KR20230133672A - 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 인간의 콜라겐 타입 1 알파 1 체인 유래 펩타이드 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환된 숙주세포, 상기 펩타이드를 제조하는 방법, 상기 펩타이드를 이용하여 콜라겐을 제조하는 방법 및 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시키는 활성이 뛰어나며, 이를 활용하여 콜라겐을 대량 생산하는 방법은 기존의 인간 콜라겐 타입 1형을 추출하는 방식과 비교하여 세균이나 바이러스 등의 오염이나 인체 내 면역반응을 회피할 수 있고, 보다 경제적이고 효율적으로 기능성 콜라겐을 대량 생산할 수 있다.

Description

콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법{Peptide with collagen synthesis-promoting activity and methods using the same}
본 발명은 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 인간의 콜라겐 타입 1 알파 1 체인 유래 펩타이드 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포, 상기 형질전환된 세포에서 상기 펩타이드를 수득하는 단계; 를 포함하는 상기 펩타이드를 제조하는 방법, 그리고 상기 펩타이드를 이용하여 콜라겐을 제조하는 방법에 대한 것이다.
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] D2121024
[부처명] 경기도
[연구관리전문기관] (재)경기과학기술진흥원
[연구사업명] 경기도 기술개발사업
[연구과제명] 생체 유사 비건(vegan) 콜라겐 기능성 화장품 소재 개발
[기여율] 20/100
[주관기관] (주)에이바이오테크
[연구기간] 2021.8.1. ~ 2022.7.31.
피부는 표피, 진피, 피하 조직으로 구성되어 이 중 표피는 체온조절 및 외부 환경으로부터 신체 내부를 보호하는 물리적 보호막 기능을 하고, 진피는 표피와 피하지방층 사이에 있는 결합 조직으로 피부에 유연성, 탄력성 및 장력을 제공하며 표피를 구조적으로 지지한다.
피부는 인체의 일차 방어막으로 체내의 제기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부 환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온 조절 등의 생체 항상성 유지에도 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 외부로부터 받는 과도한 물리화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍 등은 피부의 정상적인 기능을 저하시키고, 탄력손실, 각질화, 주름 생성 등의 피부 노화 현상을 촉진시키게 된다.
피부 노화는 일반적인 피부과적 문제이며, 내인성 및 외인성 과정의 영향을 받는다. 내인성 피부 노화는 유전적, 호르몬적 요인에 의해 시간적으로 영향을 받는 생리학적 변화인 반면, 외인성 피부 노화는 만성적 빛이나 화학 물질에의 노출과 같은 환경 및 생활 습관 요인에 의해 영향을 받는다. 이러한 요인들에는 자외선(UV) 노출 후 피부 모양의 변화와 같은 각 피부층의 조직병리학적 및 면역조직화학적 변화가 포함된다. 또한, 내인성 및 외인성 요인 모두 섬유아세포(fibroblasts)에서 엘라스틴 및 콜라겐 합성 수준을 감소시키고, 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 증가시킨다.
콜라겐과 엘라스틴은 피부의 탄력성과 견고성을 모두 유지하는 피부의 구조 단백질이다. 특히, 섬유질 단백질 콜라겐은 피부의 대부분을 구성하고, 조직의 기계적 강도를 유지하는데 기여한다. 콜라겐 분자는 단단한 삼중 나선으로 함께 감긴 3개의 사슬로 구성되어 있다. 모든 세번째 아미노산은 나선 내부에 완벽하게 맞는 글라이신(glycine)이다. 삼중 나선은 주로 글라이신(glycine), 프롤린(proline), 알라닌(alanine)으로 구성된다.
콜라겐은 인체에서 가장 흔하게 발견되는 단백질로 포유류에서 가장 많은 단백질이어서 전체 단백질의 약 25-35%를 차지한다. 특히 뼈, 힘줄, 인대를 구성하는 주요한 성분이며, 주로 장기의 구조를 유지하는 역할을 한다. 그러나, 콜라겐의 체내 생성량은 연령에 따라 감소하게 되는데, 20대에 콜라겐 생성량이 최대이며, 40대는 70% 수준으로 생성되고 이후 급격히 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 노화가 진행될수록 식품 등으로부터 섭취 및 흡수를 통한 콜라겐 보충이 필요하다.
한편, 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblasts; HDGFs)의 이동은 피부 상처 치유 및 리모델링에 필수적이다. 인간 피부 섬유아세포의 증식은 상처층으로의 이동을 유발하여 근 섬유아세포에서 두꺼운 액틴 다발의 발현과 새로운 세포외 기질(ECM)의 합성을 유발한다. 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factors; FGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor; HGF), 형질전환 성장 인자 베타 1(tansforming growth factor-β1; TGF-β1), 표피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor; PDGF) 및 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor; IGF)가 섬유아세포의 운동성과 직간접적으로 연관되어 있는 것으로 알려져 있다.
인간에서 가장 풍부한 유형의 콜라겐인 콜라겐 타입 1형은 뼈(유기질량의 90% 이상), 힘줄, 인대, 각막 및 많은 간질성(interstitial) 결합 조직에서 지배적인 구조 단백질이다. 다른 유형의 콜라겐은 폴리텝티드 사슬의 1차 아미노산 서열이 다르다. 구조적으로 타입 1형 콜라겐은 2개의 동일한 α-1 타입 1형 사슬과 α-2 타입 1형 사슬이 삼중 나선 구조로 구성되어 있다.
종래의 인간 콜라겐 타입 1형의 경우에는 인간 탯줄 유래나 지방 유래 콜라겐을 주로 생산하였으나, 고비용의 생산 단가이거나 병원체의 감염 우려를 가지고 있는 문제점이 있다. 또한, 포유동물 세포주의 발현계는 생산량이 낮고 특정 세포 유형의 제약을 받는다. 현재 휴먼 콜라겐을 코딩하는 유전자를 가진 배큘로바이러스(baculovirus) 발현계가 이미 구축되어 있으나(미국 특허 제5,077,214호 및 제5,593,859호), 형질감염을 거친 곤충 세포는 72시간 내에 사망하므로 일시적인 재조합 단백질 콜라겐만 생산된다. 그 외, 세포용해작용으로 인하여 재조합 콜라겐을 회수하거나 정제하기가 상당히 어렵고, 배큘로바이러스의 소포체 또는 골지체에 대한 파괴는 콜라겐의 생산을 더욱 제한하는 문제점이 있다. 따라서, 인간의 콜라겐 타입 1형을 보다 효과적으로 생산할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 인간의 콜라겐 타입 I 알파 1 체인(human collagen type 1 alpha 1 chain, hCOL1A1) 단백질의 특정한 단편이 콜라겐 합성을 촉진하는 활성이 뛰어날 뿐 아니라, 엘라스틴 생성 및 세포 이동성 촉진의 활성이 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
(1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 배양된 형질전환된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포합하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 배양된 형질전환된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포합하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 인간의 콜라겐 타입 1 알파 1 체인 (human collagen type 1, alpha 1 chain, hCOL1A1) 단백질의 특정한 단편인 SME 단편(hCLO1A1-CED)에 콜라겐 합성을 촉진하는 활성이 있음을 발견하였다. hCOL1A1 단백질을 임의로 나눈 N(hCOL1A2의 162-698 aa; aa는 amino acid의 약자), M(439-958 aa), C(699-1218 aa)단편을 제조하여, 콜라겐을 합성하는 세포인 인간 피부섬유아세포에 처리한 결과, N, M, C 단편이 모두 전장 hCOL1A1 단백질보다 우수하게 콜라겐 합성을 촉진하는 것을 확인하였으며, 그 중에서도 M 및 C 단편이 높은 수준으로 콜라겐 합성을 촉진하는 것을 확인하였다. 특히, M 단편이 가장 높은 수준으로 콜라겐 합성을 촉진하는 것을 확인하였다.
