KR101462765B1 - 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법, 패턴화된 세포 배양용 기판 및 세포칩 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (1) 기판을 준비하는 단계; (2) 플라즈마를 이용하여 상기 기판 상에 전구체 물질을 집적시켜 플라즈마 중합체층을 형성하는 단계; (3) 상기 플라즈마 중합체층 상에 일정한 형태의 패턴을 가지는 새도우 마스크를 올려놓는 단계; (4) 플라즈마를 이용하여 상기 새도우 마스크가 올려진 기판 상에 반응가스를 처리하는 단계; 및 (5) 상기 새도우 마스크를 기판으로부터 제거하는 단계를 포함하는 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법, 이를 이용하여 제조한 패턴화된 세포 배양용 기판에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 패턴화된 세포 배양용 기판 상에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포의 패턴화된 배양방법 및 패턴화된 세포칩, 그리고 상기 패턴화된 세포칩을 이용하여 혈관신생 유도 또는 촉진하는 활성을 가지는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법, 패턴화된 세포 배양용 기판 및 세포칩{Method for preparing patterned substrate for culturing cells, patterned substrate and cell chip for culturing cells}
본 발명은 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법, 이를 이용하여 제조한 패턴화된 세포 배양용 기판, 패턴화된 세포의 배양방법, 패턴화된 세포칩 및 이를 이용한 혈관신생 유도, 촉진 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
바이오칩은 생물에서 유래된 효소, 단백질, 항체, DNA, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 및 기관, 신경세포 등과 같은 생체 유기물과 반도체와 같은 무기물을 조합하여 기존의 반도체 칩 형태로 만든 소자이다. 바이오 칩은 크게 DNA 탐침(probe)이 고정된 'DNA 칩', 효소, 항체, 항원 등과 같은 단백질이 고정된 '단백질 칩', 세포가 고정된 '세포칩' 등으로 분류될 수 있다.
그 중 많은 양의 세포를 그 성질의 변화없이 배양할 수 있는 세포칩은 신약개발, 지노믹스, 단백질체학 등 다양한 분야로의 접근이 가능한 효과적인 매개체이다. 세포칩에서는 단백질칩과는 다르게 기판상에서의 세포 성장률도 세포칩의 성능을 나타내는 하나의 지표가 된다는 점에서 세포칩과 단백질칩은 다소 상이하다. 한편, 기판 위에 세포가 배양되어 세포성장 및 분열할 수 있게 되면 세포에 대한 분석이 쉽게 가능한 바, 예를 들어 새로운 약물에 대한 세포의 영향이나 호르몬과 같은 다른 생체 내 물질에 대한 세포 반응을 쉽게 알아볼 수 있는 강점을 가지고 있다.
세포를 기판에 배양하는 방법은 여러 가지가 있음이 알려져 있는데, 크게 바이오 물질을 이용한 방법에 의한 배양과 기판 자체의 물리적, 화학적 특성을 이용하여 배양하는 방법으로 나눌 수 있다. 바이오 물질을 이용한 방법으로는 펩타이드나 단백질을 먼저 기판 위에 고정한 뒤 이들 바이오물질이 가지고 있는 세포수용체를 이용하여 세포를 배양하는 방법이 있다[Mann BK, Tsai AT, Scott-Burden T, West JL. Modification of surfaces with cell adhesion peptides alters extracellular matrix deposition. Biomaterials 1999;20(23-24):2281-6].
그리고 기판의 물리적, 화학적 특성을 이용한 방법으로는 기판의 소수성 성질을 이용하는 방법, 전기적 성질을 이용하는 방법, 표면 구조를 이용한 방법[Curtis AS, Wilkinson CD. Reactions of cells to topography. J Biomater SciPolym Ed 1998;9(12):1313-29], 콜라겐을 이용하여 세포를 배양하는 방법[On-chip transfection of PC12 cells based on the rational understanding of the role of ECM molecules: efficient, non-viral transfection of PC12 cells using collagen IV, Neuroscience Letters 378 (2005) 40-43] 등이 있다.
이러한 바이오칩을 개발하기 위해서는 생체물질과 기판의 계면을 효율적으로 형성하고 생체물질의 고유 기능을 최대한 활용할 수 있도록 하는 생체물질의 고정화 기술이 중요하다.
이와 관련하여 국제공개특허 WO 2008/001117는 세포 배양용 기판의 제조방법, 세포 배양용 기판, 세포의 고정방법, 및 세포칩을 개시하고 있다. 상기 출원은 플라즈마를 이용하여 기판상에 많은 양의 작용기를 집적시켜 세포를 효율적으로 배양하기 위한 세포 배양용 기판의 제조방법, 세포 배양용 기판, 세포의 배양 방법, 및 세포칩에 관한 것이다. 그러나 상기 출원은 플라즈마를 이용하여 세포를 기판에 고정하는 방법 등에 대해서만 기재되어 있을 뿐 세포의 흡착 및 흡착억제를 이용하여 선택적으로 세포를 배양하는 방법에 대해서는 기재되어 있지 않다.
세포의 흡착을 억제하는 표면과 세포를 잘 배양할 수 있는 표면을 패터닝 하게 되면, 인체 삽입용 칩 개발, 인공장기 개발 그리고 세포를 이용한 유전학적 실험, 약물실험 등에 응용될 수 있지만, 상기 출원에는 단지 세포를 균일하게 배양하는 방법에 대해서만 공지되어 있기 때문에 소량의 세포를 원하는 위치에 선택적으로 배양할 수 없다는 문제가 있다.
또한, 대한민국 공개특허 제2011-0024244호에는 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법, 패턴화된 세포 배양용 기판 및 세포칩에 대해서 개시하고 있다. 상기 출원은 플라즈마를 이용하여 기판 상에 전구체 물질을 집적시키는 방법으로 세포 배양용 기판을 제조하고 있는데, 이때 두 가지 이상의 전구체 물질이 필요하며, 두 번 이상의 증착 과정을 거쳐야 하는 등의 패턴 형성을 위하여 복잡한 단계를 거쳐야 하는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명자는 보다 간단한 제조방법을 통하여 패턴화된 세포 배양용 기판을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 플라즈마를 이용하여 반응가스를 처리함으로써, 기판의 원하는 위치에만 선택적으로 세포를 배양할 수 있는 간편한 패터닝(patterning) 기술과, 이를 이용하여 패턴화된 세포 배양용 기판 및 세포칩을 제조할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (1) 기판을 준비하는 단계; (2) 플라즈마를 이용하여 상기 기판 상에 전구체 물질을 집적시켜 플라즈마 중합체층을 형성하는 단계; (3) 상기 플라즈마 중합체층 상에 일정한 형태의 패턴을 가지는 새도우 마스크를 올려놓는 단계; (4) 플라즈마를 이용하여 상기 새도우 마스크가 올려진 기판 상에 반응가스를 처리하는 단계; 및 (5) 상기 새도우 마스크를 기판으로부터 제거하는 단계를 포함하는 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법과 이를 이용하여 제조된 패턴화된 세포 배양용 기판을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 패턴화된 세포 배양용 기판 상에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포의 패턴화된 배양방법을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 패턴화된 세포 배양용 기판 상에 세포가 배양되어 있는 것을 특징으로 하는, 패턴화된 세포칩을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 패턴화된 세포칩을 이용하여 혈관신생 유도 또는 촉진하는 활성을 가지는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 기판을 준비하는 단계; (2) 플라즈마를 이용하여 상기 기판 상에 전구체 물질을 집적시켜 플라즈마 중합체층을 형성하는 단계; (3) 상기 플라즈마 중합체층 상에 일정한 형태의 패턴을 가지는 새도우 마스크를 올려놓는 단계; (4) 플라즈마를 이용하여 상기 새도우 마스크가 올려진 기판 상에 반응가스를 처리하는 단계; 및 (5) 상기 새도우 마스크를 기판으로부터 제거하는 단계를 포함하는 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법을 개략적으로 나타낸 도이다. 도 1을 참고하여, 각 단계를 구체적으로 설명하기로 한다.
(1) 기판을 준비하는 단계
본 발명에서 사용된 용어, '기판'은 플라즈마를 이용하여 전구체 물질이 집적될 수 있는 모든 종류의 판을 의미한다. 구체적으로는 유리, 플라스틱, 금속 및 실리콘 등을 사용할 수 있으며, 기판의 종류는 플라즈마를 이용하여 전구체 물질이 집적될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 유리 슬라이드가 기판으로 준비될 수 있다.
(2) 플라즈마를 이용하여 상기 기판 상에 전구체 물질을 집적시켜 플라즈마 중합체층을 형성하는 단계
본 발명에서 사용된 용어, '플라즈마(plasma)'란 전기적으로 중성인 기체분자가 전기에너지 또는 열에너지를 흡수하여 이온과 전자로 분리되어 있는 상태를 말한다. 현재 플라즈마를 이용하는 기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데 반도체 공정에서 사용되는 플라즈마 식각(plasma etching) 및 플라즈마 화학기상증착(PE-CVD: plasma enhanced chemical vapor deposition), 금속이나 고분자의 표면처리, 인조 다이아몬드 등의 신물질의 합성, 플라즈마 디스플레이 패널(PDP: plasma display panel) 및 환경정화 기술 등 그 응용분야가 점점 더 확대되고 있다.
본 발명에서 사용된 용어, '전구체 물질'이란 플라즈마를 이용하여 플라즈마 중합체층을 형성할 수 있는, 선행물질을 의미한다.
본 발명의 전구체 물질은, 세포의 흡착을 억제할 수 있는 물질이면 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 헥사메틸디실록산(hexamethyldisiloxane), 옥타메틸트리실록산(octamethyltrisiloxane), 데카메틸테트라실록산(decamethyltetrasiloxane), 헥사메틸사이클로트리실록산(hexa methylcyclotrisiloxane), 옥타메틸사이클로테트라실록산(octamethyl cyclotetrasiloxane) 또는 데카메틸사이클로펜타실록산(decamethylcyclopentasiloxane) 등의 실록산계 화합물을 사용할 수 있다. 바람직하게 상기 전구체 물질로는 헥사메틸디실록산(hexamethyldisiloxane)을 사용할 수 있다.
상기 전구체 물질을 사용하여 형성된 플라즈마 중합체층은 기판과 세포와의 결합을 억제하기 때문에 세포의 흡착을 억제하는 면에서 우수한 장점을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 용어, '집적'이란 전구체 물질을 플라즈마 에너지를 이용하여 분해하고, 분해된 부산물에 의해 플라즈마 중합체층을 형성하는 것을 의미한다.
상기 플라즈마 중합체층은 플라즈마 화학기상 증착법(PE-CVD; Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition)을 이용하여 형성될 수 있다.
플라즈마 화학기상 증착법(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition; PECVD)은 반도체나 평판 디스플레이 등의 제조시 화학 반응을 이용하여 실리콘 웨이퍼나 글래스와 같은 기판 상에 능동층, 절연층 및 보호층 등의 박막을 형성하는 화학기상 증착법(Chemical Vapor Deposition; CVD)의 한 종류이다. 구체적으로 플라즈마 화학기상 증착법은 고주파 전원을 이용하여 소정의 화학 물질을 포함하는 가스를 플라즈마 상태로 여기(勵起)시킴으로써, 상기 가스에 포함된 화학 물질이 라디칼화되어 반응성이 크게 높아져서 기판 위에 흡착되어 퇴적될 수 있도록 하는 방법이다.
상기 (2) 단계를 수행하기 위한 플라즈마 화학기상증착 장치를 도 2를 참조하여 구체적으로 설명하기로 한다. 도 2는 기판 상에 플라즈마 중합체층 형성하기 위한 플라즈마 화학기상증착 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2의 플라즈마 화학기상 증착 장치는 플라즈마가 형성되는 공간인 플라즈마 반응 챔버(Reactor)와, 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내부의 압력을 조절하기 위한 진공펌프를 포함하는 진공수단과, 전구체 물질을 기체 상태로 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내로 주입하기 위한, 거품기(bubbler)를 포함하는 가스 주입 수단과, 플라즈마 반응 챔버 내부에 배치된 내부전극에 전압을 인가하기 위한 전력공급장치(RF Power Supply)로 이루어져 있다. 플라즈마 반응 챔버는 그 내부에 기판 받침대와, 그 기판 받침대 하부에 배치되어 기판 받침대를 지지하는 내부전극이 순차적으로 장착되어 있다.
플라즈마 화학기상증착 장치를 이용하여 기판 상에 전구체 물질을 집적시켜 플라즈마 중합체층을 형성하는 단계를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
우선, 기판을 플라즈마 반응 챔버의 내부에 있는 기판 받침대 위에 설치한다. 이후, 진공펌프(Rotary Pump)를 통해 플라즈마 반응 챔버 내부의 압력을 진공 상태에 가까운 수 미리토르(mtorr)로 낮춘 상태에서 가스 주입 수단을 통해 전구체 물질을 운송 가스와 함께 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내로 주입한다. 이러한 상태에서 전력공급장치로 내부전극에 전압을 인가하면, 내부전극 주위에 생성된 플라즈마들이 기판과 플라즈마 반응 챔버(Reactor)의 벽 사이에 형성된다. 이때, 생성된 플라즈마에 의해 전구체 물질이 중합되면서 기판 상에 플라즈마 중합체층이 균일하게 형성된다.
이때, 외부전극과 내부전극 모두를 사용할 수도 있으나, 내부전극 하나만을 사용하는 것이 플라즈마 중합체층이 형성됨에 있어서 보다 효율적 및 효과적이다. 또한, 플라즈마 반응 챔버(Reactor)의 전력공급장치의 전력으로서 내부전극에 가하는 전력은 5 내지 20 W를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 10 W를 사용할 수 있다.
또한, 전구체 물질을 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내부로 주입하기 전에, 전구체 물질을 증기화(vaporization)하는 것이 바람직하다. 증기화는 거품기(Bubbler)를 이용하여 전구체 물질을 가열함으로써 상기 전구체 물질을 증발시켜 기상화하는 방법을 사용하는 것이 바람직하고, 이때, 증기화 온도는 50℃ 내지 116℃인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 전구체 물질은 60℃ 내지 70℃ 온도에서 증기화되어 상기 기판 상에 플라즈마 증착되는 것을 특징으로 한다.
전구체 물질은 운송가스를 이용하여 플라즈마 반응 챔버(50) 내로 주입되며, 이때 이용될 수 있는 운송가스로는 아르곤(Ar), 질소(N2), 헬륨(He) 및 수소(H2) 등이 이용될 수 있고, 바람직하게는 아르곤(Ar)을 이용할 수 있다. 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내부로의 반응가스의 유량(mass flow rate)은 10 내지 50 sccm에서 사용하는 것이 바람직하다.
플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내의 기판의 온도는 상온에서 실시하는 것이 바람직하다. 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내부의 압력은 10 mtorr 내지 수 토르를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 500 mtorr가 바람직하다.
상기와 같이 플라즈마를 이용하여 전구체 물질을 집적시키게 되면, 기판 상에 균일하게 플라즈마 중합체층이 형성되며, 표면 성질은 세포 비부착성의 성질을 가지게 된다.
(3) 플라즈마 중합체층 상에 일정한 형태의 패턴을 가지는 새도우 마스크를 올려놓는 단계
본 발명에서 사용된 용어, '새도우 마스크'란 원하는 특정한 부분을 노출할 수 있는 작은 구멍이 뚫려 있는 얇은 금속판을 의미한다. 예컨대 상기 새도우 마스크는 일정한 패턴을 형성할 수 있도록 라인 또는 막대 모양의 구멍이 뚫려 있으며, 이들 패턴 사이의 간격은 100 내지 500 ㎛일 수 있다.
새도우 마스크의 재질 및 형상은 플라즈마 중합체층 상에 올려질 수 있고, 일정한 형태의 패턴을 형성할 수 있으면 충분하고, 그 재질 및 형상은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 새도우 마스크의 상기 일정한 형태의 패턴은 일정한 간격을 가지는 복수 개의 막대형 구멍을 구비하며, 상기 구멍과 구멍 사이의 간격은 100 내지 500 ㎛일 수 있다.
(4) 플라즈마를 이용하여 새도우 마스크가 올려진 기판 상에 반응가스를 처리하는 단계
상기 플라즈마를 이용한 반응가스의 처리 단계는 새도우 마스크가 올려진 기판 상에서, 패턴을 형성하는 구멍들로 인하여 노출된 플라즈마 중합층의 표면을 세포흡착을 억제하는 성질을 가지도록 개질하는 단계이다.
바람직하게, 상기 플라즈마의 처리는 유도 결합 플라즈마 화학기상 증착법을 이용할 수 있다. 이러한 유도결합 플라즈마 화학기상 증착 장치에서 기판은 반응 챔버의 외부에 배치된 고주파 유도용 안테나로부터 발생되는 전기장의 영향권 밖에 있으면서, 플라즈마는 기판에 매우 근접하여 형성되므로 플라즈마에 의한 기판의 손상이 적고 효율을 높일 수 있다는 장점이 있다. 또한, 여러 종류의 반응가스들이 상호 반응을 통하여 기판에 박막을 형성하게 되므로, 기판의 박막형성 영역 전체에서 반응가스가 균일하게 분사되어 균일한 플라즈마를 형성하는 것이 중요하며, 비교적 저온에서 박막을 형성하는 것이 가능하다.
상기 (4) 단계를 수행하기 위한 유도 결합형 플라즈마 화학기상 증착 장치를 도 3을 참조하여 구체적으로 설명하기로 한다. 도 3은 본 발명에 따른 패턴화된 세포 배양용 기판을 제조하기 위한 유도 결합형 플라즈마 화학기상증착 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3을 참조하여, 유도 결합형 플라즈마 화학기상 증착 장치의 구성을 구체적으로 살펴보면, 플라즈마가 형성되는 공간인 반응 챔버(Reactor)와, 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내부의 압력을 조절하기 위한 진공펌프(Rotary pump)를 포함하는 진공수단과, 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 상부에 배치된 외부전극과 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내부에 배치된 내부전극에 전압을 인가하기 위한 전력공급장치로 이루어져 있다. 플라즈마 반응 챔버(Reactor)는 그 내부에 기판 받침대와, 그 기판 받침대 하부에 배치되어 기판 받침대를 지지하는 내부전극이 장착되어 있다.
한편, 외부전극 및 내부전극은 일반적인 플라즈마 화학기상 장치에서 사용되는 전극이면 재질 및 형태에 특별한 제한 없이 사용될 수 있으나, 특히 외부전극의 경우 그 형태가 평판 원형코일 형태인 것이 바람직하고, 내부전극의 경우 그 재질이 화학적 반응이 없고, 오염이 적은 재질을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 스테인레스 재질로 이루어진 것을 사용하는 것이 바람직하다.
유도 결합형 플라즈마 화학기상증착 장치를 이용하여 반응가스를 처리하는 단계를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. 플라즈마 중합체층이 형성된 기판을 플라즈마 반응 챔버(Reactor)의 내부에 있는 기판 받침대 위에 설치한다. 그리고 일정한 형태의 패턴을 가지는 새도우 마스크를 상기 플라즈마 중합체층이 형성된 기판 위에 고정하였다. 이후, 진공펌프(Rotary pump)를 통해 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내부의 압력을 진공 상태에 가까운 수 미리토르로 낮춘 상태에서 가스 주입 수단과 샤워링을 통해 반응가스를 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 내로 주입한다. 이러한 상태에서 전력공급장치로 외부전극 및 내부전극에 전압을 인가하면, 외부전극 및 내부전극에 의해 생성된 반응가스 플라즈마들이 플라즈마 중합체층이 형성된 기판과 플라즈마 반응 챔버(Reactor) 사이에 형성된다. 이때, 생성된 플라즈마들은 새도우 마스크가 고정된 기판의 패턴 영역 표면의 성질을 변화시킬 수 있다.
이때, 외부전극 또는 내부전극 중 하나만을 단독으로 사용할 수도 있으나, 외부전극과 내부전극 모두를 사용하는 것이 패턴화된 세포 배양용 기판을 형성함에 있어서 보다 효율적 및 효과적이다. 또한, 플라즈마 반응 챔버(Reactor)의 전력공급장치의 전력으로서 외부전극에 가하는 전력은 50 W 내지 150 W를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 70 W 내지 100 W를 사용할 수 있다. 또한, 표면 개질 처리는 30초 내지 2분 동안 수행할 수 있으며, 바람직하게 1분 동안 수행할 수 있다.
이때 사용되는 상기 반응가스는 플라즈마 중합체층의 표면을 세포가 잘 흡착되는 성질을 가지도록 개질시킬 수 있는 것이면 어떤 것이든 제한되지 않으며, 예를 들어 수소 및 헬륨의 혼합가스를 사용할 수 있다. 반응가스로 수소 및 헬륨의 혼합가스를 사용하는 경우 바람직하게 이들의 혼합 비율은 부피 기준으로 1:9일 수 있다.
(5) 새도우 마스크를 기판으로부터 제거하는 단계
증착을 완료한 후, 새도우 마스크를 상기 기판으로부터 제거, 분리하여 패턴화된 세포 배양용 기판을 제조한다. 새도우 마스크의 제거는 물리적, 화학적인 방법을 이용하여 기판으로부터 분리할 수 있는 것이면 어느 방법이든 제한되지 않는다.
기판으로부터 새도우 마스크를 제거하게 되면 새도우 마스크를 올려놓은 후 수행한 반응가스의 처리 효과가 새도우 마스크의 패턴에 따라 나타나기 때문에 일정한 패턴을 가진 기판을 제조할 수 있다.
구체적으로 새도우 마스크의 패턴에 따라 (2) 단계에서 형성한 플라즈마 중합체층의 표면이 노출된 부분은 플라즈마를 이용한 반응가스의 처리에 따라 표면의 성질이 세포가 잘 흡착되도록 개질된다. 새도우 마스크로 표면이 덮혀있는 플라즈마 중합체층 부분의 경우, 반응가스의 처리효과가 새도우 마스크로 차단되기 때문에 새도우 마스크의 제거에 따라 (2) 단계에서 제조된 상태의 플라즈마 중합체층이 노출되게 된다.
이와 같은 방법으로 제조된 기판은 표면의 일정 패턴 영역에서는 세포흡착성, 그 외의 부분에는 세포억제성을 나타내기 때문에 패턴을 형성하는 부분에서만 세포가 부착, 배양할 수 있는 환경을 제공한다. 따라서, 상기 방법으로 패턴화된 세포 배양용 기판을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조한 패턴화된 세포 배양용 기판 상에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 패턴화된 배양방법을 제공한다.
상기 세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 간, 신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도(islet), 내장, 귀, 피부, 쓸개조직, 전립선, 방광, 배아(embryo), 면역계 및 조혈계 등으로부터 분리되거나 활성화할 수 있는 세포를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, 및 혈관내 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 혈관내피세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조한 패턴화된 세포 배양용 기판 상에 세포가 배양되어 있는 것을 특징으로 하는, 패턴화된 세포칩을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 '세포칩'이란 세포의 반응을 통해 세포에 의한 복합적인 생리 신호를 검출할 수 있는 바이오 칩을 의미한다. 상기 세포칩에 배양된 세포의 종류는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 패턴화된 세포칩을 이용하여 혈관신생 유도 또는 촉진 활성을 가지는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, '혈관신생'이란 세포가 기존의 혈관으로부터 출아하여 새로운 혈관을 형성하는 것을 의미하는 것으로 태생기에 있어서 발생, 분화나 여성의 성주기, 창상의 치유 등에 관계하는 생리적 현상이다. 상기 혈관신생은 Angiogenesis라고도 불리며 최근 고형 종양, 당뇨병성 망막증, 만성관절 류마티스병 또는 동맥경화증 등의 혈관신생병이라고 불리는 병리적 현상에 관여하여, 이러한 질병, 질환 등에서 혈관내피세포의 증식을 억제하는 것은 주된 치료적 타겟이 되고 있다.
본 발명에 따른 세포가 배양된 패턴화된 세포칩에, 혈관신생을 유도 또는 촉진할 것이 의심되거나 또는 잠재적인 가능성이 있다고 여겨지는 시험물질을 처리하여 세포의 증식 양상을 확인하면 간단하고 신속하게 상기 물질이 혈관신생 작용이 있는지를 평가할 수 있다.
구체적인 일 실험예에서, 패턴화된 세포칩을 제조하고 미처리, LPS 처리, 및 VEGF 처리를 한 경우, 혈관신생을 억제하는 효과를 가진 LPS 처리군은 미처리 군에 비하여 세포 수가 현저하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었고, 반면 VEGF를 처리한 군의 경우, 미처리군과 비교하여 세포들이 현저하게 증식하여 패턴화된 빈 공간에 튜브(tube)형 모양의 혈관을 형성하는 것을 확인할 수 있었다(도 6 및 7). 이로써, 기존의 Tube Formation 방법 등으로 혈관신생을 평가(Angiogenesis Assay)를 관찰하는 방법에 비하여 본 발명에 따른 세포칩은 보다 단축된 시간으로 간편하게 혈관신생 작용이 있는지를 평가할 수 있는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법은 하나의 전구체, 새도우 마스크 및 반응가스의 플라즈마 처리만으로 세포의 흡착과 세포 흡착의 억제 영역을 패턴을 형성하면서 구분시킬 수 있는 제조방법이다. 상기 제조방법은 단계가 간단할 뿐만 아니라, 제작된 기판에 원하는 영역에만 간단히 세포 배양이 가능하여, 다양한 세포칩 응용이 가능한 효과가 있다.
또한, 상기 제조방법에 따라 제조한 기판에 세포를 배양한 세포칩은 혈관신생을 평가하는 용도로 사용될 수 있으며, 시험물질의 처리로 간편하게 혈관신생 작용을 확인할 수 있으므로, 상기 패턴화된 세포칩을 이용하여 혈관신생을 촉진 또는 유도하는 물질을 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법의 개략도이다.
도 2는 기판 상에 플라즈마 중합체층 형성하기 위한 플라즈마 화학기상증착 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 반응가스를 처리하기 위한 유도 결합형 플라즈마 화학기상증착 장치를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 패턴화된 세포 배양용 기판에 세포를 배양하여 세포가 패턴을 형성하면서 배양되는 것을 확인한 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 패턴화된 세포 배양용 기판의 패턴 모식도로 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명에 따른 패턴화된 세포칩에, 미처리, VEGF 처리 및 LPS 처리를 한 후 혈관신생 작용을 평가한 것을 확인한 그림이다.
도 7은 본 발명에 따른 패턴화된 세포칩에, 미처리, VEGF 처리 및 LPS 처리를 한 후 혈관신생 작용을 정량화하여 그래프로 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조
1-1. 기판 상에 플라즈마 중합체층 형성
전구체 물질로 헥사메틸디실록산을 사용하여 플라즈마 화학기상 증착(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition) 시스템을 이용하여 박막을 증착하였다. 기판은 38 mm ×75 mm 크기의 유리 기판을 사용하였으며, 세척 후 챔버에 넣고 플라즈마 중합된 헥사메틸디실록산 박막(Plasma Polymerized Hexamethyldisiloxane, PPHMDSO)을 증착하였다.
구체적으로, 상기 증착은 도 2에 도시된 플라즈마 화학기상증착 시스템을 사용하여 수행되었다. 전구체로는 헥사메틸디실록산(HMDSO; Hexamethyldisiloxane)을 사용하였고, 사용된 글라스 기판은 세로와 가로가 각각 75×38 mm이고, 두께 0.96 내지 1.06 mm인 코닝사(Corning 2947)의 글라스 기판이다. 글라스 기판을 PE-CVD 반응 챔버 내부의 기판 받침대(Substrate Holder)에 올려놓은 뒤 제작을 진행하였다. Bubbler 안의 HMDSO 온도를 61℃로 가열하여 기화하고 챔버 안의 기본 압력은 로터리 펌프를 사용하여 수 mTorr 상태로 만든 후, 10 sccm의 Ar(99.99%) 가스를 버블링 가스로 사용하여 기화된 HMDSO를 챔버로 이동시켰다. RF (radio frequency) 플라즈마의 발생을 위해, 매칭박스(Matching Box)에 연결된 플라즈마 발생기(Plasma Generator)를 이용하여 SB (Substrate Bias) 플라즈마 파워(Plasma Power)를 10 W, 5분으로 플라즈마를 형성시켜 PPHMDSO 박막 기판을 제작하였다. 이때 RF 플라즈마 파워의 주파수는 13.56 MHz이고, 챔버 내부의 증착 압력은 500 mTorr로 일정하게 유지하였다. 이러한 방식으로 플라즈마 중합체층이 형성된 기판, 즉 플라즈마 중합된 헥사메틸디실록산 박막이 유리 슬라이드에 증착된 기판을 제조하였다.
1-2. 패터닝 새도우 마스크 고정 후, 플라즈마를 이용한 반응가스의 처리
1-1의 방법으로 HMDSO가 플라즈마 증착된 기판 상에 일정한 패턴을 가지는 금속 새도우 마스크를 고정하였다. 사용한 새도우 마스크는 패턴 사이의 간격이 300 ㎛ 및 400 ㎛ 인 것을 사용하였다. 상기 새도우 마스크가 고정된 기판을 챔버에 넣고 로터리 펌프를 통해 챔버의 진공을 수 미리토르로 유지하였다. 그 후, MFC (Mass Flow Controller)를 이용하여 수소(10%)/헬륨(90%) 가스 10 sccm을 공정 챔버 안의 샤워링을 통하여 유입시키고 상단에 설치된 ICP(inductively coupled plasma) 전력을 100 W, 압력을 200 밀리토르를 유지하여 1분 동안 플라즈마 처리로 표면을 개질하였다. 그 후, 새도우 마스크를 상기 기판으로부터 제거, 분리하여 패턴화된 세포 배양용 기판을 제조하였다.
1-3. 패턴화된 세포 배양의 확인
상기 1-2를 통하여 제작한 패턴화된 세포 배양용 기판에 내피세포를 배양하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과, 도 4에 나타나듯이 새도우 마스크에 의하여 표면이 개질되지 않은 PPHMDSO 영역은 세포의 흡착이 억제되었고, 반응가스의 처리로 개질된 패턴 부분은 세포의 흡착과 증식이 이루어진 것을 확인하였다. 이로써, 세포가 일정한 패턴을 형성하면서 배양되는, 패턴화된 세포칩을 제조할 수 있음을 확인하였다.
실험예 1: 제조한 패턴화된 세포 배양용 기판을 이용한 혈관신생 확인 시험( angiogenesis assay )
제작된 기판을 이용한 혈관신생 확인 시험에서는 BAEC (Bovine aortic endothelial cell)을 사용하였다. 오염을 방지하기 위하여 실시예 1-2에 따라 제조한 기판을 페트리 접시에 담아 시험 전 16시간 동안 자외선을 쬐였다.
상기 BAEC의 배양을 위하여 완전 배지(1×penicillin/streptomycine (WELGENE), 20% fetal bovine serum (FBS, WELGENE)이 포함된 low glucose DMEM (WELGENE)) 2 ㎖를 2.5×105 BAEC/㎖에 포함되도록 하여 분주한 다음 37℃, CO2 5% 조건의 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 완전 배지를 제거하고 하기 조건의 배지로 교환하였다.
- 미처리 플레이트(정상 대조군): 1×penicillin/streptomycin, 0.2% FBS가 포함된 low glucose DMEM 10 ㎖.
- LPS (lipopolysaccharide)-처리 플레이트(음성 대조군): 1×penicillin/streptomycin, 0.2% FBS, 100 ng/㎖의 LPS가 포함된 low glucose DMEM 10 ㎖.
- VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)-처리 플레이트(양성 대조군): 1×penicillin/streptomycin, 0.2% FBS, 100 ng/㎖의 VEGF가 포함된 low glucose DMEM 10 ㎖.
기판 위의 세포가 배양기 안에서 배지 증발로 인하여 건조되는 것을 막기 위하여 배지의 볼륨을 10 ㎖로 증가시켰으며, 양성 대조군(VEGF 처리 플레이트)의 효과를 보다 확실하게 확인하기 위하여 성장인자의 한 종류인 FBS의 농도를 0.2%로 줄인 starvation basic medium을 사용하였다. 배지를 교환한 후, 37℃ CO2 5%의 배양기에서 18시간 동안 배양하고, 기판에서 일어난 혈관신생 효과를 광학현미경으로 관찰하여 도 6 내지 7에 나타내었다.
그 결과, 도 6에 나타나듯이, 세 가지 조건(미처리, VEGF 처리, LPS 처리)에따라서 세포의 배양양상은 서로 다르게 나타났다. 미처리한 경우와 비교하여 LPS 처리를 한 경우, 혈관신생 작용이 저해되면서 더 적은 수의 세포수를 관찰할 수 있었으나, VEGF를 처리한 경우 혈관신생 작용이 촉진, 유도되면서, 미처리 군과 비교하여 훨씬 많은 수의 세포 수 및 튜브(tube)형으로 혈관을 신생하는 양태를 확인할 수 있었다. 또한, 도 7에 나타나듯이, 상기 세 가지 조건에 따라 혈관신생 평균치가 유의성있게 차이가 나는 것을 확인할 수 있으며, 이로부터 본 발명에 따른 패턴화된 세포칩은 혈관신생을 평가(angiogenesis assay)하는 기판으로 활용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

Claims (17)

  1. (1) 기판을 준비하는 단계;
    (2) 플라즈마를 이용하여 상기 기판 상에 전구체 물질을 집적시켜 플라즈마 중합체층을 형성하는 단계;
    (3) 상기 플라즈마 중합체층 상에 일정한 형태의 패턴을 가지는 새도우 마스크를 올려놓는 단계;
    (4) 상기 새도우 마스크가 올려진 기판 상에 노출된 중합체를 플라즈마를 이용하여 세포가 흡착되도록 개질하는 단계; 및
    (5) 상기 새도우 마스크를 기판으로부터 제거하는 단계를 포함하는 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 플라스틱, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전구체 물질은 헥사메틸디실록산(hexamethyldisiloxane), 옥타메틸트리실록산(octamethyltrisiloxane), 데카메틸테트라실록산(decamethyl tetrasiloxane), 헥사메틸사이클로트리실록산(hexamethylcyclotrisiloxane), 옥타메틸사이클로테트라실록산(octamethylcyclotetrasiloxane) 및 데카메틸사이클로펜타실록산(decamethylcyclopentasiloxane)의 실록산계 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계에서 플라즈마 중합체층은 플라즈마 화학기상 증착법(PE-CVD; Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition)을 이용하여 형성되는 것인, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 플라즈마 화학기상 증착은 5 내지 20 W의 전력으로 수행하는 것인, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계에서 일정한 형태의 패턴을 가지는 새도우 마스크는 패턴 사이의 간격이 100 내지 500 ㎛인 것인, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (4) 단계는 유도결합 플라즈마 화학기상 증착법(ICP-CVD; Inductively Coupled Plasma Chemical Vapor Deposition)을 이용하여 수행하는 것인, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (4) 단계는 수소 및 헬륨의 혼합가스를 사용하여 수행하는, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수소와 헬륨의 혼합 비율은 부피 기준으로 1:9인 것인, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 유도결합 플라즈마 화학기상 증착은 50 내지 150 W의 전력에서 수행하는 것인, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 유도결합 플라즈마 화학기상 증착은 30초 내지 2분 동안 수행하는 것인, 패턴화된 세포 배양용 기판의 제조방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조한 패턴화된 세포 배양용 기판.
  13. 제1항에 따른 방법으로 패턴화된 세포 배양용 기판을 제조하는 단계; 및
    상기 패턴화된 세포 배양용 기판 상에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 패턴화된 배양방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, 및 혈관세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 세포의 패턴화된 배양방법.
  15. 제1항에 따른 방법으로 제조된 패턴화된 세포 배양용 기판 상에 세포가 배양되어 있는 것을 특징으로 하는, 패턴화된 세포칩.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포는 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, 및 혈관세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 패턴화된 세포칩.
  17. 제15항에 따른 패턴화된 세포칩을 이용하여 혈관신생 유도 또는 촉진하는 활성을 가지는 물질을 스크리닝하는 방법.
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