CN112955532A - 三维生物反应器 - Google Patents

三维生物反应器 Download PDF

Info

Publication number
CN112955532A
CN112955532A CN201980071515.1A CN201980071515A CN112955532A CN 112955532 A CN112955532 A CN 112955532A CN 201980071515 A CN201980071515 A CN 201980071515A CN 112955532 A CN112955532 A CN 112955532A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bioreactor
voids
coating
cell
xylene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980071515.1A
Other languages
English (en)
Inventor
J·凌
S·T·威灵霍夫
M·J·鲁瓦尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest Research Institute SwRI
Original Assignee
Southwest Research Institute SwRI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest Research Institute SwRI filed Critical Southwest Research Institute SwRI
Publication of CN112955532A publication Critical patent/CN112955532A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y80/00—Products made by additive manufacturing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2806—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D165/00—Coating compositions based on macromolecular compounds obtained by reactions forming a carbon-to-carbon link in the main chain; Coating compositions based on derivatives of such polymers
    • C09D165/04—Polyxylylenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y10/00—Processes of additive manufacturing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及用于细胞扩增和细胞分泌物质产生的三维(3D)生物反应器的设计、制造和应用。所述生物反应器具有相对低水平的潜在细胞毒性化合物，可以用取代或未取代的聚(对二甲苯)型涂层涂覆，并且还可以从液晶可光聚合单体单独地形成。