또한, M 단편에 대해서 동일한 분석을 실시한 결과, M 단편을 다시 임의로 구분하여 특정한 SMA(hCOL1A1의 440-880 aa), SMB(hCOL1A1의 439-698 aa), SMC(hCOL1A1의 700-958 aa), SMD(hCOL1A1의 743-958 aa), SME(hCOL1A1의 743-880 aa)의 5개 단편이 모두 음성대조군에 비하여 우수하게 콜라겐 합성을 촉진함을 확인하였으며, SME 단편(hCLO1A1-CED)이 콜라겐 합성을 촉진하는 효과가 가장 현저한 것으로 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 서열번호 1의 아미노산 서열, 즉 SME 단편(hCLO1A1-CED)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에는 피부섬유아세포 등 콜라겐을 자연적으로 합성하는 세포에서 콜라겐 합성을 더욱 촉진하는 활성이 존재하는 것을 밝힌 것이다. 이러한 콜라겐 합성 촉진 활성은 의약품과 기능성 식품, 화장품 등 다양한 분야에서 원료로 널리 사용되는 콜라겐을 대량 생산하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 본 명세서에서 “콜라겐 타입 1 알파 1 체인(collagen type 1 alpha 1 chain, COL1A1) 단백질”은 특히, 인간에서 유래된 것을 의미하는 것으로서, 본 명세서에서는 hCOL1A1로 표기하며, 인간 유전자 COL1A1에 암호화되어 있는 단백질을 의미한다. 콜라겐 타입 1 알파 2 체인(collagen type 1 alpha 2 chain, COL1A2)과 함께 인체에서 가장 높은 함유량을 보이는 삼중 나선 구조의 콜라겐 타입 1형(또는 제1형 콜라겐)을 구성한다. 콜라겐 타입 1형은 콜라겐 섬유(collagen fiber)를 형성하며, 상처 치유 과정으로 생기는 흉터 조직에 존재하며, 인대, 힘줄, 골격, 치아 상아질 등의 주요 구성성분이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다. 본 발명자들이 밝힌 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드는 콜라겐 합성을 향상시키는 새로운 기능을 발휘한다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하면서 추가로 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 9의 아미노산 서열 내의 연속하는 138개 내지 1056개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 9의 아미노산 서열 내의 연속하는 138개 내지 780개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 9의 아미노산 서열 내의 연속하는 139개 내지 520개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 9의 아미노산 서열 내의 연속하는 139개 내지 1056개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 9의 아미노산 서열 내의 연속하는 139개 내지 780개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 9의 아미노산 서열 내의 연속하는 139개 내지 520개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
바람직하게는 SME 단편(hCLO1A1-CED)을 포함하는 M 단편 또는 C 단편의 서열인 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열목록의 아미노산 서열은 별도의 표시가 없더라도 아미노 말단(N-terminal)으로부터 카르복시 말단(C-terminal)의 방향으로 기재된 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드는 콜라겐 합성 촉진 활성뿐 아니라, 세포 성장 및 세포 이동을 촉진하는 활성도 있다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드를 대장균에서 과발현하여 제조하고, 분리정제하여 인간 피부섬유아세포에 처리하면, 세포생존률이 증가함을 확인하여 세포 성장이 촉진되는 것을 MTT 어세이를 이용하여 확인하였다. 나아가, 상기 펩타이드를 처리한 인간 각질형성세포(keratinocyte)인 HaCaT 세포의 세포 이동이 증가되는 것을 트랜스웰 이동 분석으로 확인하였으며, 상기 펩타이드를 처리한 인간 각질형성세포와 인간 피부섬유아세포의 세포 이동이 증가하는 것을 상처 회복 분석(wound-healing assay)으로 확인하였다.
이른바, 본 발명에 따른 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시킬 뿐 아니라, 세포 성장인자로서 그리고 세포 이동성 증가 인자로서의 활성도 가지는 등 다양한 세포 내 기능을 촉진시키는 활성을 갖는 것이다.
이에 따라, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환되거나, 분리정제된 펩타이드를 처리한 인간 피부섬유아세포에서는 콜라겐 합성 수준이 음성대조군(아무 처리하지 않은 피부섬유아세포)과 비교하여 콜라겐 합성 수준이 증가한 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 조성물은 세포 내 콜라겐을 효과적으로 촉진하는 용도로 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
상기 조성물이란, 순수하게 본 발명에 따른 펩타이드만을 버퍼 등의 용매에 포함하는 용액일 수도 있고, 펩타이드를 안정화하기 위한 다른 첨가물이나, 유사한 활성을 갖는 인자, 보조 인자 등을 추가로 포함한 것일 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현하는 세포를 용해시킨 세포 용해물일 수도 있다.
또한, 본 발명의 조성물에 따라 합성이 촉진되는 콜라겐은 인간 유래의 콜라겐, 특히 콜라겐 타입 1인 것이 바람직하지만, 본 발명의 목적인 합성 수준의 촉진이라는 목적이 달성되는 한, 여기 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는 본 발명의 실시예에서는 인간 섬유아세포의 배양 상층액에서 콜라겐 타입 1의 프로콜라겐 C-펩타이드를 표적으로 하여 콜라겐 합성 수준을 측정하였다.
또한, 상기 세포란 콜라겐을 합성할 수 있는 능력을 가진 세포로서, 자연적으로 콜라겐을 합성할 수 있는 섬유아세포, 골아세포(osteoblast), 조연골아세포(chondroblast) 등의 세포일 수도 있고, 일반적으로 콜라겐을 합성하지는 않지만, 유전공학적으로 콜라겐을 합성하도록 형질전환된 세포일 수도 있다.
본 명세서에서 콜라겐의 합성이란, 콜라겐 유전자의 전사, 단백질로의 발현뿐 아니라, 콜라겐 섬유로서 기능적인 구조 및 아미노산의 변형을 거치는 성숙 단계를 모두 포함하는 의미이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것으로서, 상기 서열번호의 염기서열은 서열번호 1의 아미노산 서열, 더 구체적으로는 본 발명자들이 특정한 hCOL1A1 단백질의 SME 단편(hCLO1A1-CED)의 아미노산 서열을 암호화하는 것이다. 본 명세서에 기재된 서열목록의 염기서열은 별도의 표시가 없더라도 5’ 말단으로부터 3’ 말단의 방향으로 기재된 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 재조합(recombinant)은 유전자 조작(genetic manipulation)과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.
본 발명에서 발현(expression)은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에서 재조합 발현 벡터란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 작동가능하게 연결된(operably linked)이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 발현조절서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(pPICZ, YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, pcDNA3.1 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 pET-28(+) 벡터를 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다. 바람직하게 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 서열번호 10의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명에 다른 숙주 세포는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫(rat) 세포, 마우스 (mouse) 세포, 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
가장 바람직하게는 콜라겐을 합성할 수 있는 진핵세포이거나, 일반적으로 단백질을 과발현하도록 형질전환하여 사용되는 대장균 등의 원핵세포일 수 있다. 상기 콜라겐을 합성할 수 있는 세포는 앞서 설명한 바와 같다. 나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드가 발현되는지 여부를 인간 피부섬유아세포에서 분석하였고, 대량 생산 및 분리정제하기 위하여 대장균에서 과발현을 유도하였는데, 이 때 특히 Escherichia coli Rosetta2 (DE3) 대장균을 사용하였다.
본 발명에 따른 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현 또는 대량으로 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
(2) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 배양된 형질전환된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 제1항의 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 (1) 단계는 본 발명에 따른 펩타이드를 생산하기 위한 숙주세포를 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계이다. 재조합 발현 벡터는 앞서 설명한 바와 같으며, 바람직하게는 pET-28a(+) 벡터를 이용할 수 있다.
선택가능한 숙주세포로는 앞서 설명한 바와 같으며, 통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 적절한 형질전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 숙주세포는 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 제한없이 선택할 수 있지만, 본 발명을 실시하게 위해서는 상기 숙주세포는 콜라겐을 생성하는 섬유아세포 또는 단백질 과발현을 위한 대장균이 바람직하다.
포유동물 세포주, 곤충 세포주, 형질전환 동물 등의 경우에는 생산량이 낮고 특정 세포 유형의 제약을 받거나 일시적으로만 재조합 콜라겐 단백질이 생산되고, 형질전환 동물(예를 들어 누에 또는 쥐) 및 형질전환 식물(예를 들어 담뱃잎)은 콜라겐 산물이 과도하게 교차 결합하여 회수 자체나 분리정제가 어려울 수 있다. 따라서 대장균(Escherichia coli, E. coli)을 이용할 경우에는 인간 탯줄 유래나 포유 동물 세포 등에 비해서 높은 생산량을 보이면서 기존 동물성 콜라겐에 세균이나 바이러스와 같은 오염을 유발 및 면역반응이 없는 장점이 있다.
나아가, 대장균을 숙주세포로 사용하면 동물세포를 숙주세포로 사용할 경우 발생할 수 있는 세균이나 바이러스 등 병원체에 의한 오염, 인체 내 면역반응 유발 등의 문제점을 피할 수 있으며, 높은 생산 비용을 절감하는 효과도 있다.
상기 (2) 단계는 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 본 발명에 따른 펩타이드가 과발현 또는 생산되도록 하는 단계이다. 통상의 기술자는 선택한 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등을 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포에서 생산되는 펩타이드는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화(targeted) 되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 펩타이드가 구조 등 성질을 유지하거나 향상시키도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩(refolding)시키고 기능성 구조(conformation)를 갖도록 할 수 있다.
