裂、形成皱纹和老化。因此，当前市场亟需一种安全性高、纯度可控、易渗透和吸收率高的针对紫外照射后损伤修复的功能性原料。
发明内容
针对当前市场上缺乏安全性高、纯度可控、易渗透和吸收率高的针对紫外照射后损伤修复的功能性原料，本发明提出了一种损伤修复活性肽、核桃肽组合物及其制备方法和应用。损伤修复活性肽和核桃肽是一种植物源活性肽，具有安全性高(可食用)、分子量小、无致敏性、易吸收等优势特点，以损伤修复活性肽和核桃肽为主要原料制备具有晒后损伤修复功能的护肤品可以弥补晒后损伤修复护肤品成分复杂、主要功效成分不明确、安全性差、皮肤透过率低的缺点。
具体来说，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种损伤修复活性肽，其特征在于，由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成：FFPGPS，所述损伤修复活性肽的分子量为740.8062Da。
第二方面，本发明提供了一种核桃肽，其特征在于，包括所述的损伤修复活性肽。
优选的，所述的核桃肽，其特征在于，所述损伤修复活性肽占所述核桃肽的质量百分比为0.3-0.5％；
和/或，所述核桃肽中分子量小于1500Da的肽段占核桃肽的质量百分比超过85％；
优选的，所述核桃肽中分子量在1000Da～1500Da内的肽段占核桃肽的质量百分比超过50％；
进一步优选的，所述核桃肽中分子量小于1000Da的肽段占核桃肽的质量百分比超过35％。
第三方面，本发明提供了一种所述的核桃肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将核桃蛋白质溶解后，添加蛋白酶进行酶解,所述蛋白酶包括碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶；
(2)将酶解液进行过滤，经浓缩干燥得到核桃肽混合物。
优选的，所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(1)中，将核桃蛋白溶解，配制成4～6wt％的核桃蛋白溶液。
优选的，所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(1)中，先添加碱性蛋白酶酶解，后添加木瓜蛋白酶酶解。
优选的，所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(1)中，碱性蛋白酶的添加量为1.0wt％～2.0wt％；优选的，酶解温度为40℃～60℃；进一步优选的，酶解pH为7.0～8.5；更优选的，酶解时间为3h～5.5h。
优选的，所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(1)中，木瓜蛋白酶的添加量为0.5wt％～2.5wt％；优选的，酶解温度为40℃～60℃；进一步优选的，酶解pH为7.5～9.5；更优选的，酶解时间为0.7h～2.5h。
优选的，所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(2)中，对酶解液采用组合膜过滤，所述组合膜为陶瓷膜和超滤膜的组合。
优选的，所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(2)中，浓缩选自反渗透浓缩或单向浓缩中的一种；进一步优选的，浓缩温度为45℃～65℃；更优选的，干燥包括喷雾干燥。
第四方面，本发明提供了一种核桃肽，其特征在于，所述核桃肽通过所述的制备方法制备得到。
第五方面，本发明提供了所述的损伤修复活性肽或所述的核桃肽在制备晒后损伤修复产品中的应用。
优选的，所述的损伤修复活性肽或核桃肽在制备晒后损伤修复产品中的应用，其特征在于，包括在制备护肤品、化妆品和药物中的应用，优选的，包括在制备晒后损伤修复面膜中的应用。