Description

三维生物反应器
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月24日提交的美国临时申请62/735,531的申请日的利益，其教导内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及用于细胞扩增和细胞分泌物质产生的三维(3D)生物反应器的设计、制造和应用。本发明包括减少或防止在通过基于原位光聚合的3D打印技术制造时3D生物反应器或其他组件的细胞毒性浸出的方法。该方法包括将具有相对高光聚合效率的3D打印材料、打印后UV固化、打印后加热/真空提取以及使用取代或未取代的聚(对二甲苯)类型的材料的打印涂覆相结合。
背景
癌症免疫疗法(代表医学生物技术革命的最新阶段)是利用患者自身的免疫系统来治疗癌症。最近的成功案例是基于嵌合抗原受体(CAR)T细胞的癌症治疗。一种典型的CART细胞疗法是其中将从患者自身血液收集的T淋巴细胞进行基因工程改造以在其表面产生一种特殊的受体CAR，使得T细胞能够识别和攻击癌细胞。经过工程改造的CAR T细胞在实验室中生长并扩增到数十亿的数量，然后被注射回患者以杀死癌细胞。
随着CAR T细胞疗法的成功，下一个问题是如何使其更安全和更具成本效益。当前的T细胞工程化过程通常仍基于使用磁珠以与T细胞一起孵育。磁珠在其表面涂覆有CD3和CD28以充当活化T细胞的抗原，因此它们可以增殖。悬浮在具有T细胞的细胞培养基中的微珠为T细胞提供了相对较大的表面区域以接触并暂时结合CD3和CD28和然后活化。T细胞生长到一定密度后，将T细胞和磁珠移入相对较大的生物反应器(例如GE的WAVE生物反应器)中，以继续刺激和扩增的过程。重复该过程多次以生长相对大量的T细胞。在收获时，必须使用磁力分离器将T细胞从珠子分离。因此，当前的T细胞扩增过程通常依赖于磁珠、多阶段处理和手动相互作用，其不是成本有效的。另外，它是一个开放系统，这可以容易地引入污染物，并使得满足良好制造工艺(GMP)要求相对较贵。
因此，仍然需要通过提供改进的生物反应器设计、具有成本效益的制造技术以及改进的生物反应器操作能力来改善细胞扩增和特别是T细胞扩增以达到临床应用剂量要求的方法和装置。
另一个迫切需求是提供贴壁细胞(例如干细胞)的有效扩增的装置。随着干细胞技术和再生医学的最新发展，基于干细胞的疗法的数量已显著增加。由于干细胞尚未特化，并且可以分化为用于组织修复和再生的许多类型的细胞，它们具有治愈许多人类疾病的潜力。大规模的细胞扩增是基于干细胞的治疗和组织再生的瓶颈之一。通常，一克组织中有109个细胞。但是，从供体收获的复制细胞数量非常少(约105个细胞)，这需要约10,000倍的细胞扩增以用于临床应用。用于细胞培养的常规2D平面T型培养瓶法相对难以按比例放大。使用T型培养瓶的手动过程劳动强度大、容易受到污染并且需要很高的成本以满足cGMP细胞生产标准。基于堆叠板、微载体和中空纤维的商购可得的3D细胞扩增装置也有几个限制，包括：有限的可扩展性，缺乏关键的过程控制，高剪应力，较大的营养梯度以及复杂的下游加工。在本公开内容中，我们描述了用于细胞扩增和产生细胞分泌物质的作为3D生物反应器的装置的设计、制造和应用。
概述
一种用于细胞生长的3D生物反应器，其包括具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D＞d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定空隙体积(V)；和(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；并用取代或未取代的聚(对二甲苯)涂覆所述生物反应器。
一种用于细胞生长的3D生物反应器，其包括具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D＞d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定空隙体积(V)；和(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；
其中所述生物反应器包含以下单体的聚合产物：
Figure BDA0003043476880000031
其中X和Y包括通过自由基聚合反应聚合的可聚合基团，R2是具有大于R1和R3的体积的大体积(bulk)有机基团，其中R2适应于提供足够的空间位阻以在室温下实现向列状态。
附图的简要说明
图1示出了3D生物反应器固定床的截面图。
图1a示出了生物反应器的单位负模型，其显示了相邻球体的重叠。
图1b示出了单位负模型，其中每个球体被12个相同的相邻球体包围。
图1c示出了3D生物反应器固定床几何形状，其显示了相互连接的空隙系统。
图1d以剖视图示出了3D生物反应器固定床几何形状。
图1e以2D视图示出了3D生物反应器的识别出的球形空隙及其重叠区域以在球形空隙之间形成相互连接的孔。
图2示出了放置在具有用于流体灌注的入口和出口的壳体中的3D生物反应器固定床。
图3示出了典型的3D生物反应器灌注系统。
图4a、4b、4c和4d显示了通过3D生物反应器的流速分布。
图4e指示通过3D生物反应器的流速的标尺。
图5a和5b示出了3D生物反应器中的表面剪应力的分布。
图5c指示以Pa为单位的剪应力的标尺。
图6a示出了圆柱形3D生物反应器中沿流动方向的压降(梯度)。
图6b指示压力的标尺。
图7a示出了通过FDM 3D打印产生的3D生物反应器固定床。
图7b示出了3D生物反应器固定床以及生物反应器室。
图7c示出了3D生物反应器的入口和出口。
图7d示出了组装的3D生物反应器。
图7e示出了通过SLA 3D打印产生的3D生物反应器固定床。
图7f示出了通过DLP 3D打印产生的3D生物反应器固定床。
图8示出了放置在3D生物反应器的入口和出口处以接近层流的两个流体分配器。
图9示出了当使用流体分配器时通过3D生物反应器的流速分布。
图10a和10b示出了通过替代的成孔剂浸出方法的3D生物反应器的形成。
图11示出了抗体在3D生物反应器的球形空隙体积上的固定以用于结合和活化T细胞。
图12示出了用于T细胞活化和扩增的无珠子的基于闭环灌注的3D生物反应器。
图13示出了不同浓度的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白涂层的荧光强度。荧光标记的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白用于显示涂覆在生物反应器表面上的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的浓度。
图14示出了抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白上的生物素涂层的荧光强度。荧光标记的生物素用于显示结合在抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白上的生物素的浓度。
图15示出了相对于没有抗体涂层的生物反应器基质与抗体涂覆的磁珠和生物反应器基质孵育(静态)的T细胞生长(在珠子活化之后)。
图16示出了分别与珠子、具有抗体涂层的生物反应器基质和没有抗体涂层的生物反应器基质一起孵育(静态)的T细胞活化和扩增。
图17示出了在使用连续灌注的3D生物反应器中的T细胞活化和扩增。
图18示出了用于本文的3D生物反应器的优选的打印后方案。
图19显示了使用不同时间长度的UV/臭氧处理的聚对二甲苯C涂覆的3D生物反应器的比较结果。
图20显示了在使用UV/臭氧处理的聚对二甲苯C涂覆的3D生物反应器上的人源性脂肪干细胞(hADSC)的细胞扩增。
图21显示了荧光显微图像，其显示在3D生物反应器中作为时间的函数的活ADSC细胞的数量的增加。
优选实施方案的详细描述
本公开内容涉及基于灌注的可扩展生物反应器设计，并且具有相应的操作能力以实现用于免疫治疗目的的T细胞扩增或用于再生医学的干细胞扩增。来自患者的T细胞或干细胞的活化和扩增例如在基因修饰后提供可被输注回患者的治疗性T细胞或干细胞产物，并以选择性靶向并杀死患者的肿瘤细胞或使用患者自身的再生细胞用于治疗衰老相关疾病的方式使用患者自身的免疫系统。
本文提及的生物反应器是指所公开的3D反应器，其中可以在选定的环境和操作条件下实施生物和/或生化过程。这包括以下一项或多项的控制：空隙的几何形状/大小，空隙之间的相互连接的孔大小以及包括的空隙总数(确定生物反应器的整体尺寸)。另外，可以选择性地控制表面涂层、通过生物反应器内的空隙的流动特性、pH、温度、压力、氧气、营养物供应和/或废物去除。临床剂量要求是指提供109个细胞或更大的剂量的能力。
在图1中以剖视图一般性示出3D生物反应器的优选固定床10，其中显示了优选的填充的和球形的空隙结构及其在球形空隙之间的相互连接的孔的实例。更具体地，生物反应器包括连续的相互连接的3D表面区域12，其提供了在抗体的存在下结合细胞的能力，并且还在生物反应器内限定了多个相互连接的非随机空隙14，其如所示的优选为具有内部凹面以最大化表面与体积比的球形形状。空隙应理解为某一确定体积的开放空间。通过提及非随机，应当理解，现在可以鉴定3D生物反应器中导致实际所需公差的重复空隙尺寸和/或几何形状的目标或选定数量的空隙。
通过提及连续表面，应当理解，扩增的细胞可以容易地从一个表面区域位置迁移到3D生物反应器内的另一个表面区域位置，并且表面不包括任何随机中断，例如表面中的随机断裂或0.1mm或更大的随机间隙。优选地，用于细胞扩增的3D生物反应器内的50％或更多的表面区域是连续表面，更优选3D生物反应器内60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多或99％或更多的表面区域是连续的。
另外，生物反应器固定床10包括在空隙之间的非随机的相互连接的孔开口16。再次，提及非随机应该理解为现在可以鉴定空隙的具有选定的孔径的目标或选定数量的空隙，其导致具有所需公差的孔径的实际数量的孔。如剖视图所示，生物反应器最终还限定了一层非随机空隙(见箭头“L”)，并且可以理解的是，生物反应器的多个层可以随后允许鉴定一列内的多个这样的非随机空隙(见箭头“C”)。
生物反应器可以由生物相容性或生物惰性的聚合材料制成，例如在FDM(熔融沉积成型)3D打印技术中使用的聚苯乙烯、聚碳酸酯，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)。提及生物相容性或生物惰性应理解为对培养细胞无毒的材料。另外，用于3D生物反应器的聚合材料优选选自在细胞培养期间不易水解的那些聚合物，使得水解量不超过存在的聚合材料的5.0重量％，更优选地，其不超过2.5重量％，最优选不超过1.0重量％。生物反应器还可以由在SLA(立体光刻)和DLP(数字光处理)3D打印技术中使用的生物相容性材料(例如，聚(甲基丙烯酸甲酯)或PMMA等)制成。
本文的生物反应器还可以优选由美国专利号7,041,234；7,094,360；7,098,359；7,108,801；7,147,800；和7,238,831(其通过引用并入本文)中描述的生物相容性的液晶的可光聚合的单体制成。因此，本文的还可以用来形成3D生物反应器的单体可以描述为具有以下结构：
Figure BDA0003043476880000071
在上文中，X和Y包括可聚合基团，其可通过自由基聚合或通过亲核加成(包括但不限于迈克尔加成)聚合。实例包括不饱和碳-碳键和环氧端基。因此，优选的端基可包括具有不饱和碳-碳键的取代的和未取代的烯基酯基(例如-OC(O)-CH＝CH2或-OC(O)-C(CH3)＝CH2)。R2是具有大于R1和R3的体积的大体积有机基团，其中R2适应于提供足够的空间位阻以在室温下实现向列状态，同时抑制液晶单体的结晶度。因此，R1和R3选自比R2体积小的基团。合适的R2基团包括但不限于叔丁基、异丙基、苯基和仲丁基。特别优选的R2基团包括叔丁基。R1和R3比R2体积小，并且优选选自氢原子和甲基。这种类型的不同单体的共混物还可用于使起始单体粘度和聚合收缩率最小化，并使聚合转化率最大化，以产生最少的残留单体并优化最终聚合物的机械性能。考虑了在25℃至70℃的温度下起始零剪切单体粘度将在5泊至300泊的范围内，聚合转化率将在至少75％及更高的范围内，更优选地大于或等于至少90％。此外，所形成的聚合物优选具有以下机械强度特性：(1)室温下的挠曲模量至少为1500MPa，并且在1500MPa至2500MPa的范围内；(2)室温下的挠曲强度至少为70MPa，更优选在70MPa至100MPa的范围内。此外，聚合收缩率小于或等于5％，更优选在0.5％至4.0％的范围内。另外，上文示出的结构的液晶单体共混物可以与光引发剂和热引发剂体系以及粘度调节剂混合，同时仍保持液晶状态。
优选地，用于制造生物反应器的材料在水性介质中不可降解，并且可以提供机械稳定的结构以耐受在细胞扩增过程中的水性介质流动。优选地，材料和制造工艺可以产生用于单层细胞扩增的固体和光滑的相互连接的表面区域。通过提及固体表面，应该理解该表面使得其将减少或防止通常直径为约20微米至100微米的培养细胞的渗透或包埋。优选地，3D生物反应器具有拥有一定表面粗糙度值(Ra)的表面，该表面粗糙度值是指在评估长度内记录的从平均线的轮廓高度偏离的绝对值的算术平均值。因此，本文考虑了3D生物反应器表面的Ra将具有小于或等于20μm，更优选地小于或等于5μm的值。
本文的3D生物反应器还优选是由显示至少10或在10-95的范围内和更优选在45-95的范围内的邵氏D硬度的材料制成的3D生物反应器。在这方面，还值得注意的是，本文的3D生物反应器是不使用包括一定量的交联并吸收显著量的水(例如10-40重量％)的水凝胶型结构(其可以被理解为亲水型聚合结构)的3D生物反应器。还值得注意的是，本文的3D生物反应器是优选不使用胶原蛋白、藻酸盐、血纤蛋白和细胞易于消化和重塑的其他聚合物的3D生物反应器。