상기 (3) 단계는 숙주세포에서 생산된 펩타이드를 수득하는 단계이다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩타이드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 펩타이드는 숙주세포를 배양한 배지(상등액)를 수득하고, 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 펩타이드를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 펩타이드를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 펩타이드의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 펩타이드는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현하는 숙주세포의 파쇄물 또는 용해물을 원심분리하여 얻어지는 상등액을 취하는 방법으로 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
(2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계; 및
(3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 (1) 단계는 본 발명에 따른 펩타이드로 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계이다. 상기 단계는 본 발명에 따른 펩타이드의 순수하게 분리정제된 형태로 사용할 수도 있고, 적절한 용매 및 보조인자를 포함하는 용액 형태로 사용할 수 있으며, 나아가 본 발명에 따른 펩타이드를 과발현하는 세포의 용해물일 수도 있다. 이와 같이 다양한 상태 또는 형태의 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포의 외부에 처리하여 상기 펩타이드가 세포의 외부에 접촉하도록 할 수도 있고, 또는 펩타이드가 세포의 내부로 도입되도록 할 수도 있다. 통상의 기술자는 세포 내 펩타이드를 전달하기 위하여 당해 기술분야에서 널리 이용되는 방법, 예를 들어, 미세관을 이용한 주입이나 펩타이드 형질전환(peptide transfection) 등을 제한없이 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 나아가, 콜라겐 합성능을 갖는 세포가 직접 본 발명에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 재조합 발현 벡터로 콜라겐 합성능을 갖는 세포를 형질전환할 수 있다.
본 명세서의 실시예에 설명된 바와 같이, 피부섬유아세포는 본 발명에 따른 펩타이드를 발현하도록 형질전환되거나, 본 발명에 따른 펩타이드를 분리정제하여 세포 외부에 처리한 경우 모두 콜라겐 합성 수준이 크게 향상된다는 발견에 기반한 것이다.
콜라겐 합성능을 갖는 세포에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 콜라겐 합성능을 갖는 세포가 본 발명에 따른 펩타이드의 자극을 받으면 세포 내 콜라겐 합성이 크게 촉진되는 효과가 있다. 상기 접촉은 일시적이거나, 몇 시간 동안 지속되는 것일 수도 있고, 또는 펩타이드를 수득하는 (3) 단계에 이르기까지 계속되는 것일 수도 있다. 통상의 기술자라면 적절한 시간과 농도를 선택하여 실시할 수 있다.
상기 (2) 단계는 본 발명에 따른 펩타이드와 접촉한 세포가 콜라겐을 합성할
수 있도록 배양하는 단계이다. 콜라겐의 유전자가 전사되고, 단백질로 발현되어 삼중 나선 구조 형태의 콜라겐 섬유로 성숙하는 시간을 주는 것이다.
상기 (3) 단계는 세포에서 합성된 콜라겐을 수득하는 방법이다. 세포에서 펩타이드를 수득하는 방법에 대하여서는 앞서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시킬 뿐 아니라, 세포 성장인자로서 그리고 세포 이동성 증가 인자로서의 활성도 가지는 등 다양한 세포 내 기능을 촉진시키는 활성을 가짐으로써 피부 재생 및 노화 방지 효과가 뛰어나며, 이를 함유한 화장료 조성물은 우수한 보습 효과와 피부진정 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 피부보호용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코 시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 피부 상태 개선 효과는 항산화 활성, 세포 활성 증진 효과, 콜라겐 합성 효과 및 콜라겐분해효소 활성 억제 효과와 보습 및 피부 진정 효과를 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 인간의 콜라겐 타입 1 알파 1 체인 유래 펩타이드 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환된 숙주세포, 상기 펩타이드를 제조하는 방법, 상기 펩타이드를 이용하여 콜라겐을 제조하는 방법 및 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 증가시키는 활성이 뛰어나며, 이를 활용하여 콜라겐을 대량 생산하는 방법은 기존의 인간 콜라겐 타입 1형을 추출하는 방식과 비교하여 세균이나 바이러스 등의 오염이나 인체 내 면역반응을 회피할 수 있고, 보다 경제적이고 효율적으로 기능성 콜라겐을 대량 생산할 수 있다.
도 1은 콜라겐 생성 촉진 평가를 위한 전장 hCOL1A1 사슬 단백질 및 hCOL1A1 사슬 단백질의 각 도메인(단편)의 모식도를 나타낸 도이다. 각 단편의 이름 및 해당 아미노산 서열 부위는 도면에 표시된 바와 같다.
도 2는 전장 hCOL1A1 사슬 단백질 및 hCOL1A1 사슬 단백질의 각 도메인의 발현 정도 및 콜라겐 합성 촉진 정도를 비교한 실험 결과를 나타낸 도이다. 도 2의 A는 전장 hCOL1A1(FL), hCOL1A1의 N, M, C 도메인의 발현을 확인한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 2의 B는 전장 hCOL1A1 사슬 단백질 및 hCOL1A1 사슬 단백질의 N, M, C 도메인을 처리한 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 합성 정도를 비교한 바 그래프이다. NC는 음성대조군(pcDNA3.1-HA), FL은 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(162-1218 aa), N은 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(162-698 aa), M은 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(439-958 aa), C는 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(699-1218 aa)을 나타낸다. *는 p < 0.05, **는 p < 0.005를 나타낸다.
도 3은 hCOL1A1 사슬 단백질의 M 도메인 단편들의 발현 정도 및 콜라겐 합성 촉진 정도를 비교한 실험 결과를 나타낸다. 도 3의 A는 hCOL1A1 사슬 단백질의 M 도메인의 단편인 SMA, SMB, SMC, SMD 및 SME의 발현을 확인한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 3의 B는 상기 도메인을 처리한 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 합성 정도를 비교한 바 그래프이다. NC는 음성대조군(pcDNA3.1-HA), SMA는 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(440-880 aa), SMB는 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(439-698 aa), SMC는 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(700-958 aa), SMD는 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(743-958 aa), SME는 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(743-880 aa)를 나타낸다. *는 p < 0.05, **는 p < 0.005를 나타낸다.
도 4는 hCOL1A1 사슬 단백질의 SME 단편(743-880 aa)을 제조하기 위한 플라스미드 제작과 단백질 발현 실험 결과를 나타낸 도이다. 도 4의 A는 SME 단편을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터(pET-28a(+)-hCOL1A1)의 모식도를 나타낸다. 도 4의 B는 대장균(Escherichia coli Rosetta2)에서의 SME 단편의 발현 양상을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. SM은 단백질 사이즈 마커, 1번 레인은 IPTG를 통해서 재조합 단백질을 유도하지 않은 전체 세포 용해물(cell lysate), 2번 레인은 IPTG를 통해서 제조한 단백질을 유도한 전체 세포 용해물(cell lysate), 3번 레인은 IPTG를 통해서 제조한 단백질을 유도한 전체 세포 용해물(cell lysate)에 초음파 처리를 한 후 수득한 상층액, 4번 레인은 3번 레인의 상층액을 His-binding 칼럼으로 정제한 단백질을 각각 로딩한 결과를 나타낸다.
도 5는 액체 크로마토그래피-질량 분석에 의해 분리된 SME 단편(hCOL1A1-CED)의 겔 밴드에서 hCOL1A1-CED 단백질의 식별 결과를 나타낸다. 패널은 GESGPSGPAGPTGAR (1297.61724 m/z, 2+)의 확인된 펩타이드에 대한 대표적인 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 피부섬유아세포에서 SME 단편(hCOL1A1-CED)에 의한 콜라겐 합성 촉진효과를 확인한 실험 결과를 나타낸다. 도 6의 A는 SME 단편(hCOL1A1-CED), EGF, TGF-β1 및 비타민 C(vitamin C) 각각의 시료에 의한 피부섬유아세포의 콜라겐 합성량을 비교한 그래프이다. 도 6의 B는 피부섬유아세포에 SME 단편(hCOL1A1-CED)을 1μg/ml 또는 10 μg/ml의 각각 다른 농도로 처리한 경우와 TGF-β1을 처리한 경우의 Col1a1의 mRNA 수준을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 SME 단편(hCOL1A1-CED)의 단백질 세포 성장인자 활성을 분석하기 위한 피부섬유아세포에서의 MTT assay 결과를 나타낸다.
도 8은 hCOL1A1 사슬 단백질의 SME 단편(hCOL1A1-CED)의 HeCaT세포의 이동성(mobility)에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험 결과를 나타낸다. 도 8의 A는 HeCaT 세포에 SME 단편(hCOL1A1-CED), TGF-β1 또는 EGF로 처리한 후 트랜스웰 이동 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 면적은 Image J를 사용하여 측정하였다. 도 8의 B는 피부섬유아세포에 SME 단편(hCOL1A1-CED)을 1μg/ml 또는 10 μg/ml의 다른 농도, TGF-β1 또는 EGF로 처리한 후 상처 치유 분석(wound-healing assay)을 수행한 결과를 나타낸다.
