KR101400888B1 - 플라즈마 처리된 바이오폴리머를 이용한 세포 흡착을 조절하는 표면 제조방법 - Google Patents

플라즈마 처리된 바이오폴리머를 이용한 세포 흡착을 조절하는 표면 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (1) 기판(substrate)을 준비하는 단계; (2) 단계 1)의 기판을 폴리도파민(polydopamine) 수용액에 담가서, 폴리도파민이 부착된 기판을 제조하는 단계; (3) 단계 2)의 폴리도파민이 부착된 기판에 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 10초 내지 10분간 처리하는 단계; 및 (4) 단계 3) 공기 또는 산소(O2) 플라즈마가 처리된 기판 위에 바이오 소재를 코팅하는 단계를 포함하는 세포 배양용 기판의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 세포 배양용 기판은 다양한 기판에서 세포를 장기간 안정적으로 배양할 수 있고, 세포가 균일하도록 배양할 수 있어, 세포 배양용 기판의 제조방법, 이에 의해 제조된 세포 배양용 기판, 이를 이용한 세포의 배양 방법 및 세포칩에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

플라즈마 처리된 바이오폴리머를 이용한 세포 흡착을 조절하는 표면 제조방법{METHOD OF MANUFACTURING SURFACES FOR CONTROLLING CELL ATTACHMENT USING PLASMA-TREATED BIOPOLYMER}
본 발명은 세포 배양용 기판의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 증착된 폴리도파민 기판에 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 처리하고, 바이오 소재를 코팅하는 방법을 포함하는 세포 배양용 기판의 제조방법, 이에 의해 제조된 세포 배양용 기판, 이를 이용한 세포의 배양 방법 및 세포칩에 관한 것이다.
최근 인간 게놈 프로젝트를 필두로 사람의 생명에 관한 연구가 비약적으로 발전하고 있다. 생명체에 대한 연구가 진행될수록 생명체에 대한 많은 정보를 빠르게 분석, 처리하는 기술이 점차 대두하고 있다. 이에 따라 생물체에 관한 정보를 빠르게 분석할 수 있는 바이오칩에 대한 관심이 그 어느 때보다도 높아지고 있다.
바이오칩은 기판 위에 고정 또는 배양하는 바이오 물질의 종류에 따라 DNA칩, 단백질칩 및 세포칩으로 나눌 수가 있다. 바이오칩 초기에는 인간의 유전정보에 대한 이해와 맞물려 DNA칩이 한 때 크게 부각되었으나 점차 생명활동이 근간이 되는 단백질과 이들의 결합체로서 생명체의 중추가 되는 세포에 대한 관심이 높아지면서 단백질칩과 세포칩이 바이오칩의 새로운 관심거리도 대두되고 있다. 그 중 단백질칩은 초기에 비선택적 흡착이라는 난제로 어려움이 있었으나 이에 대해 최근 여러 가지 주목할 만한 결과가 나타나고 있다.
그 중 많은 양의 세포를 그 성질의 변화없이 배양할 수 있는 세포칩은 신약개발, 지노믹스, 단백질체학 등 다양한 분야로의 접근이 가능한 효과적인 매개체이다. 세포칩에서는 단백질칩과는 다르게 기판상에서의 세포 성장률도 세포칩의 성능을 나타내는 하나의 지표가 된다는 점에서 세포칩과 단백질칩은 다소 상이하다. 한편, 기판 위에 세포가 배양되어 세포성장 및 분열할 수 있게 되면 세포에 대한 분석이 쉽게 가능한 바, 예를 들어 새로운 약물에 대한 세포의 영향이나 호르몬과 같은 다른 생체 내 물질에 대한 세포 반응을 쉽게 알아볼 수 있는 강점을 가지고 있다.
세포를 기판에 배양하는 방법은 여러 가지가 있음이 알려져 있는데, 크게 바이오 물질을 이용한 방법에 의한 배양과 기판 자체의 물리적, 화학적 특성을 이용하여 배양하는 방법으로 나눌 수 있다. 바이오 물질을 이용한 방법으로는 펩타이드나 단백질을 먼저 기판 위에 고정한 뒤 이들 바이오물질이 가지고 있는 세포수용체를 이용하여 세포를 배양하는 방법이 있다[Mann BK, Tsai AT, Scott-Burden T, West JL. Modification of surfaces with cell adhesion peptides alters extracellular matrix deposition. Biomaterials 1999;20(23-.24):2281-6].