此外，本文的3D生物反应器优选是由具有至少0.01GPa的拉伸模量的材料制成的3D生物反应器。更优选地，拉伸模量具有以0.01GPa增量的在0.01GPa至20.0GPa的范围内的值。甚至更优选地，用于3D生物反应器的材料的拉伸模量在0.01GPa至10.0GPa或1.0GPa至10GPa的范围内。例如，对于先前提及的适合用于制造本文的3D生物反应器的聚合材料，聚苯乙烯指示约3.0GPa的拉伸模量，聚碳酸酯指示约2.6GPa的拉伸模量，ABS指示约2.3GPa的拉伸模量，PLA指示约3.5GPa的拉伸模量，PCL指示约1.2GPa的拉伸模量，和PMMA指示约3.0GPa的拉伸模量。
本文的具有这种优选的规则几何特征和连续表面区域的3D生物反应器设计优选根据可通过例如SolidWorksTM计算机辅助设计(CAD)程序实现的计算机生成的设计通过增材制造技术(例如FDM，选择性激光烧结(SLS)、立体光刻(SLA)、数字光处理(DLP)3D打印技术等)来制造。
作为优选实例，下面描述利用SolidWorksTM来生成3D生物反应器设计的过程。首先创建负生物反应器的计算机模型。更具体地，创建因此可以被描述为负3D生物反应器，例如使用重叠以在球体之间产生1.0mm直径的相互连接的孔的填充的6.0mm直径的球体。当然，在本公开内容的广泛范围内考虑了其他可能的尺寸。
球体优选地组织成六角形紧密填充(HCP)的晶格，以产生有效(或紧密)填充的几何形状，其导致每个球被12个相邻球体包围。这种示例性几何形状的晶胞在图1a中示出。更具体地，在图1a中，存在HCP晶格的晶胞，其中顶部的三个球体展示为半透明以显示相邻球体之间的6个径向重叠区域。在这些重叠区域处形成孔。优选地，孔的最大数量为12以优化填充。最小孔数是2，以便允许通过3D生物反应器的空隙的介质灌注。因此，存在于3D生物反应器中的至少90.0％至100％的空隙在每个空隙具有至少2个孔开口。更优选地，3D生物反应器中至少90.0％至100％的空隙在每个空隙具有8-12个孔开口。在一个特别优选的实施方案中，3D生物反应器中至少90.0％至100％的空隙在每个空隙具有12个孔开口。
在图1b中，示出了单元的所有球体。然后优选地通过反转负模型以创建包括图1c所示的相互连接的球形空隙系统的正模型来创建生物反应器几何形状。此外，在图1d中，可以再次以剖视图看到3D生物反应器，其提供了在14处在剖视图中显示的具有规则的几何特征(基本上与上文所述的相同控制的空隙体积)的相互连接的空隙和相应的相互连接的孔开口16的另一图示。
在上文所述的优选的规则几何3D生物反应器中，可以鉴定在空隙直径和相互连接的孔径之间的关系。请注意图1e。对于这种优选的几何形状，球形空隙1用实心圆表示，直径为D(由箭头指示)。因此，直径“D”可以理解为内部空隙表面上任意两点之间的最长距离。球形空隙2由虚线圆表示，并且还将具有直径D(未显示)。球形空隙2是球形空隙1的12个相邻空隙之一。由于相邻空隙之间的重叠，它在球形空隙之间形成相互连接的孔，具有直径“d”，如还提供大体上水平的箭头所示。直径“d”因此可以理解为在孔开口处的任何两个点之间的最长距离。空隙的总3D球形表面区域为SA空隙＝4×π×(D/2)2。A和B之间的表面区域称为Scap＝π×D×h，其中
Figure BDA0003043476880000101
3D生物反应器中给定空隙的有用空隙表面将为SAu＝SA空隙–[12×Scap]。
空隙直径D越小，可以将更多数量的空隙填充到一组3D空间(体积)中，因此导致较大的总体细胞结合表面。然而，为了最小化或防止细胞聚集以阻止灌注，对于此几何形状，孔的最小直径优选为d＝0.2mm。孔的直径d可以在0.2mm至10mm的范围内，并且更优选在0.2mm至2.0mm的范围内。最优选地，d≥0.5mm并且在0.5mm至2.0mm的范围内。
如果D＝0.40mm或更小，则当d＝0.2mm时，计算出的SAu小于0，这导致不可能的结构，因此，对于这种3D生物反应器几何形状，D必须>0.4mm。然而，D可以具有0.4mm至100.0mm，更优选地0.4mm至50.0mm，并且也可以在0.4mm至25.0mm的范围内的值。D的一个特别优选的值在2.0mm至10.0mm的范围内。具有相对大的D值的球形空隙可能降低在相同生物反应器体积内尽可能多地增加细胞培养表面区域的目的。因此，对于图1e中所示的优选几何形状，D＞0.4mm(空隙的直径)和d＞0.20mm(孔的直径)。还值得注意的是，对于在0.4mm至100.0的范围内的空隙的直径D的任何选定值，和对于在0.2mm至10.0mm的范围内的孔的直径d的任何选定值，D的值为使得其大于d的值(D＞d)。
现在可以认识到，可以相对于其非随机特性来表征本文的3D生物反应器。优选地，3D生物反应器内的所有空隙使得它们具有基本相同的体积，以实现最有效的3D空间填充并提供最大的对应连续表面区域。关于在任何给定的3D生物反应器中存在的相互连接的空隙的总数，优选90.0％或更多的这样的空隙，或甚至95.0％或更多的这样的空隙，或甚至99.0％至100％的这样的空隙具有空隙体积(V)，其公差使得其变化不超过+/-10.0％或+/-5.0％或+/-2.5％或+/-1.0％或+/-0.5％或+/-0.1％。应注意的是，尽管在图1中的空隙被显示为大体上球形，但是考虑了其他空隙几何形状。选择空隙的直径以最小化或避免细胞聚集，并为细胞培养提供最大的有用表面区域。
本文的3D生物反应器的另一个非随机特征是空隙之间的孔开口，其具有直径d(再次参见图1e)。与上文所述的相似，空隙之间的90.0％或更多的孔开口，或甚至95.0％或更多的孔开口，或99.0％至100％的孔开口指示d的值，其公差变化不超过+/-10.％，或+/-5.0％，或+/-2.5％或+/-1.0％，或+/-0.5％或+/-0.1％。
因此，现在可以理解，用于非粘附细胞生长的3D生物反应器包括用于细胞结合的表面区域、具有直径D(内部空隙表面上任意两点之间的最长距离)的多个空隙、在所述空隙之间的具有直径d(在孔开口的任意两点之间的最长距离)的多个孔开口，其中D＞d。另外，90％或更多的空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定空隙体积(V)，并且90％或更多的孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值。
另外，用于扩增非粘附细胞如T细胞的3D生物反应器可以包括具有直径D1的第一多个空隙、在所述第一多个空隙之间的具有直径d1的多个孔开口，其中D1>d1，其中90％或更多的第一多个空隙具有拥有变化不超过+/-10.0％的公差的空隙体积(V1)。这样的3D生物反应器还可以包含具有直径D2的第二多个空隙、在所述第二多个空隙之间的具有直径d2的多个孔开口，其中D2>d2，其中90％的第二多个空隙具有拥有变化不超过+/-10.0％的公差的空隙体积(V2)。V1和V2的值不同并且在其公差变化之外。换句话说，V1的值(包括其+/-10.0％的公差)和V2的值(包括其+/-10.0％的公差)是不同的，或[V1+/-10.0％]≠[V2+/-10.0％]。
因此，空隙内的表面的曲率半径(Rc)优选为1/0.5(D)，或者1/0.2mm＝5mm-1或更小。优选地，Rc可以具有0.2mm-1至1.0mm-1的值，其对应于10.0mm至2.0mm的D值。高曲率(大Rc)表面提供与典型的单层2D培养物明显不同的环境，这也可诱导细胞表型变化。
细胞优选结合在3D生物反应器的相互连接的球形空隙表面上。这种3D结构优选地是可扩展的，并且能够利用相对较小占地面积的细胞扩增生物反应器提供相对较高的表面与体积比用于相对较大的细胞扩增。表面区域与体积比还优选地由球形空隙的直径确定。直径越小，表面区域与体积比越高。优选地，空隙提供相对“平坦”的表面(即，低曲率半径≤1.0mm-1)用于尺寸为5μm至100μm的细胞，并且还减少或避免细胞聚集。另外，如上文所述，细胞聚集还通过控制相互连接的孔的直径d来减少或避免，该直径优选为至少500μm，但是要注意，可以是大于200μm的任何尺寸。
生物反应器固定床10因此可以优选地用作一次性使用的3D生物反应器，如图2进一步所示。更具体地，生物反应器10可以被放置在壳体18中，然后被放置在入口隔室和出口隔室20中，可以为其提供流体的流入和流出。优选地，可以使用增材制造技术将生物反应器10、壳体18以及入口隔室和出口隔室20制造为单个部件。如图3所示，壳体18以及入口隔室和出口隔室20中的生物反应器10可以成为用于MSC扩增的整个3D生物反应器系统的一部分。更具体地，优选将3D生物反应器放置在灌注系统内，该灌注系统通过3D生物反应器输送细胞培养基和氧气以用于促进细胞生长。2D T培养瓶中使用的多次传代细胞扩增方法也可以直接应用于3D生物反应器，除了3D生物反应器具有等于10、100或1000个T培养瓶的细胞培养面积。
现在可以理解的是，取决于相互连接的空隙的直径，3D生物反应器提供相对较大的表面与体积比。举例来说，限定了5厘米直径和15厘米高度的圆柱体传统的滚瓶提供了236cm2的细胞生长表面区域。如果使用相同的体积来包封具有2.0毫米直径的相互连接的空隙的本文的3D生物反应器，则总共可以将44,968个球形空隙填充到空间中，从而可以提供具有约5,648cm2表面区域的基质，几乎是滚瓶表面区域的24倍。
与中空纤维或基于微载体的生物反应器相比，本文的3D生物反应器的至少一个独特特征是能够提供较大的相互连接的连续表面而不是破碎的表面。因此，考虑了本文的3D生物反应器内的连续表面使细胞能够更自由地从一个区域迁移到另一个区域。使用图3中所示的灌注系统，考虑了可以容易地在生物反应器内部产生营养物或细胞信号的梯度以诱导细胞迁移。
结合用于制备3D生物反应器的本文提及的优选3D打印技术，现在可以使用计算流体力学(CFD)来模拟生物反应器内的介质流动，并估算3D互连表面内部任何位置的流速和剪应力，并允许优化以改善细胞培养环境。更具体地，使用CFD来模拟通过生物反应器的3D互连空隙的流动特性，并估计以下各项的分布：(1)流速；(2)压降；(3)壁面剪应力。可以理解的是，后一个参数剪应力对于细胞扩增是重要的。剪应力的减少可以减少或防止剪切诱导的细胞分化。
在下文报告的模拟中使用了直径为17.5mm、高度为5.83mm、空隙直径为2mm和孔径为0.5mm的小规模(以提高计算机模拟速度)圆柱形3D生物反应器。在这种情况下，生物反应器的直径(Φ＝17.5mm)与高度(H＝5.83mm)之比为3:1(图1d)，这是降低生物反应器的入口和出口之间营养物和氧气的梯度的优选比率。基于固定床球形表面上可用的细胞密度，估计氧气和营养物消耗率，并确定需要多久更换一次细胞培养基(即体积流量)。在此模拟中，假定总体线性流速为38.5μm/sec。使用38.5μm/sec速率的层流作为3D生物反应器的输入，CFD结果如图4-6所示。
图4a、4b、4c和4d显示了整个小规模圆柱形3D生物反应器的流速分布。图4e指示流速的标尺。更具体地，图4a指示从生物反应器的侧面看的流速分布。流动沿着流动方向通过孔流经球形空隙。图中的白色/灰色区域是没有流体流动的球形空隙之间的实心区域。通过与图4e中的彩色速度比例尺进行比较，图4a指示沿流动方向的孔处的流速达到200μm/s至240μm/s的最大流速。相反，球形表面附近的流速降低到0.06μm/s到19.0μm/s的最小值，这将显著减少流动引起的对驻留在球形表面上的细胞的剪应力。
图4b指示通过3D结构的中心横截面从生物反应器的顶部观察到的速度分布。再次，该图像显示了最大速率在沿着流动方向的球形空隙的孔的每个中心处。该最大速率再次在200μm/s至240μm/s的范围内。球形表面附近的流速仍然较低，其值为0.06μm/s至19.0μm/s。
图4c指示个体球体空隙的速度分布，其显示了流过径向相互连接的孔的流动。因此，图4c提供了球形空隙内部的流动分布的有用图示。高流速是在没有细胞的空隙的中央空的空间处，并且处于200μm/s至240μm/s的水平。细胞驻留凹入的空隙表面上，在那里流速降低，并且流速再次处于0.06μm/s至19.0μm/s的水平。因此，这种独特的结构可以保护细胞免于暴露于相对较高的流动应力。这是本文描述的3D生物反应器相对于例如基于微载体的反应器的另一个独特优势，在该基于微载体的反应器中，细胞在悬浮在细胞培养基中并在生物反应器中搅拌以将营养物和氧气输送至细胞的具有凸球形表面的直径300μm至400μm的微珠的外表面上生长。驻留在这样的凸球形表面上的细胞可暴露在达到0.1Pa的相对较大的剪应力下，这已知会影响细胞形态、通透性和基因表达。图4d指示沿着流动方向通过侧孔的流动轨迹，表明本文的3D生物反应器自始至终提供相对均匀的流动模式以始终提供营养物和氧气。
因此，在优选的3D生物反应器内计算出的最大线性流速为200μm/s至240μm/s，这发生在沿流动方向在2.0mm直径的空隙之间的0.5mm直径的相互连接的孔处。如图4a-4e所示，虽然流动优先在沿着流动的中心方向上，但在球形表面附近仍然有流动(约19.0μm/sec)，以允许营养物供应到驻留在球形表面上的细胞。因此，考虑了细胞能够驻留在整个结构中的任何地方并在任何位置处繁衍，因为营养物可以通过流动对流和在整个3D生物反应器结构中的扩散而提供。
图5a和5b显示了整个上文所述的圆柱形3D生物反应器以及在单个球形空隙表面上的表面剪应力的分布。图5c指示以Pa为单位的剪应力的标尺。在相互连接的孔的边缘观察到最高的剪应力。这是由于这些位置处的较高流速。但是，生物反应器内的大多数有用球形表面区域指示小于3×10-4Pa的剪应力，这可以理解为生物反应器的90％或更多的表面区域。这提供了细胞增殖，而没有剪切诱导的分化。此外，据信甚至4.0×10-3Pa的最大剪应力也低于在基于中空纤维的生物反应器、波生物反应器和基于微载体的生物反应器中培养时细胞所经历的平均剪应力。因此，考虑了本文的3D生物反应器与现有的细胞扩增生物反应器相比为细胞生长提供相对较低的剪应力环境。参见例如Large-Scale IndustrializedCell Expansion:Producing The Critical Raw Material For BiofabricationProcesses,A.Kumar and B.Starly,Biofabrication 7(4):044103(2015)。
