BR112014027155B1

BR112014027155B1 - Método de produção de uma ou mais células t primárias humanas modificadas e vetor para modificar células t primárias humanas

Info

Publication number: BR112014027155B1
Application number: BR112014027155-0A
Authority: BR
Inventors: Charles L. Sentman
Original assignee: The Trustees Of Dartmouth College
Priority date: 2012-04-30
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2022-03-29
Also published as: US9273283B2; RU2653761C2; CN108384758A; CN104395463A; US11136549B2; JP6805204B2; EP3447125B1; EP2844742B1; JP6411328B2; HK1207882A1; RU2018111729A3; CN108795875A; EP3904503A1; ES2878724T3; MX2019007492A; AU2018253624A1; US9663763B2; WO2013166051A1; AU2013256424A1; MX366018B

Abstract

COMPOSIÇÕES DE CELÚLAS T DEFICIENTES DO RECEPTOR DE CÉLULAS T. A invenção é direcionada para células T modificadas, métodos de produção e uso células T modificadas isoladas, e métodos de uso destas células T modificadas isoladas para tratar de doenças e distúrbios. Em uma modalidade, esta invenção refere-se amplamente a células T deficientes de TCR, respectivas populações isoladas e composições que compreendem as mesmas. Em outra modalidade da invenção, estas células T deficientes em TCR são projetadas para expressar um receptor não TCR funcional. A invenção refere- se também aos métodos de produção das referidas células T deficientes de TCR, e métodos de redução ou atenuação, ou prevenção ou tratamento, de doenças e distúrbios usando as referidas células T deficientes de TCR, respectivas populações ou composições que compreendem as mesmas.

Description

[0001] Esta invenção foi feita com apoio do governo sob o contrato número CA 130911 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0002] Este pedido é uma continuação em parte do Pedido U.S. N° 13/502.978, depositado em 19 de abril de 2012, que é um pedido de estágio nacional de Pedido de Patente Internacional N°. PCT/US2010/54846, depositado em 29 de outubro de 2010, que reivindica o benefício da prioridade para o Pedido Provisório de Patente U.S. N° 61/255,980, depositado em 29 de outubro de 2009, as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[0003] A invenção é direcionada para células T deficientes em TCR, métodos de fazer e uso de células T deficientes em TCR, e métodos de usar estas células T deficientes em TCR, para dirigir-se a doenças e distúrbios. Em uma modalidade, esta invenção refere-se amplamente de células T deficientes em TCR, populações isoladas respectivas e composições que compreendem o mesmo. Em outra modalidade da invenção, estas células T deficientes em TCR são projetadas para expressar um receptor TCR não funcional. A invenção refere-se também aos métodos de fazer as referidas células T deficientes em TCR, e métodos de reduzir ou atenuar ou prevenir ou tratar, as doenças e distúrbios usando as referidas células T deficientes em TCR, populações respectivas ou composições que compreendem o mesmo.

Descrição da Técnica Relacionada

[0004] A carga global de câncer dobrou entre 1975 e 2000, e o câncer deverá se tornar a principal causa de morte no mundo até 2010. De acordo com a American Cancer Society, é projetada para dobrar novamente até 2020 e triplicar até 2030, portanto, há uma necessidade de terapias mais eficazes para tratar várias formas de câncer. Idealmente, qualquer terapia de câncer deve ser eficaz (em matar as células cancerosas), alvo (ou seja, seletivo, para evitar matar células saudáveis), permanente (para evitar a recaída e metástases) e preços acessíveis. Os padrões atuais de cuidados para a maioria dos cânceres são insuficientes em alguns ou todos esses critérios.

[0005] Imunoterapia celular tem demonstrado resultar na eliminação de tumores específicos e tem o potencial de fornecer terapia oncológica específica e eficaz (Ho, W.Y. et al. 2003. Cancer Cell 3:13181328; Morris, E.C. et al. 2003. Clin. Exp. Immunol. 131: 1-7; Rosenberg, S. A. 2001. Nature 411: 380-384; Boon, T. and P. Van der Bruggen. 1996. J. Exp. Med. 183:725-729) Células T foram frequentemente as células efetoras da escolha para a imunoterapia devido ao seu reconhecimento seletivo e mecanismos efetores poderosos. As células T reconhecem peptídeos específicos derivados de proteínas celulares internas no contexto do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) usando seus receptores de célula T (TCR).

[0006] É reconhecido na técnica que o complexo TCR associa de maneira precisa pela formação de dímeros e associação desses dímeros (dímero TCR alfa/beta, CD3-gama/épsilon, CD3-delta/épsilon e CD3-zeta) em um complexo TCR que pode ser exportado para a superfície da célula. A incapacidade de qualquer destes complexos de formar adequadamente vai inibir o conjunto TCR e expressão (Call, M.E. et al. (2007) Nature Rev. Immunol., 7:841-850; Call, M.E. et al, (2005) Annu. Rev. Immunol, 23:101-125).

[0007] Resíduos de aminoácido específico nas respectivas cadeias TCR foram identificados como importantes para a formação adequada do dímero e montagem de TCR. Em particular, para o TCR-alfa, estes aminoácidos chaves na porção do transmembrana são arginina (para associação com CD3-zeta) e lisina (para associação com o dímero CD3- epsilon/delta). Para TCR-beta, a chave de aminoácidos na porção transmembrana é uma lisina (para associação com dímero CD3- epsilon/gama). CD3-Gamma, o aminoácido chave na porção transmembrana é um ácido glutâmico. Para CD3-delta, o aminoácido chave na porção transmembrana é um ácido aspártico. Para CD3 épsilon, a chave de aminoácidos na porção transmembrana é um ácido aspártico. Para CD3-zeta, a chave de aminoácidos na porção transmembrana é um ácido aspártico (Call, M.E. et al., (2007) Nature Rev. Immunol., 7:841-850; Call, M.E. et al, (2005) Annu. Rev. Immunol., 23:101-125)

[0008] Peptídeos derivados de proteínas alteradas ou mutadas em tumores podem ser reconhecidos por TCRs específicos. Vários estudos principais conduziram à identificação de antígenos associados a tumores específicos que foram capazes de induzir respostas eficazes de linfócitos T citotóxicos (CTL) em pacientes (Ribas, A. et al. 2003. J. Clin. Oncol. 21: 2415-2432). Mecanismos efetoras de células T incluem a capacidade de matar células tumorais diretamente e a produção de citocinas que ativam outras células imunes do hospedeiro e alterar o microambiente do tumor local. Teoricamente, as células T podem identificar e destruir uma célula de tumor expressando um único peptídeo mutado. Imunoterapia adotiva com os clones de CTL específicos para MART1 ou gp100 com baixa dose de IL-2 foi eficaz na redução ou estabilização da carga do tumor em alguns pacientes (Yee, C. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. ScL USA 99:16168-16173). Outras abordagens usam células T com um receptor anti-tumoral definido. Essas abordagens incluem modificar geneticamente CTLs com receptores de célula T antígeno-específicos novos que reconhecem peptídeos de tumor e MHC, receptores de antígeno quimérico (CARs) derivados de fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFv) acoplados a um elemento de sinalização adequado, ou o uso de receptores de células NK quimérico (Ho, W.Y. et al. 2003. Cancer Cell 3:431-437; Eshhar, Z. et al. 1993. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90:720724; Maher, J. e E.T. Davies. 2004. Br. J. Cancer 91 :817-821; Zhang, T. et al. 2005. Blood 106:1544-1551)

[0009] Terapias de células são usadas em pacientes que falharam a tratamentos de quimioterapia ou radiação convencional, ou tem uma recaída, muitas vezes tendo tentado mais de um tipo de terapia. As células do sistema imunológico de pacientes com câncer avançado, que podem ter passado por rodadas de quimioterapia, não respondem tão robustamente quanto indivíduos saudáveis. Além disso, os pacientes de câncer muitas vezes são idosos e podem sofrer de outras doenças que podem limitar o potencial de suas células imunes, tornar-se células efetoras aprontada, mesmo após a expansão e ativação in vitro. Além disso, cada paciente com câncer deve fornecer um número suficiente de suas próprias células imunes em ordem para poderem ser projetados para expressar um novo receptor imune. Porque cada terapia deve ser feita para o paciente, este processo requer semanas desde o momento da decisão de empreender tal terapia é feita; enquanto isso, o câncer continua a crescer. Publicação do Pedido de Patente U.S. No. U.S. 2002/0039576 divulga um método para modular a atividade das células T, onde as células T usadas tem um fenótipo CD3+-a- TcR+CD4"CD8"CD28'NKl.l" A Publicação do Pedido de Patente U.S.2006/0166314 divulga o uso de células-T mutantes para tratar o câncer onde as células T são aquelas com uma resposta de célula T mediando proteína MDM2-específica do receptor de células-ae T.

[00010] Câncer não é a única doença em que a manipulação de células T poderia ser uma terapia eficaz. É conhecido que os receptores de célula T ativos em células T são essenciais para a resposta do corpo para estimular a atividade do sistema imunológico. Por exemplo, tem sido demonstrado que a diversidade de receptor de células T desempenha um papel no enxerto-versus-doença do hospedeiro (GVHD), em particular GVHD crônica (Anderson et al. (2004) Blood 104: 1565-1573). Na verdade, a administração de anticorpos para o receptor de células T tem mostrado reduzir os sintomas da GVHD aguda (Maeda et al. (2005) Blood 106:749-755).

[00011] Há ainda uma necessidade das terapias baseadas em células T mais eficazes para o tratamento de determinadas doenças e distúrbios e métodos de tratamento baseados no design de novos tipos de células T.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00012] Em uma modalidade, esta invenção refere-se amplamente às células T isoladas, modificadas que não expressam um receptor funcional de células T (TCR). Na presente modalidade, as células T são deficientes em TCR na expressão de uma TCR funcional. Em outra modalidade da invenção, células T deficientes em TCR são projetadas para expressar um receptor funcional não -TCR, tais como, por exemplo, um receptor quimérico. Estas células também funcionam como uma plataforma para permitir a expressão de outros receptores de segmentação, por exemplo, os receptores que podem ser úteis em doenças específicas, mantendo as funções efetoras de células T, embora sem um funcionamento TCR.

[00013] A invenção contempla as populações de células T deficientes em TCR e composições que compreendem o mesmo. A invenção também contempla métodos de fazer as referidas células T deficiente em TCR e métodos de reduzir ou atenuar ou prevenção ou tratamento, doenças e transtornos usando as referidas células T deficientes em TCR, populações respectivas ou terapêuticas composições que compreendem o mesmo. Em uma modalidade, essa composição pode ser usada para tratar câncer, infecção, uma ou mais doenças autoimunes, doença da radiação, ou a prevenir ou tratar a doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) ou rejeição de transplante em um assunto de passar por uma cirurgia de transplante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00014] A Figura 1 ilustra os receptores quiméricos NK aqui descritos. Extracelular (EC), transmembrana (TM), e citoplasmáticos (Cyp) porções são indicadas. De tipo selvagem (WT) e quimérica (CH), formas de receptores são indicadas, em que NH2 denota o N-terminal e COOH denota o C-terminal.

[00015] A Figura 2 ilustra que TIMs reduzem reconhecimento TCR e função de células T humanas durante a cultura com halogênico PBMCs. O Painel (A) mostra que células de T 'HM transfectadas cultivadas com PMBCs halogênico têm uma redução na produção de IFN-Y. A produção total de IFN-Y é mostrada. Painel (B) mostra a quantidades de IFN-Y depois da subtração da quantidade de IFN-Y autólogo. Esse valor representa o IFN-y específico produzido por reconhecimento do PBMC halogênico.

[00016] A Figura 3 ilustra a ativação de células T que expressam TIM usando um receptor de direcionamento recombinante para o câncer. Células T expressando TIM que co-expressaram um receptor quimérico de NKG2D (chNKG2D), que reconhece a ligantes específicos sobre vários tipos de células tumorais, produziram uma maior quantidade de IFN-y sobre a co-cultura com células de tumor RPMI8226 do mieloma múltiplo. Em alguns poços, um bloqueio NKG2D mAb foi incluído para impedir a chNKG2D reconhecendo seus ligantes sobre as células do tumor, e isto demonstra a resposta específica do receptor chNKG2D nestas células T.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS Definições

[00017] É para ser entendido que está invenção não é limitada à metodologia particular, protocolos, linhagens celulares, espécies animais ou gêneros e reagentes descritos, como tal pode variar. É também para entendido que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção que será limitada apenas pelas reivindicações acrescentadas.

[00018] Como usado aqui as formas singular "a", "e", e "o" incluem plural referentes a menos que o contexto claramente dito de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células e a referência à "proteína" inclui a referência a uma ou mais proteínas e equivalentes respectivas conhecidos para aqueles qualificados na técnica e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos neste documento têm o mesmo significado como é comumente entendido como aqueles versados na técnica a que está invenção pertence a menos que claramente indicado de outra forma.

[00019] No contexto da presente invenção, por uma "célula T deficientes em TCR", ou uma frase similar destina-se a células T isoladas que carecem de expressão de um TCR funcional, é internamente capaz de inibir a própria produção de TCR, e no qual ainda a progenitura das referidas células T também podem ser razoavelmente esperadas para ser internamente capazes de inibir a sua própria produção de TCR. A capacidade interna é importante no contexto da terapia onde prazos de volume de negócios TCR (~ horas) são muito mais rápidos do que eficácia demonstrável prazos de eficácia (dias- meses), ou seja, capacidade interna é necessária para manter o fenótipo desejado durante o período terapêutico. Isto pode, por exemplo, ser realizado por meios diferentes, conforme descrito infra, por exemplo, por uma célula T de engenharia, tal que ele não expressa qualquer funcional TCR em sua superfície celular, ou pela engenharia da célula T, tal que ele não expressa uma ou mais das subunidades que compõem um TCR funcional e, portanto, não produz um TCR funcional ou por uma célula T de engenharia, tal que produz muito pouco TCR funcional em sua superfície, ou que manifesta um TCR substancialmente diminuído, por exemplo pela engenharia da célula T, para expressar uma mutação ou formas truncadas de uma ou mais das subunidades que compõem o TCR, tornando a célula T incapaz de expressar um TCR funcional ou resultando em uma célula que expressa um TCR substancialmente diminuído. As diferentes subunidades que compõem um TCR funcional são descritas infra. Se uma manifesta a sua célula um TCR funcional pode ser determinada usando métodos conhecidos tais como são conhecidos na técnica aqui descrita. Por um "TCR substancialmente diminuído" depositantes dizem que este TCR substancialmente não irá provocar uma reação imune adversa em um hospedeiro, por exemplo, uma reação de GVHD.