第六方面，本发明提供了一种晒后损伤修复面膜，其特征在于，包括所述的损伤修复活性肽，按重量份计，所述晒后损伤修复面膜包括损伤修复活性肽5-15份，保湿剂1-8份，润肤剂1-3份，增稠剂0.05-0.6份和防腐剂0.05-0.8份。
优选的，所述的晒后损伤修复面膜，其特征在于，所述的保湿剂选自甘油、丁二醇、羟乙基脲和聚甘油-10中一种或两种以上；优选的，所述的润肤剂选自癸酸甘油三酯和硬脂醇中的一种或两种；进一步优选的，所述的增稠剂选自透明汉生胶和羟乙基纤维素中的一种或两种；更优选的，所述的防腐剂选自羟苯甲酯、苯氧乙醇和苯氧乙醇中的一种或两种以上。
第七方面，本发明提供了一种所述的晒后损伤修复面膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将保湿剂、润肤剂和增稠剂混合后加热；
(2)降温后，加入损伤修复活性肽和防腐剂；
(3)过滤得到晒后损伤修复面膜液。
优选的，所述的晒后损伤修复面膜的制备方法，其中，步骤(1)中，加热温度为75-85℃；优选的，步骤(2)中，降温至35-45℃。
第八方面，本发明提供了一种所述的晒后损伤修复面膜的制备方法制备得到的晒后损伤修复面膜。
本发明的有益效果：
损伤修复活性肽和核桃肽是植物源活性肽，具有安全性高(可食用)、分子量小、无致敏性、易吸收等优势特点。相关动物实验研究表明，能显著减轻小鼠皮肤经紫外线照射后出现的溃烂、变红、出血等症状，降低血清炎症、改善Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白质含量、抑制皮肤组织中基质金属蛋白酶活性、增加基质金属蛋白酶抑制因子作用。证明核桃肽具有皮肤紫外损伤修复作用。以此为核心原料，创新开发成具有晒后修复的护肤品原料及其组合物具有广阔的市场需求。
附图说明
图1为实施例2得到的核桃肽粉中肽段相对分子量分布图。
图2为实施例2得到的核桃肽粉中肽段长度分布图。
图3为实施例2得到的核桃肽粉中氨基酸出现频次分布图。
图4为实施例2得到的核桃肽粉中肽段FFPGPS的二级质谱图。
图5为实验例1中损伤修复活性肽面膜对小鼠紫外损伤皮肤的损伤修复效果，图A为空白组；图B为实施例4-1组；图C为实施例4-2组；图D为实施例4-3组；图E为对比例1组；图F为对比例2组；图G为对比例3组；图H为对比例4组。
具体实施方式
如上所述，本发明的目的在于提供一种新的损伤修复活性肽以及提供一种包括损伤修复活性肽的核桃肽，其也具有损伤修复活性，而且本发明核桃肽的制备方法酶解收率更高，得到的肽纯度更高。
本发明所述的损伤修复活性肽是指氨基酸序列为FFPGPS的单链肽。本发明所述的核桃肽是指经过过滤之后的含有上述损伤修复活性肽和其他分子量肽段的混合肽。
本发明的第一个目的是提供一种损伤修复活性肽，所述损伤修复活性肽的氨基酸序列为FFPGPS，分子量为740.8062Da，所述损伤修复活性肽的人工合成方法为：
(1)称取1-1.5g 2-Cl(Trt)-Cl resin树脂放入150mL反应器中，并加入二氯甲烷(DCM)于20-30℃下浸泡30min。
(2)用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤步骤1中树脂，然后抽干，如此重复4次，将树脂抽干。
(3)称取0.1-0.5mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH(C端第一个氨基酸)，DCM和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)加入到反应器中，然后将反应器置于20-30℃的摇床中反应2小时。