图6a示出了沿着流动方向从上文所述的圆柱形3D生物反应器的底部到顶部的压降。图6b提供了适用的压力标尺。该图指示生物反应器的入口和出口之间的总压降小于或等于1.0Pa。因此，压降可以落在0.1Pa至1.0Pa的范围内。换句话说，生物反应器的入口和出口附近的细胞不会经历明显的压力差。低的压力梯度表明，这种设计还将在生物反应器的入口和出口之间在营养/代谢物浓度中产生小的梯度(或差异)。低梯度归因于生物反应器的设计，使得直径Φ大于高度H，而总生物反应器体积保持不变。这优于中空纤维生物反应器。难以制造具有Φ>H比率的中空纤维生物反应器以减小生物反应器的入口和出口之间的营养/代谢物的梯度。
还对具有不同纵横比(即Φ:H比，Φ：生物反应器固定床的总直径，H：生物反应器固定床的总高度)的相同总体积圆柱形3D生物反应器进行了比较。见图1d。如表1所示，对于相同的体积流量(体积流量＝流动的横截面积×线速度)，具有低Φ:H比的生物反应器的线速度显著增加。线速度的增加还增加了表面剪应力、压降以及入口和出口之间营养/代谢物浓度的梯度，这将对细胞扩增产生不利影响。因此，优选将公开的固定床3D生物反应器设计为Φ:H比率结构，例如Φ:H比率在大于1:1且至多100:1的范围内。优选地，Φ:H比率大于1:1且至多10:1。
表1：具有不同纵横比的3D生物反应器的流速比较
# 比率(Φ:H) 直径(Φ)(cm) 高度(H)(cm) 流速(μm/sec)
1 3:1 10.5 3.5 38.5
2 1:1 7.5 7.5 75.4
3 1:3 5 15 169.8
图7a示出了通过FDM 3D打印产生的3D生物反应器固定床部件，其具有相互连接的6mm直径的空隙和1mm的相互连接的孔。该3D生物反应器使用ABS细丝打印。该特定的3D生物反应器的直径(Φ)和高度(H)分别为4.28厘米和1.43厘米。因此，Φ:H比率为3:1。约134个相互连接的开放空隙包括固定床中。用于细胞培养的总的相互连接的连续球形表面区域SAu为约152cm2。入口和出口处的入口和出口壁以及流体分配器22(图8)为细胞培养提供了额外的88cm2表面区域。换句话说，在3D生物反应器中，有约240cm2的总可用表面区域用于细胞附接。流体分配器可以改善通过生物反应器的层流。如果雷诺数小于2100或在大于0到多至2100(不包括2100)的范围内，则流体分配器是任选的。
图7b显示了3D生物反应器的固定床被溶剂粘合到生物反应器腔室中。这将密封固定床和腔室壁之间的间隙，这将迫使灌注细胞培养基穿过相互连接的孔，而不是穿过那些间隙。优选地，固定床和腔室被打印在一起作为整体部分以提高制造效率。图7c示出了生物反应器的入口和出口。它们的几何形状被设计成促进通过固定床的层流。生物反应器的入口任选地包含内置的旋转齿轮，其可偶联至步进电机以控制生物反应器的旋转以用于均匀的细胞接种(参见下文)。完整的生物反应器在图7d中示出并能够连接到1/8英寸的管道以引导流体流动。可替代地，入口和出口可以被制成用于重复使用，其中仅内部的生物反应器固定床是一次性的。在图7e中还显示了通过DLA 3D打印产生的具有3.0mm空隙和0.5mm孔的相对较小尺寸的3D生物反应器固定床。图7f是使用DLP 3D打印的具有相同的直径3.0mm的空隙和0.5mm孔的相对较大尺寸的3D生物反应器固定床。当扩展生物反应器时，维持生物反应器的内部结构。因此，可以在保持局部线性流速相同的同时按比例扩展灌注体积流量。以此方式，在扩展过程中需要最小的过程更改，这可以减少过程开发成本。
接下来应注意，流体分配器22(图8)优选使得其将改善通过3D生物反应器的流动均匀性。入口、出口和流体分配器的设计还优选考虑以下因素：(1)改善通过3D生物反应器的流动均匀性；(2)最小化入口和出口处的死体积24，以减少生物反应器的总预充容量；和(3)防止在生物反应器内的气泡聚集。图9显示了通过使用流体分配器基于CFD模拟的整个3D生物反应器的流速分布。流体分配器(图8)的使用改善了流动的均匀性。最大流速(大约30μm/s)和最小流速(大约10μm/s)彼此相对接近，并有助于促进均匀的层流(即，流体在相对平行的层中的流动)。生物反应器中各处的相对均匀的流速还将为驻留于生物反应器中不同位置的细胞提供较小的剪应力差。
可以通过其他增材制造技术(例如选择性激光烧结(SLS)、立体光刻(SLA)、数字光处理(DLP)等)来制造3D生物反应器(图7e、7f)。
除了通过增材制造或3D打印制备3D生物反应器之外，考虑了可以通过传统的成孔剂浸出法制备3D生物反应器以提供相互连接的细胞培养表面。图10a和10b显示了利用成孔剂浸出方法的3D生物反应器。这是指将成孔剂和聚合物在模具中混合，然后从成孔剂浸出以产生孔。图10a中的3D生物反应器开始于通过摇动、敲击和挤压珠子将4.0mm水溶性球形糖珠(作为成孔剂)紧密地填充在圆柱形不锈钢模具中的步骤，从而使珠子处于接触状态。珠子之间的间隙填充有含5.0重量％去离子水的丙酮。随后在真空室中将丙酮和水蒸发过夜。然后在珠粒之间的间隙中填充低粘度的可聚合乙烯基单体(例如苯乙烯)以及聚合引发剂(例如苯甲酰基或叔丁基过氧苯甲酸酯)。然后，苯乙烯单体将聚合以形成聚苯乙烯。样品在90℃下保持8-12小时，然后加热到115℃持续另外3小时，并从烤箱中取出以提供图10a中所示的内容。然后将糖珠浸出，同时浸入超声水浴中，以留下具有互连空隙的聚苯乙烯3D生物反应器固定床。见图10b。然后将3D生物反应器用甲醇萃取三天，以去除任何残留的苯乙烯单体。但是，成孔剂浸出方法不仅具有复杂的制造工艺，而且由于成孔剂珠子的填充是随机的过程而难以获得精确的可再现结构。
对于使用ABS或PMMA的3D打印的生物反应器(图7d)，优选对生物反应器的疏水内表面进行修饰以允许细胞粘附。聚多巴胺被用作生物反应器表面的底漆涂层，因此其他蛋白质可以通过聚多巴胺涂层容易地粘附到生物反应器表面。因此，可以注意到，聚多巴胺底漆涂层可与其他涂层(例如肽、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、多种细胞胞外基质蛋白或特定细胞类型所需的选定抗体)组合。
将生物反应器表面在溶于10mM Tris缓冲液(在25℃，pH＝8.5)中的0.25mg/mL多巴胺中孵育约18小时，导致用于后续的蛋白涂覆的有效的聚多巴胺层。在聚多巴胺沉积在生物反应器表面后，其他蛋白质可以随后通过迈克尔加成和/或席夫碱反应与功能性配体结合。因此，配体分子包括亲核官能团，例如胺和硫醇官能团。
还可以理解的是，当本文的生物反应器用取代或未取代的聚(对二甲苯)涂覆时，聚多巴胺可以类似地施加在取代或未取代的聚(对二甲苯)涂层上以类似地允许细胞粘附。同样，聚多巴胺然后可以提供涂层表面，使得其他蛋白质可以通过在聚(对二甲苯)涂层上的聚多巴胺涂层粘附。再次考虑了这样的结合依赖于通过经由迈克尔加成和/或席夫碱反应的功能性配体的蛋白质结合，并且配体分子可以再次包括亲核官能团，例如胺和硫醇官能团。因此，可以更一般地理解的是，聚多巴胺涂层使得其能够通过使用官能化的配体结合用于细胞培养的额外的一层或多层。
从以上所有内容现在应当理解，本文公开的3D生物反应器的另外一个特征是，现在可以设计具有特定几何和空隙体积要求以及相应的可用表面区域要求的3D生物反应器，并且能够以相对最小的变化来实现(即在制造或制作期间)这样的目标。例如，现在可以鉴定对于3D生物反应器的设计要求，其中一个或多个内部空隙要具有目标空隙体积“Vt”，而3D生物反应器本身要具有用于细胞培养的目标总体表面积“SAt”。因此，现在可以形成这样的3D生物反应器，其中一个或多个内部空隙具有实际空隙体积“Va”，其在Vt的+/-10.0％之内，或更优选地在Vt的+/-5.0％之内。类似地，用于细胞培养的实际表面积SAa在SAt的+/-10.0％之内，或更优选在SAt的+/-5.0％之内。此外，还可以对目标空隙内的内表面鉴定用于制造的目标几何形状，例如目标曲率半径“Rct”，和然后在制造中现在可以实现空隙内表面的实际曲率半径“Rca”在Rct的+/-5％之内。
打印后工艺
现在优选使本文的3D生物反应器经历另外的打印后程序。这样的程序旨在提供减少或防止任何在其他方面可能已用于3D生物反应器打印的残留单体和/或光引发剂浸出的能力。当增材制造程序涉及牵涉液态树脂的固化(聚合)的立体光刻(SLA)或数字光处理(DLP)时，情况尤其如此。因此，注意力转向图18，其总结了优选的打印后方案。如所示的，通过最初依赖于光聚合(光诱导的聚合)的增材制造产生的3D生物反应器现在优选进行后固化，优选通过额外暴露于UV光。考虑了这样的额外暴露于UV光增加打印期间的潜在聚合和/或降低相对低分子量材料例如未聚合的单体材料的水平。另外，现在可以在这样的后固化之后进行热和/或真空的处理，以进一步减少或去除这样的相对低分子量的材料。例如，可以在从环境温度到125℃的温度下，施加10-3Torr或更低的真空度。因此，考虑了通过单独或与真空和/或加热结合使用后固化，可以将相对低MW的材料(小于或等于500的MW)的水平降低至小于或等于2.0重量％，优选0.01重量％至1.50重量％，甚至更优选为0.01重量％至0.75重量％。
另外，考虑了对于本文中产生的任何给定的生物反应器，现在可以优选对其进行涂覆程序以类似地减少和/或消除在其他方面对活细胞有毒的上文所述的相对低分子量化合物的浸出。这样的涂层也可以被选择性地官能化以促进贴壁细胞的附接和生长。优选地，涂覆程序依赖于使用聚(对二甲苯)单体，例如[2.2]对环芳烷，其可以根据以下一般反应方案用鉴定的R1、R2、R3和R4基团官能化，其中所示的聚合反应通过在真空下暴露于高温(约550℃)来促进以提供取代或未取代的聚(对亚二甲苯基)聚合物结构。应当理解，在下面的方案中，通过在气相中在升高的温度下的开环起始聚合反应的开始，然后在优选保持在相对较低的温度(例如，<100℃)下的3D生物反应器上沉积：
Figure BDA0003043476880000201
在以上方案中，当每个重复单元“m”和/或重复单元“n”的R基团之一为氯和另一个R基团为氢时，以上方案表示聚对二甲苯C的聚合。这是USP类VI和ISO-10993-6认证的生物相容性材料。所鉴定的重复单元的“m”和“n”的值使得分子量值相对较高，例如约500,000。因此，考虑了聚对二甲苯单体和随后的聚合物涂层的使用使得现在可以用不可渗透的膜涂覆整个3D生物反应器。膜的厚度可以优选为200埃至100.0μm。可以理解，R1、R2、R3和R4可以选自氢、卤素(-Cl或-Br)以及其他官能团，例如胺(-NH2)、脂族醛(-CHO)、羧酸官能团(-COOH)、羟基(-OH)或羧酸酯官能团，如在-C(O)CF3中的。还可以首先用第一层聚对二甲苯C然后用不同聚对二甲苯的涂层涂覆，例如，其中R1、R2、R3和R4然后可以选自胺(-NH2)和/或醛(-CHO)官能团。因此，可以提供用于本文的3D生物反应器的聚合物涂层，其中该涂层包括多个层，每个层具有其自己的特定和不同的化学组成(即R1、R2、R3和R4中至少一个的身份在至少两个层之间是不同的)。
进一步考虑了具有醛的官能化涂层的3D生物反应器可以经历与例如具有末端柔性系链的抗体蛋白(例如抗CD3/28)的反应，该末端柔性系链具有不同长度的寡环氧乙烷(OEG)的氨基末端(或其他有机端基)。换句话说，使用包含官能性端基(例如胺基)的聚(环氧乙烷)型系链，如下所示：
Figure BDA0003043476880000211
其中n的值可以在1-200的范围内，然后可以如下将其结合至3D生物反应器上的官能化聚对二甲苯涂层，其中示出了一个结合反应位点，并且应当理解，多个结合反应可以取决于反应参数的调节(例如增加结合反应产率的温度和时间)而发生：
Figure BDA0003043476880000212
因此，可以理解的是，在上文中，可以改变细胞刺激蛋白的表面迁移率以使得能够与靶向的细胞表面受体更好地结合，并使非特异性蛋白或其他大分子从细胞培养基的物理吸附最小化。
在另一个考虑的实施方案中，可以将具有末端官能化的系链的生物素在第一步骤中结合至官能化的聚对二甲苯涂层。在第二步骤中，可以将生物素端基与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白复合。然后在第三步骤中，将生物素-链霉抗生物素蛋白复合物结合到生物素官能化的刺激性抗体，以完成适合于细胞刺激的官能性表面。
本发明进一步涉及使用上文参考的本文的3D生物反应器以提供如用于免疫治疗目的的T细胞扩增。参考图11，其示出了将抗体固定在生物反应器的球形空隙体积表面上以用于结合和活化T细胞。更具体地，对于3D生物反应器，现在可以通过生物素-抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白结合机制将抗体(生物素缀合的球形蛋白)例如抗CD3和抗CD28抗体固定在生物反应器表面。如上所讨论的，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白通过底漆聚多巴胺涂层预先涂覆在生物反应器表面上。更具体地，在将聚多巴胺涂层施加至本文的3D生物反应器的表面(如已经指出的那样可以包括聚(对二甲苯)涂层)之后，可以附接四聚体蛋白(具有四个亚基的四级结构的蛋白)，例如对生物素具有亲和力的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。因此，可以理解的是，聚多巴胺涂层提供了使生物反应器表面相对更亲水和附接蛋白质和抗体的能力，而相比之下，聚(对二甲苯)涂层用于阻止单体浸出并减少或避免细胞毒性。因此，可以依靠具有四级结构的蛋白质(抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)来将生物素化的抗体例如抗CD3抗体固定在生物反应器表面上。生物素化的抗体是指生物素与抗体的共价附接。当T细胞流过生物反应器时，它们将经由T细胞表面受体(例如CD3)、经由CD3、抗CD3抗体结合而结合并活化。然后，将活化的T细胞暴露于含有信号传导分子的灌注培养基，以提供T细胞扩增。信号传导分子可优选包括细胞因子信号传导分子，例如白介素-2(IL-2)。然而，应注意的是，在本发明的广泛范围内，考虑了可以排除使用聚多巴胺涂层的需要，并将抗体(例如抗CD3抗体)直接固定在3D反应器中的表面上，将抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白直接固定在生物反应器表面上以结合生物素化的抗体。