[00020] Conforme descrito em detalhe infra, opcionalmente estas células TCR-deficiente podem projetadas para compreendem outras mutações ou transgenes que, por exemplo, mutações ou transgenes que afetam o crescimento de células T ou proliferação, resultam na expressão ou ausência de expressão de um gene desejado ou construção de gene, por exemplo, outro receptor ou uma citocina ou outros imunomoduladores ou polipeptídio terapêutico ou um marcador selecionável como um gene dominante marcador selecionável, por exemplo, DHFR ou neomicina transferase.

[00021] O "T halogênico" refere-se a uma célula T de um doador com um tecido tipo HLA que coincide com o destinatário. Normalmente, a correspondência é realizada com base na variabilidade em três ou mais loci do gene HLA e uma combinação perfeita nestes loci é preferencial. Em algumas instâncias transplante halogênico doadores podem estar relacionados (geralmente um irmão próximo HLA compatível), singênica (um gêmeo idêntico monozigóticos1 do paciente) ou independente (doador que não é relacionado e descobriu-se ter grau muito perto de HLA compatível). Os genes HLA caem em duas categorias (Tipo I e Tipo II). Em geral, incompatibilidades dos genes Tipo I (ou seja, e. HLA-A, HLA-B ou HLA-C) aumentam o risco de rejeição do enxerto. Uma incompatibilidade de um gene HLA Tipo II (ou seja, HLA-DR ou HLA- DQB1) aumenta o risco de doença do enxerto - versus - hospedeiro.

[00022] No contexto da presente invenção, um "banco de tecido compatíveis com células T deficientes em TCR" refere-se a diferentes composições cada contendo células T de um específico alótipo de HLA que são processados TCR-deficiente de acordo com a invenção. Idealmente este banco será constituído por composições contendo células T de uma vasta gama de diferentes tipos HLA que são representativos da população humana. Tal banco de células-T deficiente em TCR projetadas será útil pois facilitará a disponibilidade de células T, apropriadas para o uso em receptores diferentes, tais como, por exemplo, pacientes com câncer. A invenção fornece métodos de produção de um banco de células T deficientes TCR, tendo diferentes haplótipos HLA. Os métodos compreendem a obtenção de um pool de células isoladas de T tendo um haplótipo definido de HLA, que é determinado pelo padrão digitando procedimentos (por exemplo, anticorpos, PCR ou DNA sequenciamento) e expressando uma molécula inibidora de TCR (TIM) nestas células T que desestabiliza o Complexo TCR reduzindo ou bloqueando a expressão de componentes do complexo TCR. Isso é feito por células T, obtidas a partir de uma variedade de diferentes indivíduos com diferentes haplótipos HLA. Este conjunto de células de doadores diferentes T que expressam TIMs compõem o banco de células T deficientes em TCR. O banco de células T é composto por pools de diferentes células T que cada um contêm células T deficientes em TCR de um tipo específico de HLA. De preferência, o banco de células T é composto por uma variedade de HLA de tipos diferente, por exemplo, pelo menos 10 tipos diferentes de tecido HLA, pelo menos 50 tipos diferentes de tecido HLA, pelo menos 100 tipos diferentes de tecido HLA. Em uma modalidade, o banco de células T é composto por células T de pelo menos 10 tipos diferentes de tecido HLA. Em outra modalidade, o banco de células T é composto por células T de pelo menos 100 tipos diferentes de tecido HLA.

[00023] No contexto da presente invenção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é identificada por aquele versado na técnica como sendo uma quantidade de células T deficientes em TCR que, quando administrada a um paciente, alivia os sinais e ou sintomas da doença {por exemplo, câncer, infecção ou GVHD). O montante real a ser administrada pode ser determinado com base em estudos feitos in vitro ou in vivo, onde as células T deficientes em TCR funcionais apresentam atividade farmacológica contra a doença. Por exemplo, as células funcionais T deficientes em TCR podem inibir o crescimento de células de tumor ou in vitro ou in vivo e a quantidade de células funcionais T deficientes em TCR- que inibe tal crescimento é identificada como uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[00024] A "composição farmacêutica" refere-se a uma composição química ou biológica adequada para administração em um mamífero. Tais composições podem ser formuladas especificamente para administração através de uma ou mais de um número de rotas, incluindo mas não limitado a intracerebroventricular bucal, intra-arterial, intracardíaca, intradérmica, intramuscular, intraocular, intraperitoneal, intraspinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, por via retal, via um enema ou supositório, subcutânea, subcutânea, sublingual, transdérmica e transmucosa. Além disso, a administração pode ocorrer por meio de injeção, líquido, gel, gotas ou outros meios da administração.

[00025] Como usado neste documento, construção de ácido nucleico ou uma sequência de ácidos nucleicos destina-se a dizer que uma molécula de DNA que pode ser transformada ou introduzida em uma célula T e ser transcrito e traduzido para produzir um produto (por exemplo, um receptor quimérico ou uma proteína suicida).

[00026] Os ácidos nucleicos são "operacionalmente ligados" quando colocados em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma sequência sinal está operacionalmente ligado ao DNA a um polipeptídio se ele é expresso como uma pré proteína que participa na secreção do polipeptídio; um promotor ou potencializador está ligado operacionalmente à sequência de código se isso afeta a transcrição da sequência. Geralmente, "operacionalmente ligado" significa que sequências de DNA sendo lingadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguo e no quadro de leitura. No entanto, realçadores não precisa ser contíguo. Vinculação é realizado pela ligadura em locais convenientes de limitação ou, alternativamente, através de um método PCR/ de recombinação familiar para aqueles versados na técnica (Gateway® Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Se não existirem tais sítios, os adaptadores sintéticos do oligonucleotídeo ou ligantes são utilizados em conformidade com a prática convencional.

[00027] A invenção contempla composições e métodos para reduzir ou atenuar, ou prevenir ou tratar doenças ou condições tais como câncer, doenças infecciosas, GVHD, rejeição de transplante, uma ou mais doenças autoimunes ou doença da radiação. Em uma modalidade não limitada, as composições baseiam-se no conceito de proporcionar uma fonte halogênico de células T humanas isoladas, ou seja, as células T deficientes em TCR-, que podem ser fabricadas com antecedência o paciente necessita e barata. A capacidade de criar um único produto terapêutico em um único local usando processos que são bem controlados é atraente em termos de considerações de custo e qualidade. A mudança de um autólogo para uma fonte halogênico de células T oferece vantagens significativas. Por exemplo, estima-se que um único doador saudável pode fornecer suficiente para tratar dezenas de pacientes após transdução e expansão de células T.

[00028] Em conformidade com a presente invenção, células T halogênico modificadas são produzidas que não expressam receptores de células T funcionais (TCRs), é para ser entendido que algumas ou mesmo todas, as subunidades TCR/dímeros podem ser expressas na superfície das células, mas que a célula T não expressa bastante TCR funcional para induzir uma reação indesejável no acolhimento. Sem TCRs funcionais em sua superfície, as células T halogênicas não montam uma resposta imune indesejada de células hospedeiras. Como resultado, estas células T deficientes em TCR não causar GVHD, por exemplo, como não reconhecem as moléculas de MHC de host. Além disso, estas células T deficientes em TCR podem ser projetadas para expressar simultaneamente funcional, não TCR, receptores específicos da doença.

[00029] Como é bem conhecido por aqueles versados na técnica, vários métodos estão disponíveis para isolar células T halogênico de um indivíduo. Por exemplo, usando a expressão do marcador de superfície celular ou usando kits comercialmente disponíveis (por exemplo, ISOCELL™ de Pierce, Rockford, Ill.).

[00030] Para terapia do câncer, a abordagem engloba produzir um pool isolado de células efetoras T deficientes em TCR, por exemplo, de um tecido desejado do alótipo que não expressam uma forma funcional de seu TCR endógena ou que expressam substancialmente reduzidos níveis de TCR endógeno comparado ao tipo selvagem T células tal que eles não desencadeiam uma resposta imune após administração (tais como GVHD), mas em vez disso, expressam um receptor de funcional não-TCR que reconhece as células do tumor ou expressam outro polipeptídio que faz não sensivelmente, ou atacam, doença não- associadas a células, por exemplo, normal (não-oncogenicidade) que não expressam o antígeno ou ligante reconhecido pelo receptor específico de tumor ou que expressam o antígeno ou ligante em níveis reduzidos em relação a células tumorais. Entende-se por aqueles versados na técnica que determinados antígenos associados ao tumor são expressos em tecidos não cancerosos, mas eles são alvos terapêuticos viáveis em um host de tumor-rolamento. Com respeito aos mesmos geralmente entende-se por aqueles qualificados na técnica que certos não-TCR, tumor-específicos receptores são expressos em tecidos não-cancerosos, mas são alvos terapêuticos viáveis em um hospedeiro que carrega o tumor como eles podem ser expressos em níveis significativamente reduzidos no normal do que as células do tumor.

[00031] Enquanto não é necessário para usos mais terapêuticos das células T deficientes em TCR do indivíduo, em alguns casos pode ser desejável para remover algumas ou todas as células T do doador do hospedeiro, logo após eles terem mediado seu efeito antitumoral. Isto pode ser facilitado pela engenharia as células T para expressar receptores adicionais ou marcadores que facilitam sua remoção e/ou identificação do acolhimento como GFP e similares. Enquanto a presente invenção substancialmente deve eliminar qualquer possibilidade de GVHD ou outra reação adversa imune do receptor, este pode ser desejado em alguns indivíduos. Isto não deve comprometer a eficácia como já foi demonstrado que as células do doador T não precisa permanecer muito tempo no hospedeiro para um efeito antitumoral a longo prazo para ser iniciado (Zhang, T., et al. 2007. Cancer Res. 67:11029-11036; Barber, A. et al. 2008. J. Immunol. 180:72-78).

[00032] Em uma modalidade da invenção, construções de ácido nucleico introduzidas nas células T projetadas contém ainda um gene suicida como timidina quinase (TK) do tipo vírus HSV (herpesvirus) Tipo I (Bonini, et al. (1997) Science 276:1719-1724), um baseado em Fas " gene suicida artificiais " (Thomis, et al. (2001) Blood 97:1249-1257), ou e. coli citosina gene deaminase, que são ativados por ganciclovir, AP1903, ou 5-fluorocytosine, respectivamente. O gene suicida é vantajosamente incluído na construção do ácido nucleico da presente invenção para prever a possibilidade de ablação das células T transduzidas em caso de toxicidade e a destruir a construção quimérica, uma vez que o tumor tenha sido reduzido ou eliminado. O uso de genes suicidas para eliminar as células transformadas ou transduzidas é bem conhecido na técnica. Por exemplo, Bonini, et al. ((1997) Science 276:1719-1724) ensinam que os linfócitos do doador transformados com o gene do suicídio de HSV-TK fornecem atividade antitumoral em pacientes por até um ano e eliminação das células transduzidas é alcançada usando o ganciclovir. Além disso, Gonzalez, et al. ((2004) J. Gene Med, 6:704-711) descrevem o direcionamento de neuroblastoma com citotóxica dos linfócitos T clones geneticamente modificados para expressar um scFvFc quimérico: imunorreceptor zeta específico para um epítopo em -CAM LI, em que a construção expressa ainda o gene suicida de timidina quinase de higromicina (HyTK) para eliminar os clones transgênicos.

[00033] Está previsto que o gene suicida pode ser expresso do mesmo promotor como o shRNA, minigene ou receptor de não-TCR ou de um promotor diferente. Geralmente, no entanto, as sequências de ácido nucleico que codificam o receptor de proteína suicida e shRNA, minigene ou receptor de não-TCR funcional residem na mesma construção ou vetor. A expressão do gene suicida do mesmo promotor como o shRNA, minigene ou receptor de não-TCR pode ser realizada usando qualquer local de entrada do ribossoma interno conhecido (IRES). As sequências de IRES adequadas que podem ser usadas na construção do ácido nucleico da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, IRES de EMCV, c-myc, FGF-2, o poliovírus e HTLV- 1. A título de ilustração, apenas, uma construção de ácidos nucleicos para expressar um receptor quimérico pode ter a seguinte estrutura: promotor-> receptor quimérico-> IRES-> gene suicida. Alternativamente, o gene suicida pode ser expresso de um promotor diferente do que a do receptor quimérico (por exemplo, promotor l-> receptor quimérico-> promotor 2-> gene suicida).

[00034] Devido à ampla aplicação de células T para terapias celulares e a natureza melhorada das células T da invenção, a presente invenção compreende qualquer método ou composição, no qual as células T são terapeuticamente desejáveis. Tais composições e métodos incluem aqueles para reduzir ou atenuar ou prevenir ou tratar o câncer, GVHD, rejeição de transplante, infecção, uma ou mais doenças autoimunes, doença da radiação, ou outras doenças ou condições que são baseadas na utilização de células T derivada de uma fonte halogênica que a carece de expressão de TCR funcional.

[00035] Como indicado, em modalidades adicionais da invenção abraçam a expressão recombinante dos receptores de nas referidas células T deficientes em TCR, tais como NKG2D quimérico, domínios quiméricos Fv, NKG2D ou qualquer outro receptor para iniciar sinais para as células T, criando assim potentes, específicas células efetoras T. Um daqueles versados na técnica pode selecionar o receptor apropriado para ser expresso pelas células T deficientes em TCR com base na doença a ser tratada. Por exemplo, receptores que podem ser expressos pelas células T deficientes em TCR para o tratamento de câncer devem incluir qualquer receptor de um ligante que foi identificado em células de câncer. Tais receptores incluem, mas não estão limitados a NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1, e NKp80.

[00036] Em outra modalidade da invenção, tais receptores incluem, mas não estão limitados a, receptores quiméricos, que compreendem um domínio de ligação do ligante obtidos de NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1 e NKp80 ou um anticorpo antitumoral como anti- Her2neu ou anti-EGFR, e um domínio de sinalização obtidos de CD3- zeta, Dap10, CD28, 41BB, and CD40L. Um receptor quimérico exemplar é chNKG2D, em que o NKG2D está vinculado ao domínio citoplasmático da CD3zeta e associa-se com DaplO para fornecer ambos os sinais primários e secundários de ativação de células T (Zhang, T. et al. 2006. Câncer res 66(11): 5927-5933). Em uma modalidade da invenção, liga o receptor quimérico MIC-A, MIC-B, Her2neu, EGFR, mesotelina, CD38, CD20, CD19, PSA, MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, MUC20, receptor do estrogênio, receptores de progesterona, RON ou um ou mais membros da família de RAET1 de ULBP, incluindo ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 e ULBP6.

[00037] Nos métodos da presente invenção é administrado a um paciente que sofre de câncer, GVHD, rejeição de transplante, infecção, doenças autoimunes ou radiação uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que inclua as referidas células T deficientes em TCR. Em outra modalidade da invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que inclua as referidas células T deficientes em TCR é administrado para prevenir, tratar ou reduzir GVHD, rejeição de transplante ou câncer. Métodos de Produção de células T deficientes em TCR

[00038] Células T estáveis que carecem da expressão de um TCR funcional de acordo com a invenção podem ser produzidas usando uma variedade de abordagens. Células T internalizar, classificar e degradam os receptores de toda a célula T como um complexo, com uma meia- vida de cerca de 10 horas em repouso de células T e 3 horas em células T estimuladas (von Essen, M. et al. 2004. J. Immunol. 173:384-393). Bom funcionamento do complexo TCR requer a relação estequiométrica correta das proteínas que compõem o complexo TCR. A função TCR também requer dois funcionamentos proteínas de zeta TCR com motivos de ITAM. A ativação da TCR sobre o noivado de seu ligante de peptídeo-MHC requer o envolvimento de vários TCRs na mesma célula T, que todos devem sinalizar corretamente. Assim, se um Complexo TCR é desestabilizado com proteínas que não associam corretamente ou não sinalizam de forma otimizada, a célula T não se tornar ativada suficientemente para começar uma resposta celular.

[00039] Os métodos da presente invenção incluem expressão de moléculas TCR-inibitórias (TIMs) em células T para desestabilizar o Complexo TCR por bloquear a expressão de componentes essenciais do complexo TCR e/ou interromper a expressão TCR ou função. Existem várias classes de TIMs, incluindo, mas não limitado a, RNA hairpin pequeno (shRNAs) e proteínas de inibidor negativo dominante, por exemplo, proteínas truncadas que faltam motivos importantes de sinalização; As proteínas da IR-fusão que promovem sinais inibitórios; e proteínas com mutações que interrompem a associação adequada com outros componentes do TCR e/ou a adequada sinalização. Geralmente, TIMs podem ser usados para gerar células T deficientes em TCR, impedindo a expressão de nenhum ou muito pouco TCR funcional na superfície da célula, e/ou promovem a expressão de um TCR substancialmente diminuído na superfície das células.

[00040] Como mostrado pelos resultados nos exemplos experimentais infra, o presente inventor demonstrou que expressão de TCR ou função pode ser interrompida ou eliminada usando TIMs, por exemplo, shRNAs e/ou inibidores de negativo dominante, assim produzindo células T deficientes em TCR. Tais linhas de células T deficientes em TCR são adequadas para uso em terapias de células T para o tratamento de câncer e outras doenças e transtornos, conforme descrito abaixo.

[00041] Em uma modalidade de uma em da invenção, a expressão de TCR é eliminada usando RNAs hairpin pequenos (shRNAs) que ácidos nucleicos alvo específicos que codificam TCRs específicos (por exemplo, TCR-a e TCR-β) e/ou cadeias CD3 (por exemplo, zeta CD3) em células primárias de T. Ao bloquear a expressão de uma ou mais destas proteínas, a célula T já não produzirá um ou mais dos componentes-chave da TCR complexa, assim desestabilizando a expressão de superfície de células complexas e impedindo TCR de uma TCR funcional . Apesar de alguns complexos TCR podem ser reciclados à superfície da célula, o Plasmideo impedirá nova produção de proteínas TCR, resultando em degradação e remoção de todo complexo TCR, resultando na produção de uma célula T tendo uma deficiência estável em expressão de TCR funcional.

[00042] A expressão de shRNAs em células T primárias pode ser alcançada usando qualquer sistema convencional de expressão, por exemplo, um sistema de expressão Lentivirus. Embora lentivírus são úteis para o direcionamento células T primárias em repouso, não todas as células T expressarão shRNAs. Algumas dessas células T não podem expressar quantidades suficientes do shRNAs para permitir suficiente inibição da expressão de TCR para alterar a atividade da célula T funcional. Assim, as células T que retêm moderada a alta expressão de TCR depois de transdução viral pode ser removida, por exemplo, através de técnicas de classificação ou separação de células, para que as células T restantes sejam deficientes em superfície de célula TCR ou CD3, permitindo a expansão de uma população isolada de células T deficientes na expressão de TCR funcional ou CD3.

[00043] Em uma modalidade não limitada da invenção, exemplares shRNAs alvos foram concebidos para componentes-chave do complexo TCR como conjuntos descritos abaixo (Tabela 1).

aCom referência ao N° de Acesso EU030678. bCom referência ao N° de Acesso AY247834. cCom referência ao N° de Acesso NM_000733. dCom referência ao N° de Acesso NM_000732. eCom referência ao N° de Acesso NM_000073. f.Com referência ao N° de Acesso NM_000734.

[00044] TCR-alfa, TCR-beta, TCR-gama, TCR-delta, CD3-gama, CD3-delta, CD3-epsilon ou CD3-zeta mRNAs podem ser direcionados separadamente ou em conjunto, usando uma variedade de segmentação shRNAs. As cadeias TCR-β e TCR-a são compostas de porções variáveis e constantes. Vários shRNAs alvos foram concebidos para as porções constantes dessas sequências de TCR/CD3. Um ou uma combinação de shRNAs pode ser usada para cada alvo molecular para identificar o inibidor mais eficiente da expressão de TCR. Usando protocolos estabelecidos, cada construção shRNA é clonada em, por exemplo, um plasmídeo pLko.l ou vetor de pSMc2, com expressão controlada por um promotor rotineiramente usado na técnica, por exemplo, o promotor de U6p. A construção resultante pode ser rastreada e confirmada pela precisão de sequenciamento. O plasmídeo de expressão de shRNA pode então ser transfectado em qualquer célula hospedeira adequada (por exemplo, 293T), juntamente com um plasmídeo de embalagens e um plasmídeo de envelope para embalagens. Células mononucleares de sangue periférico humano primário (PBMC) são isoladas de doadores saudáveis e ativadas com baixa dose solúvel anti-CD3 e, por exemplo, 25U/mL a 50U/mL, rhulL-2 por 72 horas. Embora não é necessário ativar as células T para transdução retroviral, transdução funciona de forma mais eficiente e permite que as células continuar a expandir-se em IL-2. As células ativadas são lavadas e transfectadas, por exemplo, usando uma spin- fection por 1 hora a 30°C, seguido de um período de descanso de 7 horas.

[00045] Em outra modalidade da invenção, a obre-expressão de uma proteína inibidora dominante negativa é capaz de interromper o TCR expressão ou função. Nesta personificação da invenção, um minigene que incorpora a totalidade, ou parte de uma polinucleotídicas codificação para um dos componentes (por exemplo, TCR-alfa, TCR- beta, CD3-gama, CD3-delta, CD3-epsilon ou zeta-CD3) TCR é preparado, mas é modificado para que: (1) ele não possui motivos de sinalização chaves (por exemplo, um ITAM) necessários para a função da proteína; (2) é modificada para que não se associar corretamente com seus outros componentes TCR naturais; ou (3) pode associar corretamente, mas não se liga ligantes (por exemplo, um minigene TCR beta truncado). Além disso, o minigene pode ser alterado para incluir um motivo de sinal inibitório, por exemplo, um domínio citoplasmático de uma proteína KIR, que altera a sinalização a celular e promove sinais inibitório através do recrutamento de fosfatases, por exemplo, SHP1 e SHP2.

[00046] Estes minigenes também podem codificar uma porção de uma proteína que serve como um meio para identificar o minigene superexpresso. Por exemplo, polinucleotídeos codificando uma proteína truncada de CD19, que contém o sítio de ligação para anti-CD 19 mAbs, podem ser operativamente vinculados ao minigene para que a célula resultante que expressa o minigene irá expressar a proteína codificada e pode ser identificada com anti-CD 19 Celia. Esta identificação permite determinar a extensão da expressão minigene e isolar as células que expressam esta proteína (e falta-lhes um TCR funcional).

[00047] Em uma modalidade da invenção, superexpressão de um minigene carece do um motivo (s) de sinalização leva a um complexo de TCR que não pode sinalizar corretamente quando a TCR está envolvida por seu ligante de peptídeo-MHC em uma célula oposta. Em uma modalidade não limitante da invenção, em uma modalidade expressão deste minigene (e o polipeptídio codificado) supera a proteína natural completa quando associam os componentes TCR, resultando em um complexo TCR que não consegue sinal. Em outra modalidade da invenção, o minigene compreende, ou alternativamente consiste, uma codificação polinucleotídicas total ou polipeptídios parciais CD3-zeta, CD3-gamma, delta-CD3 ou CD3 épsilon faltando os motivos ITAM exigidos para sinalização. A proteína CD3-zeta contém três motivos ITAM na porção citoplasmática, e em uma personificação da invenção, remoção de todos estes através de truncamento inibem sinalização adequada TCR em quaisquer complexos onde está proteína modificado é incorporada. Veja, por exemplo, TIM5-8 na tabela 2, que correspondem a SEQ ID NO: 72-79. A construção pode incorporar ITIM ou outros motivos de sinalização, que são conhecidos por alterar a sinalização celular e promover sinais inibitórios através do recrutamento de fosfatases como SHP1 e SHP2. Veja, por exemplo, TIM9-13 na tabela 2, que correspondem a SEQ ID NO: 80-89.

[00048] Em uma personificação da invenção, o minigene compreende uma codificação polinucleotídicas total ou parcial CD3- zeta, CD3-gama, CD3-delta ou polipeptídios CD3 épsilon com mutações, por exemplo, uma alteração de nucleotídeo único, provocar uma alteração do aminoácido codificada pela polinucleotídicas. Veja, por exemplo, TIM14-19 na tabela 2, que correspondem a SEQ ID NOs: 90-101.

[00049] Em uma modalidade da invenção, excesso de expressão de um minigene é modificado para que o polipeptídio codificado pode associar com alguns, mas não todos, dos seus parceiros naturais, criando a concorrência com a proteína normal para aqueles associando proteínas. Em outra hipótese de não-limitação da invenção, uma expressão de nível elevada do minigene (e o polipeptídio codificado) supera as proteínas de parceiro natural e impede a montagem de uma TCR funcional complexo, que exige que todos os componentes para associar as razões adequados e interações da proteína-proteína. Em outra modalidade da invenção, minigenes compreendem, ou alternativamente consistem, total ou parcialmente os polinucleotídeos codificação de proteínas completos (por exemplo, TCR-alfa, TCR-beta, CD3-gama, CD3-delta, CD3-epsilon ou zeta-CD3), mas contendo exclusões selecionadas na sequência de codificação de aminoácidos na porção do transmembrana da proteína que são conhecidos por serem necessários para a montagem com outras proteínas TCR/CD3.

[00050] Em uma modalidade preferencial da invenção, exclusões selecionadas na sequência de codificação de aminoácidos na porção do transmembrana da proteína conhecida devem ser exigidas para montagem com outras proteínas TCR-CD3 incluem, mas não estão limitados a: o resíduo de arginina na posição 5 na região transmembrana TCR-alfa; os resíduos de lisina na posição 10 na região transmembrana TCR-alfa; os resíduos de lisina na posição 9 na região transmembrana TCR-beta; o resíduo de ácido glutâmico na região transmembrana de CD3-gama; o resíduo de ácido aspártico na região transmembrana de CD3-delta-epsilon; o resíduo de ácido aspártico na região transmembrana de CD3 épsilon; e o resíduo de ácido aspártico na região transmembrana de CD3-zeta.

[00051] Superexpressão de uma proteína truncada de TCR alfa, TCR-beta, TCR-gama ou TCR-delta resulta em um complexo TCR que não pode se ligar a ligantes de peptídeo-MHC e, portanto, não funcionará para ativar a célula T. Ver, Figura 2, painéis (A) e (B). Em outra modalidade da invenção, minigenes compõem, ou alternativamente consistem de polinucleotídeos codificando a porção citoplasmática e a transmembrana inteira destas proteínas e porções da região extracelular, mas carece de polinucleotídeos codificação todo ou parte do primeiro domínio extracelular (ou seja, o domínio mais exterior que contém o sítio de ligação do ligante). Em uma modalidade preferencial, polinucleotídeos dos referidos minigenes não codificam polipeptídeos Valfa e Vbeta das cadeias TCR-alfa e TCR-beta. Em uma modalidade, os polinucleotídeos minigenes podem estar ligados operavelmente a polinucleotídeos codificando um marcador de epítopo de proteína (por exemplo, CD19), permitindo assim que a identificação mAb de células expressando esses genes.

[00052] Em outra modalidade, estes minigenes podem ser expressos usando um forte promotor viral, tal como o 5' LTR de um retrovírus, ou um promotor CMV ou SV40. Normalmente, este promotor é imediatamente a montante do minigene e leva a uma alta expressão do minigene mRNA. Em outra modalidade, o construto codifica uma segunda sequência polinucleotídicas sob o mesmo promotor (usando, por exemplo, uma sequência de DNA de IRES entre) ou outro promotor. Esta segunda sequência polinucleotídicas pode codificar para um receptor funcional não -TCR fornecendo a especificidade da célula T. Exemplos deste polinucleotídicas incluem, mas não estão limitados a quimérico NKG2D, NKp30 quimérico, NKp46 quimérico ou quimérico anti-Her2neu. Em uma outra modalidade, promotor-minigenes são construídos em um retroviral ou outro plasmídeo de expressão adequado e transfectado ou transformados diretamente em células T usando métodos padrão (Zhang, T. et al, (2006) Cancer Res., 66(11) 5927-5933; Barber, A. et al, (2007) Cancer Res., 67(10):5003-5008).

[00053] Depois de transdução viral e expansão usando qualquer um dos métodos discutidos anteriormente, as células T que ainda expressam TCR/CD3 são removidas usando anti-CD3 mAbs e grânulos magnéticos usando colunas de seleção Miltenyi conforme descrito anteriormente (Barber, A. et al, (2007) Cancer Res., 67(10):5003-5008). As células T são posteriormente lavadas e cultivadas em IL-2 (25U/ml) por 3 a 7 dias para permitir a expansão das células efetoras de maneira semelhante quanto ao uso das células in vivo.

[00054] A expressão de TCR αβ e CD3 pode ser avaliada por citometria de fluxo e PCR quantitativo em tempo real PCR (qRT-PCR). A expressão do TCR-α, TCR-β, CD3ε, CD3Z e GAPDH (como um controle) mRNA pode ser analisada por qRT-PCR usando um instrumento PCR em tempo real ABI7300 e gene-específico e iniciadores TAQMAN ® usando métodos semelhantes aos usados em Sentman, C.L.et al. ((2004) J. Immunol 173:6760-6766). Mudanças na expressão de superfície de célula podem ser determinadas usando anticorpos específicos para TCR-α, TCR-β, CD3ε, CD8, CD4, CD5 e CD45.

[00055] É possível que uma espécie de shRNA único não pode inibir suficientemente expressão TCR na superfície das células. Neste caso, vários TCR shRNAs podem ser usados simultaneamente para vários componentes do complexo TCR-alvo. Cada componente é necessário para montagem complexa TCR na superfície da célula, então uma perda de uma destas proteínas pode resultar em perda da expressão de TCR na superfície da célula. Enquanto expressão de TCR alguns ou mesmo todos pode permanecer, é a função do receptor que determina se o receptor induz uma resposta imune. A deficiência funcional, ao invés ausência completa da superfície celular, é a medida crítica. Em geral, quanto menor a expressão de TCR, o menos provável suficiente ligação cruzada de TCR pode ocorrer para levar a ativação de células T através do Complexo TCR. Enquanto modalidades particulares abraçam o direcionamento de TCR-alfa e TCR-beta CD3 épsilon, outros componentes do Complexo TCR, como CD3-gamma, CD3-delta ou CD3-zeta, também podem ser direcionados.

[00056] O objetivo principal de remoção de TCR de superfície celular é para evitar a ativação de célula T de alelos de MHC incompatíveis. Para determinar se a redução na expressão de TCR com cada construto shRNA ou minigene é suficiente para alterar a função de células T, as células T podem ser testadas para: (1) sobrevivência da célula in vitro; (2) proliferação na presença de mitomicina PBMCs halogênicas tratadas-C; e (3) produção de citocinas em resposta a PBMC halogênico, anti-CD3 mAbs ou anti-TC mAbs.

[00057] Para testar a sobrevivência das células, as células de T transduzidas são propagadas no meio RPMI completo com rhuIL-2 (por exemplo, 25U/ml a 50U/ml). As células são banhadas em densidades semelhantes no início da cultura e uma amostra pode ser removida para contagem de células e viabilidade diariamente por 7 ou mais dias. Para determinar se as células T expressam TCR suficiente para induzir uma resposta contra células halogênicas, transfectadas ou células T de controle são cultivadas com mitomicina halogênico tratados com C ou singênica PBMC, por exemplo, na proporção de 4:1. As células T são pré-carregadas com CFSE, que é um corante de célula permeável que divide igualmente entre células-filhas após a divisão. A extensão da divisão celular pode ser facilmente determinada por citometria de fluxo. Outra marca de ativação de célula T é a produção de citocinas. Para determinar se cada construto shRNA inibe a função de células T, células de T transduzidas são cultivadas com diferentes doses de mAbs anti- CD3 (1.6 a 5000 ng/mL). Depois de 24 horas, sem células sobrenadantes são coletados e a quantidade de IL-2 e/ou produzida de IFN-Y é quantificada por ELISA. PMA ionomicina são usados como um controle positivo para estimular as células T e células T sozinhas são usadas como um controle negativo.

[00058] O efeito de TDvls exemplares, por exemplo, shRNA, proteínas dominantes negativas truncadas, proteínas negativas dominantes da KIR-fusão e proteínas negativas dominantes com sequência de aminoácidos alterada como resultado de alterações de nucleotídeo único, projetado para componentes-chave do complexo TCR, por exemplo, CD3-épsilon ou zeta, na função efetora de células T CD3 foi avaliada e os resultados são fornecidos abaixo na Tabela 2. Estes resultados demonstram que as células T deficientes em TCR podem ser produzidas usando TIMs.

[00059] É possível que a remoção de componentes TCR-alfa ou beta-TCR possa permitir a expansão preferencial de células T TCR- gama delta. Estas células T são bastante raras no sangue, no entanto, a presença destas células pode ser determinada com anticorpos anti- TCR-gama delta. Se há uma consequência natural destas células, o direcionamento de CD3-epsilon, que é necessário para expressão de superfície de célula de ambos os TCR-alfa beta e TCR gama/delta na superfície da célula, pode ser usado. Tanto a IL-2 e IFN-Y são citocinas efetoras chaves que impulsionam a ativação de célula T expansão e macrófagos. Portanto, a falta de produção dessas citocinas é um sinal de inativação funcional. Também é possível medir as mudanças em outras citocinas, tais como TNF-α. Qualquer redução na sobrevivência de células T após a eliminação da expressão TCR pode ser determinada pelo cultivo de células T TCR-deficiente com PBMC, que melhor reflete o ambiente in vivo e fornece suporte para a sobrevivência de células T. Métodos de Produção células T deficientes em TCR - expressando um receptor de células T não - funcional

[00060] Em outra modalidade da invenção, as células T estavelmente deficientes na expressão TCR funcional expressam um receptor funcional não-TCR. Nesta modalidade, a remoção da função TCR (conforme descrito anteriormente) é ainda combinada com a expressão de um ou mais receptores de direcionamento de não-TCR exógenos (como, por exemplo, quimérico NKG2D (chNKG2D) ou moléculas Fv). Esta modalidade fornece produtos de célula "universais", que podem ser armazenados para futura terapia de qualquer paciente com qualquer tipo de câncer, proporciona-se um receptor de direcionamento adequado é empregue.

[00061] Como indicado, em modalidades adicionais da invenção abraçam a expressão recombinante dos receptores nas referidas células T deficientes em TCR, tais como chNKG2D quiméricos, domínios quiméricos Fv, NKG2D ou qualquer outro receptor para iniciar sinais para as células T, criando assim potentes, células T efetoras específicas. Aqueles versados na técnica podem selecionar o receptor apropriado para ser expresso pelas células T deficientes em TCR com base na doença a ser tratada. Por exemplo, receptores que podem ser expressos pelas células T deficientes em TCR para o tratamento de câncer devem incluir qualquer receptor de um ligante que foi identificado em células de câncer. Tais receptores incluem, mas não estão limitados a NKG2D (GENBANK Número de Acesso BC039836), NKG2A (GENBANK Número de Acesso AF461812), N G2C (GENBANK Número de Acesso AJ001684), NKG2F, LLTl, AICL, CD26, NKRPl, NKp30 (e.g., GENBANK Número de Acesso AB055881), NKp44 (e.g., GENBANK Número de Acesso AJ225109), NKp46 (e.g., GENBANK Número de Acesso AJ001383), CD244 (2B4), DNAM-1, e NKp80.

[00062] Em outra modalidade da invenção, tais receptores incluem, mas não estão limitados a, receptores quiméricos que compreendendo um domínio de ligação do ligante obtidos de NKG2D, NKG2A,NKG2C, NKG2F, LLTl, AICL, CD26, NKRPl, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1, e NKp80 ou um anticorpo antitumoral, como anti- Her2neu e anti-EGFR como um domínio de sinalização obtidos de CD3- zeta (CD3Z (por exemplo GENBANK número de acesso humano NM_198053 (SEQ ID NO:62), Dap10 (e.g., GENBANK número de acesso AF072845),CD28, 41BB, e/ou CD40L.

[00063] Em uma outra modalidade da invenção, o receptor quimérico liga MIC-A, MIC-B, Her2neu, EGFR, mesotelina, CD38, CD20, CD19, PSA, MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, MUC20, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, RON, ou um ou mais membros da família ULBP/RAET1 incluindo ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, e ULBP6.

[00064] A título de ilustração, apenas, shRNAs ou minigenes mostrados para expressão na superfície celular do complexo TCR são coexpressos com o receptor de chNKG2D através de um ou mais vetores virais. Para alcançar coexpressão em um vetor, o plasmídeo pode ser conduzido por um promotor U6 e o receptor chNKG2D por um promotor PGK. Em outra modalidade, se uma sequência de IRES é usada para separar os elementos genéticos, em seguida, apenas um promotor é usado.

[00065] Uma proteína do receptor de células NK semelhante a lectina Tipo C particularmente adequado para uso no receptor quimérico inclui um receptor expresso na superfície das células natural killer, em que ao se ligar aos seus ligantes cognatos altera a ativação das células NK. O receptor pode trabalhar sozinho ou em conjunto com outras moléculas. Ligantes para estes receptores geralmente são expressos na superfície de um ou mais tipos de células de tumor, por exemplo, tumores associados com cânceres do cólon, pulmão, mama, rim, ovário, colo do útero e próstata; melanomas; mielomas; leucemias; e os linfomas (Wu, et al. (2004) J. Clin. Invest. 1 14:60-568; Groh, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6879-6884; Pende, et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31 :1076-1086) e não são amplamente expressas na superfície das células dos tecidos normais.

[00066] Exemplos de tais ligantes incluem, mas são não limitados a MIC-A, MIC-B, proteínas de choque térmico, proteínas de ligação de ULBP (por exemplo, ULPBs 1-4) e moléculas HLA não-clássicas como HLA-E e HLA-G, enquanto que as moléculas de MHC clássicas tais como HLA-A, HLA-B, ou HLA-C e respectivos alelos não são geralmente considerados fortes ligantes da proteína do receptor de célula NK semelhante a lectina do tipo C como da presente invenção. Receptores de células NK semelhante a lectina do Tipo C que se ligam a esses ligantes geralmente têm uma estrutura de proteína Tipo II, em que a extremidade N-terminal da proteína é intracelular. Além de quaisquer receptores de célula NK anteriormente listados acima, receptores celulares NK adicionais exemplares deste tipo incluem, mas não estão limitados a, Dectina-1 (número de acesso ao GENBANK AJ312373 ou AJ312372), antígeno associado à função de mastócitos (número de acesso ao GENBANK AF097358), HNKR-P1A (número de acesso ao GENBANK U11276), LLT1 (número de acesso ao GENBANK AF133299), CD69 (número de acesso ao GENBANK NM_001781), homólogo de CD69, CD72 (número de adesão GENBANK NM_001782) CD94 (número de adesão GENBANK NM_002262 ou NM_007334), KLRF1 (número de acesso ao GENBANK NM_016523). receptor de LDL Oxidado (número de acesso ao GENBANK NM_002543), CLEC-1, CLEC-2 (número de acesso ao GENBANK NM_016509), NKG2D (número de acesso ao GENBANK BC039836), NKG2C (número de acesso ao GENBANK AJ001684), NKG2A (número de acesso ao GENBANK AF461812), NKG2E (número de acesso ao GENBANK AF461157), WUGSC:H _DJ0701016.2, ou lectina associada à DAP12 mieloide (MDL-1; Número de acesso ao GENBANK AJ271684). Em uma modalidade preferencial da invenção, o receptor de células NK é humano NKG2D (SEQ ID NO: 58) ou NKG2C humano (SEQ ID NO: 59).

[00067] Receptores semelhantes do Tipo I que seriam úteis para o receptor quimérico incluem NKp46 (número de adesão GENBANK AJ001383), NKp30 (número de adesão GENBANK AB055881), ou NKp44 (número de adesão GENBANK AJ225109).

[00068] Como uma alternativa para a proteína do receptor da célula NK semelhante a lectina do Tipo C, uma proteína associada a proteína do receptor da célula NK semelhante a lectina do Tipo C pode ser usada na proteína do receptor quimérico. Em geral, proteínas associadas com o receptor de células NK semelhante a lectina do tipo C são definidas como proteínas que interagem com o receptor e traduz sinais delas. Proteínas humanas adequadas que funcionam dessa maneira ainda incluem, mas não estão limitadas a DAP10 (por exemplo, número de acesso ao GENBANK AF072845) (SEQ ID NO: 60), DAP12 (por exemplo, número de acesso ao GENBANK AF019562) (SEQ ID NO: 61) e gama de FcR.

[00069] Ao N-terminal do receptor de células NK semelhante a lectina do tipo C é fundido um receptor de sinalização imune, tendo um motivo de ativação de um imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM), (Asp/Glu)-Xaa-Xaa-Tyr*-Xaa-Xaa-(Ile/Leu)-Xaa6.8-Tyr*-Xaa-Xaa- (IIe/Leu) (SEQ ID NO: 55-57) que está envolvido na ativação de respostas celulares via receptores imunes. Da mesma forma, quando empregando uma proteína associada com um receptor de células NK semelhante a lectina do tipo C, um receptor de sinalização imune pode ser fundido ao C-terminal da proteína referida (Fig. 1). Receptores de sinalização imunes adequados para uso no receptor quimérico da presente invenção incluem, mas não estão limitados a cadeia zeta de receptor de células T, a cadeia eta que difere a cadeia zeta somente em no seu éxon mais C-terminal como resultado de splicing alternativo do mRNA zeta, as cadeias delta, gama e épsilon do receptor de células T (CD3 cadeias) e a subunidade gama do receptor FcRl. Nomeadamente modalidades, além de imune, receptores de sinalização identificaram anteriormente, o imunológico, sinalizando que o receptor é o CD3-zeta (CD3 (por exemplo, Número de acesso ao GENBANK NM_198053 humano e NM-000734) (SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 64, respectivamente), ou cadeia humana de receptor-gama de épsilon Fc (por exemplo, Número de acesso ao GENBANK M33195) (SEQ ID NO: 63) ou o domínio citoplasmático ou uma variante de splicing respectivas. Em particular, por exemplo, CD3-zeta tem 2 splicing alternativos transcritos que codificam isoformas variantes distintas, i.e., a variante de transcrição 1 (SEQ ID NO: 62) e a transcrição variante 2 (SEQ ID NO: 64). A isoforma codificada da variante 2 (SEQ ID NO: 65) está faltando um aminoácido interno, em comparação com a variante 1.

[00070] Em modalidades particulares, um receptor quimérico da presente invenção é uma fusão entre NKG2D e CD3-zeta, ou Dap10 e CD3-zeta.

[00071] Na construção de ácido nucleico da presente invenção, o promotor está operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico, codificação do receptor quimérico da presente invenção, ou seja, eles são posicionados de modo a promover a transcrição do RNA mensageiro a partir do DNA que codifica o receptor quimérico. O promotor pode ser de origem genômica ou gerados sinteticamente. Uma variedade de promotores para uso em células T é conhecida na técnica (por exemplo, o promotor CD4 divulgado pela Marodon, et al. (2003) Blood 101(9):3416-23). O promotor pode ser constitutivo ou induzível, onde a indução é associada com o tipo de célula específica ou um determinado nível de maturação. Como alternativa, um número de promotores virais conhecidos também é adequado. Os promotores de interesse incluem o promotor β-actina, o SV40 adiantado e atrasado, promotor de imunoglobulina, promotor do citomegalovírus humano, promotor de retrovírus e promotor do vírus do amigo de foco-formando de baço. Os promotores podem ou não podem estar associados a realçadores, no qual os realçadores podem ser naturalmente associados com o promotor especial ou associados com um promotor diferente.

[00072] A sequência quadro de leitura aberta do receptor quimérico que codifica pode ser obtido de uma fonte de DNA genômica, uma fonte de cDNA, ou podem ser sintetizadas (por exemplo, através de PCR), ou suas combinações. Dependendo do tamanho do DNA genômico e o número de íntrons, pode ser desejável usar cDNA ou uma combinação disso como se verificar que os íntrons estabilizar o mRNA ou fornecem a expressão de células T específicas (Barthel and Goldfeld (2003) J. Immunol. 171(7):3612-9). Além disso, pode ser mais vantajoso usar regiões endógenas ou exógenas não-codificantes para estabilizar o mRNA.

[00073] Para a expressão de um receptor quimérico da presente invenção, a ocorrência natural ou região de iniciação transcricional endógena da sequência do ácido nucleico codificando o componente N- terminal do receptor quimérico pode ser usado para gerar o receptor quimérico no hospedeiro direcionado. Alternativamente, uma região de iniciação transcricional exógena pode ser usada que permite expressão constitutivo ou induzível, em que a expressão pode ser controlada dependendo do hospedeiro de destino, o nível de expressão desejada, a natureza do hospedeiro de destino e similares.

[00074] Igualmente, a sequência sinal direcionando o receptor quimérico para a superfície da membrana pode ser a sequência sinal endógena de componente N-terminal do receptor quimérico. Opcionalmente, em alguns casos, pode ser desejável para trocar essa sequência para uma sequência sinal diferente. No entanto, a sequência sinal selecionada deve ser compatível com a via secretora das células T para que o receptor quimérico seja apresentado na superfície da célula T.

[00075] Da mesma forma, uma região de terminação pode ser fornecida pela ocorrência natural ou região de terminação transcricional endógena da sequência do ácido nucleico codificando o componente C- terminal do receptor quimérico. Alternativamente, a região de terminação pode ser derivada de uma fonte diferente. Na maior parte, a fonte da região de terminação, geralmente não é considerada crítica para a expressão de uma proteína recombinante e uma ampla variedade de regiões de terminação pode ser utilizado sem afetar adversamente a expressão.

[00076] Como será observado por um técnico no assunto, em alguns casos, alguns aminoácidos nas extremidades do receptor de células NK semelhante a lectina do tipo C (ou proteína associadas) ou receptor de sinalização imune pode ser deletado, geralmente não mais que 10, mais geralmente não mais de 5 resíduos. Além disso, pode ser desejável introduzir um pequeno número de aminoácidos nas fronteiras, geralmente não mais de 10, mais geralmente não mais de 5 resíduos. A deleção ou a inserção de aminoácidos geralmente será em consequência das necessidades da construção, fornecendo para sítios de restrição conveniente, facilidade de manipulação, melhoria dos níveis de expressão, ou algo assim. Além disso, o substituto de um ou mais aminoácidos com um diferente aminoácido pode ocorrer por razões semelhantes, geralmente não substituindo mais de cinco aminoácidos em qualquer um domínio.

[00077] A construção quimérica, que codifica o receptor quimérico pode ser preparada em formas convencionais. Desde então, na maior parte, sequências naturais são empregadas, os genes naturais são isolados e manipulados, conforme o caso (por exemplo, quando empregando um receptor do Tipo II, o componente receptor pode ter que ser invertida a sinalização imune), a fim de permitir a adequada a junção dos vários componentes. Assim, as sequências de ácido nucleico que codificam para as proteínas N-terminal e C-terminal do receptor quimérico podem ser isoladas, empregando a reação em cadeia de polimerase (PCR), utilizando iniciadores adequados que resultam na deleção das partes indesejadas do gene. Alternativamente, digestões de restrição de genes clonados podem ser usados para gerar a construção quimérica. Em ambos os casos, as sequências podem ser selecionadas para fornecer sítios de restrição que são terminados sem corte, ou tem sobreposições complementares.

[00078] As diversas manipulações para preparar a construção quimérica podem ser realizadas in vitro e em modalidades particulares a construção quimérica é introduzida em vetores para clonagem e expressão em um hospedeiro apropriado usando métodos padrão de transformação ou da transfecção. Assim, após cada manipulação, a construção resultante de junção de sequências de DNA é clonada, o vetor isolado, e a sequência selecionada para garantir que a sequência codifica o receptor quimérico desejado. A sequência pode ser rastreada por análise de restrição, sequenciamento ou afins.

[00079] Está previsto que a construção quimérica pode ser introduzida em células T como DNA nu ou em um vetor apropriado. Métodos de transfecção estável de células T por eletroporação usando DNA nu são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, a Pat. U.S. N. ° 6.410,319. DNA nu geralmente refere-se ao DNA que codifica um receptor quimérico da presente invenção contido em um vetor de expressão plasmidial na orientação correta para a expressão. Vantajosamente, o uso de DNA nu reduz o tempo necessário para produzir células T que expressam o receptor quimérico da presente invenção.

[00080] Alternativamente, um vetor viral (por exemplo, um vetor retroviral, vetor de adenovírus, vetor de adenovírus associado ou vetor de Lentivirus) pode ser usado para introduzir a construção quimérica em células T. Vetores apropriados para uso em conformidade com o método da presente invenção são não-replicante em células T do indivíduo. Um grande número de vetores é conhecido que são baseados em vírus, onde o número de cópia do vírus mantido na célula é baixo o suficiente para manter a viabilidade da célula. Vetores ilustrativos incluem os vetores pFB-neo (STRATAGENE™), bem como vetores baseados em HIV, SV40, EBV, HSV ou BPV. Após verificação de que a célula T transfectada ou transduzida é capaz de expressar o receptor quimérico como uma proteína de membrana de superfície com a regulação desejada e a um nível desejado, que pode ser determinado se o receptor quimérico é funcional na célula hospedeira para fornecer para a indução do sinal desejado (por exemplo, produção de Rantes, Mipl-alfa, GM-CSF após estimulação com o ligante apropriado).

[00081] Conforme descrito acima, PBMC humano primário é isolado de doadores saudáveis e ativado com baixa dose solúvel anti-CD3 (por exemplo, 40ng mL) e rhuIL-2 (por exemplo, 50U/mL), anti-CD3/anti- CD28 grânulos e rhuIL-2 ou células apresentadoras de antígeno irradiadas e rhuIL-2, as células T ativadas são lavadas e transduzidas com retrovírus, por exemplo, 1 hora de inoculação a 32° C, seguido de um período de descanso de 7 horas. Embora não é necessário ativar as células T para transdução lentiviral, a transdução é mais eficiente e as células continuam a expandir-se em IL-2. As células ativadas são lavadas e transfectadas, conforme descrito neste documento, seguidas de um período de descanso e o submetidas a seleção, por exemplo, G418 por 3 dias. Após a seleção, as células são lavadas e cultivadas em IL-2 por 2 a 7 dias para permitir a expansão das células efetoras de maneira semelhante quanto ao uso das células in vivo. Mudanças na expressão na superfície de célula de receptores são analisadas usando anticorpos específicos para CD3, CD4, NKG2D ou CD5. Espera-se que a expressão do receptor não-TCR exógeno, será aumentada em células que têm sido transfectadas para expressar esse receptor particular, por exemplo, as células T transduzidas com retrovírus que expressam chNKG2D se espera que tenham maior nível de expressão de superfície de chNKG2D.

[00082] A expressão de TCRaβ, CD3 e NKG2D pode ser avaliada por citometria de fluxo e qRT-PCR quantitativo como discutido neste documento. O número de células T CD4+ e CD8+ também pode ser determinado. Em geral números de células e a percentagem de células T que expressam o complexo TCR-deficiente, TCR-competente e chNKG2D, pode ser determinada por citometria de fluxo. Esses números podem ser comparados a PBMCs que têm sido transfectadas com os genes de shRNA ou chNKG2D sozinhos (como controles). As células transduzidas apenas com vetor também podem ser incluídos como controles.

[00083] Depois da transdução viral e expansão, as células TCR+ e TCR- podem ser separadas por mAbs com grânulos magnéticos sobre colunas Miltenyi e células T deficientes em TCR, expressando o receptor de chNKG2D são identificadas e isoladas. Por exemplo, a expressão chNKG2D pode ser verificado por QRT-PCR utilizando iniciadores específicos para o receptor do chNKG2D (Zhang, T. et al. (2007) Cancer Res. 67: 11029-11036; Barber, A. et al. (2008) J. Immunol. 180:72-78). A função dessas células chNKG2D+ TCR- deficientes pode ser determinada pelo cultivo das células com PBMC alogênico ou células tumorais que expressam ligantes de NKG2D. Proliferação de células T e produção de citocinas (por exemplo, INF-Y e/ou IL-2) pode ser determinada por citometria de fluxo e ELISA, respectivamente. Para determinar se as células T que perderam a função TCR e mantiveram a função chNKG2D, células T transfectadas ou controle serão cultivadas com anti-CD3 (1,6 a 5000 ng/mL), PBMC alogênico tratados com mitomicina C ou PBMCs singênicos. Sobrenadantes das células são coletados e a extensão da produção de citocinas (por exemplo, IFN-y e/ou IL-2) é determinada por ELISA. As células T podem ser pré-carregadas com CFSE, que é um corante celular permeável que se divide igualmente entre células-filhas após a divisão. A extensão da divisão celular pode ser facilmente determinada por citometria de fluxo.

[00084] Outra indicação da ativação das células T é a produção de citocinas. Para determinar se a células chNKG2D+ deficientes em TCR induzem a ativação de célula T, as células T são cocultivadas com PBMCs alogênicas tratadas com mitomicina C, PBMC singênica ou células tumorais: P815-MICA (um tumor humano de murino expressando MICA, um ligante para NKG2D), P815, A2008 (uma célula de tumor de ovário humano, ligante NKG2D+) e U266 (uma linhagem celular de mieloma humano, NKG2D ligante +). Depois de 24 horas, os sobrenadantes isentos de células são recolhidos e a quantidade de IL- 2 e INF-y produzida é quantificada por ELISA. Células T sozinhas e cultura com PBMC singênica são usados como um controle negativo. Uma redução maior do que 40% de na produção de IFN-Y foi observada em células T expressando TIM7 e TIM8 que também co-expressa chNKG2D (resultados não mostrados na Figura 3).

[00085] Posteriormente, as células T transduzidas são reintroduzidas ou administradas ao indivíduo para ativar respostas anti-tumorais nos referidos indivíduos. Para facilitar a administração, as células T transduzidas de acordo com a invenção podem ser feitas em uma composição farmacêutica ou feita como implante adequado para administração in vivo, com veículos ou diluentes apropriados, que podem ser ainda farmaceuticamente aceitáveis. Os meios de tornar tal composição ou implante foram descritos na técnica (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Ed., Mack, ed. (1980)). Onde apropriado, as células T transduzidas podem ser formuladas em uma preparação na forma de líquido ou semi-sólido, como uma cápsula, solução, injeção, inalante ou aerossol, das formas usuais para sua respectiva via de administração. Meios conhecidos na técnica podem ser utilizados para prevenir ou minimizar a liberação e absorção da composição, até que ela atinja o tecido alvo ou órgão, ou para assegurar a liberação retardada da composição. Desejavelmente, no entanto, uma fórmula farmaceuticamente aceitável é empregada que não torna inativa as células que expressam o receptor quimérico. Assim, desejavelmente as células T transduzidas podem ser feitas em uma composição farmacêutica contendo uma solução salina equilibrada, de preferência solução salina de Hanks equilibrada ou solução salina normal. Métodos de Melhoria ou Redução de Sintomas, ou Tratamento ou Prevenção, Doenças e Transtornos usando células T deficientes em TCR

[00086] A invenção também é direcionada para métodos de reduzir ou melhorar, ou prevenir ou tratar, doenças e distúrbios usando as células T deficientes em TCR descritas neste documento, populações isoladas respectivas, ou composições terapêuticas que compreende as mesmas. Em uma modalidade, as células T deficientes em TCR descritas neste documento, populações isoladas respectivas, ou composições terapêuticas, que compreendem as mesmas são usadas para reduzir ou diminuir, ou prevenir ou tratar, câncer, infecção, uma ou mais doenças autoimunes, doença da radiação, ou a prevenir ou tratar a doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) ou rejeição de transplante em um indivíduo que passa por uma cirurgia de transplante.

[00087] As células T deficientes em TCR descritas neste documento, populações isoladas respectivas, ou composições terapêuticas que compreendem as mesmas são úteis em alterar rejeição autoimune ou de transplante, porque estas células efetoras podem ser cultivadas em TGF-β durante o desenvolvimento e irão diferenciar para se tornarem células T reguladoras induzidas. Em uma modalidade o TCR não- funcional é usado para dar estas células T reguladoras induzidas a especificidade funcional que é necessária para poderem desempenhar a sua função inibitória no local do tecido da doença. Assim, um grande número de células T reguladoras antígeno-específicas é cultivada para o uso em pacientes. A expressão de FoxP3, que é essencial para a diferenciação de células T reguladoras, pode ser analisada por citometria de fluxo, e inibição funcional da proliferação de células T por essas células T reguladoras pode ser analisada examinando a diminuição na proliferação de células T após estimulação anti-CD3 a cocultura.

[00088] Outra modalidade da invenção é dirigida ao uso das células T deficientes em TCR descritas aqui, populações isoladas respectivas, ou composições terapêuticas que compreendem o mesmo para a prevenção ou tratamento da doença da radiação. Um desafio após tratamento com radiação ou exposição (por exemplo, exposição de bomba, vazamento de radiação) ou outra condição que faz a ablação das células da medula óssea (certas terapias com fármacos) é para reconstituir o sistema hematopoiético. Em pacientes submetidos a transplante de medula, a contagem absoluta de linfócitos no dia 15 pós- transplante está correlacionada com êxito. Aqueles pacientes com uma contagem de linfócitos alta reconstituem-se o bem, por isso é importante ter uma reconstituição de linfócitos boa. Desconhece-se a razão para este efeito, mas pode ser devido a proteção de linfócitos à infecção e/ou produção de fatores de crescimento que favorecem a reconstituição hematopoiética.

[00089] Nas presentes modalidades, células T deficientes em TCR descritas neste documento, populações isoladas respectivas, ou composições terapêuticas que compreendem o mesmo resultam na produção de um grande número de células T que são incapazes de responder aos antígenos MHC alogênicos. Assim, estas células T podem ser utilizadas para reconstituir as pessoas e oferecem proteção contra infecção, levando a auto reconstituição mais rápida das pessoas que sofrem de ablação parcial ou total da medula óssea devido a exposição à radiação. No caso de uma catastrófica ou inesperada exposição a altas doses de radiação, células T deficientes em TCR descritas neste documento, tendo outro receptor funcional, populações isoladas das respectivas, ou composições terapêuticas que compreende o mesmo podem ser infundidas rapidamente em pacientes para oferecer uma reconstituição da sua produção de resposta imune e fator de crescimento para dias ou semanas até suas próprias células hematopoiéticas têm se reconstituído, ou até que a pessoa tenha sido tratada com uma fonte adicional de células-tronco hematopoiéticas (por exemplo, um transplante de medula óssea).

[00090] Um técnico no assunto entenderia como tratar câncer, infecção, rejeição de transplante, uma ou mais doenças autoimunes, por radiação ou GVHD baseados na sua experiência com o uso de outros tipos de células T.

[00091] Além das células T deficientes em TCR chNKG2D+ descritas neste documento, está previsto que as células T deficientes em TCR podem ser modificadas ou desenvolvidas para expressar outros receptores funcionais úteis no tratamento de doenças como câncer ou infecção conforme descrito anteriormente. Brevemente, os métodos de tratamento da invenção contemplam o uso de células T deficientes em TCR expressando receptores funcionais não-TCR, tais como chNKG2D, domínios quiméricos Fv, NKG2D ou qualquer outro receptor para iniciar sinais às células T, criando potentes células T efetoras específicas. Aquele versado na técnica pode selecionar o receptor apropriado para ser expresso pelas células T deficientes em TCR com base na doença a ser tratada. Por exemplo, receptores que podem ser expressos nas células T deficientes em TCR para o tratamento de câncer devem incluir qualquer receptor que se liga a um ligante que foi identificado em células de câncer. Tais receptores incluem, mas não estão limitados a NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1 e NKp80.

[00092] Em outra modalidade da invenção, tais receptores incluem, mas não estão limitados a receptores quiméricos que compreendem um domínio de ligação do ligante obtidos deNKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1, e NKp80, ou um anticorpo antitumoral, tal como anti- Her2neu e anti-EGFR e um domínio de sinalização obtidos de CD3zeta, Dap10, CD28, 41BB, e CD40L.

[00093] Em uma outra modalidade da invenção, o receptor quimérico liga MIC-A, MIC-B, Her2neu, EGFR, mesotelina, CD38, CD20, CD19, PSA, MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, MUC20, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, RON, ou um ou mais membros da família ULBP RAET1 incluindo ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 e ULBP6.

[00094] Também englobados pela presente invenção estão as células T deficientes em TCR que expressam um receptor não-TCR de patógeno associadas e o uso das células T deficientes em TCR expressando o receptor do patógeno para tratar ou prevenir doenças infecciosas. Nesta modalidade, o receptor não-TCR liga-se ao antígeno do vírus ou antígeno viral induzido na superfície de uma célula infectada. A infecção a ser prevenida ou tratada, por exemplo pode ser causada por um vírus, bactérias, protozoários ou parasitas. Vírus que podem ser tratados incluem, mas não limitados a HCMV, EBV, hepatite tipo A, tipo de hepatite B (HBV), hepatite do tipo C (HCV), vírus ebola, VSV, influenza, adenovírus, varicela, herpes simplex tipo I (HSV-1), herpes simplex do tipo 2 (HSV-2), peste bovina, rinovírus, ecovirus, rotavírus, vírus sincicial respiratório, papilomavírus, citomegalovírus (CMV), ecinovirus, arbovírus, hantavírus, vírus coxsackie, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus da rubéola, vírus da pólio, e/ou vírus da imunodeficiência humana tipo 1 ou tipo 2 (HIV-1, HIV-2). Infecções não- virais que podem ser tratadas com as células T deficientes em TCR incluem, mas não limitado as infecciosas por Staphylococcus sp., Enterococcus sp., Bacillus anthracis, Lactobacillus sp., Listeria sp., Corynebacterium diphtheriae, Nocardia sp., Streptococcus sp., Pseudomonas sp., Gardnerella sp., Streptomyces sp., Thermoactinomyces vulgaris, Treponema sp., Camplyobacter sp., Raeruginosa SP., Legionella sp., N. gonorrhoeae, N. meningitides, F. meningosepticum, F. odoraturn, Brucella sp. B. pertussis, B. bronchiseptica, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, S. marcescens, S. liquefaciens, Edwardsiella, P. mirabilis, P. vulgaris, Estreptobacilos, R. fickettsfi, C. psittaci, C. trachomatis, M. tuberculosis, M. intracelular, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. lepraernurium, tripanosomas, clamídia ou rickettsia.

[00095] A eficácia das composições da presente invenção pode ser demonstrada no sistema modelo in vivo mais adequado dependendo do tipo de produto de drogas sendo desenvolvido. A literatura médica fornece divulgação detalhada sobre as vantagens e usa de uma grande variedade de tais modelos. Por exemplo, existem muitos tipos diferentes de modelos de câncer que são usados rotineiramente para examinar a atividade farmacológica de drogas contra o câncer, tais como modelos de xenoenxertos de camundongos (por exemplo, Mattern, J. et al. 1988. Cancer Metastasis Rev. 7:263-284; Macor, P. et al. 2008.Curr. Pharm. Des. 14:2023-2039) ou mesmo a inibição do crescimento de células de tumor in vitro. No caso de GVHD, existem modelos em camundongos de ambos GVHD agudo (por exemplo, He, S. et al. 2008. J. Immunol. 181:7581-7592) e GVHD crônico (e.g., Xiao, Z.Y. et al. 2007. Life Sci 81:1403-1410).

[00096] Uma vez que as composições da presente invenção têm demonstrado serem eficaz in vivo em animais, estudos clínicos podem ser projetados com base em doses demonstradas como sendo seguras e eficazes em animais. Aquele versado na técnica pode projetar tais estudos clínicos usando protocolos padrão, como descrito nos livros didáticos como Spilker (2000. Guide to Clinical Trials. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia) Administração

[00097] Em uma modalidade da invenção, as células T deficientes em TCR são administradas a um indivíduo destinatário em uma quantidade de entre cerca de 106 a 1011 células. Em uma modalidade preferencial da invenção, as células T deficientes em TCR são administradas para um indivíduo destinatário em uma quantidade de entre 108 a 109 células. Em uma modalidade preferencial da invenção, as células T deficientes em TCR são administradas a um indivíduo destinatário com uma frequência de uma vez a cada vinte e seis semanas ou menos, como uma vez a cada 16 semanas ou menos, uma vez cada oito semanas ou menos, ou uma vez a cada quatro semanas ou menos.

[00098] Esses valores fornecem a orientação geral da gama de células T transduzidas para ser utilizado pelo praticante acima otimizando o método da presente invenção para a prática da invenção. A recitação neste documento de tais intervalos não impede o uso de uma quantidade maior ou menor de um componente, como pode ser justificada em uma aplicação específica. Por exemplo, a dose real e horário podem variar dependendo se as composições são administradas em combinação com outras composições farmacêuticas, ou dependendo de diferenças interindividuais na disposição de drogas, farmacocinética e metabolismo. Aquele versado na técnica facilmente pode-se fazer os ajustes necessários, em conformidade com as exigências da situação particular.

[00099] Aquele versado na técnica seria capaz de determinar uma dose eficaz e frequência de administração com base nos ensinamentos da técnica ou através de experimentos de rotina, por exemplo, guiados pela divulgação neste documento e os ensinamentos de Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman's The pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C, & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; e Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams &Wilkins. a programação de dose pode ser baseada em terapias celulares bem estabelecidas (ver, e.g., Topalian e Rosenberg (1987) Acta Haematol. 78 Suppl 1:75-6; U.S. Pat. No.4,690,915) ou uma estratégia alternativa de infusão contínua pode ser empregada.

[000100] Em uma outra modalidade da invenção, as células T deficientes em TCR são administradas a um indivíduo em uma formulação farmacêutica.

[000101] Em uma modalidade da invenção, as células T deficientes em TCR podem opcionalmente ser administradas em combinação com um ou mais agentes ativos. Tais agentes ativos incluem analgésico, anti-inflamatório, antibiótico, antiviral e agentes anti-citocinas. Agentes ativos incluem agonistas, antagonistas e moduladores de TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12,IL-13, IL-18, IFN-α, rEN-Y, BAFF, CXCL13, IP- 10, VEGF, EPO, EGF, HRG, Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF), Hepcidina, incluindo anticorpos reativos contra qualquer um dos anteriores e anticorpos reativos contra qualquer um dos seus receptores. Agentes ativos também incluem Ácidos 2-Arilpropiônico, Aceclofenaco, Acemetacina, Acetilsalicílico (aspirina), o ácido Alclofenac, Alminoprofen, Amoxiprin, Ampyrone, ácidos Arylalkanoic, Apazona, Benorylate Benorilate, Benoxaprofen, Bromfenac, carprofeno, Celecoxib, salicilato de Salicilato de Magnésio Colina, Clofezona, inibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenaco, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolaco, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenâmico, Fenbufen, fenoprofeno, ácido Flufenamioc, Flunoxaprofen, flurbiprofeno, ibuprofeno, Ibuproxam, indometacina, Indoprofen, ebuzona, cetoprofeno, cetorolaco, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxibe, Salicilato de Magnésio, Ácido Meclofenamica mefenâmico, Meloxicam, Metamizol, Salicilato de Metila, Mofebutazone, Nabumetona, Naproxeno, Ácidos N- Aiylantranilico, fator de crescimento do nervo (NGF), Oxametacin, Oxaprozin, Oxicams, Oxiphenbutazona, Parecoxiba, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicama, Pirprofen, Profenos, Proglumetacina, Salicilato de Pirazolidina derivados, Rofecoxiba, Salicilacil, Salicilamida, Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindaco, Suprofeno, Tenoxicam, Ácido Tiaprofenico , Ácido Tolfenâmico, Tolmetina e Valdecoxiba.

[000102] Antibióticos incluem Amicacina, Aminoglicosídeos, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinsa, Arsfenamina, Azitromicina, azlocilina, Aztreonama, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenemas, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexin, Cefalotin, Cefalotina, Cefamandole, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepime, Cefixime, Cefoperazona, cefotaxima, cefoxitina, Cefpodoxime, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima, Ceftobiprole, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinas, Cloranfenicol, Cilastatin, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacillin, Colistina, Cotrimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Dirithromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, Ácido Fusídico Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopeptídeos, Herbimicina, Imipenem, Isoniazida, Canamicina, Levofloxacin, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrolídeos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocillin, Minociclina, Monobactamas, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoína, Norfloxacina, Floxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacillin, Platensimycin, Polimixina B, polipeptídeos, Prontosil, pirazinamida, quinolonas, quinupristina, rifampicina, rifampicina, Roxithromycin, espectinomicina, estreptomicina, Sulfacetamide, Sulfamethizole, Sulfanilimide, Sulfasalazine, Sulfisoxazole, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas, Ticarcillin, Tinidazole, TobramicinaTrimetoprim, Sulfametoxazol-trimetoprim, Troleandomicina, Trovafloxacina e Vancomicina.

[000103] Agentes ativos incluem Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides, Cortisol, Acetato de Cortisona, Acetato de Desoxicorticosterona, Dexametasona, Acetato de Fludrocortisona, Glicocorticoides, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides e Triancinolona. Qualquer combinação adequada destes agentes ativos é também contemplada.

[000104] Um "excipiente farmacêutico" ou um "excipiente farmaceuticamente aceitável" é um veículo, geralmente um líquido, no qual um agente terapêutico ativo é formulado. Em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico ativo é uma população de células T deficientes em TCR. Em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico ativo é uma população de células T deficientes em TCR expressando um receptor de funcional não-TCR. O excipiente geralmente não fornece qualquer atividade farmacológica da formulação, que proporciona estabilidade química e/ou biológica. Formulações exemplares podem ser encontradas, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed, Grennaro, A., Ed., 1995 que está incorporada por referência.

[000105] Neste documento "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente" inclui quaisquer solventes, dispersão media, revestimentos, agentes antibacteriano e antifúngico, isotônicos e absorção atrasando agentes fisiologicamente compatíveis. Em uma modalidade, a transportadora é adequada para administração parenteral. Alternativamente, o portador pode ser apropriado para administração por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular ou por via sublingual. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersões. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmaceuticamente é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer mídia convencional ou agente é incompatível com o composto ativo, uso em composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Compostos ativos complementares também podem ser incorporados as composições.

[000106] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, veículos apropriados incluem, mas não estão limitados a Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Phosphate Buffered Saline (PBS) ou qualquer meio de congelação tendo, por exemplo, 10% de DMSO e 90% de soro humano.

[000107] Composições farmacêuticas normalmente devem ser estéreis e estável nas condições de fabricação e armazenamento. A invenção contempla que a composição farmacêutica está presente na forma liofilizada. A composição pode ser formulada como uma solução. O veículo pode ser um meio de dispersão contendo, por exemplo, água.

[000108] Para cada uma das modalidades recitadas, os compostos podem ser administrados por uma variedade de formas de dosagem. Qualquer forma de dosagem aceitável biologicamente conhecida por aqueles versados na técnica e combinações destes, são contemplados. Exemplos de tais formas de dosagem incluem, sem limitação, líquidos, soluções, suspensões, emulsões, injetáveis (incluindo subcutânea, endovenosa, intramuscular e intradérmica), infusões e suas combinações.