(4)用吸管补加0.5mL DIEA，0.5mL乙酸酐，2mL DCM混合试剂(DIEA:MEOH:DCM＝1:1:2)，反应20min，封闭树脂上未反应的基团。
(5)向反应器中加入适量体积比20％的哌啶溶液(哌啶/DMF＝1:4)，为树脂体积的3倍，反应20min，脱去Fmoc保护基团，脱完保护后用DMF洗涤4次，然后抽干。
(6)用长颈吸管取反应器中树脂10～20颗，用茚三酮法检测，树脂有颜色，说明脱保护成功；若不显色，重复脱保护-洗涤-检测操作。
(7)称取0.3-1.5mmol Fmoc-Pro-OH(C端第二个氨基酸)和适量的1-羟基苯并三唑(HOBT)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入到反应器中，然后将反应器置于20-30℃的摇床中反应1小时。
(8)用DMF洗涤树脂，然后抽干，如此重复4次，将树脂抽干。
(9)用长颈吸管取反应器中树脂10～20颗，用茚三酮法检测，若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应；若树脂为无色，说明反应完全。
(10)参照步骤7-9将另外4个氨基酸依次连接到反应树脂上，直到合成结束后，脱除Fmoc，用DMF洗涤4次，最后一次用DCM洗涤，最后把树脂抽干，得到树脂肽。
(11)用三氟乙酸(TFA:TIS(三异丙基硅烷):H2O＝95:2.5:2.5)裂解树脂肽，冰乙醚沉降，收集沉淀，再用冰乙醚洗涤三次；
(12)采用高效液相色谱HPLC纯化，然后冻干即得具有损伤修复功效肽
HPLC纯化条件：
流动相A：超纯水；流动相B：乙腈；色谱柱：C18反相色谱柱( 流速：1ml/min；梯度洗脱方案为0min：95％A+5％B-60min：60％A+40％B。经过HPLC色谱峰分析，收取所需馏分，经纯化后肽纯度可达99％以上。
冻干条件：
采用真空冷冻干燥机，冷阱温度：-60℃；真空度：10Pa；冻干时间：48h。本发明实施例与对比例中使用的各种试剂/仪器，除非另作说明，都是常规市售产品。
本发明的另一个目的是提供一种核桃肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将核桃蛋白溶解后，配制成4～6wt％的核桃蛋白溶液，先添加碱性蛋白酶酶解，然后添加木瓜蛋白酶酶解。碱性蛋白酶的添加量为0.5wt％～2.0wt％，酶解温度为40℃～60℃，酶解pH为7.0～8.5，酶解时间为3h～5.5h。木瓜蛋白酶的添加量为0.5wt％～2.5wt％，酶解温度为40℃～60℃，酶解pH为7.5～9.5，酶解时间为0.7h～2.5h。
(2)将酶解液用组合膜过滤，所述组合膜为陶瓷膜和超滤膜组合过滤的组合，超滤膜孔径为4500-5000Da，陶瓷膜孔径为50nm～60nm。经浓缩干燥得到核桃肽混合物，浓缩选自反渗透浓缩或单向浓缩中的一种，浓缩温度为45℃～65，采用喷雾干燥。
步骤(1)中的核桃蛋白由安琪生物科技有限公司制备，将核桃粕通过碱提酸沉法制备核桃蛋白质。将脱脂核桃粕分散在水中，脱脂核桃粕的质量百分数为6％～12％。加入碱性溶液将溶液的pH调至7.0～10.0。所述碱性溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。将溶液的pH调至7.0～10.0后，在50～70℃温度下反应0.5～6h。分离，得到碱提溶液，加入酸性溶液将溶液的pH调至4～5。所述酸性溶液为柠檬酸溶液。将溶液的pH调至3～5后，在20～60℃下反应0.5h。反应结束后，分离得到重相，洗涤，得到核桃蛋白。
本发明实施例与对比例中使用的各种试剂/仪器，除非另作说明，都是常规市售产品。本发明所用到的实验材料和仪器信息来源如下表1所示：
表1
为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明技术方案进行详细说明。