使用本文的3D生物反应器，现在用于T细胞扩增的基于闭环灌注的系统是有可能的，如图12所示。更具体地，图12示出了用于T细胞活化和扩增的无珠子的基于闭环灌注的3D生物反应器。灌注系统优选地包含细胞安全的蠕动泵和培养基/细胞贮存器，其能够添加培养基以稀释细胞密度以用于更有效的细胞扩增或交换培养基以在扩增过程中维持营养物浓度。培养基贮存器也可以用作具有气体灌注和搅拌或摇动机制的氧合器以混合营养物和氧气。通过3D生物反应器灌注的培养基中的悬浮T细胞有很多机会与球形表面上的CD3和CD28抗体接触并因此被活化。经预计，在大表面上固定的CD3和CD28为T细胞提供与在当前的T细胞扩增系统中使用的磁珠相同的刺激作用。在没有磁珠的情况下，该过程将得到显著简化。此外，该闭环系统还有助于自动化和经济高效的cGMP细胞制造。
表2列出了三种不同大小的生物反应器的尺寸、培养表面区域面积、具有相等总表面区域面积的磁珠的数量、预计的培养基体积等。PMMA是FDA批准的可植入生物相容性材料，其用于通过使用DLP3D打印机来制造生物反应器。表2还列出了构建所鉴定的3D生物反应器的大致材料成本。
表2：使用SLA/DLP 3D打印制造不同大小的3D生物反应器的尺寸和成本
PBMC接种能力 2.5×10<sup>7α</sup> 2.2×10<sup>8</sup> 2.2×10<sup>9</sup>
生物反应器直径(cm) 2.1 4.2 9.0
生物反应器高度(cm) 0.7 1.4 3.0
表面区域面积(cm<sup>2</sup>) 29 250 2500
面积相当的珠子的数量 7.5×10<sup>7</sup> 6.5×10<sup>8</sup> 6.5×10<sup>9</sup>
培养基体积(mL) 2 14 136
构建材料体积(mL) 0.78 5.4 53.6
材料成本<sup>β</sup> $0.20 $1.34 $13.4
α基于3:1的珠子:细胞比率
β仅基质，不包括生物反应器的入口和出口；还假设直径3mm的空心球和0.5mm的孔径
生物反应器表面上抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)的涂覆
为了模拟Miltenyi MACSiBead系统，采用了抗生物素蛋白(链霉抗生物素蛋白)和生物素结合机制将抗CD2、CD3和CD28抗体固定在聚多巴胺涂覆的生物反应器表面上。首先，测试了不同浓度的荧光标记的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白(图13)，并且发现100μg/mL的抗生物素蛋白或30μg/mL的链霉抗生物素蛋白在生物反应器表面上实现了相对高的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白涂覆密度。图13显示了在不同浓度下抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白涂层的荧光强度。荧光标记的抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白用于测试可结合到聚多巴胺底漆涂层上的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的浓度。抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白涂覆的优选方法描述如下。抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的涂覆浓度可以进一步优化：
1)首先在本文中通过聚多巴胺涂覆生物反应器表面。
2)将抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白溶解在TRIS缓冲液(pH 8.5)中以制备涂覆溶液，其中抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的浓度分别为100μg/mL或30μg/mL。将生物反应器浸入涂覆溶液中持续12小时，同时在黑暗中轻轻摇动。
3)用磷酸缓冲盐水(PBS)彻底清洗支架。然后将支架留在PBS中，准备好用于用生物素化抗体涂覆。
然后针对不同浓度的第二层涂层的荧光标的记生物素，进行了与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白基础层的结合的比较(图14)。鉴定出1.0μg/mL的生物素成功结合至固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。参见图14，其鉴定了抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白上生物素涂层的荧光强度(与生物素浓度成比例)。在确认生物素可以成功结合至涂有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的生物反应器表面后，将生物素化的抗CD2、CD3和CD 28抗体应用于该生物反应器以用于T细胞活化和扩增。
为了优选将抗体涂层施加在直径为2.1厘米的支架(即相当于约7.5×107个珠子的总表面)上：
1)从BPS取下生物反应器支架
2)尽可能多地从支架上除去PBS，但不要让支架干燥。
3)在15mL试管中合并200μL的100μg/mL CD2-生物素、200μL的100μg/mL CD2-生物素和200μL的100μg/mL CD28-生物素，加入1.4mL抗体标记缓冲液(不含Ca2+和Mg2+的PBS，pH＝7.2加0.5％热灭活的胎牛血清和2mM EDTA)，并充分混合以制成总共2mL的生物素化抗体，每种抗体的浓度为10μg/mL。
4)在12孔板中加入2mL混合抗体以覆盖生物反应器基质(没有入口和出口，图7e)，上下吹吸以混合。
5)在2℃至8℃的温度下在轻轻摇动的情况下，在冰箱中于黑暗中于基质中孵育2小时。
6)用PBS洗涤从支架彻底除去未结合的抗体。
可以扩展使用聚多巴胺、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白和生物素化抗体的涂覆程序，以涂覆完整生物反应器(即生物反应器基质加上入口和出口)的内表面。
使用抗体涂覆的生物反应器基质和磁珠孵育的T细胞的针对T细胞扩增的比较
将抗体涂覆的基质(无入口和出口)与Miltenyi MACSiBeadTM系统进行比较。根据制造商的方案(其类似于上面描述的涂覆程序)，将磁珠(已用链霉抗生物素蛋白涂覆)用生物素化的抗CD2、CD3和CD28抗体涂覆。使用表1中列出的相对小的2.1cm直径×0.7cm高的生物反应器(图7e)。生物反应器基质适合放置在12孔板的孔中，因此可以容易地比较珠子和基质的性能。首先使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白涂覆三种生物反应器基质，然后使用上文所述的优选程序使用生物素化的CD2、CD3、CD28抗体涂覆。使用相同浓度的抗体涂覆生物反应器基质和MACSiBeads。一种具有链霉抗生物素蛋白涂层的生物反应器基质未进一步用抗体涂覆(阴性对照)
首先根据制造商的方案使用MACSiBeads活化并扩增(7天)人外周血CD3+Pan T细胞(ReachBio Research Labs)，然后将其从磁性颗粒移除。然后将4.5×106个T细胞分别添加到12孔板的四个孔中。各自填充有3mL培养基(补充有10％胎牛血清和20IU/mL人IL2的RPMI 1640)的四个孔分别包含1)7.5×106个抗体涂覆的磁珠、2)抗体涂覆的链霉抗生物素蛋白-基质、3)抗体涂覆的抗生物素蛋白基质和4)没有抗体涂层的链霉抗生物素蛋白基质。在第3天将另外的培养基添加到孔中。在第5天，将细胞分到具有另外的珠子和基质的两个孔中。在第3、5和7天计数从磁珠或基质解离后每个孔中的T细胞的数量。
图15显示了与没有抗体涂层的基质相比，使用抗体涂覆的磁珠和基质孵育的T细胞生长(活化后)。抗体涂覆的基质中T细胞生长的趋势与抗体涂覆的珠子的趋势相似。但是，使用没有抗体的基质孵育的T细胞不增殖，这可能是由于缺乏持续的刺激。在此实验中，将基质在静态条件下置于孔中。因此，经预计，这些结果与基于灌注的生物反应器不同。此实验清楚地表明，抗体已成功地涂覆在生物反应器的基质表面上，并且它们促进了T细胞生长。
使用抗体涂覆的生物反应器基质和磁珠孵育的外周血单核细胞
(PBMC)的针对T细胞活化和扩增的比较
用PBMC代替分离的T细胞进行了与上文所述的相似的研究。通常，从患者收集包括T细胞和其他单核细胞(例如B细胞、NK细胞、单核细胞)的PBMC，并将其直接用于细胞扩增而无需T细胞分离。这是因为非T细胞不会被CD2、CD3和CD28活化，并且在没有活化的情况下在几天后它们会被天然消除。此实验与图15中的实验的另一个不同之处是当使用抗体涂覆的基质时细胞因子活化步骤的并入。简要地，将2mL的含有2.5×106个细胞/mL的密度的PBMC的培养基添加至12孔板的三个孔中。这三个孔分别含有1)2.5×106个抗体涂覆的磁珠，2)抗体涂覆的链霉抗生物素蛋白基质和3)没有抗体涂层的链霉抗生物素蛋白基质。在此实验中未使用抗生物素蛋白涂覆的基质，因为在最后两个实验中链霉抗生物素蛋白显示出优于抗生物素蛋白的效果。将PBMC在每个孔中孵育两天以用于活化。然后将含有IL2细胞因子的另外的培养基添加到孔中，使得培养基具有20IU/mL的人IL2以开始扩增阶段。在5天的培养过程中总细胞数的变化在图16中示出。这证实了与抗体涂覆的磁珠相比，用抗体涂覆的基质扩增的T细胞导致更多的T细胞。这也证实了抗体涂覆的基质可以提供同等或更好的T细胞活化和扩增。
基于动态灌注的T细胞扩增
如本文所述制造基于灌注的3D生物反应器。3D生物反应器的内表面是通过用聚多巴胺涂覆12小时来制备的。然后用链霉抗生物素蛋白涂覆生物反应器内表面12小时。然后将生物反应器与70％乙醇孵育以灭菌。灭菌后，将内表面用PBS洗涤，并用CD2、CD3和CD28-生物素缀合物的均等混合物(每种抗体的浓度为10μg/mL)涂覆以使用上文所述的程序将抗体固定在生物反应器的内表面上。
如图12所示设置灌注回路。将具有Cytoflow泵头的Masterflex L/S(Cole-Parmer)(其被设计用于泵送活细胞和对剪切敏感的流体)用于灌注系统。因为此应用使用相对较小的生物反应器并且经预计灌注速度相对较低，所以采用使用气体扩散到培养基和培养基液滴中的定制的氧化装置取代氧合器。
将约20×106个PBMC接种到预填充的生物反应器灌注系统中。通过以2mL/min循环15分钟使细胞均匀分布。在活化阶段(不含细胞因子IL2启动子的灌注培养基)中，在第1天以0.1mL/min和在第2天以0.14mL/min的速率灌注T细胞。活化两天后，测定细胞密度，并将含有人IL-2细胞因子的培养基添加到系统中，使得总IL-2浓度为20IU/mL。T细胞扩增阶段以0.2mL/min的灌注速率进行3天。在第5天确定细胞密度，结果示于图17中。类似于图15和16中所示的静态实验，T细胞在活化/促进后实现了三倍的扩增。
聚对二甲苯C涂覆的3D生物反应器的臭氧/UV表面处理
如上文所述，聚对二甲苯涂层可以被官能化。举例来说，在本文的聚对二甲苯C涂覆的生物反应器的情况下，将其用紫外线/臭氧系统处理，这被考虑用来提供羟基、羰基和羧酸酯表面基团。更具体地，将3D生物反应器放置在一侧上具有UV透明玻璃的密闭室中。将UV灯(254nm)放置在玻璃上方距离约1.75”的地方，以在臭氧暴露期间同时施加3.2mW/cm2的暴露通量。密闭室的入口通过PTFE管道连接到VMUS-4臭氧发生器(Azco Industries)，并且密闭室的出口连接到填充有矿物油的玻璃瓶，所有这些都在通风橱内。臭氧发生器设定为2L/min的空气入口流速。将输出设置为100％的效率，以每小时输送约2.5g的臭氧。将聚对二甲苯C涂覆的生物反应器分别进行1、2、5、10和15分钟的臭氧处理。如从下表3可以看出的，将聚对二甲苯C表面处理10分钟使得该表面与经聚多巴胺/纤连蛋白(PD/FB)处理的表面一样亲水。参见美国专利申请号15/585,812，其教导内容通过引用并入本文。
表3.涂覆程序对水接触角的影响
表面处理 水接触角
聚对二甲苯C涂覆的生物反应器 73.7±9.5
聚多巴胺/纤连蛋白 44.0±9.5
臭氧/UV 1min 64.7±6.0
臭氧/UV 2min 53.0±5.0
臭氧/UV 5min 51.0±3.5
臭氧/UV 10min 41.7±3.1
臭氧/UV 15min 34.7±4.0
图19显示了UV/臭氧处理生物反应器上的聚对二甲苯C涂层5分钟对于先前已经接种在生物反应器上的粘附的间充质干细胞(MSC)的细胞增殖是最佳的。使用MTT测定的荧光强度增加是细胞数量增加的结果。在此暴露下的细胞增殖甚至超过了聚多巴胺和纤连蛋白涂覆的生物反应器在4天和7天所达到的增殖。这表明相对较复杂的PD/FB处理是不必要的。图20显示了人衍生的脂肪干细胞(hADSC)的细胞扩增。图21显示了相应的荧光显微镜图像，其显示了3D生物反应器中ADSC细胞的数量随时间的变化而增加。
灭菌和包装
本文考虑了代替本文的3D生物反应器(其现在可包含聚对二甲苯薄膜型涂层)的伽马射线灭菌，在非粘附性T细胞扩增的情况下，灭菌可依赖于在抗体表面固定之前灌注的二氧化氯(ClO2)气体。考虑了ClO2气体不与官能化的聚对二甲苯薄膜涂层(即-Cl、-CHO、-COOH、-NH2或-C(O)CF3)或下面的3D生物反应器聚合物基底反应。
例如，现在可以将3D生物反应器密封在聚合物膜中，然后可以将其放置在二氧化氯气氛中以用于灭菌目的。随后，将这种灭菌的3D生物反应器暴露于流动气流中，以释放任何残留的二氧化氯气体。其他灭菌方法包括蒸汽、臭氧、过氧化氢、二氧化硫和/或环氧乙烷灭菌。

