JP6805204B2 - Ｔ細胞受容体欠損ｔ細胞組成物 - Google Patents

Description

本発明は、国立保健研究機構によって授与された契約番号ＣＡ１３０９１１の下、政府の援助を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

関連出願の相互参照
本出願が２０１２年４月１９日に提出された米国特許出願第１３／５０２，９７８号の一部継続出願であり、２０１０年１０月２９日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５４８４６号の国内段階の出願であり、２００９年１０月２９日に提出された米国特許仮出願番号第６１／２５５，９８０号の優先権の利益を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。

本発明は、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞の作製および使用方法、並びに疾患おより障害に対処するためにこれらのＴＣＲ欠損Ｔ細胞を使用する方法に関するものである。ある実施形態では、本発明は、広く、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞、その単離された個体群、および同細胞を含む組成物に関する。本発明の別の実施形態では、当該ＴＣＲ欠損Ｔ細胞は、機能的非ＴＣＲ受容体を発現させるためにさらに設計される。本発明はまた、当該ＴＣＲ欠損Ｔ細胞の作製方法、並びに当該ＴＣＲ欠損Ｔ細胞、その個体群、または同細胞を含む組成物を使用して、疾患および障害を軽減し、寛解させ、または予防し、若しくは治療する方法に関する。

癌の世界的な負担は１９７５年から２０００年の間に２倍になり、癌は２０１０年までに死亡の主因になると予想される。アメリカがん協会によると、２０２０年までに再度２倍、２０３０年までに３倍になることが予想される。そのため、様々な形式の癌を治療するためのより効果的な療法が必要とされる。理想的には、どんな癌療法も、（癌細胞を殺すことに）効果的であり、標的化され（いわゆる健康な細胞を殺すことを回避するために選択的）、（再発および転移を避けるために）持続的であり、誰でも受け易くあるべきである。大部分の癌ケアの今日の標準は、これらの基準のいくつかまたは全てにおいて、不足している。

細胞免疫療法は特定の腫瘍の死滅をもたらすことを示しており、特定のおよび効果的な癌療法を提供する可能性がある（Ｈｏ、Ｗ．Ｙ．ら２００３．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：１３１８−１３２８；Ｍｏｒｒｉｓ、Ｅ．Ｃ．ら２００３．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１−７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．Ａ．２００１．Ｎａｔｕｒｅ ４１１：３８０−３８４；Ｂｏｏｎ、Ｔ． ａｎｄ Ｐ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ．１９９６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：７２５−７２９）。Ｔ細胞は、選択的認識および強力なエフェクター機序があるため、癌免疫療法に一般的に好まれるエフェクター細胞であることが多い。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して、自己主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の文脈で、内部の分子タンパク質から生じる特定のペプチドを認識する。

当該技術分野では、二量体の形成、およびこれらの二量体（ＴＣＲ-アルファ／ベータ、ＣＤ３-ガンマ／エプシロン、ＣＤ３-デルタ／エプシロン、およびＣＤ３-ゼータ二量体）を細胞表面に輸出することのできる１つのＴＣＲ複合体に関連することによって、ＴＣＲ複合体が正確に恊同していることを認識している。これらの複合体を適切に形成できないことにより、ＴＣＲ構築および発現が抑制される（Ｃａｌｌ、Ｍ．Ｅ．ら、（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：８４１−８５０；Ｃａｌｌ、Ｍ．Ｅ．ら、（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１０１−１２５）。

個々のＴＣＲ鎖の特定のアミノ酸残基は、適切な二量体形成およびＴＣＲ構築に重要なものとして認められている。具体的には、ＴＣＲ-アルファについては、膜貫通部分の重要なアミノ酸はアルギニン（ＣＤ３-ゼータに結合して）およびリジン（ＣＤ３-エプシロン／デルタ二量体に結合して）である。ＴＣＲ-ベータについては、膜貫通部分の重要なアミノ酸はリジン（ＣＤ３-エプシロン／ガンマ二量体に結合して）である。ＣＤ３-ガンマについては、膜貫通部分の重要なアミノ酸はグルタミン酸である。ＣＤ３-デルタについては、膜貫通部分の重要なアミノ酸はアスパラギン酸である。ＣＤ３-エプシロンについては、膜貫通部分の重要なアミノ酸はアスパラギン酸である。ＣＤ３-ゼータについては、膜貫通部分の重要なアミノ酸はアスパラギン酸である（Ｃａｌｌ、Ｍ．Ｅ．ら、（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：８４１−８５０；Ｃａｌｌ、Ｍ．Ｅ．ら．，（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１０１−１２５）。

腫瘍内の改変または変異したタンパク質から生じるペプチドは、特定のＴＣＲによって認識することができる。いくつかの重要な研究が、患者に効果的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の反応を誘導することのできる特定の腫瘍に関連する抗原を同定した（Ｒｉｂａｓ、Ａ．ら２００３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：２４１５−２４３２）。Ｔ細胞エフェクターの機序として、腫瘍細胞を直接殺す能力、およびその他の宿主免疫細胞を活性化し、局所的な腫瘍の微小環境を変化させるサイトカインの生成が挙げられる。理論的には、Ｔ細胞は単一変異ペプチドを発現する腫瘍細胞を識別し、破壊することができると思われる。低用量のＩＬ−２でＭＡＲＴ１またはｇｐ１００に特異的なＣＴＬクローンによる養子免疫療法は、ある患者では腫瘍量が減少し、または安定させるのに効果的である（Ｙｅｅ、Ｃ．ら２００２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１６１６８−１６１７３）。その他のアプローチは定義された抗腫瘍受容体と共にＴ細胞を使用することである。これらのアプローチとして、腫瘍ペプチドおよびＭＨＣを認識する新しい抗原特異的Ｔ細胞受容体でＣＴＬを遺伝学的に修飾すること、適切なシグナリング要素と結合された単一鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）から生じるキメラ抗原受容体（ＣＡＲＳ）、またはキメラＮＫ細胞受容体の使用が挙げられる（Ｈｏ、Ｗ．Ｙ．ら２００３．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：４３１−４３７；Ｅｓｈｈａｒ、Ｚ．ら１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：７２０−７２４；Ｍａｈｅｒ、Ｊ． ａｎｄ Ｅ．Ｔ．Ｄａｖｉｅｓ．２００４．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９１：８１７−８２１；Ｚｈａｎｇ、Ｔ．ら２００５．Ｂｌｏｏｄ １０６：１５４４−１５５１）。

通常の化学療法または放射線治療に失敗し、または再発し、１種類以上の療法を試したことのある患者に、細胞療法を使用する。ひと通りの化学療法を受けていたかもしれない進行した癌を持つ患者の免疫細胞は、健康な個体ほど強く反応しない。さらに、癌患者は高齢であることが多く、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化および増殖後であっても、免疫細胞が刺激されたエフェクター細胞になる能力に限界があり得るその他の疾患を罹患している場合がある。さらに、免疫細胞が新しい免疫受容体を発現するように操作するために、個々の癌患者は十分な数の自分の免疫細胞を提供しなければならない。各療法を患者にカスタムメイドしなければならないため、このプロセスは、当該療法を受けると決心してから数週間を要することになり、その間も癌は増殖し続ける。米国特許出願第ＵＳ２００２／００３９５７６号は、Ｔ細胞活性を調節する方法を開示し、使用するＴ細胞はＣＤ３^＋−αβ−ＴｃＲ^＋ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻ＣＤ２８⁻ＮＫ１．１⁻の表現型を有する。米国特許出願第ＵＳ２００６／０１６６３１４号は、癌を治療するために、変異したＴ細胞の使用を開示し、そのＴ細胞はＴ細胞反応媒介性ＭＤＭ２タンパク質特異的αβ−Ｔ細胞受容体を伴うものである。

Ｔ細胞の操作が効果的な療法に成り得るのは癌だけではない。Ｔ細胞のＴ細胞受容体を活性化することは、免疫系の活動を刺激する身体の反応に欠かせないことが知られている。例えば、Ｔ細胞受容体の多様性が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、特に慢性ＧＶＨＤに役割を似合うことが示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０４：１５６５−１５７３）。事実、Ｔ細胞受容体抗体を投与すると、急性ＧＶＨＤの症状が軽減することが示された（Ｍａｅｄａら（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６：７４９−７５５）。

特定の疾患および障害を治療するためにもっと効果的なＴ細胞に基づく療法、および新しい種類のＴ細胞の設計に基づく治療方法が必要とされている。

ある実施形態では、本発明は、広く、機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現しない単離され、修飾されたＴ細胞に関する。当該実施形態では、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲの発現にＴＣＲが欠損している。本発明の別の実施形態では、例えば、キメラ受容体等の機能的非ＴＣＲ受容体を発現させるように、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を操作する。これらの細胞はプラットホームとしても機能し、機能しているＴＣＲがなくとも、Ｔ細胞のエフェクター機能を保持しながら、その他の標的受容体、例えば、特定の疾患に有用であり得る受容体を発現する。

本発明はＴＣＲ欠損Ｔ細胞の個体群、および同細胞を含む組成物を考慮する。本発明は、当該ＴＣＲ欠損Ｔ細胞の作成方法、および当該ＴＣＲ欠損Ｔ細胞、その個体群、または同細胞を含む治療的組成物を使用して、疾患および障害を低減し、寛解し、または予防し、若しくは治療する方法も考慮する。ある実施形態では、当該組成物は癌、感染症、１つ以上の自己免疫障害、放射線疾患を治療するために、または移植手術を受けている対象の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または移植拒絶反応を予防するために使用することができる。

本明細書に記載のキメラのＮＫ受容体を説明する。細胞外（ＥＣ）、膜貫通（ＴＭ）、および細胞質（Ｃｙｐ）部分を示す。受容体の野生型（ＷＴ）およびキメラ（ＣＨ）形態を示し、ＮＨ_２はＮ末端を示し、ＣＯＯＨはＣ末端を示す。 ＴＩＭが、同種異系ＰＢＭＣで培養中のヒトＴ細胞のＴＣＲ認識および機能を減少させることを説明する。パネル（Ａ）は、同種異系ＰＢＭＣで培養されたＴＩＭが形質導入されたＴ細胞が、ＩＦＮ−γ生成を減少させることを示す。全ＩＦＮ−γの生成を示す。パネル（Ｂ）は自家のＩＦＮ−γの量を減算した後のＩＦＮ−γの量を示す。この値は同種異系ＰＢＭＣの認識によって生成された特定のＩＦＮ−γを表す。 癌についての組換え標的受容体を使用してＴＩＭ発現Ｔ細胞の活性化を説明する。多くの種類の腫瘍細胞で特定のリガンドを認識するキメラＮＫＧ２Ｄ受容体（ｃｈＮＫＧ２Ｄ）を共発現したＴＩＭ発現Ｔ細胞は、ＲＰＭＩ８２２６骨髄腫腫瘍細胞と共培養すると、増加した量のＩＦＮ−γを生成した。いくつかのウェルでは、ｃｈＮＫＧ２Ｄが腫瘍細胞のリガンドを認識するのを防ぐために、ブロッキングＮＫＧ２ＤｍＡｂを含み、このことは、これらのＴ細胞のｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体の特定の反応を証明する。

定義
本発明は、それ自体として変化するように、特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、および記載の試薬に限定されないことを理解されたい。本明細書に使用する用語は、特定の実施形態を記述する目的のためだけにあり、添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されたい。

本明細書に使用される単数形（英語の「ａ」）、「および」および「その」（英語の「ｔｈｅ」）は、明白な断りが他にない限り、複数も含む。したがって例えば、「（１つの）細胞」は、その細胞の複数を含み、「（その）タンパク質」は１つ以上のタンパク質および当業者に周知の等価物を含む。本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、他に明白な断りがない限り、本発明が帰属する当該技術分野の当業者に多く理解される意味と同じ意味を有する。

本発明の文脈で、「ＴＣＲ欠損Ｔ細胞」、または同様のフレーズによって、機能的ＴＣＲの発現を欠いている単離されたＴ細胞が、内部で自身のＴＣＲ生成を抑制することができ、さらに、当該Ｔ細胞の後代も、内部で自身のＴＣＲ生成を抑制することを当然期待してもよいことを意図する。内部の能力は、ＴＣＲの代謝回転のタイムスケール（約〜時間）が、論証可能な有効なタイムスケール（日〜月）よりもっと速い治療法の文脈で重要であり、すなわち、治療期間中に望ましい表現型を保持するために、内部の能力は必要とされる。このことは、下に記載の通り、異なる方法によって達成されてもよく、例えば、細胞表面にいかなる機能的ＴＣＲも発現しないＴ細胞を操作することによって、または機能的ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットを発現せず、したがって機能的ＴＣＲを生成しないように、Ｔ細胞を操作することによって、または表面に機能的ＴＣＲを皆無といってよいほど生成しないように、若しくは実質的に損なわれたＴＣＲを発現するＴ細胞を操作することによって、例えば、ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットの変異した、若しくは短縮された形態を発現するＴ細胞を操作することによって、Ｔ細胞が機能的ＴＣＲを発現することができないようにする、若しくは実質的に損なわれたＴＣＲを発現する細胞にする。機能的ＴＣＲを含む異なるサブユニットについては以下に記載する。細胞が機能的ＴＣＲを発現するかどうかは、本明細書に記載の技術分野に周知のアッセイ方法を使用して決定してもよい。「実質的に損なわれたＴＣＲ」によって、出願人は、当該ＴＣＲが宿主内の有害な免疫反応、例えば、ＧＶＨＤ反応を実質的に誘発しないことを意味する。

下に詳細に記載するように、その他の変異または導入遺伝子を含むようにこれらのＴＣＲ欠損細胞を操作してもよく、例えば、Ｔ細胞の成長または増殖に影響を与える変異または導入遺伝子は、例えば、別の受容体またはサイトカインまたはその他の免疫調節性若しくは治療的ポリペプチド、または優性な選択マーカー遺伝子（例えばＤＨＦＲまたはネオマイシントランスフェラーゼ）といった望ましい遺伝子または遺伝子構築物を発現する、若しくは発現しない。

「同種異系Ｔ細胞」は、レシピエントに適合する組織ＨＬＡタイプを有するドナーからのＴ細胞を意味する。典型的には、ＨＬＡ遺伝子の３つ以上の座の可変性に基づいて適合を行い、これらの座での完全適合が好ましい。いくつかの例では、同種異系の移植ドナーは、親類（たいてい、ＨＬＡ適合が近い兄弟）であっても、同一遺伝子（患者の一卵性「同一」双生児）であっても、または親類でなくても（親類ではないが、ＨＬＡ適合が極めて近いことが認められるドナー）よい。ＨＬＡ遺伝子は２つのカテゴリーに分けられる（Ｉ型またはＩＩ型）。一般的に、Ｉ型遺伝子のミスマッチ（すなわちＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃ）は、移植片拒絶のリスクが増加する。ＨＬＡＩＩ型遺伝子のミスマッチ（すなわちＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱＢ１）は、移植片対宿主病のリスクが増加する。