그리고 기판의 물리적, 화학적 특성을 이용한 방법으로는 기판의 소수성 성질을 이용하는 방법, 전기적 성질을 이용하는 방법, 표면 구조를 이용한 방법[Curtis AS, Wilkinson CD. Reactions of cells to topography. J Biomater SciPolym Ed 1998;9(12):1313 -.29], 콜라겐을 이용하여 세포를 배양하는 방법[On-chip transfection of PC12 cells based on the rational understanding of the role of ECM molecules: efficient, non-viral transfection of PC12 cells using collagen IV, Neuroscience Letters 378 (2005) 40 -43] 등이 있다.
그러나 세포칩 연구에서는 여러 가지 문제점이 존재하는데, 첫째, 세포가 기판에 고르게 배양되지 않는다는 점이다. 세포가 기판에 뭉치지 않고 고르게 분산되어 배양되어야 기판 위에서 세포들이 성장, 분열을 하는데, 세포가 기판에 고르게 배양되지 못한다면 세포들이 성장, 분열하는 데 문제점이 있을 수 있다. 또한 세포의 배양이 잘 된다는 것은 적은 양의 세포도 정확히 배양이 된다는 것을 의미한다. 적은 양의 세포도 기판에 잘 배양되므로 결과적으로 세포칩 기판의 감도를 향상시킬 수 있다.
둘째, 세포를 기판에 배양했을 경우 고유한 세포의 성질이나 조직성을 잘 유지하는 것이 필요하다. 아무리 세포가 기판에 잘 배양된다고 하더라고 그 위에서 기판의 성질 때문에 세포의 고유한 성질을 잃어버려 세포가 잘 성장하지 않는다면 칩으로서의 역할을 제대로 한다고 할 수 없다. 따라서 세포칩을 개발할 경우에는 우선적으로 상기에 대한 이해가 필요하다.
이에 본 발명자들은 기판에 폴리도파민을 부착시키고, 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 처리한 후, 공기 또는 산소(O2) 플라즈마가 처리된 기판 위에 바이오 소재를 코팅하여 세포 배양용 기판을 제조하여, 이것이 세포를 안정적으로 배양할 수 있고, 세포를 균일하게 배양할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기판의 종류에 관계없이 세포를 안정적으로 배양하고, 세포를 균일하게 배양할 수 있는 세포 배양용 기판의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 세포 배양용 기판의 제조방법에 의해 제조되는 세포 배양용 기판을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 세포 배양용 기판 상에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포의 배양방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 세포가 배양된 세포 배양용 기판을 포함하는 세포칩에 있어서, 상기 세포 배양용 기판의 제조 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 세포칩을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 기판(substrate)을 준비하는 단계; (2) 단계 1)의 기판을 폴리도파민(polydopamine) 수용액에 담가서, 폴리도파민이 부착된 기판을 제조하는 단계; (3) 단계 2)의 폴리도파민이 부착된 기판에 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 10초 내지 10분간 처리하는 단계; 및 (4) 단계 3) 공기 또는 산소(O2) 플라즈마가 처리된 기판 위에 바이오 소재를 코팅하는 단계를 포함하는 세포 배양용 기판의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포 배양용 기판의 제조방법에 의해 제조되는 세포 배양용 기판을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포 배양용 기판 상에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포의 배양방법을 제공한다.
또한 본 발명은 세포가 배양된 세포 배양용 기판을 포함하는 세포칩에 있어서, 상기 세포 배양용 기판의 제조 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 세포칩을 제공한다.
본 발명에 따른 세포 배양용 기판의 제조 방법에 따르면, 기판의 종류에 관계없이 장시간 안정적으로 세포를 배양할 수 있으며, 세포를 균일하게 배양할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 세포 배양용 기판의 제조방법의 개략도이다.
도 2는 플라즈마 처리 시간에 따른 폴리도파민 층의 두께를 측정한 도이다.
도 3은 플라즈마 처리 시간에 따른 폴리도파민 층의 접촉각을 측정한 도이다.
도 4는 폴리도파민 박막에 플라즈마를 일정시간 동안 처리한 후 폴리라이신을 처리하였을 때의 X선 광전자 분광법 결과 상대적인 질소 피크(peak)를 비교한 도이다.
도 5는 질소실리콘 위에 형성된 해마 신경세포 네트워크의 예를 나타낸 도이다: (a)폴리도파민 증착면 위에 폴리라이신을 도포한 표면; (b)폴리도파민 증착면 위에 플라즈마를 처리하고 폴리라이신을 도포한 표면이다.
도 6은 Su-8을 배양기판으로 하여 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 세포 배양용 기판의 신경 세포 배양 능력을 위상 이미지로 확인한 도이다(18DIV); 살아있는 세포는 녹색으로 표시되고, 죽어있는 세포는 붉은색으로 표시된다.
도 7은 유리를 배양기판으로 하여 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 세포 배양용 기판의 신경 세포 배양 능력을 위상 이미지로 확인한 도이다(15DIV).
도 8은 PDMS(polydimethylsiloxane)를 배양기판으로 하여 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 세포 배양용 기판의 신경 세포 배양 능력을 위상 이미지로 확인한 도이다(8DIV).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (1) 기판(substrate)을 준비하는 단계; (2) 단계 1)의 기판을 폴리도파민(polydopamine) 수용액에 담가서, 폴리도파민이 부착된 기판을 제조하는 단계; (3) 단계 2)의 폴리도파민이 부착된 기판에 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 10초 내지 10분간 처리하는 단계; 및 (4) 단계 3) 공기 또는 산소(O2) 플라즈마가 처리된 기판 위에 바이오 소재를 코팅하는 단계를 포함하는 세포 배양용 기판의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 1)에서 "기판"이라 함은 플라즈마를 이용하여 세포를 배양할 수 있는 모든 종류의 판을 의미하는 것으로서, 구체적으로는 유리, 플라스틱, 금속, 실리콘, Su-8, PDMS(polydimethylsiloxane) 또는 질소실리콘으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으나, 기판의 종류는 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 유리, Su-8, PDMS 또는 질소실리콘일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 질소실리콘일 수 있다.
상기 단계 2)에서 폴리도파민 수용액은 이에 한정되는 것은 아니지만 하기의 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된다;
(1) 3차 증류수 트리즈마 HCL(Trizma HCL) 및 트리즈마 염기(Trizma Base) 를 혼합하여 10mM의 pH 8.0의 트리즈마 완충액(Trizma buffer)를 제조하는 단계; 및
(2) 단계 1)의 트리즈마 완충액에 폴리도파민 가루(C8H11NO2ㆍHCl)를 녹이는 단계.
본 발명에 따른 폴리도파민은 도파민을 중합시킨 것으로 최근 홍합이 접착을 유도하는 주성분으로 밝혀져 이를 인공적으로 합성하여 여러 가지 기판의 표면에 코팅하여 재료에 관계없이 동일한 화학적 특성을 지니도록 표면을 개질할 수 있는 물질로 주목받고있다. 폴리도파민이 코팅된 기판에 아민(NH2)이나 싸이올기(thiol)를 가진 분자들을 공유결합적으로 흡착시켜서 기판 표면에 다양한 기능기를 도입할 수 있고 이러한 폴리도파민 코팅층은 접착력이 매우 뛰어나다.
상기 단계 3)에서 "플라즈마(plasma)"란 전기적으로 중성인 기체분자가 전기에너지 또는 열에너지를 흡수하여 이온과 전자로 분리되어 있는 상태를 말한다. 현재 플라즈마를 이용하는 기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데 반도체 공정에서 사용되는 플라즈마 식각(plasma etching) 및 플라즈마 화학기상증착(PECVD: plasma enhanced chemical vapor deposition), 금속이나 고분자의 표면처리, 인조 다이아몬드 등의 신물질의 합성, 플라즈마 디스플레이 패널(PDP: plasma display panel) 및 환경정화 기술 등 그 응용분야가 점점 더 확대되고 있다.
상기 단계 3)에서 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 처리하는 시간은 10초 내지 10분일 수 있으며, 바람직하게는 10초 내지 8분이다.
상기 단계 4)에서 바이오 소재는 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리라이신(polylysine), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 폴리라이신이다.
세포가 기판에 달라붙어 성장할 수 있기 위해서는 생체 단백질이나 바이오 소재로 코팅 되어야 하며, 폴리라이신, 라미닌, 파이브로넥틴 등이 주로 코팅 소재로 사용된다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 플라즈마 처리 시간에 따른 폴리도파민 층의 두께를 측정한 결과, 플라즈마를 처리하지 않은 대조군에 비해, 폴리도파민 층의 두께가 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 2 및 표 1참조).
본 발명의 일실시예에 있어서, 플라즈마 처리 시간에 따른 폴리도파민 층의 물의 접촉각을 측정한 결과, 플라즈마를 처리하지 않은 대조군에 비해, 폴리도파민 층의 물의 접촉각이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 3 및 표 2참조).
본 발명의 일실시예에 있어서, 플라즈마 처리 시간에 따른 상대적인 질소 피크를 비교한 결과, 에어 플라즈마를 1분, 4분 처리한 샘플이 처리하지 않은 샘플보다 질소 피크가 높게 나타났다. 질소 피크는 상대적인 폴리라이신의 양을 나타내는 것으로 플라즈마를 처리한 폴리도파민 박막은 그렇지 않은 경우보다 효율적인 바이오소재의 코팅을 일으킨다는 것을 알 수 있었다(도 4 참조).
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명에 따른 세포 배양용 기판의 세포 배양능력을 분석한 결과, 체세포나 신경돌기의 뭉침현상이 거의 일어나지 않으면서 세포가 배양되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명에 따른 세포 배양용 기판을 기판의 종류를 달리하면서 세포 배양능력을 분석한 결과, 기판의 종류에 관계없이 장시간 신경세포가 안정적으로 배양될 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명은 (1) 기판(substrate)을 준비하는 단계; (2) 단계 1)의 기판을 폴리도파민(polydopamine) 수용액에 담가서, 폴리도파민이 부착된 기판을 제조하는 단계; (3) 단계 2)의 폴리도파민이 부착된 기판에 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 10초 내지 10분간 처리하는 단계; 및 (4) 단계 3) 공기 또는 산소(O2) 플라즈마가 처리된 기판 위에 바이오 소재를 코팅하는 단계를 포함하는 세포 배양용 기판의 제조방법으로 제조된 세포 배양용 기판을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 세포 배양용 기판 상에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포의 배양방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 세포 배양용 기판은 기판에 관계없이 세포를 장기간 안정적으로 배양할 수 있고, 세포가 뭉치지 않고 균일하도록 배양할 수 있어, 세포의 배양방법에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 세포는 이에 한정되는 것은 아니지만, 미생물, 동식물 세포 및 기관 또는 신경세포를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 신경세포이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 신경세포를 체외 기판에서 배양하면 신경세포의 체세포(soma)에서 신경돌기가 자라나와 신경세포간에 네트웍이 형성되는데, 대조군에서는 네트웍이 형성되는 과정에서 신경돌기가 균일하게 표면에서 자라나오지 못하고 서로 총생(fasiculation)되고 체세포도 뭉치는 현상이 관찰되었다. 본 발명에 따른 세포 배양용 기판에서는 러한 체세포나 신경돌기의 뭉침현상이 거의 일어나지 않았다.
또한 본 발명은 세포가 배양된 세포 배양용 기판을 포함하는 세포칩에 있어서, 상기 세포 배양용 기판의 제조 방법으로 제조되는 세포칩을 제공한다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 세포 배양용 기판은 기판에 관계없이 세포를 장기간 안정적으로 배양할 수 있고, 세포가 뭉치지 않고 균일하도록 배양할 수 있어, 세포칩에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 질소실리콘 기판을 이용한 세포 배양용 기판의 제조
배양기판으로는 질소실리콘을 표면층으로 하는 칩을 사용하였다. 트리즈마 완충액(trizma buffer)은 3차 증류수에 500ml에 트리즈마 HCl(Trizma HCl) 444mg과 트리즈마 염기 265mg을 혼합한 후 10mM의 pH 8.0의 용액으로 만들었다. 폴리도파민 수용액은 10mM, pH 8.0인 트리즈마 완충액에 2mg/ml로 폴로도파민 가루(C8H11NO2ㆍHCl)를 녹여서 제조하였다. 제작된 폴리도파민 수용액에 배양 기판을 담그고 1시간 동안 두면 폴리도파민이 수용액상에서 자발적으로 중합되면서 기질 표면에 부착된다. 이 후에 증류수로 배양 기판을 세척한 후, 에어 플라즈마를 1분간 처리 하였다. 배양 기판 위에 폴리라이신(poly-D-lysine) 수용액(0.1mg/ml, pH 8.0인 트리즈마 완충액 사용)을 1ml 떨어뜨려 도포시킨 후 1시간 동안 두었다. 증류수로 배양 기판을 헹구어 내고 에탄올로 세척한 후 말려서 세포 배양용 기판을 제조하였다.
< 실시예 2> Su -8 기판을 이용한 세포 배양용 기판의 제조
배양기판으로 Su-8 on Si wafer를 표면층으로 하는 칩을 사용한 것만 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 세포 배양용 기판을 제조하였다.
< 실시예 3> 유리기판을 이용한 세포 배양용 기판의 제조
배양기판으로 유리기판을 이용한 것만 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 세포 배양용 기판을 제조하였다.
< 실시예 4> PDMS ( polydimethylsiloxane )을 이용한 세포 배양용 기판의 제조
배양기판으로 PDMS를 이용한 것만 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 세포 배양용 기판을 제조하였다.
< 실험예 1> 플라즈마 처리 시간에 따른 폴리도파민 층의 두께 분석
플라즈마 처리 시간에 따른 폴리도파민 층의 두께를 분석하기 위해, 플라즈마 처리 시간을 달리 하면서, 엘립소메트리(ellipsometry)로 각 샘플의 폴리도파민 박막의 두께를 측정하였다. 구체적으로 에어 플라즈마를 처리하는 시간을 0, 10초, 30초, 1분, 2분, 4분, 8분(n=30)으로 하는 것만 제외하고는 <실시예 1>과 같은 방법으로 세포 배양용 기판을 제조하였다. 그 후에, 엘립소메트리를 이용하여 각 샘플의 폴리도파민 박막의 두께를 측정하였다.
그 결과, 도 2 및 표 1에 나타났듯이, 폴리도파민 박막의 두께가 플라즈마를 처리하지 않은 대조군에 비해 현저하게 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
플라즈마 처리 시간에 따른 폴리도파민 층의 두께
플라즈마 처리시간(분) 0 0.17 0.5 1 2 4 8
평균(Angstrom) 31.93 7.039 0.4233 6.937 9.438 11.74 19.95
표준분포(%) 10.30 5.108 0.9940 5.865 12.66 1.807 3.648
< 실험예 2> 플라즈마 처리시간에 따른 폴리도파민 층의 물의 접촉각 분석
플라즈마 처리 시간에 따른 폴리도파민 층의 물의 접촉각을 분석하기 위해, 플라즈마 처리 시간을 달리 하면서, 엘립소메트리(ellipsometry)로 각 샘플의 폴리도파민 물의 접촉각을 측정하였다. 구체적으로 에어 플라즈마를 처리하는 시간을 0, 10초, 30초, 1분, 2분, 4분, 8분(n=30)으로 하는 것만 제외하고는 <실시예 1>과 같은 방법으로 세포 배양용 기판을 제조하였다. 그 후에, 엘립소메트리를 이용하여 각 샘플의 폴리도파민 박막의 물의 접촉각을 측정하였다.
그 결과, 도 3 및 표 2에 나타났듯이, 폴리도파민 층의 물의 접촉각이 플라즈마를 처리하지 않은 대조군에 비해 현저하게 줄어든 것을 확인할 수 있었다
플라즈마 처리 시간에 따른 폴리도파민 층의 물의 접촉각
플라즈마 처리시간(분) 0 0.17 0.5 1 2 4 8
평균(Angstrom) 51.25 9.745 4.508 4.508 5.258 4.8277 5.053
표준분포(%) 3.780 2.475 0.8454 0.3524 0.4974 0.6559 0.6828
< 실험예 3> 플라즈마 처리 시간에 따른 상대적인 질소 피크( peak ) 분석
플라즈마 처리 시간에 따른 상대적인 질소 피크를 분석하기 위해, 플라즈마 처리 시간을 달리 하면서, X선 광선자 분광법을 이용하여 각 샘플의 폴리도파민 물의 접촉각을 측정하였다. 구체적으로 에어 플라즈마를 처리하는 시간을 0, 1분, 4분으로 하는 것만 제외하고는 <실시예 1>과 같은 방법으로 세포 배양용 기판을 제조하였다. 그 후에, X선 광선자 분광법을 이용하여 각 샘플의 질소 피크의 크기를 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 알 수 있듯이, 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 1분, 4분 처리한 샘플이 처리하지 않은 샘플보다 질소 피크가 높게 나타났다. 질소 피크는 상대적인 폴리라이신의 양을 나타내는 것으로 플라즈마를 처리한 폴리도파민 박막은 그렇지 않은 경우보다 효율적인 바이오소재의 코팅을 일으킨다는 것을 알 수 있었다.
< 실험예 4> 세포 배양 능력 분석
<실시예 1>에 따라 제조된 세포 배양용 기판의 세포 배양 능력을 분석하기 위해, 쥐의 피질신경세포(E18 sprague-Dawley rat brain)를 배양하였다(세포 밀도 800cell/mm2). 세포 배양 7일 후 위상 이미지(phase image)로 관찰하였다(7 DIV, 20x)(도 5b 참조). 대조군으로 질소실리콘 기판을 에어 플라즈마 처리(1분) 한 후, 폴리라이신을 1시간 코팅(0.1mg/ml, 증류수 사용)하는 방법으로 제조된 세포 배양용 기판을 이용하였다(도 5a 참조). 아울러, 다른 기판에서도 신경세포가 안정적으로 배양되는지 알아보기 위해, 실시예 2 내지 4에서 제조된 세포 배양용 기판에 상기와 같은 방법으로 신경 세포를 배양하여, 세포 배양 능력을 평가하였다.
그 결과, 도 5a 및 5b에서 알 수 있듯이, 신경세포를 체외 기판에서 배양하면 신경세포의 체세포(soma)에서 신경돌기가 자라나와 신경세포간에 네트웍이 형성된다. (a)는 네트웍이 형성되는 과정에서 신경돌기가 균일하게 표면에서 자라나오지 못하고 서로 총생(fasiculation)되고 체세포도 뭉치는 현상이 관찰되었다. 하지만 (b)는 이러한 체세포나 신경돌기의 뭉침현상이 거의 일어나지 않았다.
또한, 실시예 2의 제조방법으로 제조된 세포 배양 기판으로 신경세포를 배양한 것을 위상 이미지(18DIV)로 관찰한 결과(도 6 참조), 신경세포가 안정적으로 배양되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 3의 제조방법으로 제조된 세포 배양 기판으로 신경세포를 배양한 것을 위상 이미지(15DIV)로 관찰한 결과(도 7 참조), 신경세포가 안정적으로 배양되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 4의 제조방법으로 제조된 세포 배양 기판으로 신경세포를 배양한 것을 위상 이미지(8DIV)로 관찰한 결과(도 8 참조), 신경세포가 안정적으로 배양되는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로, 본 발명에 따른 세포 배양용 기판은 배양기판의 종류에 관계없이 신경세포를 장시간 안정적으로 배양할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. (1) 기판(substrate)을 준비하는 단계;
    (2) 단계 1)의 기판을 폴리도파민(polydopamine) 수용액에 담가서, 폴리도파민이 부착된 기판을 제조하는 단계;
    (3) 단계 2)의 폴리도파민이 부착된 기판에 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 10초 내지 10분간 처리하는 단계; 및
    (4) 단계 3)의 공기 또는 산소(O2) 플라즈마가 처리된 기판 위에 바이오 소재를 코팅하는 단계를 포함하는 신경세포 배양용 기판의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 1)의 기판은 유리, 플라스탁, 금속, 실리콘, Su-8, PDMS(polydimethylsiloxane) 또는 질소실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경세포 배양용 기판의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 단계 3)의 공기 또는 산소(O2) 플라즈마를 10초 내지 8분간 처리하는 것을 특징으로 하는 신경세포 배양용 기판의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 단계 4)의 바이오 소재는 폴리라이신(polylysine), 라미닌(laminin) 또는 파이브로넥틴(fibronectin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경세포 배양용 기판의 제조방법.
  5. 제 1항의 방법으로 제조되는 신경세포 배양용 기판.
  6. 제 1항의 방법으로 제조된 신경세포 배양용 기판 상에 신경세포를 배양하는 단계를 포함하는 신경세포의 배양방법.
  7. 삭제
  8. 신경세포가 배양된 신경세포 배양용 기판을 포함하는 세포칩에 있어서, 상기 신경세포 배양용 기판은 제 1항의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 신경세포칩.

  9. 삭제
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