实施例1核桃蛋白的酶解制备
实施例1-1
核桃蛋白以4.0wt％的比例与水混合，pH调节至7.5，碱性蛋白酶添加量为1.0wt％，在40℃下反应5.5h后，加入0.5wt％木瓜蛋白酶，反应时间为0.7h，得到的酶解液在80℃下保温20min进行灭酶处理，离心，收集沉淀和清液，沉淀用于计算酶解收率，清液即核桃肽，取部分样测酸溶蛋白、游离氨基酸含量，以便于计算肽纯度。
实施例1-2
核桃蛋白以5wt％的比例与水混合，pH调节至8.5，碱性蛋白酶添加量为2wt％，在55℃下反应3h后，加入1.5wt％木瓜蛋白酶，反应时间为1.5h，得到的酶解液在80℃下保温20min进行灭酶处理，离心，收集沉淀和清液，沉淀用于计算酶解收率，清液即核桃肽，取部分样测酸溶蛋白、游离氨基酸含量，以便于计算肽纯度。
实施例1-3
核桃蛋白以6wt％的比例与水混合，pH调节至9.0，碱性蛋白酶添加量为2wt％，在60℃下反应3.5h后，加入2.5wt％木瓜蛋白酶，反应时间为2.5h，得到的酶解液在80℃下保温20min进行灭酶处理，离心，收集沉淀和清液，沉淀用于计算酶解收率，清液即核桃肽，取部分样测酸溶蛋白、游离氨基酸含量，以便于计算肽纯度。
将实施例1中不同酶解工序下的酶解收率进行测定，结果见表2，酶解收率的计算公式如下：
其中，式中m沉淀：离心后，沉淀的质量，单位g；DS沉淀：表示用水分仪测定的沉淀干物质含量(％)；m溶液：酶解液的质量，单位g；DS溶液：表示用水分仪测定的酶解液干物质含量(％)。
肽纯度＝酸溶蛋白含量-游离氨基酸含量
肽纯度又称为肽含量，所述肽含量、酸溶蛋白和游离氨基酸含量的测定参照中华人民共和国国家标准GB/T22492-2008大豆肽粉中的附录B(规范性附录)肽含量的测定方法。
表2各酶解工序条件下核桃蛋白酶解收率及肽纯度
项目 酶解收率/％ 肽纯度/％
实施例1-1 45.35 78.03
实施例1-2 48.66 80.45
实施例1-3 46.39 77.25
综合比较表2各条件下的酶解收率，确定方案1-2的酶解效果最优，酶解收率为48.66％，肽纯度为80.45％。
实施例2：核桃肽的制备
本实施例使用实施例1-2中制备的核桃蛋白酶解液，通过膜组合过滤技术、浓缩干燥设备制备得到核桃肽(分子质量小于5000Da核桃混合肽)，称量得到肽粉干物质总质量。陶瓷膜孔径为50nm，超滤膜孔径为5000Da，浓缩装置为反渗透或单向浓缩，浓缩温度为50℃，浓缩至干物质浓度为20％，干燥装置采用喷雾干燥，浓缩干燥步骤干基收率75.53％，整体干基收率1.85％。
干基收率(％)＝肽粉干物质总质量(g)/超滤透过液干物质总质量(g)
整体干基收率(％)＝肽粉干物质总质量(g)/核桃粕原料干物质总质量(g)
超滤透过液干物质总质量(g)＝超滤透过液干物质含量(％)x超滤透过液总质量(g)
核桃粕原料干物质总质量(g)＝核桃粕原料干物质含量(％)x核桃粕原料总质量(g)
超滤透过液干物质含量(％)和核桃粕原料干物质含量(％)为通过水分测定仪得到。
实施例3：核桃小分子活性肽的鉴定
本实施例采用纳升级液相色谱-Q-EXACTIVE质谱联用系统，对实施例2得到的分子量小于5000Da的混合肽进行肽结构鉴定。取该肽粉40mg于容量瓶中，用纯化水定容至100mL，其浓度为400μg/mL，对该溶液进行纯化、结构鉴定和活性预测，并对鉴定出的肽段进行合成。
色谱条件：流动相A：3体积％二甲基亚砜，96.9体积％超纯水，0.1体积％甲酸；流动相B：3体积％二甲基亚砜，96.9体积％乙腈，0.1体积％甲酸；色谱柱：C18反相色谱柱(Acclaim PepMap RSLC，75μm×25cm C18-2μm流动相梯度程序如下表3所示。
表3洗脱梯度程序
时间 流动相A/％ 流动相B/％
0min 95 5
60min 62 38