本発明の文脈で、「組織適合ＴＣＲ欠損Ｔ細胞のバンク」は、本発明に従いＴＣＲを欠損させる特定のＨＬＡアロタイプのＴ細胞をそれぞれ含む異なる組成物を意味する。理想的には、このバンクは、ヒト個体群を代表する広範囲の異なるＨＬＡタイプのＴ細胞を含む組成物を含む。操作されたＴＣＲ欠損Ｔ細胞のこのようなバンクは、例えば、癌患者等の異なるレシピエントに使用するのに適したＴ細胞の利用可能性を促すときに役に立つ。
本発明は、異なるＨＬＡハプロタイプを有するＴＣＲ欠損Ｔ細胞のバンクの生成方法を提供する。方法は、標準的なタイピング手順（例えば、抗体、ＰＣＲ、またはＤＮＡ配列）によって特定された、定められたＨＬＡハプロタイプを有する単離されたＴ細胞のプールを得ること、およびＴＣＲ複合体の要素の発現を減少し、ブロックすることによってＴＣＲ複合体を不安定にするこれらのＴ細胞のＴＣＲ抑制分子（ＴＩＭ）を発現させることを含む。異なるＨＬＡハプロタイプを持つ多様な異なる個体から得られるＴ細胞について行われる。ＴＩＭを発現する異なるドナーＴ細胞の収集は、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞バンクを含む。Ｔ細胞バンクは、特定のＨＬＡタイプのＴＣＲ欠損Ｔ細胞をそれぞれ含む異なるＴ細胞プールを含む。好ましくは、Ｔ細胞バンクは、多様な異なるＨＬＡタイプ、例えば、少なくとも１０個の異なるＨＬＡ組織タイプ、少なくとも５０個の異なるＨＬＡ組織タイプ、少なくとも１００個の異なるＨＬＡ組織タイプを含む。ある実施形態では、Ｔ細胞バンクは、少なくとも１０個の異なるＨＬＡ組織タイプのＴ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞バンクは、少なくとも１００個の異なるＨＬＡ組織タイプのＴ細胞を含む。

本発明の文脈で、「治療有効量」は、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を患者に投与したときに、疾患（例えば、癌、感染症またはＧＶＨＤ）の徴侯または症状を軽減するようなＴＣＲ欠損Ｔ細胞の量であるとして、当業者によって認められる。投与されるべき実際量は、機能的ＴＣＲ欠損Ｔ細胞が、疾患に対して薬理学的活性を表すｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで実施される試験に基づいて決定することができる。例えば、機能的ＴＣＲ欠損Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで腫瘍細胞の増殖を抑制し得、当該増殖を抑制する機能的ＴＣＲ欠損Ｔ細胞の量は、治療有効量として認められる。

「医薬組成物」は、哺乳動物に投与するのに適した化学的または生物学的組成物を意味する。当該組成物は、特に、限定されないが、バッカル、動脈内、心腔内、脳室内、皮内、筋肉内、眼内、腹腔内、髄腔内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、静脈内、経口、非経口、浣腸または座薬によって直腸に、皮下、真皮下、舌下、経皮、および経粘膜的１つ以上の経路によって投与してもよい。さらに、注射、液剤、ゲル剤、滴剤、またはその他の方法によって投与することができる。

核酸構築物または核酸配列は、本明細書に使用するとき、Ｔ細胞に形質移入または誘導することができ、生成物（例えば、キメラ受容体または自殺タンパク質）を生成させるために転写および翻訳することのできるＤＮＡ分子を意味する。

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「操作可能に結合される」。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に結合され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に操作可能に結合される。一般的に「操作可能に結合される」は、結合されているＤＮＡ配列が隣接している、および分泌性リーダーの場合には、読み枠に隣接している。しかしながら、エンハンサーは隣接する必要はない。都合のよい制限酵素部位に、または、あるいは当業者に周知のＰＣＲ／組換え方法（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）によって連結することによって結合は達成される。当該部位が存在しない場合、通常の実践に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。

本発明は、癌、感染性疾患、ＧＶＨＤ、移植拒絶、１つ以上の自己免疫障害、または放射線疾患等の疾患または病態を低減、若しくは寛解、または予防若しくは治療するための組成物および方法を考慮する。非限定的な実施形態では、組成物は、単離されたヒトＴ細胞、すなわちＴＣＲ欠損Ｔ細胞の同種異系の源を提供する概念に基づいており、患者の必要性に先立ち、安価に製造することができる。良好に制御されるプロセスを使用して単一の部位に単一の治療生成物を作製する能力は、コストにおいても、品質考慮事項において魅力がある。Ｔ細胞について自家から同種異系の源へ変化することは、大きな長所をもたらす。例えば、一人の健康なドナーが、形質導入および増殖後に何十もの患者を治療するのに十分なＴ細胞を供給することができると予想されている。

本発明に従い、機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現しない修飾された同種異系のＴ細胞を生成させる。ＴＣＲサブユニット／二量体のいくつか、またはそのすべてが細胞表面に発現し得るが、Ｔ細胞は、宿主に望ましくない反応を誘導するほどの機能的ＴＣＲを発現しないことを理解されたい。表面に機能的ＴＣＲがないと、同種異系Ｔ細胞は、宿主細胞への望ましくない免疫応答を開始することができない。その結果、これらのＴＣＲ欠損Ｔ細胞は、例えば、宿主ＭＨＣ分子を認識することができないように、ＧＶＨＤを引き起こすことができない。さらに、これらのＴＣＲ欠損Ｔ細胞は、機能的、非ＴＣＲ、疾患特異的受容体を同時に発現させるように操作することができない。

当業者に周知のように、対象から同種異系Ｔ細胞を単離するために、様々な方法が容易に利用可能である。例えば、細胞表面マーカー発現を使用して、または市販されているキット（例えば、ＩＳＯＣＥＬＬ（商標）、Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を使用する。

癌治療について、投与時に（ＧＶＨＤ等の）免疫応答を誘発しないように、しかし、代わりに、腫瘍細胞を認識する機能的、非ＴＣＲ受容体を発現する、または非疾患の関連細胞（例えば、腫瘍特異的受容体によって認識される前記抗原またはリガンドを、腫瘍細胞より低いレベルでしか発現しない正常な（非腫瘍形成性）細胞）をあからさまには攻撃しない、若しくは全く攻撃しない別のポリペプチドを発現するように、内因性ＴＣＲの機能的形態を発現しない、または野生型Ｔ細胞に比べ、実質的に低レベルの内因性ＴＣＲしか発現しない望ましい組織アロタイプのＴＣＲ欠損Ｔエフェクター細胞の単離されたプールを生成させることを、アプローチは含む。ある腫瘍関連性抗原は、非癌性組織に発現するが、担腫瘍宿主に実行可能な治療ターゲットであることを当業者は理解している。本明細書に関して、通常、特定の非ＴＣＲ、腫瘍特異的受容体は、非癌性組織に発現するが、腫瘍細胞より正常細胞でかなり低下したレベルで発現し得るときに、担腫瘍宿主内で実行可能な治療ターゲットであることを、当業者は理解している。

対象のＴＣＲ欠損Ｔ細胞の大部分の治療的使用に必要でないが、いくつかの例では、抗腫瘍効果を仲介した後直ちに、宿主からドナーＴ細胞のいくつかまたは全てを取り除くことが望ましい。これは、ＧＦＰ等の宿主における除去および／または同定を促進する追加の受容体またはマーカーを発現するように、Ｔ細胞を操作することによって、容易になされる。本発明は、レシピエントのＧＶＨＤまたはその他の有害な免疫応答のいかなる可能性も実質的に取り除くはずであり、このことがいくつかの個体に望まれ得る。ドナーＴ細胞が開始される長期の抗腫瘍効果のために宿主に長く留まる必要がないことが既に示されているため、このことによって効能が損なわれるはずはない（Ｚｈａｎｇ、Ｔ．ら．２００７．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７：１１０２９−１１０３６；Ｂａｒｂｅｒ、Ａ．ら２００８．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：７２−７８）。

本発明のある実施形態では、操作されたＴ細胞に誘導された核酸構築物は、Ｉ型ＨＳＶウイルス（ヘルペスウイルス）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の自殺遺伝子（Ｂｏｎｉｎｉ、ら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１７１９−１７２４）、Ｆａｓに基づく「人工自殺遺伝子」（Ｔｈｏｍｉｓ、ら（２００１）Ｂｌｏｏｄ９７：１２４９−１２５７）、またはそれぞれガンシクロビル、ＡＰ１９０３、または５−フルオロサイトシンによって活性化される大腸菌シトシン・デアミナーゼ遺伝子等の自殺遺伝子をさらに含む。自殺遺伝子は有利に本発明の核酸構築物に含まれ、毒性がある場合には形質導入されたＴ細胞を切除し、および腫瘍が除去されまたは取り除かれると、キメラ構築物を破壊する機会を提供する。形質移入され、または形質導入された細胞を取り除くために自殺遺伝子を使用することは当該技術分野に周知である。例えば、Ｂｏｎｉｎｉ、ら（（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１７１９−１７２４）は、ＨＳＶ−ＴＫ自殺遺伝子を形質導入されたドナーのリンパ球は、最大１年間、患者に抗腫瘍活性をもたらし、ガンシクロビルを使用して形質導入された細胞を取り除くことを教示する。さらに、Ｇｏｎｚａｌｅｚ、ら（（２００４）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．６：７０４−７１１）は、Ｌ１−ＣＡＭ上のエピトープに特異的なキメラｓｃＦｖＦｃ：ｚｅｔ免疫受容体を発現するために遺伝学的に修飾された細胞傷害性Ｔリンパ球クローンで神経芽細胞腫のターゲティングを説明し、構築物はさらに、トランスジェニッククローンを取り除くためにハイグロマイシンチミジンキナーゼ（ＨｙＴＫ）自殺遺伝子を発現する。

ｓｈＲＮＡ、ミニ遺伝子、若しくは非ＴＣＲ受容体として同プロモーターから、または異なるプロモーターから自殺遺伝子を発現することができることが考慮される。しかしながら、通常、自殺タンパク質およびｓｈＲＮＡ、ミニ遺伝子、若しくは非ＴＣＲ受容体の残基をコードする核酸配列は、同構築物またはベクターに帰属する。ｓｈＲＮＡ、ミニ遺伝子、または非ＴＣＲ受容体として同プロモーターからの自殺遺伝子の発現は、周知の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して達成することができる。本発明の核酸構築物に使用することができる適切なＩＲＥＳ配列として、限定されないが、ＥＭＣＶからのＩＲＥＳ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＧＦ−２、ポリオウイルスおよびＨＴＬＶ−１が挙げられる。例証だけとして、キメラ受容体を発現するための核酸構築物は、以下の構造を有することができる：プロモーター−＞キメラ受容体−＞ＩＲＥＳ−＞自殺遺伝子。あるいは、キメラ受容体とは異なるプロモーターから自殺遺伝子を発現することができる（例えば、プロモーター１−＞キメラ受容体−＞プロモーター２−＞自殺遺伝子）。

細胞療法のためのＴ細胞、および本発明のＴ細胞の改良した性質を広く適用するため、本発明は、Ｔ細胞が治療的に望まれる方法または組成物を含む。当該組成物および方法は、癌、ＧＶＨＤ、移植拒絶、感染症、１つ以上の自己免疫疾患、放射線疾患、または機能的ＴＣＲの発現を欠いている同種異系の源から生じるＴ細胞の使用に基づくその他の疾患または病態を低減、若しくは寛解、または予防若しくは治療する方法を含む。

示されるように、本発明の更なる実施形態は、キメラＮＫＧ２Ｄ、キメラＦｖドメイン、ＮＫＧ２Ｄ、またはＴ細胞に対するシグナルを開始するその他の受容体等の前記ＴＣＲ欠損Ｔ細胞に受容体の組換発現を含み、それにより潜在能があり、特定のエフェクターＴ細胞を作製する。当業者は、治療対象の疾患に基づき、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞によって発現される適切な受容体を選択することができる。例えば、癌治療のためにＴＣＲ欠損Ｔ細胞によって発現することのできる受容体は、癌細胞上で同定されたリガンドに対する任意の受容体を含む。当該受容体として、限定されないが、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０が挙げられる。

本発明の別の実施形態では、当該受容体は、限定されないが、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０から得られるリガンド結合ドメインを含むキメラ受容体、または抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ若しくは抗ＥＧＦＲ等の抗腫瘍抗体、並びにＣＤ３-ゼータ、Ｄａｐ１０、ＣＤ２８、４１ＢＢ、およびＣＤ４０Ｌから得られるシグナリングドメインが挙げられる。例示的なキメラ受容体はｃｈＮＫＧ２Ｄであり、ＮＫＧ２ＤはＣＤ３ゼータの細胞質内ドメインに結合し、Ｄａｐ１０と付随してＴ細胞に対する一次および二次活性化シグナルの両方を提供する（Ｚｈａｎｇ、Ｔ．ら２００６．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（１１）：５９２７−５９３３）。本発明のある実施形態では、キメラ受容体はＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＰＳＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＲＯＮ、またはＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６を包含するＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ１ファミリーの１つ以上のメンバーを結合する。

本発明の方法では、癌、ＧＶＨＤ、移植拒絶、感染症、１つ以上の自己免疫疾患、または放射線疾患を罹患している患者に、前記ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を含む治療有効量の組成物を投与する。本発明の別の実施形態では、ＧＶＨＤ、移植拒絶、または癌を予防し、治療し、または低減するために、前記ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を含む治療有効量の組成物を投与する。

ＴＣＲ欠損Ｔ細胞の生成方法
様々なアプローチを使用して、本発明の機能的ＴＣＲの発現を安定的に欠損しているＴ細胞を生成してもよい。Ｔ細胞を内部移行し、ソートし、複合体としてのＴ細胞受容体全体を、休止しているＴ細胞内で約１０時間の半減期、刺激を受けたＴ細胞内で３時間の半減期で、分解する（ｖｏｎ Ｅｓｓｅｎ、Ｍ．ら２００４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：３８４−３９３）。ＴＣＲ複合体の適切な機能は、ＴＣＲ複合体を構成するタンパク質の適切な化学量論比を必要とする。ＴＣＲ機能はまた、ＩＴＡＭモチーフを伴う２つの機能性ＴＣＲゼータタンパク質も必要とする。ＭＨＣペプチドリガンドの会合のときのＴＣＲの活性化は、同Ｔ細胞上のいくつかのＴＣＲの会合を必要とし、全てが適切にシグナル伝達をする。そのため、ＴＣＲ複合体は適切に付随しないタンパク質で不安定になり、または適切にシグナル伝達しない場合、Ｔ細胞は、分子応答を開始するのに十分なだけ活性化しない。

本発明の方法は、ＴＣＲ複合体の主要要素の発現をブロックすることによって、および／またはＴＣＲの発現または機能を妨害することによって、ＴＣＲ複合体を不安定にするために、Ｔ細胞内にＴＣＲ欠損分子（ＴＩＭ）の発現を含む。様々なクラスのＴＩＭがあり、限定されないが、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびドミナントネガティブ阻害タンパク質、例えば、重要なシグナルモチーフを欠いている短縮タンパク質；抑制シグナルを促進するタンパク質；およびその他のＴＣＲ要素との適切な結合、および／または適切なシグナル伝達を破壊させる変異を伴うタンパク質が挙げられる。一般的に、ＴＩＭを使用して、細胞表面上のいくつかのまたは極めて少ない機能性のＴＣＲの発現を防ぐことによって、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を産生し、および／または細胞表面に実質的に損なわれたＴＣＲの発現を促進することができる。

下の実験例の結果によって示されるように、本発明の発明者は、ＴＣＲ発現または機能がＴＩＭ、例えばｓｈＲＮＡおよび／またはドミナントネガティブ抑制因子を使用して妨害され、または取り除かれ、したがってＴＣＲ欠損Ｔ細胞が生成され得ることを証明した。当該ＴＣＲ欠損細胞株は、以下に記述の癌並びにその他の疾患および障害を治療するためのＴ細胞に基づく治療に使用するのに良く適している。

本発明のある実施形態では、一次Ｔ細胞に、特定のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ-αおよびＴＣＲ-β）および／またはＣＤ３鎖（例えばＣＤ３ゼータ）をコードする核酸を標的にする低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、ＴＣＲ発現を取り除く。これらのタンパク質の１つ以上をブロックすることによって、Ｔ細胞はＴＣＲ複合体の１つ以上の主要要素を生成せず、それによってＴＣＲ複合体を不安定にし、機能的ＴＣＲの細胞表面発現を防ぐ。いくつかのＴＣＲ複合体は細胞表面に対して再循環することができるが、ｓｈＲＮＡはＴＣＲタンパク質の新しい生成を防ぎ、ＴＣＲ複合体全体を分解および除去し、機能的ＴＣＲ発現において安定的な欠損を有するＴ細胞を生成する。

一次Ｔ細胞のｓｈＲＮＡの発現は、任意の通常の発現系、例えば、レンチウイルス発現系を使用して達成することができる。レンチウイルスは休止している一次Ｔ細胞を標的にするのに有用であるが、全てのＴ細胞がｓｈＲＮＡを発現しない。これらのＴ細胞のいくつかは、ＴＣＲ発現を十分に抑制することによって、Ｔ細胞の機能的活性を改変するのに十分な量のｓｈＲＮＡを発現しないかもしれない。したがって、残っているＴ細胞が細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３内で欠損しているように、例えば、セルソーティングまたは分割手法によって、ウイルス形質導入後の高いＴＣＲ発現を中程度にするＴ細胞を取り除くことができ、機能的ＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠損しているＴ細胞の単離された個体群を増殖させることができる。

本発明の非限定的な実施形態では、以下のように（表１）、ＴＣＲ複合体の主要要素について例示的な標的ｓｈＲＮＡを設計した。
表１

様々な標的ｓｈＲＮＡを使用して、ＴＣＲ-アルファ、ＴＣＲ-ベータ、ＴＣＲ-ガンマ、ＴＣＲ-デルタ、ＣＤ３-ガンマ、ＣＤ３-デルタ、ＣＤ３-エプシロン、またはＣＤ３-ゼータｍＲＮＡを個別にまたは一緒に標的にすることができる。ＴＣＲ-βおよびＴＣＲ-α鎖は、可変のおよび定常部分から成る。これらのＴＣＲ／ＣＤ３配列の定常部分について、いくつかの標的ｓｈＲＮＡを設計した。各分子標的について、ｓｈＲＮＡの１つまたは組み合わせを使用して、ＴＣＲ発現の最も効率的な抑制因子を同定することができる。確立されたプロトコルを使用して、各ｓｈＲＮＡ構築物を、例えば、ｐＬｋｏ．１プラスミドまたはｐＳＭｃ２ベクターにクローンし、当該技術分野で通常使用されるプロモーター、例えばＵ６ｐプロモーターによって発現を制御する。得られる構築物をスクリーニングし、シークエンシングによって正確度を確認した。ｓｈＲＮＡ発現プラスミドをその後、パッケージングプラスミドおよびパッケージングのためのエンベローププラスミドと一緒に、任意の適切な宿主細胞（例えば、２９３Ｔ）に形質移入した。健康なドナーから一次ヒト末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、低用量の可溶性抗ＣＤ３、および例えば、２５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌ、ｒｈｕｌＬ−２で７２時間活性化する。レトロウイルスの形質導入についてＴ細胞を活性化する必要はないが、形質導入がもっと効率的に働き、ＩＬ−２内で細胞を増やし続けることができる。活性化された細胞を洗浄し、例えば、３０℃で１時間のｓｐｉｎ−ｆｅｃｔｉｏｎ使用し、次に７時間の静止期間をおくことによって形質導入する。

本発明の別の実施形態では、ドミナントネガティブの阻害タンパク質の過剰発現は、ＴＣＲ発現または機能を妨害することができる。本発明のこの実施形態では、ＴＣＲ要素の１つ（例えば、ＴＣＲ-アルファ、ＴＣＲ-ベータ、ＣＤ３-ガンマ、ＣＤ３-デルタ、ＣＤ３-エプシロン、またはＣＤ３-ゼータ）をコードするポリヌクレオチドの部分または全てを組み込むミニ遺伝子を調製するが、以下のように改変する。（１）タンパク質機能に必要とされる主要なシグナルモチーフ（例えば、ＩＴＡＭ）を欠損する、（２）その他の実のＴＣＲ要素と適切に付随しないように改変する、または（３）適切には付随するが、リガンド（例えば、短縮ＴＣＲベータミニ遺伝子）を結合しない。さらに、ＫＩＲタンパク質から抑制性シグナルモチーフ、例えば細胞質内ドメインを含むように、ミニ遺伝子を変更させてもよく、細胞シグナル伝達を変化させ、ホスファターゼ、例えばＳＨＰ１およびＳＨＰ２を補充することによって、抑制性シグナルを促進する。

これらのミニ遺伝子はまた、過剰発現したミニ遺伝子を同定する方法として役立つタンパク質の部分をコードしてもよい。例えば、短縮ＣＤ１９タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗ＣＤ１９ｍＡｂについて結合部位を含むが、ミニ遺伝子を発現する得られる細胞が、コードされたタンパク質を発現し、抗ＣＤ１９ｍＡｂで同定できるように、操作可能に結合することができる。この同定によってミニ遺伝子の発現の程度を決定し、当該タンパク質を発現する細胞を単離することができる（したがって機能的ＴＣＲを欠損する）。

本発明のある実施形態では、シグナルモチーフを欠損しているミニ遺伝子の過剰発現によって、ＴＣＲが対立する細胞上のＭＨＣペプチドリガンドによって結合するとき、適切にシグナル伝達ができないＴＣＲ複合体が導かれる。本発明の非限定的な実施形態では、ミニ遺伝子（およびコードされたポリペプチド）の高発現は、ＴＣＲ要素が付随するとき、実の完全なタンパク質を打ち負かしてしまい、シグナル伝達ができないＴＣＲ複合体になる。本発明の別の実施形態では、ミニ遺伝子は、全体または部分的なＣＤ３-ゼータ、ＣＤ３-ガンマ、ＣＤ３-デルタ、またはシグナル伝達に必要とされるＩＴＡＭモチーフを欠いているＣＤ３-エプシロンポリペプチドを含む、または、あるいは、から成る。ＣＤ３-ゼータタンパク質は、細胞質部分に３つのＩＴＡＭモチーフを含み、本発明のある実施形態では、切り詰めによってこれら全てを取り除くことによって、当該改変されたタンパク質が組み込まれている任意の複合体中で適切なＴＣＲシグナル伝達が抑制される。例えば、表２、配列番号７２〜７９に対応するＴＩＭ５−８を参照のこと。構築物はＩＴＩＭまたはその他のシグナルモチーフを組み込んでもよく、ＳＨＰ１およびＳＨＰ２等のホスファターゼを補充することによって、細胞シグナル伝達を変化させ、抑制性シグナルを促進することは周知である。表２、配列番号８０〜８９に対応するＴＩＭ９−１３を参照のこと。

本発明のある実施形態では、ミニ遺伝子は、全体または部分的なＣＤ３-ゼータ、ＣＤ３-ガンマ、ＣＤ３-デルタ、または変異、例えば、一塩基の変化を伴うＣＤ３-エプシロンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドによって分類されるアミノ酸が変化する。例えば、表２、配列番号９０〜１０１に対応するＴＩＭ１４−１９を参照のこと。

本発明の別の実施形態では、コードされたポリペプチドが、全てではないがいくつかの実のパートナーと付随することができるように、ミニ遺伝子の過剰発現を改変し、付随しているタンパク質について正常なタンパク質と競争する。本発明の非限定的な別の仮説では、ミニ遺伝子（およびコードされたポリペプチド）の高レベルの発現は、実のパートナーのタンパク質を打ち負かし、機能的ＴＣＲ複合体の構築を防ぎ、適切な比およびタンパク質-タンパク質相互関係に付随する全要素を必要とする。本発明の別の実施形態では、ミニ遺伝子は、全長タンパク質（例えば、ＴＣＲ-アルファ、ＴＣＲ-ベータ、ＣＤ３-ガンマ、ＣＤ３-デルタ、ＣＤ３-エプシロン、またはＣＤ３-ゼータ）をコードするが、その他のＴＣＲ／ＣＤ３タンパク質との構築に必要であることが周知のタンパク質の膜貫通部分内のアミノ酸をコードする配列を選択的に欠失することを含む、全体または部分的なポリヌクレオチドを含む、または、あるいは、から成る。

本発明の好ましい実施形態では、その他のＴＣＲ／ＣＤ３タンパク質との構築に必要であることが周知のタンパク質の膜貫通部分内のアミノ酸をコードする配列の選択的欠失として、限定されないが、ＴＣＲ-アルファ膜貫通領域の第５位のアルギニン残基、ＴＣＲ-アルファ膜貫通領域の第１０位のリジン残基、ＴＣＲ-ベータ膜貫通の第９位のリジン残基、ＣＤ３-ガンマの膜貫通領域のグルタミン酸残基、ＣＤ３-デルタ−エプシロンの膜貫通領域のアスパラギン酸残基、ＣＤ３-エプシロンの膜貫通領域のアスパラギン酸残基、およびＣＤ３-ゼータの膜貫通領域のアスパラギン酸残基が挙げられる。

短縮ＴＣＲ-アルファ、ＴＣＲ-ベータ、ＴＣＲ-ガンマ、またはＴＣＲ-デルタタンパク質の過剰発現は、ＴＣＲ複合体をＭＨＣペプチドリガンドと結合することができないようにし、そのためＴ細胞を活性化するように機能しない。図２のパネル（Ａ）および（Ｂ）を参照のこと。本発明の別の実施形態では、ミニ遺伝子は、これらのタンパク質の細胞質全体および膜貫通部分、並びに細胞外領域の部分をコードするポリヌクレオチドを含む、または、あるいは、から成るが、第一の細胞外ドメイン（すなわちリガンド結合部位を含む最も外側のドメイン）の全てまたは部分をコードするポリヌクレオチドを欠損している。好ましい実施形態では、当該ミニ遺伝子ポリヌクレオチドは、ＴＣＲ-アルファおよびＴＣＲ-ベータ鎖のＶアルファおよびＶベータポリペプチドをコードしない。ある実施形態では、ミニ遺伝子ポリヌクレオチドは、タンパク質エピトープのタグ（例えばＣＤ１９）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に結合してもよく、それによりこれらの遺伝子に発現する細胞のｍＡｂの同定が可能になる。

別の実施形態では、レトロウイルスの５’ＬＴＲ、またはＣＭＶ若しくはＳＶ４０プロモーター等の強力なウイルス性プロモーターを使用して、これらのミニ遺伝子を発現することができる。典型的には、このプロモーターはミニ遺伝子の直ぐ上流であり、ミニ遺伝子ｍＲＮＡを高発現する。別の実施形態では、構築物は、同プロモーター（例えば、間のＩＲＥＳＤＮＡ配列を使用して）または別のプロモーター下で、第二のポリヌクレオチド配列をコードする。この第二のポリヌクレオチド配列は、Ｔ細胞に特異性を提供する機能的非ＴＣＲ受容体についてコードしてもよい。当該ポリヌクレオチドの例として、限定されないが、キメラＮＫＧ２Ｄ、キメラＮＫｐ３０、キメラＮＫｐ４６、またはキメラ抗−Ｈｅｒ２ｎｅｕが挙げられる。さらなる実施形態では、レトロウイルスまたはその他の適切な発現プラスミドに、プロモーター−ミニ遺伝子を構築し、標準的方法を使用して、Ｔ細胞に直接的に形質移入または形質導入する（Ｚｈａｎｇ、Ｔ．ら、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６６（１１）５９２７−５９３３；Ｂａｒｂｅｒ、Ａ．ら、（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６７（１０）：５００３−５００８）。

上で検討した方法を使用して、ウイルスの形質導入および増殖後に、前述したＭｉｌｔｅｎｙｉ選択カラムを使用して、抗ＣＤ３ｍＡｂおよび磁気ビーズを使用して、依然としてＴＣＲ／ＣＤ３を発現するＴ細胞を取り除く（Ｂａｒｂｅｒ、Ａ．ら、（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６７（１０）：５００３−５００８）。Ｔ細胞を次に洗浄し、３〜７日間、ＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）に培養し、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞を使用するときと同様の様式でエフェクター細胞を増殖させる。

フローサイトメトリーおよび定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＴＣＲαβおよびＣＤ３の発現を評価することができる。Ｓｅｎｔｍａｎ、Ｃ．Ｌ．ら（（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：６７６０−６７６６）で使用したものと同様の方法を用いて、ＡＢＩ７３００リアルタイムＰＣＲ装置および遺伝子特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマーを使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、ＴＣＲ-α、ＴＣＲ-β、ＣＤ３ε、ＣＤ３-ζ、およびＧＡＰＤＨ（対照として）ｍＲＮＡを、分析することができる。細胞表面の変化は、ＴＣＲ-α、ＴＣＲ-β、ＣＤ３ε、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ５、およびＣＤ４５に特異的な抗体を使用して決定することができる。

単一ｓｈＲＮＡ種は細胞表面のＴＣＲ発現を十分に抑制しない可能性がある。この場合、複数のＴＣＲｓｈＲＮＡを同時に使用してＴＣＲ複合体の複数要素を標的にしてもよい。細胞表面でのＴＣＲ複合体の構築に各要素が必要とされ、これらのタンパク質の１つでも欠いていると、細胞表面のＴＣＲ発現を欠損する可能性がある。ＴＣＲ発現のいくつかまたは全てが残っていても、受容体が免疫応答を誘導するかどうかを決定するのは受容体の機能である。細胞表面が完全にないことよりも機能的欠損のほうが、程度が重大である。一般的に、ＴＣＲ発現が低いほど、ＴＣＲ架橋結合が十分でなく、そのことがＴＣＲ複合体を経由してＴ細胞の活性化を引き起こす可能性がある。特定の実施形態は、ＴＣＲ-アルファ、ＴＣＲ-ベータ、およびＣＤ３-エプシロンのターゲティングを含むが、ＣＤ３-ガンマ、ＣＤ３-デルタ、またはＣＤ３-ゼータ等のＴＣＲ複合体のその他の要素も標的にできる。

ＴＣＲを細胞表面から取り除く主な目的は、不適合性のＭＨＣ対立遺伝子に対してＴ細胞が活性化することを防ぐことにある。各ｓｈＲＮＡまたはミニ遺伝子構築物とのＴＣＲ発現の減少がＴ細胞機能を変化させるのに十分であるかどうかを決定するために、以下についてＴ細胞を試験することができる。（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞生存、（２）マイトマイシンＣ処理された同種異系ＰＢＭＣの存在下での増殖、および（３）同種異系ＰＢＭＣ、抗ＣＤ３ｍＡｂ、または抗ＴＣＲｍＡｂに反応したサイトカインの生成。

細胞生存を試験するために、形質導入されたＴ細胞を、ｒｈｕＩＬ−２（例えば２５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌ）を伴う完全ＲＰＭＩ培地で増殖する。培養の開始時に同様の密度で細胞を播種し、細胞を数えるために、および生存率を確かめるために、試料を７日以上取り除いてもよい。Ｔ細胞が同種異系細胞に対する反応を誘発するのに十分なＴＣＲを発現するかどうかを決定するために、形質導入され、または対照のＴ細胞を、マイトマイシンＣ処理された同種異系または同一遺伝子のＰＢＭＣで、例えば４：１の比で培養する。分離後に娘細胞を均一に分解する細胞膜透過性染色であるＣＦＳＥで、Ｔ細胞を前処置する。細胞分割の程度は、フローサイトメトリーによって容易に決定することができる。Ｔ細胞の別の特徴はサイトカインの生成である。各ｓｈＲＮＡ構築物がＴ細胞機能を抑制するかどうかを決定するために、形質導入されたＴ細胞を異なる量の抗ＣＤ３ｍＡｂ（１．６〜５０００ｎｇ／ｍｌ）と培養する。２４時間後、細胞のない上清を収集し、生成されたＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって定量化する。正対照としてＰＭＡ／イオノマイシンを使用してＴ細胞を刺激し、負対照としてＴ細胞単独を使用する。

例示的なＴＩＭ、例えばｓｈＲＮＡ、短縮ドミナントネガティブタンパク質、ＫＩＲ融合ドミナントネガティブタンパク質、およびＴＣＲ複合体、例えば、ＣＤ３-エプシロンまたはＣＤ３-ゼータの主要要素について設計された、一塩基の変更の結果として改変されたアミノ酸配列を伴うドミナントネガティブタンパク質が、エフェクターＴ細胞の機能に及ぼす影響を評価し、その結果を以下の表２に記す。これらの結果は、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞がＴＩＭを使用して生成され得ることを証明する。

ＴＣＲ-アルファまたはＴＣＲ-ベータ要素を除去することによって、ＴＣＲ-ガンマ／デルタＴ細胞を優先的に増殖させることが可能である。これらのＴ細胞は血液中では稀少であるが、これらの細胞の存在が抗ＴＣＲ-ガンマ／デルタ抗体で確かめることができる。これらの細胞が増殖する場合、細胞表面でのＴＣＲ-アルファ／ベータとＴＣＲ-ガンマ／デルタの両方の細胞表面発現に必要とされるＣＤ３-エプシロンのターゲティングを使用することができる。ＩＬ−２もＩＦＮ−γも、Ｔ細胞の増殖およびマクロファージ活性化を駆動する主要エフェクターサイトカインである。したがって、これらのサイトカインの欠失が機能的不活性化の徴侯である。ＴＮＦ−α等のその他のサイトカインの変化を測定することも可能である。ＴＣＲ発現の消失時のＴ細胞の生存の減少は、ＰＢＭＣでＴＣＲ欠損Ｔ細胞を培養することによって決定することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ環境を上手く反映し、Ｔ細胞の生存を補助する。

機能的非Ｔ細胞受容体を発現するＴＣＲ欠損Ｔ細胞の生成方法
本発明の別の実施形態では、機能的ＴＣＲ発現が安定的に欠損しているＴ細胞は、機能的、非ＴＣＲ受容体を発現する。当該実施形態では、（前述のように）ＴＣＲ機能の除去は、１つ以上の外因性非ＴＣＲ標的受容体（例えば、キメラＮＫＧ２Ｄ（ｃｈＮＫＧ２Ｄ）またはＦｖ分子等）とさらに組み合わされる。当該実施形態は、適切な標的受容体が使用された場合に、任意の種類の癌である患者を将来、治療するために保存することのできる「普遍的な」細胞生成物を提供する。

本発明のさらなる実施形態は、ｃｈＮＫＧ２Ｄ、キメラＦｖドメイン、ＮＫＧ２Ｄ、または任意のその他の受容体等の当該ＴＣＲ欠損Ｔ細胞中での受容体の組換え発現を含み、Ｔ細胞にシグナル伝達を惹起し、それによって潜在能のある特定のエフェクターＴ細胞を作製する。当業者は、治療対象の疾患に基づき、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞によって発現される適切な受容体を選択することができる。例えば、癌治療のためにＴＣＲ欠損Ｔ細胞によって発現することができる受容体は、癌細胞で同定されたリガンドに対する任意の受容体を含む。当該受容体として、限定されないが、ＮＫＧ２Ｄ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＣ０３９８３６）、ＮＫＧ２Ａ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦ４６１８１２）、ＮＫＧ２Ｃ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＪ００１６８４）、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＢ０５５８８１）、ＮＫｐ４４（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＪ２２５１０９）、ＮＫｐ４６（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＪ００１３８３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０が挙げられる。

本発明の別の実施形態では、当該受容体として、限定されないが、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０から得られるリガンド結合ドメインを含むキメラ受容体、または抗Ｈｅｒ２ｎｅｕおよび抗ＥＧＦＲ等の抗腫瘍抗体、ＣＤ３-ゼータ（ＣＤ３z）（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ヒトＮＭ＿＿１９８０５３）（配列番号：６２）、Ｄａｐ１０（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦ０７２８４５）、ＣＤ２８、４１ＢＢ、および／またはＣＤ４０Ｌから得られるシグナリングドメインが挙げられる。

本発明のさらなる実施形態では、キメラ受容体はＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＰＳＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＲＯＮ、またはＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６を包含するＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ１ファミリーの一つ以上のメンバーを結合する。

例証だけとして、ＴＣＲ複合体の細胞表面発現を消失することが示されるｓｈＲＮＡまたはミニ遺伝子は、１つ以上のウイルス性ベクターによって、ｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体と共発現する。１つのベクター内で共発現を達成するために、Ｕ６プロモーターによってｓｈＲＮＡを駆動することができ、ＰＧＫプロモーターによってｃｈＮＫＧ２Ｄを駆動することができる。別の実施形態では、ＩＲＥＳ配列を使用して遺伝要素を分離する場合、たった１つのプロモーターを使用する。

キメラ受容体を使用するのに特に適したＣ型レクチン様ＮＫ細胞受容体タンパク質は、ナチュラルキラー細胞の表面で発現される受容体を含み、認識リガンドと結合すると、ＮＫ細胞活性化を変化させる。受容体は、単独で働くこともできるし、その他の分子と恊働することもできる。これらの受容体についてのリガンドは、通常、１つ以上の腫瘍細胞対応の表面で発現し、例えば、結腸、肺、乳房、腎臓、卵巣、子宮頸部、および前立腺の癌に関連する腫瘍；メラノーマ；骨髄腫；白血病；並びにリンパ腫があり（Ｗｕ、ら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：６０−５６８；Ｇｒｏｈ、ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：６８７９−６８８４；Ｐｅｎｄｅ、ら（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０７６−１０８６）、正常な組織の細胞の表面ではそれほど広くは発現しない。

当該リガンドの例として、限定されないが、ＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、熱ショックタンパク質、ＵＬＢＰ結合タンパク質（例えば、ＵＬＰＢ１〜４）、並びにＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇ等の古典的ではないＨＬＡ分子が挙げられ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃおよびその対立遺伝子等の古典的なＭＨＣ分子は、本発明のＣ型レクチン様ＮＫ細胞受容体タンパク質の強力なリガンドとは通常は考えられない。通常これらのリガンドを結合するＣ型レクチン様ＮＫ細胞受容体は、ＩＩ型タンパク質構造を有し、タンパク質のＮ末端は細胞内である。上に上げたＮＫ細胞受容体の他に、このタイプの例示的なＮＫ細胞受容体として、限定されないが、デクチン−１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＪ３１２３７３またはＡＪ３１２３７２）、肥満細胞機能関連抗原（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦ０９７３５８）、ＨＮＫＲ−Ｐ１Ａ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｕ１１２７６）、ＬＬＴ１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦ１３３２９９）、ＣＤ６９（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿＿００１７８１）、ＣＤ６９相同体、ＣＤ７２（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿＿００１７８２）、ＣＤ９４（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿＿００２２６２またはＮＭ＿＿００７３３４）、ＫＬＲＦ１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿＿０１６５２３）、酸化されたＬＤＬ受容体（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿＿００２５４３）、ＣＬＥＣ−１、ＣＬＥＣ−２（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿＿０１６５０９）、ＮＫＧ２Ｄ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＣ０３９８３６）、ＮＫＧ２Ｃ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＪ００１６８４）、ＮＫＧ２Ａ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦ４６１８１２）、ＮＫＧ２Ｅ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦ４６１１５７）、ＷＵＧＳＣ：Ｈ＿ＤＪ０７０１０１６．２、または骨髄性ＤＡＰ１２関連レクチン（ＭＤＬ−１；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＪ２７１６８４）が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、ＮＫ細胞受容体は、ヒトＮＫＧ２Ｄ（配列番号：５８）またはヒトＮＫＧ２Ｃ（配列番号：５９）である。

キメラ受容体に有用な同様のＩ型受容体として、ＮＫｐ４６（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＪ００１３８３）、ＮＫｐ３０（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＢ０５５８８１）、またはＮＫｐ４４（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＪ２２５１０９）が挙げられる。

Ｃ型レクチン様ＮＫ細胞受容体タンパク質の代わりとして、Ｃ型レクチン様ＮＫ細胞受容体タンパク質と付随したタンパク質をキメラ受容体タンパク質に使用することができる。一般的に、Ｃ型レクチン様ＮＫ細胞受容体と付随したタンパク質を、受容体と相互作用があり、そこからシグナルを形質導入するタンパク質として定義する。この様式で機能する適切なヒトタンパク質として、さらに、限定されないが、ＤＡＰ１０（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦ０７２８４５）（配列番号：６０）、ＤＡＰ１２（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦ０１９５６２）（配列番号：６１）およびＦｃＲガンマが挙げられる。

Ｃ型レクチン様ＮＫ細胞受容体のＮ末端に、免疫受容体を経由して細胞反応を活性化することに関与する免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、（Ａｓｐ／Ｇｌｕ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔｙｒ^＊−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）−Ｘａａ_６−８−Ｔｙｒ^＊−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）（Ｓ配列番号：５５〜５７）を有する免疫シグナル伝達受容体を融合する。同様に、Ｃ型レクチン様ＮＫ細胞受容体と付随したタンパク質を使用すると、免疫シグナル伝達受容体は、当該タンパク質のＣ末端に融合させることができる（図１）。本発明のキメラ受容体に使用される適切な免疫シグナル伝達受容体として、限定されないが、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖、ゼータｍＲＮＡの選択的スプライシングの結果としてＣ最末端のエキソンのゼータ鎖だけが異なるエータ鎖、Ｔ細胞受容体のデルタ、ガンマおよびエプシロン鎖（ＣＤ３鎖）並びにＦｃＲ１受容体のガンマサブユニットが挙げられる。特定の実施形態では、前述で同定された免疫シグナル伝達受容体の他に、免疫シグナル伝達受容体は、ＣＤ３-ゼータ（ＣＤ３z）（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ヒトＮＭ＿１９８０５３およびＮＭ−０００７３４）（それぞれ、配列番号：６２および配列番号：６４）、またはヒトＦｃエプシロン受容体−ガンマ鎖（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｍ３３１９５）（配列番号：６３）または細胞質内ドメイン若しくはそのスプライシング変異体である。特に、例えば、ＣＤ３-ゼータは、固有のアイソフォームをコードする２つの選択的にスプライスされた転写変異体、すなわち、転写変異体１（配列番号：６２）、および転写変異体２（配列番号：６４）を有する。変異体２のコードされたアイソフォーム（配列番号：６５）は、変異体１に比べ、内部のアミノ酸を失っている。

特定の実施形態では、本発明のキメラ受容体は、ＮＫＧ２ＤとＣＤ３-ゼータの間、またはＤａｐ１０とＣＤ３-ゼータの間の融合物である。

本発明の核酸構築物では、プロモーターは、本発明のキメラ受容体をコードする核酸配列と操作可能に結合し、すなわち、キメラ受容体をコードするＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するように、配置される。プロモーターは、ゲノム起源または、合成的に産生されてもよい。Ｔ細胞に使用される様々なプロモーターは当該技術分野で周知である（例えば、Ｍａｒｏｄｏｎ、ら（２００３）Ｂｌｏｏｄ１０１（９）：３４１６−２３によって開示されたＣＤ４プロモーター）。プロモーターは構成的または誘導的であることが可能であり、誘導は特定の細胞型または特定のレベルの成熟と付随している。あるいは、いくつかの周知のウイルス性プロモーターも適している。対象のプロモーターとして、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒト‐サイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、および脾フォーカス形成ウイルスプロモーターが挙げられる。プロモーターはエンハンサーと付随しても、付随していなくてもよく、エンハンサーは、特定のプロモーターと自然に付随し、または異なるプロモーターと付随してもよい。

キメラ受容体をコードするオープンな読み枠の配列は、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源、またはその組み合わせから得ることができ、または、（ＰＣＲによって）合成することができる。ゲノムＤＮＡの大きさおよびイントロンの数に依存して、イントロンがｍＲＮＡを安定させ、またはＴ細胞特異的発現を提供することが認められるとき、ｃＤＮＡまたはその組み合わせを使用することが望ましい（Ｂａｒｔｈｅｌ ａｎｄ Ｇｏｌｄｆｅｌｄ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（７）：３６１２−９）。また、ｍＲＮＡを安定させるために、内因性または外因性非コード領域を使用することもさらに有利になり得る。

本発明のキメラ受容体の発現について、キメラ受容体のＮ末端要素をコードする核酸配列の自然発生、または内因性の転写開始領域を使用して、標的宿主にキメラ受容体を産生することができる。あるいは、構成的または誘導的発現を可能にする外因性転写開始領域を使用することができ、標的宿主、望まれる発現のレベル、標的宿主の性質等に依存して、発現を制御することができる。

同様に、キメラ受容体を表面膜に向けるシグナル配列は、キメラ受容体のＮ末端要素の内因性シグナル配列になることができる。任意に、いくつかの例では、当該配列を異なるシグナル配列と交換することが望ましい。しかしながら、選択されるシグナル配列は、キメラ受容体がＴ細胞の表面に現れるように、Ｔ細胞の分泌経路に適合するはずである。

同様に、キメラ受容体のＣ末端要素をコードする核酸配列の自然発生の、または内因性の転写終結領域によって、終結領域を提供することができる。あるいは、終結領域を異なる源から得ることができる。大部分について、終結領域の源は、通常、組換えタンパク質の発現に重要であるとは考えられず、発現に悪影響を与えることなく広範囲の終結領域を使用することができる。

当業者によって明らかにされるように、いくつかの例では、Ｃ型レクチン様ナチュラルキラー細胞受容体の末端の２、３のアミノ酸（または付随したタンパク質）または免疫シグナル伝達受容体を、通常はせいぜい１０個、さらに通常はせいぜい５個の残基を削除することができる。また、境界の少数のアミノ酸、通常はせいぜい１０個、さらに通常はせいぜい５個の残基を導入することが望ましい。通常、便利な制限部位、操作の簡易性、発現レベルの向上等をもたらす、構成の必要性の結果として、アミノ酸の削除または挿入がある。さらに、同様の理由で、１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸に置換し、通常は任意の１つのドメインのアミノ酸を約５個以上、置換しない。

キメラ構築物は、キメラ受容体をコードするが、通常の方法で調製することができる。大部分について、天然の配列を使用するため、適宜（例えば、ＩＩ型受容体を使用するときに、免疫シグナル伝達受容体要素を反転させなければいけない）、様々な要素を適切に結合することができるように、天然の遺伝子を単離し、操作する。したがって、遺伝子の望ましくない部分を削除する適切なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、キメラ受容体のＮ末端およびＣ末端タンパク質をコードする核酸配列を単離することができる。あるいは、クローン遺伝子の制限消化物を使用してキメラ構築物を産生することができる。どちらの場合も、平滑断端した、または相補的な重なり部分を有する制限部位を提供するために、配列を選択することができる。

キメラ構築物を調製するための様々な操作をｉｎ ｖｉｔｒｏで実行し、特定の実施形態では、標準的な形質転換または形質移入手法を使用して、適切な宿主にクローニングまたは発現させるために、ベクターに、キメラ構築物を導入する。したがって、各操作の後に、ＤＮＡ配列の結合から得られる構築物をクローンし、ベクターを単離し、望ましいキメラ受容体を配列が確実にコードするように配列をスクリーニングする。限定解析、配列決定等を行うことによって、配列をスクリーニングすることができる。

裸のＤＮＡとしてＴ細胞に、または適切なベクターに、キメラ構築物を導入することができることが考慮される。裸のＤＮＡを使用して、電気穿孔によってＴ細胞を安定して形質移入する方法は、当該技術分野で周知である。米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。裸のＤＮＡは、一般的に、発現に適切な方向でプラスミド発現ベクターに含まれる本発明のキメラ受容体をコードするＤＮＡを意味する。有利なことに、裸のＤＮＡを使用すると、本発明のキメラ受容体を発現するＴ細胞を生成させるのに必要な時間が減少する。

あるいは、ウイルス性ベクター（例えば、レトロウイルス・ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ結合型ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を使用して、キメラ構築物をＴ細胞に導入することができる。本発明の方法に従って使用される適切なベクターは、対象のＴ細胞で非複製的である。ウイルスに基づく多くのベクターは周知であり、細胞内で保持されるウイルスのコピー数は、細胞の生存能を保持するのに十分なほど少ない。例証のベクターとして、ｐＦＢ−ネオベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（商標））およびＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクターが挙げられる。形質移入された、または形質導入されたＴ細胞が、望ましい制御および望ましいレベルで、表面膜タンパク質として、キメラ受容体を発現することができることが確立されると、望ましいシグナル誘導（例えば、適切なリガンドで刺激したときに、ランテス、Ｍｉｐ１−アルファ、ＧＭ−ＣＳＦが生成されること）を提供するために、キメラ受容体が宿主細胞内で機能的であるかどうかを決定することができる。

上述のように、一次ヒトＰＢＭＣは、健康なドナーから単離され、低量の可溶性抗ＣＤ３（例えば４０ｎｇ／ｍｌ）およびｒｈｕｌＬ−２（例えば５０Ｕ／ｍｌ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ並びにｒｈｕＩＬ−２、または照射された抗原提示細胞およびｒｈｕＩＬ−２で活性化される。その後、活性化されたＴ細胞を洗浄し、例えば、３２℃で１時間のｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎで、レトロウイルスで形質導入し、次に７時間の静止期間におく。レンチウイルスの形質導入についてＴ細胞を活性化する必要はないが、形質導入はより効果的に作用し、細胞をＩＬ−２内で増やし続けることができる。本明細書に記述されるように、活性化された細胞を洗浄し、形質導入し、次に静止期間におき、３日間、例えばＧ４１８で選択する。選択後、細胞を洗浄し、ＩＬ−２で２〜７日間培養し、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞に使用するのと同様の様式で、エフェクター細胞を増殖させる。ＣＤ３、ＣＤ４、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ５に特異的な抗体を使用して、受容体の細胞表面発現の変化を分析する。外因性、非ＴＣＲ受容体が、特定の受容体を発現するように形質導入されている細胞を増加させることが期待され、例えば、ｃｈＮＫＧ２Ｄ発現レトロウイルスで形質導入されたＴ細胞が、ｃｈＮＫＧ２Ｄの表面発現レベルを増加させることが期待される。

ＴＣＲαβ、ＣＤ３、およびＮＫＧ２Ｄの発現は、本明細書で検討したように、フローサイトメトリーおよび定量的ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数も決定することができる。全体の細胞数、並びにＴＣＲ複合体欠損、ＴＣＲコンピテント、およびｃｈＮＫＧ２Ｄを発現するＴ細胞の割合は、フローサイトメトリーによって決定することができる。これらの数を、ｓｈＲＮＡまたはｃｈＮＫＧ２Ｄ遺伝子単独（対照として）で形質導入されたＰＢＭＣと比較することができる。ベクターのみを形質導入された細胞を対照として含むこともできる。

ウイルスの形質導入および増殖の後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉカラムの磁気ビーズで、ＴＣＲ＋およびＴＣＲ細胞をｍＡｂによって分離し、ｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体を発現するＴＣＲ欠損Ｔ細胞を同定し、単離する。例えば、ｃｈＮＫＧ２Ｄ発現をｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的なプライマーを使用して、ＱＲＴ−ＰＣＲによって検証できる（Ｚｈａｎｇ、Ｔ．ら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７：１１０２９−１１０３６；Ｂａｒｂｅｒ、Ａ．ら（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：７２−７８）。これらのＴＣＲ欠損ｃｈＮＫＧ２Ｄ＋細胞の機能は、同種異系ＰＢＭＣまたはＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する腫瘍細胞で細胞を培養することによって、決定することができる。Ｔ細胞の増殖およびサイトカインの生成（例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２）は、それぞれ、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡによって決定することができる。Ｔ細胞がＴＣＲ機能を失い、ｃｈＮＫＧ２Ｄ機能を保持しているかどうかを決定するために、抗ＣＤ３（１．６〜５０００ｎｇ／ｍｌ）、マイトマイシンＣ処理された同種異系ＰＢＭＣ、または同一遺伝子ＰＢＭＣで、形質導入された、または制御Ｔ細胞を培養する。細胞の上清を収集し、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２）の生成の程度をＥＬＩＳＡによって決定する。分離後に娘細胞間を等しく分割する細胞膜透過性染色であるＣＦＳＥで、Ｔ細胞を前処置する。細胞分割の程度は、フローサイトメトリーによって容易に決定することができる。

Ｔ細胞活性化の別の顕著な特徴はサイトカインの生成である。ＴＣＲ欠損ｃｈＮＫＧ２Ｄ＋細胞が、Ｔ細胞活性化を誘導するかどうかを確かめるために、マイトマイシンＣ処理された同種異系ＰＢＭＣ、同一遺伝子ＰＢＭＣ、または腫瘍細胞：Ｐ８１５−ＭＩＣＡ（ヒトＭＩＣＡを発現するマウスの腫瘍、ＮＫＧ２Ｄのリガンド）、Ｐ８１５、Ａ２００８（ヒト卵巣腫瘍細胞、ＮＫＧ２Ｄリガンド＋）、およびＵ２６６（ヒト骨髄腫細胞株、ＮＫＧ２Ｄリガンド＋）と、Ｔ細胞を共培養する。２４時間後、細胞のない上清を収集し、生成されたＩＬ−２およびＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって定量化する。Ｔ細胞単独および同一遺伝子ＰＢＭＣでの培養を、負対照として使用する。ｃｈＮＫＧ２Ｄも共発現するＴＩＭ７およびＴＩＭ８発現Ｔ細胞に、ＩＦＮ−γ生成の減少が４０％超観察された。

次に、形質導入されたＴ細胞を対象に再導入し、または投与し、当該対象の抗腫瘍反応を活性化する。容易に投与できるように、本発明の形質導入されたＴ細胞を医薬組成物にし、または、さらに薬剤的にも許容可能である適切な担体または希釈剤と共に、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に適切な移植を行うことができる。当該組成物または移植の作製方法は当該技術分野に述べられている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ、ｅｄ．（１９８０）を参照のこと）。適宜、形質導入されたＴ細胞を、個別の投与経路の定常の方法で、カプセル、溶剤、注入剤、吸入剤、またはエアロゾル等の半固体若しくは液体の形態の製剤に処方することができる。当該技術分野に周知の方法を使用して、組成物が標的組織若しくは臓器に達するまで、放出および吸収を防ぐ若しくは最小限にする、または確実に組成物を徐々に放出する。しかしながら、望ましくは、キメラ受容体を発現する細胞を無駄にしない薬剤的に許容可能な形態を使用する。したがって、望ましくは、形質導入されたＴ細胞を、調和のとれた塩類液、好ましくは、ハンクス平衡塩類溶液、または普通の生理食塩水を含む医薬組成物に作製できる。

ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を使用して、疾患および障害の症状を寛解若しくは低減する、または治療、または予防する方法
本発明は、また、本明細書に記載のＴＣＲ欠損Ｔ細胞、その単離された個体群、または同細胞を含む治療的組成物を使用して、疾患および障害を低減若しくは寛解、または予防若しくは治療する方法に関する。ある実施形態では、本明細書に記載のＴＣＲ欠損Ｔ細胞、その単離された個体群、または同細胞を含む治療的組成物を使用して、癌、感染症、１つ以上の自己免疫障害、放射線疾患を低減若しくは寛解、または予防若しくは治療し、または移植手術を受けている対象の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または移植拒絶を予防若しくは治療する。

本明細書に記載のＴＣＲ欠損Ｔ細胞、その単離された個体群、または同細胞を含む治療的組成物は、発現中にエフェクター細胞がＴＧＦ−β中に増殖でき、導入された調節性Ｔ細胞になるように分化するため、自己免疫または移植拒絶を変化させるのに有用である。ある実施形態では、機能的非ＴＣＲを使用して、疾患の組織部位で、抑制機能を働かせるのに必要な機能的特異性を、これらの誘導された調節性Ｔ細胞に与える。そのため、対象に使用するために多数の抗原特異的調節性Ｔ細胞が増殖する。調節性Ｔ細胞の分化に欠くことのできないＦｏｘＰ３の発現は、フローサイトメトリーによって分析することができ、これらの調節性Ｔ細胞によるＴ細胞の増殖の機能的抑制は、共培養に抗ＣＤ３刺激を与えた後に、Ｔ細胞の増殖の減少を検査することによって分析することができる。

本発明の別の実施形態は、放射線疾患を予防または治療するために、本明細書に記載のＴＣＲ欠損Ｔ細胞、その単離された個体群、または同細胞を含む治療的組成物を使用することに関する。放射線治療または曝露（例えば、汚い爆弾の暴露、放射線漏れ）または骨髄細胞を切除する（特定の薬物療法）その他の条件の後の課題の１つは、造血系を再構成することである。骨髄移植を受けている患者では、移植後第１５日目のリンパ球の絶対数は、転帰成功に相関する。リンパ球が多い患者は良好に回復するため、良好なリンパ球再構成を有することが重要である。この影響の理由は明らかではないが、増殖因子の感染および／または生成から、造血の再構築を好むリンパ球を保護することに起因し得る。

当該実施形態では、本明細書に記載のＴＣＲ欠損Ｔ細胞、その単離された個体群、または同細胞を含む治療的組成物は、同種異系ＭＨＣ抗原に反応することができない多数のＴ細胞を生成させる。そのため、これらのＴ細胞を使用して、人々を回復させ、感染から守り、放射線曝露による全体または部分的骨髄切除を罹患している人々の速い自己再構成を導き得る。破壊的または予期せずに高用量の放射線に曝露される事象では、別の機能的受容体を有する本明細書に記載のＴＣＲ欠損Ｔ細胞、その単離された個体群、または同細胞を含む治療的組成物を患者に迅速に注入し、自身の造血細胞を自身で再構成し、または造血幹細胞源の追加で（例えば、骨髄移植）治療されるまで、数日から数週間、免疫応答および増殖因子の生成の何らかの再構成を提供することができる。

当業者は、癌、感染症、移植拒絶、１つ以上の自己免疫障害、放射線疾患、またはその他の種類のＴ細胞を使用した経験に基づくＧＶＨＤの治療方法を理解している。

本明細書に記載の例証のＴＣＲ欠損ｃｈＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の他に、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を改変、または発現させ、前述の癌または感染症等の疾患を治療するのに有用なその他の機能的受容体を発現することができる。端的には、本発明の治療方法は、ｃｈＮＫＧ２Ｄ、キメラのＦｖドメイン、ＮＫＧ２Ｄ、またはＴ細胞へのシグナルを惹起する任意のその他の受容体等の機能的非ＴＣＲ受容体の使用を考慮し、それによって、潜在能があり、特定のエフェクターＴ細胞を作製する。当業者は、治療対象の疾患に基づき、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞によって発現される適切な受容体を選択することができる。例えば、癌を治療するためのＴＣＲ欠損Ｔ細胞によって発現することができる受容体は、癌細胞上で同定されたリガンドに結合する任意の受容体を含む。当該受容体として、限定されないが、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０が挙げられる。

本発明の別の実施形態では、当該受容体として、限定されないが、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０から得られるリガンド結合ドメインを含むキメラ受容体、または抗Ｈｅｒ２ｎｅｕおよび抗ＥＧＦＲ等の抗腫瘍抗体、並びにＣＤ３ｚｅｔａ、Ｄａｐ１０、ＣＤ２８、４１ＢＢ、およびＣＤ４０Ｌから得られるシグナリングドメインが挙げられる。

本発明のさらなる実施形態では、キメラ受容体はＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＰＳＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＲＯＮ、またはＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６を包含するＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ１ファミリーの一つ以上のメンバーを結合する。

非ＴＣＲ病原体結合型受容体を発現するＴＣＲ欠損Ｔ細胞、および感染性疾患を治療または予防するための病原体受容体を発現するＴＣＲ欠損Ｔ細胞も、本発明によって含まれる。当該実施形態では、非ＴＣＲ受容体は、感染された細胞の表面に認められるウイルス抗原またはウイルス誘導抗原に結合する。予防または治療される感染症は、例えば、ウイルス、細菌、原生動物，または寄生虫によって引き起こされ得る。治療することのできるウイルスとして、限定されないが、ＨＣＭＶ、ＥＢＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、エボラウイルス、ＶＳＶ、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−１）、２型単純ヘルペス（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エチノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、および／または１型若しくは２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）が挙げられる。ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を使用して、治療することのできる非ウイルス性感染症として、限定されないが、感染性スタフィロコッカス属の一種、腸球菌属の一種、炭疽菌、乳酸桿菌属の一種、リステリア属の一種、ジフテリア菌、ノカルジア属の一種、連鎖球菌属の一種、シュードモナス属の一種、ガードネレラ属の一種、ストレプトミセス属の一種、テルモアクチノミセス‐ブルガリス、トレポネーマ属の一種、カンピロバクター属の一種、Ｒａｅｒｕｇｉｎｏｓａ属の一種、レジオネラ属の一種、淋菌、髄膜炎菌、Ｆ．メニンゴゼプチクム、Ｆ．オドラタム、ブルセラ属の一種、百日咳菌、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、大腸菌、クレブシエラ、エンテロバクター、霊菌、セラチア・リクファシエンス、エドワージエラ属、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、ストレプトバチルス属、Ｒ．ｆｉｃｋｅｔｔｓｆｉ、オウム病クラミジア、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｒｎａｔｉｓ、結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、Ｍ．ｆｏｌｌｕｉｔｕｒｎ、ライ菌、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、カンサシ菌、Ｍ．ｌｅｐｒａｅｒｎｕｒｉｕｍ、トリパノソーマ、クラミジア属、またはリケッチアが挙げられる。

本発明の組成物の効果は、開発されている薬剤の種類に依存して、最も適切なｉｎ ｖｉｖｏモデル系で証明することができる。医学文献は、様々な当該モデルの利点および使用の詳細な開示を提供する。例えば、異種移植片マウスモデル等の癌に対する薬剤の薬理学的活性を検討するために通常に使用される多くの異なる種類の癌モデル（例えば、Ｍａｔｔｅｒｎ、Ｊ．ら１９８８．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．７：２６３−２８４；Ｍａｃｏｒ、Ｐ．ら ２００８．Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１４：２０２３−２０３９）があり、またはｉｎ ｖｉｔｒｏの腫瘍増殖の抑制に関するものもある。ＧＶＨＤでは、急性ＧＶＨＤ（例えば、Ｈｅ、Ｓ．ら２００８．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：７５８１−７５９２）と慢性ＧＶＨＤ（例えば、Ｘｉａｏ、Ｚ．Ｙ．ら ２００７．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８１：１４０３−１４１０）の両方のマウスモデルがある。

本発明の組成物の効果が動物でｉｎ ｖｉｖｏで示されると、動物において安全で効果的であると示された用量に基づき、臨床研究が設計され得る。当業者は、Ｓｐｉｌｋｅｒ（２０００．Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）等のテキストに記載の標準的なプロトコルを使用して当該臨床研究を設計することができる。

投与
本発明のある実施形態では、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を約１０^６〜１０^１１細胞個の量で、レシピエントの対象に投与する。本発明の好ましい実施形態では、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を約１０^８〜１０^９細胞個の量で、レシピエントの対象に投与する。本発明の好ましい実施形態では、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を、１６週間未満毎に１回、８週間未満毎に１回、４週間未満毎に１回等の２６週間未満毎に１回の頻度で、レシピエントの対象に投与する。

これらの値は、本発明を実践するために、本発明の方法を最適化するときに、実施者によって使用される形質導入されたＴ細胞の範囲の一般的な手引きを提供する。本明細書でこのような範囲を列挙することによって、特定の適用で保証されるように、要素のより高いまたは低い量を使用することを妨げることは決してない。例えば、組成物がその他の組成物と併用して投与されるかどうか、薬物動態の個体差、薬物消長、および代謝に依存して、実際の用量およびスケジュールは変化する可能性がある。当業者は、特定の状況の緊急性に従って、容易にいかなる必要な調整もすることができる。

当該技術分野の教授に基づき、または通常の実験、例えば、本明細書の開示、およびＧｏｏｄｍａｎ、Ｌ．Ｓ．，Ｇｉｌｍａｎ、Ａ．，Ｂｒｕｎｔｏｎ、Ｌ．Ｌ．，Ｌａｚｏ、Ｊ．Ｓ．，＆Ｐａｒｋｅｒ、Ｋ．Ｌ．（２００６）の教授によって、当業者は、効果的な用量および投与頻度を決定することができる。Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ；Ｈｏｗｌａｎｄ、Ｒ．Ｄ．，Ｍｙｃｅｋ、Ｍ．Ｊ．，Ｈａｒｖｅｙ、Ｒ．Ａ．，Ｃｈａｍｐｅ、Ｐ．Ｃ．，＆ Ｍｙｃｅｋ、Ｍ．Ｊ．（２００６）。薬理学。Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ’ｓ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ ｒｅｖｉｅｗｓ。Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，［ｅｔｃ．］：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＧｏｌａｎ， Ｄ． Ｅ． （２００８）。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ。Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．，［ｅｔｃ．］：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ。投与スケジュールは、良く確立され、細胞ベースの治療法に基づくことができ（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８７）Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．７８ Ｓｕｐｐｌ １：７５−６；米国特許第４，６９０，９１５号）に基づくことができ、交互の連続注入戦略を使用することができる。

本発明の別の実施形態では、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を医薬製剤で対象に投与することができる。

本発明のある実施形態では、１つ以上の活性剤と併用してＴＣＲ欠損Ｔ細胞を投与してもよい。当該活性剤として、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス薬、および抗サイトカイン剤が挙げられる。活性薬剤として、アゴニスト、アンタゴニスト、およびＴＮＦ−αの修飾薬、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ１３、ＩＰ−１０、ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＨＲＧ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、前述のいずれかに反応性のある抗体を含むヘプシジン、およびそれらの受容体のいずれかに対して反応性のある抗体が挙げられる。活性剤として、また、２−アリールプロピオン酸、アセクロフェナク、アセメタシン、アセチルサリチル酸（アスピリン）、アルクロフェナク、アルミノプロフェン、アモキシプリン、アンピロン、アリールアルカン酸、アザプロパゾン、ベノリレート／ベノリラート、ベノキサプロフェン、ブロムフェナク、カルプロフェン、セレコキシブ、コリンマグネシウムサリチル酸塩、クロフェゾン、シクロオキシゲナーゼ−２阻害薬、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサール、ドロキシカム、エテンザミド、エトドラク、エトリコキシブ、ファイスラミン、フェナム酸、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルフェナム酸、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、イブプロキサム、インドメタシン、インドプロフェン、ケブゾン、ケトプロフェン、ケトロラック、ロルノキシカム、ロキソプロフェン、ルミラコキシブ、サリチル酸マグネシウム、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、メタミゾール、サルチル酸メチル、モフェブタゾン、ナブメトン、ナプロキセン、Ｎ−アリールアントラニル酸、神経成長因子（ＮＧＦ）、オキサメタシン、オキサプロジン、オキシカム、オキシフェンブタゾン、パレコキシブ、フェナゾン、フェニルブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、ピルプロフェン、プロフェン、プログルメタシン、ピラゾリジン誘導体、ロフェコキシブ、サリチル酸サリチル、サリチルアミド、サルチル酸塩、スルフィンピラゾン、スリンダク、スプロフェン、テノキシカム、チアプロフェン酸、トルフェナム酸、トルメチン、およびバルデコキシブが挙げられる。

抗体として、アミカシン、アミノグリコシド、アモキシシリン、アンピシリン、アンサマイシン、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カルバセフェム、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファロチン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セホキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアクソン、セフロキシム、セファロスポリン類、クロラムフェニコール、シラスタチン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、ダルホプリスチン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリトロマイシン、エタンブトール、フルクロキサシリン、ホスホマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲンタマイシン、グリコペプチド、ハービマイシン、イミペネム、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マウロライド、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モノバクタム、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペニシリン、ピペラシリン、プラテンシマイシン、ポリミキシンＢ、ポリペプチド、プロントジル、ピラジナミド、キノロン、キヌプリスチン、リファンピシン、リファンピン、ロキシスロマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルファフラゾール、スルホンアミド、テイコプラニン、テリスロマイシン、テトラサイクリン、テトラサイクリン類、チカルシリン、チニダゾール、トブラマイシン、トリメトプリン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、およびバンコマイシンが挙げられる。

活性剤として、また、アルドステロン、ベクロメタゾン、ベタメサゾン、コルチコイド、コルチゾール、酢酸コルチゾン、デオキシコルチコステロン酢酸、デキサメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、グルココルチコイド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ステロイド、およびトリアムシノロンが挙げられる。これらの活性剤の任意の適切な組み合わせも考慮される。

「薬剤的賦活剤」または「薬剤的に許容可能な賦形剤」は、担体、通常は液体であり、活性治療剤が処方される。本発明のある実施形態では、活性治療剤は、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞の個体群である。本発明のある実施形態では、活性治療剤は、機能的非ＴＣＲ受容体を発現するＴＣＲ欠損Ｔ細胞の個体群である。賦形剤は、化学的および／または生物学的安定性を与え得るが、製剤に薬理学的活性は与えない。例示的な製剤として、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９^ｔｈＥｄ．，Ｇｒｅｎｎａｒｏ、Ａ．，Ｅｄ．，１９９５に認めることができ、参照により本明細書に取り込まれる。

「薬剤的に許容可能な担体」または「賦形剤」は、本明細書に使用するとき、任意のおよび全ての溶媒、分散培地、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、生理学的に適合性のある等張剤および吸収遅延剤を含む。ある実施形態では、担体は、非経口投与に適している。あるいは、担体は静脈内、腹腔内、筋肉内、または舌下投与に適することができる。薬剤的に許容可能な担体は、無菌の注入液または分散液を即座に調製するために、無菌の水溶液、または分散液を含む。薬剤的に活性の物質について当該培地および薬剤を使用することは当該技術分野で周知である。任意の通常の培地または薬剤において活性化合物と適合性がなくても、本発明の医薬組成物にそれを使用することは考慮される。補助活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。

本発明の特に好ましい実施形態では、適切な担体として、限定されないが、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、または例えば、１０％のＤＭＳＯおよび９０％のヒト血清を有する任意の凍結媒体が挙げられる。

医薬組成物は、製造および保管条件下で、典型的には無菌で安定的でなければいけない。本発明は、医薬組成物が凍結乾燥した形態で存在することを考慮する。組成物は溶液として処方することができる。担体は、例えば、水を含む分散培地であってもよい。

列挙した実施形態のそれぞれについて、様々な剤形で化合物を投与することができる。当業者に周知の任意の生物学的に許容可能な剤形およびその組み合わせが考慮される。当該剤形の例として、限定されないが、液体、溶液、懸濁液、乳状液、注入液（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）、注入、およびその組み合わせが挙げられる。

本発明の様々な説明された実施形態の上の記述は、本発明を、開示される正確な形態に余すところなく示すこと、または限定することを意図しない。本発明の特定の実施形態および実施例は、説明する目的で記述しており、関連技術分野の当業者が認識するように、様々な同等の修正が本発明の範囲で可能である。本発明の明細書に提供される教授は、その他の目的、上述の実施例と異なるものに適用することができる。

上述の詳細な記述の観点から、本発明にこれらおよびその他の変更を施すことができる。一般的に、以下の請求項では、使用される用語が、本発明を、明細書および請求項に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではない。したがって、本発明は、開示物によって制限されるものではないが、本発明の範囲が以下の請求項によって全体的に特定される。

本発明は、以下の記述および実施例に具体的に記載されるもの以外の方法で、実施してもよい。本発明の多くの修正および変形例は、上述の教授の観点から可能であり、したがって、添付の請求項の範囲にある。

Ｔ細胞受容体欠損Ｔ細胞組成物に関する特定の教授およびその使用方法は、２００９年１０月２９日に提出された米国特許仮出願第６１／２５５，９８０号に開示され、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。

キメラ受容体を発現するＴ細胞の生成およびその使用法に関する教授は、２０１０年２月４日に提出された米国特許仮出願第ＵＳ２０１０／００２９７４９号に開示され、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。

本発明のＴ細胞受容体欠損Ｔ細胞の生成に有用な特定のポリヌクレオチド配列は、当該特許出願の提出に付随して、配列一覧表に開示し、当該配列一覧表の開示は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。

背景技術、発明を実施するための形態、および実施例中に列挙された各書類（特許、特許出願、雑誌論文、要約、マニュアル、書物、またはその他開示物）の全体の開示は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。

以下の実施例は、本発明の作製および使用方法を完全に開示し記述したものを当業者に提供するために記述しており、本発明としてみなされるものの範囲を制限することを意図しない。使用される数値（例えば、量、温度、濃度等）に関して、正確性を期すために努力をしているが、いくつかの実験誤差および偏差があることは許容されるものである。他に断りがない限り、部は重量部であり、分子量は平均の分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気またはそれに近い圧力である。

実施例１：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）欠損Ｔ細胞の生成

ミニ遺伝子を５’および３’ＬＴＲ配列を含むレトロウイルス発現プラスミド（例えば、ｐＦＢ−ネオまたはｐＳＦＧ）にコードする。プラスミドをＰＴ６７またはＰＧ１３等のレトロウイルスパッケージング細胞株にパッケージし、パッケージングがコンフルエンスになったら、ウイルス粒子を収集する。その後、完全培地（または血清のない培地）とｒＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）中で、１〜３日間、ＰＨＡ、抗ＣＤ３、または抗ＣＤ３／２８ｍＡｂによって、Ｔ細胞を活性化させ、レトロネクチンまたはポリブレンの存在下で、３２℃でｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎを実施することによって、Ｔ細胞を形質導入した。約５〜７時間休ませた後に、細胞を洗浄し、新鮮な培地＋ＩＬ−２に２〜７日間置く。過剰な細胞濃度を避けるために（すなわち、＞２ｘ１０^６細胞個／ｍｌ）、周期的に細胞を数え、７ｘ１０^５細胞個／ｍｌで再播種する。形質導入されなかったＴ細胞を取り除くために、選択培地を２日後、３〜５日の期間、使用してもよい。生きている細胞をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ、ミラン、イタリア）勾配によって収集し、さらに１〜３日間増殖させる。

インキュベーションの後、ＴＣＲの発現および機能について、細胞を分析した。適宜、この時点で、機能的非ＴＣＲ受容体の発現も分析してもよい。フローサイトメトリーを使用し、蛍光色素標識抗体を使用して、ＴＣＲ／ＣＤ３発現について試験する。生きている細胞をＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、またはＴＣＲδに対する抗体と組み合わせて、ＣＤ５、ＣＤ８、およびＣＤ４に対する抗体と染色した。ＣＤ３またはＴＣＲ遺伝子のいずれかの発現を使用する場合、ＴＣＲタンパク質とＣＤ３タンパク質の両方の発現は、対照ベクター処理されたＴ細胞に比べ、激しく減少するはずである。アイソタイプの対照抗体を使用して背景蛍光を制御する。Ｔ細胞を同定するために、細胞をＣＤ５でゲート開閉し、その後、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＴＣＲの発現を決定する。各処理について複数の試料を使用し、蛍光色素発光スペクトルの適切な補正を使用する。前述した（Ｚｈａｎｇ、Ｔ．ら、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６６（１１）５９２７−５９３３；Ｂａｒｂｅｒ、Ａ．ら、（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６７（１０）：５００３−５００８のように、特異抗体およびフローサイトメトリーを使用して、別
の受容体（例えば、ｃｈＮＫＧ２Ｄ）の発現を決定する。

ＴＣＲの機能的欠損について試験するために、エフェクター細胞の抗ＣＤ３刺激を培養の最後に使用して、２４時間後にインターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマの生成を測定する。Ｔ細胞（２ｘ１０^５）を可溶性抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）ｍＡｂと完全培地中で培養する。２４時間後、細胞のない馴化培地を収集し、ＩＦＮ−ガンマについてＥＬＩＳＡによって分析する。ＴＣＲ発現または機能の変化は、ＩＦＮ−ガンマ生成の減少に反映されるはずである。

機能的非ＴＣＲの機能について試験するために、特定のリガンドを発現する、または発現しない腫瘍細胞でインキュベートされるＴ細胞による特定のサイトカインの生成を使用する。例えば、ｃｈＮＫＧ２Ｄの機能を試験するために、１０^５Ｔ細胞を、１０^５Ｐ８１５−ＭＩＣＡ腫瘍細胞（リガンド＋）、１０^５Ｐ８１５（リガンド−）細胞、１０^５ＲＰＭＩ８２２６細胞（リガンド＋）またはＴ細胞単独とインキュベートする。２４時間後、細胞のない馴化培地を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−ｇを測定する。リガンド発現腫瘍細胞との培養後、キメラＮＫＧ２ＤＴ細胞はＩＦＮ−γを生成する（Ｚｈａｎｇ、Ｔ．ら、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６６（１１）５９２７−５９３３；Ｂａｒｂｅｒ、Ａ．ら、（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６７（１０）：５００３−５００８）。前述した（Ｚｈａｎｇ、Ｔ．ら、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６６（１１）５９２７−５９３３）のように、リガンド＋腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を試験することも可能である。リガンド−腫瘍細胞または特定の受容体ブロッキングｍＡｂを使用して、特異性が示される。

実施例２：ｃｈＮＫＧ２Ｄを発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）欠損Ｔ細胞の生成

当該実施例では、ｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体の同時発現および内因性ＴＣＲ発現の抑制を実施する。当該実施例では、マウスのｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体をＮ末端に結合されたＣＤ３-ゼータと組み合わせたＮＫＧ２Ｄから成るマウスのｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体を使用する。マウスＴ細胞にｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体を生成させ、発現させる。ＮＫＧ２ＤはＩＩ型タンパク質であり、Ｎ末端は細胞内に位置し（Ｒａｕｌｅｔ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７８１−７９０）、ＣＤ３-ゼータは、細胞質中でＣ末端を伴うＩ型タンパク質である（Ｗｅｉｓｓｍａｎ、ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：９７０９−９７１３）。キメラＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３-ゼータ融合タンパク質を産生させるために、開始コドンＡＴＧは、ＣＤ３-ゼータ鎖（停止コドンＴＡＡなし）の細胞質領域についてコーディング配列の前方、次に野生型ＮＫＧ２Ｄ遺伝子に位置している。発現と同時に、ＣＤ３-ゼータ部分の方向が細胞内で反転する。細胞外および膜貫通ドメインはＮＫＧ２Ｄから生じる。Ｄａｐ１０遺伝子、次にＣＤ３-ゼータ細胞質内ドメインについてコードする断片をコードする第二のキメラ遺伝子も構築する。図１はキメラおよび野生型受容体の構築物を表す。

レンチウイルスベクター内で、ｓｈＲＮＡをｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体と操作的に結合させる。両遺伝子の発現を達成するために、Ｕ６プロモーターによってｓｈＲＮＡを駆動し、ＰＧＫプロモーターによってｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体を駆動する。一次ヒトＰＢＭＣを健康なドナーから単離し、低用量の可溶性抗ＣＤ３および２５Ｕ／ｍｌのｒｈｕＩＬ−２で４８時間活性化させる。レンチウイルスの形質導入にＴ細胞を活性化させる必要はないが、形質導入がより効果的に作用し、ＩＬ−２内で細胞を増殖させ続けることができる。活性化した細胞を洗浄し、３０℃でｓｐｉｎ−ｆｅｃｔｉｏｎを１時間使用し、次に７時間の静止期間をおくことによって形質導入する。細胞を洗浄し、３〜７日間２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２内で培養し、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞を使用して行うのと同様の様式で、エフェクター細胞を増殖させる。ＴＣＲαβ、ＣＤ３、およびＮＫＧ２Ｄの発現を、フローサイトメ
トリーおよび定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）によって評価する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、フローサイトメトリーによって決定する。全体の細胞数およびＴＣＲ複合体の欠損の割合はフローサイトメトリーによって決定する。ｓｈＲＮＡまたはｃｈＮＫＧ２Ｄ遺伝子単独（対照として）で形質導入されるＰＢＭＣと比較する。ベクターのみが形質導入された細胞も対照として含まれる。

ｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体が共発現するため、細胞表面のＴＣＲ発現がない、またはほとんどない細胞が、より高い量の細胞表面ＮＫＧ２Ｄを発現することが予想される。

代わりに、１つはｓｈＲＮＡ構築物であり、もう１つはｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体である２つのウイルスと同時に形質導入を発生させてもよい。ＴＣＲ発現を欠損するＴ細胞中に、確実にｃｈＮＫＧ２Ｄを高発現させるために、多量のｃｈＮＫＧ２Ｄウイルスを使用する。残っているＴＣＲ＋Ｔ細胞を取り除き、ＴＣＲ-、ｃｈＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞を得る。

ウイルスの形質導入および発現の後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉカラムの磁気ビーズで、ＴＣＲ＋およびＴＣＲ細胞をｍＡｂによって分離する。ｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体に特定のプライマーを使用して、ＱＲＴ−ＰＣＲによって、ｃｈＮＫＧ２Ｄ発現の検証を実施する。

Ｔ細胞がＴＣＲ機能を失い、ｃｈＮＫＧ２Ｄ機能を保持しているのかを確かめるために、形質導入された、または制御Ｔ細胞を、マイトマイシンＣ処理された同種異系ＰＢＭＣまたは同一遺伝子ＰＢＭＣと培養する。分離後に娘細胞間を等しく分割する細胞膜透過性染色であるＣＦＳＥで、Ｔ細胞を前処置する。細胞分割の程度は、フローサイトメトリーによって容易に決定できる。

ｓｈＲＮＡ構築物がＴＣＲ機能を抑制し、ｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体を機能させることができるかどうかを確かめるために、形質導入されたＴ細胞をマイトマイシンＣ処理された同種異系ＰＢＭＣ若しくは同一遺伝子ＰＢＭＣ、または腫瘍細胞：Ｐ８１５−ＭＩＣＡ（ヒトＭＩＣＡを発現するマウス腫瘍、ＮＫＧ２Ｄについてのリガンド）、Ｐ８１５、Ａ２００８（ヒト卵巣腫瘍細胞、ＮＫＧ２Ｄリガンド＋）、およびＵ２６６（ヒト骨髄腫細胞株、ＮＫＧ２Ｄリガンド＋）と培養する。４８時間後、細胞のない上清を収集し、生成されたＩＬ−２およびＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって定量化する。Ｔ細胞単独を負対照として使用する。

実施例３：ｃｈＮＫＧ２Ｄを発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）欠損Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ投与

当該実施例では、実施例２で生成されるように、マウスｃｈＮＫＧ２Ｄ受容体を発現するＴＣＲ欠損Ｔ細胞をマウスに投与し、特定の癌の当該Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏの治療能力を評価する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、キメラＮＫＧ２Ｄを保有するＴ細胞（１０^６）をＲＭＡ／Ｒａｅ−１β腫瘍細胞（１０^５）と共に、皮下に同時投与する。３０日後に、腫瘍がない、またはＲＭＡ／Ｒａｅ−１β腫瘍が腫瘍抑制的に増殖する、キメラＮＫＧ２Ｄを保有するＴＣＲ欠損Ｔ細胞で治療されたマウスは、これらのマウスの中で治療的な抗腫瘍活性を反映する。

第二の、もっとストリンジェントなモデルでは、右側にＲＭＡ／Ｒａｅ−１β腫瘍を皮下に接種する１日前に、Ｂ６マウスに形質導入されたＴ細胞（１０^７）を養子性に静脈内に移す。対照ベクターを修飾したＴ細胞に比べ、ＲＭＡ／Ｒａｅ−１β腫瘍（皮下）の増殖の抑制は、これらのマウスに治療的な抗癌作用を反映する。キメラＮＫＧ２Ｄを修飾したＴ細胞での治療の毒性について、キメラＮＫＧ２Ｄを保有するＴ細胞で治療する場合、炎症性損傷（すなわちひだ状の毛、せむし様または下痢等）の明らかな証拠は認められず
、明らかな毒性がないことを反映する。

確立された卵巣腫瘍（ＩＤ８）のよりストリンジェントなモデルでは、５週間腫瘍を持っているマウスに、形質導入されたｃｈＮＫＧ２ＤＴ細胞（５ｘ１０^６Ｔ細胞、静脈内）を注射する。腫瘍曝露から７および９週で、マウスにＴ細胞をさらに注射する。これらの条件下で、ｃｈＮＫＧ２ＤＴ細胞で治療を受けたマウスは、２５０日以上の間、腫瘍のない状態が続き、同じ計画で対照Ｔ細胞の治療を受けたマウスは、１００日以内に腫瘍増殖のため死亡する。キメラＮＫＧ２Ｄ修飾Ｔ細胞での治療の毒性について、キメラＮＫＧ２Ｄを修飾したＴ細胞で治療する場合、炎症性損傷の明らかな証拠は認められず、明らかな毒性がないことを反映する。

多発性骨髄腫のモデルでは、５Ｔ３３ＭＭ腫瘍細胞を持っているマウスを、腫瘍細胞注入後の第１２日目に、ｃｈＮＫＧ２ＤＴ細胞（５ｘ１０^６細胞個、静脈内）で治療する。この治療によって、全マウスの寿命が増加し、これらのマウスの半数は、長期間の無腫瘍生存である。対照Ｔ細胞で治療を受けたマウスは、３０日以内に腫瘍のため死亡する。ｃｈＮＫＧ２ＤＴ細胞で治療することによる毒性の明らかな証拠は観察されない。

免疫系は腫瘍変異体について選択することができるため、癌に最も効果的な免疫療法は、複数の腫瘍抗原に対する免疫性を誘発するものになる可能性がある。３番目の実験では、キメラＮＫＧ２Ｄを保有するＴ細胞で治療することが、野生型腫瘍細胞に対する宿主免疫を誘発するかどうかを試験する。キメラＮＫＧ２Ｄを保有するＴ細胞およびで治療を受ける５Ｔ３３ＭＭ腫瘍細胞を有するマウスは、５Ｔ３３ＭＭ腫瘍細胞に曝露されてから８０日後も無腫瘍である。無腫瘍生存マウスは、平均２７日以内に腫瘍により死亡する対照ナイーブマウスに比べ、その後の５Ｔ３３ＭＭ細胞個（３ｘ１０^５）の曝露に抵抗性がある。しかしながら、無腫瘍生存マウスは、ＲＭＡ−Ｒａｅ１腫瘍細胞（３ｘ１０^５）のその後の曝露には抵抗性がなく、ナイーブマウスと同様のタイムスパンで腫瘍により死亡する（２０日）。このことは、キメラＮＫＧ２Ｄを保有するＴ細胞の養子移入が、宿主に腫瘍特異的Ｔ細胞記憶を産生することを示す。

当該発明では、Ｔ細胞の機能に影響を与える４つのクラスのＴＣＲ抑制分子（ＴＩＭ）を提供する。表２は、１９個の異なるＴＩＭが、可溶性抗ＣＤ３（ＯＫＴ３（２００ｎｇ／ｍｌ））刺激（ＣＤ３）への反応、または同種異系ＰＢＭＣ（Ａｌｌｏ）での培養のいずれかのエフェクターＴ細胞機能に及ぼす影響をまとめたものである。左の名称はＴＩＭのクラスを意味する。数値は、対照ｐＦＢベクターを形質導入されたＴ細胞に比例したＴＣＲ抑制のパーセント減少を示す。ＮＩ：抑制なし。ＮＤ：なされていない。

実施例４：ＣＤ３-エプシロンまたはＣＤ３-ゼータをコードするｓｈＲＮＡ標的核酸を使用したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）欠損Ｔ細胞の生成

当該実施例では、ＣＤ３-エプシロンまたはＣＤ３-ゼータをコードする核酸を標的にするｓｈＲＮＡ配列を使用して、内因性ＴＣＲ発現を抑制した。

Ｕ６プロモーターによって制御された発現を伴うレトロウイルス・ベクターｐＳＭ２ｃ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にクローンされたｓｈＲＮＡ配列を購入した。Ｔ細胞がＴＣＲ複合体の主要要素を１つも生成しないように、これらのｓｈＲＮＡ構築物を使用してＣＤ３-エプシロンおよび／またはＣＤ３-ゼータタンパク質の発現をブロックした。その結果、ＴＣＲ複合体は不安定になり、機能的ＴＣＲの細胞表面発現が防がれ、ＴＣＲ複合体によるＴ細胞機能が減少した。ＣＤ３-エプシロンまたはＣＤ３-ゼータに対するｓｈＲＮＡの配列を表１に記載し、それぞれ、配列番号９〜２６および６８〜７１に対応する。

ｓｈＲＮＡがＴＣＲ機能を変質させるかどうかを確かめるために、（ｉ）可溶性抗ＣＤ３刺激（ＣＤ３）に反応して、または（ｉｉ）同種異系ＰＢＭＣ（Ａｌｌｏ）での培養に反応して、ＩＦＮ−ガンマ生成を測定した。具体的には、２００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクロナール抗体で刺激した後に、ＴＩＭ１またはＴＩＭ３で処理されたＴ細胞のＴＣＲ抑制は、それぞれ、２２．６％または１４．９％減少した。上の表２を参照のこと。

実施例４：ＣＤ３-ゼータのドミナントネガティブ抑制因子を使用したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）欠損Ｔ細胞の生成

当該実施例では、ドミナントネガティブな阻害タンパク質、すなわちＴＩＭの過剰発現が、ＴＣＲ発現および機能を妨げた。ＫＩＲ２ＤＬ１から抑制シグナルを含むように変質されたＣＤ３-ゼータを含むドミナントネガティブ阻害タンパク質を使用して、内因性ＴＣＲ発現を抑制し、得られるＴ細胞はＴＣＲ刺激に反応して活性化されなかった。

ＣＤ３-ゼータをコードする修飾ポリヌクレオチドの全て、または部分を組み込んだミニ遺伝子構築物を、ＣＤ３-ゼータおよびＫＩＲ２ＤＬ１ｃＤＮＡテンプレート（それぞれ、配列番号６４および配列番号６６に対応し、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ハンツビル、アラバマ州）から購入した）を使用して、ＰＣＲによって産生した。Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を使用して全ＰＣＲを実施し、プライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルビル、アイオワ州）によって合成した。確立された実験計画を用いて、各構築物を、５’ＬＴＲによって制御された発現で、レトロウイルス・ベクターｐＦＢ−ネオ（ストラタジーン）にクローンした。得られる構築物をスクリーニングし、シークエンシングによって正確度を確認し、ＤＮＡｄｙｎａｍｏ（Ｂｌｕｅ Ｔｒａｃｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ）によって分析した。ＤＮＡ配列およびその予測されるタンパク質配列は、配列番号６８〜１０１に対応する。

レトロウイルス発現系を使用して、一次Ｔ細胞にＴＩＭを発現させた。２つの異なるパッケージング細胞株を使用して低力価または高力価のいずれかのウイルスを生成した。低力価のウイルスは、パッケージングプラスミドおよびエンベローププラスミドで一過性に形質移入されたＧＰ２−２９３Ｔ細胞によって生成した。７２時間後、ウイルスの上清を集め、Ｇ４１８で選択した後にＮＩＨ−３Ｔ３細胞を感染させることによって力価を測定した。当該系によって生成されたウイルスの力価は５ｘ１０^５と１ｘ１０^７ＣＦＵ／ｍｌの間であった。高力価のウイルスを生成させるために、ＧＰ２−２９３Ｔ系によってウイルスを生成し、ＰＴ６７パッケージング細胞を形質導入した。Ｇ４１８での処理下、ウイルス粒子に感染されたＰＴ６７細胞を５日間選択した。ＴＩＭ発現ＰＴ６７細胞を増殖させ、ウイルス生成に使用した。細胞がコンフルーエントに達してから７２時間後、ウイルスの上清を集め、ＮＩＨ−３Ｔ３で力価を測定した。当該系によって得られるウイルスの力価は、７ｘ１０^７〜２ｘ１０^８ＣＦＵ／ｍｌの範囲にあった。

ヒトＴ細胞を形質導入するために、一次ヒトＰＢＭＣを健康なドナーから単離し、４０ｎｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３および５０Ｕ／ｍｌのｒｈｕＩＬ−２で、７２時間活性化した。活性化されたＴ細胞を洗浄し、３２℃でｓｐｉｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎを１時間使用し、次に６時間の静止期間をおいて、低力価または高力価のいずれかのウイルスによって生成されたレトロウイルスで形質導入した。細胞を洗浄し、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２に４８時間培養し、その後、３日間選択した。選択後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を使用して生きている細胞を単離し、細胞を機能的アッセイに使用する場合、エフェクター細胞を５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２に４８時間増殖させた。ｓｈＲＮＡで形質導入された細胞中のＣＤ３-エプシロンおよびＣＤ３-ゼータの内因性細胞発現、およびｓｈＲＮＡによる遺伝子発現の減少を、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。端的には、ＲＮＡを形質導入されたＴ細胞から抽出し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して０．５〜１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、得られるｃＤＮＡをＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用し、データは、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）レベルに正規化した。ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、およびＣＤ５に特異的な抗体を使用して、細胞表面発現の変化を分析し、ＴＩＭ発現Ｔ細胞では、ベクター対照と比較して、これらの細胞表面分子の発現に差は観察されなかった。

各ｓｈＲＮＡまたはミニ遺伝子構築物（ＴＣＲを細胞表面で除去するか破壊した）でのＴＣＲ発現の減少が、ＴＣＲ刺激に対するＴ細胞の活性化を防ぐのに十分であるかどうかを確かめるために、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞生存および（２）同種異系ＰＢＭＣおよび／または抗ＣＤ３ｍＡｂに反応したサイトカイン生成について、Ｔ細胞を試験した。

細胞生存を試験するために、ｒｈｕＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）を含む完全ＲＰＭＩ培地で形質導入されたＴ細胞を増殖させた。培養開始時と同様の密度で細胞を播種し、細胞数をカウントするために、および生存度を確かめるために、７日またはそれ以上の間、毎日、試料を除去した。対応するベクター対照発現Ｔ細胞と比較して、ＴＩＭ発現Ｔ細胞の増殖に、差は観察されなかった。Ｔ細胞が同種異系の細胞に対する反応を誘発するために十分なＴＣＲを発現したかどうかを確かめるために、４：１の比で、同種異系または自家ＰＢＭＣで、形質導入されたまたは対照のＴ細胞を培養した。２４時間後、細胞のない上清を集め、生成されたＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡで定量した。ＰＢＭＣおよび形質導入された細胞を含むＴ細胞単独を負対照として使用した。分析されたＴＣＲ抑制分子のうち、２つのミニ遺伝子（ＴＩＭ７およびＴＩＭ８）が、Ｔ細胞内のＴＣＲ機能を有意に低下させることができることを識別した。図２を参照のこと。ＴＩＭ７またはＴＩＭ８を発現する１９個の異なるドナーを使用して、同種異系アッセイを実施し、各ドナーを３個の異なる同種異系ＰＢＭＣと共に培養した。ＩＦＮ−γ生成の平均減少が、ＴＩＭ７発現Ｔ細胞では４９％であり、ＴＩＭ８発現Ｔ細胞では６０％であることを観察した。

ＴＣＲ複合体の直接的な抗体刺激によって、各ＴＩＭがＴ細胞機能を抑制するかどうかを確かめるために、ＴＩＭを形質導入したＴ細胞を、異なる濃度範囲の抗ＣＤ３ｍＡｂ（１．６〜５０００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。２４時間後、細胞のない上清を集め、生成されたＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡで定量した。Ｔ細胞単独を負対照として使用した。２００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｍＡｂで細胞を２４時間刺激すると、ＩＦＮ−γ生成の最大減少が、それぞれ、ＴＩＭ７を発現するＴ細胞では４４％、ＴＩＭ８を発現するＴ細胞では５８％であることを観察した。まとめると、このことは、例えば、ＴＣＲを除去するまたは破壊させるためにＴＩＭを使用して、ＴＣＲ発現を減少させることは、Ｔ細胞機能を変化させるのに十分であることを示す。

実施例５：ｃｈＮＫＧ２Ｄを発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）欠損Ｔ細胞の生成

当該実施例では、ドミナントネガティブのＴＣＲ阻害タンパク質、すなわちＴＩＭの同時過剰発現、およびキメラ腫瘍標的受容体の発現を実施した。具体的には、ＴＩＭを使用して内因性ＴＣＲ発現を抑制し、ＣＤ３-ゼータの細胞質内ドメインに結合されたｃｈＮＫＧ２Ｄキメラ受容体、すなわちＮＫＧ２Ｄを発現させた。ＮＫＧ２ＤはＤａｐ１０と付随し、Ｔ細胞に一次および二次活性化シグナルの両方を提供する。Ｚｈａｎｇ、Ｔ．ら．２００６．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（１１）：５９２７−５９３３を参照のこと。ＮＫＧ２Ｄについてのリガンドは、大部分のヒト腫瘍細胞によって発現されるが、大部分の正常な細胞には発現されない。

ＴＩＭとキメラ腫瘍標的受容体の両方の発現を試験するために、一次ヒトＰＢＭＣを健康なドナーから単離し、４０ｎｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３および５０Ｕ／ｍｌのｒｈｕＩＬ−２で７２時間活性化した。活性化されたＴ細胞を洗浄し、３２℃で１時間のｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎを使用し、次に７時間の静止期間をおくことによって、高力価のレトロウイルスで形質導入した。ＴＩＭとｃｈＮＫＧ２Ｄの等量を形質導入に使用した。細胞を洗浄し、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２に４８時間培養し、その後、３日間、Ｇ４１８選択を行った。選択後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を使用して生きている細胞を単離し、細胞を機能的アッセイに使用するときに、エフェクター細胞を５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２中に４８時間増殖させた。ＣＤ３、ＣＤ４、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ５に特異的な抗体を使用して、細胞表面発現の変化を分析した。ベクター対照と比較して、ＴＩＭ発現Ｔ細胞内のこれらの表面分子の発現に有意差は観察されなかったが、但し、予想したように、ｃｈＮＫＧ２Ｄウイルスで形質導入された細胞内のＮＫＧ２Ｄ受容体に高い発現が観察された。

ＴＩＭ＋ｃｈＮＫＧ２Ｄ＋細胞が同種異系細胞への反応を減少するが、腫瘍細胞には反応を増加させるかどうかを確かめるために、Ｔ細胞を同種異系ＰＢＭＣ、同一遺伝子ＰＢＭＣ、または腫瘍細胞：ＰＭＩ８２２６（ヒト骨髄腫細胞株、ＮＫＧ２Ｄリガンド＋）、ＰＡＮＣ−１（ヒト膵臓細胞株、ＮＫＧ２Ｄ＋）、若しくは負対照としてＮＩＨ−３Ｔ３（正常マウスの線維芽細胞株、ＮＫＧ２Ｄリガンド−）と同時に培養した。２４時間後、細胞のない上清を集め、生成されたＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって定量した。Ｔ細胞単独、および同一遺伝子ＰＢＭＣとの培養を負対照として使用した。

同種異系アッセイでは、ＴＩＭ７発現Ｔ細胞ではＩＦＮ−γ生成が４５％減少し、ベクター対照を発現する細胞に比べ、ｃｈＮＫＧ２Ｄを同時発現するＴＩＭ８−発現Ｔ細胞では、ＩＦＮ−γ生成が４４％減少することを観察した。腫瘍細胞と培養したとき、ＴＩＭのみを発現する細胞と比較して、腫瘍細胞がＮＫＧ２Ｄリガンド（ＲＰＭＩ８２２６およびＰＡＮＣ−１）を発現したとき、ＴＩＭ＋ｃｈＮＫＧ２Ｄ＋細胞内の腫瘍細胞に反応してＩＦＮ−γ生成量が有意に増加することが観察されたが、リガンド欠損腫瘍細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）と培養したときは、増加は観察されなかった。ＲＰＭＩ８２２６を使用した代表的な実験を示す図３を参照のこと。同実験はまた、ＮＫＧ２ＤについてブロッキングｍＡｂとのインキュベーションはＩＦＮ−γ生成を増加させないため、高いＩＦＮ−γ生成はＮＫＧ２Ｄ依存的であることも証明した。

Claims (17)

1. 単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）欠損ヒトＴ細胞を生成させる方法であって、ＴＣＲ複合体の要素の発現を減少し、またはブロックすることによって、ＴＣＲ複合体を不安定にするＴＣＲ抑制分子（ＴＩＭ）をＴ細胞中で発現させることを含み、当該細胞はさらに操作されて、キメラの腫瘍標的受容体（ＣＡＲ）を発現するものであってもよく、
   前記ＴＩＭは、配列番号８１（ＴＩＭ９）または配列番号８５（ＴＩＭ１１）のアミノ酸配列を有するＫＩＲ融合タンパク質を含む抑制シグナルを含むように改変されたＣＤ３-ゼータを含むドミナントネガティブ阻害タンパク質を含む、方法。
2. 前記抑制シグナルは、配列番号８０によりコードされるＫＩＲ融合タンパク質（ＴＩＭ９）を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記抑制シグナルは、配列番号８４によりコードされるＫＩＲ融合タンパク質（ＴＩＭ１１）を含む、請求項１に記載の方法。
4. ＴＣＲ欠損Ｔ細胞が、シグナリングドメインに結合されるリガンド結合ドメインを含むＣＡＲを発現する、請求項１、２または３に記載の方法。
5. リガンド結合ドメインはＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、またはＮＫｐ８０から得られる、請求項４に記載の方法。
6. リガンド結合ドメインは抗腫瘍キメラ抗原受容体または抗腫瘍抗体から得られる、請求項４に記載の方法。
7. 抗腫瘍抗体は、抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体から得られる、請求項６に記載の方法。
8. シグナリングドメインはＣＤ３ゼータ、Ｄａｐ１０、ＣＤ２８、４１ＢＢ、またはＣＤ４０Ｌから得られる、請求項４に記載の方法。
9. ＣＡＲは、ＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＰＳＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＲＯＮ、またはＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ１ファミリーの１つ以上のメンバーを結合する、請求項４に記載の方法。
10. ＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ１ファミリーの１つ以上のメンバーは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６を包含する、請求項９に記載の方法。
11. ＣＡＲは、感染された細胞の表面に認められるウイルス抗原またはウイルス誘導抗原に結合する、請求項４に記載の方法。
12. ウイルスは、ＨＣＭＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、エボラウイルス、ハンタウイルス、またはＶＳＶから選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 請求項１〜１２に従って生成されたＴＣＲ欠損ヒトＴ細胞。
14. ヒトの療法用医薬の製造における、請求項１〜１２に従って生成されたＴＣＲ欠損ヒトＴ細胞の使用。
15. 医薬が、癌または感染状態を治療するためのものである、請求項１４の使用。
16. ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄからのリガンド結合ドメイン、およびＣＤ３-ゼータからのシグナリングドメインを含む、請求項４に記載の方法。
17. キメラ受容体はｃｈＮＫＧ２Ｄである、請求項１６に記載の方法。