[000109] A descrição acima de várias modalidades ilustradas da invenção não pretende ser exaustiva ou limitar a invenção a forma exata divulgada. Enquanto modalidades específicas de e exemplos para, a invenção estão descritos neste documento para fins ilustrativos, várias modificações equivalentes são possíveis no âmbito da invenção, como aqueles qualificados na técnica relevante vai reconhecer. Os ensinamentos aqui apresentados da invenção podem ser aplicados a outros fins, que não sejam os exemplos descritos acima.

[000110] Estas e outras alterações podem ser feitas para a invenção, tendo em conta a descrição detalhada acima. Em geral, em declarações a seguir, os termos utilizados não devem ser interpretados para limitar a invenção para as modalidades específicas divulgadas na especificação e as reivindicações. Nesse sentido, a invenção não é limitada pela divulgação, mas em vez o escopo da invenção é determinado inteiramente pelas seguintes reivindicações.

[000111] A invenção pode ser praticada de formas diferentes das descritas particularmente na precedente descrição e exemplos. Inúmeras modificações e variações da invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações acrescentadas.

[000112] Certos ensinamentos relacionado com o receptor de células T, composições de células T deficiente e métodos de utilização dos mesmos foram divulgados no Pedido de patente provisório U.S. n. ° 61/255,980, arquivado em 29 de outubro de 2009, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[000113] Certos ensinamentos relacionados com a produção de células T expressando receptores quiméricos e métodos de uso dos mesmos foram divulgados nos EUA não publicação do pedido de patente. NOS 2010/0029749, publicado a 4 de fevereiro de 2010, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[000114] Determinadas sequências polinucleotídicas úteis na produção de receptor de células T deficientes de receptor de células T da invenção são divulgadas na sequência de listagem que acompanha este depósito de pedido de patente, e a divulgação da referida listagem é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[000115] A divulgação completa de cada documento citado (incluindo patentes, aplicações de patentes, artigos, resumos, manuais, livros ou outras divulgações) nos Fundamentos da invenção, descrição detalhada e exemplos neste documento é incorporada por referência em sua totalidade.

[000116] Os exemplos a seguir são apresentados para fornecer aqueles versados na técnica com uma divulgação completa e descrição de como fazer e usar a invenção do indivíduo e não se destinam a limitar o escopo do que é considerado como a invenção. Têm sido feitos esforços para garantir a exatidão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.) mas alguns erros experimentais e desvios devem ser permitidos. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, peso molecular é a massa molecular média, é de temperatura em graus centígrados; e a pressão está próximo do atmosférico. EXEMPLOS Exemplo 1: Produção de células T deficientes de receptor de células T (TCR)

[000117] Minigenes são codificados em um plasmídeo de expressão de retrovírus (p. ex. pFB-neo ou pSFG) que contêm sequências LTR 5' e 3'. Os plasmídeos são embalados em uma linha de celular retroviral embalagens, tais como PT67 ou PG13, e partículas virais são recolhidas uma vez que as células crescem em confluência. Células T são então ativadas por PHA, anti-CD3 ou anti-CD3/28 mAbs para 1 a 3 dias em meio completo (ou meio livre de soro) Além de rIL-2 (25 U/ml), e as células T são transfectadas por inoculação a 32° C, na presença de Tetranectina ou polibreno. Depois de descansar por cerca de 5 a 7 horas, as células são lavadas e colocadas em meio fresco, mais IL-2 para 2 a 7 dias. As células são contadas, periodicamente para evitar a concentração excessiva de célula (i.e., > 2 x 106 células/mL) e re- plaqueadas em 7 x 10s células/mL. Meio de seleção para remover as células T de não-transfectadas opcionalmente é usado depois de 2 dias por um período de 3 a 5 dias. Células vivas são colhidas por gradiente Lymphoprep™ (Sentinel, Milan, Itália) e ampliadas por 1 a 3 dias.

[000118] Após incubação, as células são analisadas para a expressão e a função da TCR. A expressão do receptor não-TCR funcional também pode ser analisada neste momento, se for o caso. Citometria de fluxo é usada para testar a expressão TCR/CD3 usando anticorpos marcados com fluorocromo. Células vivas estão marcadas com anticorpos contra CD5, CD8 e CD4, em combinação com um anticorpo contra CD3ε, TCRα, TCRβ, TCRy ou TCRδ. Se a expressão de genes CD3 ou TCR é usada, a expressão de proteínas TCR e proteínas CD3 deve ser severamente reduzida em comparação com células T tratadas com o vetor controle. Anticorpos do isótopo controle são usados para controle de fluorescência de fundo. Para identificar as células T, as células são colocadas no canal CD5, então a expressão de CD4, CD8, CD3, e TCR é determinado. Amostras múltiplas são usadas para cada tratamento e compensação adequada dos espectros de emissão do fluorocromo é usada. A expressão de outro receptor (por exemplo, chNKG2D) é determinada usando anticorpos específicos e citometria de fluxo, como descrito anteriormente na técnica (Zhang, T. et al., (2006) Cancer Res., 66(11) 5927-5933; Barber, A. et al., (2007) Cancer Res., 67(10):5003- 5008).

[000119] Para testar para deficiência funcional do TCR, estimulação de células efetoras com anti-CD3 é usada no final da cultura para medir a produção de interferon (IFN)-gama após 24 horas. Células T (2 x 105) são cultivadas com mAbs anti-CD3 solúvel (OKT3) em meio completo. Após 24 horas, meio condicionado livre de células é coletado e analisado por ELISA para IFN-gama. Alterações na expressão de TCR ou função devem refletir na produção reduzida de IFN-gama.

[000120] Para testar a função produção de citocinas específicas da células T funcional não-TCR, incubadas com células tumorais que expressam ou não seu ligante específico é usado. Por exemplo, para testar a função de chNKG2D, 105 células T são incubadas com 105 células tumorais P815-MICA (Iigante+), 105 células P815 (ligante-), 105 células RPMI8226 (ligantes+) ou células T sozinhas. Depois de 24 horas, meio condicionado isento de células é recolhido e IFN-gama medido por ELISA. Células T Quiméricas NKG2D produzem IFN-Y após cultivo com células tumorais que expressam o Iigante (Zhang, T. et al., (2006) Cancer Res., 66(11) 5927-5933; Barber, A. et al, (2007) Cancer Res., 67(10):5003- 5008).Também é possível testar a citotoxicidade celular contra células tumorais ligantes+, tal como foi previamente descrito na técnica (Zhang, T. et al., (2006) Cancer Res., 66(11) 5927-5933) A especificidade é mostrada usando células tumorais-ligantes ou receptor específico bloqueando mAbs. Exemplo 2: Produção de células T deficientes de receptor de células T (TCR) expressando chNKG2D

[000121] Neste exemplo, a expressão simultânea de um receptor de chNKG2D e expressão e inibição da expressão de TCR endógenos é realizada. Neste exemplo, é usado um receptor murino chNKG2D, composto de NKG2D em combinação com um CD3-zeta anexado ao N- terminal. O receptor de chNKG2D é gerado e expressado em células T murinas. A NKG2D é uma proteína de tipo II, em que o N-terminal está localizado intracelularmente (Raulet (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:781790), ao passo que a cadeia zeta CD3 é tipo proteína I com o C-terminal no citoplasma (Weissman, et al. (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:9709-9713). Para gerar uma proteína de fusão NKG2D-CD3-zeta quimérica, um códon de iniciação ATG é colocado à frente a sequência de código para a região citoplasmática da cadeia zeta-CD3 (sem um códon de parada TAA) seguida por um gene de NKG2D do tipo selvagem. A expressão, a orientação da parte CD3-zeta é invertida no interior das células. Os domínios transmembrana e extracelulares são derivados de NKG2D. Um segundo gene quimérico de codificação do gene DaplO, seguido por um fragmento de codificação para o domínio citoplasmático CD3-zeta também é construído. A Figura 1 apresenta as estruturas dos receptores do tipo quiméricos e selvagens.

[000122] Um shRNA está operavelmente ligado em um vetor de lentivirus com o receptor de chNKG2D. Para alcançar a expressão de ambos os genes, o plasmídeo é impulsionado por um promotor U6 e o receptor chNKG2D por um promotor PGK. PBMC humano primário é isolado de doadores saudáveis e ativado com baixa dose solúvel anti- CD3 e 25U/mL rhuIL-2 por 48 horas. Embora não é necessário ativar as células T para transdução Lentiviral, a transdução irá trabalhar com mais eficiência e permitir que as células continuem a expandir-se em IL-2. As células ativadas são lavadas e transduzidas usando giro (spin-fection) de 1 h a 30°C, seguido de um período de descanso por 7 h. As células são lavadas e cultivadas em 25U/mL de IL-2 por 3 a 7 dias para permitir a expansão das células efetoras da mesma forma como fazemos para uso das células in vivo. A expressão de TCRaβ, CD3 e NKG2D é avaliada por citometria de fluxo e em PCR quantitativo em tempo real (QRT-PCR). O número de células T CD4+ e CD8+ é determinado por citometria de fluxo. Em geral, números de células e o percentual de células T deficientes e expressando o complexo TCR são determinados por citometria de fluxo. Estas são comparadas ao PBMCs que são transduzidas com os genes de shRNA ou chNKG2D sozinhos (como controles). As células transduzidas apenas com vetor, também estão incluídos como controles.

[000123] Prevê-se que essas células com pouca ou nenhuma expressão de TCR na superfície da célula irão expressar quantidades mais elevadas de NKG2D na superfície celular por causa coexpressão do receptor chNKG2D.

[000124] Como uma alternativa, transdução pode ocorrer com dois vírus ao mesmo tempo, um com a construção de shRNA e um com o receptor de chNKG2D. Uma quantidade maior de vírus chNKG2D é usada para garantir a alta expressão de chNKG2D nas células T que a falta de expressão de TCR. As células T TCR+ que podem permanecer são removidos para obter TCR-, células chNKG2D + T.

[000125] Depois da transdução viral e expansão, células TCR+ e TCR- são separadas por mAbs com grânulos magnéticos sobre colunas Miltenyi. A verificação da expressão chNKG2D é executada por QRT- PCR utilizando iniciadores específicos para o receptor do chNKG2D.

[000126] Para determinar se as células T perderam função TCR e manteve a função chNKG2D, células T transduzidas ou controle são cultivadas com PBMC alogênico tratados com mitomicina C ou PBMCs singênico. As células T são pré-carregadas com CFSE, que é um corante celular permeável que divide igualmente entre células-filhas após a divisão. A extensão da divisão celular pode ser facilmente determinada por citometria de fluxo.

[000127] Para determinar se a construção shRNA pode inibir a função de TCR e permitir que a função do receptor chNKG2D, as células T transduzidas são cultivadas com PBMCs tratadas mitomicina-C, as PBMC halogênicas ou singênicas, células tumorais: P815-MICA (um tumor murino expressando MICA humano, um ligante para NKG2D), P815, A2008 (uma célula de tumor de ovário humano, ligante NKG2D), e U266 (uma linhagem de células de mieloma humano, ligante NKG2D+). Após 48 horas, os sobrenadantes livres de células são recolhidos e a quantidade de IL-2 e IFN-Y produzido vai ser quantificada por ELISA. As células T são utilizadas por si só como controle negativo. Exemplo 3: administração in vivo de células T deficientes de receptor de células T (TCR) expressando chNKG2D

[000128] Neste exemplo, as células T deficientes em TCR expressando um receptor chNKG2D murino como produzido no exemplo 2 são administradas a camundongos para avaliar o potencial terapêutico in vivo das referidas células T em certos tipos de câncer. As células T contendo NKG2D quiméricos (106) são coinjetadas com células de tumor RMA/Rae-lβ (105) por via subcutânea em camundongos C57BL/6. Ratos tratados com células T deficientes de TCR, contendo NKG2D quimérico, que são livres de tumor ou que tem o crescimento tumural inibido de tumores RMA/Rae-lβ após 30 dias reflete a atividade anti-câncer terapêutica nestes ratos.

[000129] Em um segundo e mais rigoroso modelo, células T transduzidas (107) são transferidas adotivamente i.v. em camundongos B6 um dia antes da inoculação do tumor RMA/Rae-lβ s.c. no flanco direito. A supressão do crescimento dos tumores RMA/Rae-lβ (s.c.) comparado com células T modificadas por vetor controle reflete a atividade anti-câncer terapêutica nestes camundongos. Quanto à toxicidade do tratamento com células T NKG2D modificadas quiméricas, prevê-se que os animais não vão mostrar provas evidentes de dano inflamatório (ou seja, cabelo em tufos, corcunda ou diarreia, etc.) quando tratadas com as células T contendo NKG2D quiméricos, o que seria o reflexo de uma falta de toxicidade evidente.

[000130] Em um modelo mais rigoroso dos tumores ovarianos estabelecidos (ID8), células T transduzidas chNKG2D (5 x 106 células T, i.p.) são injetadas em ratos com tumores por 5 semanas. São ainda injetadas células T em camundongos nas 7 e 9 semanas após o desafio do tumor. Nestas condições, ratos tratados com as células T chNKG2D permanecerão livres de tumor por mais de 250 dias, enquanto que os camundongos tratados em uma programação semelhante com as células de T controle irá morrer de crescimento tumoral dentro de 100 dias. Quanto à toxicidade do tratamento com células quiméricas NKG2D-modificadas, prevê-se que os animais não vão mostrar provas evidentes de dano inflamatório (ou seja, cabelo babado, corcunda ou diarreia, etc.) quando tratadas com as células T contendo NKG2D quiméricos, que seriam o reflexo de uma falta de toxicidade evidente.

[000131] Em um modelo de mieloma múltiplo, camundongos contendo células do tumor 5T33MM são tratados com infusão de células de tumor no 12 dia pós a infusão de células T com chNKG2D (5 x 106 células, i.v.) Este tratamento irá resultar em uma maior duração de todos os camundongos e cerca de metade destes camundongos serão sobreviventes de longo prazo, livre de tumor. Camundongos tratados com células T controle vão sucumbir aos seus tumores no prazo de 30 dias. Não há evidência de toxicidade observada devido ao tratamento com as células T chNKG2D.

[000132] Porque o sistema imunológico pode selecionar para variantes do tumor, as imunoterapias mais eficazes para o câncer provavelmente serão aquelas que induzem a imunidade contra vários antígenos tumorais. Numa terceira experiência, verifica-se se o tratamento com células T contendo NKG2D quiméricos irá induzir imunidade do hospedeiro contra células tumorais do tipo selvagem. Camundongos que são tratados com células T contendo NKG2D quiméricos e células de tumor 5T33MM e estão livres de tumor após 80 dias, são desafiados com células de tumor 5T33MM. Camundongos sobreviventes livres de tumor são resistentes a um desafio posterior de células 5T33MM (3 x 105), em comparação com camundongos naive controle que sucumbem ao tumor dentro de uma média de 27 dias. No entanto, os camundongos sobreviventes livres de tumor não são resistentes a um desafio subsequente de células de tumor RMA-Rael (3 x 105) e sucumbem ao tumor em um intervalo de tempo similar como camundongos naive (20 dias). Isso indica que a transferência adotiva de células T contendo NKG2D quiméricos permitirá hospedeiros gerar memória de células T específicas para o tumor.

[000133] Esta invenção, quatro classes de moléculas TCR-inibitório (TIMs) que afetam a função da célula T são fornecidas. A Tabela 2 é um resumo do efeito de 19 diferentes TIMs nas células T efetoras funcionar também em resposta ao solúvel anti-CD3 (OKT3 (200ng/mL)) estimulação (CD3), ou cultura com PBMC halogênico (Alio). Designações da esquerda referem-se à classe de TIM. Valores numéricos indicam redução percentual de inibição de TCR em relação ao vetor para controlar pFB células T transduzidas. NI: nenhuma inibição. ND: não feito. Tabela 2. Resumo do efeito de moléculas Inibitórias TCR (TIM) na função de células T.

Exemplo 4: Produção de células T deficientes de receptor de células T (TCR) usando shRNAs direcionando ácidos nucleicos que codificam CD3 épsilon ou CD3 zeta

[000134] Neste exemplo, expressão endógena de TCR foi inibida usando sequências shRNA que têm como alvo os ácidos nucleicos que codifica CD3-epsilon ou zeta-CD3,

[000135] As sequências shRNA clonadas dentro do vetor retroviral pSM2c (Open Biosystems), com expressão controlada pelo promotor U6, foram comprados. Essas construções shRNA foram usadas para bloquear a expressão das proteínas CD3-epsilon ou zeta-CD3, tal, que a célula T não é mais um dos principais componentes do complexo TCR. Consequentemente, o Complexo TCR foi desestabilizado e expressão de superfície de célula de um TCR funcional foi impedida, resultando na redução da função de células T através do complexo TCR. A sequência de shRNAs contra CD3-epsilon ou zeta-CD3 são descritos na tabela 1, que correspondem a SEQ ID NOs: 9-26 e 68-71, respectivamente.

[000136] Para determinar se o shRNAs alterou a função TCR, a produção de IFN-gama foi medida em resposta à (i) estimulação anti- CD3 solúvel (CD3), ou (ii) em resposta à cultura com PBMC alogênico (Alio). Em particular, as células T, tratadas com TIM1 ou TIM3 tinham uma redução de 22,6% ou 14,9% na inibição de TCR, respectivamente, após estimulação com 200 ng/mL de anticorpo monoclonal anti-CD3. Ver Tabela 2 supra. Exemplo 4: Produção de células T deficientes para o receptor de células T(TCR) usando um inibidor negativo dominante de zeta-CD3

[000137] Neste exemplo, a superexpressão de uma proteína de inibidor negativo dominante, ou seja, um TIM, interrompeu expressão e função do TCR. A expressão TCR endógena foi inibida usando uma proteína inibidora negativa dominante que compreende CD3 zeta alterada para incluir um sinal inibidor de KIR2DL1, e a célula T resultante não foram ativadas em resposta à estimulação de TCR.

[000138] As construções minigene que incorporavam tudo, ou parte de um polinucleotídeo modificado que codifica para CD3-zeta foram geradas por PCR usando modelos de cDNA CD3-zeta e KIR2DL1, correspondente a SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 66, respectivamente, comprados de Open Biosystems (Huntsville, AL). Todos os PCRs foram feitos usando High-Fidelity DNA Polymerase Phusion (New England Biolabs, Ipswich,MA), e iniciadores foram sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Usando protocolos estabelecidos, cada construção foi clonada no vetor retroviral pFB-neo (Stratagene), com expressão controlada por 5' LTR. As construções resultantes foram analisadas e confirmadas pela precisão de sequenciamento e analisadas pelo DNA Dínamo (Blue Trator Software Ltd). As sequências de DNA e suas sequências de proteínas preditas correspondem a SEQ ID NOs: 68-101.

[000139] Os TIMs foram expressos em células T primárias usando um sistema de expressão retroviral. Duas linhagens de células de empacotamento diferentes foram usadas para produzir vírus com um título baixo ou alto. Um vírus de baixo título foi produzido por células GP2-293T que transitoriamente foram transfectadas com o plasmídeo de empacotamento e do plasmídeo de envelope. Após 72 horas, o sobrenadante viral foi colhido e os títulos foram medidos por infecção de células NIH-3T3 com a seguinte seleção com G418. Os títulos dos vírus produzidos por este sistema foram entre 5x105 e 1x107 CFU/mL. Para produzir o vírus de alta concentração, o vírus foi produzido pelo sistema GP2-293T para transduzir células de empacotamento PT67. As células PT67 infectadas com partículas virais foram selecionadas sob tratamento com G418 durante 5 dias. O TIM expressando células PT67 foram expandidos e utilizadas para produção de vírus. 72 horas após as células atingirem a confluência, o sobrenadante viral foi colhido e os títulos foram medidos em células NIH-3T3. Os títulos de vírus obtidos por este sistema eram na gama de 7x107 a 2x108 CFU/mL.

[000140] Para a transdução de células T humanas, PBMCs humanos primários foram isolados a partir de doadores saudáveis e ativados com 40 ng/mL de anti-CD3 solúvel e 50 U/mL rhuIL-2 durante 72 horas. As células T ativadas foram lavadas e transduzidas com retrovírus produzido tanto por vírus de titulação baixos ou elevados utilizando giro (spin-infection) por 1 hora a 32°C, seguido por um período de repouso de 6 horas. As células foram lavadas e cultivadas em 50U/mL de IL-2 durante 48 horas, e, em seguida, submetidos a seleção por 3 dias. Depois da seleção, foram isoladas células vivas utilizando Lymphoprep (Mediatech), e as células efetoras foram expandidas em 50U/mL de IL- 2 por 48 horas, quando as células foram utilizadas para ensaios funcionais. A expressão endógena de células de CD3-epsilon e zeta- CD3 em células transduzidas com shRNAs, e a diminuição na expressão dos genes por shRNA, foram analisadas por PCR quantitativo em tempo real, (qRT-PCR). Resumidamente, o RNA foi extraído a partir de células T transduzidas, e 0,5-1 ug de RNA total foi transcrito de forma inversa utilizando QuantiTect Rev. Transcription Kit (Qiagen). O cDNA resultante foi utilizado com SYBR green (Applied Biosystems) para análise de qRT-PCR, e os dados normalizados para (GAPDH), os níveis de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato. As alterações na expressão da superfície das células foram analisadas utilizando anticorpos específicos para CD3, CD8, CD4, e CD5, e não houve diferença na expressão dessas moléculas da superfície celular foi observada em células T que expressam TIM em comparação com o vetor controle.

[000141] Para determinar se a redução na expressão de TCR com cada construção de shRNA ou minigene (que removido ou interrompido o TCR na superfície da célula) foi suficiente para impedir a ativação da célula T para estimulação de TCR, as células T foram testadas para: (1) a sobrevivência das células in vitro; e (2) a produção de citocinas em resposta a PBMC alogênicas e/ou mAb anti-CD3.

[000142] Para testar a sobrevivência celular, as células T transduzidas foram propagadas em meio RPMI completo com rhuIL-2 (50 U/mL). As células foram plaqueadas a densidades semelhantes no início da cultura, e foi removida uma amostra para contagem de células e viabilidade diariamente durante 7 ou mais dias. Não foi observada diferença no crescimento de TIM expressando células T comparadas as células T que expressam o vector de controle correspondente. Para determinar se as células T que expressam TCR suficiente para induzir uma resposta contra células halogênicas, transduzidas ou células T de controle foram cultivadas com PBMC halogênicos ou autólogas na proporção de 4:1. Após 24 horas, os sobrenadantes livres de células foram recolhidos e a quantidade de IFN-Y produzido foi quantificada por ELISA. As células T sozinhas, incluindo as PBMC e as células transduzidas, foram utilizados como controlos negativos. Entre as moléculas de TCR-inibitórios analisados, dois minigenes (TIM7 e TIM8) foram identificados que foram capazes de reduzir significativamente a função de TCR em células T. Veja, A Figura 2. O ensaio foi realizado utilizando alogênico de 19 doadores diferentes que expressam TIM7 ou TIM8, onde cada doador foi cultivado com 3 diferentes PBMC halogênicos. Uma redução média na produção de IFN-y de 49% foi observada em células T que expressam TIM7, e uma redução média de 60% foi observada em células T que expressam TIM8.

[000143] Para determinar se cada TIM inibia a função das células T por estimulação direta do anticorpo do complexo TCR, as células T transduzidas TIM foram tratadas com uma gama de concentrações diferentes de mAb anti-CD3 (1,6 a 5000 ng/mL). Após 24 horas, os sobrenadantes livres de células são recolhidos e a quantidade de IFN-y produzida foi quantificada por ELISA. As células T foram usadas por si só como controle negativo. Quando as células foram estimuladas com 200 ng/mL de mAb anti-CD3 durante 24 horas, uma redução máxima na produção de IFN-Y de 44% e 58% foi observada em células T que expressam TIM7 e TIM8, respectivamente. Coletivamente, isto indica que a redução na expressão de TCR, por exemplo, utilizando as TIM para remover ou perturbar o TCR, é suficiente para alterar a função das células T. Exemplo 5: Produção de células T deficientes em receptor de células T (TCR) células que expressam chNKG2D

[000144] Neste exemplo, foi realizada a superexpressão simultânea de uma proteína inibidora de TCR negativa dominante, ou seja, um TIM e expressão de um tumor quimérico direcionamento do receptor. Em particular, a expressão endógena de TCR foi inibida usando a TIM e receptor quimérico de chNKG2D, ou seja, NKG2D vinculado ao domínio citoplasmático do CD3-zeta, foi expressa. NKG2D associa-se com Dap10 para fornecer ambos os sinais primários e secundários de ativação de células T. Veja, Zhang, T. et al. 2006. Cancer Res. 66 (11): 5927-5933. Os ligantes para NKG2D são expressos pela maioria das células de tumores humanos, mas não na maior parte das células normais.

[000145] A fim de testar a expressão de ambos um TIM e um tumor quimérico do receptor de direcionamento, humanos primários PBMC foram isolados a partir de doadores saudáveis e ativado com 40 ng/mL de anti-CD3 solúvel e 50 U/mL rhuIL-2 por 72 horas. As células T ativadas foram lavadas e transfectadas com alto título de retrovírus usando 1 hora de inoculação a 32°C, seguido de um período de descanso de 7 horas. Quantidades iguais de vírus TIM e chNKG2D foram usadas para a transdução. As células foram lavadas cultivadas em 50 U/mL de IL-2 por 48 horas e então enviadas para seleção de G418 por 3 dias. Após a seleção, células vivas foram isoladas usando Lymphoprep (Mediatech), e as células efetoras foram expandidas em 50 U/mL de IL-2 por 48 horas, quando as células foram utilizadas para os ensaios funcionais. As mudanças na expressão de superfície de célula foram analisadas usando anticorpos específicos para CD3, CD4, NKG2D e CD5. Nenhuma diferença significativa foi observada na expressão destas moléculas de superfície de célula em células T que expressam TIM em relação ao controle de vetor, exceto para uma maior expressão do receptor NKG2D em células transfectadas com o vírus chNKG2D, conforme o esperado.

[000146] Para determinar se o TIM+ chNKG2D+ células teriam uma resposta reduzida de células halogênicas, mas uma resposta aumentada para as células do tumor, as células T co-cultivadas com PBMC alogênico, PBMC singênico ou células tumorais: RPMI8226 (uma linhagem de células de mieloma humana, NKG2D ligante+), PANC-1 (uma linhagem de células de pâncreas humano, NKG2D+), ou NIH-3T3 (uma linhagem de células de fibroblastos de rato normal, NKG2D ligante-), como um controle negativo. Depois de 24 horas, sem células sobrenadantes foram coletados e a quantidade de IFN-Y produzido foi quantificada por ELISA. Células T sozinhas e cultura com PBMC singênico foram usados como controle negativo.

[000147] Sobre o ensaio halogênico, observou-se uma redução de 45% na produção de IFN-y em células T que expressam TIM7, e observou-se uma redução de 44% na produção de IFN-y em células T expressando TIM8 que tinha coexpressão de chNKG2D, em comparação com células expressando o controle do vetor. Quando cultivadas com células tumorais, observou-se um aumento significativo na quantidade de produção de IFN- y, em resposta às células do tumor em células TIM+ chNKG2D+, em comparação com células expressando TIM somente, quando as células do tumor expressaram NKG2D ligantes (RPMI8226 e PANC-1), mas não quando cultivadas com células tumorais de deficiência de ligante (NIH- 3T3). Veja a Figura 3, mostrando um representante experimento usando RPMI8226. O mesmo experimento também demonstrou que a maior produção de IFN-Y foi NKG2D dependente, porque a incubação com um bloqueio mAb para NKG2D resultou em não aumento na produção de IFN- y.

Claims

1. Método de produção de uma ou mais células T primárias humanas modificadas, caracterizado pelo fato de que compreende expressar em uma ou mais células T primárias humanas pelo menos uma molécula inibitória de TCR (TIM) codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO: 76 e 78.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 77.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico é SEQ ID NO: 76.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula T é ainda projetada para expressar um receptor quimérico direcionado ao tumor.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o TIM desestabiliza o complexo TCR através da redução ou bloqueio da expressão de componentes do complexo TCR.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as células T primárias humanas modificadas provocam nenhuma resposta ou resposta da doença enxerto versus hospedeiro (GVHD) reduzida em um receptor humano histocompatível quando comparado com a resposta GVHD provocada pela uma ou mais células T primárias humanas que não expressam a pelo menos uma molécula inibitória TCR (TIM).

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as células T primárias humanas modificadas não provocam uma resposta GVHD em um indivíduo humano.

8. Vetor para modificar células T primárias humanas, caracterizado pelo fato de que contém um ácido nucleico codificando o polipeptídeo CD3-zeta truncado em que sequência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo CD3-zeta truncado é a SEQ ID NO: 76 ou 78.