CN117402235A - 生物合成人体结构性材料iv型胶原蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供了生物合成人体结构性材料IV型胶原蛋白的方法。本文提供了重组胶原蛋白，其包含SEQ ID NO:1等所示的序列。本文的重组胶原蛋白具有良好的细胞粘附活性。本文的方法利用基因工程技术生产重组胶原蛋白，克服了现有技术的缺陷。

Description

生物合成人体结构性材料IV型胶原蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种重组IV型人源化胶原蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
胶原蛋白(Collagen，COL)简称胶原，是由三条肽链构成的螺旋形纤维状的功能性蛋白，它也是细胞外基质的主要组成成分，含量丰富、覆盖范围广泛。人体中胶原蛋白含量占总蛋白的25％-30％，主要存在于皮肤、肌腱以及骨骼中，起着保护并连结各种组织的重要作用，在体内发挥着重要的生理功能。IV型胶原是与层粘连蛋白一同构成基底膜的主要蛋白质，以具有由3条α链构成的螺旋结构的三聚体作为结构单元。虽然根据组织而构成三聚体的亚单位不同，但在以肝脏为例的许多组织中，三聚体由两条α1链和一条α2链构成。IV型胶原分子在形成所述螺旋结构的TH结构域的两端具有IV型胶原分子特有的结构，将N末端的结构称为7S结构域，将C末端的结构称为NC1结构域。
胶原蛋白具有良好的生物兼容性、可降解性以及低抗原性，其独特的生物构造使其成为了近年来的研究热点，可以在生物医学、化妆品、保健品、食品等多个领域得到广泛的应用。
人体内含有28种不同的胶原蛋白，按照结构是否为纤维状可分为纤维状和非纤维状两大类。纤维状胶原蛋白主要承担细胞支架的功能，固定细胞位置、发挥锚定作用，也为组织提供拉伸强度和刚度；非纤维胶原则进一步细分为基底胶原蛋白、短链胶原、跨膜胶原蛋白等，各自承担不同的功能。
胶原蛋白的传统生产方法是利用酸、碱、酶解法对动物来源的组织进行提纯处理，从而提取胶原蛋白衍生物。但是，经由此法得到的胶原蛋白已经丧失了原本的生物学活性，且水溶性差、不易与人体结合、难以避免病毒感染以及致敏性的危险，无法发挥真正的功能。也有一些研究机构通过常规重组表达的方法体外表达人源胶原蛋白，但成本高、生产周期长且无法投入大规模生产。
因此，市场上急需一种具有优良生物材料性质，氨基酸序列与人体高度同源，并且能在工业化体系中大量制备的胶原蛋白材料。
发明内容
发明人对人IV型胶原蛋白进行了大规模功能区筛选，发现了11种重组胶原蛋白。这些重组胶原蛋白可以通过大肠杆菌进行表达，并且可以得到纯化。进一步，发明人发现了这些重组胶原蛋白收率较高，精纯后目的蛋白纯度较好，且在细胞粘附活性测定中活性高于阳性对照(牛Ⅰ型胶原蛋白)。
在一方面，本发明提供了重组胶原蛋白，其包含一个或多个重复单元，所述重复单元直接或通过接头连接，所述重复单元包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:1(Gakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeq)或28(Gptgpagqkgepgsdgipgsagekgepglp)，所述变体是(1)所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，多个重复单元为2-50个重复单元，例如2-45、2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、4-10或6-10个重复单元。例如，重复单元的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50或它们之间的范围。
在一个实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸残基，例如1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个或1-2个氨基酸残基。
在一个实施方案中，突变选自取代、添加、插入或缺失。
在一个实施方案中，取代是保守氨基酸取代。
在一个实施方案中，重组胶原蛋白是重组人IV型胶原蛋白或重组IV型人源化胶原蛋白。
在一个实施方案中，重组胶原蛋白具有细胞粘附活性。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的变体包含以下突变：在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N端添加Gfpgfp(SEQ ID NO:34)或SEQ ID NO:34的1-5个氨基酸残基长的N端截短片段，和/或在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的C端添加GFMGPPGPQGQPGLP(SEQ ID NO:35)或SEQID NO:35的1-14个氨基酸残基长的C端截短片段或者在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的C端截短1-5个氨基酸残基。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:28的变体包含以下突变：在SEQ ID NO:28的氨基酸序列的N端添加Glpgtp(SEQ ID NO:36)或其1-5个氨基酸残基长的N端截短片段。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的变体选自SEQ ID NO:4(Gakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfmgppgpq)、7(GFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLP)、10(Gfpgfpgakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfmgppgpq)、13(Gfpgfpgakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfm) 、 16(Gfpgfpgakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeq) 、 19(Gakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfmgppgpqgqpglp) 、 22(Gakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfm) 、 或 31(Gfpgfpgakgdkgskgevgfpglagspgipgsk)。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:28的变体是SEQ ID NO:25(Glpgtpgptgpagqkgepgsdgipgsagekgepglp)。