利用纳升级液相色谱-Q-EXACTIVE质谱联用，对实施例2中肽段分子量分布情况(见图1)、肽链长度分布情况(见图2)、氨基酸出现频次分布情况(见图3)、肽序列FFPGPS图谱(见图4)进行分析。
由图1可知，制备的核桃肽中分子质量小于1000Da肽段占比35.5％，1000～1500Da肽段占比50.3％，1500～2000Da肽段占比12.6％，大于2000Da肽段占比1.6％。肽段分子量主要分布在1000～1500Da范围内，且小于1500Da的肽段占比超过85％，说明酶解效果较彻底。酶解后肽的分子量最大值为蛋白质分子没有被酶解分成小分子，即蛋白质的原始分子量，肽的分子量最小值为单个氨基酸分子量。
由图2可知，制备的核桃肽中肽段的氨基酸组成数量为7-12个，属于寡肽，大多数寡肽能够直接被肠道吸收利用，且生物活性强。
由图3可知，制备的核桃肽中，精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸含量最高，精氨酸对于保护心血管具有重要作用。而脯氨酸是组成胶原蛋白的特征氨基酸，对皮肤损伤具有一定缓解作用。
在核桃肽中鉴定出一条具有损伤修复功效的肽段，保留时间为45.20min，其结构为FFPGPS，分子量为740.8062Da，FFPGPS肽段的含量占总的肽段含量的质量百分比为0.482％，对应质谱图见图4。通常活性预测得分在0.80以上，预示该物质具有潜在的损伤修复活性。其中，肽段的活性预测采用PeptideRanker在线预测软件进行。
实施例4：损伤修复活性肽晒后损伤修复面膜的制备
实施例4-1
(1)将5％wt甘油、1wt％癸酸甘油三酯、0.05wt％透明汉生胶混匀，加热至80℃，均质，搅拌使其溶解均匀；
(2)降温至40℃，将5％wt损伤修复活性肽和0.05wt％羟苯甲酯原料搅拌均匀，过滤出料，即得损伤修复活性肽面膜液，损伤修复活性肽面膜液余量为水。
将普通面膜无纺布浸泡上述面膜液中，制成5wt％损伤修复活性肽面膜。
实施例4-2
(1)将5wt％羟乙基脲、1wt％硬脂醇、0.5wt％羟乙基纤维素混匀，加热至80℃，均质，搅拌使其溶解均匀；
(2)降温至40℃，将10wt％损伤修复活性肽和0.8wt％苯氧乙醇原料搅拌均匀，过滤出料，即得损伤修复活性肽面膜液，损伤修复活性肽面膜液余量为水。
将普通面膜无纺布浸泡上述面膜液中，制成10wt％损伤修复活性肽面膜。
实施例4-3
(1)将5wt％聚甘油-10、1wt％硬脂醇、0.5wt％透明汉生胶混匀，加热至80℃，均质，搅拌使其溶解均匀；
(2)降温至40℃，将15wt％损伤修复活性肽和0.3wt％羟苯甲酯原料搅拌均匀，过滤出料，即得损伤修复活性肽面膜液，损伤修复活性肽面膜液余量为水。
将普通面膜无纺布浸泡上述面膜液中，制成15wt％损伤修复活性肽面膜。
实施例4-4
(1)将1wt％丁二醇、3wt％自癸酸甘油三酯、0.6wt％羟乙基纤维素混匀，加热至75℃，均质，搅拌使其溶解均匀；
(2)降温至35℃，将5wt％损伤修复活性肽和0.8wt％苯氧乙醇原料搅拌均匀，过滤出料，即得损伤修复活性肽面膜液，损伤修复活性肽面膜液余量为水。
将普通面膜无纺布浸泡上述面膜液中，制成5wt％损伤修复活性肽面膜。
实施例4-5
(1)将8wt％甘油、3wt％硬脂醇、0.5wt％羟乙基纤维素混匀，加热至85℃，均质，搅拌使其溶解均匀；
(2)降温至45℃，将5wt％损伤修复活性肽和0.8wt％苯氧乙醇原料搅拌均匀，过滤出料，即得损伤修复活性肽面膜液，损伤修复活性肽面膜液余量为水。
将普通面膜无纺布浸泡上述面膜液中，制成5wt％损伤修复活性肽面膜。
对比例1
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对比例2
(1)将5wt％羟乙基脲、1wt％硬脂醇、0.5wt％羟乙基纤维素混匀，加热至80℃，均质，搅拌使其溶解均匀；