Claims (22)

1.一种用于细胞生长的3D生物反应器，其包含
具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D＞d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定空隙体积(V)；和(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；
其中所述生物反应器具有取代或未取代的聚(对二甲苯)的涂层。
2.权利要求1的3D生物反应器，其中所述生物反应器包含0.01重量％至0.25重量％的具有小于或等于500的MW的材料。
3.权利要求1的3D生物反应器，其中所述聚(对二甲苯)具有以下结构：
Figure FDA0003043476870000011
其中R1、R2、R3和R4选自氢、卤素、胺(-NH2)、脂族醛(-CHO)、羧酸官能团(-COOH)、羟基(-OH)或包括-C(O)CF3的羧酸酯官能团。
4.权利要求1的3D生物反应器，其中所述涂层具有200埃至100.0μm的厚度。
5.权利要求1的3D生物反应器，其中所述聚(对二甲苯)涂层包含具有不同化学组成的多个涂层。
6.权利要求1的3D生物反应器，其中将聚多巴胺施加到所述聚(对二甲苯)涂层，其中所述聚多巴胺能够结合额外的一层或多层用于细胞培养。
7.权利要求3的3D生物反应器，其中所述取代的聚(对二甲苯)涂层与包含末端取代的抗体蛋白的聚(环氧乙烷)键合。
8.权利要求3的3D生物反应器，其中R1、R2、R3和R4中的至少一个选自醛(-CHO)，并且所述3D生物反应器通过具有以下结构的键联与具有末端取代的抗体蛋白的聚(环氧乙烷)键合：-CH＝N-。
9.权利要求6的3D生物反应器，还包含附接至所述聚多巴胺涂层的细胞外基质蛋白。
10.权利要求6的3D生物反应器，还包含附接至所述聚多巴胺涂层的四聚体蛋白。
11.权利要求10的3D生物反应器，还包含固定在所述四聚体蛋白上的生物素化抗体。
12.权利要求10的3D生物反应器，其中所述四聚体蛋白包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。
13.权利要求11的3D生物反应器，其中所述生物素化抗体包括抗CD-3抗体。
14.权利要求11的3D生物反应器，其中所述生物素化抗体包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。
15.权利要求11的3D生物反应器，其中所述生物素化抗体包括抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗CD2抗体。
16.一种形成3D生物反应器的方法，包括：
通过增材制造形成所述3D生物反应器，其中所述3D生物反应器包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D＞d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定空隙体积(V)；和(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；和
用取代或未取代的聚(对二甲苯)涂覆所述生物反应器。
17.权利要求16的方法，其中所述增材制造包括立体光刻(SLA)或数字光处理(DLP)。
18.权利要求17的方法，其中在用取代或未取代的聚(对二甲苯)涂覆之前，将所述生物反应器暴露于UV光。
19.权利要求17的方法，其中在用取代或未取代的聚(对二甲苯)涂覆之前，将所述生物反应器暴露于真空。
20.权利要求17的方法，其中在用取代或未取代的聚(对二甲苯)涂覆之前，将所述生物反应器暴露于加热。
21.如权利要求16的方法，其中将所述取代或未取代的聚(对二甲苯)涂层暴露于紫外光和臭氧。
22.一种用于细胞生长的3D生物反应器，其包含
具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D＞d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定空隙体积(V)；和(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；
其中所述生物反应器包含以下单体的聚合产物：
Figure FDA0003043476870000041
其中X和Y包括通过自由基聚合反应聚合的可聚合基团，R2是具有大于R1和R3的体积的大体积有机基团，其中R2适应于提供足够的空间位阻以在室温下实现向列状态。
CN201980071515.1A 2018-09-24 2019-09-24 三维生物反应器 Pending CN112955532A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862735531P 2018-09-24 2018-09-24
US62/735,531 2018-09-24
PCT/US2019/052713 WO2020068840A1 (en) 2018-09-24 2019-09-24 Three-dimensional bioreactors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112955532A true CN112955532A (zh) 2021-06-11