在一个实施方案中，重组胶原蛋白包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ IDNO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29或32，所述变体是(1)所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，突变选自取代、添加、插入或缺失。在一个实施方案中，取代是保守氨基酸取代。
在另一个方面，提供了核酸，其编码本文所述的重组胶原蛋白。在一个实施方案中，核酸包含经密码子优化的核苷酸序列。在一个实施方案中，核苷酸序列是针对真核宿主细胞或原核宿主细胞，如酵母或大肠杆菌表达进行密码子优化的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30或33。
在另一个方面，提供了载体，其包含本文所述的核酸。在一个实施方案中，载体包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件、纯化标签的核苷酸和/或前导序列的核苷酸。在一个实施方案中，表达控制元件选自启动子、终止子或增强子。在一个实施方案中，纯化标签选自His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签。在一个实施方案中，载体是表达载体或克隆载体，优选为pET-28a(+)。pET-28a(+)可以包含N端的His、Thrombin和T7蛋白标签、和C端His标签。在本文中，重组胶原蛋白的N端可以包含酶切位点以便于纯化。
在另一个方面，提供了宿主细胞，其包含本文所述的核酸或载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在一个实施方案中，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞，在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌BL21。
在另一个方面，提供了组合物，其包含本文所述的重组胶原蛋白、核酸、载体和宿主细胞中的一个或多个。在一个实施方案中，组合物是试剂盒。在一个实施方案中，组合物是生物敷料、人体仿生材料、整形或美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种。在一个实施方案中，组合物为表面用组合物、注射用组合物或口服用组合物。在一个实施方案中，组合物是溶液、冻干粉、凝胶、海绵或纤维形式的组合物。
在另一个方面，提供了本文的重组胶原蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或组合物在生物敷料、人体仿生材料、整形或美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种中的用途。
在另一个方面，提供了促进细胞粘附的方法，其包括使本文的重组胶原蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或组合物与细胞接触的步骤。在一个实施方案中，细胞是动物细胞。动物细胞可以是哺乳动物细胞或人细胞。提供了本文的重组胶原蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或组合物在制备试剂盒中的用途，所述药物用于促进细胞粘附。
在另一个方面，一种美容方法，其包括对受试者施用根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白，优选地施用为表面施用、口服施用或注射施用，优选地，受试者是人。
在另一个方面，提供了生产本文所述的重组胶原蛋白的方法，其包括：
(1)在合适的培养条件下培养本文所述的宿主细胞；
(2)收获包含重组胶原蛋白的宿主细胞和/或培养基；和
(3)纯化重组胶原蛋白。
在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
在一个实施方案中，步骤(1)包括将大肠杆菌细胞在LB培养基中培养并且通过IPTG诱导表达。
在一个实施方案中，步骤(2)包括收获大肠杆菌菌体，重悬于平衡工作液中，对大肠杆菌菌体进行均质化，优选高压均质化，分离上清液。在一个实施方案中，平衡工作液包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris、10-50mM咪唑，pH7-9。
在一个实施方案中，步骤(3)包括粗纯、酶切、精纯、和/或反挂镍柱纯化。
在一个实施方案中，粗纯包括对上清液进行Ni-琼脂糖凝胶柱纯化以得到含目标蛋白的洗脱液，其中洗脱液包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris和100-500mM咪唑，优选pH7-9。
在一个实施方案中，精纯包括用强阴离子交换层析柱对含目标蛋白的洗脱液进行梯度洗脱；优选地，梯度洗脱包括0-15％ B液1-5分钟然后保持3个柱体积、15-30％ B液1-5分钟然后保持3个柱体积、30-50％ B液1-5分钟然后保持3个柱体积、50-100％ B液1-5分钟然后保持3个柱体积；其中B液包含10-50mM Tris，0.5-5M氯化钠，pH7-9。在一个实施方案中，步骤(3)包括用纯化柱，例如镍柱纯化重组胶原蛋白和/或用胶原工具酶切割重组胶原蛋白。
本发明的优点包括：
1.本发明的重组胶原蛋白源自人IV型胶原蛋白，为重组IV型人源化胶原蛋白；
2.本发明的重组胶原蛋白适合于大肠杆菌的制备，并且可以进行分离纯化；
3.本发明的重组胶原蛋白具有较大的收率且适合于后续纯化(Ni柱或强阴离子柱纯化)；和
4.本发明的重组胶原蛋白具有细胞粘附活性。本发明的重组胶原蛋白(例如C4P7Ch)与阳性对照相比更高的细胞粘附活性。
附图说明
图1显示了C4P7Ca电泳检测结果。
图2显示了C4P7Cb电泳检测结果。
图3显示了C4P7Cc电泳检测结果。
图4显示了C4P7Cd电泳检测结果。
图5显示了C4P7Ce电泳检测结果。
图6显示了C4P7Cf电泳检测结果。
图7显示了C4P7Cg电泳检测结果。
图8显示了C4P7Ch电泳检测结果。
图9显示了C4P7Ea电泳检测结果。
图10显示了C4P7Eb电泳检测结果。
图11显示了C4P7Ec电泳检测结果。
图12显示了胶原蛋白C4P7Ch对细胞黏附的作用。
图13显示了胶原蛋白C4P7Cf对细胞黏附的作用。
具体实施方式