(2)降温至40℃，将3wt％损伤修复活性肽和0.8wt％苯氧乙醇原料搅拌均匀，过滤出料，即得损伤修复活性肽面膜液，损伤修复活性肽面膜液余量为水。
将普通面膜无纺布浸泡上述面膜液中，制成低浓度损伤修复活性肽面膜。
对比例3
(1)将5wt％羟乙基脲、1wt％硬脂醇、0.5wt％羟乙基纤维素混匀，加热至80℃，均质，搅拌使其溶解均匀；
(2)降温至40℃，将20wt％损伤修复活性肽和0.8wt％苯氧乙醇原料搅拌均匀，过滤出料，即得损伤修复活性肽面膜液，损伤修复活性肽面膜液余量为水。
将普通面膜无纺布浸泡上述面膜液中，制成高浓度损伤修复活性肽面膜。
对比例4
(1)将5wt％羟乙基脲、1wt％硬脂醇、0.5wt％羟乙基纤维素混匀，加热至80℃，均质，搅拌使其溶解均匀；
(2)降温至40℃，加入0.8wt％苯氧乙醇原料搅拌均匀，过滤出料，即得面膜液基础组物质，面膜液基础组物质余量为水。
将普通面膜无纺布浸泡上述面膜液中，制成基础物质面膜。
实验例1将损伤修复活性肽制备成的面膜应用于小鼠紫外损伤皮肤的损伤修复功效的验证实验
将健康小鼠分成8组，依次为空白对照组、实施例4-1组、实施例4-2组、实施例4-3组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组。将各组小鼠背部脱毛，按照各组要求对小鼠使用面膜，其中，空白对照组使用去离子水替代面膜液。大剂量紫外线照射小鼠皮肤，造成小鼠皮肤出现明显溃烂、变红、出现等症状后，将完全吸收面膜液的面膜无纺布分别敷在鼠皮上，15min后取下，持续15d，拍摄小鼠皮肤状态。
从图5可知，与空白对照组(图A)相比，对比例组(图E对比例1组；图F对比例2组；图G对比例3组；图H为对比例4组)4组小鼠皮肤出现溃烂、变红、出血等症状较轻。与对比例相比，实施例组(图B实施例4-1组；图C实施例4-2组；图D为实施例4-3组)3组小鼠皮肤中以上不良症状均有所缓解，且实施例4-2组小鼠皮肤状态最好，说明含有损伤修复活性肽的面膜能有效修复晒后皮肤，改善皮肤状态。
实验例2损伤修复活性肽皮肤透过率实验
1.鼠皮的制备
将试验小鼠断颈处死，清除背部毛发，剥离背部无损伤皮肤，除去皮下脂肪层和结缔组织，生理盐水冲洗。
2.Franz扩散池进行体外透皮吸收试验
将上述鼠皮固定在透皮吸收仪上的扩散池，皮肤表层面向给药室，接受池加入生理盐水作为接受液，分别将相同损伤修复活性肽含量的面膜液(实施例4-2中的面膜液)、损伤修复活性肽水溶液置于供给池中。在0h，3h，6h，9h吸取接受液2ml，并快速补充2ml新鲜接受液，每次排尽皮肤下起泡。测定接受液中损伤修复活性肽的含量，并根据公式计算皮肤累积损伤修复活性肽透过量Q(mg/cm2)(见表4)。
其中，V为接收液体积(15mL)；A为鼠皮有效透皮面积(1.21cm2)；Ci为第i(i≤n-1)个取样点的损伤修复活性肽浓度，共取8个取样点。
表4损伤修复活性肽皮肤累积透过量
由表4可知，损伤修复活性肽试验组小鼠皮肤经过核桃肽累积透过量试验表明，损伤修复活性肽具有较强的皮肤透过性，与损伤修复活性肽水溶液组相比，损伤修复活性肽面膜液中关键活性物质损伤修复活性肽的皮肤累积透过量差异较小，说明面膜液中的损伤修复活性肽较易透过皮肤，损伤修复活性肽与面膜液中其他组分具有协同作用，面膜液中其他组分可以促进损伤修复活性肽的透过率。
实验例3损伤修复活性肽制备成的面膜对小鼠皮肤相关生化指标的评价实验
1.动物分组及面膜的使用
将42只雌性Balb/c小鼠按体重随机分为8组，分别为空白对照组、实施例4-1组、实施例4-2组、实施例4-3组、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4。然后各组背部进行脱毛，大剂量紫外线照射小鼠皮肤，造成小鼠皮肤出现明显溃烂、变红、出现等症状后，按照各组要求对小鼠使用面膜，其中，空白对照组将面膜液替代为等量去离子水，将完全吸收面膜液的面膜无纺布分别敷在鼠皮上，15min后取下。
2.小鼠皮肤组织Ⅰ型胶原蛋白质(Col1)、Ⅲ型胶原蛋白质(Col3)、基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP1)的测定取小鼠背部皮肤，并去除皮下脂肪和结缔组织，加热生理盐水匀浆后，4℃、3000r/min条件下离心10min，取上清液，按照试剂盒说明检测皮肤组织中Col1、Col3、MMP1、TIMP1含量。
3.小鼠血清α肿瘤坏死因子(TNF-α)的测定
取小鼠背部皮肤，并去除皮下脂肪和结缔组织，加热生理盐水匀浆后，4℃、3000r/min条件下离心10min，取上清液，按照试剂盒说明检测小鼠血清中TNF-α含量。
4.试验结果
Ⅰ型胶原蛋白质(Collagen I，Col1)、Ⅲ型胶原蛋白质(Collagen I，Col3)是皮肤真皮层的主体，其中前者占皮肤胶原总量85％，为皮肤提供较强支撑结构和力量，维持皮肤的韧性和硬度。紫外损伤会导致小鼠皮肤MMP-1蛋白降解，胶原蛋白含量减少，也会使小鼠体内氧化应激反应加强，造成胶原合成受阻，降解增加。
基质金属蛋白酶-1(metallo-proteinase-1，MMP-1)、基质金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1)共同调节胶原代谢，维持真皮层的结构，是皮肤松弛衰老的重要指标。MMP-1是降解I型和Ⅲ型胶原最主要的酶，当体内MMP-1过度表达时，特异性降解细胞外基质成分，破坏胶原纤维和弹力纤维的正常结构，真皮层结构由于胶原蛋白的分解而遭到破坏。因此MMP-1是导致皮肤出现皱缩细纹等衰老症状最主要的酶，与TIMP-1共同维持真皮结构。
α肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与正常炎症反应和免疫反应。长期紫外线照射会造成皮肤细胞释放自由基和炎症因子，造成皮肤各种细胞内部结构相互作用，导致细胞和组织损伤。炎症反应被认为是造成紫外线照射光损伤的重要因素。TNF-α是炎症反应中最早出现的炎性因子，因此该指标是紫外损伤修复中的一个重要指标。
从表5中可知，与空白组相比，3组实施例中Ⅰ型胶原蛋白质含量略微上升、Ⅲ型胶原蛋白质含量显著升高，基质金属蛋白酶1、α肿瘤坏死因子含量均显著下降，基质金属蛋白酶抑制因子增加，说明损伤修复活性肽面膜能有效修复晒后皮肤损伤，其中，实施例4-2效果最好。与对比例相比，实施例中5个生理生化指标变化趋势同上述相似。说明损伤修复活性肽作为一种生物活性物质，具有较强的紫外损伤修复功效。
表5各组面膜对小鼠皮肤相关生化指标的影响
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围进行限制，在本发明技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (18)

1.一种损伤修复活性肽，其特征在于，由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成：FFPGPS，所述损伤修复活性肽的分子量为740.8062Da。
2.一种核桃肽，其特征在于，包括权利要求1所述的损伤修复活性肽。
3.根据权利要求2所述的核桃肽，其特征在于，所述损伤修复活性肽占所述核桃肽的质量百分比为0.3-0.5％；
和/或，所述核桃肽中分子量小于1500Da的肽段占核桃肽的质量百分比超过85％；
优选的，所述核桃肽中分子量在1000Da～1500Da内的肽段占核桃肽的质量百分比超过50％；
进一步优选的，所述核桃肽中分子量小于1000Da的肽段占核桃肽的质量百分比超过35％。
4.一种权利要求2或3所述的核桃肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将核桃蛋白质溶解后，添加蛋白酶进行酶解,所述蛋白酶包括碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶；
(2)将酶解液进行过滤，经浓缩干燥得到核桃肽混合物。
5.根据权利要求4所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(1)中，将核桃蛋白溶解，配制成4～6wt％的核桃蛋白溶液。
6.根据权利要求4或5所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(1)中，先添加碱性蛋白酶酶解，后添加木瓜蛋白酶酶解。
7.根据权利要求4-6任一项所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(1)中，碱性蛋白酶的添加量为1.0wt％～2.0wt％；优选的，酶解温度为40℃～60℃；进一步优选的，酶解pH为7.0～8.5；更优选的，酶解时间为3h～5.5h。
8.根据权利要求4-7任一项所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(1)中，木瓜蛋白酶的添加量为0.5wt％～2.5wt％；优选的，酶解温度为40℃～60℃；进一步优选的，酶解pH为7.5～9.5；更优选的，酶解时间为0.7h～2.5h。
9.根据权利要求4-8任一项所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(2)中，对酶解液采用组合膜过滤，所述组合膜为陶瓷膜和超滤膜的组合。
10.根据权利要求4-9任一项所述的核桃肽的制备方法，其中，步骤(2)中，浓缩选自反渗透浓缩或单向浓缩中的一种；进一步优选的，浓缩温度为45℃～65℃；更优选的，干燥包括喷雾干燥。
11.一种核桃肽，其特征在于，所述核桃肽通过权利要求4-10中任一项所述的制备方法制备得到。
12.权利要求1所述的损伤修复活性肽或权利要求2、3或11所述的核桃肽在制备晒后损伤修复产品中的应用。
13.根据权利要求12所述的损伤修复活性肽或核桃肽在制备晒后损伤修复产品中的应用，其特征在于，包括在制备护肤品、化妆品和药物中的应用，优选的，包括在制备晒后损伤修复面膜中的应用。
14.一种晒后损伤修复面膜，其特征在于，包括权利要求1所述的损伤修复活性肽，按重量份计，所述晒后损伤修复面膜包括损伤修复活性肽5-15份，保湿剂1-8份，润肤剂1-3份，增稠剂0.05-0.6份和防腐剂0.05-0.8份。
15.根据权利要求14所述的晒后损伤修复面膜，其特征在于，所述的保湿剂选自甘油、丁二醇、羟乙基脲和聚甘油-10中一种或两种以上；优选的，所述的润肤剂选自癸酸甘油三酯和硬脂醇中的一种或两种；进一步优选的，所述的增稠剂选自透明汉生胶和羟乙基纤维素中的一种或两种；更优选的，所述的防腐剂选自羟苯甲酯、苯氧乙醇和苯氧乙醇中的一种或两种以上。
16.一种权利要求14或15所述的晒后损伤修复面膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将保湿剂、润肤剂和增稠剂混合后加热；
(2)降温后，加入损伤修复活性肽和防腐剂；
(3)过滤得到晒后损伤修复面膜液。
17.根据权利要求16所述的晒后损伤修复面膜的制备方法，其中，步骤(1)中，加热温度为75-85℃；优选的，步骤(2)中，降温至35-45℃。
18.一种权利要求16或17所述的晒后损伤修复面膜的制备方法制备得到的晒后损伤修复面膜。
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