Family

ID=69952352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980071515.1A Pending CN112955532A (zh) 2018-09-24 2019-09-24 三维生物反应器

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11447731B2 (zh)
EP (1) EP3856888A4 (zh)
JP (1) JP7376576B2 (zh)
KR (1) KR20210064299A (zh)
CN (1) CN112955532A (zh)
AU (1) AU2019346419B2 (zh)
CA (1) CA3113690A1 (zh)
SG (1) SG11202102986XA (zh)
WO (1) WO2020068840A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690604A (zh) * 2020-06-24 2020-09-22 杭州原生生物科技有限公司 一种msc体外扩增方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017192717A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Southwest Research Institute Three-dimensional bioreactor for cell expansion and related applications
US11149244B2 (en) 2018-04-04 2021-10-19 Southwest Research Institute Three-dimensional bioreactor for T-cell activation and expansion for immunotherapy
EP3856888A4 (en) 2018-09-24 2022-10-12 Southwest Research Institute THREE-DIMENSIONAL BIOREACTORS
US11492580B2 (en) 2020-05-12 2022-11-08 Southwest Research Institute Method using a three-dimensional bioprocessor
ES2932808B2 (es) * 2021-07-20 2023-06-01 Univ Cadiz Dispositivo de flotacion para la regeneracion artificial del velo de flor
WO2024044348A1 (en) * 2022-08-26 2024-02-29 Chunguang Xia System and method for perfusion bioreactor for 3d cell culture
US20240076597A1 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Terumo Bct, Inc. Methods for cell expansion, differentiation, and/or harvesting of natural killer cells using hollow-fiber membranes

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994003496A1 (en) * 1992-07-30 1994-02-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Biomaterials and biosensors containing immobilized modified antibodies
US20030055280A1 (en) * 2001-01-23 2003-03-20 Wellinghoff Stephen T. Methods for synthesis of liquid crystals
US20170037368A1 (en) * 2014-04-16 2017-02-09 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells
US20170321178A1 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 Southwest Research Institute Three-dimensional bioreactor for cell expansion and related applications
WO2017204235A1 (ja) * 2016-05-24 2017-11-30 日本電信電話株式会社 微小粒子を内包する三次元薄膜構造体およびその製造方法
US20180016533A1 (en) * 2016-07-12 2018-01-18 California Institute Of Technology Substrates for high-density cell growth and metabolite exchange
EP3351656A1 (en) * 2017-01-18 2018-07-25 May-Hwa Enterprise Corporation Three - dimensional porous structure of parylene