如本文中所用，“重组胶原蛋白”是指由DNA重组技术制备的经设计、修饰后的特定基因编码的氨基酸序列或其片段，或是这类功能性氨基酸序列片段的组合。重组胶原蛋白的基因编码序列或氨基酸序列与人胶原蛋白的基因编码序列或氨基酸序列同源性可以较低。“重组人源化胶原蛋白”是指由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。在本文中，重组胶原蛋白包含一个或多个重复单元。该重复单元可以来源于人IV型胶原蛋白。因此，重组胶原蛋白可以为重组IV型人源化胶原蛋白。多个重复单元可以通过接头连接，该接头可以是重复单元在人IV型胶原蛋白上的天然氨基酸残基，例如1-50个氨基酸残基。重复单元可以为SEQ IDNO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31或33。重组胶原蛋白可以为SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29或32。
如本文中所用，术语“变体”意指具有细胞粘附活性的、在一个或多个位置处包括改变/突变(即，取代、添加、插入和/或缺失)的重组胶原蛋白。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。添加指在氨基酸序列的C端和/或N端添加一个或多个氨基酸残基。取代可以是保守取代。重复单元的变体可以是SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31或33中改变或突变(即，取代、添加、插入和/或缺失)一个或多个氨基酸残基后的序列。重组胶原蛋白的变体可以是SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29或32中改变或突变(即，取代、添加、插入和/或缺失)一个或多个氨基酸残基后的序列。
例如，SEQ ID NO:1的重复单元的变体可以是包含如下突变的变体：在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N端添加Gfpgfp(SEQ ID NO:34)或SEQ ID NO:34的N端截短片段(即从SEQID NO:34的N端截短1-5个氨基酸残基，例如1、2、3、4或5个氨基酸残基，分别对应于fpgfp、pgfp、gfp、fp和p残基)，和/或在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的C端添加GFMGPPGPQGQPGLP(SEQ ID NO:35)或SEQ ID NO:35的C端截短片段(从SEQ ID NO:35的C端截短1-14个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基)。SEQ ID NO:1的重复单元的变体可以是包含如下突变的变体：在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N端添加Gfpgfp(SEQID NO:34)或其N端截短片段(即从SEQ ID NO:34的N端截短1、2、3、4或5)，和/或在SEQ IDNO:1的氨基酸序列的C端截短1-5个氨基酸残基，例如1、2或3个氨基酸残基。
SEQ ID NO:28的重复单元的变体可以是包含如下突变的变体：在SEQ ID NO:28的氨基酸序列的N端添加Glpgtp(SEQ ID NO:36)或其的N端截短段(即从SEQ ID NO:36的N端截短1-5个氨基酸残基，例如1、2、3、4或5个氨基酸残基)。
在本发明的上下文中，保守取代可由在一个或多个下表中反映的氨基酸类别内的取代定义：
保守类别的氨基酸残基：
备选的氨基酸残基的物理和功能分类：
如本文中所用，“细胞粘附”指细胞与胶原蛋白之间的粘附。胶原蛋白(例如本文中所述的重组胶原蛋白)可以促进细胞与培养细胞的容器之间的粘附。
如本文中所用，术语“表达”包括涉及重组胶原蛋白生产的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
如本文中所用，术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码重组胶原蛋白的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
如本文中所用，术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。
如本文中所用，术语“核酸”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子可以包含一个或多个控制序列。核酸可以为SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30或33。核酸可以是经密码子优化的核酸，例如针对大肠杆菌细胞表达进行密码子优化的核酸。
术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
重组胶原蛋白
本发明提供了重组胶原蛋白，其包含一个或多个重复单元，所述重复单元直接或通过接头连接，所述重复单元包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31或33。变体可以是(1)SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31或33的氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31或33的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。就本文所述的重组胶原蛋白而言，突变可以选自取代、添加、插入或缺失。优选地，取代是保守氨基酸取代。
本文所述的重组胶原蛋白可以包含多个重复单元，例如2-50个重复单元，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个重复单元。
本文所述的重组胶原蛋白中的接头可以包含一个或多个氨基酸残基，例如1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个氨基酸残基。
重组胶原蛋白是重组人IV型胶原蛋白或重组IV型人源化胶原蛋白，优选具有细胞粘附活性。本文所述的重组胶原蛋白可以是源自人的，因此是重组IV型人源化胶原蛋白。
本文所述的重组胶原蛋白也可以包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ IDNO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29或32，所述变体是(1)所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的核酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。载体可以包含核酸构建体。
可用多种方式操纵核酸以提供重组胶原蛋白的表达。取决于表达载体，在核酸插入载体之前对其进行操纵可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰核酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的重组胶原蛋白的多核苷酸。启动子包含介导重组胶原蛋白的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内重组胶原蛋白的基因获得。
用于指导本发明的载体或核酸构建体在细菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是获得自以下的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码重组胶原蛋白的多核苷酸的3'末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992)描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其提高该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区的实例从以下基因中获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码重组胶原蛋白的多核苷酸的5'末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是编码与重组胶原蛋白的N-末端连接的信号肽并指导重组胶原蛋白进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码重组胶原蛋白的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-端可以含有对编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强重组胶原蛋白的分泌。然而，可以使用指导已表达重组胶原蛋白进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
酵母宿主细胞的有用的信号肽从以下的基因中获得：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(Yeast8:423-488)描述。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的核酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。核酸和控制序列可连接在一起以生产重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以使编码该重组胶原蛋白的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将核酸或包含该核酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。而且，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体可以含有允许载体整合至宿主细胞基因组中或载体在细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该重组胶原蛋白的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。而且，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以提高重组胶原蛋白的生产。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数量，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接上述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989《分子克隆:实验室手册》(第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社))。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的重组胶原蛋白的生产。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码重组胶原蛋白的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的重组胶原蛋白的重组生产中有用的任何细胞，例如，原核生物或真核生物。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。本文中的植物细胞不包括可再生成植株的植物细胞。动物细胞也不包括可产生动物体的细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞，如担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)等。真菌宿主细胞可以为酵母细胞，包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌纲(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
生产方法
本发明还涉及生产本文所述的重组胶原蛋白的方法，其包括：
(1)在合适的培养条件下培养本文所述的宿主细胞；
(2)收获包含重组胶原蛋白的宿主细胞和/或培养基；和
(3)纯化重组胶原蛋白。
宿主细胞是在合适的使用本领域已知的方法生产重组胶原蛋白的营养培养基中培养的。例如，可通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的介质中并且在使重组胶原蛋白表达和/或分离的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养培养基中。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果重组胶原蛋白被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该重组胶原蛋白。如果重组胶原蛋白不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
可以使用本领域已知的对于重组胶原蛋白是特异性的方法来检测重组胶原蛋白。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用。例如，可以使用粘附测定法来确定重组胶原蛋白的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收重组胶原蛋白。例如，可通过常规程序，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从营养培养基回收重组胶原蛋白。在一个方面，回收包含重组胶原蛋白的发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化重组胶原蛋白，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法、和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取，以便获得基本上纯的重组胶原蛋白。
步骤(1)可以包括以下一个或多个步骤：构建表达质粒，例如将编码核苷酸序列插入pET-28a-Trx-His表达载体中得到重组表达质粒。可以将构建成功的表达质粒转化大肠杆菌细胞中(例如大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3))。具体过程可以为：(1)取待转化的质粒加入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中；(2)将混合物置于冰上冰浴(例如10-60min，例如30min)，然后水浴热激(例如于40-50℃，例如42℃，45-90s)，取出后置于冰上冰浴(例如1-5min，例如2min)；(3)加入液体LB培养基，然后培养(例如于35-40℃，例如37℃、150-300rpm，例如220rpm条件下培养40-80min，例如60min)；(4)涂布菌液并且挑选单菌落。例如取菌液均匀涂布在含有氨苄西林钠LB平板上，将平板在37℃的培养箱中培养15-17h，待其长出大小均匀的菌落。
步骤(2)可以包括将单菌落于含有抗生素储液的LB培养基中培养(例如在150-300rpm，例如220rpm，35-40℃，例如37℃恒温摇床中5-10h，例如7h)。再将培养后的摇瓶降温至10-20℃，例如16℃，添加IPTG诱导表达一段时间后收集菌体(例如通过离心收集)。
步骤(3)可以包括将菌体用平衡工作液重悬，将菌液降温至≤15℃，进行均质(例如高压均质，例如1-5次，例如2次)，均质后的菌液分离得到上清液。平衡工作液可以包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris和10-50mM咪唑，pH7-9。例如，氯化钠的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。Tris的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。咪唑的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。
步骤(3)可以包括对重组胶原蛋白进行纯化和酶切。纯化可以是粗纯，包括对上清液进行Ni-琼脂糖凝胶柱纯化以得到含目标蛋白的洗脱液。粗纯可以包括水洗柱材，例如2-10个柱体积(CV)，例如5个CV。可以对柱材用平衡液(200mM氯化钠、25mM Tris、20mM咪唑，pH8.0)平衡，例如2-10个CV，例如5个CV。平衡液可以包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris和10-50mM咪唑，pH7-9。例如，氯化钠的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。Tris的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。咪唑的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。
步骤(3)可以包括将上清液加入柱材中，用洗杂液清洗杂蛋白。洗杂液可以包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris和10-50mM咪唑，pH7-9。例如，氯化钠的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。Tris的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。咪唑的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。然后，可以添加洗脱液并且收集流穿液。洗脱液可以包含100-500mM氯化钠、10-50mM Tris、100-500mM咪唑，pH8.0。例如，氯化钠的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。Tris的浓度可以为10、15、20、25、30、35、40、45或50nM。咪唑的浓度可以为110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480或490nM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。
酶切可以包括添加胶原工具酶酶切(按蛋白总量与胶原工具酶总量比为10-100:1，例如50:1，10-20℃，例如16℃酶切2-8h，例如4h)。将酶切后的蛋白液透析，例如放入透析袋，于1-6℃，例如4℃透析1-8h，例如2h，再转移至新的透析液中1-6℃，例如4℃过夜透析。
纯化可以包括精纯(例如蛋白等电点＞8.0)。优选地，精纯包括用强阴离子交换层析柱(例如pH可以为7、7.5、8、8.5或9。)对含目标蛋白的洗脱液或酶切后的产物(例如酶切且透析后的产物)进行梯度洗脱。梯度洗脱包括0-15％ B液1-5分钟然后保持1-5个，例如3个柱体积、15-30％ B液1-5分钟然后保持1-5个，例如3个柱体积、30-50％ B液1-5分钟然后保持1-5个，例如3个柱体积、50-100％ B液1-5分钟然后保持1-5个，例如3个柱体积。B液可以包含10-50mM Tris，0.5-5M氯化钠，pH7-9。例如，Tris的浓度为15、20、25、30、35、40或45mM。氯化钠的浓度为1、2、3或4M。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。精纯可以包括使用A液平衡柱材并且上样，然后梯度洗脱。A液可以包含10-50mM Tris，10-50mM氯化钠，pH7-9。例如，Tris的浓度为15、20、25、30、35、40或45mM。氯化钠的浓度为15、20、25、30、35、40或45mM。pH可以为7、7.5、8、8.5或9。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
进一步提供以下实施例以阐明本发明。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1：重组IV型人源化胶原蛋白片段的构建、表达和筛选
1.进行大规模功能区筛选，得到以下不同的重组IV型人源化胶原蛋白的目的基因功能区。
1)C4P7Ch的氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为Gakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeq，SEQ ID NO:1，重复单元数目为10；C4P7Ch的氨基酸序列为SEQ ID NO:2)：
C4P7Ch碱基序列(SEQ ID NO:3)：
2)C4P7Cf(重复单元的氨基酸序列为Gakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfmgppgpq，SEQ ID NO:4，重复单元数目为8；C4P7Cf的氨基酸序列为SEQ ID NO:5)：
C4P7Cf碱基序列(SEQ ID NO:6)：
3)C4P7Ca氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为GFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLP，SEQ ID NO:7，重复单元数目为6；C4P7Ca的氨基酸序列为SEQID NO:8)：
C4P7Ca碱基序列(SEQ ID NO:9)：
4)C4P7Cb氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为Gfpgfpgakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfmgppgpq，SEQ ID NO:10，重复单元数目为8；C4P7Cb的氨基酸序列为SEQ IDNO:11)：
C4P7Cb碱基序列(SEQ ID NO:12)：
5)C4P7Cc氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为Gfpgfpgakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfm，SEQ ID NO:13，重复单元数目为8；C4P7Cc的氨基酸序列为SEQ ID NO:14)：
C4P7Cc碱基序列(SEQ ID NO:15)：
6)C4P7Cd氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为Gfpgfpgakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeq，SEQ ID NO:16，重复单元数目为10；C4P7Cd的氨基酸序列为SEQ ID NO:17)：
C4P7Cd碱基序列(SEQ ID NO:18)：
7)C4P7Ce氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为Gakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfmgppgpqgqpglp，SEQ ID NO:19，重复单元数目为8；C4P7Ce的氨基酸序列为SEQ IDNO:20)：
C4P7Ce碱基序列(SEQ ID NO:21)：
8)C4P7Cg氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为Gakgdkgskgevgfpglagspgipgskgeqgfm，SEQ ID NO:22，重复单元数目为10；C4P7Cg的氨基酸序列为SEQ ID NO:23)：
C4P7Cg碱基序列(SEQ ID NO:24)：
9)C4P7Ea氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为Glpgtpgptgpagqkgepgsdgipgsagekgepglp，SEQ ID NO:25，重复单元数目为10；C4P7Ea的氨基酸序列为SEQ ID NO:26)：
C4P7Ea碱基序列(SEQ ID NO:27)：
10)C4P7Eb氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为Gptgpagqkgepgsdgipgsagekgepglp，SEQ ID NO:28，重复单元数目为10；C4P7Eb的氨基酸序列为SEQ ID NO:29)：
C4P7Eb碱基序列(SEQ ID NO:30)：
11)C4P7Ec氨基酸序列(重复单元的氨基酸序列为Gfpgfpgakgdkgskgevgfpglagspgipgsk，SEQ ID NO:31，重复单元数目为10；C4P7Ec的氨基酸序列为SEQ ID NO:32)：
C4P7Ec碱基序列(SEQ ID NO:33)：
上述每种编码核苷酸序列为商业合成。将上述每种编码核苷酸序列(在5’端添加了胶原工具酶酶切位点，胶原工具酶酶切位点的氨基酸序列为ENLYFQ，核苷酸序列为GAAAACCTGTATTTCCAG)插入pET-28a-Trx-His表达载体的KpnI和XhoI酶切位点之间，得到重组表达质粒。
3.将构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。具体过程为：(1)在超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)置于冰上，待半融时取2μl待转化的质粒加入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，稍微混匀2-3次。(2)将混合物置于冰上冰浴30min，然后于42℃水浴热激45-90s，取出后置于冰上冰浴2min。(3)转移至生物安全柜中，并加入700μl液体LB培养基，然后于37℃、220rpm条件下培养60min。(4)取200μl的菌液均匀涂布在含有氨苄西林钠的LB平板上。(5)将平板在37℃的培养箱中培养15-17h，待其长出大小均匀的菌落。
4.从转化好的LB平板中挑取5-6个单菌落于含有抗生素储液的LB培养基的摇瓶中，在220rpm，37℃恒温摇床中7h。再将培养后的摇瓶降温至16℃，添加IPTG诱导表达一段时间后，将菌液分装于离心瓶中，于8000rpm、4℃离心10min，收集菌体，并记录菌体重量，取样(标注：菌液)进行电泳检测。
5.将收集的菌体用平衡工作液(200mM氯化钠、25mM Tris、20mM咪唑，pH8.0)重悬，将菌液降温至≤15℃，进行均质，高压均质两次(分别取两次均质后的样品标注：均一、均二)，完成后收集菌液。将均质后的菌液分装至离心瓶中，于17000rpm、4℃离心30min，收集上清液，取上清液(标注：上清液)和沉淀进行电泳检测。
6.将重组IV型人源化胶原蛋白进行纯化和酶切，具体过程是：(1)粗纯：a.水洗柱材(Ni6FF，Cytiva)，5个CV。b.平衡液(200mM氯化钠、25mM Tris、20mM咪唑，pH8.0)平衡柱材，5个CV。c.上样：将离心后的上清液加入柱材中，直至液体流完后，取流穿进行电泳检验(标注为流穿)。d.清洗杂蛋白：添加洗杂液25mL(200mM氯化钠，25mM Tris，20mM咪唑)至液体流完，并取洗杂流穿进行电泳检验(标注为洗杂)。e.收集目的蛋白：添加20mL洗脱液(200mM氯化钠、25mM Tris、250mM咪唑，pH8.0)，并收集流穿液(标注：洗脱)，检测蛋白浓度计算蛋白量，并进行电泳检测。f.用1M咪唑工作液清洗柱材(标注为1M洗)。g.纯化水清洗柱材。(2)酶切：按蛋白总量与TEV酶总量比为50：1，添加TEV酶，16℃酶切4h，取样进行电泳检测(标记为切后)。将酶切后的蛋白液放入透析袋，于4℃透析2h，再转移至新的透析液中4℃过夜透析(标记为换液)。
(3)精纯：a.平衡柱材(Capto Q，Cytiva)：使用A液(20mM Tris，20mM氯化钠，pH8.0)将柱材平衡，流速为10ml/min。b.上样：流速为5ml/min，上样并收集流穿(标注QFL)，并进行电泳检测。c.梯度洗脱：分别设置0-15％B液(20mM Tris，1M氯化钠，pH8.0)2min然后保持3个CV、15-30％ B液2min然后保持3个CV、30-50％ B液2min然后保持3个CV、50-100％B液2min然后保持3个CV，出峰收集并进行电泳检测(标注为B洗)。d.清洗柱材。将蛋白储存在4℃环境中。
7.电泳检测
具体过程为：取样品液40μl，加入10μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH:6.8)，10％SDS,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。
图1显示了C4P7Ca电泳检测结果。图2显示了C4P7Cb电泳检测结果。图3显示了C4P7Cc电泳检测结果。图4显示了C4P7Cd电泳检测结果。图5显示了C4P7Ce电泳检测结果。图6显示了C4P7Cf电泳检测结果。图7显示了C4P7Cg电泳检测结果。图8显示了C4P7Ch电泳检测结果。图9显示了C4P7Ea电泳检测结果。图10显示了C4P7Eb电泳检测结果。图11显示了C4P7Ec电泳检测结果。图1-图11显示了分离得到的各蛋白质(C4P7Ca、C4P7Cb、C4P7Cc、C4P7Cd、C4P7Ce、C4P7Cf、C4P7Cg、C4P7Ch、C4P7Ea、C4P7Eb和C4P7Ec)的实际分子量与其相应的预期分子量相符，表明蛋白质得到正确表达。
实施例2：重组IV型人源化胶原蛋白的质谱检测
实验方法
蛋白样品(C4P7Cf和C4P7Ch胶原蛋白)经DTT还原和碘代乙酰胺烷基化处理后，加入胰蛋白酶酶解过夜。酶解后得到的肽段再经C18ZipTip脱盐后，与基质α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)混合点板。最后用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOF/TOF UlraflextremeTM，Brucker，Germany进行分析(肽指纹图谱的技术可以参考Protein J.2016；35:212-7)。
数据检索是通过从本地masco网站上MS/MS Ion Search页面处理的。蛋白质鉴定结果是根据酶解后所产生的肽段的一级质谱得到的。检测参数：Trypsin酶解，设两个漏切位点。设定半胱氨酸的烷基化为固定修饰。甲硫氨酸的氧化为可变修饰。鉴定所用的数据库为NCBprot。
表1：重组IV型人源化胶原蛋白C4P7Cf质谱检出分子量及对应多肽
检出多肽片段与理论序列相比，覆盖率为99.04％
(
下划线的残基为覆盖部分)，检测结果非常可信。
表2：重组IV型人源化胶原蛋白C4P7Ch质谱检出分子量及对应多肽
检出多肽片段与理论序列相比，覆盖率为98％(
下划线的残基为覆盖部分)，检测结果非常可信。
实施例3：重组IV型人源化胶原蛋白的生物活性检测
胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao,Satoshi Yanagisawa,Tetsuo Asakura,Design,Expression and Characterization of Collagen-LikeProteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived fromNative Collagens,J Biochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：
(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括牛Ⅰ型胶原蛋白(中国食品药品检定研究院，编号：380002)、本发明提供的重组人源化胶原蛋白C4P7Cf、C4P7Ch。
具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)＝144×(A215-A225)计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。该方法的原理是：测定肽键在远紫外光下的特征吸收，不受生色团含量的影响，干扰物质少，操作简便，适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。(参考文献为Walker JM.The ProteinProtocols Handbook,second edition.HumanaPress.43-45.)。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/mL。
(2)样本准备：使用样品原液直接进行实验；使用D-PBS将阳性对照牛Ⅰ型胶原蛋白(PC)稀释至1mg/ml备用；阴性对照为D-PBS缓冲液(NC)。
(3)包被：在酶标板中分别加入不同浓度的胶原蛋白(C4P7Cf或C4P7Ch)及阳性对照和阴性对照，每孔100μL,每组设置5个复孔，4℃孵育过夜。
(4)封闭：弃去上清，加入100μL 1％ BSA(56℃热灭活30min)，37℃孵育60min。弃去上清，用D-PBS溶液清洗3次。
(5)细胞接种：每孔中加入105个D-PBS重悬的培养状态良好3T3/NIH细胞，37℃孵育120min。每孔用D-PBS溶液清洗3次。
(6)检测：用CCK8检测试剂盒(厂商碧云天，产品目录编号C0038)检测OD450 nm的吸光度。根据如下公式，计算细胞的贴壁程度。细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的细胞粘附能力。细胞粘附能力越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。
式中：
P：相对细胞粘附性比值；
OD1：测试胶原蛋白样品各复孔在450nm处的紫外吸光度平均值；
OD2：对照胶原蛋白样品各复孔在450nm处的紫外吸光度平均值；
OD0：空白对照组各复孔在450nm处的紫外吸光度平均值。
(7)统计分析：使用双尾t-test统计分析目标重组人源化胶原蛋白与阴性对照的统计学差异，其中*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。
结果如图11和12所示，与D-PBS组相比，阳性对照有明显促细胞粘附作用，重组人源化胶原蛋白C4P7Cf、C4P7Ch亦对细胞粘附有促进作用。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。

Claims (10)

1.重组胶原蛋白，其包含一个或多个重复单元，所述重复单元直接或通过接头连接，所述重复单元包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:1或28，所述变体是(1)所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
优选地，其中多个重复单元为2-50个重复单元，例如2-45、2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、4-10或6-10个重复单元；
优选地，其中接头包含一个或多个氨基酸残基，例如1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个或1-2个氨基酸残基；
优选地，其中突变选自取代、添加、插入或缺失；
优选地，其中取代是保守氨基酸取代；
优选地，其中重组胶原蛋白是重组人源化胶原蛋白；优选是重组IV型胶原蛋白；优选是重组人IV型胶原蛋白或重组IV型人源化胶原蛋白；
优选地，其中重组胶原蛋白具有细胞粘附活性；
优选地，其中SEQ ID NO:1的变体包含以下突变：在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N端添加GFPGFP(SEQ ID NO:34)或SEQ ID NO:34的1-5个氨基酸残基长的N端截短片段，和/或在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的C端添加GFMGPPGPQGQPGLP(SEQ ID NO:35)或SEQ ID NO:35的1-14个氨基酸残基长的C端截短片段或者在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的C端截短1-5个氨基酸残基；
优选地，其中SEQ ID NO:28的变体包含以下突变：在SEQ ID NO:28的氨基酸序列的N端添加Glpgtp(SEQ ID NO:36)或其1-5个氨基酸残基长的N端截短片段；
优选地，其中SEQ ID NO:1的变体选自SEQ ID NO:4、7、10、13、16、19、22、或31；和/或SEQ ID NO:28的变体是SEQ ID NO:25。
2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白，其包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29或32，所述变体是(1)所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与所述氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
优选地，其中突变选自取代、添加、插入或缺失；
优选地，其中取代是保守氨基酸取代。
3.核酸，其编码根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白，
优选地，其中核酸包含经密码子优化的核苷酸序列，
优选地，其中核苷酸序列是针对真核宿主细胞或原核宿主细胞，如酵母或大肠杆菌表达进行密码子优化的核苷酸序列；
优选地，其中核酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30或33。
4.载体，其包含根据权利要求3所述的核酸，
优选地，其中载体包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件、纯化标签的核苷酸和/或前导序列的核苷酸，
优选地，其中表达控制元件选自启动子、终止子或增强子；
优选地，其中纯化标签选自His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签；
优选地，载体是表达载体或克隆载体，优选为pET-28a(+)。
5.宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的核酸或根据权利要求4所述的载体；其中优选地，宿主细胞是真核细胞或原核细胞；其中优选地，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞，和/或原核细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌BL21。
6.组合物，其包含根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白、根据权利要求3所述的核酸、根据权利要求4所述的载体和根据权利要求5所述的宿主细胞中的一个或多个，优选地，组合物是试剂盒；优选地，组合物是生物敷料、人体仿生材料、整形或美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种，优选地其中组合物为表面用组合物、注射用组合物或口服用组合物；优选地，组合物是溶液、冻干粉、凝胶、海绵或纤维形式的组合物。
7.根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白、根据权利要求3所述的核酸、根据权利要求4所述的载体、根据权利要求5所述的宿主细胞和/或根据权利要求6所述的组合物在生物敷料、人体仿生材料、整形或美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种中的用途。
8.促进细胞粘附的方法，其包括使根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白、根据权利要求3所述的核酸、根据权利要求4所述的载体、根据权利要求5所述的宿主细胞和/或根据权利要求6所述的组合物与细胞接触的步骤，优选地，细胞是动物细胞，优选哺乳动物细胞，优选人细胞。
9.一种美容方法，其包括对受试者施用根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白，优选地施用为表面施用、口服施用或注射施用；优选地，受试者是人。
10.生产根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白的方法，其包括：
(1)在合适的培养条件下培养根据权利要求5所述的宿主细胞；
(2)收获包含重组胶原蛋白的宿主细胞和/或培养基；和
(3)纯化重组胶原蛋白；
优选地，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞；
优选地，步骤(3)包括用纯化柱，例如镍柱纯化重组胶原蛋白和/或用胶原工具酶切割重组胶原蛋白。
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