도 9는 피부섬유아세포에 SME 단편(hCOL1A1-CED)을 1μg/ml 또는 10 μg/ml의 다른 농도, TGF-β1 또는 EGF로 처리한 후 엘라스틴 합성량을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 전장 hCOL1A1 사슬 단백질 및 hCOL1A1 사슬 단백질 내 도메인 단편 플라스미드 발현 벡터의 제조
인간의 hCOL1A1 사슬 단백질 내에 존재하는 특정 도메인(단편)에 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 효과가 있는지, 나아가 콜라겐 촉진 정도가 단편에 따라 다른지 여부를 확인하기 위하여, hCOL1A1 사슬 단백질 내 도메인(단편)을 특정하고, 이를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하여 각각의 단편을 제조하였다. 본 실시예에서 특정하고 재조합 발현 벡터에 삽입한 단편은 도 1에 도시된 바와 같다.
먼저 에피토프 매핑(epitope mapping) 및 시험관 내 전사/번역(in vitro transcription/translation) 실험을 위한 플라스미드 DNA 클로닝(plasmid DNA cloning)을 수행하였다.
구체적으로, 각각의 hCOL1A1 플라스미드 DNA 벡터를 주형(template)으로 하여, Pfu DNA 중합효소로 PCR을 수행하였다(PCR 사이클: 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 55초의 반응을 30회 반복). 전장 hCOL1A1 사슬 단백질(FL, 162-1218 aa, aa는 amino acids의 약자), hCOL1A1 N-말단 단편(N, 162-698 aa), hCOL1A1 중간 단편(M, 439-958 aa), hCOL1A1 C-말단 단편(C, 699-1218 aa), hCOL1A1 작은 중간 단편 A(SMA, 440-880 aa), hCOL1A1 작은 중간 단편 B(SMB, 439-698 aa), hCOL1A1 작은 중간 단편 C(SMC, 700-958 aa), hCOL1A1 작은 중간 단편 D(SMD, 743-958 aa), hCOL1A1 작은 중간 단편 E(SME, 743-880 aa)을 PCT 타겟(Target)으로 하였다. 각각 증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 정제 키트(geneall, 한국)를 이용하여 정제 분리하였다. 그런 다음, pcDNA3.1-HA 벡터와 PCR 산물을 제한효소 Hind III과 Not I으로 절단 후, 연결하고(ligation), 형질전환(transformation)한 후, 암피실린 LB 아가(ampicillin LB agar) 플레이트에 스프레딩(spreading)하였다. 단일 클론(single clone)에서 DNA를 추출하고 시퀀싱(sequencing)을 수행하여, 목적한 플라스미드 DNA 벡터가 맞는지 확인하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열은 다음의 표 1에 나타낸 바와 같다.
PCR Target 프라이머 방향 염기 서열(5' → 3') 서열 번호
FL
　		 forward ACGAAGCTTCAGCTGTCTTATGGCTAT 13
reverse TCGAGCGGCCGCAGCCCGGTAGTAGCGGCC 14
N
　		 forward ACGAAGCTTCAGCTGTCTATGGCTAT 15
reverse TCGAGCGGCCGCCCCTCGGGGACCAGCAGG 16
M
　		 forward ACGAAGCTTCCTGGCAGCAAAGGAGAC 17
reverse TCGAGCGGCCGCACGCTGTCCAGAATACC 18
C
　		 forward ACGAAGCTTGCCAACGGTGCCCCGGC 19
reverse TCGAGCGGCCGCAGCCCGGTAGTAGCGGCC 20
SMA
　		 forward CTGAAGCTTGCGGCAGCAAAGGAGACA 21
reverse CCGGCGGCCGCAGCAGCACCAGGGAAA 22
SMB
　		 forward ACGAAGCTTCCTGGCAGCAAAGGAGAC 23
reverse TCGAGCGGCCGCCCCTCGGGGACCAGCAGG 24
SMC
　		 forward ACGAAGCTTGCCAACGGGCTCCCGGC 25
reverse TCGAGCGGCCGCACGCTGTCCAGCAATACC 26
SMD
　		 forward CAGAAGCTTGCGGTGACAGAGGTGATG 27
reverse CCGGCGGCCGCACGCTGTCCAGCAATA 28
SME
　		 forward ATGGGTCGCGGATCCGGTGACAGAGGT 29
reverse CTCGAGTGCGGCCGCAGCAGCACCAGG 30
실시예 2: 전장 hCOL1A1 사슬 단백질 및 hCOL1A1 사슬 단백질 내 N, M, C 도메인 단편의 콜라겐 생성 촉진 효과 비교
실시예 1에서 특정한 hCOL1A1 사슬 단백질 내 N, M, C 도메인 단편들이 전장 hCOL1A1 사슬 단백질과 비교하였을 때 세포 내 콜라겐 합성을 촉진하는 효과가 우수한지 여부를 확인하기 위하여, 콜라겐을 생성하는 세포인 인간 피부섬유아세포를 전장 hCOL1A1 사슬 단백질, hCOL1A1 사슬 단백질 내 N, M, C 단편을 각각 발현하는 플라스미드로 형질전환시키고, 단백질 발현 여부를 확인하였다. 또한, 전장 단백질 또는 각 단편의 단백질을 발현하는 형질전환 세포의 배지 상층액을 취하여 콜라겐 합성량의 변화를 측정하였다.
<2-1> 인간 피부섬유아세포의 형질전환
인간 피부섬유아세포(human dermal fibroblast; HDF, ATCC, USA)를 10%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, ThermoFisher), 2 mM의 L-글루타민(L-glutamine, Sigma), 100 IU/mL의 페니실린(penicillin) 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin, Sigma)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 배양하였다. 인간 피부섬유아세포를 웰 플레이트(well plate)에 접종(seeding)한 후, 세포 부착과 환경 적응을 위해 24시간 동안 인큐베이터(incubator)(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 다음 날, 각각 pcDNA3.1-HA(음성대조군), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(162-1218 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(162-698 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(439-958 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(699-1218 aa)의 플라스미드 2 ug을 TurboFect transfection Reagent (Thermo Scientific)를 이용하여 형질전환(transfection)을 진행하였다.
<2-2> 형질전환된 피부섬유아세포에서의 전장 hCOL1A1 사슬 단백질 및 hCOL1A1 사슬 단백질 내 N, M, C 도메인 단편의 발현 확인
형질전환된 피부섬유아세포의 각 단백질 발현 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 다음과 같이 수행하였다.
상기 실시예 2-1의 pcDNA3.1-HA(NC, 음성대조군), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(FL, 162-1218 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(N, 162-698 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(M, 439-958 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(C, 699-1218 aa) 각각의 플라스미드로 형질전환된 세포를 형질전환 48시간 후 수확하고, 핵 추출 완충액(20mM HEPES [pH 7.6], 20% 글리세롤, 250mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 1mM PMSF, 1mM DTT, 및 단백질 억제제 칵테일 [Roche])에 4℃ 상태로 풀어 놓고 원심분리하여 상층액을 단백질 추출액으로 준비하였다. 단백질 양은 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 표준으로 하여 Bradford assay(BioRad)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 6 내지 15% Gradient SDS-PAGE 젤을 만들어서 섬유아세포 30 ug을 로딩한 후 PVDF membrane에 transfer를 진행하였다. 1XPBST+5% skin milk buffer로 1시간 동안 blocking을 진행하였다. α-Tubulin (B-7)(sc-52861; Santa Cruz) 및 HA-HRP(F-7)(sc-7392; Santa Cruz) 1차 항체는 5% skim milk, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS에 희석시켜서 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 15분씩 3차례 세척하였다. Blocking solution으로 1：5,000배로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-IgG 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 3차례 세척하고 발색은 ECL hyperfilm으로 확인하였다.
그 결과, 도 2의 A에 나타난 바와 같이, 전장 hCOL1A1 사슬 단백질, hCOL1A1사슬 단백질의 N, M, C 단편 단백질 모두 인간의 피부섬유아세포에서 잘 발현된 것을 확인하였다.
<2-3> 전장 hCOL1A1 사슬 단백질 및 hCOL1A1 사슬 단백질 내 N, M, C 도메인 단편의 콜라겐 생성 촉진 효과 확인
형질전환된 피부섬유아세포에서 hCOL1A1 사슬 단백질 및 hCOL1A1 사슬 단백질 내 N, M, C 도메인 단편의 콜라겐 생성 촉진 효과를 비교하기 위하여 하기와 같이 콜라겐 합성량의 변화를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-1의 pcDNA3.1-HA(NC, 음성대조군), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(FL, 162-1218 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(N, 162-698 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(M, 439-958 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(C, 699-1218 aa) 각각의 플라스미드로 형질전환된 세포를 48시간 동안 배양한 후, 세포 배양 배지를 수집하고, 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 후 배지의 상층액을 취하여 합성된 콜라겐 타입 1형을 정량하였다. 콜라겐 타입 1형의 정량은 ELISA 키트(Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 사용하여 제조사의 권장 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 표 2와 도 2의 B에 나타난 바와 같이, 각각의 형질전환된 피부섬유아세포를 배양한 배지 상층액에서 합성된 콜라겐 타입 1형을 정량한 결과, 음성대조군(NC)과 비교하여 모든 실험군에서 콜라겐 타입 1형의 합성량이 증가하였으며, 특히 중간 부분에 해당하는 M 단편이 다른 부분보다 콜라겐의 생성을 우수하게 촉진하는 것을 확인하였다.
실시예 3: hCOL1A1 사슬 단백질 내 SMA, SMB, SMC, SMD, SME 도메인 단편의 콜라겐 생성 촉진 효과 비교
상기 실시예 2-3에서 콜라겐 합성 촉진 효과가 우수한 것으로 확인된 hCOL1A1 사슬 단백질의 M 단편에 대하여, 콜라겐 합성 촉진 기능을 하는 펩타이드 부위를 더욱 특정하기 위하여 M 단편을 SMA(hCOL1A1의 440-880 aa), SMB(hCOL1A1의 439-698 aa), SMC(hCOL1A1의 700-958 aa), SMD(hCOL1A1의 743-958 aa), SME(hCOL1A1의 743-880 aa)로 더욱 세분화하여 분석하였다.
<3-1> 인간 피부섬유아세포의 형질전환
인간 피부섬유아세포를 pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(SMA, 440-880 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(SMB, 439-698 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(SMC, 700-958 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(SMD, 743-958 aa), pcDNA3.1-HA-hCOL1A1(SME, 743-880 aa) 플라스미드 발현 벡터를 이용하여 실시예 2-1과 동일한 방법으로 형질전환하였다.
<3-1> 형질전환된 피부섬유아세포에서의 hCOL1A1 단백질 내 SMA, SMB, SMC, SMD, SME 도메인 단편의 발현 확인
상기 실시예 3-1에서 형질전환된 피부섬유아세포의 각 단백질 발현 여부를 확인하기 위하여 항체로 α-Tubulin 대신 β-actin을 사용한 것 외에는 실시예 2-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 도 3의 A에 나타낸 바와 같이, hCOL1A1 단편 단백질 모두 인간의 피부섬유아세포에서 잘 발현된 것을 확인하였다.
<3-3> hCOL1A1 단백질 내 SMA, SMB, SMC, SMD, SME 도메인 단편의 콜라겐 생성 촉진 효과 확인
형질전환된 피부섬유아세포에서 hCOL1A1 단백질 내 SMA, SMB, SMC, SMD, SME 도메인 단편의 콜라겐 생성 촉진 효과를 비교하기 위하여 실시예 3-1의 각각의 형질전환된 인간 피부섬유아세포를 이용하여 실시예 2-3과 동일한 방법으로 콜라겐 합성량의 변화를 측정하여 표 3과 도 3의 B에 나타내었다.
그 결과, 표 3과 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, 각각의 형질전환된 피부섬유아세포를 배양한 배지 상층액에서 합성된 콜라겐 타입 1형을 정량한 결과, 음성대조군(NC)과 비교하여 모든 실험군에서 콜라겐 타입 1형의 합성량이 증가하였으며, 특히 SME 단편이 다른 부분보다 콜라겐의 생성을 우수하게 촉진하는 것을 확인하였다. 이에, hCOL1A1 단백질의 SME 단편을 hCOL1A1-콜라겐 유효 도메인(hCOL1A1-collagen effective domain; 이하 hCOL1A1-CED)으로 지정하여 추가적인 실험을 수행하였다.
실시예 4: hCOL1A1-CED 단편의 재조합 발현 벡터의 제조 및 hCOL1A1-CED 단편 발현 확인
<4-1> hCOL1A1-CED 단편의 재조합 발현 벡터의 제조
hCOL1A1-CED 단편(hCOL1A1 사슬 단백질의 SME 단편)은 COL1A1의 743-880 아미노산에 해당하는 138 아미노산 길이의 펩타이드로, 약 21 kDa 정도 크기이다.
hCOL1A1-CED 단편의 재조합 단백질을 대량 생산하기 위한 hCOL1A1(743-880 aa) 플라스미드를 제작하기 위하여, hCOL1A1의 743-880 아미노산 위치의 유전자를 PCR을 이용하여 증폭하여 pET-28a(+) 벡터에 삽입하여 pET-28a(+)-hCOL1A1을 제조하였다(도 4의 A).
구체적으로, hCOL1A1 단편을 hCOL1A1의 cDNA를 주형으로 하여, 제한효소인 Hind III 절단 부위를 가지는 서열번호 31의 정방향 프라이머 및 제한효소 NotI 절단부위를 가지는 서열번호 32의 역방향 프라이머를 사용하여 증폭하였다(서열번호 31: CAGAAGCTTGCGGTGACAGAGGTGATG, 서열번호 32: CCGGCGGCCGCAGCAGCACCAGGGAAA). PCR 반응은 hCOL1A1의 cDNA를 template로 하여, pfu DNA 중합효소로 PCR을 수행하였다(PCR 사이클: 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 55초의 반응을 30회 반복; PCR 타겟: hCOL1A1; 743-880 aa). 증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 정제 키트(geneall)를 이용하여 정제 및 분리하고, pET-28a(+) 벡터(Novagen)와 정제 분리한 PCR 산물을 제한효소 BamHI 과 NotI으로 절단 후, ligation하고 형질전환(transformation)하여 kanamycin LB agar 플레이트에 spreading하였다. 단일 클론(Single clone)에서 DNA를 추출하고 시퀀싱(sequencing)하여, 목적한 플라스미드 DNA 벡터가 맞는지 확인하였다.
<4-2> 재조합 hCOL1A1-CED 단편의 발현 확인
실시예 4-1에서 제작한 pET-28a(+)-hCOL1A1을 대장균에서 대량으로 발현시키고, 순수한 재조합 단백질로 분리하였다.
구체적으로, pET-28a(+)-hCOL1A1을 E. coli Rosetta2(DE3)에 형질감염시킨 후, 50 μg/ml의 카나마이신을 포함하는 배지에서 37℃, OD값이 0.6이 될 때까지 배양하고, IPTG를 최종 1 mM이 되도록 첨가하여, hCOL1A1의 단백질을 유도한 후에, 37℃에서 6시간 동안 추가로 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여(12,000 rpm, 10 min, 4℃) 균체를 수득한 후에, 상기 균체를 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)에 현탁시킨 후에, 초음파 분쇄기로 균체를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 균체 현탁액을 원심분리하여(12,000 rpm, 40 min, 4℃) 펠렛(pellet)을 버리고 상등액(supernatant)을 얻었다. 상기 얻은 상등액으로부터 His-binding 칼럼(GE healthcare)을 이용하여 재조합 콜라겐 타입 1형 (hCOL1A1) 단백질을 정제하였으며, 15% SDS-PAGE로 정제된 단백질을 확인하였다.
상기 재조합 단백질의 정제 단계별 샘플의 15% SDS-PAGE 결과는 도 4의 B에 도시한 바와 같다. 약 21 kDa 크기의 재조합 hCOL1A1-CED 단편 단백질이 대장균 E. coli Rosetta2(DE3) 균주 내에서 효과적으로 과발현되었으며(도 4 B의 화살표), 정제 단계를 거치면서 순수한 재조합 단백질로 수득한 것을 확인할 수 있다(레인 4).
실시예 5: 재조합 hCOL1A1-CED 단편의 수산화 정도 분석
상기 실시예 4에서 정제분리한 재조합 hCOL1A1-CED 단편 단백질의 서열 및 콜라겐의 형성에 중요한 프롤린 수산화 정도를 질량 분석 방법으로 분석하였다. 세포 외부에서 아교원섬유는 전아교질펩타이드가수분해효소(procollagen peptidase)라고 하는 특수한 단백질분해효소의 작용에 의해 등록 펩타이드가 제거되는데, 이 변형된 단백질을 트로포콜라겐(tropocollagen)이라고 하며, 이들은 모여서 아교원섬유 중합체(polymeric collagen fibril)를 형성한다. 특히, 수산화프롤린은 폴리펩타이드 사슬 사이에 수소결합을 형성하여 트로포콜라겐의 삼중나선구조를 안정화시키는 역할을 한다.
구체적인 방법은 다음과 같다. 재조합 콜라젠 단백질 SDS-PAGE를 수행한 후, SDS-PAGE에서 분석한 밴드를 취하고, 40% 아세토나이트릴(acetonitrile)을 가한 후 60℃에서 800 rpm으로 5분 동안 shaking하여 젤(gel)을 씻어내었다. 그런 다음, 100% 아세토나이트릴(acetonitrile)을 가하고, 60℃에서 800 rpm으로 5분 동안 shaking하여 젤을 탈수하였다. 50 mM 중탄산암모늄(Ammonium bicarbonate) 수용액에 녹인 25 mM Dithiothreitol 용액을 100 μl 가하고, 56℃에서 800 rpm으로 20분간 shaking하여 펩타이드의 이황화결합을 끊고, 100 mM 중탄산암모늄 (Ammonium bicarbonate) 수용액에 녹인 25 mM 요오드아세트아마이드(Iodoacetamide)용액을 100 μl 가하고, 빛을 차단한 뒤 상온(25℃)에서 800 rpm으로 30분간 shaking하여 펩타이드가 재결합하지 않도록 알킬화(alkylation)하였다. HPLC grade의 water 100 μl를 가하여 상온(25℃)에서 800 rpm으로 1분간 shaking하여 젤을 씻어낸 후, 40% 아세토나이트릴(acetonitrile)을 100 μl 가하여 상온(25℃)에서 800 rpm으로 15분간 shaking하여 젤을 씻어내었다. 100% 아세토나이트릴(acetonitrile)을 100μl 가하여 상온(25℃)에서 800 rpm으로 5분간 shaking하여 젤을 탈수한 후, 100 μl의 50 mM 아세트산(acetic acid)에 Trypsin GOLD 100 μg을 녹였다. 10% 아세토나이트릴(acetonitrile)에 녹인 40 mM 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate) 용액과 녹인 용액을 49:1의 비율로 혼합한 트립신(trypsin) 반응액 50 μl을 가한 후 37℃에서 12-16시간 동안 반응시켜 펩타이드를 조각내었다. 0.1% 포름산(formic acid)으로 희석한 50% 아세토나이트릴 (acetonitrile)을 100 μl 가하고 상온(25℃)에서 800 rpm으로 5분간 shaking하여 단백질을 추출한 후, Lowbinding Tube를 준비하여 용액을 옮겼다. 0.1% 포름산으로 희석한 99.9% 아세토나이트릴을 100 μl 가하고 상온(25℃)에서 800 rpm으로 20분간 shaking하여 단백질을 추출한 후, 용액을 Lowbinding Tube로 옮겼다. 단백질이 추출된 용액이 들어있는 Lowbinding Tube를 Concentrator Plus를 이용하여 60℃ 진공 상태에서 2-3시간 정도 완전히 말린 후, 용액이 마르고 단백질이 남은 Lowbinding Tube에 0.1% 포름산을 70 μl씩 가하여 vortexing하였다. 초음파 처리한 후, Lowbind Tube의 용액을 HPLC용 유리병(vial)으로 옮겨 질량분석하였다. 시료 유리병을 nano EASY-nLC II의 autosampler에 로딩한 후, HPLC 컬럼은 trap column과 analytical column을 Easy nano LC II에 장착하고, 전기스프레이 이온화(Electrospray ionization, ESI)를 위해 stainless steel emitter(내경 30μm) 를 장착하여, 질량 분석 장비인 LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer의 Tune 파일을 활성화하고 분석을 개시하였다. 분당 300 nl의 유속을 유지하며, 시간에 따라 이동상의 유기용매 농도를 변화하여 gradient를 적용하였다. 분석 해상도는 100,000이며, 질량 범위는 300-2,000 m/z이다. 텐덤 매스 (Tandom MS/MS 분석) 시행 시, 첫 번째 full mass(MS) 후 두 번째 매스(MS/MS)는 CID(colision energy induced dissociation; 충돌에 의한 분리) 기법을 사용하였다.
분석 결과는 표 4에 나타낸 바와 같다. LC/MS/MS 질량 분석에서 hCOL1A1 Peptide 서열 13종이 검출되었고, 폴리펩타이드 사슬 사이에 수소 결합을 형성하여 트로포콜라겐의 삼중나선구조를 안정화시키는 역할을 하는 수산화프롤린(hydroxy proline)이 검출되었다. 이러한 결과에 따라, 화장품이나 식품 등에 사용될 수 있는 원재료뿐만 아니라 콜라겐의 수산화의 정도는 콜라겐 삼중 나선 또는 트로포콜라겐의 헐거움 또는 단단함 및 재조합 콜라겐에 의해 제조된 제품, 예컨대 생체조직으로 제조된 가죽의 기능적 및 심미적 특성에 가진 것에 이용될 가능성이 충분함을 알 수 있다.
상기 표의 범위(Range)는 야생형 COL1A1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 나타낸 아미노산 범위로, 예를 들어, 746-759범위는 서열번호 1의 4번째 내지 17번째 아미노산 서열과 동일하다.
실시예 6: hCOL1A1-CED 단편의 콜라겐 합성 촉진 효과 확인
<6-1> hCOL1A1-CED 단편의 콜라겐 타입 1형 합성 유도 효과 확인
실시예 4에서 분리정제한 재조합 hCOL1A1-CED 단편 단백질의 콜라겐 생성 촉진 활성을 EGF, TGF-β1 및 비타민 C와 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 인간 피부섬유아세포(human dermal fibroblast; HDF, ATCC, USA)를 플레이트(well plate)에 6x104 cells(per 1 well)의 밀도로 접종(seeding)한 후, 5%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, ThermoFisher)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 배양하였다. 그런 다음, 배지를 0.1% 소태아혈청을 함유하는 새로운 검정 배지로 교체하고, 1 μg/ml의 EGF, 10 ng/ml의 TGF-β1, 100 μg/ml의 비타민 C(Vitamin C) 또는 10 μg/ml의 hCOL1A1-CED 단백질을 각각 배지에 용해하여 처리하였다. 각 시료를 처리한 인간 피부섬유아세포를 48시간 동안 배양한 후 세포 배양 배지를 수집하여 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 배지의 상층액을 취하여 합성된 콜라겐을 정량하였다. 콜라겐 타입 1형의 정량은 ELISA 키트(Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 사용하여 제조사의 권장 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 표 5 및 도 6의 A에 나타낸 바와 같이, 피부섬유아세포에 hCOL1A1-CED 처리한 경우 음성대조군에 비해 우수한 콜라겐 합성 촉진 효과가 있을 뿐 아니라, 양성대조군인 EGF, TGF-β1 및 비타민 C 처리군에 비해서도 통계적으로 유의한 차이로 우수한 콜라겐 합성 유도 효과가 있음을 확인하였다.
<6-2> hCOL1A1-CED 단편의 내인성 Col1a1 유전자 발현 유도 효과 확인
실시예 4에서 분리정제한 재조합 hCOL1A1-CED 단편의 내인성 Col1a1 유전자 발현 유도 효과를 TGF-β1와 비교하고, hCOL1A1-CED 단편의 농도에 따른 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 인간 피부섬유아세포(human dermal fibroblast; HDF, ATCC, USA)를 플레이트(well plate)에 6x104 cells(per 1 well)의 밀도로 접종(seeding)한 후, 5%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, ThermoFisher)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 배양하였다. 그런 다음, 배지를 0.1% 소태아혈청을 함유하는 새로운 검정 배지로 교체하고, 10 ng/ml의 TGF-β1, 1 μg/ml 또는 10 μg/ml의 hCOL1A1-CED 단백질을 각각 배지에 용해하여 처리하였다. 각 시료를 처리한 인간 피부섬유아세포를 48시간 동안 배양한 후, 인간 피부섬유아세포를 수득하여 qRT-PCR 분석을 수행하였다. RNA는 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 분리하고, cDNA는 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 합성한 다음, CFX96 Real-Time PCR 검출기에서 Power SYBR Green PCR 마스터 믹스를 사용하여 역전사효소 PCR을 정량화하였다.
그 결과, 도 6의 B에 나타낸 바와 같이, 1 μg/ml 또는 10 μg/ml 농도로hCOL1A1-CED 단편을 처리한 경우는 음성대조군에 비해 우수한 Col1a1 유전자 발현 유도 효과가 있음을 확인하였다. 특히, 낮은 농도인 1 μg/ml에서도 음성대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
실시예 7: hCOL1A1-CED 단편의 세포 성장인자 활성 분석
실시예 4에서 분리정제한 재조합 hCOL1A1-CED 단편 단백질의 성장인자로서의 활성을 EGF 및 TGF-β1과 비교하기 위하여 하기와 같이 MTT assay 실험을 수행하였다.
구체적으로, 인간 피부섬유아세포(human dermal fibroblast; HDF, ATCC, USA)를 플레이트(well plate)에 6x104 cells(per 1 well)의 밀도로 접종(seeding)한 후, 5%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, ThermoFisher)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 배양하였다. 1 μg/ml의 EGF, 10 ng/ml의 TGF-β1 또는 10 μg/ml의 hCOL1A1-CED 단백질을 각각 배지에 용해하여 처리하였다. 각 시료를 처리한 인간 피부섬유아세포를 48시간 동안 배양하였다. 상기 배지를 1 mg/ml의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 함유하는 새로운 배지로 교체하고, 다시 3-4시간 동안 배양하였다. 각 웰에 DMSO 200 μl를 첨가하여 실온에서 추가로 30분 동안 배양한 후, 490 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, hCOL1A1-CED 단편을 처리한 경우 음성대조군 뿐만 아니라, 양성대조군인 EGF 및 TGF-β1을 처리한 경우보다 세포 성장이 증가하였다. 따라서, hCOL1A1-CED 단편은 단순히 세포 내 콜라겐 합성을 촉진하는 외에, 세포분열을 촉진하는 성장인자로서의 활성도 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 8: hCOL1A1-CED 단편의 세포 이동 촉진 활성 분석
<8-1> hCOL1A1-CED 단편의 세포 이동 활성 분석
피부각질형성세포에서 hCOL1A1-CED 단편의 세포 이동 활성 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 트랜스웰 이동 분석을 수행하였다.
구체적으로, 인간 피부각질형성세포(HaCaT, ATCC, USA)를 5%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, ThermoFisher)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 배양하였다. 그런 다음, 배지를 0.1% 소태아혈청을 함유하는 새로운 검정 배지로 교체하고, 10 ng/ml의 TGF-β1, 1 μg/ml의 EGF 또는 10 μg/ml의 hCOL1A1-CED 단백질을 각각 배지에 용해하여 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 8 μm 기공이 있는 코팅되지 않은 세포 배양 삽입물(Corning Inc., Tewksbury, USA)을 사용하여 트랜스웰 이동 분석을 수행하였다. 이동은 최대 20시간 동안 모니터링하였으며, 시료를 처리한 직후와 처리 20시간 후에 동일한 필드를 촬영하고 Adobe Photoshop을 사용하여 이미지를 중첩하였다. 면적은 Image J를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 8의 A에 나타낸 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 세포는 약간의 이동만 관찰할 수 있었던 반면, 양성대조군인 TGF-β, EGF 및 hCOL1A1-CED 단편을 처리한 세포에서는 세포 이동이 증가하는 현상을 확인하였다.
<8-2> hCOL1A1-CED 단편의 상처 회복 활성 분석
hCOL1A1-CED 단편이 인간 피부섬유아세포와 피부각질형성세포의 이동 능력에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 상처 회복 분석(wound-healing assay)을 수행하였다.
구체적으로, 인간 피부섬유아세포(HDF, ATCC, USA)와 인간 피부각질형성세포(HaCaT, ATCC, USA)를 5%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, ThermoFisher)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 배양하였다. 그런 다음, 배지를 0.1% 소태아혈청을 함유하는 새로운 검정 배지로 교체하고, 10 ng/ml의 TGF-β1, 1 μg/ml 또는 10 μg/ml의 hCOL1A1-CED 단백질을 각각 배지에 용해하여 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 단층으로 균일하게 자란 피부섬유아세포(HDF)와 피부각질형성세포(HaCaT) 배지를 멸균 Tip으로 긁은 후, 실선 안의 세포를 모두 제거하였다. 그 후, 16시간 동안 배양하여 세포가 제거된 실선 안의 영역으로 세포가 이동하는 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 8의 B에 나타낸 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 세포는 Tip으로 긁은 직후의 세포와 비교해 약간의 이동만 관찰할 수 있었던 반면, 양성대조군인 TGF-β(10 ug/ml) 및 hCOL1A1-CED 단편(1 ug/ml 또는 10 ug/ml)을 처리한 세포에서는 세포 이동이 증가하는 현상을 확인하였다. 특히, hCOL1A1-CED 단편을 처리한 세포에서 양성대조군 보다도 현저한 세포 이동 능력이 관찰되었다. 이러한 결과는 hCOL1A1-CED 단편은 피부섬유아세포(HDF)와 피부각질형성세포(HaCaT)의 이동 능력을 증가시키는 활성도 있음을 보여주는 것이다.
실시예 9: hCOL1A1-CED 단편의 엘라스틴 합성 촉진 활성 분석
엘라스틴 합성에 대한 hCOL1A1-CED 단편의 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 인간 피부섬유아세포(HDF, ATCC, USA)를 5%(v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, ThermoFisher)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 배양하였다. 그런 다음, 배지를 0.1% 소태아혈청을 함유하는 새로운 검정 배지로 교체하고, 10 ng/ml의 TGF-β1, 1 μg/ml의 EGF 또는 10 μg/ml의 hCOL1A1-CED 단백질을 각각 배지에 용해하여 처리하였다. 각 시료를 처리한 인간 피부섬유아세포를 48시간 동안 배양한 후, 배양 배지에서 엘라스틴의 양을 ELISA 분석법으로 측정하여 그 결과를 표 6 및 도 9에 나타내었다.
그 결과, 표 6 및 도 9에 나타낸 바와 같이, hCOL1A1-CED 단편을 처리한 경우 음성대조군 뿐만 아니라, 양성대조군인 EGF 및 TGF-β1을 처리한 경우보다 엘라스틴 합성이 유의하게 증가된 것을 확인하였다.
<110> ABIOTECH Co., Ltd. <120> Peptide with collagen synthesis-promoting activity and methods using the same <130> DPP20220209KR <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCOL1A1 SME fragment 743-880 aa <400> 1 Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly 1 5 10 15 Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro 20 25 30 Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala 35 40 45 Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly 50 55 60 Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln 65 70 75 80 Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala 85 90 95 Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly 100 105 110 Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro 115 120 125 Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala 130 135 <210> 2 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCOL1A1 SMA fragment 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Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln 385 390 395 400 Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala 405 410 415 Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly 420 425 430 Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro 435 440 445 Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala 450 455 460 Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly 465 470 475 480 Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys 485 490 495 Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser 500 505 510 Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly 515 520 525 Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly 530 535 <210> 9 <211> 1057 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCOL1A1 FL 162-1218 aa <400> 9 Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val 1 5 10 15 Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro 20 25 30 Gly Ala Pro Gly Pro 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Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro 245 250 255 Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser 260 265 270 Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly 275 280 285 Glu Pro Gly Pro Val Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu 290 295 300 Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro 305 310 315 320 Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly 325 330 335 Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser 340 345 350 Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro 355 360 365 Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly 370 375 380 Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln 385 390 395 400 Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala 405 410 415 Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly 420 425 430 Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro 435 440 445 Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala 450 455 460 Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly 465 470 475 480 Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys 485 490 495 Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser 500 505 510 Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly 515 520 525 Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn 530 535 540 Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln 545 550 555 560 Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly 565 570 575 Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala 580 585 590 Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile 595 600 605 Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly 610 615 620 Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp 625 630 635 640 Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro 645 650 655 Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly 660 665 670 Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro 675 680 685 Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg 690 695 700 Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly 705 710 715 720 Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro 725 730 735 Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr 740 745 750 Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 755 760 765 Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala 770 775 780 Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val 785 790 795 800 Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly 805 810 815 Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu 820 825 830 Arg Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro 835 840 845 Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly 850 855 860 Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro 865 870 875 880 Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val 885 890 895 Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly 900 905 910 Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro 915 920 925 Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp Arg 930 935 940 Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly 945 950 955 960 Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Pro 965 970 975 Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys Asp 980 985 990 Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly 995 1000 1005 Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro 1010 1015 1020 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu 1025 1030 1035 1040 Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg 1045 1050 1055 Ala <210> 10 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCOL1A1 SME fragment's DNA sequence <400> 10 ggtgacagag gtgatgctgg tcccaaaggt gctgatggct ctcctggcaa agatggcgtc 60 cgtggtctga ctggccccat tggtcctcct ggccctgctg gtgcccctgg tgacaagggt 120 gaaagtggtc ccagcggccc tgctggtccc actggagctc gtggtgcccc cggagaccgt 180 ggtgagcctg gtccccccgg ccctgctggc tttgctggcc cccctggtgc tgacggccaa 240 cctggtgcta aaggcgaacc tggtgatgct ggtgctaaag gcgatgctgg tccccctggc 300 cctgccggac ccgctggacc ccctggcccc attggtaatg ttggtgctcc tggagccaaa 360 ggtgctcgcg gcagcgctgg tccccctggt gctactggtt tccctggtgc tgct 414 <210> 11 <211> 1561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCOL1A1 M fragment's DNA sequence <400> 11 cctggcagca aaggagacac tggtgctaag ggagagcctg gccctgttgg tgttcaagga 60 ccccctggcc ctgctggaga ggaaggaaag cgaggagctc gaggtgaacc cggacccact 120 ggcctgcccg gaccccctgg cgagcgtggt ggacctggta gccgtggttt ccctggcgca 180 gatggtgttg ctggtcccaa gggtcccgct ggtgaacgtg gttctcctgg ccctgctggc 240 cccaaaggat ctcctggtga agctggtcgt cccggtgaag ctggtctgcc tggtgccaag 300 ggtctgactg gaagccctgg cagccctggt cctgatggca aaactggccc ccctggtccc 360 gccggtcaag atggtcgccc cggaccccca ggcccacctg gtgcccgtgg tcaggctggt 420 gtgatgggat tccctggacc taaaggtgct gctggagagc ccggcaaggc tggagagcga 480 ggtgttcccg gaccccctgg cgctgtcggt cctgctggca aagatggaga ggctggagct 540 cagggacccc ctggccctgc tggtcccgct ggcgagagag gtgaacaagg ccctgctggc 600 tcccccggat tccagggtct ccctggtcct gctggtcctc caggtgaagc aggcaaacct 660 ggtgaacagg gtgttcctgg agaccttggc gcccctggcc cctctggagc aagaggcgag 720 agaggtttcc ctggcgagcg tggtgtgcaa ggtccccctg gtcctgctgg tccccgaggg 780 gccaacggtg ctcccggcaa cgatggtgct aagggtgatg ctggtgcccc tggagctccc 840 ggtagccagg gcgcccctgg ccttcaggga atgcctggtg aacgtggtgc agctggtctt 900 ccagggccta agggtgacag aggtgatgct ggtcccaaag gtgctgatgg ctctcctggc 960 aaagatggcg tccgtggtct gactggcccc attggtcctc ctggccctgc tggtgcccct 1020 ggtgacaagg gtgaaagtgg tcccagcggc cctgctggtc ccactggagc tcgtggtgcc 1080 cccggagacc gtggtgagcc tggtcccccc ggccctgctg gctttgctgg cccccctggt 1140 gctgacggcc aacctggtgc taaaggcgaa cctggtgatg ctggtgctaa aggcgatgct 1200 ggtccccctg gccctgccgg acccgctgga ccccctggcc ccattggtaa tgttggtgct 1260 cctggagcca aaggtgctcg cggcagcgct ggtccccctg gtgctactgg tttccctggt 1320 gctgctggcc gagtcggtcc tcctggcccc tctggaaatg ctggaccccc tggccctcct 1380 ggtcctgctg gcaaagaagg cggcaaaggt ccccgtggtg agactggccc tgctggacgt 1440 cctggtgaag ttggtccccc tggtccccct ggccctgctg gcgagaaagg atcccctggt 1500 gctgatggtc ctgctggtgc tcctggtact cccgggcctc aaggtattgc tggacagcgt 1560 g 1561 <210> 12 <211> 1561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCOL1A1 C fragment's DNA sequence <400> 12 gccaacggtg ctcccggcaa cgatggtgct aagggtgatg ctggtgcccc tggagctccc 60 ggtagccagg gcgcccctgg ccttcaggga atgcctggtg aacgtggtgc agctggtctt 120 ccagggccta agggtgacag aggtgatgct ggtcccaaag gtgctgatgg ctctcctggc 180 aaagatggcg tccgtggtct gactggcccc attggtcctc ctggccctgc tggtgcccct 240 ggtgacaagg gtgaaagtgg tcccagcggc cctgctggtc ccactggagc tcgtggtgcc 300 cccggagacc gtggtgagcc tggtcccccc ggccctgctg gctttgctgg cccccctggt 360 gctgacggcc aacctggtgc taaaggcgaa cctggtgatg ctggtgctaa aggcgatgct 420 ggtccccctg gccctgccgg acccgctgga ccccctggcc ccattggtaa tgttggtgct 480 cctggagcca aaggtgctcg cggcagcgct ggtccccctg gtgctactgg tttccctggt 540 gctgctggcc gagtcggtcc tcctggcccc tctggaaatg ctggaccccc tggccctcct 600 ggtcctgctg gcaaagaagg cggcaaaggt ccccgtggtg agactggccc tgctggacgt 660 cctggtgaag ttggtccccc tggtccccct ggccctgctg gcgagaaagg atcccctggt 720 gctgatggtc ctgctggtgc tcctggtact cccgggcctc aaggtattgc tggacagcgt 780 ggtgtggtcg gcctgcctgg tcagagagga gagagaggct tccctggtct tcctggcccc 840 tctggtgaac ctggcaaaca aggtccctct ggagcaagtg gtgaacgtgg tccccctggt 900 cccatgggcc cccctggatt ggctggaccc cctggtgaat ctggacgtga gggggctcct 960 ggtgccgaag gttcccctgg acgagacggt tctcctggcg ccaagggtga ccgtggtgag 1020 accggccccg ctggaccccc tggtgctcct ggtgctcctg gtgcccctgg ccccgttggc 1080 cctgctggca agagtggtga tcgtggtgag actggtcctg ctggtcccgc cggtcctgtc 1140 ggccctgttg gcgcccgtgg ccccgccgga ccccaaggcc cccgtggtga caagggtgag 1200 acaggcgaac agggcgacag aggcataaag ggtcaccgtg gcttctctgg cctccagggt 1260 ccccctggcc ctcctggctc tcctggtgaa caaggtccct ctggagcctc tggtcctgct 1320 ggtccccgag gtccccctgg ctctgctggt gctcctggca aagatggact caacggtctc 1380 cctggcccca ttgggccccc tggtcctcgc ggtcgcactg gtgatgctgg tcctgttggt 1440 ccccccggcc ctcctggacc tcctggtccc cctggtcctc ccagcgctgg tttcgacttc 1500 agcttcctgc cccagccacc tcaagagaag gctcacgatg gtggccgcta ctaccgggct 1560 g 1561 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-FL-F <400> 13 acgaagcttc agctgtctta tggctat 27 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-FL-R <400> 14 tcgagcggcc gcagcccggt agtagcggcc 30 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-N-F <400> 15 acgaagcttc agctgtctat ggctat 26 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-N-R <400> 16 tcgagcggcc gcccctcggg gaccagcagg 30 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-M-F <400> 17 acgaagcttc ctggcagcaa aggagac 27 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-M-R <400> 18 tcgagcggcc gcacgctgtc cagaatacc 29 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-C-F <400> 19 acgaagcttg ccaacggtgc cccggc 26 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-C-R <400> 20 tcgagcggcc gcagcccggt agtagcggcc 30 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SMA-F <400> 21 ctgaagcttg cggcagcaaa ggagaca 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SMA-R <400> 22 ccggcggccg cagcagcacc agggaaa 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SMB-F <400> 23 acgaagcttc ctggcagcaa aggagac 27 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SMB-R <400> 24 tcgagcggcc gcccctcggg gaccagcagg 30 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SMC-F <400> 25 acgaagcttg ccaacgggct cccggc 26 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SMC-R <400> 26 tcgagcggcc gcacgctgtc cagcaatacc 30 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SMD-F <400> 27 cagaagcttg cggtgacaga ggtgatg 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SMD-R <400> 28 ccggcggccg cacgctgtcc agcaata 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SME-F <400> 29 atgggtcgcg gatccggtga cagaggt 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer COL1A1-SME-R <400> 30 ctcgagtgcg gccgcagcag caccagg 27 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pET-28a(+) vector <400> 31 cagaagcttg cggtgacaga ggtgatg 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pET-28a(+) vector <400> 32 ccggcggccg cagcagcacc agggaaa 27

Claims (20)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 9의 아미노산 서열 내의 연속하는 138개 내지 1056개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 138 내지 780개의 아미노산 서열로 이루어진, 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진, 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포 내 콜라겐 합성을 촉진하는 것인, 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포 성장 또는 세포 이동을 촉진하는 것인, 펩타이드.
  6. 제1항의 펩타이드를 포함하는 세포 내 콜라겐 합성 촉진용 조성물.
  7. 제1항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  10. 제9항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  11. (1) 숙주세포를 제1항의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계;
    (2) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (3) 상기 배양된 형질전환된 숙주세포에서 제1항의 펩타이드를 수득하는 단계;
    를 포함하는 제1항의 펩타이드를 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 숙주세포는 섬유아세포 또는 대장균인, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 펩타이드는 숙주세포 파쇄물 또는 용해물을 원심분리한 상등액으로 수득하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 pET-28a(+)인 것인, 방법.
  15. (1) 제1항의 펩타이드를 콜라겐 합성능을 갖는 세포에 접촉 또는 도입시키는 단계;
    (2) 상기 접촉 또는 도입한 세포를 배양하는 단계; 및
    (3) 상기 접촉 또는 도입한 세포에서 콜라겐을 수득하는 단계;
    를 포함하는 콜라겐을 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 콜라겐 합성능을 갖는 세포는 섬유아세포인 것인, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 도입은 콜라겐 합성능을 갖는 세포를 상기 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항의 펩타이드를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 세포 내 콜라겐 합성을 촉진하는 것인, 화장료 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 피부 상태 개선용은 피부 노화 방지용, 피부주름 방지용, 피부 보습용인 것인, 화장료 조성물.
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CN117304306A (zh) * 2023-09-28 2023-12-29 广州普言生物科技有限公司 一种重组Ⅲ型胶原蛋白Pro.C3及其制备方法和应用
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