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4247434A (en) 1978-12-29 1981-01-27 Lovelace Alan M Administrator Process for preparation of large-particle-size monodisperse
US5266480A (en) 1986-04-18 1993-11-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional skin culture system
US5707739A (en) 1995-06-05 1998-01-13 Southwest Research Institute Powdered biocidal compositions
US5360609A (en) 1993-02-12 1994-11-01 Southwest Research Institute Chlorine dioxide generating polymer packaging films
US5705092A (en) 1995-06-05 1998-01-06 Southwest Research Institute Multilayered biocidal film compositions
US5668185A (en) 1993-02-12 1997-09-16 Southwest Research Institute Method of making an amine containing biocidal composition
US5639295A (en) 1995-06-05 1997-06-17 Southwest Research Institute Method of making a composition containing a stable chlorite source
US5650446A (en) 1993-02-12 1997-07-22 Southwest Research Institute Sustained release biocidal composition
US6046243A (en) 1993-02-12 2000-04-04 Bernard Technologies, Inc. Compositions for sustained release of a gas
US5631300A (en) 1993-02-12 1997-05-20 Southwest Research Institute Method of making a sustained release biocidal composition
US5914120A (en) 1995-06-05 1999-06-22 Southwest Research Institute Amine-containing biocidal compositions containing a stabilized chlorite source
AU713284B2 (en) 1995-06-12 1999-11-25 Bernard Technologies, Inc. Sustained release, transparent biocidal compositions
WO1998050522A1 (en) 1997-05-07 1998-11-12 Baxter International Inc. Method and apparatus for high volume production of viral particles
US5888528A (en) 1997-05-19 1999-03-30 Bernard Technologies, Inc. Sustained release biocidal powders
US6605304B1 (en) 1998-02-09 2003-08-12 Bernard Technologies, Inc. Silicate-containing powders providing controlled, sustained gas release
US6277408B1 (en) 1998-02-09 2001-08-21 Southwest Research Institute Silicate-containing powders providing controlled, sustained gas release
US7273567B1 (en) 1999-11-24 2007-09-25 Microactive Corp. Energy-activated compositions for controlled sustained release of a gas
US20030119185A1 (en) 2000-02-24 2003-06-26 Xcyte Therapies, Inc. Activation and expansion of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
FR2810552B1 (fr) 2000-06-26 2004-11-19 Univ Paris Curie Polymere biocompatible a structure tridimensionnelle a cellules communicantes, procede de preparation et application en medecine et en chirurgie
US7147800B2 (en) 2001-01-23 2006-12-12 Southwest Research Institute Selective ether cleavage synthesis of liquid crystals
JP4223394B2 (ja) 2001-07-09 2009-02-12 サウスウェスト リサーチ インスティテュート 新規メソゲン及びそれらの合成及び使用
GB0129008D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Univ London Method for forming matrices of hardened material
AU2002950340A0 (en) 2002-07-23 2002-09-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Biodegradable polyurethane/urea compositions
US8007823B2 (en) 2003-04-03 2011-08-30 Corporation De L'ecole Polytechnique De Montreal Microporous articles comprising biodegradable medical polymers, method of preparation thereof and method of use thereof
CN103173354B (zh) 2003-10-08 2017-07-14 威尔森沃尔夫制造公司 利用透气性材料进行细胞培养的方法及装置
US20110039690A1 (en) 2004-02-02 2011-02-17 Nanosys, Inc. Porous substrates, articles, systems and compositions comprising nanofibers and methods of their use and production
US7592431B2 (en) 2004-02-26 2009-09-22 Immunovative Therapies, Ltd. Biodegradable T-cell Activation device
EP3067415A1 (en) 2004-02-26 2016-09-14 Immunovative Therapies, Ltd. Methods for preparing t-cells for cell therapy
US8900610B2 (en) 2004-08-30 2014-12-02 Southwest Research Institute Biocidal fibrous and film materials comprising silver and chlorite ions
US9364579B2 (en) 2004-08-30 2016-06-14 Southwest Research Institute Biocidal fibrous and film materials utilizing silver ion
EP2796544B1 (en) 2005-09-09 2019-04-03 Duke University Tissue engineering methods and compositions
US20070178586A1 (en) 2005-11-09 2007-08-02 The Ohio State University Research Foundation Methods and apparatuses for growing cells
US20090041825A1 (en) * 2006-02-10 2009-02-12 Kotov Nicholas A Cell culture well-plates having inverted colloidal crystal scaffolds
US20100273667A1 (en) 2006-02-10 2010-10-28 The Regents Of The University Of Michigan Cell culture well-plates having inverted colloidal crystal scaffolds
WO2008049108A1 (en) 2006-10-19 2008-04-24 Northwestern University Surface-independent, surface-modifying, multifunctional coatings and applications thereof
CN201193228Y (zh) 2007-02-13 2009-02-11 刘青 三维细胞培养插入件、其制造设备及成套用具
US8399047B2 (en) 2007-03-22 2013-03-19 The Regents Of The Univeristy Of Michigan Multifunctional CVD coatings
WO2008140295A1 (en) 2007-05-16 2008-11-20 Erasmus University Medical Center Rotterdam Cell culture substrate, culture flasks and methods for cell cultivation employing said substrate
US8463418B2 (en) 2007-08-22 2013-06-11 3D Biotek, Llc Methods and apparatus for fabricating porous 3-dimensional cell culture construct for cell culture and other biomedical applications
DE102009022354B4 (de) 2009-05-15 2015-05-07 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Bioreaktorsystem
EP2260937A1 (en) 2009-06-12 2010-12-15 DSM IP Assets B.V. Device for processing and conditioning of material transported through the device
DE102009038019B4 (de) 2009-08-12 2011-11-17 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. 3D Mikro-Strukturierung zur Erzeugung von Misch- und Kanalstrukturen in Multilayertechnologie zur Verwendung in oder zum Aufbau von Reaktoren
US9273283B2 (en) 2009-10-29 2016-03-01 The Trustees Of Dartmouth College Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor
KR20120111733A (ko) 2009-12-17 2012-10-10 퀸즈 유니버시티 엣 킹스턴 탈세포화된 지방 조직
ES2725549T3 (es) * 2010-07-12 2019-09-24 Univ Southern California Sustrato biocompatible para facilitar las interconexiones entre células madre y tejidos diana y métodos para implantarlo
GB201019932D0 (en) 2010-11-24 2011-01-05 Imp Innovations Ltd Dimensional hollow fibre bioreactor systems for the maintenance, expansion, differentiation and harvesting of human stem cells and their progeny
JP6182135B2 (ja) 2011-06-06 2017-08-16 レゲネシス ベーフェーベーアー 中空繊維バイオリアクター中での幹細胞の増幅
US9456893B2 (en) 2011-07-29 2016-10-04 Southwest Research Institute Engineered tissue implants and methods of use thereof
US20130084622A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Massachusetts Institute Of Technology Device and method for continuous cell culture and other reactions
SG11201406622UA (en) 2012-04-20 2014-11-27 Agency Science Tech & Res An in vitro method for culturing stem cells
KR101400888B1 (ko) 2012-05-30 2014-05-29 한국과학기술원 플라즈마 처리된 바이오폴리머를 이용한 세포 흡착을 조절하는 표면 제조방법
ES2529501T3 (es) 2012-09-06 2015-02-20 Pluristem Ltd. Dispositivos y métodos para el cultivo de células
GB2515751A (en) 2013-07-01 2015-01-07 Tap Biosystems Phc Ltd Bioreactor consumable units
EP3063218A4 (en) 2013-08-22 2017-07-26 Polyvalor, Limited Partnership Porous gels and methods for their preparation
WO2015086029A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Aarhus Universitet Injectable hierarchical scaffolds
KR20220119176A (ko) 2014-02-04 2022-08-26 카이트 파마 인코포레이티드 B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법
WO2015131143A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Florida State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for expansion of stem cells
WO2015160753A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Salve Regina University Electrochemical detection systems and methods using modified coated multi-labeled magnetic beads with polymer brushes
KR20160145162A (ko) 2014-04-24 2016-12-19 밀테니 비오텍 게앰베하 유전적으로 변형된 t 세포의 자동화 생성 방법
GB201417042D0 (en) 2014-09-29 2014-11-12 Fkd Therapies Oy Method
MA41296A (fr) 2014-12-30 2017-11-07 Orgenesis Ltd Procédés de transdifférenciation et procédés d'utilisation de ceux-ci
CN107750271B (zh) 2015-05-13 2021-12-10 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
GB201508752D0 (en) 2015-05-21 2015-07-01 Mason Christopher And Veraitch Farlan S Cell culture device, system and methods of use thereof
CN105126168B (zh) 2015-09-07 2019-01-25 上海交通大学 用于镁基医用材料及器件的仿生多功能涂层及制备、用途
WO2017049066A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Apparatus for culturing and interacting with a three-dimensional cell culture
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
US10052372B2 (en) 2016-05-24 2018-08-21 Tessa Therapeutics Pte Ltd T cell expansion
CN116286352A (zh) 2016-06-29 2023-06-23 东北大学 细胞培养系统
CN109789092A (zh) 2016-07-13 2019-05-21 哈佛学院院长等 抗原呈递细胞模拟支架及其制备和使用方法
CN109689853B (zh) 2016-08-27 2022-08-23 三维生物科技有限公司 生物反应器
US20190002815A1 (en) 2016-08-27 2019-01-03 3D Biotek, Llc Large-scale Bioreactor
CN109890952A (zh) 2016-09-12 2019-06-14 朱诺治疗学股份有限公司 灌注生物反应器袋装配
WO2018055191A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Tessa Therapeutics Pte. Ltd. T cell expansion method
CN110431222B (zh) 2016-11-11 2022-12-20 奥瑞生物技术有限公司 细胞培养装置、系统及其使用方法
CN115216450A (zh) 2017-09-01 2022-10-21 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 端到端细胞治疗自动化
US11149244B2 (en) 2018-04-04 2021-10-19 Southwest Research Institute Three-dimensional bioreactor for T-cell activation and expansion for immunotherapy
EP3856888A4 (en) 2018-09-24 2022-10-12 Southwest Research Institute THREE-DIMENSIONAL BIOREACTORS
EP3894540A4 (en) 2018-12-11 2022-11-16 Lonza Walkersville, Inc. ISOLATION OF CELLS FOR USE IN AUTOMATED BIOREACTORS
SG11202106377XA (en) 2018-12-21 2021-07-29 Lonza Walkersville Inc Automated production of viral vectors
US20200255790A1 (en) 2019-01-04 2020-08-13 Oribiotech Ltd. Systems, devices, and methods for cell processing
CN113728085A (zh) 2019-02-05 2021-11-30 康宁股份有限公司 织造细胞培养基材
KR20210125510A (ko) 2019-02-08 2021-10-18 론자 워커스빌 아이엔씨. 자동화 생물반응기에서 사용하기 위한 세포 농축 방법 및 장치

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994003496A1 (en) * 1992-07-30 1994-02-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Biomaterials and biosensors containing immobilized modified antibodies
US20030055280A1 (en) * 2001-01-23 2003-03-20 Wellinghoff Stephen T. Methods for synthesis of liquid crystals
US20170037368A1 (en) * 2014-04-16 2017-02-09 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells
US20170321178A1 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 Southwest Research Institute Three-dimensional bioreactor for cell expansion and related applications
WO2017204235A1 (ja) * 2016-05-24 2017-11-30 日本電信電話株式会社 微小粒子を内包する三次元薄膜構造体およびその製造方法
US20180016533A1 (en) * 2016-07-12 2018-01-18 California Institute Of Technology Substrates for high-density cell growth and metabolite exchange
EP3351656A1 (en) * 2017-01-18 2018-07-25 May-Hwa Enterprise Corporation Three - dimensional porous structure of parylene

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
葛泉波, 何淑兰, 毛津淑, 姚康德: "生物材料与细胞相互作用及表面修饰", 化学通报, no. 01, pages 43 - 48 *
陈文元: "非硅MEMS技术及其应用", 31 March 2015, 上海：上海交通大学出版社, pages: 20 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690604A (zh) * 2020-06-24 2020-09-22 杭州原生生物科技有限公司 一种msc体外扩增方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230021385A1 (en) 2023-01-26
AU2019346419A1 (en) 2021-05-20
US11912971B2 (en) 2024-02-27
US11447731B2 (en) 2022-09-20
CA3113690A1 (en) 2020-04-02
JP7376576B2 (ja) 2023-11-08
EP3856888A1 (en) 2021-08-04
JP2022513563A (ja) 2022-02-09
KR20210064299A (ko) 2021-06-02
WO2020068840A1 (en) 2020-04-02
US20200157483A1 (en) 2020-05-21
EP3856888A4 (en) 2022-10-12
SG11202102986XA (en) 2021-04-29
AU2019346419B2 (en) 2023-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019346419B2 (en) Three-dimensional bioreactors
KR102428530B1 (ko) 세포 확장을 위한 3차원 생물 반응기 및 관련 적용
Gauvin et al. Hydrogels and microtechnologies for engineering the cellular microenvironment
JP7237088B2 (ja) 免疫療法用のｔ細胞活性化及び増殖のための三次元バイオリアクター
Anderson et al. Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications
Coutinho et al. Micro-and nanotechnology in tissue engineering
Bjørge et al. Hipster microcarriers: exploring geometrical and topographical cues of non-spherical microcarriers in biomedical applications
Simms et al. Using living radical polymerization to enable facile incorporation of materials in microfluidic cell culture devices
Wang et al. Cellularized polymeric microarchitectures for drug screening
AU2021253701B2 (en) Three-dimensional bioreactor for viral vector production
Coutinho Micro/nano-scale strategies for engineering in vitro the cellular microenvironment using biodegradable biomaterials

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination