JP2023509770A - 転写の調節可能な制御のための組成物及び方法 - Google Patents

転写の調節可能な制御のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2023509770000001
本開示は、転写因子系に関連する組成物及び方法を提供する。そのような系は、制御された転写活性によって駆動されるモジュラー及び調節可能なタンパク質発現を提供する。本開示は、制御された転写活性によって駆動される調節可能なタンパク質発現のための系、組成物及び方法に関する。本開示で提供されるのは、転写の制御及び制御された転写活性によって駆動される制御されたタンパク質発現に使用するためのモジュラー転写因子系、転写因子系のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、細胞、組成物、及び方法である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月８日出願の米国仮特許出願第６２／９５８，６９３号及び２０２０年１月１０日出願の米国仮特許出願第６２／９５９，８５９号の優先権の利益を主張する。上述した出願の内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。２０２１年１月８日に作成された、そのＡＳＣＩＩコピーは、２６８０５２＿４８３２６７＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２４１，８１５バイトのサイズである。
分野
本開示は、制御された転写活性によって駆動される調節可能なタンパク質発現のための系、組成物及び方法に関する。本開示で提供されるのは、転写の制御及び制御された転写活性によって駆動される制御されたタンパク質発現に使用するためのモジュラー転写因子系、転写因子系のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、細胞、組成物、及び方法である。
背景
遺伝子治療及び細胞療法は医学に革命をもたらし、これまでに難治性であった状態の処置に新たな可能性をもたらしている。しかしながら、現在のほとんどの技術では、標的タンパク質誘導のタイミングまたはレベルの用量設定ができない。これにより、多くの潜在的な遺伝子治療及び細胞療法の適用を安全かつ効果的に用いることが困難または不可能になっている。
不十分な外因性及び／または内因性遺伝子制御は、多くの遺伝子治療及び細胞療法の状況において重大な問題である。この調節可能性の欠如は、狭い、もしくは不確実な治療ウィンドウを有するタンパク質またはより用量設定された、もしくは一過性の発現を必要とするタンパク質を安全に発現させることも困難にする。
制御されたタンパク質発現または機能に対する１つのアプローチは、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）の使用である。薬物応答性ドメインは、目的の標的タンパク質に付加され得る小さなタンパク質ドメインである。ＤＲＤは、ＤＲＤ結合リガンドが存在しない場合、付加された目的のタンパク質を不安定にし、目的のタンパク質は、細胞のユビキチン－プロテアソーム系によって急速に分解される。しかしながら、特定の小分子ＤＲＤ結合リガンドがＤＲＤに結合する場合、付加された目的のタンパク質が安定化し、タンパク質機能が達成される。
ＤＲＤ技術は、遺伝子の発現及び機能を調節可能かつ一時的に制御できる新しいクラスの細胞療法及び遺伝子治療の基盤を形成し、細胞療法及び遺伝子治療のモダリティに安全かつ効果的に組み込まれ得るタンパク質治療の領域を広げる。しかしながら、現在のＤＲＤ技術では、目的のタンパク質がＤＲＤに結合されている融合タンパク質が生成されるため、一部の適応症には不適当な場合がある。したがって、目的の天然タンパク質が、制御された手法で発現され得る細胞療法及び遺伝子治療を開発することが依然として必要である。
概要
本発明は、改変細胞、核酸分子、ベクター、及び天然の治療用タンパク質のタイミングまたはレベルが、経口小分子薬の投与によって制御され得る細胞療法及び遺伝子治療を提供する。
さらに、本開示は、転写の調節可能な制御のための組成物、系及び方法を提供する。組成物は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写活性を誘導する転写因子系及び薬剤に関する。本開示によって提供される組成物は、転写因子系に関連する核酸分子、ポリペプチド、及び細胞を含む。本開示によって提供される転写因子系に関連する方法は、改変細胞を作製する方法及び疾患を処置または予防する方法を含む。
本明細書で提供されるのは、転写因子系である。本開示の転写因子系は、（１）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化できる転写因子をコードする１つ以上の核酸配列、（２）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列であって、転写因子、またはその一部がＤＲＤに機能的に連結されている核酸配列、及び（３）ペイロードをコードし、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドの組合せである。
本開示は、転写因子系に関連する改変細胞を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ペイロードの発現または転写を制御する可能性がある改変細胞を提供する。改変細胞は、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドを含む。転写因子活性化ドメイン、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、ＤＲＤに機能的に連結される。転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインは相互作用して、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると第４核酸配列の転写を活性化できる転写因子を形成し、第４核酸配列は目的のタンパク質をコードし、特定のポリヌクレオチド結合部位、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーター、またはその両方のいずれかに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、異種タンパク質である。いくつかの実施形態では、第４核酸配列は、第１ポリヌクレオチド上に位置する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの態様では、本開示は、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１核酸配列及び転写因子をコードする第２核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む改変細胞を提供する。転写因子はＤＲＤに機能的に連結され、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、目的のタンパク質をコードする第３核酸配列の転写を活性化でき、第３核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーター、またはその両方のいずれかに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、異種タンパク質である。いくつかの実施形態では、第３核酸配列は、第１核酸配列及び第２核酸配列を含むポリヌクレオチド上に位置する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、第３核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドをさらに含む。
別の態様では、本開示は、（ａ）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化できる転写因子をコードする第１核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドであって、転写因子、またはその一部がＤＲＤに機能的に連結されている第１ポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）目的のタンパク質をコードする第３核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドであって、その第３核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されている第２ポリヌクレオチドを含む改変細胞を提供する。
別の態様では、本開示は、（ａ）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して、目的のタンパク質をコードする第２核酸配列の転写を活性化できる転写因子をコードする第１核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、第２核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されているポリヌクレオチド、及び（ｂ）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列であって、転写因子がＤＲＤに機能的に連結されている第３核酸配列を含む改変細胞を提供する。
別の態様では、本開示は、（ａ）転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドであって、転写因子活性化ドメイン、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、ＤＲＤに機能的に連結されている第１ポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドであって、その第４核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されている第２ポリヌクレオチドを含む改変細胞を提供し、ここで転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインが相互作用して、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると転写を活性化できる転写因子を形成する。
別の態様では、本開示は、（ａ）転写因子活性化ドメインをコードする核酸配列を含む第１ポリヌクレオチド、（ｂ）外因性誘導性プロモーター上に位置する特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列を含む第２ポリヌクレオチド、及び（ｃ）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列を含む第３ポリヌクレオチドを含む改変細胞を提供し、ここで転写因子活性化ドメイン、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、ＤＲＤに機能的に連結される。一態様では、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインは相互作用し、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して目的のタンパク質をコードする核酸配列の転写を活性化できる転写因子を形成し、その核酸配列は、外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される。
様々な実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン及びＤＲＤのうち１つ以上が、親タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＨＤ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、及びＴＡＬからなる群から選択される親タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、転写因子活性化ドメインは親タンパク質に由来し、親タンパク質はｐ６５である。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＦＲ（ｅｃＤＨＦＲ）、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５を含む群から選択される親タンパク質に由来する。
いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドの存在下で安定化する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドに応答するか、またはそれと相互作用する。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、野生型タンパク質である。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、治療用タンパク質である。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、サイトカイン、抗体、またはその抗原結合断片、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、分泌タンパク質である。
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞、肝臓細胞、血液細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼細胞、筋細胞、または骨細胞である。
また本開示によって提供されるのは、転写因子系に関連する核酸分子である。
一態様では、本開示は、（ａ）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１核酸配列、及び（ｂ）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含む核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、（ｃ）転写因子活性化ドメインをコードする第３核酸配列をさらに含み、ここで（ｉ）転写因子ＤＮＡ結合ドメインがＤＲＤに機能的に連結されるか、（ｉｉ）転写因子活性化ドメインがＤＲＤに機能的に連結されるか、または（ｉｉｉ）転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインの組合せがＤＲＤに機能的に連結されるかのいずれかである。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＨＤ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、及びＴＡＬからなる群から選択される親タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、転写因子活性化ドメインは親タンパク質に由来し、その親タンパク質はｐ６５である。
一態様では、本開示は、（ａ）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化できる転写因子をコードする第１核酸配列、及び（ｂ）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含む核酸分子を提供し、ここで転写因子がＤＲＤに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、（ｃ）目的のタンパク質をコードする第３核酸配列をさらに含み、第３核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーター、またはその両方のいずれかに機能的に連結される。
いくつかの実施形態では、特定のポリヌクレオチド結合部位は、外因性誘導性プロモーター上に位置する。
いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５を含む群から選択される親タンパク質に由来する。
いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドの存在下で安定化する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドに応答するか、またはそれと相互作用する。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、野生型タンパク質である。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、治療用タンパク質である。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、分泌タンパク質である。
また本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される核酸分子を含むベクターである。本開示によって提供されるベクターとしては、プラスミドまたはウイルスベクターが挙げられる。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスに由来する。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される。
また本開示によって提供されるのは、転写因子系の１つ以上の構成要素をコードする核酸配列を含む第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドである。
一態様では、本開示は、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを提供し、第１ポリヌクレオチドは、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、転写因子活性化ドメイン、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、ＤＲＤに機能的に連結され、第２ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、第４核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結され、ここで転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインが相互作用して、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると転写を活性化できる転写因子を形成し、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、各々単一のベクターに担持されるか、または第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは別々のベクターに担持される。
一態様では、本開示は、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを提供し、第１ポリヌクレオチドは、転写因子をコードする第１核酸配列及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含み、ここで転写因子はＤＲＤに機能的に連結され、転写因子は、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると転写を活性化でき、第２ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする第３核酸配列を含み、第３核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結され、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、各々単一のベクターに担持されるか、または第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは別々のベクターに担持される。
いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５を含む群から選択される親タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドの存在下で安定化する。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、野生型タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、分泌タンパク質である。
また本開示によって提供されるのは、転写因子系に関連する方法である。
一態様では、本開示は、改変細胞を作製する方法を提供し、本方法は、（ａ）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１核酸配列、及び（ｂ）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含む核酸分子を細胞中に導入することを含む。一実施形態では、核酸分子は、転写因子活性化ドメインをコードする第３核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）転写因子ＤＮＡ結合ドメインがＤＲＤに機能的に連結されるか、（ｉｉ）転写因子活性化ドメインがＤＲＤに機能的に連結されるか、または（ｉｉｉ）転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインの組合せがＤＲＤに機能的に連結されるかのいずれかである。
いくつかの実施形態では、本方法は、目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を細胞中に導入することをさらに含み、その第４核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、異種タンパク質である。一実施形態では、第４核酸配列は、第１、第２及び第３核酸配列と同じ核酸分子上にある。一実施形態では、第４核酸配列は、第１、第２及び第３核酸配列とは異なる核酸分子上にある。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、サイトカイン、抗体、またはその抗原結合断片、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、分泌タンパク質である。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、プラスミドまたはウイルスベクターによって細胞中に導入される。一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスに由来する。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、非ウイルス送達方法によって細胞中に導入される。
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞、肝臓細胞、血液細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼細胞、筋細胞、または骨細胞である。
また本開示によって提供されるのは、疾患を処置または予防することに関連する方法である。
一態様では、本開示は、疾患の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、本方法は、（ａ）細胞集団を提供すること、（ｂ）細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に少なくとも１つの核酸分子を導入し、少なくとも１つの核酸分子が、（ｉ）転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドであって、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、ＤＲＤに機能的に連結されている第１ポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）疾患、またはその症状を予防または処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドであって、その第４核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されている第２ポリヌクレオチドを含むこと、（ｃ）細胞を対象に送達すること、ならびに（ｄ）転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つの発現を可能にするのに十分なほどＤＲＤを安定化させるリガンドを、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、細胞中で目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で対象に投与し、目的のタンパク質の発現が、対象においてリガンドの存在によって制御され、リガンド投与の量及び／または持続時間が、治療有効量の目的のタンパク質を生成するのに十分であることを含む。
一態様では、本開示は、疾患の処置または予防を必要とする対象中に改変細胞を導入する方法を提供し、本方法は、（ａ）細胞集団を提供すること、（ｂ）細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に少なくとも１つの核酸分子を導入し、少なくとも１つの核酸分子が、（ｉ）転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドであって、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、ＤＲＤに機能的に連結されている第１ポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドであって、第４核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されている第２ポリヌクレオチドを含むこと、ならびに（ｃ）細胞を対象に送達することを含む。
一態様では、本開示は、疾患の処置または予防を必要とする対象中に改変細胞を導入する方法を提供し、本方法は、（ａ）細胞集団を提供すること、（ｂ）少なくとも１つの核酸分子または上に列挙される態様のいずれかの第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを、細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入すること、ならびに細胞を対象に送達することを含む。
一実施形態では、本開示は、疾患の処置または予防を必要とする対象中において１つ以上の細胞を遺伝子改変する方法を提供し、本方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸分子を対象の少なくとも１つの細胞中に導入し、少なくとも１つの核酸分子が、（ｉ）転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドであって、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、細胞内での発現時にＤＲＤに機能的に連結されている第１ポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドであって、第４核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されている第２ポリヌクレオチドを含むことを含む。
一態様では、本開示は、疾患の処置または予防を必要とする対象中において１つ以上の細胞を遺伝子改変する方法を提供し、本方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸分子を対象の少なくとも１つの細胞中に導入し、少なくとも１つの核酸分子が、（ｉ）転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドであって、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、細胞内での発現時にＤＲＤに機能的に連結されている第１ポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドであって、第４核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されている第２ポリヌクレオチドを含むこと、ならびに（ｂ）転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つの発現を可能にするのに十分なほどＤＲＤを安定化させるリガンドを、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、細胞中で目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で対象に投与し、目的のタンパク質の発現が、対象においてリガンドの存在によって制御され、リガンド投与の量及び／または持続時間が、治療有効量の目的のタンパク質を生成するのに十分であることを含む。
一態様では、本開示は、疾患の処置を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、本方法は、（ａ）細胞集団を提供すること、（ｂ）第１核酸分子のうち少なくとも１つ及び第２核酸分子のうち少なくとも１つを、細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、（ｉ）第１核酸分子が、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、細胞内での発現時にＤＲＤに機能的に連結され、（ｉｉ）第２核酸分子が、疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、第４核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されていること、（ｃ）細胞を対象に送達すること、ならびに（ｄ）転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの発現を可能にするのに十分なほどＤＲＤを安定化させるリガンドを、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、細胞中で目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で対象に投与し、目的のタンパク質の発現が、対象においてリガンドの存在によって制御され、リガンド投与の量及び／または持続時間が、治療有効量の目的のタンパク質を生成するのに十分であることを含む。
一態様では、本開示は、疾患の処置を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、本方法は、（ａ）細胞集団を提供すること、（ｂ）第１核酸分子のうち少なくとも１つ及び第２核酸分子のうち少なくとも１つを、細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、（ｉ）第１核酸分子が、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、細胞内での発現時にＤＲＤに機能的に連結され、（ｉｉ）第２核酸分子が、疾患を予防及び／または処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、第４核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されていること、ならびに（ｃ）細胞を対象に送達することを含む。
関連する実施形態では、本開示は、疾患の予防及び／または処置を、それを必要とする対象において行う方法を提供する。本方法は、（ａ）細胞集団を提供すること、（ｂ）第１核酸分子のうち少なくとも１つ及び第２核酸分子のうち少なくとも１つを、細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入することを含む。本方法例では、第１核酸分子は、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む。転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、細胞内での発現時にＤＲＤに機能的に連結され、第２核酸分子は、疾患の予防及び／または処置を、それを必要とする対象において行う目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む。第４核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される。本方法はまた、（ｃ）細胞を対象に送達するステップ、ならびに（ｄ）転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの発現を可能にするのに十分なほどＤＲＤを安定化させるリガンドを、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、細胞中で目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で対象に投与するステップを含む。本方法例では、目的のタンパク質の発現は、対象においてリガンドの存在によって制御され、リガンド投与の量及び／または持続時間は、治療有効量の目的のタンパク質を生成するのに十分である。
関連する実施形態では、本開示の処置及び予防の方法は、単一のベクターを細胞中に導入することによって達成され得、ここでベクターは第１核酸分子及び第２核酸分子を担持し、（ｉ）第１核酸分子は、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、転写因子活性化ドメイン及び／または転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、細胞内での発現時にＤＲＤに機能的に連結され、第２核酸分子は、疾患を処置または予防する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、第４核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される。
いくつかの代替実施形態では、本開示の処置及び予防の方法は、第１ベクター及び第２ベクターを細胞中に導入することによって達成され得、第１ベクターは、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、転写因子活性化ドメイン及び／または転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、細胞内での発現時にＤＲＤに機能的に連結され、第２ベクターは、疾患を予防及び／または処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、第４核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、プラスミドまたはウイルスベクターによって細胞中に導入される。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスに由来する。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、非ウイルス送達方法によって細胞中に導入される。
また本開示によって提供されるのは、細胞中における目的のタンパク質の調節可能な発現のための系であり、本系は、（ａ）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に連結される転写因子をコードする第１ポリヌクレオチドであって、転写因子が、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を選択的に転写する第１ポリヌクレオチド、（ｂ）目的のタンパク質をコードする核酸配列の上流に隣接して配置された外因性転写因子結合部位を含む第２ポリヌクレオチド、（ｃ）第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に安定に組み込むような条件下で、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを細胞中に導入すること、（ｄ）ＤＲＤを安定化させるリガンドを添加することによって転写因子の発現を調節することを含み、ここで転写因子は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の上流に隣接して配置された転写因子結合部位に特異的に結合し、目的のタンパク質の発現は、細胞中に存在する転写因子の量によって制御される。
本開示はまた、本明細書に記載される組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
転写因子系設計スキームの略図を示す。Ａは、「ＤＲＤ－ＴＦ構築物」と称される、転写因子構築物の概略図を示し、本構築物は、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列を含む。Ｂは、ペイロード構築物の概略図を示し、本構築物は転写因子ＤＮＡ結合ドメインに対する結合部位を含む誘導性プロモーターを含む。 異なるＤＲＤを有する、ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド依存性活性を示す。Ａは、非トランスフェクト（「ｍｏｃｋ」）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び構成的転写因子をコードする構築物（構築物ＺＦＨＤ－０５５、「Ｃｏｎｓ．」）またはＣＡ２、ｅｃＤＨＦＲ、ＥＲ、もしくはｈＤＨＦＲ親タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結された転写因子をコードする構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。各構築物及びリガンド処理条件の詳細は、表４及び表６で提供される。ウェスタンブロットの上部パネルは、内因性ｐ６５、ＤＲＤ－ＴＦ構築物の各々によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチド、ならびに構成的構築物ＺＦＨＤ－０５５によってコードされる転写因子ポリペプチドのバンドを示す。Ｂは、図２Ａのウェスタンブロットの定量化を示し、構成的条件を１．０に設定して正規化している。 ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド依存性活性を示す。Ａは、転写因子構築物ＺＦＨＤ－００５の概略図を示す。Ｂは、ペイロード構築物ＺＦＨＤ－００７の概略図を示す。Ｃは、構成的転写因子構築物ＺＦＨＤ－００４の概略図を示す。Ｄは、１０μＭ ＴＭＰまたは０．１％ＤＭＳＯで処理した、示される構築物を安定に組み込んだＵ２ＯＳ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。およそ６０ｋＤａで現れているバンドは、内因性ｐ６５を表す。およそ４４．３ｋＤａで現れているバンドは、転写因子構築物ＺＦＨＤ－００５によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドを表す。およそ２６．５ｋＤａで現れているバンドは、構築物ＺＦＨＤ－００４によってコードされる転写因子ポリペプチドを表す。Ｅは、１０μＭ ＴＭＰまたは０．１％ＤＭＳＯで処理した、示される構築物を安定に組み込んだＵ２ＯＳ細胞上でのフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンドに対する用量反応を示す。Ａは、ＤＭＳＯまたは表示濃度のＴＭＰで処理した、構築物ＺＦＨＤ－００５及びＺＦＨＤ－００７を安定に組み込んだＵ２ＯＳ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。「Ｕ２ＯＳ」とラベル付けしたレーンは、ＴＭＰで処理した非形質導入Ｕ２ＯＳ細胞を表す。およそ６０ｋＤａで現れているバンドは、内因性ｐ６５を表す。およそ４４．３ｋＤａで現れているバンドは、転写因子構築物ＺＦＨＤ－００５によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドを表す。Ｂは、図４Ａのウェスタンブロットにおいて示される「ＺＦＨＤ－００５ポリペプチド」バンドの定量化を示す。蛍光を、内因性ｐ６５を基準として正規化している。Ｃは、表示濃度のＴＭＰで処理した、安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－００５及びＺＦＨＤ－００７を有するＵ２ＯＳ細胞上でのフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図４Ｃで使用したＴＭＰの最高濃度は、３３μＭである。示したデータは、３回反復している。エラーバーは、標準偏差を表す。 Ｔ細胞中におけるｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド依存性活性を示す。Ａは、ＴＭＰまたはＤＭＳＯで処理した、非形質導入Ｔ細胞またはウイルス（ＯＴＬＶ－ＺＦＨＤ－００５もしくはＯＴＬＶ－ＺＦＨＤ－００７）で形質導入したＴ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。およそ６０ｋＤａで現れているバンドは、内因性ｐ６５を表す。およそ４４．３ｋＤａで現れているバンド（矢印で示されている）は、転写因子構築物ＺＦＨＤ－００５によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドを表す。Ｂは、ＴＭＰまたはＤＭＳＯで処理した、非形質導入Ｔ細胞または示される構築物から作製したウイルスで形質導入したＴ細胞のフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。示したデータは、３回反復している。エラーバーは、平均値からの標準偏差を表す。 ＡＲＰＥ－１９細胞中におけるＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド依存性活性を示す。Ａは、転写因子構築物ＺＦＨＤ－０１９の概略図を示す。Ｂは、１０μＭ ＡＣＺまたは１％ＤＭＳＯで処理した、非形質導入ＡＲＰＥ－１９細胞または安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－０１９及びＺＦＨＤ－００７を有するＡＲＰＥ－１９細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。およそ６０ｋＤａで現れているバンドは、内因性ｐ６５を表す。およそ５５．８ｋＤａで現れているバンドは、転写因子構築物ＺＦＨＤ－０１９によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドを表す。Ｃは、図６Ｂのウェスタンブロットにおいて示される「ＺＦＨＤ－０１９ポリペプチド」バンドの定量化を示す。蛍光を、内因性ｐ６５を基準として正規化している。Ｄは、非形質導入ＡＲＰＥ－１９細胞あるいは未処理または１０μＭ ＡＣＺもしくは１％ＤＭＳＯで処理したいずれかの、示される構築物を安定に組み込んだＡＲＰＥ－１９細胞のフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。示したデータは、３回反復している。エラーバーは、平均値からの標準偏差を表す。グラフ上に示した非形質導入ＡＲＰＥ－１９細胞及び構築物ＺＦＨＤ－００７を安定に組み込んだＡＲＰＥ－１９細胞をＤＭＳＯで処理した。 ＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンドに対する用量反応を示す。Ａは、表示濃度のＡＣＺで処理した、安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－００７及びＺＦＨＤ－０１９を有するＡＲＰＥ－１９細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。およそ６０ｋＤａで現れているバンドは、内因性ｐ６５を表す。およそ５５．８ｋＤａで現れているバンドは、転写因子構築物ＺＦＨＤ－０１９によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドを表す。Ｂは、図７Ａのウェスタンブロットにおいて示される「ＺＦＨＤ－０１９ポリペプチド」バンドの定量化を示す。蛍光を、内因性ｐ６５バンドを基準として正規化している。 ＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンドに対する用量反応を示す。グラフは、表示濃度のＡＣＺで処理した、構築物ＺＦＨＤ－００７及びＺＦＨＤ－０１９を安定に組み込んだＵ２ＯＳ細胞のフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。示したデータは、２回反復している。エラーバーは、標準偏差を表す。 Ｊｕｒｋａｔ細胞中におけるＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド依存性活性を示す。Ａは、転写因子構築物ＺＦＨＤ－０４８の概略図を示す。Ｂは、ペイロード構築物ＺＦＨＤ－０２２の概略図を示す。Ｃは、ＤＭＳＯ（０．１％）またはＡＣＺ（１０μＭの最終濃度）で処理した、構築物ＺＦＨＤ－０４８及びＺＦＨＤ－０２２を安定に組み込んだＪｕｒｋａｔ細胞上でのフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。提示したデータは、形質導入マーカーが陽性であった細胞に関するものである。 ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む単一ベクターの転写因子系のリガンド依存性活性を示す。構築物ＺＦＨＤ－０１２の概略図を示す。 ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む単一ベクターの転写因子系のリガンド依存性活性を示す。構築物ＺＦＨＤ－０１８の概略図を示す。 ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む単一ベクターの転写因子系のリガンド依存性活性を示す。示される構築物から作製したレンチウイルスで形質導入し、１０μＭ ＴＭＰまたは０．１％ＤＭＳＯで処理したＵ２ＯＳ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。およそ４４．３ｋＤａで現れているバンドは、示される構築物によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドを表す。単一ベクター構築物では、ＥＧＦＰ配列の最後に終止コドン及び転写因子－ＤＲＤ配列の最後に終止コドンが存在するため、転写因子及びＤＲＤポリペプチドを表すおよそ４４．３ｋＤａのバンドが得られる。 ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む単一ベクターの転写因子系のリガンド依存性活性を示す。示される構築物から作製したレンチウイルスで形質導入し、１０μＭ ＴＭＰまたは０．１％ＤＭＳＯで処理したＵ２ＯＳ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。およそ４４．３ｋＤａで現れているバンドは、示される構築物によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドを表す。単一ベクター構築物では、ＥＧＦＰ配列の最後に終止コドン及び転写因子－ＤＲＤ配列の最後に終止コドンが存在するため、転写因子及びＤＲＤポリペプチドを表すおよそ４４．３ｋＤａのバンドが得られる。 ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む単一ベクターの転写因子系のリガンド依存性活性を示す。示される構築物から作製したレンチウイルスで形質導入し、１０μＭ ＴＭＰまたは０．１％ＤＭＳＯで処理したＵ２ＯＳ細胞のフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む単一ベクターの転写因子系のリガンド依存性活性を示す。示される構築物から作製したレンチウイルスで形質導入し、１０μＭ ＴＭＰまたは０．１％ＤＭＳＯで処理したＵ２ＯＳ細胞のフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 ＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む単一ベクターの転写因子系のリガンド依存性活性を示す。Ａは、構築物ＺＦＨＤ－０３６として示される、単一ベクター系の概略図を示す。Ｂは、示される構築物から作製したレンチウイルスで形質導入し、１０μＭ ＡＣＺまたは０．１％ＤＭＳＯで処理したＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。グラフ上のＺＦＨＤ－０３６．１及びＺＦＨＤ－０３６．２は２つの細胞株を表し、各々が構築物ＺＦＨＤ－０３６から作製したレンチウイルスで形質導入されている。 転写因子構築物のバリアントを含む転写因子系のリガンド依存性活性を示す。Ａは、転写因子構築物バリアントの概略図を示す。Ｂは、０．１％ＤＭＳＯまたは１０μＭ ＴＭＰのいずれかで処理した、示される構築物を安定に組み込んだＵ２ＯＳ細胞上でのフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 転写因子構築物のバリアントを含む転写因子系のリガンド応答時間経過分析を示す。グラフは、示される時間で０．１％ＤＭＳＯまたは１０μＭ ＴＭＰのいずれかを用いて処理した、示される構築物を安定に組み込んだＵ２ＯＳ細胞のフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 ペイロード構築物のバリアントを含む転写因子系のリガンド依存性活性を示す。Ａは、ペイロード構築物ＺＦＨＤ－００７の概略図を示す。Ｂは、ペイロード構築物ＺＦＨＤ－０１７の概略図を示す。Ｃ～Ｄは、０．１％ＤＭＳＯまたは１０μＭ ＴＭＰのいずれかで処理した、示される構築物を安定に組み込んだＵ２ＯＳ細胞上でのフローサイトメトリーによって評価されるようなＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 分泌ＩＬ１２ペイロードをコードするペイロード構築物を含む転写因子系のリガンド依存性活性を示す。グラフは、０．１％ＤＭＳＯまたは１０μＭ ＴＭＰのいずれかで処理した、示される構築物を安定に組み込んだＵ２ＯＳ細胞から収集した上清中における分泌ＩＬ１２の濃度を示す。 親ＣＡ２タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結されている異なる転写因子のリガンド依存性制御を示す。非トランスフェクト（「ｍｏｃｋ」）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び次の構築物：（１）ｃｊｕｎ－００１（「００１」）、（２）ｃｊｕｎ－００２（「００２」）、または（３）ｃｊｕｎ－００３（「００３」）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。ＤＭＳＯまたはＡＣＺで処理した後（「＋」記号によって示される）の各構築物トランスフェクト細胞集団が示されている。ラベル付けされているバンド「ｃ－Ｊｕｎ－００１及び－００２ポリペプチド」は、ｃｊｕｎ－００１及びｃｊｕｎ－００２構築物によってコードされるＣＡ２－リンカー－Ｃ－ｊｕｎポリペプチドを識別する。ラベル付けされているバンド「ｃ－Ｊｕｎ－００３ポリペプチド」は、構築物ｃｊｕｎ－００３によってコードされるｃ－Ｊｕｎポリペプチドを識別する。 親ＣＡ２タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結されている異なる転写因子のリガンド依存性制御を示す。図１６Ａのウェスタンブロットの定量化を示す。 親ＣＡ２タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結されている異なる転写因子のリガンド依存性制御を示す。非トランスフェクト（「ｍｏｃｋ」）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び次の構築物：（１）ＦＯＸＰ３－０１３（「０１３」）、（２）ＦＯＸＰ３－０１４（「０１４」）、または（３）ＦＯＸＰ３－０１５（「０１５」）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。ＤＭＳＯまたはＡＣＺで処理した後（「＋」記号によって示される）の各構築物トランスフェクト細胞集団が示されている。ラベル付けされているバンド「ＦＯＸＰ３－０１３及び－０１４ポリペプチド」は、ＦＯＸＰ３－０１３及びＦＯＸＰ３－０１４構築物によってコードされるＣＡ２－ＦＯＸＰ３ポリペプチドを識別する。ラベル付けされているバンド「ＦＯＸＰ３－０１５ポリペプチド」は、構築物ＦＯＸＰ３－０１５によってコードされるＦＯＸＰ３ポリペプチドを識別する。 親ＣＡ２タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結されている異なる転写因子のリガンド依存性制御を示す。図１６Ｃのウェスタンブロットの定量化を示す。 Ｊｕｒｋａｔ細胞中に安定に組み込まれたｃ－Ｊｕｎ転写因子構築物のリガンド依存性制御を示す。Ａは、非形質導入（「ｍｏｃｋ」）Ｊｕｒｋａｔ細胞ならびに構築物ｃｊｕｎ－００１（「００１」）及びｃｊｕｎ－００２（「００２」）から作製したレンチウイルスで形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。ＤＭＳＯまたはＡＣＺで処理した後（「＋」記号によって示される）の各構築物形質導入細胞株が示されている。ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及びリン酸化ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのバンドが示されている。Ｂは、図１７Ａのウェスタンブロットの定量化を示す。 図１８は、ｐＥＬＤＳ－ｐｕｒｏ導入ベクター（配列番号：６８）のヌクレオチド配列を示す。 図１８は、ｐＥＬＤＳ－ｐｕｒｏ導入ベクター（配列番号：６８）のヌクレオチド配列を示す。 図１９は、ｐＥＬＮＳ－ｐｕｒｏ導入ベクター（配列番号：６９）のヌクレオチド配列を示す。 図１９は、ｐＥＬＮＳ－ｐｕｒｏ導入ベクター（配列番号：６９）のヌクレオチド配列を示す。
詳細な説明
転写因子系
本開示によれば、転写因子系は、（１）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化することができる転写因子をコードする１つ以上の核酸配列、（２）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列であって、転写因子がＤＲＤに機能的に連結されている核酸配列、及び（３）ペイロードをコードし、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドの組合せである。
いくつかの実施形態では、転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せが、細胞、例えば、疾患の処置に有用な免疫細胞を改変し、目的のペイロードまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチド（複数可）に対して作用する転写因子の存在を制御することによって、目的のタンパク質の発現を調節可能にするための系を作製するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せは、転写因子をコードする第１核酸配列及びＤＲＤをコードする第２核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。
本開示はまた、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドも提供し、第１ポリヌクレオチドは、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む。本例では、転写因子活性化ドメイン、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、本明細書で例示されるＤＲＤに機能的に連結される。第２ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、第４核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される。本例では、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインが相互作用して、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると転写を活性化できる転写因子を形成し、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、各々単一のベクターに担持されるか、または第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは別々のベクターに担持される。
関連する例では、本開示は、転写を制御するように作動可能な組成物及び核酸を提供する。例えば、本開示は、調節可能な転写因子系の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを提供する。第１ポリヌクレオチドは、転写因子をコードする第１核酸配列及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含み、転写因子はＤＲＤに機能的に連結され、転写因子は、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると転写を活性化できる。第２ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする第３核酸配列を含み、第３核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結され、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、各々単一のベクターに担持されるか、または第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは別々のベクターに担持されるようにする。
いくつかの実施形態では、転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せは、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１核酸配列、転写因子活性化ドメインをコードする第２核酸配列、及びＤＲＤをコードする第３核酸配列を含む。いくつかの態様では、転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せは、第１、第２及び第３核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せは、第１、第２及び第３核酸配列のうち２つを含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せは、第１核酸配列を含む第１ポリヌクレオチド、第２核酸配列を含む第２ポリヌクレオチド、及び第３核酸配列を含む第３ポリヌクレオチドを含む。一態様では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＲＤに機能的に連結される。別の態様では、転写因子活性化ドメインが、ＤＲＤに機能的に連結される。別の態様では、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインの両方が、ＤＲＤに機能的に連結される。いくつかの態様では、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインは、転写因子融合タンパク質として発現される。
本開示によれば、転写因子系は、ペイロードの発現を駆動し得る転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、転写因子は、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列及び特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列によってコードされる。転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインは相互作用して、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合するとペイロードをコードする核酸配列の転写を活性化する転写因子を形成する。
いくつかの実施形態では、特定のポリヌクレオチド結合部位は、転写因子ＤＮＡ結合ドメインによって認識され、結合される特定の配列を有する少なくとも１つの核酸部位を含む。いくつかの実施形態では、特定のポリヌクレオチド結合部位は、本開示のＤＮＡ結合ドメインによって認識される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０の核酸部位を含む。いくつかの実施形態では、特定のポリヌクレオチド結合部位は、ＤＮＡ結合ドメインによって認識される８つの核酸部位を含む。いくつかの実施形態では、特定のポリヌクレオチド結合部位は、転写因子ＤＮＡ結合ドメインによって認識され、結合される特定の配列を各々が有する２つ以上のタンデム核酸部位を含む。いくつかの態様では、タンデム核酸部位は、同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、特定のポリヌクレオチド結合部位は、本開示のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるタンデムリピート核酸部位を含む。
本明細書に記載されるように、転写因子またはその一部は、本開示の転写因子系においてＤＲＤに機能的に連結される。ＤＲＤに結合するか、またはそれと相互作用するリガンドの存在、欠如または量は、そのような結合または相互作用の際に、転写因子の安定性、結果的に転写因子の機能を調節し得る。したがって、転写因子系は、リガンド依存性活性を示し得る。
いくつかの実施形態では、転写因子系は、細胞または細胞集団中に存在する。いくつかの実施形態では、転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドは、細胞または細胞集団中に導入される。
転写因子系構築物
転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せはまた、本明細書では１つ以上の核酸構築物の組合せと称されてよい。ポリヌクレオチドまたは核酸構築物は、ポリヌクレオチドまたは核酸構築物の得られた組合せが、（１）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化できる転写因子をコードする１つ以上の核酸配列、（２）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列であって、転写因子がＤＲＤに機能的に連結されている核酸配列、及び（３）ペイロードをコードし、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含む限り、核酸配列の異なる配置を含んでよい、及び／または転写因子系の一部として特有の形で組み合わされてよい。
いくつかの実施形態では、転写因子系は、複数の構築物を含む。いくつかの実施形態では、転写因子系は、転写因子構築物及びペイロード構築物を含む。一態様では、転写因子構築物は、転写因子をコードする核酸配列を含む。一態様では、転写因子構築物は、転写因子活性化ドメインをコードする核酸配列及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、転写因子系は、単一の構築物を含む。単一の構築物は、転写因子系の転写因子、ＤＲＤ、及びペイロードをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような単一構築物転写因子系は、プラスミドまたはベクターなどの単一の核酸分子上にある状態で細胞中に導入されてよい。単一の構築物を含む転写因子系は、本明細書では単一ベクター転写因子系と称されてよい。
転写因子系について本明細書に記載される核酸配列を含むことに加えて、本開示の核酸構築物は、追加の核酸配列を含んでよい。構築物の追加の核酸配列としては、調節エレメント、ポリアデニル化配列、リンカー、及び切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、転写因子構築物は、プロモーター、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及びＤＲＤをコードする核酸配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤをコードする核酸配列は、転写因子ドメインのうち少なくとも１つをコードする核酸配列に隣接している。いくつかの実施形態では、ＤＲＤをコードする核酸配列は、転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列と転写因子活性化ドメインをコードする核酸配列との間に配置される。
いくつかの実施形態では、転写因子構築物は、プロモーター、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、リンカー、及びＤＲＤをコードする核酸配列を含んでよい。いくつかの態様では、リンカーは、転写因子ドメインをコードする核酸配列とＤＲＤをコードする核酸配列との間に配置される。
いくつかの実施形態では、転写因子構築物中のプロモーターは、ＥＦ１ａである。いくつかの実施形態では、転写因子構築物中のコードされた転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＨＤ１である。いくつかの実施形態では、転写因子構築物中のコードされた転写因子活性化ドメインは、ｐ６５である。
いくつかの実施形態では、ペイロード構築物は、転写因子ＤＮＡ結合ドメインによって認識され、結合される特定の配列を有する少なくとも１つの核酸部位を含む特定のポリヌクレオチド結合部位、プロモーター、及びペイロードをコードする核酸配列を含んでよい。例示的な結合部位は、ＺＦＨＤ１ ＤＮＡ結合ドメインによって認識される８つの核酸部位を含む。
いくつかの実施形態では、転写因子構築物またはペイロード構築物などの本開示の構築物は、プラスミドまたはウイルスベクター中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、プラスミドまたはウイルスベクターは、プラスミドまたはウイルスベクター中に組み込まれる構築物の１つ以上の構成要素に機能的に連結されるようになる１つ以上の調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドまたはウイルスベクターは、例えば、プロモーター、イントロン、スペーサー、スタッファー配列などを含む、当該技術分野において周知の調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、転写因子構築物は、転写因子構築物の構成要素がプラスミドまたはウイルスベクターの調節エレメントに機能的に連結されるように、プラスミドまたはウイルスベクター中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、そのような転写因子構築物は、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及びＤＲＤをコードする核酸配列を含み、プラスミドまたはウイルスベクター中のプロモーター配列が、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及びＤＲＤの発現を駆動するように、プラスミドまたはウイルスベクター中に組み込まれる。そのようなプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、細胞分化特異的プロモーター、及び／または疾患特異的プロモーターから選択されてよい。場合により、プロモーターは、ＥＦ１ａ、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＲＳＶ、ＳＦＦＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、及びＳＶ４０から選択されてよい。
転写因子系の構成要素
上に記載される通り、転写因子系のポリヌクレオチドまたは核酸構築物は、ポリヌクレオチドまたは核酸構築物の得られた組合せが、（１）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化できる転写因子をコードする１つ以上の核酸配列、（２）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列であって、転写因子がＤＲＤに機能的に連結されている核酸配列、及び（３）ペイロードをコードし、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含む限り、核酸配列の異なる配置を含んでよい、及び／または転写因子系の一部として特有の形で組み合わされてよい。このように、転写因子系はモジュラー系であり、転写因子系の各構成要素は別個に選択され得る。
薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列は、以下の「薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）」節でより詳細に記載されるＤＲＤの配列から選択されてよい。
転写因子をコードする１つ以上の核酸配列は、既存の転写因子、既存の転写因子に由来している操作された転写因子、またはＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインを含む操作された転写因子をコードする１つ以上の配列から選択されてよい。本明細書で使用される場合、「既存の転写因子に由来している操作された転写因子」は、少なくとも部分的に親（天然）転写因子分子または配列に由来し、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化する能力を保持する操作された転写因子を指す。例えば、操作された転写因子は、ＤＮＡとの配列特異的接触が可能な１つ以上のジンクフィンガードメインを含む親転写因子に由来してよい。操作されたＴＡＬエフェクター転写因子は、特定のＤＮＡ結合部位、哺乳動物核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び合成転写活性化ドメインを認識するＴＡＬエフェクター反復領域を含むように設計されてよい。転写因子が、ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインを含む操作された転写因子である場合、ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインの両方が別々に選択され、組み合わされて完全な転写因子を形成してよい。
転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、既存の核酸結合タンパク質に由来してよい。例えば、既存のＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合配列またはドメインは、本開示の転写因子ＤＮＡ結合ドメインとして使用されてよいか、またはそれを生成するためにさらに改変されてよい。
いくつかの態様では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＨＤ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、及びＴＡＬからなる群から選択される親タンパク質に由来する。
いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＨＤ１親タンパク質に由来する。ＺＦＨＤ１は、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２６７，ｎｏ．５１９４，１９９５）によって設計されたジンクフィンガー－ホメオドメイン融合タンパク質である。ＺＦＨＤ１は、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ａｒｇ－ａｒｇリンカー、ならびにＯＣＴ－１ホメオドメインを含む。ＺＦＨＤ１は、配列ＴＡＡＴＧＡＴＧＧＧＣＧ（配列番号：７０）を含む核酸配列に結合し得る。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＨＤ１のアミノ酸配列からなるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、標的遺伝子及びそれらの対応する機能性タンパク質（例えば、ペイロードまたは目的のタンパク質）を、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ系を使用して制御する方法を提供する。当業者は、本明細書に記載されるような標的遺伝子を含む標的核酸との共局在化複合体を形成するための好適なガイドＲＮＡを設計できることになると理解されるべきである。
様々なＣａｓタンパク質が当業者には既知であり、これらのタンパク質としては、ＣａｓＩ（Ｃａｓ３）、ＣａｓＩＡ（Ｃａｓ８ａ）、ＣａｓＩＢ（Ｃａｓ８ｂ）、ＣａｓＩＣ（Ｃａｓ８ｃ）、ＣａｓＩＤ（Ｃａｓ１０ｄ）、ＣａｓＩＥ（Ｃｓｅ１）、ＣａｓＩＦ（Ｃｓｙ１）、ＣａｓＩＵ、ＣａｓＩＩ（Ｃａｓ９）、ＣａｓＩＩＡ（Ｃｓｎ２）、ＣａｓＩＩＢ（Ｃａｓ４）、ＣａｓＩＩＣ、ＣａｓＩＩＩ（Ｃａｓ１０）、ＣａｓＩＩＩＡ（Ｃｓｍ２）、ＣａｓＩＩＩＢ（Ｃｍｒ５）、ＣａｓＩＩＩＣ、ＣａｓＩＩＢＤ、ＣａｓＩＶ（Ｃｓｆ１）、ＣａｓＩＶＡ、ＣａｓＩＶＢ、ＣａｓＶ（Ｃｐｆ１）、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ１などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとも称される）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４からなる群から選択されるＣａｓタンパク質に由来する。
一態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９に由来する天然に存在するＣａｓ９について記載されるような配列及びそれらと少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の相同性を有し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質であるタンパク質配列を含む。
一態様によれば、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ種、またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種に由来する天然に存在するＣａｓ１２について記載されるような配列及びそれらと少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の相同性を有し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質であるタンパク質配列を含む。
いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、親Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質などの親Ｃａｓタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠くように改変されているＣａｓ９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠くように改変されているＣａｓ１２であるか、またはそれを含む。
天然に存在するＣａｓ９は、ガイドＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ鎖（標的鎖）を切断するＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、及び相補鎖の反対側のＤＮＡ鎖（非標的鎖）を切断するＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインの２つのヌクレアーゼドメインを含む。ＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの両方を変異させる（いわゆる「デッドＣａｓ９」または「ｄＣａｓ９」をもたらす）ことによって、得られたｄＣａｓ９は、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化能力を保持するが、そのエンドヌクレアーゼ活性を失う。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、変異したＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含むｄＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、変異したＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含むｄＣａｓ９であり、親Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９に由来する。
天然に存在するＣａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂ）は、ＤＮＡを切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを変異させることによって、触媒的に死んだＣａｓ１２（ＤＮａｓｅ活性の不活性化を有し、本明細書では「ｄＣａｓ１２」とも称される）は、親Ｃａｓ１２タンパク質から得られる場合がある。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、触媒的に死んだＣａｓ１２（ｄＣａｓ１２）であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＩＩ型Ｃａｓホモログである親タンパク質に由来する。Ｃａｓ９は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質の一例である。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠くか、またはヌクレアーゼ活性を欠くように改変されているＩＩ型Ｃａｓホモログであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、変異したＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含むＩＩ型Ｃａｓホモログであるか、またはそれを含む。
例示的実施形態においては、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を不活性化するように変化またはさもなければ改変されている。そのような変化または改変は、ヌクレアーゼ活性またはヌクレアーゼドメインを不活性化するように１つ以上のアミノ酸を変化させることを含む。そのような改変は、ヌクレアーゼ活性を示すポリペプチド配列（複数可）、すなわちヌクレアーゼドメインを除去することを含み、ヌクレアーゼ活性を示すポリペプチド配列（複数可）、すなわちヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓ９ ＤＮＡ結合タンパク質には存在しなくなるようにする。ヌクレアーゼ活性を不活性化するための他の改変は、当業者には容易に明らかとなる。したがって、ヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を不活性化するように改変されたポリペプチド配列またはヌクレアーゼ活性を不活性化するためにポリペプチド配列（複数可）の除去を含む。ヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されていても、ＤＮＡに結合する能力を保持する。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合に必要なポリペプチド配列（複数可）を含むが、ヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列のうち１つ以上または全てを欠く場合がある。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１を参照のこと。ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼヌルＣａｓ９（「Ｃａｓ９Ｎｕｃ」、「デッドＣａｓ９」または「ｄＣａｓ９」）と称され、ヌクレアーゼ活性の減少もしくは排除を示すか、またはヌクレアーゼ活性が検出レベル内で存在しないか、もしくは実質的に存在しない。本態様によれば、Ｃａｓ９Ｎｕｃのヌクレアーゼ活性は既知のアッセイを使用して検出不能、すなわち、既知のアッセイの検出レベル未満である可能性がある。
いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９親タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、変異したヌクレアーゼドメインを有するＣａｓ９（「デッドＣａｓ９」または「ｄＣａｓ９」と称される）を含む。得られたｄＣａｓ９は、そのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化能力を保持するが、そのエンドヌクレアーゼ活性を失う。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ｄＣａｓ９である。
本開示は、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド結合配列を、Ｃａｓタンパク質、例えば、ＤＲＤに機能的に連結されたヌクレアーゼヌルＣａｓ９の標的とするためのガイドＲＮＡの使用を提供する。そのようなガイドＲＮＡは、特定のポリヌクレオチド結合配列を知っている場合、当業者によって容易に設計され得る。ガイドＲＮＡは、スペーサー配列、ｔｒａｃｒメイト配列及びｔｒａｃｒ配列のうち１つ以上を含んでよい。スペーサー配列という用語は当業者によって理解され、ポリヌクレオチド結合配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチド結合配列に配列特異的に結合させるために、ポリヌクレオチド結合配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチドを含む場合がある。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒメイト配列（これはｃｒＲＮＡと称される場合がある）に共有結合されたスペーサー配列及び別個のｔｒａｃｒ配列から形成される場合があり、ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒ配列の一部にハイブリダイズされる。ある特定の態様によれば、ｔｒａｃｒメイト配列及びｔｒａｃｒ配列は、リンカー配列による共有結合などによって結合または連結され、この構築物は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列との融合体と称されてよい。本明細書で言及されるリンカー配列は、本明細書では核酸配列と称されるヌクレオチドの配列であり、これはｔｒａｃｒメイト配列及びｔｒａｃｒ配列を結合させる。したがって、ガイドＲＮＡは、２つの構成要素の種（すなわち、互いにハイブリダイズする別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡ）または単分子種（すなわち、多くの場合にｓｇＲＮＡと称される、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒ ＲＮＡ融合体）であってよい。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、注射もしくはリポフェクションを含む当業者に既知の方法によって在来種として細胞中に直接送達されてよいか、またはエレクトロポレーション、一過性で安定したトランスフェクション（リポフェクションを含む）及びウイルス形質導入によって細胞中に導入された同族ＤＮＡを用いて、その同族ＤＮＡから転写されるように細胞中に送達されてよい。
いくつかの実施形態では、転写因子系は、ＤＲＤ制御転写因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み、転写因子は、ヌクレアーゼヌルＣａｓ９であるか、またはそれを含むＤＮＡ結合ドメインを含む。ＤＲＤ安定化リガンドが添加される場合、ＤＲＤ及び転写因子が安定化し、ヌクレアーゼヌルＣａｓ９が発現されて、ガイドＲＮＡに結合できるようになる。ガイドＲＮＡと結合すると、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ系は目的のタンパク質に機能的に連結されているポリヌクレオチド結合配列に結合する。Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ系がポリヌクレオチド結合配列に結合される場合、目的のタンパク質遺伝子は、転写因子活性化ドメインの存在によって転写される。したがって、調節可能な転写因子発現構築物がＣａｓ９－ｇＲＮＡ系を含む場合、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ制御が、ＤＲＤをヌクレアーゼヌルＣａｓ９または転写因子活性化ドメインのいずれかにつなぐか、または結合させることによってヒト細胞などの細胞内で行われる。したがって、本開示の態様は、ＤＲＤをＣａｓ９Ｎｕｃもしくは転写因子活性化ドメインのいずれか、またはその両方に融合、結合または連結させることによって、転写調節ドメインを標的遺伝子座に局在化させる方法及び材料を含む。
いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬ親タンパク質に由来する。ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター（「ＴＡＬＥ」とも称される）は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌によって分泌されるタンパク質であり、宿主植物の遺伝子発現を調節し、細菌感染を助ける。ＴＡＬエフェクターは、主に３３または３４アミノ酸残基のタンデムリピートからなる反復領域を有する。リピートモノマーは主にアミノ酸１２位及び１３位で互いに異なり、１２位及び１３位のアミノ酸とＴＡＬＥ結合部位の対応するヌクレオチドの特有の対との間に強い相関関係がある。本開示の転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ結合部位に結合できるＴＡＬエフェクターの反復領域の全てまたは一部を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、所望の核酸配列を認識できる合成ＴＡＬエフェクターを含む。カスタムＴＡＬエフェクターを組み立てる方法は、当業者には容易に利用可能である。「操作されたＴＡＬエフェクター」は、本明細書では親ＴＡＬエフェクタータンパク質に由来するポリペプチド、ＴＡＬエフェクター及び／または合成ＴＡＬエフェクターまたはその領域の反復領域を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、特定の核酸部位に結合できる操作されたＴＡＬエフェクターである。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質の親タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、親ジンクフィンガータンパク質は、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガータンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡと配列特異的接触を行う１つ以上のジンクフィンガードメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ部位を特異的に認識できるジンクフィンガーアレイを形成する、少なくとも２つのジンクフィンガードメイン、少なくとも３つのジンクフィンガードメイン、少なくとも４つのジンクフィンガードメイン、または少なくとも５つのジンクフィンガードメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、３つのフィンガーアレイを含む。１つ以上のジンクフィンガードメインを含む操作されたＤＮＡ結合ドメインは、本明細書では「操作されたジンクフィンガー結合タンパク質」と称される。
いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、操作されたジンクフィンガー結合タンパク質、操作されたＴＡＬエフェクター、または他の天然もしくは操作されたＤＮＡ結合ドメインから選択されてよい。
ジンクフィンガー及びＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識領域を操作する（１つ以上のアミノ酸を変化させる）ことによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然には存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作する方法の非限定的な例は、設計及び選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主として合理的基準によってもたらされる天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用ならびに既存のＺＦＰ及び／またはＴＡＬＥ設計及び結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号及び同第８，５８６，５２６号を参照し、またＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６も参照し、それが既存のＺＦＰ及び／またはＴＡＬＥタンパク質及びそれらに関連する結合データから得られるＤＮＡ結合タンパク質の設計及び選択に関する場合にこれらの参考文献の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示による操作された転写因子の活性化ドメインは、既存の転写因子の領域またはドメインに由来してよい。いくつかの実施形態では、活性化ドメインは、転写活性化が可能な既存の転写因子の領域である。いくつかの実施形態では、転写因子活性化ドメインは、ｐ６５、ＶＰ６４、ｐ３００、ＳＡＭ、ＶＰＲの活性化ドメイン、または他の活性化ドメインから選択されてよい。いくつかの実施形態では、活性化ドメインは、ヒト転写因子ＮＦ－κβ ｐ６５タンパク質（本明細書では「ｐ６５」と称される）のカルボキシ末端領域に由来する。いくつかの実施形態では、活性化ドメインは、ヒト転写因子ＮＦ－κβ ｐ６５タンパク質のカルボキシ末端領域を含む。
本明細書で提供される転写因子系の設計における考慮事項は、コードされた転写因子が特定のポリヌクレオチド結合部位に結合できること、及びペイロードをコードする核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結されることである。様々な実施形態では、誘導性プロモーターは、外因性誘導性プロモーターである。転写因子（操作された転写因子を含む）及びそれらの対応するポリヌクレオチド結合部位の対は、当該技術分野において既知である。ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインも、それらの対応するポリヌクレオチド結合部位と共に既知であり、合成転写因子及び対応する合成プロモーターの設計に使用され得る新規のＤＮＡ結合ドメイン配列及び対応するポリヌクレオチド結合部位の同定方法もまた既知である。例えば、Ｋｈａｌｉｌ Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．は、合成転写因子を構築するためのコア構成要素として使用され得るジンクフィンガーアレイを提供し、合成プロモーター内に挿入してジンクフィンガーアレイによって認識され得る対応する核酸結合配列をさらに提供する（Ｋｈａｌｉｌ Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１２，１５０，６４７－６５８、その全体が参照によって組み込まれる）。Ｋｈａｌｉｌ Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．はまた、合成転写因子－プロモーター対を特定し、プロモーターを変化させる（例えば、ジンクフィンガー結合配列を多量体化してリピートオペレーターでプロモーターを作製する）、及び合成転写因子を変化させることによって（例えば、バリアントを作製することによって）転写出力を改変するような設計戦略を提供する。Ｋｈａｌｉｌ Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．によって開示される転写因子－プロモーター対または操作されたジンクフィンガーアレイ及びそれらの対応する核酸結合部位のいずれも、本開示の転写因子系に使用され得る。一例として、Ｋｈａｌｉｌ Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．の図３Ａは、本開示の転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び特定のポリヌクレオチド結合部位の設計に使用され得るジンクフィンガーアレイの認識ヘリックスのアミノ酸残基及び対応するＤＮＡ結合配列のライブラリーを提供する。当業者は、Ｋｈａｌｉｌ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．によって提供される転写因子またはジンクフィンガーアレイ配列を、これらの転写因子またはアレイの配列を本明細書で提供される転写因子系の構築物にクローニングすることによって改変できることになる。別の例として、Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ ａｌは、対応する核酸結合部位を有する操作されたＴＡＬエフェクターの設計及び作製方法について記載している。これらは、操作された転写因子及びそれらの特定のポリヌクレオチド結合部位の調製に使用され得る。Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．によって提供されるＴＡＬエフェクターのいずれも、本開示の転写因子系における転写因子ＤＮＡ結合ドメインを調製するために使用されてよい。例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．は、特定のＤＮＡ結合部位を標的とする１７の人工ＴＡＬエフェクターの構築について開示し、図２ａにＴＡＬエフェクターリピート領域の配列及び対応する核酸結合配列も提供している。Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．に開示されるＴＡＬエフェクターまたはそのＤＮＡ結合部分は、ＤＮＡ結合ドメインに加えて、本開示の誘導性プロモーターの対応する核酸結合配列を構築するために使用され得る。当業者は、本開示のＤＮＡ結合ドメインの選択及び設計にはいくつかの選択肢があることを認識することになる。当該技術分野において既知の認識されたＤＮＡ結合タンパク質及びドメインの選択に加えて、本開示のＤＮＡ結合ドメインは、既存のＤＮＡ結合タンパク質のフレームワークに基づいて設計されてよい。例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質フレームワークに基づくＤＮＡ結合ドメインを選択する方法が、当業者に利用可能である（Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１．７０：３１３－４０）。
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする核酸配列に機能的に連結される誘導性プロモーターは、最小プロモーター（「ｍｉｎプロモーター」または「コアプロモーター」とも称される）及び特定のポリヌクレオチド結合部位を含む。本シナリオでは、最小プロモーター及び特定のポリヌクレオチド結合部位の両方が、ペイロードをコードする核酸配列に機能的に連結される。「最小プロモーター」という用語は、開始複合体の形成を可能にする最小構造を指す。最小プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡボックス及び転写開始部位を含む場合がある。最小プロモーターは、１つ以上の応答エレメント（エンハンサーまたは転写因子結合部位など）と結合されて、誘導性プロモーターを生成する場合がある。最小プロモーター及び最小プロモーターと応答エレメントとの結合に関する追加の詳細が、Ｅｄｅ及び同僚ら（Ｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｍａｙ ２０；５（５）：３９５－４０４）によって提供される。いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系またはその構成要素の誘導性プロモーターは、以下の最小プロモーター：ｍｉｎＣＭＶ、ＣＭＶ５３（上流ＧＣボックスの付加を伴うｍｉｎＣＭＶ）、ｍｉｎＳＶ４０（最小シミアンウイルス４０プロモーター）、ｍｉｎｉＴＫ（単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターの－３３～＋３２領域）、ＭＬＰ（アデノウイルス主要後期プロモーターの－３８～＋６領域）、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５（ヒトｊｕｎＢ遺伝子に由来する最小プロモーター）、ＹＢ＿ＴＡＴＡ（Ｂｅｎｅｎｓｏｎ及び同僚ら（Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４；１１１：１５７０５－１５７１０）によって開発された合成最小プロモーター）、ならびにＴＡＴＡボックス単独から選択される最小プロモーターを含む。
上記の通り、特定のポリヌクレオチド結合部位は、転写因子ＤＮＡ結合ドメインによって認識され、結合される特定の配列を有する少なくとも１つの核酸部位を含んでよい。いくつかの実施形態では、特定のポリヌクレオチド結合部位は、転写因子ＤＮＡ結合ドメインによって認識され、結合される特定の配列を各々が有する２つ以上の核酸部位を含む。ＤＮＡ結合ドメインとそれらの対応するポリヌクレオチド結合部位との対合は、上述されている。
ペイロードをコードする核酸配列は、任意のペイロードまたは目的のタンパク質をコードするように選択されてよい。ペイロードに関する追加の詳細は、以下の「ペイロード」節で提供される。
個別に（単一の構築物として）または転写因子系の一部として組み合わせて使用されてよい例示的な核酸構築物が、表１に記載されている。表１のアスタリスク（「＊」）は、終止コドンの翻訳を示す。
Figure 2023509770000002
Figure 2023509770000003
Figure 2023509770000004
Figure 2023509770000005
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構造的に異なる転写因子構成要素を含む追加の例示的な構築物が、表２に提供される。表２のアスタリスク（「＊」）は、終止コドンの翻訳を示す。制御された転写因子を含まない対応する対照構築物に加えて、別個の構築物構成要素もまた提供される。構築物ｃｊｕｎ－００１及びｃｊｕｎ－００２の説明に示されている通り、ペプチドリンカーは、各構築物のＣＡ２構成要素とｃ－Ｊｕｎ構成要素との間に配置される。さらに、全ての構築物はＰ２Ａペプチドを含む。
Figure 2023509770000019
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転写因子系のリガンド依存性活性の特徴付け
転写因子系のリガンド依存性活性は、様々な方法によって特徴付けられてよい。
いくつかの実施形態では、転写因子系のリガンド依存性活性は、転写因子系によってコードされる、転写因子ポリペプチド（例えば、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメインまたは転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインの両方）のリガンド依存性制御を特徴とする。いくつかの実施形態では、転写因子系のリガンド依存性活性は、転写因子系によってコードされる転写因子ポリペプチドのリガンド用量依存性制御を特徴とする。一態様では、転写因子ポリペプチドは、転写因子活性化ドメインを含むポリペプチドである。別の態様では、転写因子ポリペプチドは、転写因子ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドである。別の態様では、転写因子ポリペプチドは、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの両方を含むポリペプチドである。転写因子ポリペプチドのリガンド依存性制御は、様々な方法によって特徴付けられてよい。いくつかの態様では、転写因子ポリペプチドのリガンド依存性制御は、転写因子ポリペプチドまたはそのドメインのレベルを測定することによって、例えば、イムノアッセイなどによって評価されてよい。
いくつかの実施形態では、転写因子系のリガンド依存性活性は、転写因子系によってコードされるペイロードのリガンド依存性発現を特徴とする。ペイロードの発現は、様々な方法によって評価されてよい。いくつかの態様では、ペイロードの発現は、ペイロードｍＲＮＡレベルを測定することによって評価される。いくつかの態様では、ペイロードの発現は、ペイロードポリペプチドレベルを測定することによって評価される。
いくつかの実施形態では、転写因子系は、ＤＲＤを欠く対照転写因子系と比較されてよい。いくつかの実施形態では、転写因子系のリガンド依存性活性は、ＤＲＤを欠く対照転写因子構築物を含む転写因子系の活性と比較して分析または特徴付けられてよい。対照転写因子構築物の一例は構築物ＺＦＨＤ－００４であり、これは本開示によって記載される（表１に示される通り）。
転写因子
転写因子は、ＤＮＡ、好ましくはプロモーター内またはその近傍に位置するＤＮＡ上の配列特異的部位（転写因子ポリヌクレオチド結合部位）に結合するタンパク質であり、これは転写機構とプロモーターとの結合を促進することにより、ＤＮＡ配列の転写を活性化する。そのような実体は、転写調節タンパク質としても知られている。
様々な実施形態では、本明細書に記載される転写因子系、組成物及び方法に使用するための転写因子は、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインの組合せは、機能的転写因子をもたらす。様々な実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び／または転写因子活性化ドメインは、他の転写調節エレメントと相互作用してよい。
いくつかの実施形態では、転写因子は、特定の短いＤＮＡ配列を認識して結合し、それによって遺伝子発現に必然的に影響を及ぼすタンパク質として例示される。転写因子によるＤＮＡ配列の認識は、転写因子タンパク質のアミノ酸側鎖と、調節配列として機能するＤＮＡの塩基対残基との化学的相互作用によって行われる。したがって、転写因子はゲノム配列を「読み取り」、この機構は、遺伝子発現を制御する調節処理の情報的側面が依存する配列認識機能を提供する。
転写因子は通常、他の転写因子を含む、転写に必要な他のタンパク質との相互作用を媒介するＤＮＡ結合ドメイン及びエフェクターまたは活性化ドメインからなる。転写因子は、遺伝子活性化を含む多くの機能を実行する。それらは核内で転写され、細胞質内で翻訳されて、全ての転写因子タンパク質配列に含まれる核局在化部位によって媒介される、核内への再進入時にゲノムＤＮＡ内でそれらの標的部位を発見する。転写因子は、ＤＮＡの近傍に非特異的に集中する塩基性ドメインを含み、それらの標的部位の拡散律速の発見を容易にする。
本開示の様々な実施形態では、転写因子系は、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子エフェクターまたは活性化ドメインもしくはタンパク質（本明細書では交換可能に使用される）で構成され、かつ／あるいはそれらを含む転写因子を利用する。転写因子活性化ドメイン、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、及び／または転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せは、ＤＲＤに機能的に連結されてよい（そのいずれもＤＲＤ－ＴＦである）。外因性安定化リガンドの結合によって連結されたＤＲＤが安定化すると、安定化したＤＲＤ－ＴＦは、目的のタンパク質を転写できる。
転写因子ＤＮＡ結合ドメインが結合するＤＮＡ配列は、転写因子結合部位もしくは応答エレメント、または本明細書で交換可能に使用される場合、特定のポリヌクレオチド結合部位と呼ばれ、これらの結合部位は、制御されたＤＮＡ配列のプロモーター内またはその近傍に見出される。特定のポリヌクレオチド結合部位を含むプロモーターは、外因性プロモーターであってよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、外因性誘導性プロモーターであってよい。目的のタンパク質またはペイロードを含有する転写因子系内に組み込まれる場合、転写因子結合部位または特定のポリヌクレオチド結合部位は、外因性核酸配列である。
本開示の様々な実施形態では、転写因子系の合成に有用な好適な転写因子は、転写因子結合部位が既知である任意の既知の転写因子を含み得る。そのような転写因子のいくつかの例としては、ＳＴＡＴファミリー（ＳＴＡＴ１、２、３、４、５ａ、５ｂ、及び６）、ｃ－Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ－１、Ｆｒａ－２、ｃ－Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ及びＪｕｎＤ、ｆｏｓ／ｊｕｎ、ＮＦカッパＢ、ＨＩＶ－ＴＡＴ、Ｅ２Ｆファミリー、Ｔ－Ｂｏｘ遺伝子ファミリー、ヘリックス－ループ－ヘリックス転写因子、ジンクフィンガー転写因子、例えば、ＺＦＨＤ１、Ｏｃｔ４、及びＺｉｆ２６８、操作されたジンクフィンガー転写因子、ならびに以下のファミリー：ｂＨＬＨ、ｂＺＩＰ、フォークヘッド、核内受容体、ＨＭＧ／Ｓｏｘ、Ｅｔｓ、Ｔ－ｂｏｘ、ＡＴ ｈｏｏｋ、ホメオドメイン＋ＰＯＵ、Ｍｙｂ／ＳＡＮＴ、ＴＨＡＰフィンガー、ＣＥＮＰＢ、Ｅ２Ｆ、ＢＥＤ ＺＦ、ＧＡＴＡ、Ｒｅｌ、ＣｘｘＣ、ＩＲＦ、ＳＡＮＤ、ＳＭＡＤ、ＨＳＦ、ＭＢＤ、ＲＦＸ、ＣＵＴ＋ホメオドメイン、ＤＭ、ＳＴＡＴ、ＡＲＩＤ／ＢＲＩＧＨＴ、グレイニーヘッド、ＭＡＤＳボックス、ＡＰ－２、ＣＳＤ、及びホメオドメイン＋ＰＡＸの転写因子が挙げられる（が、これらに限定されない）。例示的な転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＨＤ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、及びＴＡＬからなる群から選択される親タンパク質に由来する１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含んでよい。
様々な実施形態では、転写因子系は、目的のタンパク質またはペイロード（本明細書では交換可能に使用される）の調節可能な転写を提供する。様々な実施形態では、目的のタンパク質をコードする核酸配列は、転写因子ＤＮＡ結合ドメインに特異的に結合する特定のポリヌクレオチド結合部位、すなわち、定義されたＤＮＡポリヌクレオチド配列を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される。次いで、転写因子結合ドメインは、転写因子ＤＮＡ活性化ドメインと組み合わされて、目的のタンパク質の転写を調節できる。
ＤＲＤ－ＴＦを含む細胞または生物が外因性安定化リガンドに曝露される場合、ＤＲＤ－ＴＦは安定化する。次いで、安定化したＤＲＤ－ＴＦは、ＤＲＤ－ＴＦが結合する特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、それゆえ目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を制御できる。いくつかの実施形態では、安定化したＤＲＤ－ＴＦの結合は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を活性化するため、それは細胞または生物においてタンパク質発現をもたらす。外因性安定化リガンドが存在しない場合、ＤＲＤ－ＴＦは分解され、転写を活性化できない。したがって、タンパク質発現の量及びタイミングの両方が、細胞または生物に外因性安定化リガンドを投与することによって制御され得る。
様々な実施形態では、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメインは、典型的には機能的に連結されているか、または１つ以上の介在配列、例えば、リンカーもしくは切断部位によって分離されてよい。様々な実施形態では、第１ポリヌクレオチドは、転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１核酸配列、転写因子活性化ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含んでよい。そのような実施形態では、転写因子活性化ドメイン及び／または転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、細胞内での発現時にＤＲＤに機能的に連結される。加えて、細胞はまた、転写因子ＤＮＡ結合ドメインによって特異的に結合され得る第４核酸配列及び本明細書に記載されるような目的のタンパク質またはペイロードをコードする第５核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドも含むことになる。
転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン及び目的のタンパク質またはペイロードは、同じベクター上または別々のベクター内に本開示の方法のために供給されてよい。
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインのうち少なくとも１つをコードする少なくとも第１核酸配列、ならびに薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含み、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び／または転写因子活性化ドメインは、ＤＲＤに機能的に連結される。場合により、いくつかの実施形態では、第１ベクターは、ＤＲＤに連結される転写因子を含み、第２ベクターは、転写因子ポリヌクレオチド結合部位に機能的に連結される目的のタンパク質またはペイロードを含む。さらなる実施形態では、単一のベクターは、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化できる転写因子をコードする第１核酸配列、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含み、ここで転写因子はＤＲＤに機能的に連結され、場合により、転写因子ポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される目的のタンパク質をコードする第３核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ベクターは、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインのうち少なくとも１つをコードする少なくとも第１核酸配列、ならびに薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含み、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び／または転写因子活性化ドメインは、ＤＲＤに機能的に連結され、第２ベクターは、転写因子ＤＮＡ結合ドメインによって特異的に結合され得る第３核酸配列及び本明細書に記載されるような目的のタンパク質またはペイロードをコードする第４核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ベクターはまた、例えば、細菌におけるベクターの増幅を可能にする複製起点（ｏｒｉ）を有する。さらに、または代わりに、ベクターは、抗生物質耐性遺伝子、着色マーカーの遺伝子及び自殺遺伝子などの選択可能マーカーを含む。
薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）
薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）は、リガンドが存在しない場合では不安定で分解されるタンパク質ドメインであるが、その安定性は、対応するＤＲＤ結合リガンドに結合することによって回復する。薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）という用語は、不安定化ドメイン（ＤＤ）という用語と交換可能である。薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）は、ポリペプチドまたはタンパク質に付加され得、ＤＲＤ結合リガンドが存在しない場合では付加されたポリペプチドまたはタンパク質を不安定にし得る。ＤＲＤは、タンパク質分解によって、付加されたポリペプチドまたはタンパク質にそれらの不安定化特性を付与する。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＤＲＤ結合リガンドが存在しない場合、付加されたポリペプチドまたはタンパク質は、細胞のユビキチン－プロテアソーム系によって急速に分解される。ＤＲＤに結合するか、またはそれと相互作用するリガンドは、そのような結合または相互作用の際に、付加されたポリペプチドまたはタンパク質の安定性を調節し得る。リガンドがその意図されるＤＲＤに結合する場合、不安定性が逆転し、付加されたポリペプチドまたはタンパク質の機能が回復し得る。ＤＲＤの条件付き安定性によって、安定したタンパク質から分解を目的とした不安定な基質への切替えが、迅速かつ障害されることなく行われることが可能になる。さらに、そのリガンド濃度へのその依存は、分解速度の調節可能な制御をさらに提供する。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、タンパク質の翻訳後制御が可能な既知のポリペプチドに由来してよい。いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、既知のタンパク質から開発されるか、またはそれに由来してよい。野生型タンパク質の領域または部分またはドメインは、全体的または部分的にＤＲＤとして利用されてよい。それらは組み合わされ、または再配置されて、新しいペプチド、タンパク質、領域またはドメインを作製してよく、それらのいずれもＤＲＤとして、またはさらなるＤＲＤの設計の開始点として使用されてよい。
いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、親タンパク質または親タンパク質と比較して１つ、２つ、３つ、もしくはそれを超えるアミノ酸変異を有する変異体タンパク質に由来してよい。いくつかの実施形態では、親タンパク質は、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、ヒトＤＨＦＲ（ｈＤＨＦＲ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＦＲ（ｅｃＤＨＦＲ）、ＰＤＥ５（ホスホジエステラーゼ５）、ＣＡ２（炭酸脱水酵素ＩＩ）、及びＥＲ（エストロゲン受容体）から選択されてよいが、これらに限定されない。ＤＲＤ及びそれらのリガンドを開発するために使用されてよいタンパク質の例が、表３に列挙される。
Figure 2023509770000029
Figure 2023509770000030
いくつかの実施形態では、ＤＲＤを開発するために使用されるタンパク質の配列は、表３のタンパク質配列の全て、その一部、またはその領域を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤを開発するために使用されてよいタンパク質は、表３に列挙されるタンパク質のアイソフォームを含む。
ｈＰＤＥ５ ＤＲＤ
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＰＤＥ５に由来する。いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＰＤＥ５アイソフォーム２に由来する。いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＰＤＥ５アイソフォーム３に由来する。いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＰＤＥ５アイソフォームＸ１に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、配列番号．７１のアミノ酸配列を含むｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼ（ｈＰＤＥ５）に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＰＤＥ５全体（配列番号．７１）を含んでよい。いくつかの実施形態では、ｈＰＤＥ５に由来するＤＲＤは、ｈＰＤＥ５の触媒ドメイン（例えば、配列番号．７１の５３５～８６０）を含んでよい。いくつかの実施形態では、本開示のｈＰＤＥ５ ＤＲＤは、ｈＰＤＥ５の触媒ドメイン、すなわち、ｈＰＤＥ５野生型（ＷＴ）のアミノ酸５３５～８６０のＮ末端にメチオニンを含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼ（ｈＰＤＥ５、配列番号．７１）を含み、配列番号．７１の７３２位（Ｒ７３２）にアミノ酸の変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、７３２位（Ｒ７３２）のアミノ酸の変異は、Ｒ７３２Ｌ、Ｒ７３２Ａ、Ｒ７３２Ｇ、Ｒ７３２Ｖ、Ｒ７３２Ｉ、Ｒ７３２Ｐ、Ｒ７３２Ｆ、Ｒ７３２Ｗ、Ｒ７３２Ｙ、Ｒ７３２Ｈ、Ｒ７３２Ｓ、Ｒ７３２Ｔ、Ｒ７３２Ｄ、Ｒ７３２Ｅ、Ｒ７３２Ｑ、Ｒ７３２Ｎ、Ｒ７３２Ｍ、Ｒ７３２Ｃ、及びＲ７３２Ｋからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示のｈＰＤＥ５ ＤＲＤは、Ｈ６５３Ａ、Ｆ７３６Ａ、Ｄ７６４Ａ、Ｄ７６４Ｎ、Ｙ６１２Ｆ、Ｙ６１２Ｗ、Ｙ６１２Ａ、Ｗ８５３Ｆ、Ｉ８２１Ａ、Ｙ８２９Ａ、Ｆ７８７Ａ、Ｄ６５６Ｌ、Ｙ７２８Ｌ、Ｍ６２５Ｉ、Ｅ５３５Ｄ、Ｅ５３６Ｇ、Ｑ５４１Ｒ、Ｋ５５５Ｒ、Ｆ５５９Ｌ、Ｆ５６１Ｌ、Ｆ５６４Ｌ、Ｆ５６４Ｓ、Ｋ５９１Ｅ、Ｎ５８７Ｓ、Ｋ６０４Ｅ、Ｋ６０８Ｅ、Ｎ６０９Ｈ、Ｋ６３０Ｒ、Ｋ６３３Ｅ、Ｎ６３６Ｓ、Ｎ６６１Ｓ、Ｙ６７６Ｄ、Ｙ６７６Ｎ、Ｃ６７７Ｒ、Ｈ６７８Ｒ、Ｄ６８７Ａ、Ｔ７１２Ｓ、Ｄ７２４Ｎ、Ｄ７２４Ｇ、Ｌ７３８Ｈ、Ｎ７４２Ｓ、Ａ７６２Ｓ、Ｄ７６４Ｇ、Ｄ７６４Ｖ、Ｓ７６６Ｆ、Ｋ７９５Ｅ、Ｌ７９７Ｆ、Ｉ７９９Ｔ、Ｔ８０２Ｐ、Ｓ８１５Ｃ、Ｍ８１６Ａ、Ｉ８２４Ｔ、Ｃ８３９Ｓ、Ｋ８５２Ｅ、Ｓ５６０Ｇ、Ｖ５８５Ａ、Ｉ５９９Ｖ、Ｉ６４８Ｖ、Ｓ６６３Ｐ、Ｌ６７５Ｐ、Ｔ７１１Ａ、Ｆ７４４Ｌ、Ｌ７４６Ｓ、Ｆ７５５Ｌ、Ｌ８０４Ｐ、Ｍ８１６Ｔ、及びＦ８４０Ｓからなる群から独立して選択される１つ以上の変異をさらに含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼ（ｈＰＤＥ５、配列番号．７１）を含み、配列番号．７１の７３２位（Ｒ７３２）にアミノ酸の変異をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、ＤＲＤは、（ｉ）配列番号．７１の７６４位（Ｄ７６４）におけるアミノ酸の変異であって、Ｄ７６４の変異がＤ７６４Ｎ及びＤ７６４Ａから選択される変異、（ｉｉ）配列番号．７１の６１２位（Ｙ６１２）におけるアミノ酸の変異であって、Ｙ６１２の変異がＹ６１２Ａ、Ｙ６１２Ｆ、及びＹ６１２Ｗからなる群から選択される変異、（ｉｉｉ）配列番号．７１の７３６位（Ｆ７３６）におけるアミノ酸のＦ７３６Ａ変異、または（ｉｖ）配列番号．７１の６５３位（Ｈ６５３）におけるアミノ酸のＨ６５３Ａ変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼ（ｈＰＤＥ５、配列番号．７１）を含み、配列番号．７１と比較してある位置にアミノ酸の変異をさらに含み、その変異は、Ｗ８５３Ｆ、Ｉ８２１Ａ、Ｙ８２９Ａ、Ｆ７８７Ａ、Ｆ７３６Ａ、Ｄ６５６Ｌ、Ｙ７２８Ｌ、Ｍ６２５Ｉ、及びＨ６５３Ａからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示のｈＰＤＥ５ ＤＲＤは、Ｔ５３７Ａ、Ｅ５３９Ｇ、Ｖ５４８Ｅ、Ｄ５５８Ｇ、Ｆ５５９Ｓ、Ｅ５６５Ｇ、Ｃ５７４Ｎ、Ｒ５７７Ｑ、Ｒ５７７Ｗ、Ｎ５８３Ｓ、Ｑ５８６Ｒ、Ｑ５８９Ｌ、Ｋ５９１Ｒ、Ｋ５９１Ｒ、Ｌ５９５Ｐ、Ｃ５９６Ｒ、Ｗ６１５Ｒ、Ｆ６１９Ｓ、Ｑ６２３Ｒ、Ｋ６３３Ｉ、Ｑ６３５Ｒ、Ｎ６３６Ｓ、Ｔ６３９Ｓ、Ｄ６４０Ｎ、Ｅ６４２Ｇ、Ｉ６４３Ｔ、Ｌ６４６Ｓ、Ａ６４９Ｖ、Ａ６５０Ｔ、Ｓ６５２Ｇ、Ｈ６５３Ａ、Ｄ６５４Ｇ、Ｖ６６０Ａ、Ｖ６６０Ａ、Ｌ６７２Ｐ、Ａ６７３Ｔ、Ｃ６７７Ｙ、Ｍ６８１Ｔ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８５Ｒ、Ｆ６８６Ｓ、Ｑ６８８Ｒ、Ｍ６９１Ｔ、Ｓ６９５Ｇ、Ｇ６９７Ｄ、Ｓ７０２Ｉ、Ｉ７０６Ｔ、Ｅ７０７Ｋ、Ｙ７０９Ｈ、Ｙ７０９Ｃ、Ｉ７１５Ｖ、Ｉ７２０Ｖ、Ａ７２２Ｖ、Ｄ７２４Ｇ、Ｙ７２８Ｃ、Ｋ７３０Ｅ、Ｒ７３２Ｌ、Ｌ７３８Ｉ、Ｉ７３９Ｍ、Ｋ７４１Ｎ、Ｋ７４１Ｒ、Ｆ７４４Ｌ、Ｄ７４８Ｎ、Ｋ７５２Ｅ、Ｋ７５２Ｅ、Ｋ７５２Ｅ、Ｅ７５３Ｋ、Ｌ７５６Ｖ、Ｍ７５８Ｔ、Ｍ７６０Ｔ、Ａ７６２Ｖ、Ｃ７６３Ｒ、Ｄ７６４Ｎ、Ｄ７６４Ｎ、Ｉ７７４Ｖ、Ｌ７８１Ｆ、Ｌ７８１Ｐ、Ｅ７８５Ｋ、Ｒ７９４Ｇ、Ｍ８０５Ｔ、Ｒ８０７Ｇ、Ｋ８１２Ｒ、Ｉ８１３Ｔ、Ｉ８１３Ｔ、Ｍ８１６Ｒ、Ｑ８１７Ｒ、Ｖ８１８Ａ、Ｆ８２０Ｓ、Ｉ８２１Ｖ、Ｃ８２５Ｒ、Ｙ８２９Ｃ、Ｅ８３０Ｋ、Ｌ８３２Ｐ、Ｓ８３６Ｌ、Ｃ８４６Ｙ、Ｃ８４６Ｓ、Ｌ８５６Ｐ、Ｌ８５６Ｐ、Ａ８５７Ｔ、またはＥ８５８Ｇからなる群から独立して選択される１つ以上の変異を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のｈＰＤＥ５ ＤＲＤは、Ｅ５３６Ｋ、Ｉ７３９Ｗ；Ｈ６７８Ｆ、Ｓ７０２Ｆ；Ｅ６６９Ｇ、Ｉ７００Ｔ；Ｇ６３２Ｓ、Ｉ６４８Ｔ；Ｔ６３９Ｓ、Ｍ８１６Ｒ；Ｑ５８６Ｒ、Ｄ７２４Ｇ；Ｅ５３９Ｇ、Ｌ７３８Ｉ；Ｌ６７２Ｐ、Ｓ８３６Ｌ；Ｍ６９１Ｔ、Ｄ７６４Ｎ；Ｉ７２０Ｖ、Ｆ８２０Ｓ；Ｅ６８２Ｇ、Ｄ７４８Ｎ；Ｓ６５２Ｇ、Ｑ６８８Ｒ；Ｙ７２８Ｃ、Ｑ８１７Ｒ；Ｈ６５３、Ｒ７３２Ｌ；Ｌ５９５Ｐ、Ｋ７４１Ｒ；Ｒ７３２Ｄ、Ｆ７３６Ｓ；Ｒ７３２Ｅ、Ｆ７３６Ｄ；Ｒ７３２Ｖ、Ｆ７３６Ｇ；Ｒ７３２Ｗ、Ｆ７３６Ｇ；Ｒ７３２Ｗ、Ｆ７３６Ｖ；Ｒ７３２Ｌ、Ｆ７３６Ｗ；Ｒ７３２Ｐ、Ｆ７３６Ｑ；Ｒ７３２Ａ、Ｆ７３６Ａ；Ｒ７３２Ｓ、Ｆ７３６Ｇ；Ｒ７３２Ｔ、Ｆ７３６Ｐ；Ｒ７３２Ｍ、Ｆ７３６Ｈ；Ｒ７３２Ｙ、Ｆ７３６Ｍ；Ｒ７３２Ｐ、Ｆ７３６Ｄ；Ｒ７３２Ｐ、Ｆ７３６Ｇ；Ｒ７３２Ｗ、Ｆ７３６Ｌ；Ｒ７３２Ｌ、Ｆ７３６Ｓ；Ｒ７３２Ｄ、Ｆ７３６Ｔ；Ｒ７３２Ｌ、Ｆ７３６Ｖ；Ｒ７３２Ｇ、Ｆ７３６Ｖ；及びＲ７３２Ｗ、Ｆ７３６Ａから独立して選択される２つの変異を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のｈＰＤＥ５ ＤＲＤは、Ｑ６２３Ｒ、Ｄ６５４Ｇ、Ｋ７４１Ｎ；Ａ６７３Ｔ、Ｌ７５６Ｖ、Ｃ８４６Ｙ；Ｅ６４２Ｇ、Ｇ６９７Ｄ、Ｉ８１３Ｔ；Ｃ６７７Ｙ、Ｈ６８５Ｒ、Ａ７２２Ｖ；Ｑ６３５Ｒ、Ｅ７５３Ｋ、Ｉ８１３Ｔ；Ｙ７０９Ｈ、Ｋ８１２Ｒ、Ｌ８３２Ｐ；Ｎ５８３Ｓ、Ｋ７５２Ｅ、Ｃ８４６Ｓ；Ｋ５９１Ｒ、Ｉ６４３Ｔ、Ｌ８５６Ｐ；Ｆ６１９Ｓ、Ｖ８１８Ａ、Ｙ８２９Ｃ；及びＦ５５９Ｓ、Ｙ７０９Ｃ、Ｍ７６０Ｔから独立して選択される２つの変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、本開示のｈＰＤＥ５ ＤＲＤは、Ｓ６９５Ｇ、Ｅ７０７Ｋ、Ｉ７３９Ｍ、Ｃ７６３Ｒ；Ａ６４９Ｖ、Ａ６５０Ｔ、Ｋ７３０Ｅ、Ｅ８３０Ｋ；及びＲ５７７Ｗ、Ｗ６１５Ｒ、Ｍ８０５Ｔ、Ｉ８２１Ｖから独立して選択される２つの変異を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のｈＰＤＥ５ ＤＲＤは、Ｖ６６０Ａ、Ｌ７８１Ｆ、Ｒ７９４Ｇ、Ｃ８２５Ｒ、Ｅ８５８Ｇ；Ｔ５３７Ａ、Ｄ５５８Ｇ、Ｉ７０６Ｔ、Ｆ７４４Ｌ、Ｄ７６４Ｎ；Ｒ５７７Ｑ、Ｃ５９６Ｒ、Ｖ６６０Ａ、Ｉ７１５Ｖ、Ｅ７８５Ｋ、Ｌ８５６Ｐ；及びＶ５４８Ｅ、Ｑ５８９Ｌ、Ｋ６３３Ｉ、Ｍ６８１Ｔ、Ｓ７０２Ｉ、Ｋ７５２Ｅ、Ｌ７８１Ｐ、Ａ８５７Ｔから独立して選択される複数の変異を含んでよい。
ｈＤＨＦＲ ＤＲＤ
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｈＤＨＦＲ）タンパク質、例えば、これらに限定されないが、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ１（ｈＤＨＦＲ１）、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ２（ｈＤＨＦＲ２）、またはその断片もしくはバリアントなどに由来する。
いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し、少なくとも１つの変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し、２つ以上の変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＤＨＦＲ全体（配列番号．２）を含んでよい。いくつかの実施形態では、ｈＤＨＦＲに由来するＤＲＤは、親ｈＤＨＦＲ配列のアミノ酸２～１８７（例えば、配列番号．２のアミノ酸２～１８７）を含んでよい。これは、本明細書ではｈＤＨＦＲ Ｍ１ｄｅｌ変異と称される。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＤＨＦＲ（配列番号．２）の領域またはその全体を含み、配列番号．２と比較してＩ１７Ｖ、Ｆ５９Ｓ、Ｎ６５Ｄ、Ｋ８１Ｒ、Ｙ１２２Ｉ、Ｎ１２７Ｙ、Ｍ１４０Ｉ、Ｋ１８５Ｅ、Ｎ１８６Ｄ、及びＭ１４０Ｉから選択される変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＤＨＦＲ（配列番号．２）の領域またはその全体を含み、配列番号．２と比較して２つ以上の変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｈＤＨＦＲ ＤＲＤは、（Ａ１０Ｖ、Ｈ８８Ｙ）、（Ｃ７Ｒ／Ｙ１６３Ｃ）、（Ｉ１７Ｖ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｈ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｋ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｒ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｓ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｔ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ６５Ｈ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ６５Ｌ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ６５Ｒ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ６５Ｗ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ１０３Ｅ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ１０３Ｓ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ１０８Ｄ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｖ１２１Ａ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｙ１２２Ｉ、Ｋ１７４Ｎ）、（Ｙ１２２Ｉ、Ｅ１６２Ｇ）、（Ａ１２５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ１２７Ｙ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｈ１３１Ｒ／Ｅ１４４Ｇ）、（Ｅ１６２Ｇ／Ｉ１７６Ｆ）、（Ｋ５５Ｒ、Ｎ６５Ｋ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｅ、Ｑ１０３Ｈ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｆ、Ｎ６５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ）、及び（Ｖ１１０Ａ／Ｖ１３６Ｍ／Ｋ１７７Ｒ）から選択される２つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｈＤＨＦＲ ＤＲＤは、（Ｉ１７Ｖ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｇ２１Ｔ、Ｙ１２２Ｎ）、（Ｑ３６Ｈ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｋ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｒ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｓ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｔ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ６５Ｈ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ６５Ｌ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ６５Ｒ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ６５Ｗ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｌ７４Ｎ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ１０３Ｅ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ１０３Ｓ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ１０８Ｄ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｖ１２１Ａ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｙ１２２Ｉ、Ｋ１７４Ｎ）、（Ｙ１２２Ｉ、Ｅ１６２Ｇ）、（Ａ１２５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｎ１２７Ｙ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｋ５５Ｒ、Ｎ６５Ｋ、Ｙ１２２Ｉ）、（Ｑ３６Ｅ、Ｑ１０３Ｈ、Ｙ１２２Ｉ）、及び（Ｑ３６Ｆ、Ｎ６５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ）から選択される２つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｈＤＨＦＲ、配列番号．２）を含み、配列番号．２の１２２位（Ｙ１２２）にアミノ酸のＹ１２２Ｉ変異をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、ＤＲＤは、（ｉ）配列番号．２の３６位（Ｑ３６）におけるアミノ酸のＱ３６Ｋ変異、（ｉｉ）配列番号．２の１２５位（Ａ１２５）におけるアミノ酸のＡ１２５Ｆ変異、または（ｉｉｉ）配列番号．２の６５位（Ｎ６５）におけるアミノ酸のＮ６５Ｆ変異及び配列番号．２のアミノ酸３６位（Ｑ３６）にＦもしくはＫの置換をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｈＤＨＦＲ ＤＲＤは、Ｍ１ｄｅｌ、Ｖ２Ａ、Ｃ７Ｒ、Ｉ８Ｖ、Ｖ９Ａ、Ａ１０Ｔ、Ａ１０Ｖ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ１４Ｓ、Ｇ１６Ｓ、Ｉ１７Ｎ、Ｉ１７Ｖ、Ｋ１９Ｅ、Ｎ２０Ｄ、Ｇ２１Ｔ、Ｇ２１Ｅ、Ｄ２２Ｓ、Ｌ２３Ｓ、Ｐ２４Ｓ、Ｌ２８Ｐ、Ｎ３０Ｄ、Ｎ３０Ｈ、Ｎ３０Ｓ、Ｅ３１Ｇ、Ｅ３１Ｄ、Ｆ３２Ｍ、Ｒ３３Ｇ、Ｒ３３Ｓ、Ｆ３５Ｌ、Ｑ３６Ｒ、Ｑ３６Ｓ、Ｑ３６Ｋ、Ｑ３６Ｆ、Ｒ３７Ｇ、Ｍ３８Ｖ、Ｍ３８Ｔ、Ｔ４０Ａ、Ｖ４４Ａ、Ｋ４７Ｒ、Ｎ４９Ｓ、Ｎ４９Ｄ、Ｍ５３Ｔ、Ｇ５４Ｒ、Ｋ５６Ｅ、Ｋ５６Ｒ、Ｔ５７Ａ、Ｆ５９Ｓ、Ｉ６１Ｔ、Ｋ６４Ｒ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｓ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５Ｆ、Ｌ６８Ｓ、Ｋ６９Ｅ、Ｋ６９Ｒ、Ｒ７１Ｇ、Ｉ７２Ｔ、Ｉ７２Ａ、Ｉ７２Ｖ、Ｎ７３Ｇ、Ｌ７４Ｎ、Ｖ７５Ｆ、Ｒ７８Ｇ、Ｌ８０Ｐ、Ｋ８１Ｒ、Ｅ８２Ｇ、Ｈ８８Ｙ、Ｆ８９Ｌ、Ｒ９２Ｇ、Ｓ９３Ｇ、Ｓ９３Ｒ、Ｌ９４Ａ、Ｄ９６Ｇ、Ａ９７Ｔ、Ｌ９８Ｓ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｒ、Ｌ１００Ｐ、Ｅ１０２Ｇ、Ｑ１０３Ｒ、Ｐ１０４Ｓ、Ｅ１０５Ｇ、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｖ、Ｎ１０８Ｄ、Ｋ１０９Ｅ、Ｋ１０９Ｒ、Ｖ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｎ、Ｍ１１２Ｔ、Ｍ１１２Ｖ、Ｖ１１３Ａ、Ｗ１１４Ｒ、Ｉ１１５Ｖ、Ｉ１１５Ｌ、Ｖ１１６Ｉ、Ｇ１１７Ｄ、Ｖ１２１Ａ、Ｙ１２２Ｃ、Ｙ１２２Ｄ、Ｙ１２２Ｉ、Ｋ１２３Ｒ、Ｋ１２３Ｅ、Ａ１２５Ｆ、Ｍ１２６Ｉ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｙ、Ｈ１２８Ｒ、Ｈ１２８Ｙ、Ｈ１３１Ｒ、Ｌ１３２Ｐ、Ｋ１３３Ｅ、Ｌ１３４Ｐ、Ｆ１３５Ｐ、Ｆ１３５Ｌ、Ｆ１３５Ｓ、Ｆ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ｍ、Ｔ１３７Ｒ、Ｒ１３８Ｇ、Ｒ１３８Ｉ、Ｉ１３９Ｔ、Ｉ１３９Ｖ、Ｍ１４０Ｉ、Ｍ１４０Ｖ、Ｑ１４１Ｒ、Ｄ１４２Ｇ、Ｆ１４３Ｓ、Ｆ１４３Ｌ、Ｅ１４４Ｇ、Ｄ１４６Ｇ、Ｔ１４７Ａ、Ｆ１４８Ｓ、Ｆ１４８Ｌ、Ｆ１４９Ｌ、Ｐ１５０Ｌ、Ｅ１５１Ｇ、Ｉ１５２Ｖ、Ｄ１５３Ａ、Ｄ１５３Ｇ、Ｅ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｒ、Ｙ１５７Ｒ、Ｙ１５７Ｃ、Ｋ１５８Ｅ、Ｋ１５８Ｒ、Ｌ１５９Ｐ、Ｌ１６０Ｐ、Ｅ１６２Ｇ、Ｙ１６３Ｃ、Ｖ１６６Ａ、Ｓ１６８Ｃ、Ｄ１６９Ｇ、Ｖ１７０Ａ、Ｑ１７１Ｒ、Ｅ１７２Ｇ、Ｅ１７３Ｇ、Ｅ１７３Ａ、Ｋ１７４Ｒ、Ｉ１７６Ａ、Ｉ１７６Ｆ、Ｉ１７６Ｔ、Ｋ１７７Ｅ、Ｋ１７７Ｒ、Ｙ１７８Ｃ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８０Ｌ、Ｅ１８１Ｇ、Ｖ１８２Ａ、Ｙ１８３Ｃ、Ｙ１８３Ｈ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｇ、Ｋ１８５Ｒ、Ｋ１８５ｄｅｌ、Ｋ１８５Ｅ、Ｎ１８６Ｓ、Ｎ１８６Ｄ、Ｄ１８７Ｇ、及びＤ１８７Ｎからなる群から独立して選択される１つ以上の変異を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＤＨＦＲ（Ｃ７Ｒ、Ｙ１６３Ｃ）、ｈＤＨＦＲ（Ｅ１６２Ｇ、Ｉ１７６Ｆ）、ｈＤＨＦＲ（Ｇ２１Ｔ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｈ１３１Ｒ、Ｅ１４４Ｇ）、ｈＤＨＦＲ（Ｉ１７Ｖ、Ｙ１２２Ｉ、ｈＤＨＦＲ（Ｌ７４Ｎ、Ｙ１２２Ｉ、ｈＤＨＦＲ（Ｌ９４Ａ、Ｔ１４７Ａ）、ｈＤＨＦＲ（Ｍ５３Ｔ、Ｒ１３８Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｎ１２７Ｙ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｑ３６Ｋ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｔ１３７Ｒ、Ｆ１４３Ｌ）、ｈＤＨＦＲ（Ｔ５７Ａ、Ｉ７２Ａ）、ｈＤＨＦＲ（Ｖ１２１Ａ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｖ７５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｙ１２２Ｉ、Ａ１２５Ｆ）、ｈＤＨＦＲ（Ｙ１２２Ｉ、Ｍ１４０Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｙ１７８Ｈ、Ｅ１８１Ｇ）、ｈＤＨＦＲ（Ｙ１８３Ｈ、Ｋ１８５Ｅ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｇ２１Ｔ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｉ１７Ｖ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｌ７４Ｎ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｌ９４Ａ、Ｔ１４７Ａ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｍ５３Ｔ、Ｒ１３８Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｎ１２７Ｙ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｑ３６Ｋ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｖ１２１Ａ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｖ７５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｙ１２２Ｉ、Ａ１２５Ｆ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｙ１２２Ｉ、Ｍ１４０Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｅ３１Ｄ、Ｆ３２Ｍ、Ｖ１１６Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｇ２１Ｅ、Ｉ７２Ｖ、Ｉ１７６Ｔ）、ｈＤＨＦＲ（Ｉ８Ｖ、Ｋ１３３Ｅ、Ｙ１６３Ｃ）、ｈＤＨＦＲ（Ｋ１９Ｅ、Ｆ８９Ｌ、Ｅ１８１Ｇ）、ｈＤＨＦＲ（Ｌ２３Ｓ、Ｖ１２１Ａ、Ｙ１５７Ｃ）、ｈＤＨＦＲ（Ｎ４９Ｄ、Ｆ５９Ｓ、Ｄ１５３Ｇ）、ｈＤＨＦＲ（Ｑ３６Ｆ、Ｎ６５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（Ｑ３６Ｆ、Ｙ１２２Ｉ、Ａ１２５Ｆ）、ｈＤＨＦＲ（Ｖ１１０Ａ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１７７Ｒ）、ｈＤＨＦＲ（Ｖ９Ａ、Ｓ９３Ｒ、Ｐ１５０Ｌ）、ｈＤＨＦＲ（Ｙ１２２Ｉ、Ｈ１３１Ｒ、Ｅ１４４Ｇ）、ｈＤＨＦＲ（Ｇ５４Ｒ、Ｉ１１５Ｌ、Ｍ１４０Ｖ、Ｓ１６８Ｃ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｅ３１Ｄ、Ｆ３２Ｍ、Ｖ１１６Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｑ３６Ｆ、Ｎ６５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｑ３６Ｆ、Ｙ１２２Ｉ、Ａ１２５Ｆ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｙ１２２Ｉ、Ｈ１３１Ｒ、Ｅ１４４Ｇ）、ｈＤＨＦＲ（Ｖ２Ａ、Ｒ３３Ｇ、Ｑ３６Ｒ、Ｌ１００Ｐ、Ｋ１８５Ｒ）、ｈＤＨＦＲ（Ｄ２２Ｓ、Ｆ３２Ｍ、Ｒ３３Ｓ、Ｑ３６Ｓ、Ｎ６５Ｓ）、ｈＤＨＦＲ（ＷＴのアミノ酸２～１８７）（Ｄ２２Ｓ、Ｆ３２Ｍ、Ｒ３３Ｓ、Ｑ３６Ｓ、Ｎ６５Ｓ）、ｈＤＨＦＲ（Ｉ１７Ｎ、Ｌ９８Ｓ、Ｋ９９Ｒ、Ｍ１１２Ｔ、Ｅ１５１Ｇ、Ｅ１６２Ｇ、Ｅ１７２Ｇ）、ｈＤＨＦＲ（Ｇ１６Ｓ、Ｉ１７Ｖ、Ｆ８９Ｌ、Ｄ９６Ｇ、Ｋ１２３Ｅ、Ｍ１４０Ｖ、Ｄ１４６Ｇ、Ｋ１５６Ｒ）、ｈＤＨＦＲ（Ｋ８１Ｒ、Ｋ９９Ｒ、Ｌ１００Ｐ、Ｅ１０２Ｇ、Ｎ１０８Ｄ、Ｋ１２３Ｒ、Ｈ１２８Ｒ、Ｄ１４２Ｇ、Ｆ１８０Ｌ、Ｋ１８５Ｅ）、ｈＤＨＦＲ（Ｒ１３８Ｇ、Ｄ１４２Ｇ、Ｆ１４３Ｓ、Ｋ１５６Ｒ、Ｋ１５８Ｅ、Ｅ１６２Ｇ、Ｖ１６６Ａ、Ｋ１７７Ｅ、Ｙ１７８Ｃ、Ｋ１８５Ｅ、Ｎ１８６Ｓ）、ｈＤＨＦＲ（Ｎ１４Ｓ、Ｐ２４Ｓ、Ｆ３５Ｌ、Ｍ５３Ｔ、Ｋ５６Ｅ、Ｒ９２Ｇ、Ｓ９３Ｇ、Ｎ１２７Ｓ、Ｈ１２８Ｙ、Ｆ１３５Ｌ、Ｆ１４３Ｓ、Ｌ１５９Ｐ、Ｌ１６０Ｐ、Ｅ１７３Ａ、Ｆ１８０Ｌ）、ｈＤＨＦＲ（Ｆ３５Ｌ、Ｒ３７Ｇ、Ｎ６５Ａ、Ｌ６８Ｓ、Ｋ６９Ｅ、Ｒ７１Ｇ、Ｌ８０Ｐ、Ｋ９９Ｇ、Ｇ１１７Ｄ、Ｌ１３２Ｐ、Ｉ１３９Ｖ、Ｍ１４０Ｉ、Ｄ１４２Ｇ、Ｄ１４６Ｇ、Ｅ１７３Ｇ、Ｄ１８７Ｇ）、ｈＤＨＦＲ（Ｌ２８Ｐ、Ｎ３０Ｈ、Ｍ３８Ｖ、Ｖ４４Ａ、Ｌ６８Ｓ、Ｎ７３Ｇ、Ｒ７８Ｇ、Ａ９７Ｔ、Ｋ９９Ｒ、Ａ１０７Ｔ、Ｋ１０９Ｒ、Ｄ１１１Ｎ、Ｌ１３４Ｐ、Ｆ１３５Ｖ、Ｔ１４７Ａ、Ｉ１５２Ｖ、Ｋ１５８Ｒ、Ｅ１７２Ｇ、Ｖ１８２Ａ、Ｅ１８４Ｒ）、ｈＤＨＦＲ（Ｖ２Ａ、Ｉ１７Ｖ、Ｎ３０Ｄ、Ｅ３１Ｇ、Ｑ３６Ｒ、Ｆ５９Ｓ、Ｋ６９Ｅ、Ｉ７２Ｔ、Ｈ８８Ｙ、Ｆ８９Ｌ、Ｎ１０８Ｄ、Ｋ１０９Ｅ、Ｖ１１０Ａ、Ｉ１１５Ｖ、Ｙ１２２Ｄ、Ｌ１３２Ｐ、Ｆ１３５Ｓ、Ｍ１４０Ｖ、Ｅ１４４Ｇ、Ｔ１４７Ａ、Ｙ１５７Ｃ、Ｖ１７０Ａ、Ｋ１７４Ｒ、Ｎ１８６Ｓ）、ｈＤＨＦＲ（Ｌ１００Ｐ、Ｅ１０２Ｇ、Ｑ１０３Ｒ、Ｐ１０４Ｓ、Ｅ１０５Ｇ、Ｎ１０８Ｄ、Ｖ１１３Ａ、Ｗ１１４Ｒ、Ｙ１２２Ｃ、Ｍ１２６Ｉ、Ｎ１２７Ｒ、Ｈ１２８Ｙ、Ｌ１３２Ｐ、Ｆ１３５Ｐ、Ｉ１３９Ｔ、Ｆ１４８Ｓ、Ｆ１４９Ｌ、Ｉ１５２Ｖ、Ｄ１５３Ａ、Ｄ１６９Ｇ、Ｖ１７０Ａ、Ｉ１７６Ａ、Ｋ１７７Ｒ、Ｖ１８２Ａ、Ｋ１８５Ｒ、Ｎ１８６Ｓ）、及びｈＤＨＦＲ（Ａ１０Ｔ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｐ２４Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｍ３８Ｔ、Ｔ４０Ａ、Ｋ４７Ｒ、Ｎ４９Ｓ、Ｋ５６Ｒ、Ｉ６１Ｔ、Ｋ６４Ｒ、Ｋ６９Ｒ、Ｉ７２Ａ、Ｒ７８Ｇ、Ｅ８２Ｇ、Ｆ８９Ｌ、Ｄ９６Ｇ、Ｎ１０８Ｄ、Ｍ１１２Ｖ、Ｗ１１４Ｒ、Ｙ１２２Ｄ、Ｋ１２３Ｅ、Ｉ１３９Ｖ、Ｑ１４１Ｒ、Ｄ１４２Ｇ、Ｆ１４８Ｌ、Ｅ１５１Ｇ、Ｅ１５５Ｇ、Ｙ１５７Ｒ、Ｑ１７１Ｒ、Ｙ１８３Ｃ、Ｅ１８４Ｇ、Ｋ１８５ｄｅｌ、Ｄ１８７Ｎ）を含む。
ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し、少なくとも１つの変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し、２つ以上の変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し、Ｙ１００Ｉ、Ｆ１０３Ｌ、及びＧ１２１Ｖから選択される少なくとも１つの変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し、Ｒ１２Ｙ、Ｙ１００Ｉ；Ｒ１２Ｈ、Ｅ１２９Ｋ；Ｈ１２Ｙ、Ｙ１００Ｉ；Ｈ１２Ｌ、Ｙ１００Ｉ；Ｒ９８Ｈ、Ｆ１０３Ｓ；Ｍ４２Ｔ、Ｈ１１４Ｒ；Ｎ１８Ｔ、Ａ１９Ｖ；及びＩ６１Ｆ、Ｔ６８Ｓから選択される少なくとも２つの変異を含んでよい。
ＦＫＢＰ ＤＲＤ
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し、少なくとも１つの変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し、２つ以上の変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒトＦＫＢＰタンパク質（配列番号．３）に由来し、Ｆ３６Ｖ、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ６０Ｇ、Ｌ１０６Ｐ、Ｄ１００Ｇ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、及びＫ１０５Ｉから選択される少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＦＫＢＰ ＤＲＤは、Ｆ３６Ｐ、Ｌ１０６Ｐ；及びＥ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｒ７１Ｇ、Ｋ１０５Ｅから選択される２つ以上の変異を含む。
ＥＲ ＤＲＤ
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、エストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し、少なくとも１つの変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し、２つ以上の変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ＥＲのリガンド結合ドメイン（配列番号：６のアミノ酸３０５～５０９）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲのリガンド結合ドメインと比較して少なくとも１つの変異を含んでよく、変異は、４１３位（Ｎ４１３）及び／または５０２位（Ｑ５０２）に生じる。いくつかの実施形態では、変異はＮ４１３位に存在し、Ｎ４１３Ｄ、Ｎ４１３Ｔ、Ｎ４１３Ｈ、Ｎ４１３Ａ、Ｎ４１３Ｑ、Ｎ４１３Ｖ、Ｎ４１３Ｃ、Ｎ４１３Ｋ、Ｎ４１３Ｍ、Ｎ４１３Ｒ、Ｎ４１３Ｓ、Ｎ４１３Ｗ、Ｎ４１３Ｉ、Ｎ４１３Ｅ、Ｎ４１３Ｌ、Ｎ４１３Ｐ、Ｎ４１３Ｆ、Ｎ４１３ＹまたはＮ４１３Ｇである。いくつかの実施形態では、変異はＱ５０２位に存在し、Ｑ５０２Ｈ、Ｑ５０２Ｄ、Ｑ５０２Ｅ、Ｑ５０２Ｖ、Ｑ５０２Ａ、Ｑ５０２Ｔ、Ｑ５０２Ｎ、Ｑ５０２Ｋ、Ｑ５０２Ｓ、Ｑ５０２Ｌ、Ｑ５０２Ｙ、Ｑ５０２Ｗ、Ｑ５０２Ｆ、Ｑ５０２Ｉ、Ｑ５０２Ｇ、Ｑ５０２Ｐ、Ｑ５０２Ｍ、またはＱ５０２Ｃである。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、Ｎ４１３位及びＱ５０２位の変異を含み、Ｎ４１３位の変異は、Ｎ４１３Ｄ、Ｎ４１３Ｔ、Ｎ４１３Ｈ、Ｎ４１３Ａ、Ｎ４１３Ｑ、Ｎ４１３Ｖ、Ｎ４１３Ｃ、Ｎ４１３Ｋ、Ｎ４１３Ｍ、Ｎ４１３Ｒ、Ｎ４１３Ｓ、Ｎ４１３Ｗ、Ｎ４１３Ｉ、Ｎ４１３Ｅ、Ｎ４１３Ｌ、Ｎ４１３Ｐ、Ｎ４１３Ｆ、Ｎ４１３ＹまたはＮ４１３Ｇから選択され、Ｑ５０２位の変異は、Ｑ５０２Ｈ、Ｑ５０２Ｄ、Ｑ５０２Ｅ、Ｑ５０２Ｖ、Ｑ５０２Ａ、Ｑ５０２Ｔ、Ｑ５０２Ｎ、Ｑ５０２Ｋ、Ｑ５０２Ｓ、Ｑ５０２Ｌ、Ｑ５０２Ｙ、Ｑ５０２Ｗ、Ｑ５０２Ｆ、Ｑ５０２Ｉ、Ｑ５０２Ｇ、Ｑ５０２Ｐ、Ｑ５０２Ｍ、またはＱ５０２Ｃから選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異はＮ４１３Ｄである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異はＮ４１３Ｔである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異はＱ５０２Ｈである。いくつかの実施形態では、ＥＲ ＤＲＤは、少なくとも２つの変異を含み、Ｎ４１３Ｔ、Ｑ５０２ＨまたはＮ４１３Ｄ、Ｑ５０２Ｈである。
いくつかの実施形態では、ＥＲ ＤＲＤは、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１ＲまたはＹ５３７Ｓから独立して選択される１つ以上の変異をさらに含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、以下を含む：ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｆ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｌ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｙ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｈ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｑ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｉ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｋ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｖ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｓ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｃ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｗ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｐ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｒ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｔ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ａ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｅ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｎ４１３Ｇ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｆ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｌ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｙ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｈ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｉ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｍ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｎ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｋ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｖ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｓ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｃ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｗ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｐ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｔ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ａ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｄ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、ＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｅ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）、及びＥＲ（ＷＴのａａ３０５～５４９、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｑ５０２Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ）。
ＣＡ２ ＤＲＤ
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ヒト炭酸脱水酵素２（ｈＣＡ２）に由来してよく、これは金属酵素のスーパーファミリーである炭酸脱水酵素のメンバーである。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＣＡ２タンパク質に由来し、少なくとも１つの変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＣＡ２タンパク質に由来し、２つ以上の変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＣＡ２タンパク質に由来し、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ＣＡ２（配列番号．５）のアミノ酸１～２６０に由来してよい。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、親ＣＡ２配列のアミノ酸２～２６０（例えば、配列番号．５のアミノ酸２～２６０）を含むＣＡ２に由来する。これは、本明細書ではＣＡ２ Ｍ１ｄｅｌ変異と称される。一実施形態では、ＣＡ２に由来するＤＲＤは、親ＣＡ２配列のアミノ酸２～２３７（例えば、配列番号．５のアミノ酸２～２３７）を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）の領域またはその全体を含み、配列番号．５と比較してＥ１０６Ｄ、Ｇ６３Ｄ、Ｈ１２２Ｙ、Ｉ５９Ｎ、Ｌ１５６Ｈ、Ｌ１８３Ｓ、Ｌ１９７Ｐ、Ｓ５６Ｆ、Ｓ５６Ｎ、Ｗ２０８Ｓ、Ｙ１９３Ｉ、及びＹ５１Ｔから選択される変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）の領域またはその全体を含み、配列番号．５と比較してＡ１１５Ｌ、Ａ１１６Ｑ、Ａ１１６Ｖ、Ａ１３３Ｌ、Ａ１３３Ｔ、Ａ１４１Ｐ、Ａ１５２Ｄ、Ａ１５２Ｌ、Ａ１５２Ｒ、Ａ１７３Ｃ、Ａ１７３Ｇ、Ａ１７３Ｌ、Ａ１７３Ｔ、Ａ２３Ｐ、Ａ２４７Ｌ、Ａ２４７Ｓ、Ａ２５７Ｌ、Ａ２５７Ｓ、Ａ３８Ｐ、Ａ３８Ｖ、Ａ５４Ｑ、Ａ５４Ｖ、Ａ５４Ｘ、Ａ６５Ｌ、Ａ６５Ｎ、Ａ６５Ｖ、Ａ７７Ｉ、Ａ７７Ｐ、Ａ７７Ｑ、Ｃ２０５Ｍ、Ｃ２０５Ｒ、Ｃ２０５Ｖ、Ｃ２０５Ｗ、Ｃ２０５Ｙ、Ｄ１０１Ｇ、Ｄ１０１Ｍ、Ｄ１１０Ｉ、Ｄ１２９Ｉ、Ｄ１３８Ｇ、Ｄ１３８Ｍ、Ｄ１３８Ｎ、Ｄ１６１＊、Ｄ１６１Ｍ、Ｄ１６１Ｖ、Ｄ１６４Ｇ、Ｄ１６４Ｉ、Ｄ１７４＊、Ｄ１７４Ｔ、Ｄ１７９Ｅ、Ｄ１７９Ｉ、Ｄ１７９Ｒ、Ｄ１８９Ｇ、Ｄ１８９Ｉ、Ｄ１９Ｔ、Ｄ１９Ｖ、Ｄ２４２Ｇ、Ｄ２４２Ｔ、Ｄ３２Ｔ、Ｄ３４Ｔ、Ｄ４１Ｔ、Ｄ５２Ｉ、Ｄ５２Ｌ、Ｄ７１Ｆ、Ｄ７１Ｇ、Ｄ７１Ｋ、Ｄ７１Ｍ、Ｄ７１Ｓ、Ｄ７１Ｙ、Ｄ７２Ｉ、Ｄ７２Ｓ、Ｄ７２Ｔ、Ｄ７２Ｘ、Ｄ７５Ｔ、Ｄ７５Ｖ、Ｄ８５Ｍ、Ｅ１０６Ｄ、Ｅ１０６Ｇ、Ｅ１０６Ｓ、Ｅ１１７＊、Ｅ１１７Ｎ、Ｅ１４Ｎ、Ｅ１８６＊、Ｅ１８６Ｎ、Ｅ２０４Ａ、Ｅ２０４Ｄ、Ｅ２０４Ｇ、Ｅ２０４Ｎ、Ｅ２１３＊、Ｅ２１３Ｇ、Ｅ２１３Ｎ、Ｅ２２０Ｋ、Ｅ２２０Ｒ、Ｅ２２０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ、Ｅ２３３Ｇ、Ｅ２３３Ｒ、Ｅ２３５＊、Ｅ２３５Ｇ、Ｅ２３５Ｎ、Ｅ２３７Ｋ、Ｅ２３７Ｒ、Ｅ２３８＊、Ｅ２３８Ｎ、Ｅ２３８Ｒ、Ｅ２６Ｓ、Ｅ６９Ｄ、Ｅ６９Ｋ、Ｅ６９Ｓ、Ｆ１３０Ｌ、Ｆ１４６Ｖ、Ｆ１７５Ｉ、Ｆ１７５Ｌ、Ｆ１７５Ｓ、Ｆ１７８Ｌ、Ｆ１７８Ｓ、Ｆ２０Ｌ、Ｆ２０Ｓ、Ｆ２２５Ｉ、Ｆ２２５Ｌ、Ｆ２２５Ｓ、Ｆ２２５Ｙ、Ｆ２３０Ｉ、Ｆ２３０Ｌ、Ｆ２３０Ｓ、Ｆ２５９Ｌ、Ｆ２５９Ｓ、Ｆ６６Ｓ、Ｆ７０Ｉ、Ｆ７０Ｌ、Ｆ９５Ｙ、Ｇ１０２Ｄ、Ｇ１０４Ｒ、Ｇ１０４Ｖ、Ｇ１２８Ｒ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｅ、Ｇ１３１Ｅ、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｗ、Ｇ１３９Ｄ、Ｇ１４４Ｄ、Ｇ１４４Ｖ、Ｇ１５０Ａ、Ｇ１５０Ｓ、Ｇ１５０Ｗ、Ｇ１５５Ａ、Ｇ１５５Ｃ、Ｇ１５５Ｄ、Ｇ１５５Ｓ、Ｇ１７０Ａ、Ｇ１７０Ｄ、Ｇ１８２Ａ、Ｇ１８２Ｗ、Ｇ１９５Ａ、Ｇ１９５Ｒ、Ｇ２３２Ｒ、Ｇ２３２Ｗ、Ｇ２３４Ｌ、Ｇ２３４Ｖ、Ｇ２５Ｅ、Ｇ６３Ｄ、Ｇ６３Ｖ、Ｇ８１Ｅ、Ｇ８１Ｖ、Ｇ８２Ｄ、Ｇ８６Ａ、Ｇ８６Ｄ、Ｇ９８Ｖ、Ｈ１０７Ｉ、Ｈ１０７Ｑ、Ｈ１１９Ｔ、Ｈ１１９Ｙ、Ｈ１２２Ｔ、Ｈ１２２Ｙ、Ｈ１５Ｌ、Ｈ１５Ｔ、Ｈ１５Ｙ、Ｈ１７Ｄ、Ｈ１７Ｉ、Ｈ３６Ｉ、Ｈ３６Ｑ、Ｈ６４Ｍ、Ｈ９４Ｔ、Ｈ９６Ｔ、Ｉ１４５Ｆ、Ｉ１４５Ｍ、Ｉ１６６Ｈ、Ｉ１６６Ｌ、Ｉ２０９Ｄ、Ｉ２０９Ｌ、Ｉ２１５Ｈ、Ｉ２１５Ｓ、Ｉ２２Ｌ、Ｉ２５５Ｎ、Ｉ２５５Ｓ、Ｉ３３Ｓ、Ｉ５９Ｆ、Ｉ５９Ｎ、Ｉ５９Ｓ、Ｉ９１Ｆ、Ｋ１１１Ｅ、Ｋ１１１Ｎ、Ｋ１１２Ｒ、Ｋ１１３Ｉ、Ｋ１１３Ｎ、Ｋ１２６Ｎ、Ｋ１３２Ｅ、Ｋ１３２Ｒ、Ｋ１４８Ｅ、Ｋ１４８Ｒ、Ｋ１５３＊、Ｋ１５３Ｎ、Ｋ１５８Ｅ、Ｋ１５８Ｎ、Ｋ１６７＊、Ｋ１６９Ｎ、Ｋ１６９Ｒ、Ｋ１７１Ｑ、Ｋ１７１Ｒ、Ｋ１８Ｒ、Ｋ２１２Ｎ、Ｋ２１２Ｑ、Ｋ２１２Ｒ、Ｋ２１２Ｗ、Ｋ２２４Ｅ、Ｋ２２４Ｎ、Ｋ２２７＊、Ｋ２２７Ｎ、Ｋ２４Ｒ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５６Ｑ、Ｋ２６０Ｆ、Ｋ２６０Ｌ、Ｋ２６０Ｑ、Ｋ３９Ｓ、Ｋ４５Ｎ、Ｋ４５Ｓ、Ｋ８０Ｍ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１１８Ｆ、Ｌ１２０Ｗ、Ｌ１４０Ｖ、Ｌ１４０Ｗ、Ｌ１４３＊、Ｌ１４７＊、Ｌ１４７Ｆ、Ｌ１５６Ｆ、Ｌ１５６Ｈ、Ｌ１５６Ｐ、Ｌ１５６Ｑ、Ｌ１６３Ａ、Ｌ１６３Ｗ、Ｌ１８３Ｐ、Ｌ１８３Ｓ、Ｌ１８４Ｆ、Ｌ１８４Ｐ、Ｌ１８８Ｐ、Ｌ１８８Ｗ、Ｌ１９７＊、Ｌ１９７Ｍ、Ｌ１９７Ｐ、Ｌ１９７Ｒ、Ｌ１９７Ｔ、Ｌ２０２Ｆ、Ｌ２０２Ｈ、Ｌ２０２Ｉ、Ｌ２０２Ｐ、Ｌ２０２Ｒ、Ｌ２０２Ｓ、Ｌ２０３Ｐ、Ｌ２０３Ｓ、Ｌ２０３Ｗ、Ｌ２１１＊、Ｌ２１１Ａ、Ｌ２１１Ｓ、Ｌ２２３＊、Ｌ２２３Ｉ、Ｌ２２３Ｖ、Ｌ２２８Ｆ、Ｌ２２８Ｈ、Ｌ２２８Ｔ、Ｌ２３９＊、Ｌ２３９Ｆ、Ｌ２３９Ｔ、Ｌ２５０＊、Ｌ２５０Ｐ、Ｌ２５０Ｔ、Ｌ４４＊、Ｌ４４Ｍ、Ｌ４７Ｃ、Ｌ４７Ｖ、Ｌ５７＊、Ｌ５７Ｘ、Ｌ６０Ｓ、Ｌ７９Ｆ、Ｌ７９Ｓ、Ｌ８４Ｗ、Ｌ９０＊、Ｌ９０Ｖ、Ｍ２４０Ｄ、Ｍ２４０Ｌ、Ｍ２４０Ｒ、Ｍ２４０Ｗ、Ｎ１１Ｄ、Ｎ１１Ｋ、Ｎ１２４Ｔ、Ｎ１７７＊、Ｎ１７７Ｔ、Ｎ２２９＊、Ｎ２２９Ｔ、Ｎ２３１Ｄ、Ｎ２３１Ｆ、Ｎ２３１Ｋ、Ｎ２３１Ｌ、Ｎ２３１Ｍ、Ｎ２３１Ｑ、Ｎ２３１Ｔ、Ｎ２４３Ｑ、Ｎ２４３Ｔ、Ｎ２５２Ｅ、Ｎ２５２Ｔ、Ｎ６１Ｒ、Ｎ６１Ｔ、Ｎ６１Ｙ、Ｎ６２Ｋ、Ｎ６２Ｍ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｔ、Ｐ１３７Ｌ、Ｐ１３Ａ、Ｐ１３Ｈ、Ｐ１３Ｌ、Ｐ１３Ｓ、Ｐ１５４Ｌ、Ｐ１５４Ｒ、Ｐ１５４Ｔ、Ｐ１８０Ｌ、Ｐ１８０Ｓ、Ｐ１８５Ｌ、Ｐ１８５Ｓ、Ｐ１８５Ｖ、Ｐ１９４Ｑ、Ｐ２００Ａ、Ｐ２００Ｌ、Ｐ２００Ｓ、Ｐ２００Ｔ、Ｐ２０１Ａ、Ｐ２０１Ｌ、Ｐ２０１Ｒ、Ｐ２０１Ｓ、Ｐ２１４Ｔ、Ｐ２３６Ｌ、Ｐ２３６Ｔ、Ｐ２４６Ｌ、Ｐ２４６Ｑ、Ｐ２４９Ａ、Ｐ２４９Ｆ、Ｐ２４９Ｈ、Ｐ２４９Ｉ、Ｐ２４９Ｘ、Ｐ３０Ｌ、Ｐ３０Ｓ、Ｐ４２Ｌ、Ｐ８３Ａ、Ｑ１０３Ｋ、Ｑ１３５Ｓ、Ｑ１３６Ｎ、Ｑ１５７Ｒ、Ｑ１５７Ｓ、Ｑ２２１Ａ、Ｑ２２１Ｒ、Ｑ２４８Ｆ、Ｑ２４８Ｌ、Ｑ２４８Ｓ、Ｑ２５４Ａ、Ｑ２５４Ｋ、Ｑ２８Ｓ、Ｑ５３Ｈ、Ｑ５３Ｋ、Ｑ５３Ｎ、Ｑ７４Ｒ、Ｑ９２Ｈ、Ｑ９２Ｓ、Ｒ１８１Ｈ、Ｒ１８１Ｓ、Ｒ１８１Ｖ、Ｒ２２６Ｈ、Ｒ２２６Ｐ、Ｒ２２６Ｖ、Ｒ２４５Ａ、Ｒ２５３Ｇ、Ｒ２５３Ｑ、Ｒ２７Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ８９Ｄ、Ｒ８９Ｆ、Ｒ８９Ｉ、Ｒ８９Ｘ、Ｒ８９Ｙ、Ｓ１０５Ｌ、Ｓ１０５Ｑ、Ｓ１５１Ａ、Ｓ１５１Ｉ、Ｓ１５１Ｑ、Ｓ１６５Ｆ、Ｓ１６５Ｐ、Ｓ１７２Ｅ、Ｓ１７２Ｖ、Ｓ１８７Ｉ、Ｓ１８７Ｐ、Ｓ１９６Ｈ、Ｓ１９６Ｌ、Ｓ２１６Ａ、Ｓ２１６Ｑ、Ｓ２１８Ａ、Ｓ２１８Ｑ、Ｓ２１９Ａ、Ｓ２１９Ｑ、Ｓ２５８Ｆ、Ｓ２５８Ｐ、Ｓ２９Ｃ、Ｓ２９Ｐ、Ｓ４３Ｐ、Ｓ４３Ｔ、Ｓ４８Ｌ、Ｓ５０Ｐ、Ｓ５６Ｆ、Ｓ５６Ｎ、Ｓ５６Ｐ、Ｓ５６Ｘ、Ｓ７３Ｌ、Ｓ７３Ｎ、Ｓ７３Ｘ、Ｓ９９Ｈ、Ｔ１０８Ｌ、Ｔ１２５Ｉ、Ｔ１２５Ｐ、Ｔ１６８Ｋ、Ｔ１６８Ｎ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７６Ｈ、Ｔ１７６Ｌ、Ｔ１９２Ｄ、Ｔ１９２Ｆ、Ｔ１９２Ｉ、Ｔ１９２Ｎ、Ｔ１９２Ｐ、Ｔ１９２Ｘ、Ｔ１９８Ｄ、Ｔ１９８Ｉ、Ｔ１９８Ｐ、Ｔ１９９Ａ、Ｔ１９９Ｈ、Ｔ１９９Ｐ、Ｔ２０７Ｄ、Ｔ２０７Ｉ、Ｔ２０７Ｐ、Ｔ２０７Ｓ、Ｔ３５Ｉ、Ｔ３５Ｌ、Ｔ３７Ｑ、Ｔ５５Ｌ、Ｔ８７Ｌ、Ｖ１０９Ｍ、Ｖ１０９Ｗ、Ｖ１２１Ｆ、Ｖ１３４Ｃ、Ｖ１３４Ｆ、Ｖ１４２Ｆ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１５９Ｌ、Ｖ１５９Ｓ、Ｖ１６０Ｃ、Ｖ１６０Ｌ、Ｖ１６２Ａ、Ｖ１６２Ｃ、Ｖ２０６＊、Ｖ２０６Ｃ、Ｖ２０６Ｍ、Ｖ２１０Ｃ、Ｖ２１７Ｌ、Ｖ２１７Ｒ、Ｖ２１７Ｓ、Ｖ２２２Ａ、Ｖ２２２Ｃ、Ｖ２２２Ｇ、Ｖ２４１Ｇ、Ｖ２４１Ｗ、Ｖ２４１Ｘ、Ｖ３１Ｌ、Ｖ４９Ｆ、Ｖ６８Ｌ、Ｖ６８Ｗ、Ｖ７８Ｃ、Ｗ１２３Ｇ、Ｗ１２３Ｒ、Ｗ１６Ｇ、Ｗ１９１＊、Ｗ１９１Ｇ、Ｗ１９１Ｌ、Ｗ２０８Ｇ、Ｗ２０８Ｌ、Ｗ２０８Ｓ、Ｗ２４４＊、Ｗ２４４Ｇ、Ｗ２４４Ｌ、Ｗ９７Ｃ、Ｗ９７Ｇ、Ｙ１１４Ｈ、Ｙ１１４Ｍ、Ｙ１２７Ｍ、Ｙ１９０＊、Ｙ１９０Ｌ、Ｙ１９０Ｔ、Ｙ１９３Ｃ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ１９３Ｉ、Ｙ１９３Ｌ、Ｙ１９３Ｔ、Ｙ１９３Ｖ、Ｙ１９３Ｘ、Ｙ４０Ｍ、Ｙ５１Ｆ、Ｙ５１Ｍ、Ｙ５１Ｔ、Ｙ５１Ｘ、Ｙ８８Ｔ、Ｋ９Ｎ、及びＳ２９Ａから選択される変異をさらに含む。本明細書で使用される場合、「＊」は終止コドンの翻訳を示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）の領域またはその全体を含み、配列番号．５と比較して２つ以上の変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｒ２７Ｌ、Ｈ１２２Ｙ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｔ８７Ｉ、Ｈ１２２Ｙ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｈ１２２Ｙ、Ｎ２５２Ｄ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｖ２４１Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｖ２４１Ｆ、Ｐ２４９Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｐ２４９Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｌ、Ｌ２５０Ｒ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｐ２４９Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｔ５５Ｋ、Ｇ６３Ｎ、Ｑ２４８Ｎ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ａ２５７ｄｅｌ、Ｓ２５８ｄｅｌ、Ｆ２５９ｄｅｌ、Ｋ２６０ｄｅｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ｓ２ｄｅｌ、Ｈ３ｄｅｌ、Ｈ４ｄｅｌ、Ｗ５ｄｅｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｗ４Ｙ、Ｌ１５６Ｈ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ｇ２３４ｄｅｌ、Ｅ２３５ｄｅｌ、Ｐ２３６ｄｅｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ｆ２２５Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７０Ｎ、Ｄ７４Ｎ、Ｄ１００Ｎ、Ｌ１５６Ｈ）、（ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｉ５９Ｎ、Ｇ１０２Ｒ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｇ６３Ｄ、Ｅ６９Ｖ、Ｎ２３１Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｒ２７Ｌ、Ｔ８７Ｉ、Ｈ１２２Ｙ、Ｎ２５２Ｄ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｖ２４１Ｆ、Ｐ２４９Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｌ、Ｔ８７Ｎ、Ｌ２５０Ｒ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ｓ１７２Ｃ、Ｆ１７８Ｙ、Ｅ１８６Ｄ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ａ７７Ｉ、Ｐ２４９Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｅ１０６Ｄ、Ｃ２０５Ｓ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｃ２０５Ｓ、Ｗ２０８Ｓ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ７３Ｎ、Ｒ８９Ｙ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｋ、Ｔ１９２Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ７３Ｎ、Ｒ８９Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｇ６３Ｄ、Ｍ２４０Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｖ１３４Ｆ、Ｌ２２８Ｆ）、またはＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ５６Ｆ、Ｄ７１Ｓ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｒ２７Ｌ、Ｈ１２２Ｙ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｔ８７Ｉ、Ｈ１２２Ｙ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｈ１２２Ｙ、Ｎ２５２Ｄ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｖ２４１Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｖ２４１Ｆ、Ｐ２４９Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｐ２４９Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｌ、Ｌ２５０Ｒ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｐ２４９Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｔ５５Ｋ、Ｇ６３Ｎ、Ｑ２４８Ｎ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ａ２５７ｄｅｌ、Ｓ２５８ｄｅｌ、Ｆ２５９ｄｅｌ、Ｋ２６０ｄｅｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ｓ２ｄｅｌ、Ｈ３ｄｅｌ、Ｈ４ｄｅｌ、Ｗ５ｄｅｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｗ４Ｙ、Ｌ１５６Ｈ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ｇ２３４ｄｅｌ、Ｅ２３５ｄｅｌ、Ｐ２３６ｄｅｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ｆ２２５Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７０Ｎ、Ｄ７４Ｎ、Ｄ１００Ｎ、Ｌ１５６Ｈ）、（ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｉ５９Ｎ、Ｇ１０２Ｒ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｇ６３Ｄ、Ｅ６９Ｖ、Ｎ２３１Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｒ２７Ｌ、Ｔ８７Ｉ、Ｈ１２２Ｙ、Ｎ２５２Ｄ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｖ２４１Ｆ、Ｐ２４９Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｌ、Ｔ８７Ｎ、Ｌ２５０Ｒ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１５６Ｈ、Ｓ１７２Ｃ、Ｆ１７８Ｙ、Ｅ１８６Ｄ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｆ、Ｎ２３１Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ａ７７Ｉ、Ｐ２４９Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｋ、Ｐ２４９Ｈ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｐ２４９Ｈ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｑ５３Ｎ、Ｎ６１Ｙ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｅ１０６Ｄ、Ｃ２０５Ｓ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｃ２０５Ｓ、Ｗ２０８Ｓ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ７３Ｎ、Ｒ８９Ｙ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｋ、Ｔ１９２Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｙ１９３Ｌ、Ｋ２６０Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｆ、Ｖ２４１Ｆ、Ｐ２４９Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ１４７Ｆ、Ｑ２４８Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ５２Ｉ、Ｓ２５８Ｐ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｓ、Ｔ１９２Ｎ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ１７９Ｅ、Ｔ１９２Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ５６Ｎ、Ｑ１０３Ｋ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｙ、Ｑ２４８Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ７３Ｎ、Ｒ８９Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｋ、Ｎ２３１Ｌ、Ｅ２３５Ｇ、Ｌ２３９Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｆ、Ｐ２４９Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｘ、Ｖ２４１Ｘ、Ｐ２４９Ｘ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ａ５４Ｘ、Ｓ５６Ｘ、Ｌ５７Ｘ、Ｔ１９２Ｘ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｙ１９３Ｖ、Ｋ２６０Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｇ６３Ｄ、Ｍ２４０Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｖ１３４Ｆ、Ｌ２２８Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｇ、Ｎ２３１Ｋ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ５６Ｆ、Ｄ７１Ｓ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ５２Ｌ、Ｇ１２８Ｒ、Ｑ２４８Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ７３Ｘ、Ｒ８９Ｘ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｙ５１Ｘ、Ｄ７２Ｘ、Ｖ２４１Ｘ、Ｐ２４９Ｘ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７２Ｉ、Ｗ９７Ｃ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７１Ｋ、Ｔ１９２Ｆ、Ｎ２３１Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｈ３６Ｑ、Ｓ４３Ｔ、Ｙ５１Ｆ、Ｎ６７Ｄ、Ｇ１３１Ｗ、Ｒ２２６Ｈ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｆ７０Ｉ、Ｆ１４６Ｖ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｋ４５Ｎ、Ｖ６８Ｌ、Ｈ１１９Ｙ、Ｋ１６９Ｒ、Ｄ１７９Ｅ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｈ１５Ｌ、Ａ５４Ｖ、Ｋ１１１Ｅ、Ｅ２２０Ｋ、Ｆ２２５Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｐ１３Ｓ、Ｐ８３Ａ、Ｄ１０１Ｇ、Ｋ１１１Ｎ、Ｆ２３０Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｇ６３Ｄ、Ｗ１２３Ｒ、Ｅ２２０Ｋ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｎ１１Ｄ、Ｅ６９Ｋ、Ｇ８６Ｄ、Ｖ１０９Ｍ、Ｋ１１３Ｉ、Ｔ１２５Ｉ、Ｄ１３８Ｇ、Ｇ１５５Ｓ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｉ５９Ｎ、Ｇ１０２Ｒ、Ａ１７３Ｔ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ７９Ｆ、Ｐ１８０Ｓ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ａ７７Ｐ、Ｇ１０２Ｒ、Ｄ１３８Ｎ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｆ２０Ｌ、Ｋ４５Ｎ、Ｇ６３Ｄ、Ｅ６９Ｖ、Ｎ２３１Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｔ１９９Ｎ、Ｌ２０２Ｐ、Ｌ２２８Ｆ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｋ９Ｎ、Ｈ１２２Ｙ、Ｔ１６８Ｋ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｑ５３Ｈ、Ｌ９０Ｖ、Ｑ９２Ｈ、Ｇ１３１Ｅ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｌ４４Ｍ、Ｌ４７Ｖ、Ｎ６２Ｋ、Ｅ６９Ｄ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｄ７５Ｖ、Ｋ１６９Ｎ、Ｆ２５９Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｔ２０７Ｓ、Ｖ２２２Ａ、Ｎ２３１Ｄ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｉ５９Ｆ、Ｖ２０６Ｍ、Ｇ２３２Ｒ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｐ１３Ａ、Ａ１３３Ｔ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｉ５９Ｎ、Ｒ８９Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ａ６５Ｎ、Ｇ８６Ｄ、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１５５Ｄ、Ｋ１５８Ｎ、Ｖ１６２Ａ、Ｇ１７０Ｄ、Ｐ２３６Ｌ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｇ１２Ｒ、Ｈ１５Ｙ、Ｄ１９Ｖ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ａ６５Ｖ、Ｆ９５Ｙ、Ｅ１０６Ｇ、Ｈ１０７Ｑ、Ｉ１４５Ｍ、Ｆ１７５Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｇ６３Ｄ、Ｅ６９Ｖ、Ｎ２３１Ｉ）、ＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ２９Ａ、Ｃ２０５Ｓ）及び／またはＣＡ２（ＷＴのａａ２～２６０、Ｓ２９Ｃ、Ｃ２０５Ｓ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５の１２２位（Ｈ１２２）にアミノ酸のＨ１２２Ｙ変異をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、ＤＲＤは、（ｉ）配列番号．５の２７位（Ｒ２７）におけるアミノ酸のＲ２７Ｌ変異、（ｉｉ）配列番号．５の８７位（Ｔ８７）におけるアミノ酸のＴ８７Ｉ変異、（ｉｉｉ）配列番号．５の２５２位（Ｎ２５２）におけるアミノ酸のＮ２５２Ｄ変異、あるいは（ｉ）、（ｉｉ）及び／または（ｉｉｉ）の組合せをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５の１０６位（Ｅ１０６）にアミノ酸のＥ１０６Ｄ変異をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、ＤＲＤは、配列番号．５の２０５位（Ｃ２０５）におけるアミノ酸のＣ２０５Ｓ変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５の２０８位（Ｗ２０８）にアミノ酸のＷ２０８Ｓ変異をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、ＤＲＤは、配列番号．５の２０５位（Ｃ２０５）におけるアミノ酸のＣ２０５Ｓ変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５の５９位（Ｉ５９）にアミノ酸のＩ５９Ｎ変異をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、ＤＲＤは、配列番号．５の１０２位（Ｇ１０２）におけるアミノ酸のＧ１０２Ｒ変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５の１５６位（Ｌ１５６）にアミノ酸のＬ１５６Ｈ変異をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、ＤＲＤは、（ｉ）配列番号．５の４位（Ｗ４）におけるアミノ酸のＷ４Ｙ変異、（ｉｉ）配列番号．５の２２５位（Ｆ２２５）におけるアミノ酸のＦ２２５Ｌ変異、（ｉｉｉ）配列番号．５の２５７～２６０位におけるアミノ酸の欠失、（ｉｖ）配列番号．５の１～５位におけるアミノ酸の欠失、または（ｖ）配列番号．５のアミノ酸Ｇ２３４、Ｅ２３５及びＰ２３６の欠失をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５と比較して４つの変異をさらに含み、変異は（ｉ）Ｌ１５６Ｈ、Ｓ１７２Ｃ、Ｆ１７８Ｙ、及びＥ１８６Ｄ、または（ｉｉ）Ｄ７０Ｎ、Ｄ７４Ｎ、Ｄ１００Ｎ、及びＬ１５６Ｈに対応する。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５と比較して第１変異及び第２変異をさらに含み、（ｉ）第１変異は、配列番号．５の７３位（Ｓ７３）におけるアミノ酸のＳ７３Ｎ変異であり、（ｉｉ）第２変異は、配列番号．５のアミノ酸８９位（Ｒ８９）におけるＦまたはＹの置換である。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５のアミノ酸５６位（Ｓ５６）にＮまたはＦの置換をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、ＤＲＤは、配列番号．５と比較してＳ５６Ｆ及びＤ７１Ｓに対応する２つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５と比較して１つ以上の置換をさらに含み、少なくとも１つの置換が、配列番号．５のアミノ酸６３位（Ｇ６３）におけるＤまたはＮの置換であり、１つ以上の置換は、（ｉ）Ｇ６３Ｄ、（ｉｉ）Ｇ６３Ｄ及びＭ２４０Ｌ、（ｉｉｉ）Ｇ６３Ｄ、Ｅ６９Ｖ及びＮ２３１Ｉ、または（ｉｖ）Ｔ５５Ｋ、Ｇ６３Ｎ及びＱ２４８Ｎに対応する。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５と比較して２つ以上の置換をさらに含み、２つ以上の置換のうち１つが、配列番号．５のアミノ酸７１位（Ｄ７１）におけるＬまたはＫの置換であり、２つ以上の置換は、（ｉ）Ｄ７１Ｌ及びＴ８７Ｎ、（ｉｉ）Ｄ７１Ｌ及びＬ２５０Ｒ、（ｉｉｉ）Ｄ７１Ｌ、Ｔ８７Ｎ及びＬ２５０Ｒ、または（ｉｖ）Ｄ７１Ｋ及びＴ１９２Ｆに対応する。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５と比較して２つ以上の置換をさらに含み、２つ以上の置換のうち少なくとも１つが、（ｉ）配列番号．５のアミノ酸２４１位（Ｖ２４１）におけるＦの置換、または（ｉｉ）配列番号．５のアミノ酸２４９位（Ｐ２４９）におけるＦもしくはＬの置換であり、２つ以上の置換は、（ｉ）Ｄ７２Ｆ及びＶ２４１Ｆ、（ｉｉ）Ｄ７２Ｆ及びＰ２４９Ｌ、（ｉｉｉ）Ｄ７２Ｆ及びＰ２４９Ｆ、（ｉｖ）Ｄ７２Ｆ、Ｖ２４１Ｆ及びＰ２４９Ｌ、（ｖ）Ａ７７Ｉ及びＰ２４９Ｆ、または（ｖｉ）Ｖ２４１Ｆ及びＰ２４９Ｌに対応する。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、全体的または部分的に、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２、配列番号．５）を含み、配列番号．５と比較してＹ５１Ｔ、Ｌ１８３Ｓ、Ｙ１９３Ｉ、Ｌ１９７ＰならびにＶ１３４Ｆ及びＬ２２８Ｆの組合せから選択される１つ以上の置換をさらに含む。
本開示に包含されるＤＲＤのアミノ酸配列は、それが由来する親タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性、好ましくは少なくとも約７５％または８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本開示に包含されるＤＲＤのアミノ酸配列は、それが由来する親タンパク質（例えば、配列番号：１、２、３、４、５、６、及び７１のいずれか１つのアミノ酸配列を有する親タンパク質）のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性、好ましくは少なくとも約７５％または８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
本開示のＤＲＤの例としては、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５に由来するものが挙げられる。好適なＤＲＤは、不安定化ドメインまたはリガンド結合ドメインと称されてよく、それらもまた当該技術分野において既知である。例えば、ＷＯ２０１８／１６１０００、ＷＯ２０１８／２３１７５９、ＷＯ２０１９／２４１３１５、ＵＳ８，１７３，７９２、ＵＳ８，５３０，６３６、ＷＯ２０１８／２３７３２３、ＷＯ２０１７／１８１１１９、ＵＳ２０１７／０１１４３４６、ＵＳ２０１９／０３００８６４、ＷＯ２０１７／１５６２３８、Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１３４：３９４２（２０１２）、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２６：９９５－１００４、Ｓｔａｎｋｕｎａｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１６１５－１６２４、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４：１１２３－１１２７、Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１７：９８１－９８８、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１００７－１００９、Ｍａｄｅｉｒａ ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：７５８３－７５８８、Ｐｒｕｅｔｔ－Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．５：ｅ１０００３７６、及びＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｅｌｉｆｅ ４：ｅ１０６０６を参照のこと。
「転写因子系」節において上で提供される通り、転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せが、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列を含み、転写因子（例えば、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、またはその両方）は、ＤＲＤに機能的に連結される。ＤＲＤをコードする核酸配列は、本明細書に記載されるＤＲＤの配列から選択されてよい。ＤＲＤ配列を含む構築物が、上表１に提供される。異なるＤＲＤを含む追加の構築物が、表４に提供される。表４のアスタリスク（「＊」）は、終止コドンの翻訳を示す。
Figure 2023509770000031
Figure 2023509770000032
Figure 2023509770000033
Figure 2023509770000034
Figure 2023509770000035
Figure 2023509770000036
転写因子系の刺激
本開示の転写因子系は、刺激に応答し得る。
いくつかの実施形態では、刺激はリガンドである。リガンドは、核酸ベース、タンパク質ベース、脂質ベース、有機、無機または前述の任意の組合せであってよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、合成分子であってよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、小分子治療用化合物であってよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの規制機関によってこれまでに承認された小分子薬であってよい。
本開示に記載されるように、転写因子系は、リガンド依存性活性を示し得る。リガンドはＤＲＤに結合し、転写因子系によってコードされる転写因子または転写因子のドメインを安定化させ得る。候補ＤＲＤと結合することが知られているリガンドは、転写因子系の活性に対するそれらの効果について試験され得る。
いくつかの実施形態では、リガンドは細胞透過性である。いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞透過性を改善するために親油性であるように設計されてよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは小分子である。小分子リガンドは、安全であり、適切な医薬動態及び分布を有すると臨床的に承認されている場合がある。
いくつかの実施形態では、リガンドは、１つ以上の他の分子、例えば、これらに限定されないが、別のリガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、脂質誘導体、ステロール、ステロイド、代謝産物、代謝産物誘導体または小分子などと複合化されるか、あるいはそれらに結合されてよい。いくつかの実施形態では、リガンド刺激は、１つ以上の異なる種類及び／または数の他の分子と複合化されるか、あるいはそれらに結合される。いくつかの実施形態では、リガンド刺激は、同じ種類のリガンドの多量体である。いくつかの実施形態では、リガンド刺激多量体は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超えるモノマーを含む。
ＣＡ２リガンド
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、炭酸脱水酵素に結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、炭酸脱水酵素に結合してその機能を阻害し、本明細書では炭酸脱水酵素阻害剤と称される。
いくつかの実施形態では、リガンドは、炭酸脱水酵素２に結合する小分子である。一実施形態では、小分子はＣＡ２阻害剤である。ＣＡ２阻害剤の例としては、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘとも称される）、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、ジクロフェナミド、エトキシゾラミド、ゾニサミド、ダンシルアミド、及びジクロルフェナミドが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ＣＡ２との結合を媒介することが知られている小分子の一部を含んでよい。リガンドはまた、ＣＡ２以外の炭酸脱水酵素へのオフターゲット結合を減少し、ＣＡ２への特異的結合を増加させるように改変されてよい。
いくつかの実施形態では、刺激は、２つ以上の炭酸脱水酵素に結合するリガンドであってよい。一実施形態では、刺激は、２つ以上の炭酸脱水酵素に結合する可能性がある汎炭酸脱水酵素阻害剤である。
ＤＨＦＲリガンド
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ジヒドロ葉酸レダクターゼに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、ジヒドロ葉酸レダクターゼに結合してその機能を阻害し、本明細書ではジヒドロ葉酸阻害剤と称される。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ヒトＤＨＦＲの選択的阻害剤であってよい。本開示のリガンドはまた、細菌及び寄生生物、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種などのジヒドロ葉酸レダクターゼの選択的阻害剤であってよい。他のＤＨＦＲに特異的なリガンドは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼへの結合を改善するために改変されてよい。
ジヒドロ葉酸阻害剤の例としては、トリメトプリム（ＴＭＰ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、プララトレキサート、ピリトレキシム、ピリメタミン、タロトレキシン、クロログアニド、ペンタミジン、トリメトレキサート、アミノプテリン、Ｃ１ ８９８三塩酸塩、ペメトレキセド二ナトリウム、ラルチトレキセド、スルファグアニジン、Ｆｏｌｏｔｙｎ、イクラプリム及びジアベリジンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ヒトＤＨＦＲに結合する可能性があるジヒドロ葉酸またはその誘導体のいずれかを含んでよい。いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、２，４，ジアミノ複素環式化合物であってよい。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸中の４－オキソ基は、ＤＨＦＲ阻害剤を生成するように改変されてよい。一例では、４－オキソ基は４－アミノ基で置き換えられてよい。プテリジン、キナゾリン、ピリドピリミジン、ピリミジン、及びトリアジンを含む様々なジアミノ複素環もまた、ＤＨＦＲ阻害剤を開発するための足場として使用されてよく、本開示に従って使用されてよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ＤＨＦＲへの結合を媒介することが知られているリガンドの一部を含有するＴＭＰ由来のリガンドを含む。リガンドはまた、他の葉酸代謝酵素へのオフターゲット結合を減少し、ＤＨＦＲへの特異的結合を増加させるように改変されてよい。
ＥＲリガンド
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ＥＲに結合する。リガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストであってよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＥＲに結合してその機能を阻害し、本明細書ではＥＲ阻害剤と称される。いくつかの実施形態では、リガンドは、ヒトＥＲの選択的阻害剤であってよい。本開示のリガンドはまた、他の種のＥＲの選択的阻害剤であってよい。他のＥＲに特異的なリガンドは、ヒトＥＲへの結合を改善するために改変されてよい。
リガンドは、ＥＲアゴニスト、例えば、これらに限定されないが、内因性エストロゲン１７ｂ－エストラジオール（Ｅ２）及び合成非ステロイド性エストロゲンジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などであってよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＥＲアンタゴニスト、例えば、ＩＣＩ－１６４，３８４、ＲＵ４８６、タモキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）、フルベストラント、トレミフェン、ラソフォキシフェン、クロミフェン、ｆｅｍａｒｅｌｌｅ及びオルメロキシフェン及びラロキシフェン（ＲＡＬ）などであってよい。
いくつかの実施形態では、本開示の刺激は、ＥＲアンタゴニスト、例えば、これらに限定されないが、バゼドキシフェン及び／またはラロキシフェンなどであってよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ＥＲへの結合を媒介することが知られているリガンドの一部を含有するバゼドキシフェン由来のリガンドを含む。リガンドはまた、他の葉酸代謝酵素へのオフターゲット結合を減少し、ＥＲ由来のＤＲＤへの特異的結合を増加させるように改変されてよい。
ホスホジエステラーゼリガンド
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ホスホジエステラーゼに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、ホスホジエステラーゼに結合してその機能を阻害し、本明細書ではホスホジエステラーゼ阻害剤と称される。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ホスホジエステラーゼ５に結合する小分子である。一実施形態では、小分子はｈＰＤＥ５阻害剤である。ｈＰＤＥ５阻害剤の例としては、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ベンザミデナフィル、ダサンタフィル、ベミナフィル、ＳＬｘ－２１０１、ＬＡＳ３４１７９、ＵＫ－３４３，６６４、ＵＫ－３５７９０３、ＵＫ－３７１８００、及びＢＭＳ－３４１４００が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ５への結合を媒介することが知られているリガンドの一部を含有するシルデナフィル由来のリガンドを含む。リガンドはまた、ホスホジエステラーゼへのオフターゲット結合を減少し、ｈＰＤＥ５への特異的結合を増加させるように改変されてよい。
いくつかの実施形態では、刺激は、２つ以上のホスホジエステラーゼに結合するリガンドであってよい。一実施形態では、刺激は、２つ以上のｈＰＤＥに結合する可能性がある汎ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えば、アミノフィリン、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、ジピリダモール、テオフィリン、ザプリナスト、イカリイン、ＣＤＰ－８４０、エタゾレート及びグラウシンなどである。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ１阻害剤である。いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ２阻害剤である。いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ３阻害剤である。いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ４阻害剤である。いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ６阻害剤である。いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ７阻害剤である。いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ８阻害剤である。いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ９阻害剤である。いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ１０阻害剤である。
ＦＫＢＰリガンド
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ヒトＦＫＢＰを含むＦＫＢＰに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＳＬＦまたはＳｈｉｅｌｄ－１である。
ペイロード
ペイロードは、任意のポリペプチドもしくは任意のタンパク質またはその断片を含む場合がある。ペイロードは、野生型配列、野生型配列の断片の場合がある、及び／または１つ以上の変異を含む場合がある。ペイロードは、生物ゲノムに由来する天然タンパク質、またはそのバリアント、変異体、及び誘導体の場合がある。天然タンパク質は、例えば、哺乳動物生物、細菌、及びウイルスに由来する場合がある。ペイロードは、組換え核酸分子によってコードされるタンパク質もしくはポリペプチド、融合もしくはキメラポリペプチド、またはタンパク質複合体の一部として機能するポリペプチドの場合がある。
一例では、ペイロードは、ヒトゲノムの核酸配列によってコードされるポリペプチドの場合がある。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、親ポリペプチドのバリアント配列であってよい。いくつかの態様では、バリアント配列は、参照配列と同じまたは類似した活性を有してよい。あるいは、バリアントは、参照配列と比較して変化した活性（例えば、増加または減少）を有してよい。一般に、本開示の特定のポリペプチドのバリアントは、当業者に既知の配列アラインメントプログラムによって決定されるように、その特定の参照ポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有することになる。
ペイロードとしての治療剤
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、治療剤であってよい。例えば、ペイロードは、がん治療剤、自己免疫疾患の治療剤、免疫療法剤、抗炎症剤、抗病原体剤または遺伝子治療剤であってよい。いくつかの態様では、免疫療法剤は、抗体ならびにその断片及びバリアント、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、共抑制分子のアンタゴニスト、共刺激分子のアゴニスト、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、代謝因子、凝固因子、酵素、ホーミング受容体ならびに安全スイッチであってよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、生物内で免疫応答を誘導する免疫療法剤であってよい。免疫療法剤は、抗体ならびにその断片及びバリアント、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン－サイトカイン受容体融合ポリペプチド、または免疫応答を誘導する任意の薬剤であってよいが、これらに限定されない。一実施形態では、免疫療法剤は、細胞、または対象中で抗がん免疫応答を誘導する。
ペイロードとしてのサイトカイン、ケモカイン及び他の可溶性因子
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、免疫細胞、がん細胞及び他の細胞型によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、成長因子、及び可溶性タンパク質であってよく、これらは体内の細胞と組織との間の化学伝達物質として作用する。これらのタンパク質は、細胞の成長、分化、遊走及び生存に対する効果から多数のエフェクター活性まで幅広い生理機能を媒介する。例えば、活性化Ｔ細胞は、腫瘍細胞を排除する細胞傷害性機能のために様々なサイトカインを産生する。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、サイトカイン、ならびにその断片、バリアント、類似体及び誘導体であってよく、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＴＧＦベータ及びケモカインを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明のペイロードは、免疫応答を刺激するサイトカインであってよい。他の実施形態では、本発明のペイロードは、抗がん免疫応答に負の影響を与えるサイトカインのアンタゴニストであってよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、サイトカイン受容体、その組換え受容体、バリアント、類似体及び誘導体、またはサイトカインのシグナル構成要素であってよい。様々な実施形態では、本開示のペイロードは、分泌サイトカインまたはサイトカインの膜結合型を含んでよい。膜サイトカインの例示的な例としては、膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、Ｂ７－１膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ－４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域に機能的に融合、連結または結合されているサイトカイン（例えば、免疫刺激性サイトカイン、例えば、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ１５及びＩＬ１８）が挙げられてよい。様々な実施形態では、サイトカインは、リンカー、ヒンジ、膜貫通尾部などの介在ペプチドまたはタンパク質配列によって膜貫通ドメインに融合または結合されてよい。
一実施形態では、本開示のペイロードは、ＴＮＦアルファ外部ドメインに融合されるサイトカインであってよい。そのようなペイロードは、ＴＮＦ外部ドメインに融合される膜関連サイトカインとして産生される。一実施形態では、サイトカインは、膜関連プロテアーゼ、及び／または細胞外空間のプロテアーゼ、例えば、ＭＭＰ９の作用によって細胞表面から脱落してよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、インターロイキン（ＩＬ）サイトカインであってよい。インターロイキン（ＩＬ）は、免疫応答を制御するために白血球によって産生される糖タンパク質のクラスである。本明細書で使用される場合、「インターロイキン（ＩＬ）」という用語は、任意の種または供給源からのインターロイキンポリペプチドを指し、全長タンパク質に加えてタンパク質の断片または一部を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、ＩＬ１２を含んでよい。ＩＬ１２は、マクロファージ及び樹状細胞などの抗原提示細胞によって分泌される２つのサブユニット（ｐ３５、ｐ４０）のヘテロ二量体タンパク質である。ＩＬ１２の発現には、生物学的に活性なヘテロ二量体を産生するために２つのサブユニットの同時発現が必要である。いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、ｐ３５サブユニットまたはｐ４０サブユニットであってよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、ＩＬ１２全体またはその一部を含んでよい。
いくつかの実施形態では、ＩＬ１２はＦｌｅｘｉ ＩＬ１２であってよく、ｐ３５及びｐ４０サブユニットの両方が、一本鎖ポリペプチドを産生する単一のｃＤＮＡによってコードされる。一本鎖ポリペプチドは、一本鎖ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にｐ３５サブユニットを配置することによって生成されてよい。同様に、ｐ４０サブユニットは、一本鎖ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にあってよい。
本開示のＩＬ１２ペイロードの形式は、最適化されてよい。一実施形態では、ペイロードは、単一ベクターからのサブユニット両方の独立した発現を可能にするために、内部リボソーム進入部位またはＰ２Ａもしくはフューリンなどの切断部位によって分離されるｐ４０及びｐ３５サブユニットを含有するバイシストロニックＩＬ１２であってよい。別の実施形態では、ペイロードは、ＩＬ１２のｐ４０サブユニットまたはＩＬ１２のｐ３５サブユニットであってよい。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、膜に結合されているＩＬ１２であってよい。ＩＬ１２は、膜貫通ドメインによって膜に結合されてよい。膜貫通ドメインはまた、任意のヒンジドメインを含んでよい。いくつかの態様では、ＩＬ１２分子は細胞外に存在し、膜貫通ドメインによって細胞につながれている。いくつかの態様では、膜結合ＩＬ１２は、プロテアーゼの作用によって細胞表面から脱落または切断されてよい。いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、天然源に、または合成源のいずれかに由来してよい。膜貫通ドメインは、任意の天然膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してよい。あるいは、本開示の膜貫通ドメインは合成であってよい。いくつかの態様では、合成配列は、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性残基を含んでよい。いくつかの態様では、プロテアーゼの活性に耐性がある膜貫通及び／またはヒンジドメインが選択されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、ＩＬ１５を含んでよい。インターロイキン１５は強力な免疫刺激性サイトカインであり、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞に不可欠な生存因子である。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、ＩＬ１５全体またはその一部を含んでよい。全長または成熟ＩＬ１５の１つ以上の機能を保持するＩＬ１５の任意の一部が、本開示において有用な場合がある。そのような機能としては、ＮＫ細胞の生存の促進、ＮＫ細胞及びＴ細胞の活性化及び増殖の制御に加えて造血幹細胞からのＮＫ細胞発達の支援が挙げられる。
いくつかの場合では、ＩＬ１５全体またはその一部が、１つ以上の膜貫通タンパク質全体またはその一部に連結される。
ＩＬ１５ペイロードは、分泌されるように（例えば、ＩＬ２シグナル配列を使用して）、または膜結合されるように（例えば、ＩｇＥもしくはＣＤ８ａシグナル配列を使用して）設計されてよい。
ＩＬ１５媒介活性化の特有の特徴は、ＩＬ１５が、同じ細胞または異なる細胞上のいずれかで膜結合型ＩＬ１５ベータ／ガンマ受容体に結合してそれを活性化する、ＩＬ１５受容体のアルファサブユニット（ＩＬ１５Ｒａ）との複合体として提示されるトランス提示の機構である。いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、膜結合型ＩＬ１５である。いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＩＬ１５Ｒａ全体またはその一部に融合されるＩＬ１５全体またはその一部であってよい。全長または成熟ＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒａのそれぞれの１つ以上の機能を保持するＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒａの任意の一部が、使用されてよい。
いくつかの態様では、ＩＬ１５分子は細胞外に存在し、膜貫通ドメインによって細胞につながれている。いくつかの態様では、膜結合ＩＬ１５は、プロテアーゼの作用によって細胞表面から脱落または切断されてよい。
本開示の膜結合型ＩＬ１５またはＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチド全体またはその一部は、細胞外空間に脱落してよい。脱落は、本明細書で使用される場合、膜関連生体分子がつながれている膜からのそれらの放出を指す。いくつかの場合では、脱落は、タンパク質分解切断によって誘導されてよい。
本開示のペイロードは、ヒトＩＬ１５、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４０９３３（ＩＬ１５＿ＨＵＭＡＮ）のアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋ＴＥＭ、ナチュラルキラー細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞、ならびに免疫療法に使用されるＣＡＲ Ｔ細胞などの増殖、生存、持続性、及び効力を改善するために利用されてよい。一態様では、本開示は、サイトカイン療法に関連する毒性を最小限に抑えるためのペイロードを提供する。いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、ＩＬ２全体またはその一部を含んでよい。全長または成熟ＩＬ２の１つ以上の機能を保持するＩＬ２の任意の一部が、本開示において有用な場合がある。
当該技術分野において、同じ遺伝子またはタンパク質に対するある特定の遺伝子及び／またはタンパク質命名法が、ダッシュ「－」などの句読点またはギリシャ文字などの記号を含む場合または含まない場合があると理解される。それらが本明細書に含まれるか、または除外されるかにかかわらず、その意味は、当業者によって理解されるように変更されることを意図するものではない。例えば、ＩＬ２、ＩＬ－２及びＩＬ ２は、同じインターロイキンを指す。同様に、ＩＬ１５、ＩＬ １５及びＩＬ－１５は、同じインターロイキンを指す。同様に、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦα、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦアルファ及びＴＮＦαは、全て同じタンパク質を指す。
ペイロードとしての抗体及び抗体断片
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、抗体、抗体断片及びそのバリアントであってよい。
抗体は、インタクトな抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体断片、抗体バリアント、または抗体誘導体であってよい。
本明細書における目的のために、「抗体」は、重鎖及び軽鎖可変ドメインに加えてＦｃ領域を含んでよい。
いくつかの実施形態では、ペイロードは、モノクローナル抗体であってよい。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種細胞（またはクローン）の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一及び／または同じエピトープと結合し、一般に少量で存在するバリアントなどの、モノクローナル抗体の産生中に生じる場合がある可能なバリアントを除く。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。
一実施形態では、本開示のペイロードは、ヒト化抗体であってよい。本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、１つ以上の非ヒト（例えば、マウス）抗体源（複数可）からの最小部分を含み、残りが１つ以上のヒト免疫グロブリン源に由来するキメラ抗体を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体の超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性、及び／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種の抗体（ドナー抗体）の超可変領域の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一実施形態では、抗体は、ヒト化全長抗体であってよい。
本明細書で使用される場合、「抗体バリアント」という用語は、改変抗体（天然または出発抗体に関連する）、あるいは構造及び／または機能が天然または出発抗体に類似している生体分子（例えば、抗体模倣物）を指す。抗体バリアントは、天然の抗体と比較した場合にそれらのアミノ酸配列、組成または構造が変化してよい。抗体バリアントとしては、変化したアイソタイプを有する抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭ）、ヒト化バリアント、最適化バリアント、多重特異性抗体バリアント（例えば、二重特異性バリアント）、及び抗体断片を挙げてよいが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗体断片及びバリアントは、インタクトな抗体の抗原結合領域を含んでよい。抗体断片及びバリアントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体を挙げてよいが、これらに限定されない。抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、２つの同一の抗原結合断片が生成され、各々が単一の抗原結合部位を有する。残存する「Ｆｃ」断片も生成され、その名称は容易に結晶化するその能力を反映している。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と架橋できるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。本開示のペイロードは、それらの断片のうち１つ以上を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体ペイロードは、治療用抗体であってよい。
キメラ抗原受容体ペイロード
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってよい。本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を模倣する合成受容体を指す。一般に、ＣＡＲは、細胞外標的化ドメイン、膜貫通ドメイン／領域及び細胞内シグナル伝達／活性化ドメインから構成される。ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞などの細胞は、ＣＡＲの標的化部分によって認識され得る分子を発現する標的細胞を攻撃するように再指向され得る。標準的なＣＡＲ受容体では、構成要素：細胞外標的化ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達／活性化ドメインは、単一の融合タンパク質として直線的に構築される。細胞外領域は、特定の腫瘍抗原または他の腫瘍細胞表面分子を認識する標的化ドメイン／部分（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。細胞内領域は、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζのシグナル領域）、ならびに／または１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びＯＸ－４０（ＣＤ１３４）に由来するものなどを含有してよい。例えば、「第１世代ＣＡＲ」はＣＤ３ζシグナル伝達ドメインしか有しないのに対して、Ｔ細胞の持続性及び増殖を増強するために、共刺激細胞内ドメインが追加され、ＣＤ３ζシグナルドメインと１つの共刺激シグナル伝達ドメインを有する第２世代ＣＡＲ、及びＣＤ３ζシグナルドメインと２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを有する第３世代ＣＡＲが形成される。ＣＡＲは、Ｔ細胞によって発現される場合、ＣＡＲの細胞外標的化部分によって決定される抗原特異性をＴ細胞に付与する。第４世代ＣＡＲは、より有能で安全なＣＡＲの構造を開発するために、ホーミング遺伝子及び自殺遺伝子などの１つ以上の要素の追加を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲペイロードは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）に形質導入される場合、ＣＡＲの細胞外標的部分によって認識される分子を発現する標的（例えば、腫瘍細胞）に対して免疫細胞を再指向し得る。
ペイロードとしての核酸修飾剤
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、核酸修飾剤であってよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、遺伝子編集系の構成要素であってよい。いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２を含むＣａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）であってよい。Ｃａｓタンパク質は変化させるか、またはさもなければ改変されてよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、デッドＣａｓ９であってよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、酵素的に活性なＣａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質野生型タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質ニッカーゼまたはヌクレアーゼヌルもしくはヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ）及びメガヌクレアーゼであってよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、Ｃｒｅリコンビナーゼなどのリコンビナーゼであってよい。
ペイロードとしての自己免疫障害を処置するための薬剤
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、自己免疫障害を処置、改善または予防するための薬剤であってよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、ＩＬ－１及びＩＬ－６に対する中和抗体などの抗サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のペイロードはＢ細胞枯渇を標的とし、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、及びＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）に対する中和抗体などである。
医薬組成物及び製剤
本教示は、本開示の転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、改変細胞またはペイロードのうち１つ以上、及び場合により、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または不活性成分を含む医薬組成物をさらに含む。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載される転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、改変細胞、ペイロードもしくは転写因子系構成要素のうち１つ以上、またはその薬学的に許容される塩の、場合により生理学的に好適な担体及び賦形剤などの他の化学成分を含む調製物を指す。
「賦形剤」または「不活性成分」という用語は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性（ｉｎｅｒｔ）または不活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）物質を指す。
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は一般に、本明細書に記載されるように送達される任意の１つ以上の転写因子系構成要素を指す。
本明細書で提供される医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物を対象とするが、そのような組成物は一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に適していると当業者によって理解されることになる。医薬組成物の投与が企図される対象としては、ウシ、ウマ、ニワトリ及びブタなどの農業動物、ネコ、イヌなどの飼育動物、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ及び非ヒト霊長類などの研究動物を含む、非ヒト哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示による医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／または複数の単一単位用量として調製、包装、及び／または販売されてよい。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は一般に、対象に投与されることになる活性成分の投与量及び／またはそのような投与量の適切な分数、例えば、そのような投与量の２分の１もしくは３分の１などに等しい。
本開示による医薬組成物における活性成分、薬学的に許容される賦形剤もしくは不活性成分、及び／または任意の追加成分の相対量は、処置される対象の識別情報、サイズ、及び／または状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変動することになる。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでよい。
疾患の処置または改善の有効性は、例えば、疾患の進行、疾患の寛解、症状の重症度、疼痛の減少、生活の質、処置効果を維持するのに必要な薬剤の用量、疾患マーカーのレベルまたは予防のために処置もしくは標的とされる所与の疾患に適した任意の他の測定可能なパラメータを測定することによって評価され得る。当該技術分野の当業者である医療従事者は、そのようなパラメータのうちいずれか１つ、またはパラメータの任意の組合せを測定することによって処置または予防の有効性をモニターしてよい。本開示の組成物の投与に関連して、例えば、がん「に対して効果的」は、臨床的に適切な方法での投与が、少なくともかなりの割合の患者に有益な効果、例えば、症状の改善、治癒、疾患負荷の減少、腫瘍の質量もしくは細胞数の減少、寿命の延長、生活の質の改善、または特定のがん型の処置に精通している医師によって一般にプラスと認識されている他の効果などをもたらすことを示す。
処置または予防効果は、疾患状態の１つ以上のパラメータにおける統計的に有意な改善がある場合、またはさもなければ症状が予想されることになるそれらを悪化もしくは発症させないことにより明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータにおける少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化は、効果的な処置を示し得る。本開示の所与の組成物または製剤の有効性はまた、当該技術分野において既知の通り、所与の疾患の実験動物モデルを使用して判断され得る。実験動物モデルを使用する場合、処置の有効性は、統計的に有意な変化が観察される場合に証明される。
製剤
本開示のポリヌクレオチド及びベクター組成物は、送達に適した任意の方法で製剤化されてよい。製剤は、ナノ粒子、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖を含む）、カチオン性脂質及びそれらの組合せであってよいが、これらに限定されない。
一実施形態では、ポリヌクレオチド及びベクター製剤は、少なくとも１つの脂質を含んでよいナノ粒子である。脂質は、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ及びＰＥＧ化脂質から選択されてよいが、これらに限定されない。別の態様では、脂質は、これらに限定されないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ及びＤＯＤＭＡなどのカチオン性脂質であってよい。
本開示のポリヌクレオチドについて、製剤は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０で教示されるもののいずれかから選択されてよい。
不活性成分
いくつかの実施形態では、医薬製剤または他の製剤は、不活性成分である少なくとも１つの賦形剤を含んでよい。本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる１つ以上の不活性剤を指す。いくつかの実施形態では、本開示の製剤に使用されてよい不活性成分の全てまたは一部が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されるか、いずれも承認されない場合がある。
投薬、送達及び投与
本開示の組成物は、１つ以上の経路及びモダリティによって細胞または対象に送達されてよい。本明細書に記載される１つ以上の転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、ペイロード、及び他の構成要素を含有するウイルスベクターが、それらを細胞及び／または対象に送達するために使用されてよい。ｍＲＮＡ、プラスミドなどの他のモダリティも使用され、組換えタンパク質としても使用されてよい。
送達
裸の送達
本開示の医薬組成物、転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードは、細胞、組織、器官及び／または生物に裸の形態で送達されてよい。本明細書で使用される場合、「裸の」という用語は、トランスフェクションまたは透過性を促進する薬剤または改変を含まずに送達される医薬組成物、転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードを指す。裸の医薬組成物、転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードは、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される投与経路を使用して細胞、組織、器官及び／または生物に送達されてよい。いくつかの実施形態では、裸の送達は、生理食塩水またはＰＢＳなどの単純な緩衝液中での製剤を含んでよい。
製剤化送達
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物、転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードは、本明細書に記載される方法を使用して製剤化されてよい。製剤は、改変される、及び／または改変されない場合がある医薬組成物、転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードを含んでよい。製剤としては、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生体侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）もしくは生体適合性ポリマー、溶媒、及び／または徐放性送達デポーがさらに挙げられてよいが、これらに限定されない。本開示の製剤は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される投与経路を使用して細胞に送達されてよい。
医薬組成物、転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードはまた、当該技術分野におけるいくつかの方法、例えば、これらに限定されないが、直接浸漬または浴、カテーテルを介する、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／または点滴による、組成物でコーティングまたは組成物を浸透させた布または生分解性材料などの基材を使用する手段などを含む方法のいずれにおいても、器官または組織に直接送達するために製剤化されてよい。
細胞への送達
本開示の別の態様では、転写因子系またはその構成要素のポリヌクレオチド及び本開示の組成物及びポリヌクレオチドを含むベクターは、免疫エフェクター細胞などの細胞中に導入されてよい。
本開示の一態様では、転写因子系またはその構成要素のポリヌクレオチド及び本開示の組成物は、ポリヌクレオチドの一過性または安定発現を可能にするプラスミド、ウイルスベクターにパッケージングされるか、またはウイルスゲノム中に組み込まれてよい。好ましいウイルスベクターは、レンチウイルスベクター及びガンマレトロウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクターを構築するために、転写因子系のポリヌクレオチド分子が、ある特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入されて、複製欠損ウイルスを作製する。次いで、組換えウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲ及びパッケージング構成要素を含まないパッケージング細胞株に導入される。組換えレトロウイルス粒子が培養培地に分泌され、次いで収集され、場合により濃縮されて遺伝子導入に使用される。レンチウイルスベクターは、それらが分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染できるため特に好ましい。
ベクターはまた、針、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ハイドロポレーションなどの物理的方法、無機粒子（例えば、リン酸カルシウム、シリカ、金）などの化学的担体及び／または化学的方法による非ウイルス法によって細胞に移入されてよい。いくつかの実施形態では、合成または天然の生分解性剤は、カチオン性脂質、脂質ナノエマルジョン、ナノ粒子、ペプチドベースのベクター、またはポリマーベースのベクターなどの送達のために使用されてよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、一時的な膜破壊によって、例えば、高速細胞変形によって細胞に移入されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、細胞に直接送達されてよい。一実施形態では、本開示のポリペプチドは、細胞透過ドメイン（ＣＬＤ）に融合されるエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）を含む合成ペプチドを使用して送達されてよい。本開示のポリペプチドは、ＥＬＤ－ＣＬＤ－合成ペプチドと共に細胞中に共導入される。ＥＬＤは、エンドソームに捕捉されたタンパク質のサイトゾルへの脱出を容易にする。そのようなドメインは、微生物及びウイルス起源のタンパク質から得られ、当該技術分野において記載されてきた。ＣＰＤは、原形質膜を通過するタンパク質の輸送を可能にし、それらも当該技術分野において記載されてきた。ＥＬＤ－ＣＬＤ融合タンパク質は、いずれかのドメインのみとの共形質導入と比較した場合、形質導入効率を相乗的に増加させる。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、エンドソームからサイトゾルへのカーゴの脱出を可能にする追加の方法として、場合によりシャトル構築物に追加されてよい。シャトルはまた、融合ペプチドの多量体を生成するためにＮまたはＣ末端にシステイン残基を含んでよい。ペプチド末端へのシステイン残基の付加によって生成されるＥＬＤ－ＣＬＤ融合ペプチドの多量体は、単一の融合ペプチド構築物と比較した場合、さらに高い形質導入効率を示す。本開示のポリペプチドはまた、カーゴを適切な細胞内位置、例えば、核に向けるために適切な局在化シグナルに付加されてよい。いくつかの実施形態では、国際特許公開ＷＯ２０１６１６１５１６及びＷＯ２０１７１７５０７２で教示されるＥＬＤ、ＣＬＤまたは融合ＥＬＤ－ＣＬＤ合成ペプチドのいずれも、本開示において有用であってよい（それらの各々の内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる）。
送達モダリティ及び／またはベクター
本開示の転写因子系またはその構成要素は、１つ以上のモダリティを使用して送達されてよい。本開示はまた、転写因子及びその一部、ＤＲＤ、またはペイロード構築物、ならびにそれらの組合せをコードする本開示のポリヌクレオチドをパッケージングするベクターを提供する。本開示のベクターはまた、パッケージングされたポリヌクレオチドを細胞、局所組織部位または対象に送達するために使用されてよい。それらのベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、ウイルスベクター及び粒子を含む、任意の種類のものであってよい。ウイルスベクター技術は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターから選択される。
一般に、ベクターは、少なくとも１つの生物で機能する複製起点、プロモーター配列及び便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、ならびに１つ以上の選択可能マーカー、例えば、薬剤耐性遺伝子を含有する。
いくつかの実施形態では、組換え発現ベクターは、転写及び翻訳の開始及び終止コドンなどの調節配列を含んでよく、これらはベクターが導入される宿主細胞型に特有である。
いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、本明細書で教示される１つ以上のペイロードを含んでよく、２つ以上のペイロードが１つのリガンド応答に含まれてよい。その場合、２つ以上のペイロードは、同じリガンドまたは応答剤によって同時に調節される。
レンチウイルスビヒクル／粒子
いくつかの実施形態では、レンチウイルスビヒクル／粒子は、送達モダリティとして使用されてよい。レンチウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスのサブグループであり、宿主ゲノム中に組み込む前にウイルスＲＮＡゲノムのＤＮＡへの逆転写が必要となることから命名される。そのため、レンチウイルスビヒクル／粒子の最も重要な特徴は、それらの遺伝物質を標的／宿主細胞のゲノム中に組み込むことである。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ビスナ－マエディウイルスならびにヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。
通常、遺伝子送達ビヒクルを構成するレンチウイルス粒子は、それ自体では複製欠損性である（「自己不活性化」とも称される）。レンチウイルスは、無傷の宿主核膜を介する侵入機構によって分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染できる。組換えレンチウイルスビヒクル／粒子は、ＨＩＶ病原性遺伝子を何倍にも弱毒化することによって生成されていて、例えば、遺伝子Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ及びＴａｔが除去されて、ベクターを生物学的に安全にしている。それに対応して、例えば、ＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２に由来するレンチウイルスビヒクルは、非分裂細胞中への導入遺伝子の効率的な送達、組込み及び長期発現を媒介し得る。
レンチウイルス粒子は、ウイルスパッケージング要素及びベクターゲノムそれ自体を、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの産生細胞中で共発現させることによって生成される場合がある。それらの要素は通常、３つまたは４つの別々のプラスミドで提供される。産生細胞は、ウイルスのコア（すなわち、構造タンパク質）及び酵素構成要素、ならびにエンベロープタンパク質（複数可）（パッケージングシステムと称される）を含むレンチウイルス構成要素をコードするプラスミド、ならびに標的細胞に移入される外来導入遺伝子を含むプラスミド、ビヒクルそれ自体（導入ベクターとも称される）で共トランスフェクトされる。一般に、プラスミドまたはベクターは、産生細胞株に含まれる。プラスミド／ベクターは、トランスフェクション、形質導入または感染を介して産生細胞株中に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染の方法は、当業者には周知である。非限定的な例として、パッケージング及び導入構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによって、一般にｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンテターゼまたはＡＤＡなどの主要な選択可能マーカーと共に産生細胞株中に導入され、続いて適切な薬物の存在下における選択及びクローンの単離が行われ得る。
産生細胞は、外来遺伝子、例えば、本開示の転写因子系構成要素またはそのポリヌクレオチドを含有する組換えウイルス粒子を産生する。組換えウイルス粒子は培養培地から回収され、当業者によって使用される標準的な方法によって滴定される。組換えレンチウイルスビヒクルは、標的細胞に感染するために使用され得る。
高力価レンチウイルス粒子を産生するために使用され得る細胞としては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、２９３Ｇ細胞、ＳＴＡＲ細胞（Ｒｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００５，１１：４５２－４５９）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及び他のＨＥＫ２９３Ｔベースの産生細胞株（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１，２２（３）：３５７－３６９、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２，１０９９６）：１５５１－１５６０、Ｔｈｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９，１１３（２１）：５１０４－５１１０、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を挙げてよいが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、エンベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ Ｇ）またはバキュロウイルスｇｐ６４エンベロープタンパク質などの、他のウイルスの異種エンベロープタンパク質であってよい。ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質は、特にｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ属：Ｃａｒａｊａｓ ｖｉｒｕｓ（ＣＪＳＶ）、Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ ｖｉｒｕｓ（ＣＨＰＶ）、Ｃｏｃａｌ ｖｉｒｕｓ（ＣＯＣＶ）、Ｉｓｆａｈａｎ ｖｉｒｕｓ（ＩＳＦＶ）、Ｍａｒａｂａ ｖｉｒｕｓ（ＭＡＲＡＶ）、Ｐｉｒｙ ｖｉｒｕｓ（ＰＩＲＹＶ）、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ａｌａｇｏａｓ ｖｉｒｕｓ（ＶＳＡＶ）、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｉｎｄｉａｎａ ｖｉｒｕｓ（ＶＳＩＶ）及びＶｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ｖｉｒｕｓ（ＶＳＮＪＶ）に分類される種及び／またはソウギョラブドウイルス、ＢｅＡｎ １５７５７５ウイルス（ＢｅＡｎ １５７５７５）、Ｂｏｔｅｋｅウイルス（ＢＴＫＶ）、Ｃａｌｃｈａｑｕｉウイルス（ＣＱＩＶ）、Ｅｅｌ ｖｉｒｕｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ（ＥＶＡ）、Ｇｒａｙ Ｌｏｄｇｅ ｖｉｒｕｓ（ＧＬＯＶ）、Ｊｕｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ（ＪＵＲＹ）、Ｋｌａｍａｔｈウイルス（ＫＬＡＶ）、Ｋｗａｔｔａウイルス（ＫＷＡＶ）、Ｌａ Ｊｏｙａウイルス（ＬＪＶ）、Ｍａｌｐａｉｓ Ｓｐｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ（ＭＳＰＶ）、Ｍｏｕｎｔ Ｅｌｇｏｎ ｂａｔウイルス（ＭＥＢＶ）、Ｐｅｒｉｎｅｔ ｖｉｒｕｓ（ＰＥＲＶ）、Ｐｉｋｅ ｆｒｙラブドウイルス（ＰＦＲＶ）、Ｐｏｒｔｏｎウイルス（ＰＯＲＶ）、Ｒａｄｉウイルス（ＲＡＤＩＶ）、コイ春ウイルス血症ウイルス（ＳＶＣＶ）、Ｔｕｐａｉａウイルス（ＴＵＰＶ）、潰瘍性疾患ラブドウイルス（ＵＤＲＶ）及びＹｕｇ Ｂｏｇｄａｎｏｖａｃ ｖｉｒｕｓ（ＹＢＶ）としてｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ属に暫定的に分類される株の中から選択されてよい。ｇｐ６４または他のバキュロウイルスｅｎｖタンパク質は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）（ＡｃＭＮＰＶ）、Ａｎａｇｒａｐｈａ ｆａｌｃｉｆｅｒａ核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ核多核体病ウイルス、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ核多核体病ウイルス、Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ単一カプシド核多核体病ウイルス、Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ核多核体病ウイルス、Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ核多核体病ウイルス、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ核多核体病ウイルス、Ｄｈｏｒｉ ｖｉｒｕｓ、Ｔｈｏｇｏｔｏ ｖｉｒｕｓ、Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｍｙｉ核多核体病ウイルスまたはＢａｔｋｅｎウイルスに由来し得る。いくつかの態様では、エンベロープタンパク質は、ＲＤ１１４、ＲＤ１１５であってよいか、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）もしくはヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）に由来してよい。
レンチウイルス粒子で提供される他のエレメントは、５’末端または３’末端のいずれかにあるレトロウイルスＬＴＲ（長い末端反復配列）、レトロウイルス輸送エレメント、場合によりレンチウイルス逆応答エレメント（ＲＲＥ）、プロモーターまたはその活性部分、及び遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）またはその活性部分を含んでよい。
組換えレンチウイルス粒子を生成する方法は、当該技術分野、例えば、米国特許第８，８４６，３８５号、同第７，７４５，１７９号、同第７，６２９，１５３号、同第７，５７５，９２４号、同第７，１７９，９０３号、及び同第６，８０８，９０５号において述べられている。
使用されるレンチウイルスベクターは、ｐＬＶＸ、ｐＬｅｎｔｉ、ｐＬｅｎｔｉ６、ｐＬＪＭ１、ＦＵＧＷ、ｐＷＰＸＬ、ｐＷＰＩ、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ、ｐＬＪＭ１－ＥＧＦＰ、ｐＵＬＴＲＡ、ｐＩｎｄｕｃｅｒ２０、ｐＨＩＶ－ＥＧＦＰ、ｐＣＷ５７．１、ｐＴＲＰＥ、ｐＥＬＰＳ、ｐＲＲＬ、及びｐＬｉｏｎＩＩから選択されてよいが、これらに限定されない。
アデノ随伴ウイルス粒子
本開示の転写因子系、転写因子構築物、またはペイロード構築物のいずれのポリヌクレオチドの送達も、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを使用して達成されてよい。そのようなベクターまたはウイルス粒子は、既知の血清型カプシドのいずれかまたは血清型カプシドの組合せを利用するように設計されてよい。
ＡＡＶベクターは、一本鎖ベクターだけでなく、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）も含む。ｓｃＡＡＶベクターは、共にアニーリングして二本鎖ベクターゲノムを形成するＤＮＡを含有する。二本鎖合成をスキップすることによって、ｓｃＡＡＶは細胞内での迅速な発現を可能にする。
ｒＡＡＶベクターは、当該技術分野における標準的な方法によって、例えば、三重トランスフェクションによって、ｓｆ９昆虫細胞中で、またはＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞の浮遊細胞培養などにおいて製造される場合がある。
転写因子構築物及びペイロード構築物は、本明細書で教示されるＡＡＶカプシドにパッケージングされている１つ以上のウイルスゲノムでコードされてよい。
そのようなベクターまたはウイルスゲノムはまた、少なくとも１つまたは２つのＩＴＲ（逆方向末端反復配列）に加えて、ベクターまたはウイルスゲノムからの発現に必要なある特定の調節エレメントを含んでよい。そのような調節エレメントは当該技術分野において周知であり、例えば、プロモーター、イントロン、スペーサー、スタッファー配列などが挙げられる。
本開示の転写因子構築物またはペイロード構築物は、１つ以上または別個のＡＡＶ粒子で投与されてよい。
いくつかの実施形態では、転写因子系構築物は、１つ以上のＡＡＶ粒子で投与されてよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の転写因子系構築物が、ウイルスゲノムにコードされてよい。
レトロウイルスビヒクル／粒子（γ－レトロウイルスベクター）
いくつかの実施形態では、レトロウイルスビヒクル／粒子は、本開示の転写因子系、転写因子構築物またはペイロード構築物を送達するために使用されてよい。レトロウイルスベクター（ＲＶ）は、標的細胞内への導入遺伝子の永久的な組込みを可能にする。複合ＨＩＶ－１／２に基づくレンチウイルスベクターに加えて、単純なガンマ－レトロウイルスに基づくレトロウイルスベクターが、治療遺伝子を送達するために広く使用されていて、幅広い細胞型を形質導入できる最も効率的で強力な遺伝子送達システムの１つとして臨床的に実証されている。ガンマレトロウイルスの例示的な種としては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの哺乳動物ガンマ－レトロウイルスに由来するガンマ－レトロウイルスベクターは、組換え型である。ガンマレトロウイルスのＭＬＶファミリーは、エコトロピック、アンホトロピック、ゼノトロピック及びポリトロピックサブファミリーを含む。エコトロピックウイルスは、ｍＣＡＴ－１受容体を使用してマウス細胞のみに感染できる。エコトロピックウイルスの例は、モロニーＭＬＶ及びＡＫＶである。アンホトロピックウイルスは、Ｐｉｔ－２受容体を介してマウス、ヒト及び他の種に感染する。アンホトロピックウイルスの一例は、４０７０Ａウイルスである。ゼノトロピックウイルス及びポリトロピックウイルスは同じ（Ｘｐｒ１）受容体を利用するが、それらの種の指向性が異なる。ＮＺＢ－９－１などのゼノトロピックウイルスは、ヒト及び他の種に感染するが、マウス種には感染しないのに対して、フォーカス形成ウイルス（ＭＣＦ）などのポリトロピックウイルスは、マウス、ヒト及び他の種に感染する。
ガンマ－レトロウイルスベクターは、レトロウイルスの構造及び酵素（ｇａｇ－ｐｏｌ）ポリタンパク質をコードするプラスミド、エンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質をコードするプラスミド、ならびに新たに形成されたウイルス粒子内にパッケージングされる、本開示の組成物をコードするポリヌクレオチドを含むベクターｍＲＮＡをコードするプラスミドを含むいくつかのプラスミドで、細胞を共トランスフェクトすることによってパッケージング細胞中で産生されてよい。
いくつかの態様では、組換えガンマ－レトロウイルスベクターは、他のウイルスのエンベロープタンパク質で偽型化される。エンベロープ糖タンパク質は、細胞指向性を増大／変化し得るウイルス粒子の外部脂質層中に組み込まれる。いくつかの態様では、エンベロープタンパク質は、ＲＤ１１４、ＲＤ１１５であってよいか、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）もしくはヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）に由来してよい。
いくつかの実施形態では、組換えガンマ－レトロウイルスベクターは、自己不活性化（ＳＩＮ）ガンマレトロウイルスベクターである。ベクターは、複製の機能不全である。ＳＩＮベクターは、最初にエンハンサー／プロモーター活性を含む３’Ｕ３領域内に欠失を持つ場合がある。さらに、５’Ｕ３領域は、サイトメガロウイルスもしくはＲＳＶに由来する強力なプロモーター（パッケージング細胞株に必要）、もしくは好適な内部プロモーター、及び／またはエンハンサーエレメントで置き換えられてよい。内部プロモーターの選択は、本開示の特定の目的に必要な遺伝子発現の特定の要件に従って行われてよい。
いくつかの実施形態では、転写因子系、転写因子構築物、またはペイロード構築物のポリヌクレオチドは、組換えウイルスゲノム内に挿入される。組換えガンマ－レトロウイルスベクターのウイルスｍＲＮＡの他の構成要素は、天然に存在する配列の挿入または除去（例えば、ＩＲＥＳの挿入、目的のポリペプチドまたは阻害核酸をコードする異種ポリヌクレオチドの挿入、野生型プロモーターの代わりに異なるレトロウイルスまたはウイルスのより効果的なプロモーターのシャッフリングなど）によって改変されてよい。いくつかの例では、組換えガンマ－レトロウイルスベクターは、改変されたパッケージングシグナル、及び／またはプライマー結合部位（ＰＢＳ）、及び／または５’－長末端反復（ＬＴＲ）のＵ３領域の５’－エンハンサー／プロモーターエレメント、及び／または３’－ＬＴＲのＵ３領域に改変された３’－ＳＩＮエレメントを含んでよい。それらの改変によって、感染の力価及び能力が増加する場合がある。
腫瘍溶解性ウイルスベクター
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、腫瘍溶解性ウイルスにパッケージングされてよい。本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、がん細胞に選択的に感染してそれらを死滅させるウイルス、例えば、ワクチンウイルスなどを指す。腫瘍溶解性ウイルスは天然に存在し得るか、または腫瘍溶解性アデノウイルス、及び腫瘍溶解性ヘルペスウイルスなどの遺伝子改変ウイルスであり得る。
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクチンウイルスは、腫瘍内で細胞の腫瘍崩壊を誘導するのに十分な、チミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）－コロニー刺激因子（ＣＳＦ）発現の、複製可能なワクチンウイルスベクターのウイルス粒子を含んでよく、例えば、米国特許第９，２２６，９７７号を参照のこと。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系、転写因子構築物、またはペイロード構築物は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として設計されてよい。本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、目的のポリペプチドをコードし、翻訳されてインビトロ、インビボ、インサイチュまたはエクスビボでコードされた目的のポリペプチドを生成できる任意のポリヌクレオチドを指す。そのようなｍＲＮＡ分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号で教示されるもののいずれかの構造成分または特徴を有してよい。
いくつかの実施形態では、転写因子系またはその構成要素は、自己増幅ＲＮＡとして設計されてよい。「自己増幅ＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、宿主内で複製し、ＲＮＡ及びＲＮＡによってコードされるタンパク質の量を増加させ得るＲＮＡ分子を指す。そのような自己増幅ＲＮＡは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１００５７９９号で教示されるもののいずれかの構造的特徴または構成要素を有してよい。
投薬
本開示は、転写因子系の任意の１つ以上の構成要素または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。それらは、疾患、障害、及び／または状態（例えば、がんまたは自己免疫疾患に関連する疾患、障害、及び／または状態）を予防または処置または撮像するのに効果的な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象に投与されてよい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身の状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法などに応じて対象ごとに変動することになる。
本開示による組成物は、典型的には投与を容易にし、投与量を均一にするために投与単位形態で製剤化される。しかしながら、本開示の組成物の１日の総使用量は、主治医によって妥当な医学的判断の範囲内で決定されてよいと理解されることになる。任意の特定の患者に対する特定の治療上有効な、予防上有効な、または適切な撮像用量レベルは、様々な要因、例えば、処置されている障害及び障害の重症度、用いられる特定の化合物の活性、用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事、用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排出速度、処置期間、用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物、ならびに医学分野において周知の同様の要因を含むものに依存することになる。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、Ｔ細胞疲弊を回避し、サイトカイン放出症候群を予防して、免疫療法に関連する毒性を最小限に抑えるために様々な用量でがん免疫療法に使用されてよい。例えば、本開示の組成物の低用量は、最初に腫瘍負荷の高い患者を処置するために使用されてよいが、一方で腫瘍負荷の低い患者は、最小限の腫瘍抗原負荷の認識を確実にするために、本開示の組成物の高用量及び反復用量で処置されてよい。別の例では、本開示の組成物は、強力なＴ細胞シグナル伝達を減少させ、インビボでの持続性を増強するためにパルス様式で送達されてよい。いくつかの態様では、毒性は、高用量を投与する前に、最初に低用量の本開示の組成物を使用することによって最小限に抑えられてよい。投薬は、フェリチン、血清Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ６、ＩＦＮ－γ、及びＴＮＦ－αなどの血清マーカーが上昇する場合に変更されてよい。
いくつかの実施形態では、神経毒性は、ＣＡＲまたはＴＩＬ療法と関連する場合がある。そのような神経毒性は、ＣＤ１９－ＣＡＲに関連する場合がある。毒性は、脳への過剰なＴ細胞浸潤が原因の可能性がある。いくつかの実施形態では、神経毒性は、血液脳関門を介するＴ細胞の通過を防ぐことによって軽減される場合がある。これは、ｔｙｓａｂｒｉ／ナタリズマブなどの内因性アルファ－４インテグリン阻害剤の標的遺伝子欠失によって達成され得、それらはまた本開示においても有用であってよい。
また本明細書で提供されるのは、本開示に従ってリガンドまたはＤＲＤリガンドを、それを必要とする対象に投与する方法である。いくつかの実施形態では、リガンドは、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）から選択される。リガンドは、本開示の転写因子系、ＤＲＤ、またはペイロードを調節するのに効果的な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象または細胞に投与されてよい。いくつかの実施形態では、ＡＣＺはｈＣＡ２ ＤＲＤと共に使用されてよく、メトトレキサートはｈＤＨＦＲ ＤＲＤと共に使用されてよく、トリメトプリムはｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤと共に使用されてよい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身の状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法などに応じて対象ごとに変動することになる。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であってよい。本開示による組成物は、典型的には投与を容易にし、投与量を均一にするために単位剤形で製剤化される。しかしながら、本開示の組成物の１日の総使用量は、主治医によって妥当な医学的判断の範囲内で決定されてよいと理解されることになる。ある特定の実施形態では、本開示によるリガンドは、所望の効果を得るために、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ対象体重を、１日に１回以上送達するのに十分な投与量レベルで投与されてよい。いくつかの実施形態では、投与量レベルは、所望の効果を得るために、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１７０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、１９０ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／ｋｇ対象体重を１日あたり、または１日に１回以上であってよい。
本開示は、本明細書に記載されるリガンドのいずれかを細胞または組織に送達する方法を提供し、本方法は、細胞または組織をリガンドと接触させることを含み、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで達成され得る。ある特定の実施形態では、本開示によるリガンドは、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約１００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約５μＭ～約５０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約２５μＭ～約２５０μＭ、約５０μＭ～約５００μＭを送達するのに十分な投与量レベルで細胞に投与されてよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、０．０００６４μＭ、０．００３２μＭ、０．０１６μＭ、０．０８μＭ、０．４μＭ、１μＭ、２μＭ、１０μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、１７５μＭ、２００μＭ、２５０μＭから選択されるが、これらに限定されない用量で細胞に投与されてよい。
本開示のリガンドの所望の投与量は、１回のみ、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、２日おき、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達されてよい。ある特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれを超える投与）を使用して送達されてよい。複数回の投与が用いられる場合、本明細書に記載されるものなどの分割投薬レジメンが使用されてよい。本明細書で使用される場合、「分割用量」は、「単一単位用量」または総１日用量を２つ以上の用量、例えば、「単一単位用量」を２回以上の投与に分割することである。本明細書で使用される場合、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち、単回投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。本開示のリガンドの所望の投与量は、「パルス用量」または「連続流」として投与されてよい。本明細書で使用される場合、「パルス用量」は、ある期間にわたって設定された頻度で投与される任意の治療薬の一連の単一単位用量である。本明細書で使用される場合、「連続流」は、単一経路／単一接触点、すなわち連続投与イベントで、ある期間にわたって連続して投与される治療薬の用量である。総１日用量、２４時間における所定の、または処方される量は、それらの方法のいずれかによって、またはそれらの方法の組合せとして、または医薬投与に適した任意の他の方法によって投与されてよい。
投与
いくつかの実施形態では、がん免疫療法または自己免疫疾患の処置のための組成物は、エクスビボで細胞に投与され、続いて対象に投与されてよい。さらなる実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から選択される。免疫細胞は、当該技術分野において既知の様々な方法を使用してエクスビボで単離及び増殖し得る。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞を単離する方法は、米国特許第６，８０５，８６１号及び同第６，５３１，４５１号に記載されている。ＮＫ細胞の単離は、米国特許第７，４３５，５９６号に記載されている。
いくつかの実施形態では、細胞の性質に応じて、細胞は、注射、輸血、注入、局所点滴注入または移植を含む多種多様な方法で、宿主生物、例えば、哺乳動物中に導入されてよい。いくつかの態様では、本開示の細胞は、腫瘍の部位に導入されてよい。用いられる細胞の数は、多数の状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコール、例えば、投与の回数、細胞が増殖する能力などに依存することになる。細胞は、生理学的に許容される培地中に存在する場合がある。
いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、疾患または状態を有する対象に複数回用量で投与されてよい。投与は一般に、がんもしくは臨床状態の１つ以上の症状の改善をもたらす、及び／またはがんもしくはその臨床状態もしくは症状を処置もしくは予防する。
いくつかの実施形態では、免疫療法または自己免疫疾患の処置のための組成物は、インビボで投与されてよい。いくつかの実施形態では、転写因子系を含む本開示のポリヌクレオチド、本開示のペイロード及び組成物は、遺伝子治療を介してインビボで対象に送達されてよい。
送達経路
本開示の医薬組成物、転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、ペイロード、ベクター及び細胞は、治療上有効な結果を達成するために任意の経路によって投与されてよい。それらとしては、経腸（腸内に）、胃腸、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）（硬膜に）、経口（口から）、経皮、硬膜外（ｐｅｒｉｄｕｒａｌ）、脳内（大脳に）、脳室内（脳室内に）、皮膚上（皮膚上に塗布）、皮内（皮膚自体に）、皮下（皮膚の下に）、経鼻投与（鼻から）、静脈内（静脈に）、静脈内ボーラス、点滴静脈注射、動脈内（動脈に）、筋肉内（筋肉に）、心臓内（心臓に）、骨内注入（骨髄に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜に注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（目から）、空洞内注射（病的腔に）、海綿体内（陰茎の基部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のために無傷の皮膚から拡散）、経粘膜（粘膜から拡散）、経膣、吹送（鼻から吸入）、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上に）、点耳で、耳介（耳内または耳から）、頬側（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯（歯（複数可）に）、電気浸透、頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内に）、仙骨内（馬尾内に）、大槽内（大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）内に）、角膜内（角膜内に）、歯冠内（ｄｅｎｔａｌ ｉｎｔｒａｃｏｒｎａｌ）、冠動脈内（冠動脈内に）、海綿体内（陰茎の海綿体の膨張空間内に）、脊髄内（椎間板内に）、管内（腺の管内に）、十二指腸内（十二指腸内に）、硬膜内（硬膜内または硬膜の下に）、表皮内（表皮に）、食道内（食道に）、胃内（胃に）、歯肉内（歯肉に）、回腸内（小腸の遠位部内に）、病巣内（限局性病変内または限局性病変に直接導入）、管腔内（管の内腔内に）、リンパ管内（リンパ内に）、髄内（骨の髄腔内に）、髄膜内（髄膜内に）、心筋内（心筋内に）、眼内（眼球内に）、卵巣内（卵巣内に）、心膜内（心膜内に）、胸膜内（胸膜内に）、前立腺内（前立腺内に）、肺内（肺またはその気管支内に）、洞内（鼻腔または眼窩周囲腔内に）、脊髄内（脊柱内に）、滑液嚢内（関節の滑膜腔内に）、腱内（腱内に）、精巣内（精巣内に）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルで脳脊髄液内に）、胸内（胸郭内に）、管内（臓器の細管内に）、腫瘍内（腫瘍内に）、鼓室内（中耳内に）、血管内（血管（複数可）内に）、室内（室内に）、イオン導入（可溶性塩のイオンが体内組織に移行する電流によって）、灌注（開放創または体腔を浸すか、または洗い流す）、喉頭（喉頭上に直接）、経鼻胃（鼻から胃に）、閉鎖包帯法（局所経路投与後、その領域を塞ぐ包帯で覆う）、経眼（外眼部に）、口腔咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周部、直腸、呼吸器（局所または全身作用のために経口または経鼻吸入によって気道内に）、球後（脳橋後ろまたは眼球後ろ）、心筋内（心筋内に進入）、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通過して、または胎盤を越えて）、経気管（気管壁を通過して）、経鼓膜（鼓室を越えて、または鼓室を通過して）、尿管（尿管に）、尿道（尿道に）、膣内、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシスあるいは脊髄が挙げられるが、これらに限定されない。
非経口投与及び注射剤投与
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物、転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、ペイロード、ベクター及び細胞は、非経口的に投与されてよい。経口及び非経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及び／またはエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒など、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールならびにソルビタンの脂肪酸エステルなど、ならびにそれらの混合物を含んでよい。不活性希釈剤以外に、経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、香味剤、ならびに／または芳香剤などを含み得る。非経口投与のある特定の実施形態では、組成物は、可溶化剤、例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／またはそれらの組合せなどと混合される。他の実施形態では、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤が含まれる。
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、既知の技術分野に従って好適な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁化剤を使用して製剤化されてよい。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤及び／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／またはエマルジョン、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液としてであってよい。用いられてよい許容されるビヒクル及び溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張食塩水がある。減菌固定油が、溶媒または懸濁媒として慣例的に用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油が用いられ得る。オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製に使用され得る。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通して濾過することによって、及び／または滅菌剤を、使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散させ得る滅菌固体組成物の形態で組み込むことによって滅菌されてよい。
検出可能な薬剤及び標識
本開示の転写因子系、核酸、ポリヌクレオチド、ペイロード、ベクター及び細胞は、１つ以上の放射性薬剤または検出可能な薬剤と関連するか、またはそれらに結合されてよい。
それらの薬剤としては、様々な有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素または酵素基質、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン）、化学発光物質、放射性物質（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、または９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸（テクネチウム酸（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４ －）として）、ならびに造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレートＧｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、及び極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ－ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ素化造影剤（イオヘキソール）、マイクロバブル、またはパーフルオロカーボン）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、検出可能な薬剤は、活性化時に検出可能となる検出不能な前駆体（例えば、蛍光発生テトラジン－フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン－ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、テトラジン－Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、もしくはテトラジン－ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ－Ｘ）または酵素活性化可能な蛍光発生剤（例えば、ＰＲＯＳＥＮＳＥ（登録商標）（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）））であってよい。酵素標識組成物が使用され得るインビトロアッセイとしては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及びウェスタンブロット分析が挙げられるが、これらに限定されない。
用途及び使用
本開示の転写因子系、構築物、リガンド、または組成物は、多種多様な用途、例えば、治療、診断及び予後、バイオエンジニアリング、バイオプロセシング、バイオマニュファクチャリング、研究薬剤、メタボロミクス、遺伝子発現、酵素置換などを含むが、これらに限定されない用途に利用されてよい。
本開示は、組成物、例えば、転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
例えば、科学研究のために細胞株及び試薬を生成するための、医学的処置を伴わないいくつかの使用が存在する場合があるが、１つの使用は、インビボ遺伝子治療または養子細胞療法のための改変細胞を生成するための本開示の組成物の投与を含み、例えば、がん、自己免疫疾患及び他の疾患の処置を含む。疾患、状態または障害の医学的処置または予防を、それを必要とする対象において行う例示的な方法では、以下のステップを含み得る：（ａ）細胞集団（自己、同種または同系を含む、ヒト、動物、初代または細胞培養物のいずれか）を提供するステップ、（ｂ）少なくとも１つの核酸分子を細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、少なくとも１つの核酸分子が、（ｉ）転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドであって、転写因子活性化ドメイン及び／または転写因子ＤＮＡ結合ドメインが、ＤＲＤに機能的に連結されている第１ポリヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドであって、第４核酸配列が、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されている第２ポリヌクレオチドを含むステップ、（ｃ）細胞を対象に送達するステップ、ならびに（ｄ）転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの発現を可能にするのに十分なほどＤＲＤを安定化させるリガンドを、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、細胞中で目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で対象に投与し、目的のタンパク質の発現が、対象においてリガンドの存在によって制御され、リガンド投与の量及び／または持続時間が、治療有効量の目的のタンパク質を生成するのに十分であるステップ。
上記方法では、目的のタンパク質は、疾患、状態または障害の１つ以上の症状を改善、治癒、予防または減少させるために使用され得る。
本開示の組成物は、疾患、障害、及び／または状態（例えば、がん、自己免疫疾患及び他の疾患に関連する疾患、障害、及び／または状態）を予防または処置または撮像するのに効果的な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象に投与されてよい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身の状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法などに応じて対象ごとに変動することになる。
本開示による組成物は、典型的には投与を容易にし、投与量を均一にするために投与単位形態で製剤化される。しかしながら、本開示の組成物の１日の総使用量は、主治医によって妥当な医学的判断の範囲内で決定されてよいと理解されることになる。任意の特定の患者に対する特定の治療上有効な、予防上有効な、または適切な撮像用量レベルは、様々な要因、例えば、処置されている障害及び障害の重症度、用いられる特定の化合物の活性、用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事、用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排出速度、処置期間、用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物、ならびに医学分野において周知の同様の要因を含むものに依存することになる。
また本明細書で提供されるのは、１つ以上の安定化リガンド（本明細書で使用される場合、ＤＲＤを安定化させるリガンドは、リガンドが本開示による転写因子系で使用されるＤＲＤを安定化させるのに効果的であると理解した上で、安定化リガンドまたは単にリガンドと呼ばれてよい）を、それを必要とする対象に投与する方法である。リガンドは、転写因子系を含む細胞における本開示の転写因子発現の量を調節するのに効果的な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象または細胞に投与されてよい。必要とされる安定化リガンドの正確な量は、対象の種、年齢、及び全身の状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法などに応じて対象ごとに変動することになる。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であってよい。
治療的使用
がん免疫療法
がん免疫療法は、がんに対する免疫系の反応性の誘導または回復を目的とする。免疫療法研究の著しい進歩は、能動免疫療法及び受動免疫療法に大まかに分類される場合のある様々な戦略の開発につながっている。一般に、それらの戦略は、がん細胞を直接死滅させるため、または免疫抑制性腫瘍微小環境に対抗するために利用される場合がある。能動免疫療法は、内因性で長期的に持続する腫瘍抗原特異的免疫応答の誘導を目的とする。応答は、サイトカインなどの免疫応答調節因子の非特異的刺激によってさらに増強され得る。対照的に、受動免疫療法は、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞または抗体などのエフェクター免疫分子が宿主に投与されるアプローチを含む。このアプローチは一時的であり、複数回の適用が必要となる。
著しい進歩にもかかわらず、現在の免疫療法戦略の有効性は、関連する毒性によって限定されている。それらは、免疫療法と関連する狭い治療ウィンドウに関連することが多く、これは臨床的に意味のある処置効果を得るために、潜在的な致死的毒性の限界まで治療用量を近付ける必要性から部分的に生じる。さらに、養子移入した免疫細胞が患者内で増殖し続け、多くの場合に予測不能であるため、用量はインビボで増加する。
免疫療法に伴う主なリスクは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の正常な組織発現に応答するＴ細胞活性化に起因する、オンターゲットであるが腫瘍外の副作用である。特定のＴＡＡに対してＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を利用する臨床試験では、免疫療法に応答して皮膚の発疹、大腸炎及び聴力損失が報告された。
免疫療法はまた、免疫療法に応答して腫瘍細胞が死滅する場合に現れる、オンターゲットの腫瘍毒性の発現をもたらす場合がある。副作用としては、腫瘍崩壊症候群、サイトカイン放出症候群及び関連するマクロファージ活性化症候群が挙げられる。重要なことには、これらの有害作用は腫瘍の破壊中に生じる場合があり、したがって腫瘍免疫療法の効果発現が成功したとしても毒性をもたらす可能性がある。したがって、免疫療法剤の制御によって免疫療法を制御するアプローチは、それらが毒性を減少させて有効性を最大化させる可能性を有するため、非常に望ましい。
本開示は、免疫療法のための系、組成物、免疫療法剤及び方法を提供する。これらの組成物は、例えば、がんの予防及び処置のために、免疫療法における遺伝子発現及び機能の調節可能な制御を提供する。
一態様では、本開示の系、組成物、免疫療法剤及び他の構成要素は、別々に添加される安定化リガンドによって制御され得、これはがん免疫療法を制御するための重要な柔軟性を提供する。さらに、本開示の系、組成物及び方法はまた、疾患、例えば、がんを予防及び／または処置するために、化学療法剤、小分子、遺伝子治療、及び抗体などの治療剤と組み合わされてよい。
本開示の系及び組成物の調節可能な性質は、免疫療法の有効性の効力及び持続時間を改善する可能性を有する。本開示の組成物を使用して養子移入した細胞の生物活性を可逆的にサイレンシングすることによって、回復不可能なほど死滅させて療法を終了してしまうことなく、細胞療法の可能性を最大化することが可能である。
本開示は、患者に投与した後の免疫療法の微調整を目的とした方法を提供する。その結果、免疫療法の安全性及び有効性が向上し、免疫療法から恩恵を受ける可能性のある対象集団が増加する。
いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、目的のペイロードまたはタンパク質、例えば、本明細書で教示される抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（ＣＡＲ Ｔ細胞として知られる）を発現するように改変されたＴ細胞であってよい。したがって、目的のタンパク質、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲシステム（もしくはＴＣＲ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含むベクターが、Ｔ細胞中に導入される。ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲの細胞外標的化部分を介して特定の抗原に結合し、それによって細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）を介したシグナルがＴ細胞に伝達され、結果としてＴ細胞が活性化される。活性化ＣＡＲ Ｔ細胞は、細胞傷害性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、及びリンホトキシンなど）の放出、細胞増殖率の改善、細胞表面分子の変化などを含むその挙動を変化させる。そのような変化は、ＣＡＲまたはＴＣＲによって認識される抗原を発現する標的細胞の破壊を引き起こす。加えて、サイトカインの放出または細胞表面分子の変化は、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージを刺激する。
Ｔ細胞に導入されるＣＡＲは、ＴＣＲ ＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインのみを含む第１世代ＣＡＲ、またはＴＣＲ ＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む第２世代ＣＡＲ、またはＴＣＲ ＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン及び２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む第３世代ＣＡＲ、またはスプリットＣＡＲシステム、またはオン／オフスイッチＣＡＲシステムであってよい。一例では、ＣＡＲまたはＴＣＲの発現が、転写因子によって制御され、転写因子またはその構成要素がＤＲＤに機能的に連結されていると、それは安定化リガンドが存在しない場合、ほとんどまたは全く転写因子の蓄積をもたらさないことになる。ペイロードは、転写因子またはその構成要素に特異的なポリヌクレオチド結合配列を有し、それゆえ安定化リガンドが存在しない場合、目的のタンパク質がほとんどまたは全く生成されない。転写因子系を含む細胞に安定化リガンドが投与されると、転写因子は、ＤＲＤに結合されている場合に分解から救出され、次いで転写因子は目的のタンパク質に直接隣接するその同族ポリヌクレオチド結合配列に結合し、次いで転写される。次いで、転写されたｍＲＮＡが翻訳されて目的のポリペプチド／タンパク質を産生する。いくつかの例示的な実施形態では、ＤＲＤ安定化リガンドの存在または欠如は、形質導入したＴ細胞またはＮＫ細胞におけるＣＡＲまたはＴＣＲ発現を調節するために使用される。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞は、別の１つ、２つ、３つまたはそれを超える免疫療法剤を発現するようにさらに改変されてよい。免疫療法剤は、異なる標的分子に特異的な別のＣＡＲもしくはＴＣＲ、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５及びＩＬ１８などのサイトカイン、もしくはＩＬ１５Ｒａなどのサイトカイン受容体、阻害シグナルを刺激シグナルに変換するキメラスイッチ受容体、養子移入した細胞を腫瘍組織などの標的部位に誘導するホーミング受容体、免疫細胞の代謝を最適化する薬剤、または養子細胞移入後に重篤なイベントが観察される場合、もしくは移入した免疫細胞がもはや必要なくなった場合に活性化Ｔ細胞を死滅させる安全スイッチ遺伝子（例えば、自殺遺伝子）であってよい。これらの分子は、同じ構築物または別々の構築物中に含まれてよい。
一実施形態では、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＣＲ Ｔ細胞を含む）は、ＣＡＲペイロードを含む転写因子系及びサイトカインをコードする同じまたは異なる転写因子系のいずれかの１つ以上の構成要素で、同じまたは異なるＤＲＤに機能的に連結される同じまたは異なる転写因子の制御下においてトランスフェクトまたは形質導入される「武装化（ａｒｍｅｄ）」ＣＡＲ Ｔ細胞であってよい。誘導性サイトカインまたは分泌される構成的活性化サイトカインは、有効性及び持続性を改善するためにＣＡＲ Ｔ細胞をさらに武装化する。これに関連して、そのようなＣＡＲ Ｔ細胞は、「武装化（ａｒｍｏｒｅｄ）ＣＡＲ Ｔ細胞」とも称される。「武装」分子は、腫瘍微小環境ならびに自然及び適応免疫系の他の要素に基づいて選択されてよい。いくつかの実施形態では、分子は、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、Ｉ型ＩＦＮ、ＣＤ４０Ｌ及び４－１ＢＢＬなどの刺激因子であってよく、それらは適さない腫瘍微小環境に直面しても、異なる機構によってＣＡＲ Ｔ細胞の有効性及び持続性をさらに増強することが示されている。
キメラ抗原受容体操作Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法は、まだ固形腫瘍への適用が成功しているわけではない。ＣＡＲ－Ｔ細胞機能を強化し、固形腫瘍の部位にカーゴを選択的に送達することは、固形腫瘍に対する効果的なＣＡＲ－Ｔ療法を達成するための重要な戦術となる。一実施形態では、目的のペイロードまたはタンパク質は、インターロイキン１２（ＩＬ１２）を含んでよく、特にそれが腫瘍微小環境を再構築する可能性があるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を増強するために利用されてよい。ＩＬ１２は、前臨床及び臨床モデルにおいて、ＣＡＲまたはＴＣＲ改変Ｔ細胞に加えて腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の有効性を増強するのに効果的であることがこれまでに示されている。しかしながら、ＩＬ１２の構成的産生は、安全性及び／または有効性を損なう可能性があるため、必要に応じて、サイトカインの局所送達が好ましいアプローチである場合がある。いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系、またはその構成要素は、養子細胞療法におけるＩＬ１２の使用を可能にするために、ＩＬ１２発現を外因的に制御するために利用されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の転写因子制御系は、特に固形腫瘍状況においてＣＡＲの有効性を改善するために、腫瘍微小環境の再構築及びエピトープ拡散のために制御された局所シグナルを提供することによって、形質転換した免疫細胞におけるＦｌｅｘｉ ＩＬ１２（または膜結合型ＩＬ１２などの他のＩＬ１２構築物）などのペイロード発現を制御するために使用されてよい。本明細書に記載されるような転写因子制御はまた、ＤＲＤ特異的安定化リガンドの添加時に、ＩＬ１２の迅速で用量依存的な局所的産生を提供する。
いくつかの態様では、本開示の武装化ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲ及びＩＬ１２などのペイロードを発現するように改変され、これは本開示の転写因子系または組成物を使用して制御される。そのようなＴ細胞は、腫瘍におけるＣＡＲ媒介活性化後、誘導性ＩＬ１２を放出してＴ細胞活性化を増強し、自然免疫細胞を誘引して活性化し、ＣＤ１９陽性がん細胞を排除する。
一実施形態では、本開示のＴ細胞は、転写因子系またはその構成要素によってコードされるＣＡＲペイロードを含む転写因子系及び自殺遺伝子をコードする核酸配列を組み込むように改変されてよい。
一実施形態では、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＣＲ Ｔ細胞を含む）は、サイトカイン及び安全スイッチ遺伝子（例えば、自殺遺伝子）を含む転写因子系の１つ以上の構成要素でトランスフェクトまたは形質導入されてよい。自殺遺伝子は、転写因子系によってコードされるＤＲＤの細胞外安定化リガンドによって活性化されると、アポトーシスを誘導するカスパーゼ９などの誘導性カスパーゼであってよい。そのような誘導アポトーシスは、直接的な毒性及び制御不能な細胞増殖のリスクを低減するために必要に応じて移植細胞を排除する。
一実施形態では、任意の記載される目的のペイロードまたはタンパク質（交換可能に使用される）の発現レベル及び活性を調節する転写因子系、及びその構成要素は、免疫療法に使用されてよい。非限定的な例として、免疫療法剤は、抗体ならびにその断片及びバリアント、がん特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びそのバリアント、抗腫瘍特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、共阻害受容体もしくはリガンドの阻害剤、共刺激受容体及びリガンドのアゴニスト、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、可溶性成長因子、代謝因子、自殺遺伝子、ホーミング受容体、または細胞及び対象において免疫応答を誘導する任意の薬剤であってよい。
いくつかの実施形態では、免疫応答を誘導または抑制するための組成物は、転写因子系の１つ以上の構成要素、または転写因子系によってコードされる１つ以上のポリペプチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、転写因子系は以下のポリヌクレオチドを含んでよく、第１ポリヌクレオチドが、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、転写因子活性化ドメイン、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、ならびに転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、ＤＲＤに機能的に連結され、第２ポリヌクレオチドが、目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、第４核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結され、転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインは、相互作用して転写因子を形成し、転写因子と特定のポリヌクレオチド結合部位との結合が、転写因子によって第４核酸配列の転写を制御するために必要である。
一態様では、ペイロードは免疫療法剤であってよい。
いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系、及び組成物は、例えば、免疫療法剤の抗腫瘍免疫応答を含む、タンパク質（目的のタンパク質またはペイロード）機能の転写制御に関する。いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、１つ以上の免疫細胞型の機能を上方制御する、もしくは改善するために、または１つ以上の免疫細胞型の活性を下方制御するために使用されてよいサイトカイン、ケモカイン、抗体、インテグリン、内在性タンパク質、膜タンパク質、細胞外タンパク質を含んでよい。様々な実施形態では、疾患、状態または障害の処置に有用な免疫療法剤は、サイトカイン、例えば、インターロイキンを含み得る。様々な実施形態では、転写因子系は、疾患、状態もしくは障害またはそれらのいずれかと関連する症状を処置するのに有用な１つ以上の免疫細胞型の寿命及び活性を促進または上方制御するインターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８ならびに他の免疫療法剤を含む目的のタンパク質またはペイロードを提供する。
いくつかの実施形態では、転写因子ポリヌクレオチド結合部位に連結される目的のタンパク質（免疫療法剤）の転写を可能にするように作動可能な少なくとも１つの転写因子をコード及び発現するように遺伝子改変されている細胞は、養子細胞療法（ＡＣＴ、「養子細胞移入」とも称される）に使用されてよい。本明細書で使用される場合、養子細胞移入は、直接的な抗がん活性を有する免疫細胞（自己、同種または遺伝子改変宿主に由来）の投与を指す。ＡＣＴは、悪性疾患及び感染症に対する臨床応用において有望であることを示している。例えば、ＣＤ１９を認識するように遺伝子操作されたＴ細胞は、濾胞性Ｂ細胞リンパ腫の処置に使用されていて（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：４０９９－４１０２、及びＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２０１３，１０（５）：２６７－２７６）、抗腫瘍Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変された自己リンパ球を使用するＡＣＴは、転移性黒色腫の処置に使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄｕｄｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，２１：２３３－２４０）。
本開示によれば、転写因子系の１つ以上の構成要素は、養子細胞療法などの細胞療法の開発及び実施に使用されてよい。いくつかの実施形態では、転写因子系の１つ以上の構成要素は、操作されたＴＣＲ、もしくは改変ＴＣＲをコードするために、またはＴＣＲ以外のＴ細胞を増強するために（例えば、サイトカイン遺伝子、チェックポイント阻害剤ＰＤ１、ＣＴＬＡ４の遺伝子を導入することによって）、ＣＡＲ療法を実施するための細胞療法に、ＴＩＬの操作または制御に、同種細胞療法に、他の処置ライン（例えば、放射線、サイトカイン）とのＴ細胞療法の組合せに使用されてよい。
本明細書で提供されるのは、養子細胞療法に使用するための方法である。本方法は、それを必要とする対象をプレコンディショニングすること、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素、及び／または組成物で免疫細胞を調節すること、本開示の組成物を発現する操作された免疫細胞を対象に投与すること、ならびに対象内での操作された細胞の生着が成功することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の調節可能な転写因子発現構築物及び組成物は、養子細胞療法と関連するプレコンディショニングレジメンを最小限に抑えるために使用されてよい。本明細書で使用される場合、「プレコンディショニング」は、養子細胞療法の結果を改善するために対象に投与される任意の治療レジメンを指す。プレコンディショニング戦略としては、全身照射及び／またはリンパ球除去化学療法が挙げられるが、これらに限定されない。プレコンディショニングを用いない養子療法の臨床試験は、臨床的利益を全く実証できないため、ＡＣＴにおいてその重要性を示している。さらに、プレコンディショニングは重大な毒性と関連し、ＡＣＴに適した対象コホートを限定する。いくつかの場合では、ＡＣＴの免疫細胞は、プレコンディショニングの必要性を減らすために、本開示の安定化リガンドを使用して調節されてよい目的のタンパク質の選択的発現を可能にするため、本明細書に記載される転写因子を使用してペイロードとしてＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ１２及びＩＬ１５などのサイトカインを発現するように操作されてよい（Ｐｅｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９（１８）：４１３３－４１、その内容全体が参照によって組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ＡＣＴの免疫細胞は、樹状細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞などのＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ヘルパーＴ細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、ならびにそれらの任意の組合せであってよい。他の実施形態では、ＡＣＴの免疫刺激細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成されてよい。いくつかの実施形態では、自己または同種免疫細胞がＡＣＴに使用される。
いくつかの実施形態では、ＡＣＴに使用される細胞は、目的の腫瘍細胞上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞であってよい。他の実施形態では、ＡＣＴに使用される細胞は、目的の腫瘍細胞上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞であってよい。免疫療法のための遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）の養子移入に加えて、ＣＡＲ発現白血球の代替型が、単独で、またはＣＡＲ Ｔ細胞と組み合わせたいずれかで養子免疫療法に使用されてよい。一例では、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の混合物がＡＣＴに使用されてよい。Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＣＡＲの発現レベルは、本開示によれば、転写因子またはその構成要素に機能的に連結されるＤＲＤ（複数可）に結合する小分子によって調節及び制御され、これにより、トランスフェクトまたは形質導入Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＣＡＲの選択的転写が可能となる。このシナリオでは、ＣＡＲは、転写因子の特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、転写因子系の１つ以上の構成要素を発現するように操作されたＮＫ細胞が、ＡＣＴに使用されてよい。ＮＫ細胞の活性化は、標的細胞においてパーフォリン／グランザイム依存性アポトーシスを誘導する。ＮＫ細胞の活性化はまた、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α及びＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカイン分泌も誘導する。これらのサイトカインは、マクロファージの貪食機能及びそれらの抗菌活性を増強し、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞による抗原提示の上方制御を介して適応免疫応答を増強する（Ｖｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，９（５）：５０３－５１０によって概説されている）。
遺伝子改変の他の例としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の導入及びＮＫＧ２Ａなどの阻害性ＮＫ細胞受容体の下方制御が挙げられてよい。
ＮＫ細胞はまた、腫瘍細胞との相互作用の際にＮＫ細胞阻害シグナルを回避するように遺伝的に再プログラムされてよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、またはＴＡＬＥＮを使用してＮＫ細胞を遺伝子改変し、それらの阻害性受容体をサイレンシングすると、ＮＫ細胞の抗腫瘍能が増強される場合がある。
免疫細胞は、当該技術分野において既知の様々な方法を使用してエクスビボで単離及び増殖し得る。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞を単離及び増殖させる方法は、米国特許第６，８０５，８６１号及び同第６，５３１，４５１号、米国特許公開第ＵＳ２０１６０３４８０７２Ａ１号ならびに国際特許公開第ＷＯ２０１６１６８５９５Ａ１号に記載されていて、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＮＫ細胞の単離及び増殖は、米国特許公開第ＵＳ２０１５０１５２３８７Ａ１号、米国特許第７，４３５，５９６号、及びＯｙｅｒ，Ｊ．Ｌ．（２０１６）．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．１８（５）：６５３－６３に記載されていて、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。特に、ヒト初代ＮＫ細胞は、フィーダー細胞、例えば、膜結合型ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１２及び４－１ＢＢＬを発現するように遺伝子改変されている骨髄細胞株の存在下で増殖する場合がある。
いくつかの場合では、免疫細胞の亜集団が、ＡＣＴのために濃縮されてよい。免疫細胞濃縮の方法は、国際特許公開第ＷＯ２０１５０３９１００Ａ１号に教示されている。別の例では、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーターマーカー（ＢＴＬＡ）が陽性のＴ細胞が、米国特許第９，５１２，４０１号（その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように、抗がん反応性であるＴ細胞を濃縮するために使用されてよい。
いくつかの実施形態では、ＡＣＴのための免疫細胞は、Ｔ細胞増殖を増強するために選択した亜集団を枯渇させてよい。例えば、免疫細胞は、米国特許公開第ＵＳ２０１６０２９８０８１Ａ１号（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に教示される方法を使用して、Ｆｏｘｐ３＋Ｔリンパ球を枯渇させて抗腫瘍免疫応答を最小限に抑える場合がある。
いくつかの実施形態では、ＡＣＴのためのＴ細胞の活性化及び増殖は、細胞表面上で一過性に発現されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原刺激によって達成される。そのような活性化方法は、国際特許第ＷＯ２０１７０１５４２７号に教示され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と関連する抗原によって活性化されてよい。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、抗原特異的または非特異的である樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞であってよい。ＡＰＣは、それらの器官内で自己または同種の場合がある。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、例えば、細胞ベースのａＡＰＣまたは無細胞ａＡＰＣなどであってよい。細胞ベースのａＡＰＣは、ヒト赤白血病細胞などの遺伝子改変同種細胞またはマウス線維芽細胞及びショウジョウバエ細胞などの異種細胞のいずれかから選択されてよい。あるいは、ＡＰＣは無細胞性の場合があり、抗原または共刺激ドメインが、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ、脂質小胞またはエキソソームなどの合成表面上に提示される。
いくつかの実施形態では、本開示の細胞、特にＴ細胞は、人工細胞プラットフォームを使用して増殖されてよい。一実施形態では、成熟Ｔ細胞は、Ｓｅｅｔ ＣＳ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４，５２１－５３０（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）によって記載されている人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）を使用して生成されてよい。ＡＴＯは、デルタ様カノニカルＮｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ１）を発現する間質細胞株に基づく。本方法では、間質細胞が、遠心分離によって造血幹細胞及び前駆細胞と凝集し、細胞培養挿入物上に気液界面で配置され、オルガノイド培養物を生成する。ＡＴＯ由来のＴ細胞は、ナイーブ表現型、多様なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリー及びＴＣＲ依存性機能を示す。
いくつかの実施形態では、養子細胞療法は、自己移入によって実施され、細胞は処置を必要とする対象に由来し、単離及び処理後の細胞が同じ対象に投与される。他の場合では、ＡＣＴは同種移入を伴う場合があり、細胞は、最終的に細胞療法を受けるレシピエント対象以外のドナー対象から単離及び／または調製される。ドナー及びレシピエント対象は、遺伝的に同一、もしくは類似している場合があるか、または同じＨＬＡクラスもしくはサブタイプを発現する場合がある。
いくつかの実施形態では、ＡＣＴのために免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）中に導入される複数の免疫療法剤は、同じまたは異なる転写因子系によって制御されてよい。一例では、２つのペイロード、例えば、ＩＬ１２などのサイトカイン及びＣＤ１９ ＣＡＲなどのＣＡＲ構築物の各々が、同じまたは異なる転写因子系上の１つ以上の転写因子（複数可）によって転写され、転写因子（複数可）は、同じまたは異なるＤＲＤに連結される。ペイロードは、ＤＲＤ（複数可）がＤＲＤ（複数可）に特異的な安定化リガンドで安定化される場合に転写及び翻訳される。ＩＬ１２及びＣＤ１９ ＣＡＲの発現は、１つ以上の安定化リガンドを使用して調節される。他の実施形態では、ＡＣＴのために免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）中に導入される複数の免疫療法剤は、異なる転写因子系によって制御されてよい。一例では、ＩＬ１２などのサイトカイン及びＣＤ１９ ＣＡＲなどのＣＡＲ構築物は各々、２つの異なる転写因子のうち１つによって転写され、各転写因子は異なるＤＲＤに機能的に連結され、それによって異なる刺激を使用して別々に調節され得る。別の例では、自殺遺伝子及びＣＡＲ構築物が、２つの異なる転写因子によって転写的に活性化されてよい。
本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素及び組成物を使用する遺伝子調節に続いて、細胞がそれを必要とする対象に投与される。養子細胞療法のための細胞の投与方法は既知であり、提供される方法及び組成物に関連して使用されてよい。例えば、養子Ｔ細胞療法の方法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０１１）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．８（１０）：５７７－８５）に記載されている。例えば、Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（１０）：９２８－９３３、Ｔｓｕｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４３８（１）：８４－９、Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）：ｅ６１３３８を参照し、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＡＣＴの免疫細胞は、免疫細胞の活性化、浸潤、増殖、生存及び抗腫瘍機能を促進する１つ以上の免疫療法剤（目的のタンパク質）を発現するように改変されてよい。免疫療法剤は、異なる標的分子に特異的な第２ＣＡＲもしくはＴＣＲ、サイトカインもしくはサイトカイン受容体、阻害シグナルを刺激シグナルに変換するキメラスイッチ受容体、養子移入した細胞を腫瘍組織などの標的部位に誘導するホーミング受容体、免疫細胞の代謝を最適化する薬剤、または養子細胞移入後に重篤なイベントが観察される場合、もしくは移入した免疫細胞がもはや必要なくなった場合に活性化Ｔ細胞を死滅させる安全スイッチ遺伝子（例えば、自殺遺伝子）であってよい。
いくつかの実施形態では、養子細胞移入に使用される免疫細胞は、がん患者の腫瘍を死滅させるそれらの能力をさらに改善する全体的な目標のために、それらの持続性、細胞毒性、腫瘍標的化能、及びインビボで疾患部位にホーミングする能力を改善するために遺伝子操作され得る。一例は、ガンマ－サイトカイン（例えば、ＩＬ２及びＩＬ１５）などのサイトカインをコードする本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を免疫細胞中に導入し、免疫細胞の増殖及び生存を促進することである。転写因子系によってコードされるサイトカイン遺伝子（例えば、ガンマ－サイトカインＩＬ２及びＩＬ１５）の免疫細胞への形質導入は、外因性サイトカインを添加することなく免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞の増殖が可能となり、サイトカイン発現ＮＫ細胞が腫瘍細胞傷害性を増強するようになる。
いくつかの実施形態では、転写因子系の１つ以上の構成要素は、Ｔ細胞疲弊を防止するために利用されてよい。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞疲弊」は、慢性Ｔ細胞活性化によって引き起こされるＴ細胞機能の段階的な進行性の喪失を指す。Ｔ細胞疲弊は、抗ウイルス及び抗腫瘍免疫療法の有効性を制限する主な要因である。疲弊したＴ細胞は、アポトーシス率が高く、複数の阻害性受容体の表面発現が高いのと同時に増殖能及びサイトカイン産生能が低下している。疲弊につながるＴ細胞活性化は、抗原の存在下または不存在下のいずれかで生じる場合がある。
いくつかの実施形態では、転写因子系の１つ以上の構成要素は、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）との関連においてＴ細胞疲弊を防止するために利用されてよい。これに関連して、いくつかの場合では疲弊は、ＣＡＲの細胞内ドメインの継続的な活性化をもたらす、細胞表面上でのＣＡＲのｓｃＦｖのオリゴマー化によって引き起こされる可能性がある。非限定的な例として、本開示のＣＡＲは、オリゴマー化できないｓｃＦｖを含んでよい。別の非限定的な例として、抗原曝露後に急速に内在化及び再発現されるＣＡＲもまた、細胞表面上での慢性的なｓｃＦｖオリゴマー化を防止するために選択されてよい。一実施形態では、ｓｃＦｖのフレームワーク領域が、構成的ＣＡＲシグナル伝達を防止するために改変されてよい（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７４（１９）Ｓ１、その内容全体が参照によって組み込まれる）。本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素はまた、慢性Ｔ細胞活性化を防止するために、Ｔ細胞表面上のＣＡＲの表面発現を制御することに使用されてよい。本開示のＣＡＲはまた、疲弊を最小限に抑えるように設計されてよい。非限定的な例として、４１－ＢＢシグナル伝達ドメインが、Ｔ細胞疲弊を改善するためにＣＡＲ設計に組み込まれてよい。いくつかの実施形態では、Ｌｏｎｇ Ｈ Ａ ｅｔ ａｌ．によって開示される戦略のいずれも、疲弊を防止するために利用されてよい（Ｌｏｎｇ Ａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１，５８１－５９０、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系の調節可能な性質は、強力なＣＡＲシグナル伝達で観察されるヒトＴ細胞疲弊を逆転させるために利用されてよい。本開示の組成物を使用して養子移入した細胞の生物活性を可逆的にサイレンシングすることが使用され、強力なシグナル伝達を逆転させて、それによりＴ細胞を再活性化する場合がある。疲弊の逆転は、疲弊と関連する複数の阻害性受容体の下方制御によって測定されてよい。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞代謝経路は、疲弊に対するＴ細胞の感受性を減少させるように改変されてよい。代謝経路としては、解糖、尿素回路、クエン酸回路、ベータ酸化、脂肪酸生合成、ペントースリン酸経路、ヌクレオチド生合成、及びグリコーゲン代謝経路を挙げてよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、解糖の速度を減少させるペイロードが、Ｔ細胞疲弊を制限または防止するために利用されてよい（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３，１（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｐ２１、その内容全体が参照によって組み込まれる）。一実施形態では、本開示のＴ細胞は、２－デオキシグルコース、及びラパマイシンなどの解糖の阻害剤と組み合わせて使用されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の目的のペイロードまたはタンパク質は、Ｔ細胞疲弊と関連するＴ細胞表面マーカーを標的とする抗体または断片と組み合わせて使用されてよい。使用されてよいＴ細胞疲弊と関連するＴ細胞表面マーカーとしては、ＣＴＬＡ－１、ＰＤ－１、ＴＧＩＴ、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、及びＣＤ９６が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、転写因子系の１つ以上の構成要素は、Ｔ細胞疲弊を防止するために利用されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象におけるＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）集団を変化させるために利用されてよい。一実施形態では、本明細書に記載されるペイロードのいずれも、ＣＤ４陽性細胞対ＣＤ８陽性集団の比率を変更するために利用されてよい。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、エクスビボで選別され、本明細書に記載されるサイトカインのいずれかを発現するように操作されてよい。本開示のペイロードは、ＴＩＬ媒介免疫応答を増強するために、ＴＩＬのＣＤ４及び／またはＣＤ８集団を増殖させることに使用されてよい。
ＣＡＲ－Ｔ療法の結果を改善するためのパラメータは、Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．ＪＣＩ．２０１９；１２９（５）：２１２３－２１３２（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。アフェレーシス時の末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるバイオマーカーＬＡＧ３（ｈｉｇｈ）／ＴＮＦ－α（ｌｏｗ）のレベルはまた、数週間以上持続する完全奏効を達成しない、高抗原負荷の対象においてその後の機能不全応答を予測する場合がある。出発Ｔ細胞レパートリー及び製造プロセスの効果の結果であるＴ細胞固有の特徴が、養子移入後のＣＤ１９抗原誘導活性化に収束することも、ＣＡＲ－Ｔ療法の結果において役割を果たしている可能性がある。出発Ｔ細胞レパートリーは、アフェレーシスのタイミングに部分的に影響を受ける場合がある。一実施形態では、アフェレーシスは、化学療法の前に実施されてよい。リンパ球除去化学療法の前に骨髄で評価されるように、ＣＤ１９発現白血病及び正常Ｂ細胞の累積負荷は、ＣＡＲ－Ｔ療法の結果を決定するのに重要な場合がある。Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．によれば、抗原負荷の増加はＣＡＲ－Ｔ療法の結果を改善する。インビボでのＣＤ１９抗原負荷を増加させるために、対象はまた、ＣＤ１９を発現するように遺伝子改変し、増殖させた対象由来のＴ細胞（Ｔ－ＡＰＣとも称される）を注入されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の調節可能な転写因子発現構築物、目的のペイロード（例えば、免疫療法剤）、ベクター、細胞及び組成物は、がんワクチンと組み合わせて使用されてよい。
いくつかの実施形態では、がんワクチンは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するペプチド及び／またはタンパク質を含んでよい。そのような戦略は、対象において免疫応答を誘発するために利用されてよく、これはいくつかの場合では、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の場合がある。がんワクチンに使用されるペプチドは、対象の変異プロファイルに一致するように改変されてもよい。例えば、療法を必要とする対象に見られる変異と一致した変異を有するＥＧＦＲ由来ペプチドは、肺癌を有する患者での使用に成功している（Ｌｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｏｃｔ ７；５（１２）：ｅ１２３８５３９、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、本開示のがんワクチンは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するスーパーアゴニスト改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）を含んでよい。それらは、１つ以上のアミノ酸によって天然ペプチド配列から逸脱している変異体ペプチドリガンドであり、これは天然エピトープよりも効果的に特定のＣＴＬクローンを活性化する。それらの変化によって、ペプチドが制限クラスＩ ＭＨＣ分子により良好に結合するか、または所与の腫瘍特異的ＣＴＬサブセットのＴＣＲとより有利に相互作用することが可能となる場合がある。ＡＰＬは、米国特許公開第ＵＳ２０１６０３１７６３３Ａ１号に教示される方法を使用して選択されてよく、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系の構成要素、及びペイロードをコードするように遺伝子改変されたエフェクター免疫細胞は、本明細書に記載される生物学的アジュバントと組み合わされてよい。ＣＡＲならびにサイトカイン及びリガンドの二重制御は、内在性細胞のＴ細胞増殖から標的媒介活性化の動態制御を分離する。そのような二重制御はまた、患者のプレコンディショニングレジメンの必要性を最小限に抑える。非限定的な例として、ペイロード、例えば、ＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを転写するＤＲＤ制御転写因子は、サイトカイン、例えば、ＩＬ１２と組み合わされてＣＡＲの抗腫瘍効果を増強する場合がある（Ｐｅｇｒａｍ Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ＩＬ１２ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｉｏｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９：４１３３－４１、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。別の非限定的な例として、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．は、樹状細胞ベースのワクチン接種を組換えヒトＩＬ７と組み合わせて、高リスクの小児肉腫患者の転帰を改善した（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ．Ａｄｊｕｖａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ Ｈｉｇｈ－Ｒｉｓｋ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｓａｒｃｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６．２２（１３）：３１８２－９１、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原特異的ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変されたエフェクター免疫細胞は、免疫抑制性腫瘍微小環境を変換する免疫療法剤を含む本開示の組成物と組み合わされてよい。
一態様では、同じ細胞上の異なる標的分子に特異的なＣＡＲを発現するように改変されたエフェクター免疫細胞が組み合わされてよい。別の態様では、ＮＫ細胞及びＴ細胞などの同じＣＡＲ構築物を発現するように改変された異なる免疫細胞が、腫瘍処置のために組み合わせて使用されてよく、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞が、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するために同じＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように改変されたＮＫ細胞と組み合わされてよい。
他の実施形態では、ＣＡＲを発現するように改変された免疫細胞は、チェックポイント遮断剤と組み合わされてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素、例えば、ペイロードを発現するように遺伝子改変されたエフェクター免疫細胞は、本開示のがんワクチンならびに他の免疫療法及びアジュバント処置と組み合わされてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本開示の組成物と、がん、感染症及び他の免疫不全障害の処置に効果的な他の薬剤、例えば、抗がん剤などとの組合せを含んでよい。本明細書で使用される場合、「抗がん剤」という用語は、例えば、がん細胞の死滅、がん細胞でのアポトーシスの誘導、がん細胞の増殖速度の減少、転移の発生率もしくは数の減少、腫瘍サイズの縮小、腫瘍増殖の阻害、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給の減少、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答の促進、がんの進行の予防もしくは阻害、またはがんを有する対象の寿命の増加によって、対象のがんに悪影響を及ぼすことができる任意の薬剤を指す。
いくつかの実施形態では、抗がん剤または療法は、化学療法剤、もしくは放射線療法、免疫療法剤、外科手術、または本開示と組み合わせて処置の治療有効性を改善する任意の他の治療剤であってよい。
一実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲを含む転写因子系の１つ以上の構成要素は、国際特許出願第ＷＯ２０１６１６４５８０号（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に教示される方法を使用して、バーキットチロシン受容体キナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤などのアミノピリミジン誘導体と組み合わせて使用されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、腫瘍細胞の表面上におけるいくつかの標的分子に特異的な抗体などの、本明細書に記載される本発明の療法以外の免疫療法と組み合わせて使用されてよい。
例示的な化学療法としては、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）、酢酸アメタントロン、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペリン（Ａｓｐｅｒｒｉｎ）、スリンダク、クルクミン、以下を含むアルキル化剤：ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシルなど、ニトロソウレア、例えば、カルムスチン（ＢＣ Ｕ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル－ＣＣ Ｕ）など、エチレンイミン／メチルメラミン、例えば、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）など、ブスルファンなどのスルホン酸アルキル、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジン、以下を含む代謝拮抗薬：葉酸類似体、例えば、メトトレキサート及びトリメトレキサートなど、ピロリジン類似体、例えば、５－フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５－アザシチジン、２，２’－ジフルオロデオキシシチジンなど、プリン類似体、例えば、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、アザチオプリン、２’－デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２－ＣｄＡ）など、以下を含む天然物：パクリタキセルなどの抗有糸分裂薬、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビン、ｔａｘｏｔｅｒｅ、エストラムスチン、ならびにエストラムスチンリン酸を含むビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド及びテニポシドなど、抗生物質、例えば、アクチモマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシンなど、Ｌ－アスパラギナーゼなどの酵素、サイトカイン、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）－ガンマ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ、ＴＮＦ－ベータ及びＧＭ－ＣＳＦなど、抗血管新生因子、例えば、アンギオスタチン及びエンドスタチンなど、ＦＧＦもしくはＶＥＧＦの阻害剤、例えば、可溶性ＶＧＦ／ＶＥＧＦ受容体を含む、血管新生因子の可溶型の受容体など、白金配位錯体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチンなど、ミトキサントロンなどのアントラセンジオン、ヒドロキシ尿素などの置換尿素、Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＦｆ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制薬、例えば、ミトタン（ο、ρ’－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなど、以下を含むホルモン及びアンタゴニスト：副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、例えば、プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾンならびにアミノグルテチミドなど、プロゲスチン、例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロールなど、エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物など、タモキシフェンなどの抗エストロゲン薬、プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン、抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体及びロイプロリドなど、フルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲン薬、キナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、メチル化阻害剤、プロテアソーム阻害剤、モノクローナル抗体、酸化剤、抗酸化剤、テロメラーゼ阻害剤、ＢＨ３模倣薬、ユビキチンリガーゼ阻害剤、ｓｔａｔ阻害剤ならびに受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、メシル酸イマチニブ（ＧｌｅｅｖｅｃまたはＧｌｉｖｅｃとして販売）及びＴａｒｖｅｃａとして現在販売されているエルロチニブ（ＥＧＦ受容体阻害剤）など、抗ウイルス薬、例えば、リン酸オセルタミビル、アンホテリシンＢ、及びパリビズマブなど、Ｓｄｉ１模倣薬、セムスチン、老化誘導阻害剤１、スパルフォシン酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、超活性血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、Ｖｉｔａｘｉｎ、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、ならびにジノスタチンスチマラマー、ＰＩ３Ｋβ小分子阻害剤、ＧＳＫ２６３６７７１、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＢＫＭ１２０）、ＢＲＡＦ阻害剤、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）ならびにダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ）、または前述の任意の類似体もしくは誘導体及びバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
放射線治療剤及び因子としては、ＤＮＡ損傷を誘導する放射線及び波、例えば、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、放射性同位体などが挙げられる。療法は、上記の放射線の形態を限局性腫瘍部位に照射することによって達成される場合がある。それらの因子は全て、広範囲の損傷ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに染色体の組立て及び維持に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）での５０～２００レントゲンの１日線量から２０００～６０００レントゲンの単回線量の範囲である。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、同位体の半減期、放射される放射線の強度及び種類、ならびに腫瘍性細胞による取込みに依存する。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、レナリドミド（ＬＥＮ）などの免疫調節剤であってよい。最近の研究では、レナリドミドがＣＡＲ改変Ｔ細胞の抗腫瘍機能を増強し得ることが実証されている（Ｏｔａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１５，５（４）：ｅ１１１５９４０）。抗腫瘍抗体のいくつかの例としては、トシリズマブ、シルツキシマブが挙げられる。
本開示の組成物と組み合わせて使用されてよい他の薬剤としては、細胞表面受容体及びそれらのリガンド、例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４もしくはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ及びギャップ結合などの上方制御に影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、例えば、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンなど、または抗体Ｃ２２５などのアポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる薬剤も挙げられてよいが、これらに限定されない。
組合せは、本開示の組成物及び他の薬剤を同時にまたは別々に投与することを含んでよい。あるいは、本免疫療法は、分、日、週から月の範囲の間隔で他の薬剤／療法に先行するか、またはその後に行われてよい。
本開示で提供されるのは、腫瘍体積または負荷を、必要とする対象において減少させる方法であり、本方法は本開示の組成物を対象中に導入することを含む。
本開示はまた、対象のがんを処置する方法を提供し、本方法は、本開示の転写因子系を含むように遺伝子改変された有効量のエフェクター免疫細胞を対象に投与することを含む。
がん
様々ながんが、医薬組成物、転写因子系構成要素、本開示のそれらのＤＲＤまたはペイロードを含む調節可能な転写因子発現構築物で処置されてよい。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、周囲組織に侵入し、新しい身体部位に転移する傾向がある未分化細胞の増殖を特徴とする様々な悪性新生物のいずれかを指し、そのような悪性新生物の増殖を特徴とする病態も指す。がんは、腫瘍または血液悪性腫瘍の場合があり、これらとしては、リンパ腫／白血病、癌腫及び肉腫の全ての型、例えば、肛門、膀胱、胆管、骨、脳、乳房、頸部、結腸／直腸、子宮内膜、食道、眼、胆嚢、頭頸部、肝臓、腎臓、喉頭、肺、縦隔（胸部）、口、卵巣、膵臓、陰茎、前立腺、皮膚、小腸、胃、脊髄、尾骨、精巣、甲状腺及び子宮に見られるがんまたは腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の組成物で処置されてよい癌腫型としては、乳頭腫／癌腫、絨毛癌、内胚葉洞腫瘍、奇形腫、腺腫／腺癌、黒色腫、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫、血管腫、骨腫、軟骨腫、神経膠腫、リンパ腫／白血病、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、基底細胞癌及び副鼻腔未分化癌が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の組成物で処置されてよい肉腫型としては、軟部組織肉腫、例えば、胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管周皮細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、及びアスキン腫瘍、ユーイング肉腫（原始神経外胚葉性腫瘍）、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、骨肉腫、ならびに軟骨肉腫などが挙げられるが、これらに限定されない。
感染症
いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系は、感染症の処置のために使用されてよい。本開示の転写因子系は、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、及び／またはＴ細胞などの養子細胞移入に適した細胞中に導入されてよい。本開示の転写因子系によって処置される感染症としては、ウイルス、細菌、真菌、及び／または寄生虫によって引き起こされる疾患が挙げられてよい。本開示のＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒａペイロードは、免疫細胞の増殖及び／または感染症の処置に有用な免疫細胞の持続性を増加させるために使用されてよい。
本明細書における「感染症」は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞に感染し、疾患状態を引き起こす任意の病原体または媒介物によって引き起こされる疾患を指す。それらの例としては、細菌、酵母、真菌、原生動物、マイコプラズマ、ウイルス、プリオン、及び寄生虫が挙げられる。例としては、（ａ）ウイルス性疾患、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－ＩＩ、ＣＭＶ、またはＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡もしくはワクシニアなどのオルソポックスウイルス、または伝染性軟属腫）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルスまたはエンテロウイルス）、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、パポーバウイルス（例えば、パピローマウイルス、例えば、性器疣贅、一般的な疣贅、または足底疣贅を引き起こすものなど）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルスまたはデングウイルス）、あるいはレトロウイルス（例えば、ＨＩＶなどのレンチウイルス）による感染に起因する疾患など、（ｂ）細菌性疾患、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属の細菌による感染に起因する疾患など、（ｃ）他の感染症、例えば、クラミジア、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコッカス髄膜炎を含むが、これらに限定されない真菌症、マラリア、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｎｉｉ肺炎、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、及びトリパノソーマ感染症を含むが、これらに限定されない寄生虫症ならびにヒト疾患、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症及びクールーなどを引き起こすプリオンなどに関与するものが挙げられる。
がん免疫療法及び細胞療法
がん免疫学の分野における最近の進歩によって、免疫系ががんを予防するのを助けるためのいくつかのアプローチの開発が可能となっている。そのような免疫療法アプローチは、モノクローナル抗体による、またはエクスビボで操作されたＴ細胞（例えば、キメラ抗原受容体もしくは操作されたＴ細胞受容体を含有する）の養子移入によるがん抗原の標的化を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物、転写因子系、調節可能な転写因子発現構築物、調節可能な転写因子発現構築物構成要素、本開示のそれらのペイロードを含む調節可能な転写因子発現構築物は、１つ以上のがんを標的とするために免疫系の調節または改変または開発に使用されてよい。このアプローチはまた、他のそのような生物学的アプローチ、例えば、免疫応答改変療法、例えば、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、他のモノクローナル抗体、ワクチン、遺伝子療法の投与などを用いると考えられてよく、非特異的免疫調節剤も、医薬組成物、転写因子系、調節可能な転写因子発現構築物、調節可能な転写因子発現構築物構成要素、本開示のそれらのペイロードを含む調節可能な転写因子発現構築物と組み合わされる抗がん療法として想定される。
がん免疫療法は、がんと戦うために患者自身の免疫系を誘導するように設計された多様な治療戦略を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物、転写因子系、調節可能な転写因子発現構築物、調節可能な転写因子発現構築物構成要素、本開示のそれらの転写因子及び／またはペイロードを含む調節可能な転写因子発現構築物は、免疫腫瘍学治療薬として設計される。
細胞療法
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を保有する遺伝子操作Ｔ細胞、及び組換えＴＣＲ技術を含む、いくつかの種類の細胞免疫療法が存在する。
本開示によれば、転写因子系は、養子細胞療法などの細胞療法の開発及び実施に使用されてよい。転写因子系、ならびにそれらの転写因子及びペイロードは、エピトープタグ付き受容体を制御するために、ＴＣＲ除去－ＴＣＲ遺伝子破壊、ＴＣＲ工学を実施するための細胞療法に、Ｔ細胞の増殖方法を改善するために、エクスビボＡＰＣ刺激を増強するためのツールとして、Ｔ細胞を刺激するためのＡＰＣプラットフォームに、操作されたＴＣＲ、もしくは改変ＴＣＲをコードするために、またはＴＣＲ以外のＴ細胞を増強するために（例えば、サイトカイン遺伝子、チェックポイント阻害剤ＰＤ１、ＣＴＬＡ４の遺伝子を導入することによって）、抗原によるエクスビボ刺激に、ＴＣＲ／ＣＡＲの組合せに、ＴＩＬの操作または制御に、同種細胞療法に、他の処置ライン（例えば、放射線、サイトカイン）とのＴ細胞療法の組合せに使用されてよい。
いくつかの実施形態では、奏効率の改善は、細胞療法の支援で得られる。
細胞集団の増殖及び持続性は、ペイロード、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または他の免疫関連細胞の受容体または経路構成要素の制御または微調整によって達成されてよい。いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の応答を増強するタンパク質の発現を空間的に、及び／または一時的に制御するように設計される。いくつかの実施形態では、転写因子系は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の応答を阻害するするタンパク質の発現を空間的に、及び／または一時的に制御するように設計される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような転写因子系を含むように遺伝子改変されている細胞は、ＣＡＲサイトカインストームを減少、軽減または排除するように設計されてよい。いくつかの実施形態では、そのような減少、軽減及び／または排除は、固形腫瘍または腫瘍微小環境内で生じる。
いくつかの実施形態では、転写因子系は、１つ以上のサイトカイン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１５及びＩＬ２１などのインターロイキンをコードしてよい。
一実施形態では、本開示のペイロードは、ＩＬ２を含んでよい。一態様では、本開示の転写因子系は、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５及び他のインターロイキン免疫療法剤を選択的に転写する転写因子をコードしてよく、これは転写因子系で使用されるＤＲＤに選択的な安定化リガンドを使用して慎重に調節されてよい。
一態様では、本開示の転写因子系は、ペイロード、例えば、ＩＬ１２融合ポリペプチドを選択的に転写する転写因子をコードしてよい。調節可能なＩＬ１２融合ポリペプチドは、免疫療法剤として直接使用されるか、またはエフェクター免疫細胞（Ｔ細胞及びＴＩＬ細胞）に形質導入され、養子細胞移入のためのより優れたインビボ増殖能及び生存能を有する改変Ｔ細胞を生成してよい。現在の養子細胞療法における過酷なプレコンディショニングレジメンの必要性は、制御ＩＬ１２を使用すると最小限に抑えられる可能性がある。ＩＬ１２は、腫瘍微小環境を改変し、現時点では腫瘍抗原標的療法に抵抗性を示す固形腫瘍において持続性を増加させるために利用されてよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、全身毒性をもたらすことなく免疫抑制を軽減するために、転写因子制御ＩＬ１２で武装化されてよい。
いくつかの実施形態では、ＩＬ１２はＦｌｅｘｉ ＩＬ１２であってよく、ｐ３５及びｐ４０サブユニットの両方が、一本鎖ポリペプチドを産生する単一のｃＤＮＡによってコードされる。
いくつかの実施形態では、例示的な転写因子系は、本開示の細胞増殖のために１つ以上のサイトカインをコードするか、またはそれらを産生するために調節もしくは誘導されてよい。そのような場合、細胞は実際の増殖について試験されてよい。増殖は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％であるか、またはそれを超えてよい。いくつかの実施形態では、サイトカインはＩＬ１５である。ＩＬ１５をコードする転写因子系は、細胞傷害性集団の増殖を誘導し、Ｔｒｅｇの刺激を回避するように設計されてよい。他の場合には、細胞傷害性集団の増殖を誘導する転写因子系はまた、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞も刺激する可能性がある。インターロイキン１５は強力な免疫刺激性サイトカインであり、Ｔ細胞、及びナチュラルキラー細胞に不可欠な生存因子である。ＩＬ２とＩＬ１５とを比較する前臨床試験では、ＩＬ１５は、ＩＬ２よりも毒性が低いことに関連することが示されている。いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系は、ＩＬ１５融合ポリペプチドをコードしてよい。ＩＬ１５ポリペプチドはまた、ＩＬ１５受容体に対するその結合親和性を増加させるために改変されてよい。例えば、アスパラギンは、ＩＬ１５の７２位でアスパラギン酸によって置き換えられてよい（米国特許公開第ＵＳ２０１４０１３４１２８号の配列番号．２、その内容全体が参照によって組み込まれる）。
免疫系は、がん以外の疾患の処置に利用され得る。転写因子系、それらの構成要素または調節可能な転写因子発現構築物は、自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主病、ならびに免疫不全をもたらす可能性のある疾患及び障害、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などを含むが、これらに限定されない疾患の処置のために免疫療法に利用されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってよく、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）に形質導入される場合、ＣＡＲの細胞外標的部分によって認識される分子を発現する標的（例えば、腫瘍細胞）に対して免疫細胞を再指向し得る。
いくつかの実施形態では、転写因子系の目的のペイロードまたはタンパク質を含む、転写因子系を含む医薬組成物は、自己免疫疾患を減弱させるため、１つ以上の自己反応性免疫構成要素、例えば、自己抗体及び自己反応性免疫細胞などを標的とするために免疫系の調節または改変または開発に使用されてよい。
いくつかの実施形態では、転写因子系は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を減弱または軽減するために、免疫療法に基づく処置に利用されてよい。ＧＶＨＤは、幹細胞または骨髄移植後に同種ドナーの免疫細胞が宿主組織に対して反応する状態を指す。いくつかの実施形態では、転写因子系は、ＧＶＨＤの処置のためにＴｒｅｇを調節するように設計されたサイトカインまたは免疫学的薬剤をコードするように設計されてよい。
いくつかの実施形態では、転写因子系は、目的のヒト天然または野生型タンパク質の発現に起因して、当該技術分野における他の生体回路またはスイッチよりも免疫原性が有意に低い場合がある。
様々な自己免疫疾患及び自己免疫関連疾患が、本開示の転写因子系を含む医薬組成物で処置されてよい。本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」という用語は、身体がその自身の組織を攻撃する抗体を産生する疾患を指す。
自己免疫疾患としては、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経性神経障害、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年型糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性連鎖球菌関連性精神神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚病ならびに白斑が挙げられるが、これらに限定されない。
様々な腎疾患が、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物で処置されてよい。
様々な心血管疾患が、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物で処置されてよい。
様々な抗体産生不全症が、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物で処置されてよい。
様々な神経疾患が、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物で処置されてよい。
様々な肺疾患が、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物で処置されてよい。
様々な骨疾患が、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物で処置されてよい。
様々な血液疾患が、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物で処置されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物は、脳脊髄（ＣＳＦ）タンパク質を含む中枢神経系におけるタンパク質の調節または改変または開発に使用されてよい。
いくつかの例では、本開示の転写因子系の１つ以上の構成要素を含む医薬組成物は、調節可能なＥＲＴ（酵素補充療法）生成物を中枢神経系に提供するために使用されてよい。多くのリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、ＣＮＳ症状、例えば、精神遅滞、発作、重度神経変性、行動異常、及び精神運動欠損などを伴う。ＬＳＤのＥＲＴは、現代の分子医学における成功実話の１つである。ＥＲＴの適用の成功は、リソソームタンパク質（例えば、酵素）の制御及びＣＮＳ細胞への送達に依存する。
遺伝子編集
いくつかの実施形態では、転写因子系は、遺伝子編集及び遺伝子治療のために特定のＤＮＡ配列を選択的に標的とするためのＤＮＡ結合ドメインを含有するヌクレアーゼを含むペイロードを含む。いくつかの実施形態では、転写因子系は、系内の転写因子によって調節されるペイロードとしてジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、多数のモデル生物及び細胞型で急速に開発及び実施されている新しいゲノム編集系であり、ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮなどの他のゲノム編集技術に取って代わる。ＣＲＩＳＰＲは、細菌及び古細菌ゲノム中に存在する配列モチーフであり、短い（約２４～４８ヌクレオチド）ダイレクトリピートで構成され、それらは同様のサイズの特有のスペーサーによって分離されている（Ｇｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８，１７２（２００７））。それらは一般に、ＣＲＩＳＰＲの維持及び機能に必要なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質コード遺伝子のセットに隣接している（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５，１７０９（２００７）、Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１，９６０（２００８）、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １，ｅ６０（２００５））。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、侵入遺伝因子（例えば、ウイルス、ファージ及びプラスミド）に対する適応免疫を提供する（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３２７：１６７－１７０、Ｂｈａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１１，４５：２７３－２９７、及びＢｒｒａｎｇｏｕ Ｒ，ＲＮＡ，２０１３，４：２６７－２７８）。細菌では３つの異なる種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が分類されていて、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が最も研究されている。細菌のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系では、トランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）／Ｃａｓ９の存在下でｐｒｅ－リピート－スペーサー転写物（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）からプロセシングされた小さなＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体と二本鎖を形成し得る。成熟した複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二本鎖のスペーサー配列に相補的な標的二本鎖ＤＮＡ配列に動員され、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって標的ＤＮＡを切断する（Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６８：６７－７１、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７：８１６－８２１、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０９：Ｅ２５７９－２５８６、及びＨａｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３２９：１３５５－１３５８）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ系におけるｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体による標的認識及び切断は、標的配列（「プロトスペーサー」配列とも呼ばれる）に相補的なｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二本鎖の配列を必要とするだけでなく、標的ポリヌクレオチドのプロトスペーサー配列の３’末端に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も必要とする。ＰＡＭモチーフは、異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系では変動し得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、遺伝子編集で使用するために開発及び改変されていて、真核細胞でも核酸配列を編集するのに非常に効果的で特異的な技術であることが分かっている。
しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（例えば、ガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ）の効果及び活性を制御することは困難であり、多くの場合に問題がある可能性がある。
本開示の転写因子系及び／またはそれらの構成要素のいずれも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を、その利用を最適化するために制御または調節することに利用されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の調節可能な転写因子発現構築物のペイロードは、Ｃａｓ９酵素の代替アイソフォームまたはオルソログを含んでよい。
最も一般的に使用されるＣａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、ＲｕｖＣドメインはＤ１０Ａ変異によって不活性化され得、ＨＮＨドメインはＨ８４０Ａ変異によって不活性化され得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９に加えて、他のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）もプログラム可能なゲノム編集に使用されてよい。Ｃａｓ９配列は、６００を超える細菌株で同定されている。Ｃａｓ９ファミリーはアミノ酸配列及びタンパク質サイズの高度な多様性を示すが、全てのＣａｓ９タンパク質が、中央のＨＮＨヌクレアーゼドメイン及び分割ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ Ｈドメインを有する共通の構造を共有している。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、分割Ｃａｓ－９であってよい（Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｆｅｂ；３３（２）：１３９－４２、その内容全体が参照によって組み込まれる）。
Ｃａｓ９オルソログに加えて、不活性ｄＣａｓ９及び異なる機能を有するエフェクタードメインの融合タンパク質などの他のＣａｓ９バリアントが、遺伝子調節のプラットフォームとして機能する場合がある。前述の酵素のいずれも、本開示において有用であってよい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの調節可能な転写因子発現構築物は、国際公開第ＷＯ２０１６１０６２４４号及びＧａｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄＣａｓ９ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１６ Ｄｅｃ；１３（１２）：１０４３－１０４９（その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に教示される方法のいずれによっても生成されてよい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系はまた、遺伝子発現を調節するために利用されてよく、これはその遺伝子編集の有用性と組み合わされてよい。いくつかの実施形態では、本開示の調節可能な転写因子系のペイロードは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系と関連するＣＲＩＳＰＲ関連転写活性化因子、例えば、ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）を含んでよい。
追加の用途及び使用
幹細胞用途
本開示の転写因子系及び／またはそれらの構成要素は、細胞の制御されたリプログラミング、幹細胞生着またはそのようなリプログラミング因子の制御された、もしくは調節可能な発現が有用である他の用途に利用されてよい。
本開示の調節可能な転写因子発現構築物は、幹細胞または誘導幹細胞を含む細胞のリプログラミングに使用されてよい。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の誘導は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ（Ｃｅｌｌ，２００６．１２６（４）：６６３－７６、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）によって、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２、さもなければＫＭＯＳと総称されるこれらを発現するためにウイルスベクターを使用して最初に達成された。
切除可能なレンチウイルス及びトランスポゾンベクター、一過性プラスミド、エピソーム及びアデノウイルスベクターの反復適用も、ｉＰＳＣを誘導する試みに使用されている（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．－Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００９．２７（５）：１０４２－１０４９、Ｋａｊｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００９．４５８（７２３９）：７７１－５、Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８．３２２（５９０３）：９４９－５３、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８．３２２（５９０３）：９４５－９、Ｗｏｌｔｊｅｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００９、Ｙｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９：１１７２４８２、Ｆｕｓａｋｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｊｐｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ，２００９．８５（８）：３４８－６２、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
ヒトｉＰＳＣを生成するＤＮＡを用いない方法も、細胞膜透過性ペプチド部分を組み込んだ組換えタンパク質での連続タンパク質形質導入を使用して（Ｋｉｍ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００９．４（６）：４７２－４７６、Ｚｈｏｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００９．４（５）：３８１－４、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、及びセンダイウイルスを使用した感染性導入遺伝子送達を使用して（Ｆｕｓａｋｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｊｐｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ，２００９．８５（８）：ｐ．３４８－６２、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）得られている。
本開示の調節可能な転写因子発現構築物は、ＯＣＴ４などのＯＣＴ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５及びＳＯＸ１８などのＳＯＸ、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４及びＫＬＦ５などのＫＬＦ、ｃ－ＭＹＣ及びｎ－ＭＹＣなどのＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴならびにＬＩＮ２８、ならびに細胞のリプログラミングを支援するそれらのバリアントを含むが、これらに限定されない遺伝子のいずれかを含むペイロードを含んでよい。そのようなリプログラミング因子の配列は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４５６０号で教示され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示の調節可能な転写因子発現構築物は、幹細胞動員に寄与する因子のいずれかを含むペイロードを含んでよい。自己幹細胞療法では、移植用の幹細胞の供給源は、骨髄、末梢血単核細胞及び臍帯血を含む場合がある。幹細胞は刺激され、それらの供給源（例えば、骨髄）を出て血流へと流れる。そのため、将来の再注入を目的とした収集のために十分な幹細胞が利用可能である。サイトカイン戦略の１つまたは組合せが幹細胞を動員するために使用されてよく、Ｇ－ＣＳＦ（フィルグラスチム）、ＧＭ－ＣＳＦ、及びサイトカインに先行する化学療法（化学動員）を含むが、これらに限定されない。
代謝ペプチド及びホルモン
いくつかの実施形態では、本開示の転写因子系及び／またはそれらの構成要素のいずれも、天然または合成ペプチドを制御するために使用されてよい。天然に存在するペプチドとしては、ペプチドホルモン、ナトリウム利尿ペプチド、食品ペプチド、ならびに誘導体及び前駆体が挙げられてよいが、これらに限定されない。
本開示の転写因子系及び／またはそれらの構成要素のいずれも、ホルモンまたは他のペプチド薬のパルス放出に利用されてもよい。
酵素補充療法（ＥＲＴ）
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、患者の酵素を置き換える医学的処置である。ＥＲＴは、酵素欠損によって引き起こされる多くの障害の根本的な代謝障害に対処する治療的介入を提供する。そのような障害としては、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、先天性グリコシル化異常症、及び細胞質内の酵素活性の欠如または減少を特徴とする代謝障害が挙げられるが、これらに限定されない。
凝固
凝固障害は、多くの場合に出血及び／または血栓症を引き起こす。最もよく知られている凝固因子障害は、血友病である。３つの主な形態は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠乏症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症または「クリスマス病」）及び血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠乏症、軽度の出血傾向）である。凝固因子の欠損によって引き起こされる他の障害としては、フォンヴィルブランド病（フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）の欠損によって引き起こされる）、ベルナール・スーリエ症候群（ｖＷＦの受容体であるＧＰＩｂの欠損または欠乏によって引き起こされる）、血栓性静脈炎（第ＸＩＩ因子の変異によって引き起こされる）、先天性無フィブリノゲン血症、家族性腎アミロイドーシス（第Ｉ因子の変異によって引き起こされる）、先天性プロコンバーチン／第ＶＩＩ因子欠乏症、血栓性素因（第ＩＩ因子欠乏症によって引き起こされる）、先天性第Ｘ因子欠乏症、先天性第ＸＩＩＩａ／ｂ因子欠乏症、プレカリクレイン／フレッチャー因子欠乏症、キニノーゲン欠乏症、フィブロネクチン沈着を伴う糸球体症、ヘパリンコファクターＩＩ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、プロテインＺ欠乏症、アンチトロンビンＩＩＩ欠乏症、プラスミノーゲン欠乏症、Ｉ型（木質性結膜炎）、抗プラスミン欠乏症、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター－１欠乏症、及びケベック血小板障害も挙げられるが、これらに限定されない。
凝固因子置換のための遺伝子治療は、凝固因子欠乏によって引き起こされる障害の医学的処置である。本開示においては、本開示の調節可能な転写因子発現構築物及び／またはそれらの構成要素のいずれも、遺伝子治療に使用される凝固因子を制御するために利用されてもよい。いくつかの例では、凝固因子は、第Ｉ因子（フィブリノゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＩＩＩ因子（組織因子）、第ＩＶ因子、第Ｖ因子（プロアクセレリン）、第ＶＩ因子、第ＶＩＩ因子（安定因子）、第ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子Ａ）、第ＩＸ因子（抗血友病因子Ｂ）、第Ｘ因子（スチュアート・プロワー因子）、第ＸＩ因子（血漿トロンボプラスチン前駆物質）、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォンヴィルブランド因子、プレカリクレイン（フレッチャー因子）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１（ＰＡＩ１）、及びプラスミノーゲン活性化因子インヒビター２（ＰＡＩ２）から選択されてよい。
一実施形態では、凝固因子は、血友病の遺伝子治療のための第ＶＩＩＩ因子であり、野生型第ＶＩＩＩ因子、操作された第ＶＩＩＩ因子、活性化第ｆＶＩＩＩ因子（ｆＶＩＩＩａ）、または等価物を含む。例示的な操作された第ＶＩＩＩ因子としては、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｎｄｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０１１，１：Ｓ１－００６、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）によって述べられているものが挙げられてよい。
別の実施形態では、凝固因子は、血友病Ｂの遺伝子治療のための第ＩＸ因子であってよい。第ＩＸ因子は、米国特許第７，５７５，８９７号、同第７，７００，７３４号、同第７，８８８，０６７号、及び同第８，１６８，４２５号、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１６／０７５４７３号に開示されるような組換え第ＩＸ因子であってよく、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の調節可能な転写因子発現構築物及び／またはそれらの構成要素のいずれも、タンパク質のプロセシング及び改変において役割を果たす因子のいずれかを含んでよい。タンパク質の翻訳後修飾としては、酵素による疎水基の付加（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、グリピエーション、及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー）、機能増強のための補因子の付着（例えば、リポイル化、フラビン、ホスホパンテテイニル化、及びヘムＣ）、小さな化学基の付加（例えば、アシル化、ホルミル化、アルキル化、リン酸化、メチル化、アルギニル化、ポリグルタミル化、ポリグリシル化、ブチリル化、グリコシル化、プロピオニル化、Ｓ－グルタチオン化、Ｓ－ニトロシル化、Ｓ－スルフェニル化、スクシニル化、硫酸化、及びアセチル化）、他のタンパク質及び／またはペプチドの連結、例えば、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ｎｅｄｄ化、及びｐｕｐ化など、アミノ酸の化学修飾、ならびに構造変化を挙げてよいが、これらに限定されない。
肝臓標的化
肝臓はタンパク質を産生する重要な器官であり、血液凝固及び多数の代謝機能を伴う。様々な疾患が肝臓に影響を与える可能性があり、疾患処置のために肝臓を標的とすることは、特に肝臓標的遺伝子治療において有望なアプローチである。いくつかの実施形態では、本開示の調節可能な転写因子発現構築物及び／またはそれらの構成要素のいずれも、肝臓標的遺伝子治療及び遺伝子導入を制御するために利用されてよい。
肝臓を標的とし、制御のために本発明の調節可能な転写因子発現構築物へと構築され得るタンパク質としては、肝臓癌、例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維層板ＨＣＣ、胆管癌、血管肉腫及び続発性肝臓癌など、欠陥遺伝子によって引き起こされる遺伝性障害、例えば、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、チロシン血症、アルファ１アンチトリプシン欠損症、糖原病など、酵素欠損による代謝障害、例えば、ジルベール症候群、リソソーム酸性リパーゼ欠損症（ＬＡＬＤ）及びゴーシェ病など、自己免疫性肝炎、脂肪肝疾患、ならびにウイルス性肝炎（Ａ、Ｂ及びＣ）のタンパク質が挙げられてよい。いくつかの例では、本発明の調節可能な転写因子発現構築物は、肝細胞癌（ＨＣＣ）に対してＩＬ１２を、糖尿病性神経障害に対してＩＬ１０を誘導するために使用されてよい。
いくつかの実施形態では、本発明の調節可能な転写因子発現構築物は、遺伝子治療を目的として、肝臓特異的遺伝子産物を制御するために使用されてよい。
いくつかの実施形態では、本発明の調節可能な転写因子発現構築物は、（例えば、血液中に）分泌される肝臓タンパク質を制御するために使用されてよい。
治療薬を作製するためのツール及び薬剤
本開示において提供されるのは、治療薬、例えば、これらに限定されないが、必要とする対象の腫瘍体積または負荷を減少させるための免疫療法薬などの生成に使用されてよいツール及び薬剤である。非常に多くの変数が治療剤の生成に関与し、例えば、ペイロードの構造、細胞型、遺伝子導入の方法、エクスビボ増殖の方法及び時間、プレコンディショニングならびに対象の腫瘍負荷の量及び種類などである。そのようなパラメータは、本明細書に記載されるツール及び薬剤を使用して最適化されてよい。
細胞株
本開示は、本開示の組成物で遺伝子改変されている哺乳動物細胞を提供する。好適な哺乳動物細胞としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。好適な哺乳動物細胞株としては、ヒト胎児腎臓細胞株２９３、線維芽細胞株ＮＩＨ ３Ｔ３、ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ－３、不死化Ｔ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＳｕｐＴ１細胞）、リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞、ＮＡＬＭ－６細胞、Ｋ５６２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＣ１２細胞、ＨＬ－６０細胞、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、ＮＫ９６２、及びＹＴＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、細胞は不死化細胞株ではなく、代わりに個体から得られた細胞であり、これは本明細書では初代細胞と称される。例えば、細胞は個体から得られたＴリンパ球である。他の例としては、個体から得られた細胞傷害性細胞、幹細胞、末梢血単核細胞または前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞アッセイ
いくつかの実施形態では、免疫療法剤としての本開示の組成物の有効性は、細胞アッセイを使用して評価されてよい。本開示の組成物の発現及び／または同一性のレベルは、タンパク質の同定及び／またはタンパク質レベルの定量化を目的とした、当該技術分野において既知の任意の方法に従って決定されてよい。いくつかの実施形態では、そのような方法は、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、及びイムノアッセイを含んでよい。
本明細書で提供されるのは、本開示の調節可能な転写因子発現構築物及び本開示の組成物でトランスフェクトまたは形質導入した細胞を機能的に特徴付ける方法である。いくつかの実施形態では、機能的特徴付けは、初代免疫細胞または不死化免疫細胞株において実施され、細胞表面マーカーの発現によって決定されてよい。Ｔ細胞の細胞表面マーカーの例としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＩＦＮガンマが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞疲弊のマーカーとしては、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ３９、及びＬＡＧ３が挙げられる。抗原提示細胞の細胞表面マーカーの例としては、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＦＮγ受容体及びＩＬ２受容体、ＩＣＡＭ－１及び／またはＦｃγ受容体が挙げられるが、これらに限定されない。樹状細胞の細胞表面マーカーの例としては、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７－２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ－４４、ＣＭＲＦ－５６、ＤＣＩＲ及び／またはデクチン－１などが挙げられるが、これらに限定されず、一方で、いくつかの場合には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、及び／またはＣＤ５７の欠如も有する。ＮＫ細胞の細胞表面マーカーの例としては、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ６９、ＣＣＲ５、ホスホＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ホスホＥＲＫ、ホスホｐ３８／ＭＡＰＫ、ホスホＡＫＴ、ホスホＳＴＡＴ３、グラニュライシン、グランザイムＢ、グランザイムＫ、ＩＬ１０、ＩＬ２２、ＩＦＮｇ、ＬＡＰ、パーフォリン、及びＴＮＦａが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｌｏｎｇ Ｈ Ａ ｅｔ ａｌ．によって開示される戦略のいずれも、疲弊を防止するために利用されてよい（Ｌｏｎｇ Ａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１，５８１－５９０、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞代謝経路は、疲弊に対するＴ細胞の感受性を減少させるように改変されてよい。代謝経路としては、解糖、尿素回路、クエン酸回路、ベータ酸化、脂肪酸生合成、ペントースリン酸経路、ヌクレオチド生合成、及びグリコーゲン代謝経路を挙げてよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、解糖の速度を減少させるペイロードが、Ｔ細胞疲弊を制限または防止するために利用されてよい（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３，１（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｐ２１、その内容全体が参照によって組み込まれる）。一実施形態では、本開示のＴ細胞は、２－デオキシグルコース、及びラパマイシンなどの解糖の阻害剤と組み合わせて使用されてよい。
いくつかの実施形態では、免疫療法に有用な、本開示の調節可能な転写因子発現構築物は、Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体アルファ遺伝子座定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座の転写制御下に置かれてよい。Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ＴＲＡＣ遺伝子座からのＣＡＲの発現が、過剰なＴ細胞活性化によって引き起こされるＴ細胞疲弊及びＴ細胞の分化の加速を防止することを示している（Ｅｙｑｕｅｍ Ｊ．ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ．５４３（７６４３）：１１３－１１７、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、Ｔ細胞疲弊と関連するＴ細胞表面マーカーを標的とする抗体または断片を含んでよい。ペイロードとして使用されてよいＴ細胞疲弊と関連するＴ細胞表面マーカーとしては、ＣＴＬＡ－１、ＰＤ－１、ＴＧＩＴ、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、及びＣＤ９６が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本開示のペイロードは、ＣＤ２７６ ＣＡＲ（ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、及びＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを有する）であってよく、これは早期Ｔ細胞疲弊と関連するマーカーの上方制御を示さない（国際特許公開第ＷＯ２０１７０４４６９９号を参照し、その内容全体が参照によって組み込まれる）。
細胞
本開示においては、本開示のコードされた転写因子及びＤＲＤリガンドの制御下で少なくとも１つの目的のタンパク質またはペイロードを発現するように遺伝子改変された細胞が提供される。本開示の細胞としては、免疫細胞、幹細胞及び腫瘍細胞を挙げてよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、エフェクター免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｆｏｘｐ３＋細胞）など、メモリーＴ細胞、例えば、Ｔメモリー幹細胞、セントラルメモリーＴ細胞、及びエフェクターメモリーＴ細胞など、最終分化エフェクターＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ならびに樹状細胞（ＤＣ）、エフェクター機能を誘発し得る他の免疫細胞、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない免疫細胞である。Ｔ細胞は、Ｔαβ細胞及びＴγδ細胞の場合がある。いくつかの実施形態では、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び神経幹細胞に由来してよい。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、疲弊した内因性Ｔ細胞受容体の場合がある（米国特許第９，２７３，２８３号、同第９，１８１，５２７号、及び同第９，０２８，８１２号を参照し、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、特定の個別の対象に関して自己、同種、同系、または異種であってよい。
いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞であってよい。本開示の細胞は、初代細胞または不死化細胞株であってよい。
操作された免疫細胞は、以下を含む核酸分子を細胞中に導入することを含む方法によって達成され得る：
ａ．転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインのうち少なくとも１つをコードする第１核酸配列、ならびに
ｂ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列。いくつかの実施形態では、細胞はまた、転写因子ポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される目的のタンパク質をコードする第３核酸配列を挿入するように遺伝子改変されてよい。いくつかの実施形態では、第３核酸配列は、第１及び第２核酸配列と同じ核酸分子上に存在する。
あるいは、第３核酸配列は、第１及び第２核酸配列とは異なる核酸分子上に存在する。本明細書で使用される場合、第１核酸配列及び第２核酸配列は、１つのベクター上で第１及び第２ポリヌクレオチドを、または別々のベクター中で各ポリヌクレオチドを表し得る。
ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、ガンマ－レトロウイルスベクター、組換えＡＡＶ、アデノウイルスベクター及び腫瘍溶解性ウイルスベクターなどであってよい。他の態様では、非ウイルスベクター、例えば、ナノ粒子及びリポソームもまた使用されてよい。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、安定化リガンドを使用して調節可能な本開示の少なくとも１つの免疫療法剤を発現するように遺伝子改変される。いくつかの例では、同じ調節可能な転写因子発現構築物中で構築される２つ、３つまたはそれを超える免疫療法剤が細胞中に導入される。他の例では、２つ、３つ、またはそれを超える調節可能な転写因子発現構築物が細胞中に導入されてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、本明細書で教示される抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＮＫ細胞であってよい。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然リンパ細胞ファミリーのメンバーであり、ヒトではＣＤ３（Ｔ細胞共受容体）の不存在下における表現型マーカーＣＤ５６（神経細胞接着分子）の発現を特徴とする。ＮＫ細胞は、事前の抗原プライミングを行う必要なく細胞傷害性の攻撃を媒介し、がん悪性腫瘍及びウイルス感染を含む疾患に対して防御の第一線を形成する自然免疫系の強力なエフェクター細胞である。
いくつかの前臨床及び臨床試験は、ＮＫ細胞の養子移入が急性骨髄性白血病などのがんに対する有望な処置アプローチであることを実証している（Ｒｕｇｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ；２００２，２９５：２０９７－２１００、及びＧｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，３：１４４５－１４５９）。ＤＡＰ１２ベースの活性化ＣＡＲなどのＣＡＲを発現するＮＫ細胞の養子移入によって、腫瘍細胞の根絶の改善が明らかとなった（Ｔｏｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４：３２０１－３２１２）。ＣＳ－１特異的ＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞は、多発性骨髄腫において細胞溶解及びインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）産生の増強も示した（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１４，２８（４）：９１７－９２７）。
ＮＫ細胞活性化は、活性化及び阻害機能を有する一連の受容体によって特徴付けられる。ＮＫ細胞上の重要な活性化受容体としては、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｄ（Ｃ型レクチン様受容体）、ならびに天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６が挙げられ、それらは腫瘍細胞またはウイルス感染細胞上のリガンドを認識する。ＮＫ細胞阻害は、多型阻害性キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）とそれらの同族のヒト－白血球－抗原（ＨＬＡ）リガンドとの、ＨＬＡ分子のアルファ－１ヘリックスを介した相互作用によって本質的に媒介される。活性化受容体及び阻害性受容体から生成されるシグナル間のバランスによって、主に即時の細胞傷害活性化が決定される。
ＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されるか、またはヒト胚性幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する場合がある。ＰＢＭＣから単離される初代ＮＫ細胞は、養子免疫療法のためにさらに増殖されてよい。ＮＫ細胞の増殖に有用な戦略及びプロトコールは、インターロイキン２（ＩＬ２）刺激及び自己フィーダー細胞の使用、または遺伝子改変同種フィーダー細胞の使用を含んでよい。いくつかの態様では、ＮＫ細胞は、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ２、４１ＢＢＬ、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＭＩＣＡ、２Ｂ４、ＬＦＡ－１、及びＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２を含むリガンドを刺激することを組み合わせて選択的に増殖され得る（例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１５０１９０４７１号）。
定義
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術に関する全ての用語、表記及び他の科学用語または専門用語は、本発明が関連する当業者によって一般に理解される意味を有することを意図する。いくつかの場合には、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするために、及び／または迅速な参照及び理解のために本明細書で定義され、本明細書におけるそのような定義の包含が、必ずしも当該技術分野において一般に理解されるものとの実質的な差を意味すると解釈されるべきではない。分子生物学用語及び／または方法及び／またはプロトコールの一般に理解される定義は、Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００６）Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ－１０：０８７９６９７７１７、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＩＳＢＮ－１０：０４７１２５０９２９に見出され得る。
適宜、市販のキット及び／または試薬の使用を伴う手順は一般に、別段の注記がない限り、製造業者の指針及び／またはプロトコール及び／またはパラメータに従って実施される。
「親和性」は結合の強度を指し、結合親和性の増加はＫｄの低下と相関する。
「養子細胞療法」または「養子細胞移入」という用語は、本明細書で使用される場合、患者への細胞の移入を伴う細胞療法を指し、細胞が患者、または別の個体に由来している場合があり、患者に戻して移入する前に操作（改変）される。治療用細胞は免疫系に由来し、例えば、エフェクター免疫細胞：ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ならびに切除した腫瘍に由来するＢ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの場合がある。最も一般的に移入される細胞は、エクスビボ増殖または操作後の自己抗腫瘍Ｔ細胞である。例えば、自己末梢血リンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることによって特定の腫瘍抗原を認識するように遺伝子操作され得る。
本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、生物学的化合物、医薬化合物、または化学化合物を指す。非限定的な例としては、単純または複合有機または無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体断片、受容体、及び可溶性因子が挙げられる。
「アゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、受容体と組み合わせて細胞応答をもたらし得る化合物を指す。アゴニストは、受容体に直接結合するリガンドの場合がある。あるいは、アゴニストは、例えば、（ａ）受容体に直接結合する別の分子と複合体を形成することによって、または（ｂ）さもなければ、他の化合物が受容体に直接結合するように別の化合物の修飾をもたらすことによって間接的に受容体と組み合わされる場合がある。アゴニストは、特定の受容体または受容体ファミリーのアゴニスト、例えば、共刺激受容体のアゴニストと称されてよい。
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、それが結合する標的（複数可）の生物活性を阻害または減少させる任意の薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、目的の１つ以上の値に適用されるような「およそ」または「約」という用語は、規定の参照値と類似している値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、規定の参照値から２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、またはそれ未満の値内にいずれの方向にも（上回るか、または下回る）含まれる値の範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「と関連」、「複合化」、「連結」、「付加」、及び「つなぐ」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、部分が、直接または連結剤として機能する１つ以上の追加の部分を介するいずれかで、互いに物理的に関連または結合され、構造が使用される条件下、例えば、生理学的条件下で部分が物理的に関連したままであるように十分に安定した構造を形成することを意味する。「会合」は、厳密には直接共有化学結合を介する必要はない。それはまた、「関連する」実体が物理的に関連したままとなるように十分に安定したイオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーションベースの結合性を示唆している場合もある。
「自己」という用語は、本明細書で使用される場合、それが後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合性相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成要素が、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸塩残基との接触）。そのような相互作用は一般に、１０－６Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。
「結合タンパク質」は、別の分子に結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合し得る（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成するために）、及び／またはそれは異なるタンパク質（複数可）の１つ以上の分子に結合し得る。結合タンパク質は、２種以上の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性及びタンパク質結合活性を有する。
「カセット」、「発現カセット」及び「遺伝子発現カセット」という用語は、特定の部位で（例えば、制限部位または相同組換えによって）核酸またはポリヌクレオチド中に挿入され得るＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセット及び制限部位は、転写及び翻訳のための適切なリーディングフレーム内へのカセットの挿入を確実にするように設計される。カセット、発現カセット、及び遺伝子発現カセットはまた、宿主細胞において目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現増強を可能にするエレメントを含む場合がある。それらのエレメントとしては、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、終結配列、ポリアデニル化配列などを挙げてよいが、これらに限定されない。
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破損を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方とも可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、標的二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでＲＮＡスプライシングされて（コード配列がイントロンを含有する場合）、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞内の転写及び翻訳調節配列の「制御下」にある。
「構築物」及び「核酸構築物」という用語は交換可能に使用され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のうち１つ以上をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを指す。「構築物」は、任意の供給源に由来し、ゲノム組込みまたは自律複製が可能な任意の組換え核酸分子、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製核酸分子、ファージ、または直鎖もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ核酸分子などであってよい。構築物は、例えば、３’－非翻訳領域（３’ＵＴＲ）からの追加の調節核酸エレメントを含んでよいが、これに限定されない。構築物は、翻訳開始に重要な役割を果たすことができ、発現構築物の遺伝子構成要素でもあり得る、ｍＲＮＡ核酸分子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み得るが、これに限定されない。それらの追加の上流及び下流の調節核酸エレメントは、構築物上に存在する他のエレメントに関して天然または異種である供給源に由来する場合がある。
「サイトカイン」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫系の機能に影響を及ぼしてそれを制御し得る多くの細胞型によって産生される、多面発現機能を有する小さな可溶性因子のファミリーを指す。
「送達」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードを送達する行為または方法を指す。「送達剤」は、少なくとも部分的に、細胞、対象または他の生物系への１つ以上の物質（本開示の化合物及び／または組成物を含むが、これらに限定されない）の送達を容易にする任意の薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、「に由来する」という語句は、規定の親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは規定の親配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）に由来し、親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは親配列の１つ以上の構造特性及び／または機能特性との類似性を保持するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。親分子は、ポリペプチドまたは核酸分子の場合がある。例えば、親分子は、天然タンパク質（天然アミノ酸配列を含む）または野生型タンパク質であってよく、「親タンパク質」と称されてよい。別の例として、親分子は、天然核酸配列または野生型タンパク質をコードする配列を含む核酸分子であってよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、（ｉ）全長野生型親分子もしくは配列、または（ｉｉ）全長野生型親分子もしくは配列の領域もしくはドメインのいずれかに由来し、（ｉ）全長野生型親分子もしくは配列、または（ｉｉ）それぞれのその領域もしくはドメインのいずれかの構造特性及び／または機能特性を保持する。構造特性としては、アミノ酸配列、核酸配列、あるいはタンパク質構造（例えば、二次タンパク質構造、三次タンパク質構造、及び／または四次タンパク質構造など）が挙げられる。機能特性としては、触媒活性、結合能、及び／または細胞内局在化などの生物活性が挙げられる。非限定的な例として、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、それが親分子または配列の全長と比較して、親核酸配列またはアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性、好ましくは少なくとも約７５％または８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する場合に親分子または配列との類似性を保持する。別の非限定的な例として、ポリペプチドは、それが親アミノ酸配列と１００％の同一性を共有するアミノ酸の領域を含む場合に親分子または配列との類似性を保持し、領域は、１０～１，０００アミノ酸長（例えば、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、及び９００アミノ酸超または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、及び１，０００アミノ酸）の範囲である。別の非限定的な例として、ポリペプチドは、それが親アミノ酸配列と比較した場合、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸変異を含む場合に親分子またはアミノ酸配列との類似性を保持する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、それが親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは親配列と比較した場合、実質的に同じ生物活性を有する場合に親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは親配列との類似性を保持すると見なされる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは親配列と比較した場合、少なくとも１つの生物活性の重複が存在する場合に親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは親配列との類似性を保持すると見なされる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、それが親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは親配列と比較した場合、１つ以上の生物活性の改善または最適化を有する場合に親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは親配列との類似性を保持すると見なされる。例えば、ＤＲＤは、天然に存在するタンパク質のドメインまたは領域に由来してよく、ＤＲＤ機能を最適化するために本明細書で教示される方法のいずれにおいても改変される。いくつかの実施形態では、生物活性は、親分子と比較した場合に別の活性を減少または排除しながら、ある特定の活性を保持または増強することなどによって、特定の目的のために最適化されてよい。いくつかの実施形態では、規定の親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは規定の親配列に由来するＤＲＤは、規定の親分子またはその領域もしくはドメイン、あるいは規定の親配列のバリアントである。例えば、いくつかの実施形態では、ヒト炭酸脱水酵素２（ｈＣＡ２）に由来するＤＲＤは、ｈＣＡ２のバリアントである。
本明細書で使用される場合、「不安定」、「不安定化」、「不安定化領域」または「不安定化ドメイン」という用語は、同じ領域または分子の出発形態、参照形態、野生型または天然型よりも安定性が低い領域または分子を意味する。
ＤＮＡの「コード配列」または「コード領域」は、ポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡ配列を指し、好適な調節配列の制御下に置かれると、細胞内、エクスビボ、インビトロまたはインビボでポリペプチドへと転写及び翻訳され得る。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その配列内、またはその下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が挙げられてよい。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物配列、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。コード配列が真核細胞での発現を目的とする場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常、コード配列の３’側に位置することになる。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、下流のヌクレオチド配列は一般に、転写の開始点に続く配列に関連する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、上流のヌクレオチド配列は一般に、コード配列または転写の開始点の５’側に位置する配列に関連する。例えば、プロモーターの多くは転写の開始部位の上流に位置する。
本明細書で使用される場合、本開示の実施形態は、それらが開始点、野生型または天然分子とは異なる、構造的または化学的かにかかわらず、特徴または特性を有するように設計される場合に「操作されている」。
「外来」分子は、通常は細胞中に存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞中に導入され得る分子である。「通常は細胞中に存在する」かは、細胞の特定の発達段階及び環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に対して外来分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外来分子である。外来分子は、例えば、機能異常の内因性分子の機能型または正常に機能する内因性分子の機能異常型を含み得る。
外来分子は、とりわけ、小分子、例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成される小分子など、もしくは高分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の改変誘導体など、または上記分子のうち１つ以上を含む任意の複合体であり得る。核酸はＤＮＡ及びＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖、分岐または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸は、二重鎖を形成できる核酸に加えて三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラート、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース及びヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
外来分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外来タンパク質または核酸であり得る。例えば、外来核酸は、細胞中に導入される感染ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞内には通常存在しない染色体を含み得る。細胞への外来分子の導入方法は当業者に既知であり、これらとしては、脂質媒介導入（すなわち、中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介導入ならびにウイルスベクター媒介導入が挙げられるが、これらに限定されない。外来分子はまた、内因性分子と同じ型の分子であるが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞株中に導入されてよい。
外来核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコード配列もしくは非コード配列に加えて１つ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外来核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を生成する場合がある。
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞内に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。追加の内因性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子及び酵素が挙げられ得る。
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミド及びある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
「真核」細胞としては、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞及びヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうち１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写によって）、（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによって）、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳、（４）ポリペプチドまたはタンパク質の折り畳み、ならびに（５）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
発現ベクター、発現構築物、プラスミド、または組換えＤＮＡ構築物は一般に、例えば、宿主細胞における特定の核酸の転写または翻訳を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いた、組換え手段または直接の化学合成によるものを含む、ヒトの介入によって生成される核酸を指すと理解される。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結されて転写される核酸を含み得る。
ポリヌクレオチド配列に適用されるような「断片」という用語は、参照核酸と比較して短縮された長さのヌクレオチド配列を指し、共通部分にわたって、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含む。本発明によるそのような核酸断片は、必要に応じて、それが構成要素であるより大きなポリヌクレオチド内に含まれてよい。そのような断片は、本発明による核酸の少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、またはそれを超える連続ヌクレオチドの範囲の長さであるオリゴヌクレオチドを含むか、または代わりにそれらからなる。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子よりも多い残基、少ない残基、もしくは同じ数の残基を有し得る、及び／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定する方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質機能を決定する方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定され得る。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価され得る。上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照のこと。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝的及び生化学的の両方の相補性によって決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５－２４６、米国特許第５，５８５，２４５号及びＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「機能」生体分子は、それが特徴付けられる特性及び／または活性を呈する構造を有し、その形態の生物学的実体である。
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結される分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１型の融合分子の例としては、融合タンパク質、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ及び／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）とヌクレアーゼ（切断）ドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼなど）との融合体ならびに融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２型の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合体、及び副溝結合剤と核酸との融合体が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞内での融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって得られることができ、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて融合タンパク質を生成する。ＲＮＡスプライシング、ポリペプチド切断及びポリペプチドライゲーションも、細胞内でのタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチドの送達方法は、本開示の他の箇所に提示される。
「遺伝子」は、転写のみによって生成される機能性分子（例えば、生物活性ＲＮＡ種）または転写及び翻訳によって生成される機能性分子（例えば、ポリペプチド）を含む機能性分子をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸を包含する。「遺伝子」はまた、コード配列前の調節配列（５’非コード配列）及びコード配列後の調節配列（３’非コード配列）を含む、特定のＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドを発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見られるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には共に見られない調節配列及び／またはコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見られるものとは異なる方法で配置されている調節配列及びコード配列を含む場合がある。キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来するコード配列及び／または異なる供給源に由来する調節配列を含む場合がある。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内においてその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子または「異種」遺伝子は、宿主生物には通常見られないが、遺伝子導入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物中に挿入される天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、ゲノム中に導入されている遺伝子である。例えば、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）遺伝子は、ＩＬ－１２タンパク質をコードする。ＩＬ－１２は、ジスルフィド結合を介して連結される３５ｋＤサブユニット（ｐ３５）及び４０ｋＤサブユニット（ｐ４０）のヘテロ二量体であり、完全に機能的なＩＬ－１２ｐ７０を形成する。ＩＬ－１２遺伝子は、ｐ３５及びｐ４０サブユニットの両方をコードする。
転写されたポリヌクレオチドは、機能性タンパク質などのポリペプチドをコードする配列を有し得、これは適切な調節領域の制御下に置かれると、コードされるポリペプチドに翻訳され得る。遺伝子は、いくつかの機能的に連結される断片、例えば、プロモーター、５’リーダー配列、コード配列及びポリアデニル化部位などの３’非翻訳配列に加えて、遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域などを、そのような調節配列がコード配列及び／または転写配列に隣接しているか否かを問わず、含む場合がある。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位など、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡもしくは任意の他のＲＮＡ型）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、及びグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含む。
キメラ遺伝子または組換え遺伝子は、通常では天然に見られない遺伝子、例えば、プロモーターが転写されたＤＮＡ領域の一部または全てと天然では関連しない遺伝子などである。「遺伝子の発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写されるプロセス及び／または機能性タンパク質に翻訳されるプロセスを指す。
「遺伝子送達」または「遺伝子導入」は、組換えまたは外来ＤＮＡを宿主細胞中に導入する方法を指す。移入したＤＮＡは、組み込まれないままであるか、または好ましくは宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。遺伝子送達は、例えば、ウイルスベクターを使用する形質導入によって、またはエレクトロポレーション、細胞衝撃などの既知の方法を使用する細胞の形質転換もしくはトランスフェクションによって行われ得る。
「ゲノム」という用語は、染色体に加えてミトコンドリア、葉緑体及びウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
「異種ＤＮＡ配列」、「外来ＤＮＡセグメント」または「異種核酸」という用語は各々、本明細書で使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来性の供給源に由来するか、または同じ供給源に由来する場合は、その元の形態から改変される配列を指す。したがって、宿主細胞内の異種遺伝子は、特定の宿主細胞において内因性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用によって改変されている遺伝子を含む。本用語はまた、天然に存在するＤＮＡ配列の天然には存在しない複数のコピーも含む。したがって、本用語は、細胞に対して外来性もしくは異種であるか、または細胞に対して相同であるが、要素が通常は見られない宿主細胞核酸内の位置にあるＤＮＡセグメントを指す。外来ＤＮＡセグメントは、外来ポリペプチドを生成するように発現される。「異種タンパク質」（「外来タンパク質」と交換可能に使用される）または「目的の異種タンパク質」は、それぞれ異種核酸によってコードされるタンパク質または目的のタンパク質である。「相同」ＤＮＡ配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関連するＤＮＡ配列である。
「異種ＤＮＡ」は、細胞内、または細胞の染色体部位には天然に位置しないＤＮＡを指す。異種ＤＮＡは、細胞に対して外来性の遺伝子を含む場合がある。
「免疫細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、骨髄中の造血幹細胞に由来する免疫系の任意の細胞を指し、これは２つの主要な系統、すなわち、骨髄前駆細胞（骨髄細胞、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球及び顆粒球などを生じる）ならびにリンパ系前駆細胞（リンパ細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などを生じる）を生じる。例示的な免疫系細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブＴ細胞、Ｔγδ細胞、Ｔαβ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び樹状細胞が挙げられる。マクロファージ及び樹状細胞は、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」と称されてよく、これらは、ペプチドと複合化されるＡＰＣの表面上にある主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体が、Ｔ細胞の表面上にあるＴＣＲと相互作用する場合にＴ細胞を活性化し得る特殊化した細胞である。
「免疫療法」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患に対する免疫系の反応性の誘導または回復による疾患の処置の種類を指す。
「免疫療法剤」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫療法に使用されてよい生物学的化合物、医薬化合物、または化学化合物を指す。
本発明の目的において「単離された」という用語は、その本来の環境（それが天然に存在する環境）から除去されている生体材料（細胞、核酸またはタンパク質）を指定する。例えば、植物または動物に自然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然に存在している隣接した核酸から分離される同じポリヌクレオチドは「単離された」と見なされる。
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節としては、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が挙げられ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、変化、不活性化、ランダム変異）は、発現を調節するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、親または参照分子または実体と比較した場合に分子または実体の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的を含む多くの方法で改変される場合がある。いくつかの実施形態では、本開示の化合物及び／または組成物は、非天然アミノ酸の導入によって改変される。
本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、変化及び／または変更を指す。いくつかの実施形態では、変異は、タンパク質（ペプチド及びポリペプチドを含む）及び／または核酸（ポリ核酸を含む）の変化及び／または変更であってよい。いくつかの実施形態では、変異は、タンパク質及び／または核酸配列の変化及び／または変更を含む。そのような変化及び／または変更は、１つ以上のアミノ酸（タンパク質及び／またはペプチドの場合）及び／またはヌクレオチド（核酸及び／またはポリ核酸、例えば、ポリヌクレオチドの場合）の付加、置換及び／または欠失を含んでよい。いくつかの実施形態では、変異は、アミノ酸及び／またはヌクレオチドの付加及び／または置換を含み、そのような付加及び／または置換は、１つ以上のアミノ酸及び／またはヌクレオチド残基を含んでよく、改変アミノ酸及び／またはヌクレオチドを含んでよい。変異、変化または変更から得られた構築物、分子または配列は、本明細書では変異体と称されてよい。
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン、「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン、「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、あるいはその任意のリン酸エステル類似体、例えば、ホスホロチオエート及びチオエステルなどを指し、一本鎖形態、または二本鎖ヘリックスのいずれかである。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ及びＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、任意の特定の三次形態に限定しない。したがって、本用語は、とりわけ、直鎖または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイルＤＮＡ及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について述べる際に、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを付与するという通常の慣習に従って本明細書に記載されてよい。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けているＤＮＡ分子である。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「機能的に連結された」という語句は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能的結合を指す。
核酸配列及びポリヌクレオチドを指す場合の「機能的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された」または「機能的に（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ）連結された」は、一方の機能が他方によって影響を受けるような核酸配列の会合を指すが、核酸配列は必ずしも互いに隣接または近接している必要はなく、それらの間に介在配列を有する場合がある。例えば、調節性ＤＮＡ配列は、調節性ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼす（すなわち、コード配列または機能性ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）ように２つの配列が位置する場合、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列「に機能的に連結される」またはそれ「と関連する」と言われる。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に機能的に連結され得る。転写調節配列は一般に、シスでコード配列と機能的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが隣接していなくとも、コード配列に機能的に連結されている転写調節配列であるか、またはプロモーターは、プロモーターが細胞内で目的の遺伝子の転写を制御または媒介する場合に目的の遺伝子に機能的に連結されている。
例えば、ＥＦ－１プロモーターまたはエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞または他の発現系におけるコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、転写配列に機能的に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接している、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、物理的に隣接する必要がないか、またはそれらが転写を増強するコード配列に非常に近接して位置する必要もない。
融合ポリペプチドを作製するための２つ以上のポリペプチドまたはそのドメイン間の会合では、「機能的に連結された」という用語は、融合タンパク質における１つのポリペプチドの状態または機能が、融合タンパク質の他のポリペプチドによって影響を受けることを意味する。例えば、ＤＲＤ及び転写因子またはそのドメインを含む融合タンパク質に関して、ＤＲＤ及び転写因子またはそのドメインは、リガンドによるＤＲＤの安定化が転写因子またはそのドメインの安定化をもたらす一方で、リガンドが存在しない場合のＤＲＤの不安定化が、転写因子またはそのドメインの不安定化をもたらす場合に機能的に連結されている。ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその特異的結合部位に結合でき、それゆえ活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することが可能となる場合に機能的に連結されている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本用語は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。いくつかの場合では、ポリペプチドは約５０アミノ酸よりも小さく、次いでポリペプチドは「ペプチド」と称されてもよい。ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の等価物、バリアント、ならびに前述の類似体が挙げられる。ポリペプチドは単一分子の場合があるか、または二量体、三量体もしくは四量体などの多分子複合体の場合がある。それらはまた、一本鎖または多重鎖ポリペプチドを含む場合があり、関連または連結される場合がある。本用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化などを含む。
「プラスミド」という用語は、宿主細胞の染色体の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝因子を指す。そのような因子は、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列で、直鎖、環状、またはスーパーコイルの場合がある。プラスミドは、選択された遺伝子産物のためにプロモーター断片及びＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と共に細胞中に導入できる特有の構造に結合または再結合されている多数のヌクレオチド配列を含む場合がある。本明細書に開示される出発プラスミドは、市販されているか、制限されることなく公的に入手可能であるか、または周知の公開された手順の日常的な適用によって入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。本発明に従って使用され得る多くのプラスミドならびに他のクローニング及び発現ベクターは周知であり、当業者には容易に入手可能である。さらに、当業者は、本発明での使用に適した任意の数の他のプラスミドを容易に構築することができる。本発明におけるそのようなプラスミドに加えて他のベクターの特性、構築及び使用は、本開示から当業者には容易に明らかとなる。
「プロモーター」及び「プロモーター配列」は交換可能に使用され、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来する場合があるか、または天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成される場合があるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含む場合もある。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発達段階において、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して遺伝子の発現を誘導する場合があると当業者によって理解される。プロモーターは、転写の開始部位の近くに必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントなどを含み得る。プロモーターは、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを場合により含み得、これは転写の開始部位から数千もの塩基対の距離に位置し得る。
細胞型の多くでほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。特定の細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と称される。特定の発生または細胞分化の段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と称される。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理後に誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導性プロモーター」または「調節可能なプロモーター」と称される。ほとんどの場合に調節配列の厳密な境界が完全に定義されているわけではないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があるとさらに認識される。プロモーター配列は通常、転写開始部位によってその３’末端に結合され、上流（５’方向）に伸長し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることによって簡便に定義される）に加えて、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。
遺伝子のプロモーター領域は、典型的には構造遺伝子の５’側にある転写調節エレメントを含む。遺伝子が活性化される場合、転写因子として知られるタンパク質が遺伝子のプロモーター領域に結合する。このアセンブリは、酵素が第２遺伝子セグメントをＤＮＡからＲＮＡに転写可能にすることで、「オンスイッチ」に類似する。ほとんどの場合、得られたＲＮＡ分子は、特定のタンパク質を合成するための鋳型として機能し、ＲＮＡ自体が最終生成物となることもある。プロモーター領域は、通常の細胞プロモーターまたは腫瘍プロモーター（ｏｎｃｏｐｒｏｍｏｔｅｒ）の場合がある。
疾患特異的プロモーターの例として、がんを処置するための有用なプロモーターとしては、貧血を処置するためのプロモーターを含む、がん遺伝子のプロモーターが挙げられる。がん遺伝子のクラスの例としては、成長因子、成長因子受容体、プロテインキナーゼ、プログラム細胞死調節因子及び転写因子が挙げられるが、これらに限定されない。
当該技術分野において既知の、本発明の治療用スイッチプロモーターとして有用なプロモーター配列及び他の調節エレメント（例えば、エンハンサー）の例が、２０１２年３月２日出願の米国特許第９，４０２，９１９号、シリアル番号１４／００１，９４３に開示されている。
「ペイロード」という用語は、その機能または量が変更されている任意のタンパク質またはポリペプチドまたは化合物を指す。本開示との関連において、ペイロードは、その転写活性が本開示の転写因子によって制御される核酸配列によってコードされるポリペプチドであってよい。転写因子と対応する特定のポリヌクレオチド結合部位との結合は、コードされるポリペプチドの転写を可能にし、次いで転写された核酸分子（転写物）が翻訳及び発現されることにより、ペイロードの発現をもたらし得る。ペイロードは、タンパク質、融合タンパク質、もしくは非コード遺伝子の産物、またはそのバリアント及び断片であってよい。アミノ酸ベースの場合、ペイロードは「目的のタンパク質」と称されてよい。
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、医薬組成物中に存在し、対象において実質的に非毒性かつ非炎症性である特性を有する、活性剤（例えば、本明細書に記載されるような）以外の任意の成分を指す。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、活性剤の懸濁及び／または溶解が可能なビヒクルである。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料（色味）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング剤、香味料、芳香剤、流動化剤（流動促進剤）、滑沢剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁化剤または分散剤、甘味料、及び水和水が挙げられてよい。例示的な賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される化合物の「薬学的に許容される塩」は、開示される化合物の形態であり、酸または塩基部分がその塩形態である（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって生成されるような）。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどに加えて、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオン、例えば、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むが、これらに限定されないものが挙げられる。薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の無機または有機酸からの従来の非毒性塩を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって塩基または酸部分を含有する親化合物から調製される。一般に、そのような塩は、それらの化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論量の適切な塩基または酸と水中もしくは有機溶媒中で、またはそれら２つの混合物中で反応させることによって調製され得、一般にエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見出され、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。薬学的に許容される溶媒和物：「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、本明細書で使用される場合、好適な溶媒の分子が結晶格子内に組み込まれている化合物の結晶形を指す。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製される場合がある。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と称される。いくつかの実施形態では、溶媒和物中に組み込まれる溶媒は、溶媒和物が（例えば、医薬組成物の単位剤形で）投与される生物に対して生理学的に忍容される種類またはレベルのものである。
「組換え」という用語は、当該技術分野における通常の意味を有し、インビトロで合成もしくはさもなければ操作されるポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）を指すか、組換えポリヌクレオチドを使用して細胞もしくは他の生物系において遺伝子産物を産生する方法を指すか、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。細胞に関連して使用される場合、本用語は、細胞が異種核酸を複製するか、または異種核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内では見られない遺伝子を含有し得る。組換え細胞はまた、細胞の天然形態に見られる遺伝子も含有し得、遺伝子が改変され、人工的手段によって細胞中に再導入される。本用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変されている細胞に対して内因性の核酸を含有する細胞も包含し、そのような改変は、遺伝子置換、部位特異的変異、及び関連する技術によって得られるものを含む。
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、そのような配列と適合する宿主の制御エレメントに機能的に連結される構造遺伝子の発現に影響を及ぼすことが可能な制御エレメントを有する、組み換えて、または合成的に生成される核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーター及び場合により転写終結シグナルを含む。典型的には、組換え発現カセットは、少なくとも転写される核酸及びプロモーターを含む。発現をもたらすのに必要または有用な追加の因子も、本明細書に記載されるように使用され得る。例えば、遺伝子発現に影響を与える転写終結シグナル、エンハンサー、及び他の核酸配列もまた、発現カセット内に含まれ得る。
「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換えによるドナー捕捉を含むが、これらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間における遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞における二本鎖切断の修復中に生じるそのような交換の特殊化した形態を指す。本プロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を使用して「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経た分子）を鋳型修復し、それがドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として広く知られている。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／または標的の一部となる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」、及び／または関連プロセスを含み得る。そのような特殊化したＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に組み込まれるように、多くの場合に標的分子の配列の変化をもたらす。いくつかの実施形態では、「相同組換え」は、別のＤＮＡ分子への外来ＤＮＡ配列の挿入、例えば、染色体へのベクターの挿入を指す。好ましくは、ベクターは、相同組換えのために特定の染色体部位を標的とする。特定の相同組換えの場合、ベクターは、染色体の配列に対して十分に長い相同性領域を含有し、染色体へのベクターの相補的結合及び組込みを可能にする。より長い相同領域、及びより高度な配列類似性が、相同組換えの効率を高める場合がある。
「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定されることができる同定因子をコードする核酸を指し、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡し、目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物を同定し、及び／または遺伝子発現の誘導もしくは転写を測定するために使用される。当該技術分野において既知の、使用されているレポーター遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータ－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが挙げられる。選択可能マーカー遺伝子も、レポーター遺伝子と見なされる場合がある。
「応答エレメント」という用語は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を介して媒介される、プロモーターに応答性を付与する１つ以上のシス作用性ＤＮＡエレメントを指す。いくつかの実施形態では、応答エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子に対する結合部位を提供する。このＤＮＡエレメントは、その配列がパリンドローム（完全もしくは不完全）であるか、または可変数のヌクレオチドによって分離される配列モチーフもしくはハーフサイトで構成される場合がある。ハーフサイトは類似している、または同一であり、直列もしくは逆方向反復配列のいずれかとして、または単一のハーフサイトもしくは隣接するハーフサイトの多量体としてタンデムに配置され得る。応答エレメントは、応答エレメントが組み込まれる細胞または生物の性質に応じて、異なる生物から単離される最小プロモーターを含む場合がある。転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、応答エレメントのＤＮＡ配列に結合し、この応答エレメントの制御下で下流の遺伝子（複数可）の転写を開始または抑制する。
「配列」という用語は、核酸分子に関連して使用される場合、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直鎖、環状または分岐状であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
「選択可能マーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する耐性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択できる同定因子、通常は抗生物質または化学耐性遺伝子を指し、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡し、及び／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物を同定するために使用される。当該技術分野において既知の、使用されている選択可能マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子、及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「安定化させる」、「安定化した」、「安定化領域」という用語は、ポリペプチドまたはその領域を安定にさせるか、または安定したままにすることを意味する。いくつかの実施形態では、安定性は絶対値と比較して測定される。例えば、そのリガンドに結合したＤＲＤを含むポリペプチドの安定性は、野生型ポリペプチドの安定性と比較されてよい。いくつかの実施形態では、安定性は、同じポリペプチドの異なる状態（ｓｔａｔｕｓ）または状態（ｓｔａｔｅ）と比較して測定される。例えば、そのリガンドに結合したＤＲＤを含むポリペプチドの安定性は、そのリガンドが存在しない場合のＤＲＤを含むポリペプチドの安定性と比較されてよい。
本明細書で使用される場合、「標準ＣＡＲ」という用語は、キメラ抗原受容体の標準設計を指す。細胞外ｓｃＦｖ断片、膜貫通ドメイン及び１つ以上の細胞内ドメインを含むＣＡＲ融合タンパク質の構成要素は、単一の融合タンパク質として直線的に構築される。
「対象」及び「患者」という用語は交換可能に使用され、ヒト患者及び非ヒト霊長類などの哺乳動物に加えて、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、及び他の動物などの実験動物を指す。したがって、「対象」または「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、本開示の核酸、ポリヌクレオチド、ペイロード、組成物、ベクターまたは細胞が投与され得る任意の患者または対象（例えば、哺乳動物）を意味する。
「Ｔ細胞」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を産生する免疫細胞である。Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されておらず、ＴＣＭと比較した場合にＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、及びＣＤ４５ＲＡの発現増加、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現減少）、メモリーＴ細胞（ＴＭ）（抗原を経験した長命な）、ならびにエフェクター細胞（抗原を経験し、細胞傷害性）であり得る。ＴＭは、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較した場合にＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、及びＣＤ９５の発現増加、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現減少）ならびにエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較した場合にＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現減少、及びＣＤ１２７の発現増加）のサブセットにさらに分類され得る。エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＴＣＭと比較した場合にＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現が減少し、グランザイム及びパーフォリンが陽性である、抗原を経験したＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。他の例示的なＴ細胞としては、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｆｏｘｐ３＋）制御性Ｔ細胞及びＴｒｅｇ１７細胞などに加えて、Ｔｒ１、Ｔｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８－、及びＱａ－１拘束性Ｔ細胞が挙げられる。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、可変抗原結合ドメイン、定常ドメイン、膜貫通領域、及び短い細胞質尾部を有する免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーを指し、これはＭＨＣ受容体に結合される抗原ペプチドに特異的に結合できる。ＴＣＲは細胞の表面上に、または可溶型で見られ得、一般にα鎖及びβ鎖（それぞれＴＣＲα及びＴＣＲβとしても知られる）、またはγ鎖及びδ鎖（それぞれＴＣＲγ及びＴＣＲδとしても知られる）を有するヘテロ二量体で構成される。ＴＣＲ鎖の細胞外部分（例えば、α鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメイン、Ｎ末端に可変ドメイン（例えば、α鎖可変ドメインまたはＶα、β鎖可変ドメインまたはＶβ）、ならびに細胞膜に隣接する１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣα及びβ鎖定常ドメインまたはＣβ）を含有する。免疫グロブリンと同様に、可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって分離される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。ＴＣＲは通常、ＣＤ３複合体と関連してＴＣＲ複合体を形成する。本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ複合体」という用語は、ＣＤ３とＴＣＲとの会合によって形成される複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲα鎖、及びＴＣＲβ鎖で構成され得る。あるいは、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲγ鎖、及びＴＣＲδ鎖で構成され得る。「ＴＣＲ複合体の構成要素」は、本明細書で使用される場合、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγもしくはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εもしくはＣＤ３ζ）、または２つ以上のＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖によって形成される複合体（例えば、ＴＣＲα及びＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγ及びＴＣＲδの複合体、ＣＤ３ε及びＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γ及びＣＤ３εの複合体、もしくはＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び２つのＣＤ３ε鎖のサブＴＣＲ複合体）を指す。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、感染症、疾患、障害、及び／または状態に罹患しているか、または罹患しやすい対象に投与されると、感染症、疾患、障害、及び／または状態を処置する、その症状を改善する、診断する、予防する、及び／またはその開始を遅延させるのに十分な送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。いくつかの実施形態では、治療有効量は、単回用量で提供される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、複数の用量を含む投与レジメンで投与される。当業者は、いくつかの実施形態では、単位剤形が、そのような投与レジメンの一部として投与される場合に効果的な量を含む場合、治療有効量の特定の薬剤または実体を含むと見なされる場合があると理解することになる。
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」とは、好ましくは有益なまたは所望の臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを表す。そのような有益なまたは所望の臨床結果としては、以下のうち１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：がん性細胞もしくは他の疾患細胞の増殖を減少させること（もしくは破壊すること）、がんに見られるがん性細胞の転移を減少させること、腫瘍のサイズを収縮させること、疾患に起因する症状を低減させること、疾患に罹患している患者の生活の質を向上させること、疾患を処置するのに必要な他の薬剤の用量を低減させること、疾患の進行を遅延させること、及び／または個体の生存を延長させること。
本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、刺激に応答して、または特定の結果に向けて１つのものを調整する、釣り合うようにする、または適応させることを意味する。非限定的な一例では、本開示のＤＲＤは、特定の刺激及び／または環境に応答して、それらが付加、結合または関連する組成物の機能または構造を調整する、釣り合うようにする、または適応させる。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥとその同族の標的ＤＮＡ配列との結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも称される）は、典型的には３３～３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。
「標的部位」または「標的配列」は、結合するのに十分な条件が存在することを条件として、結合分子が結合することになる核酸の一部を定義する核酸配列である。「意図される」標的部位は、ＤＮＡ結合分子が、結合するために設計及び／または選択されている部位である。
「転写」は、ＲＮＡポリメラーゼと遺伝子との相互作用を伴うプロセスを指し、これは遺伝子のコード配列中に存在する構造情報のＲＮＡとしての発現を誘導する。本プロセスとしては、以下のステップが挙げられるが、これらに限定されない：（１）転写開始、（２）転写伸長、（３）転写スプライシング、（４）転写キャッピング、（５）転写終結、（６）転写ポリアデニル化、（７）転写物の核外輸送、（８）転写物の編集、及び（９）転写物の安定化。
転写調節エレメントまたは配列としては、プロモーター配列（例えば、ＴＡＴＡボックス）、エンハンサーエレメント、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイが挙げられるが、これらに限定されない。そのエレメントまたは配列は、それに機能的に連結される遺伝子の転写を制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）または制御（ｒｅｇｕｌａｔｅ）する。
「転写開始部位」または「開始部位」は、転写配列の一部である第１ヌクレオチドの周囲の位置であり、これは位置＋１としても定義される。この部位に関して、遺伝子の他の全ての配列及びその制御領域が番号付けされ得る。下流の配列（すなわち、３’方向のさらなるタンパク質コード配列）は正と称され得るが、上流の配列（主として５’方向の制御領域の配列）は負と称される。
「導入遺伝子」は、宿主細胞中に導入されている遺伝子を指す。導入遺伝子は、細胞にとって自然な配列、細胞内で天然には存在しない配列、またはそれらの組合せを含む場合がある。導入遺伝子は、細胞内でのコード配列の発現を目的とした適切な調節配列に機能的に連結される場合がある１つ以上のタンパク質をコードする配列を含有する場合がある。
「形質導入」は、レンチウイルスベクターなどの遺伝子送達ベクター、またはｒＡＡＶなどによる、レシピエント宿主細胞への核酸分子の送達を指す。例えば、ｒＡＡＶビリオンによる標的細胞の形質導入は、そのビリオンに含有されるｒＡＡＶベクターの形質導入細胞への移入をもたらす。「宿主細胞」または「標的細胞」は、核酸送達が行われる細胞を指す。
「形質転換」、「トランスジェニック」、及び「組換え」は、異種核酸分子が導入されている細菌、シアノバクテリア、動物または植物などの宿主細胞または生物を指す。核酸分子は、当該技術分野において一般に既知であり、開示されているようにゲノム中に安定に組み込まれ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ １９８９、Ｉｎｎｉｓ １９９５、Ｇｅｌｆａｎｄ １９９５、Ｉｎｎｉｓ＆Ｇｅｌｆａｎｄ １９９９）。
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来または異種核酸の取込みを指す。そのような核酸が細胞内に導入されている場合に、細胞は核酸によって「トランスフェクト」されている。形質転換核酸は、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合的に連結され）得る。
「転写及び翻訳制御配列」は、宿主細胞においてコード配列の発現を提供する核酸調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを指す。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドに関して使用される場合の「バリアント」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較した場合に、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、挿入、付加、欠失及び／または共有結合修飾を有する場合がある。本明細書で使用される場合、「欠失」はまた、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端での切断を含む。通常、バリアントは、天然または参照配列と少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有することになり、好ましくは、それらは天然または参照配列と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一（相同）となる。本明細書で使用される場合、配列に関する場合の「天然」または「開始」または「参照」という用語は、比較を行うことができる元の分子を指す相対的な用語である。天然または開始または参照配列は、野生型配列と混同されるべきではない。天然配列または分子は、野生型（その配列が天然に見られる）を表す場合があるが、野生型配列と同一である必要はない。
「ベクター」は、核酸を宿主細胞にクローニング及び／または移入するための任意のビヒクルを指す。そのような核酸は、ベクター内またはベクターによって「運ばれる」と称される場合がある。ベクターは、結合したセグメントの複製をもたらすように、別のＤＮＡセグメントが結合される場合があるレプリコンであってよい。「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製できる任意の遺伝因子（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を細胞中に導入するためのウイルス及び非ウイルスビヒクルの両方を含む。当該技術分野において既知の多数のベクターが、核酸を操作し、応答エレメント及びプロモーターを遺伝子などに組み込むために使用されてよい。可能なベクターとしては、例えば、プラスミドもしくは例えば、ラムダ誘導体などのバクテリオファージを含む改変ウイルス、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターが挙げられる。例えば、好適なベクターへの応答エレメント及びプロモーターに対応するＤＮＡ断片の挿入は、相補的な凝集末端を有する選択されたベクターに適切なＤＮＡ断片をライゲーションすることによって達成され得る。あるいは、ＤＮＡ分子の末端が酵素的に修飾される場合があるか、または任意の部位が、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることによって生成される場合がある。そのようなベクターは、マーカーを細胞ゲノム中に組み込んでいる細胞の選択を提供する選択可能マーカー遺伝子を含有するように操作されてよい。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされるタンパク質を組み込んで発現する宿主細胞の同定及び／または選択を可能にする。一般的なベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、ならびに（主に酵母及び細菌において）「人工染色体」を含む。「発現ベクター」は、ベクターにクローニングされる核酸の転写を提供または促進するエレメントを含むベクターである。そのようなエレメントは、例えば、目的の核酸に機能的に結合されるプロモーター及び／またはエンハンサーを含み得る。を含むベクター
「クローニングベクター」は「レプリコン」を指し、これは連続して複製する核酸、好ましくはＤＮＡの単位長であり、結合したセグメントの複製をもたらすように、別の核酸セグメントが結合される場合がある、プラスミド、ファージまたはコスミドなどの複製起点を含む。クローニングベクターは、ある細胞型では複製し、別の細胞型では発現できる場合がある（「シャトルベクター」）。クローニングベクターは、目的の配列を挿入するためのベクター及び／または１つ以上のマルチプルクローニングサイトを含む細胞の選択に使用され得る１つ以上の配列を含む場合がある。
「発現ベクター」という用語は、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルを指す。クローニングした遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどの制御エレメントの制御下に置かれる。開始制御領域またはプロモーターは、所望の宿主細胞において核酸の発現を誘導するのに有用であり、それらは数が多く、当業者に周知である。実際に、それらの遺伝子の発現を誘導できる任意のプロモーターが発現ベクターに使用され得、これらとしては、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、病因または疾患関連プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光制御プロモーター、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰ１、アルカリホスファターゼプロモーター（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現に有用）、ＡＯＸ１プロモーター（Ｐｉｃｈｉａでの発現に有用）、ベータ－ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、及びｔｒｃプロモーター（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの発現に有用）、光制御、種子特異的、花粉特異的、卵巣特異的、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ ３５Ｓ最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質、リブロース１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ桿菌状ウイルス、植物スーパープロモーター、ポテトロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸レダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質、及びアントシアニンプロモーター（植物細胞での発現に有用）、当該技術分野において既知の動物及び哺乳動物プロモーター、例えば、ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’長末端反復（ＬＴＲ）に含有されるプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、バキュロウイルス１Ｅ１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｌプロモーター及び転写制御領域の調節配列、ユビキタスプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、アルファ－アクチン、チューブリンなど）、中間径フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）のプロモーター、治療遺伝子（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ因子型などの）のプロモーター、病因または疾患関連プロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物に利用されているプロモーター、例えば、膵腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ及び肥満細胞で活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域、肝臓で活性なアルブミン遺伝子、Ａｐｏ ＡＩ及びＡｐｏ ＡＩＩ制御領域、肝臓で活性なアルファ－フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓で活性なアルファ１－アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄細胞で活性なベータ－グロビン遺伝子制御領域、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域、ならびに視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞のプロモーター、アルファ－アクチンなどを含むが、これらに限定されないプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、それらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列などの付加によって改変される場合がある。
ベクターは、当該技術分野において既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＦデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体によって所望の宿主細胞中に導入されてよい（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）、及びＨａｒｔｍｕｔ ｅｔ ａｌ．，カナダ特許出願第２，０１２，３１１号を参照のこと）。
ウイルスベクター、特にレンチウイルス及びレトロウイルスベクターは、細胞に加えて、生きている動物対象における多種多様な遺伝子送達用途に使用されている。使用され得るウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタイン・バー、アデノウイルス、ジェミニウイルス、及びカリモウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）、ＤＮＡ－タンパク質複合体、及びバイオポリマーが挙げられる。核酸に加えて、ベクターはまた１つ以上の調節領域、及び／または核酸移入結果（組織への移入、発現期間など）の選択、測定、及びモニタリングに有用な選択可能マーカーを含む場合がある。
当該技術分野において既知のいくつかの方法が、本発明によるポリヌクレオチドを増殖させるために使用されてよい。好適な宿主系及び増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターを増殖し、大量に調製できる。本明細書に記載されるように、使用され得る発現ベクターとしては、以下のベクターまたはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない：ほんの数例を挙げれば、レンチウイルス、ワクシニアウイルスもしくはＡＡＶ、またはアデノウイルスなどのヒトまたは動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、ならびにプラスミド及びコスミドＤＮＡベクター。本発明のベクターはまた、筋肉内投与を含むが、これに限定されない任意の投与経路によって対象に投与されてよい。
本開示によるポリヌクレオチドはまた、リポフェクションによってインビボで導入され得る。インビトロでの核酸のカプセル封入及びトランスフェクションのためのリポソームの使用が増加している。リポソーム媒介トランスフェクションで遭遇する困難及び危険性を制限するように設計された合成カチオン性脂質が、遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る。カチオン性脂質の使用は、負荷電核酸のカプセル封入を促進し、また負荷電細胞膜との融合も促進する場合がある。核酸の移入に特に有用な脂質化合物及び組成物は、ＷＯ９５／１８８６３、ＷＯ９６／１７８２３及び米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。インビボで特定の器官に外来遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、ある特定の実用的な利点を有する。特定の細胞に対するリポソームの分子標的化は、１つの利益の領域を表す。特定の細胞型にトランスフェクションを誘導することが、膵臓、肝臓、腎臓、及び脳などの細胞の不均一性を有する組織で特に好ましいことは明らかである。脂質は、標的化を目的として他の分子に化学的に結合される場合がある。標的ペプチド、例えば、ホルモンもしくは神経伝達物質、及び抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子は、リポソームに化学的に結合され得た。
他の分子もまた、インビボで核酸のトランスフェクションを促進するのに有用であり、例えば、カチオン性オリゴペプチド（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質に由来するペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）などである。
裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボでベクターを導入することも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、同第５，５８９，４６６号及び同第５，５８０，８５９号を参照のこと）。受容体媒介ＤＮＡ送達アプローチも使用され得る。
加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、それらの増幅またはそれらの発現が求められる細胞宿主における複製の１つ以上の起点、マーカーまたは選択可能マーカーを含んでよい。
「野生型」は、任意の既知の変異を含まない、天然に見られる核酸配列、核酸分子、アミノ酸配列、ポリペプチド、ウイルスまたは生物を指す。本用語はまた、野生型核酸配列、核酸分子、アミノ酸配列、ポリペプチド、ウイルスまたは生物の特性について記載するために使用されてよい。
実施例１：転写因子系の設計及び試験
本実施例は、本開示によって教示される転写因子系を設計、調製及び評価する方法を提供する。
転写因子系の設計：上に記載した通り、転写因子系はモジュラー系であり、その場合に転写因子系のポリヌクレオチドまたは核酸構築物は、ポリヌクレオチドまたは核酸構築物の得られた組合せが、（１）特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化できる転写因子をコードする１つ以上の核酸配列、（２）薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列であって、転写因子がＤＲＤに機能的に連結されている核酸配列、及び（３）ペイロードをコードし、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含む限り、核酸配列の異なる配置を含んでよい、及び／または転写因子系の一部として特有の形で組み合わされてよい。
本実施例は、例示的な転写因子系を設計するためのアプローチを実証する。本実施例の転写因子系は、（ｉ）転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１核酸構築物ならびに（２）ペイロードをコードする第２核酸構築物を含む核酸構築物によってコードされ、ペイロードの発現が、転写因子ＤＮＡ結合ドメインの結合部位を含む誘導性プロモーターによって駆動される（図１Ａ～図１Ｂ）。図１Ａに示す通り、プロモーターが、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン及びＤＲＤの発現を駆動する。本実施例の転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインを、転写因子融合タンパク質として発現し、融合タンパク質をＤＲＤに機能的に連結する（ＤＲＤ－ＴＦ）。転写因子融合タンパク質のレベルを、ＤＲＤリガンドで制御し得る。さらに、制御した転写因子融合タンパク質は、リガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得る。上で述べて、さらに後続の実施例で例示するように、本設計スキームの実行可能な変化形態としては、構築物構成要素の配置の変動、構築物の一部として追加の核酸配列の包含（例えば、リンカー配列、調節エレメント、ポリアデニル化配列、及びリボソームスキップエレメントなど）、ならびに転写因子系をコードする単一の核酸構築物の設計が挙げられる。
本実施例の転写因子系の各構成要素は、個別に選択できる。例えば、転写因子ＤＮＡ結合ドメインを、操作したジンクフィンガー結合タンパク質、操作したＴＡＬエフェクター、または他の天然もしくは操作したＤＮＡ結合ドメインから選択してよい。転写因子活性化ドメインを、ｐ６５、ＶＰ６４、ｐ３００、ＳＡＭ、ＶＰＲの活性化ドメイン、または他の活性化ドメインから選択してよい。転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン及びＤＲＤの発現を駆動するプロモーターを、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、細胞分化特異的プロモーター、及び／または疾患特異的プロモーターから選択してよい。場合により、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン及びＤＲＤの発現を駆動するプロモーターを、ＥＦ１ａ、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＲＳＶ、ＳＦＦＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、及びＳＶ４０から選択してよい。ペイロードを、細胞内タンパク質、膜結合タンパク質、または分泌タンパク質などの任意の目的のタンパク質から選択してよい。場合により、ペイロードは治療用タンパク質であってよい。ペイロードの非限定的な例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、またはＩＬ１５）、抗体、凝固因子、酵素（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、またはＣｒｅ）、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられる。ペイロードをコードする核酸配列に機能的に連結される誘導性プロモーターを、核酸転写のために開始複合体の形成を可能にする既知の調節配列から選択することによって設計してよい。転写因子系の特定のポリヌクレオチド結合部位と結合したそのような調節配列を使用して、本明細書に記載した転写因子系の誘導性プロモーターを設計し得る。例えば、Ｅｄｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．は、本開示の転写因子系の設計に使用してよい当該技術分野において既知のプロモーターについて記載している（Ｅｄｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｍａｙ ２０；５（５）：３９５－４０４）。
本実施例の例示的な転写因子系の場合、転写因子ＤＮＡ結合ドメインを、結合ドメインの結合部位を含み、ペイロードの発現を駆動する誘導性プロモーターに対応するように選択する。本実施例のＤＮＡ結合ドメインは、対応する特定のポリヌクレオチド結合部位が既知であるか、または決定され得るＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含むか、あるいはそれに由来してよい。当該技術分野において既知のＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及びそれらの対応するポリヌクレオチド結合部位の対を、本実施例の核酸構築物に使用してよい。例えば、例示的な転写因子系の核酸構築物は、Ｋｈａｌｉｌ Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌによって提供されるジンクフィンガーアレイを含んでよい。あるいは、核酸構築物は、Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．によって提供されるＴＡＬエフェクターリピート領域を含んでよい。さらに、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン及びそれらの対応するポリヌクレオチド結合部位の相互作用対を設計する方法が、当業者に利用可能である。例えば、結合タンパク質－ＤＮＡ認識部位対を同定する方法が、オリゴマー化プール工学法及びファージディスプレイ法に加えて、Ｋｈａｌｉｌ Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．、Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．、及びＺｈａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（Ｋｈａｌｉｌ Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１２，１５０，６４７－６５８、Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１，７０：３１３－４０）において述べられる他の方法を含む。
転写因子系の調製：本明細書に示した通り、転写因子系を、系をコードする核酸構築物を細胞中に導入することによって調製できる。それらの構築物を１つ以上の核酸分子に導入してよく、一過性に発現させるか、または安定に組み込んでよい。一過性発現の場合は、細胞を、実施例２に記載したように調製した導入ベクターでトランスフェクトする。安定した組込みの場合は、安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞株を、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択する。形質導入する細胞株を、Ｕ２ＯＳ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ、または他の細胞株細胞を含むが、これらに限定されない細胞から選択してよい。
転写因子系の評価：上に、例えば、「転写因子系のリガンド依存性活性の特徴付け」節に記載した通り、様々な方法を使用して転写因子系を評価できる。本実施例は、上述した構築物の安定した組込みによって調製した転写因子系を評価する方法を提供する。それらの方法を使用して、転写因子系の一過性発現によって調製した転写因子系も評価できる。
評価する細胞は、非形質導入（親）細胞及び以下の構築物から作製したレンチウイルスで形質導入した細胞を含んでよい：（１）図１Ａに示したものなどのＤＲＤ－ＴＦ構築物、（２）図１Ｂに示したものなどのペイロード構築物、ならびに（３）ＤＲＤ－ＴＦ構築物から作製したレンチウイルス及びペイロード構築物から作製したレンチウイルスの両方。各細胞株を、リガンドまたはＤＭＳＯを含有する培地で処理する。細胞を約２４～４８時間インキュベートし、収集して分析する。分析技術としては、フローサイトメトリー及びイムノアッセイ、例えば、イムノブロット分析、ＥＬＩＳＡ、または電気化学発光法、例えば、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームのものなどが挙げられてよい。例えば、ＤＲＤ－ＴＦ構築物によってコードされる転写因子ポリペプチドのリガンド依存性制御を、転写因子ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン及び／または転写活性化ドメインを対象とする抗体を用いたイムノブロット分析によって評価できる。ペイロードも、ペイロードを対象とする抗体を用いたイムノブロット分析によって評価してよい。フローサイトメトリーを使用して、例えば、ペイロードを認識する標識抗体の使用によってペイロードレベルを評価してもよい。ＥＬＩＳＡ及びＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙなどの分析技術を使用して、分泌ペイロードのレベルを評価できる。
ＤＭＳＯ条件で処理した細胞と比較して、リガンド処理細胞は、ＤＲＤ－ＴＦ構築物によってコードされる転写因子ポリペプチドのレベルが増加することに加えて、ペイロードのレベルも増加することになると予想する。これらの結果は、転写因子融合タンパク質のレベルをＤＲＤリガンドで制御し得ること、及び制御した転写因子融合タンパク質がリガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得ることを裏付けることになった。
本実施例は、本開示の転写因子系を設計する際のモジュール性ならびにこれらの系を調製及び評価する方法について実証する。本明細書に示す通り、様々な構築物工学スキームを用いて転写因子系を設計できる。追加の工学スキームを、本開示によって他の箇所に記載している。
実施例２：構築物の組立て、ウイルス産生及び細胞株の生成
以下の材料及び方法を使用して、本開示の実施例で使用した構築物、ウイルス及び細胞株を調製した。
クローニング方法：表１に列挙した構築物を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いたＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙによって調製した。組立て用のＤＮＡ断片を、新たに購入して合成したか、または以前に作製した構築物からＰＣＲコピーしたかのいずれかを行った。表１の全ての構築物を、導入ベクター骨格に導入した。使用した導入ベクターは、ｐＥＬＤＳ－ｐｕｒｏ（その配列を本明細書で提供する、図１８及び配列番号：６８）を含んだ。ｐＥＬＤＳ－ｂｌａｓｔ、ｐＥＬＤＳ－Ｔｈｙ１．２、及びｐＥＬＤＳ－Ｔｈｙ１．１導入ベクターを、ｐＥＬＤＳ－ｐｕｒｏベクターのピューロマイシン耐性遺伝子を、それぞれブラストサイジン耐性（ｐＬｅｎｔｉ６．３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｔｈｙ１．２ ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＴｈｙ１．１ ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に交換することによって作製した。表５は、示した構築物に使用した導入ベクターを示している。
Figure 2023509770000037
組み立てたプラスミドを、増幅のためにＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に形質転換し、ウイルス産生を進める前に配列を確認した。
レンチウイルスの作製：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコラーゲンコーティング組織培養プレート上に播種し、増殖培地（５％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中で７０％コンフルエントになるまで維持した。トランスフェクション前に、培地をＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３培地で置き換えた。細胞を、上に記載したように調製した導入ベクターに加えて、パッケージングプラスミド（ｐＲＳＶ．ＲＥＶ、ｐＭＤＬｇ／ｐ．ＲＲＥ及びｐＭＤ２．Ｇ）を用いて、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの６～８時間後に、培地を新鮮なＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３培地で置き換えた。ウイルスを含有する上清をトランスフェクションの２４時間後に回収し、新鮮な培地を添加してトランスフェクションの４８時間後に上清を再度回収した。ウイルス上清を濾過して残屑を除去し、２０％スクロース勾配での超遠心分離によって濃縮した。ウイルスをＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に再懸濁し、分取して－８０℃で保存した。
安定した細胞株の生成：細胞を、対応する構築物から作製したレンチウイルスで形質導入した。形質導入したＵ２ＯＳ細胞を、ペイロード構築物もしくは単一ベクター構築物を発現する場合には、２μｇ／ｍＬのピューロマイシンと共に、または転写因子構築物を発現する場合には、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンと共に２週間培養することによって選択した。形質導入したＡＲＰＥ－１９細胞を、ペイロード構築物もしくは単一ベクター構築物を発現する場合には、２μｇ／ｍＬのピューロマイシンと共に、または転写因子構築物を発現する場合には、２０μｇ／ｍＬのブラストサイジンと共に２週間培養することによって選択した。ペイロード構築物を含む導入ベクターから作製したレンチウイルス及び転写因子構築物を含む導入ベクターから作製したレンチウイルスの両方で形質導入した細胞を、組合せ選択下に置いた。形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を、どのレンチウイルス（複数可）でそれらを形質導入したかに応じて、Ｔｈｙ１．１及び／またはＴｈｙ１．２の染色後に蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離した。
実施例３：転写因子のリガンド依存性制御
本実施例は、異なる薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）及びリガンドを使用する転写因子の制御を実証する。本実施例では、転写因子は、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸構築物によってコードされる（図１Ａ）。本実施例の転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインを、転写因子融合タンパク質として発現し、融合タンパク質を、ｅｃＤＨＦＲ、ＣＡ２、ｈＤＨＦＲ、またはＥＲ親タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結する。本明細書で示すように、転写因子融合タンパク質のレベルをリガンドで制御し得る。
細胞株：本実施例では、非トランスフェクト（親）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び次の構築物：（１）ＺＦＨＤ－０５９、（２）ＺＦＨＤ－０６０、（３）ＺＦＨＤ－０５４、（４）ＺＦＨＤ－０４８、または（５）ＺＦＨＤ－０５５のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を分析した。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中で培養し、以下の通りにトランスフェクトした：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を組織培養プレート上に播種し、増殖培地（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中で７０～８０％コンフルエントになるまで維持した。細胞を、上に記載したように調製した導入ベクターを用いて、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、培地を、１０μＭ ＴＭＰ、１μＭバゼドキシフェン、１００μＭアセタゾラミド、５０μＭトリメトプリムまたは０．１％ＤＭＳＯのいずれかを含む増殖培地で置き換えた。２４時間後、イムノブロットアッセイのために細胞を収集した。プラスミド及び対応するリガンド処理条件の説明を表６に提供する。表６の「ＯＴ－」標識は、示した構築物（例えば、ＺＦＨＤ－０５９、ＺＦＨＤ－０６０など）を含むプラスミドへの言及を示す。表６の説明に示した構成要素は、本実施例で細胞をトランスフェクトするために使用したプラスミド上の構成要素の選択に加えて、導入ベクター骨格（ｐＥＬＤＳ）の名称を含む。表６の「説明」列では、「ＺＦＨＤ１」という用語はＺＦＤＨ１ ＤＮＡ結合ドメインを指し、「ｐ６５」という用語はｐ６５活性化ドメインを指す。
Figure 2023509770000038
リガンド処理：各細胞株を播種し、細胞を一晩接着させた。培地を除去し、適切なリガンドまたは０．１％ＤＭＳＯ（表６）を含む１ｍＬの培地を添加した。細胞を２４時間インキュベートし、収集のために０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出した。収集した細胞をペレット化し、培地を除去して細胞ペレットを後のイムノブロットアッセイのために－２０℃で保存した。
イムノブロットアッセイ：細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液（Ｔ－ＰＥＲ（商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中に再懸濁した。細胞溶解物を、ベータ－メルカプトエタノールまたは還元試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有するＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に添加し、３００ｒｐｍで攪拌しながら９６℃で６分間インキュベートした。試料を、ＢＯＬＴ抗酸化剤を含むＢＯＬＴ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液中のＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、次の抗体：ウサギ抗ＮＦカッパＢ－ｐ６５抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）及びマウス抗βアクチン抗体（１：２０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）でプローブした。二次抗体は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤロバ抗マウス（１：４０００、ＬＩ－ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）またはＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷロバ抗ウサギ（１：３０００、ＬＩ－ＣＯＲ）であった。
結果：ＤＲＤ－ＴＦ構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロット分析によって、転写因子構築物ＺＦＨＤ－０５９、ＺＦＨＤ－０６０、ＺＦＨＤ－０５４、及びＺＦＨＤ－０４８によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドが、ＤＭＳＯ処理細胞と比較して、リガンド処理細胞ではより高いレベルで存在したことが明らかとなった（図２Ａ～図２Ｂ）。このデータは、ＤＲＤに機能的に連結した転写因子のタンパク質レベルをＤＲＤのリガンドで制御し得ることを示している。
実施例４：ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド依存性活性
本実施例は、転写因子系のリガンド依存性活性を実証する。本実施例では、転写因子系を、（１）転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１核酸構築物ならびに（２）ペイロードをコードする第２核酸構築物を含む核酸構築物によってコードし、ペイロードの発現を、転写因子ＤＮＡ結合ドメインの結合部位を含む誘導性プロモーターによって駆動する（図３Ａ～図３Ｂ）。本実施例の転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインを、転写因子融合タンパク質として発現し、融合タンパク質をｅｃＤＨＦＲ親タンパク質に由来するＤＲＤに連結する。本明細書で示すように、転写因子融合タンパク質のレベルをｅｃＤＨＦＲリガンドで制御し得る。さらに、制御した転写因子融合タンパク質は、リガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得る。
細胞株：本実施例では、非形質導入（親）Ｕ２ＯＳ細胞及び以下の構築物から作製したレンチウイルスで形質導入したＵ２ＯＳ細胞を分析した：（１）ＺＦＨＤ－００５、（２）ＺＦＨＤ－００７、（３）構築物ＺＦＨＤ－００５から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方、または（４）構築物ＺＦＨＤ－００４から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞株を、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：各細胞株を２４ウェルプレートの６～８ウェルに２５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。培地を除去し、１０μＭトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む１ｍＬの培地を各細胞株のウェルの半分に添加した。残りのウェルには、０．１％ＤＭＳＯを含む１ｍＬの培地を入れた。細胞を４８時間インキュベートし、収集のために０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出した。各処理条件の１つのウェルをフローサイトメトリーによって分析した。残存する試料を用いて、収集した細胞をペレット化し、培地を除去して細胞ペレットを後のイムノブロット分析のために－２０℃で保存した。
フローサイトメトリー：収集した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁してフローサイトメトリーによって分析した。
イムノブロットアッセイ：細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液（Ｔ－ＰＥＲ（商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中に再懸濁した。細胞溶解物を、ベータ－メルカプトエタノールを含有するＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に添加し、３００ｒｐｍで攪拌しながら９６℃で６分間インキュベートした。試料を、ＢＯＬＴ抗酸化剤を含むＢＯＬＴ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液中のＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、次の抗体：ウサギ抗ＮＦカッパＢ－ｐ６５抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）及びマウス抗βアクチン抗体（１：２０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）でプローブした。二次抗体は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤロバ抗マウス（１：４０００、ＬＩ－ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）またはＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷロバ抗ウサギ（１：３０００、ＬＩ－ＣＯＲ）であった。
結果：安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－００５及びＺＦＨＤ－００７を有するＵ２ＯＳ細胞のイムノブロット分析によって、転写因子構築物ＺＦＨＤ－００５によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドが、ＤＭＳＯ処理細胞と比較して、ＴＭＰ処理細胞ではより高いレベルで存在したことが明らかとなった（図３Ｄ）。このデータは、ＤＲＤに機能的に連結した転写因子のタンパク質レベルをＤＲＤのリガンドで制御し得ることを示している。比較すると、安定に組み込んだ構成的転写因子構築物（図３Ｃに図示したＺＦＨＤ－００４）を有するＵ２ＯＳ細胞は、細胞をＤＭＳＯまたはＴＭＰのいずれかで処理する場合に、構築物ＺＦＨＤ－００４によってコードされる転写因子ポリペプチドを検出することを示した。
安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－００５及びＺＦＨＤ－００７を有するＵ２ＯＳ細胞のフローサイトメトリー分析は、ＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した通り、ペイロード発現が、ＤＭＳＯ処理細胞と比較してＴＭＰ処理細胞ではより高かったことを示した（図３Ｅ）。このデータは、ＤＲＤ制御転写因子がリガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得ることを示している。
実施例５：ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系の用量依存的活性
本実施例は、リガンドに応答する転写因子系の用量反応挙動を実証する。本実施例の転写因子系を、実施例４で上に記載している。本実施例に示すように、ＤＲＤに機能的に連結した転写因子のタンパク質レベルを、ＤＲＤのリガンドに応答して用量依存的に制御し得る。さらに、転写因子結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結した核酸配列によってコードされるペイロードの発現もまた、リガンドの用量に依存する。
細胞株：本実施例では、非形質導入（親）Ｕ２ＯＳ細胞ならびに構築物ＺＦＨＤ－００５から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方で形質導入したＵ２ＯＳ細胞を分析した。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞株を、実施例２で上に記載した通りに調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：細胞を２４ウェルプレートに２５，０００細胞／ウェルの密度で播種した。播種した細胞を一晩接着させた。
１０点用量反応曲線の培地を調製するために、１０μＭトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む培地を、単純培地中において１：３の８段階希釈物で希釈した。用量反応曲線の第１０点では、培地を０．１％ＤＭＳＯで調製した。
培地をプレートから除去し、ＤＭＳＯ培地またはＴＭＰを含む培地のいずれかで置き換えた。親Ｕ２ＯＳウェルの半分に、１０μＭ ＴＭＰを含む交換培地を入れた。親Ｕ２ＯＳウェルの残りの半分に、０．１％ＤＭＳＯを含む交換培地を入れた。安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－００５及びＺＦＨＤ－００７を有するＵ２ＯＳ細胞に、０．１％ＤＭＳＯまたは各用量のＴＭＰ（各条件について２～３ウェル）を含む交換培地を入れた。処理細胞を４８時間インキュベートした。細胞を、０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出して収集した。イムノブロット試料分析では、収集した細胞をペレット化し、培地を除去して、実施例４で上に記載したようなウェスタンブロットの手順まで細胞を－２０℃で保存した。フローサイトメトリー試料分析では、収集した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁してフローサイトメトリーによって分析した。
結果：ＴＭＰの濃度が高いほど、転写因子融合タンパク質のレベルが高くなった（図４Ａ～図４Ｂ）。このデータは、ＴＭＰがｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤに機能的に連結した転写因子のタンパク質レベルを用量依存的に制御することを示している。
ＴＭＰの濃度が高いほど、ＧＦＰ ＭＦＩによって評価したように、ペイロード発現のレベルが高くなった（図４Ｃ）。ペイロード応答のＥＣ５０は、転写因子応答のＥＣ５０と同様であった。このデータは、ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子が、ＴＭＰの異なる用量に応答して、ペイロードの発現を用量依存的に駆動し得ることを示している。
実施例６：Ｔ細胞中におけるｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド依存性活性
本実施例は、Ｔ細胞中における転写因子系のリガンド依存性活性を実証する。本実施例の転写因子系の構成要素を、実施例４で上に記載している。Ｔ細胞形質導入及びリガンド処理：０日目に、凍結したヒトＴ細胞を解凍し、完全Ｔ細胞培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、ＮＥＡＡ（１００倍ストックから１％）、ＨＥＰＥＳ（１００倍ストックから１％）、ピルビン酸ナトリウム（１００倍ストックから１％）、及びメルカプトエタノール（１０００倍ストックから１倍）を補充したＲＰＭＩ）中に再懸濁した。細胞を洗浄し、計数して２４ウェルプレートに播種した（１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で１ウェルあたり５００μＬ）。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔ－ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８）を滅菌ＰＢＳまたは培地で洗浄し、１．５×１０＾６ビーズ／ウェルで添加した。細胞を一晩インキュベートした。
１日目に、ウイルス（ＯＴＬＶ－ＺＦＨＤ－００７、ＯＴＬＶ－ＺＦＨＤ－００５、ＯＴＬＶ－ＥＧＦＰ－００１、またはＯＴＬＶ－ＺＦＨＤ－００５及びＯＴＬＶ－ＺＦＨＤ－００７の両方）を、活性化Ｔ細胞に添加した。本明細書で使用される場合、「ＯＴＬＶ－」標識は、示した構築物（例えば、ＺＦＨＤ－００７及びＺＦＨＤ－００５）を含むプラスミドから生成されるレンチウイルスを指す。２日目に、１ｍＬの新鮮な完全Ｔ細胞培地を１ウェルごとに添加した。３日目に、Ｔ細胞を以下の通りにリガンドで処理した：各形質導入Ｔ細胞を、９６ウェル平底プレートの８つのウェルごとに播種し（７５μＬ／ウェル）、２０μＭ ＴＭＰを含む７５μＬの培地をウェルの半分に添加し、等量のＤＭＳＯを含む培地を残り半分のウェルに添加した。５日目に、各形質導入／処理の１つのウェルを収集し、回転させて上清を取り出し、実施例４で上に記載したようなウェスタンブロットの手順まで細胞を－２０℃で保存した。残りの試料を回転させて上清を取り出した。試料を細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で１回洗浄し、細胞染色緩衝液中において１：１０００の５０μＬの固定可能な生存色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）で、２０分間４℃で染色した。試料を細胞染色緩衝液で２回洗浄し、細胞を２００μＬの固定緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に再懸濁して、４℃で一晩保存した。６日目に、細胞を回転させて１％ＱＳｏｌ（商標）緩衝液（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）を含む細胞染色緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
結果：イムノブロット分析は、転写因子構築物ＺＦＨＤ－００５によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドが、ＯＴＬＶ－ＺＦＨＤ－００５ウイルスで形質導入し、ＴＭＰで処理したＴ細胞では、ＤＭＳＯで処理した同じ細胞と比較してより高いレベルで存在したことを示した（図５Ａ）。このデータは、ＤＲＤに機能的に連結した転写因子のタンパク質レベルを、Ｔ細胞中においてＤＲＤのリガンドで制御し得ることを示している。
フローサイトメトリー分析は、ＧＦＰ ＭＦＩによって測定した通り、ペイロード発現が、ＯＴＬＶ－ＺＦＨＤ－００５及びＯＴＬＶ－ＺＦＨＤ－００７ウイルスの両方で形質導入し、ＴＭＰで処理したＴ細胞では、ＤＭＳＯで処理した同じ細胞と比較しておよそ１．６倍増加したことを示した（図５Ｂ）。このデータは、ＤＲＤ制御転写因子が、Ｔ細胞中においてリガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得ることを示している。
これらの結果は、本開示によって記載した転写因子系が、Ｔ細胞中でペイロード発現を制御し得ることを示している。ペイロード発現で観察した低倍率変化は、細胞が１００％形質導入されず、任意の形質導入マーカーに分類されなかったことが理由である可能性がある。
実施例７：ＡＲＰＥ－１９細胞中におけるＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド依存性活性
本実施例は、ＡＲＰＥ－１９細胞中における転写因子系のリガンド依存性活性を実証する。本実施例では、転写因子系を、（１）転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１核酸構築物ならびに（２）ペイロードをコードする第２核酸構築物を含む核酸構築物によってコードし、ペイロードの発現を、転写因子ＤＮＡ結合ドメインの結合部位を含む誘導性プロモーターによって駆動する（図３Ｂ及び図６Ａ）。本実施例の転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインを、転写因子融合タンパク質として発現し、融合タンパク質をＣＡ２親タンパク質に由来するＤＲＤに連結する。本明細書で示すように、転写因子融合タンパク質のレベルをＣＡ２リガンドで制御し得る。さらに、制御した転写因子融合タンパク質は、リガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得る。
細胞株：本実施例では、非形質導入（親）ＡＲＰＥ－１９細胞及び以下の構築物から作製したレンチウイルスで形質導入したＡＲＰＥ－１９細胞を分析した：（１）ＺＦＨＤ－００７、（２）ＺＦＨＤ－０１９、ならびに（３）構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－０１９から作製したレンチウイルスの両方。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞株を、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ－Ｆ１２培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：各細胞株を１５，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートの６～８ウェルに播種した。細胞を一晩接着させた。翌日、各細胞型のウェルの半分の培地を、１０μＭアセタゾラミド（ＡＣＺ）を含む１ｍＬの培地で置き換え、残りのウェルの培地を、０．１％ＤＭＳＯを含む１ｍＬの培地で置き換えた。４８時間のインキュベーション後、細胞を、０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出して収集した。イムノブロットアッセイでは、収集した細胞をペレット化し、培地を除去して、実施例４で上に記載したようなウェスタンブロットの手順まで細胞ペレットを－２０℃で保存した。フローサイトメトリーでは、試料を細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で１回洗浄し、１％ＱＳｏｌ（商標）緩衝液（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）を含む細胞染色緩衝液中に再懸濁して、フローサイトメトリーによって分析した。
結果：安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－０１９及びＺＦＨＤ－００７を有するＡＲＰＥ－１９細胞のイムノブロット分析によって、ＤＭＳＯ処理と比較した場合に、ＡＣＺ処理を行った転写因子構築物ＺＦＨＤ－０１９によってコードされる転写因子及びＤＲＤポリペプチドのレベルがおよそ１３．５倍の増加となったことが明らかとなった（図６Ｂ～図６Ｃ）。このデータは、ＣＡ２ ＤＲＤに機能的に連結した転写因子のタンパク質レベルを、ＡＲＰＥ－１９細胞中においてＣＡ２リガンドで制御し得ることを示している。
フローサイトメトリー分析は、ＧＦＰ ＭＦＩによって測定した通り、ペイロード発現が、安安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－０１９及びＺＦＨＤ－００７を有するＡＲＰＥ－１９細胞では、ＤＭＳＯ処理と比較してＡＣＺ処理を行った場合におよそ１．９倍増加したことを示した（図６Ｄ）。このデータは、ＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子が、ＡＲＰＥ－１９細胞中においてリガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得ることを示している。
これらの結果は、ＣＡ２ ＤＲＤを含む転写因子構築物を有する転写因子系が、ＡＲＰＥ－１９細胞中においてペイロード発現を制御し得ることを実証している。
実施例８：ＡＲＰＥ－１９細胞中におけるＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系の用量依存的活性
本実施例は、ＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド用量反応挙動を実証し、転写因子のタンパク質レベルについて分析した。本実施例の転写因子系を、実施例７で上に記載している。本実施例で示すように、転写因子タンパク質レベルをリガンド用量依存的に制御し得る。
細胞株：本実施例では、非形質導入（親）ＡＲＰＥ－１９細胞ならびに構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－０１９から作製したレンチウイルスの両方で形質導入したＡＲＰＥ－１９細胞を分析した。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞株を、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ－Ｆ１２培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：細胞を２４ウェルプレートに１５，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩接着させた。
１０点用量反応曲線の培地を調製するために、１０μＭアセタゾラミド（ＡＣＺ）を含む培地を、単純培地中において１：３の８段階希釈物で希釈した。用量反応曲線の第１０点では、培地を０．１％ＤＭＳＯで調製した。
培地をプレートから除去し、ＤＭＳＯ培地またはＡＣＺを含む培地のいずれかで置き換えた。親ＡＲＰＥ－１９ウェルの半分に、１０μＭ ＡＣＺを含む交換培地を入れた。親ＡＲＰＥ－１９ウェルの残りの半分に、０．１％ＤＭＳＯを含む交換培地を入れた。形質導入ＡＲＰＥ－１９細胞に、０．１％ＤＭＳＯまたは各用量のＡＣＺ（各条件について２～３ウェル）を含む交換培地を入れた。処理細胞を４８時間インキュベートした。細胞を、０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出して収集した。イムノブロット試料分析では、収集した細胞をペレット化し、培地を除去して、実施例４で上に記載したようなウェスタンブロットの手順まで細胞を－２０℃で保存した。
結果：ＡＣＺの濃度が高いほど、転写因子融合タンパク質のレベルが高くなった（図７Ａ～図７Ｂ）。このデータは、ＡＣＺがＣＡ２ ＤＲＤに機能的に連結した転写因子のタンパク質レベルを用量依存的に制御することを示している。
実施例９：Ｕ２ＯＳ細胞中におけるＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系の用量依存的活性
本実施例は、ＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド用量反応挙動を実証し、ペイロード発現について分析した。本実施例の転写因子系を、実施例７で上に記載している。本実施例で示すように、ペイロードの発現をリガンド用量依存的に制御し得る。
細胞株：本実施例では、構築物ＺＦＨＤ－０１９から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方で形質導入したＵ２ＯＳ細胞を分析した。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞を、３０％超の細胞を形質導入するのに十分なウイルスを添加して、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：細胞を２５，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。播種した細胞を一晩接着させた。
１０点用量反応曲線の培地を調製するために、１０μＭアセタゾラミド（ＡＣＺ）を含む培地を、単純培地中において１：３の８段階希釈物で希釈した。用量反応曲線の第１０点では、培地を０．１％ＤＭＳＯで調製した。
培地をプレートから除去し、０．１％ＤＭＳＯまたは各用量のＡＣＺ（各条件について２～３ウェル）を含む交換培地で置き換えた。処理細胞を４８時間インキュベートした。細胞を、０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出して収集した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁してフローサイトメトリーによって分析した。
結果：ＡＣＺの濃度が高いほど、ＭＦＩによって評価したようにペイロードのレベルが高くなった（図８）。ペイロード応答のＥＣ５０は１．１μＭであった。このデータは、ＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子が、ＡＣＺの異なる用量に応答して、ペイロードの発現を用量依存的に駆動し得ることを示している。
実施例１０：Ｊｕｒｋａｔ細胞中におけるＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む転写因子系のリガンド依存性活性
本実施例は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中における転写因子系のリガンド依存性活性を実証する。本実施例では、転写因子系を、（１）転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１核酸構築物ならびに（２）ペイロードをコードする第２核酸構築物を含む核酸構築物によってコードし、ペイロードの発現を、転写因子ＤＮＡ結合ドメインの結合部位を含む誘導性プロモーターによって駆動する（図９Ａ～図９Ｂ）。本実施例の転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインを、転写因子融合タンパク質として発現し、融合タンパク質をＣＡ２親タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結する。本明細書で示すように、制御した転写因子融合タンパク質は、リガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得る。
細胞株：本実施例では、構築物ＺＦＨＤ－０２２から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－０４８から作製したレンチウイルスの両方で形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を分析した。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞を、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：細胞を１ｅ６細胞／ウェルの密度で、１００μＬを９６ウェルＵ底プレートに播種した。２０μＭアセタゾラミド（ＡＣＺ）または０．２％ＤＭＳＯのいずれかを含む培地を、１００μＬで添加した。細胞を４８時間インキュベートして収集した。収集した細胞をペレット化し、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で洗浄し、形質導入マーカー抗体を含む細胞染色緩衝液中に再懸濁してインキュベートし、洗浄して１％ＱＳｏｌ（商標）緩衝液（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）を含む細胞染色緩衝液中に再懸濁して、フローサイトメトリーによって分析した。染色に使用した抗体は、１：１０００のＡＰＣ抗ラットＣＤ９０／マウスＣＤ９０．１（Ｔｈｙ－１．１）抗体及び１：１００のＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１抗マウスＣＤ９０．２（Ｔｈｙ－１．２）抗体であった。
結果：フローサイトメトリー分析は、ＧＦＰ中央蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した通り、ペイロード発現が、安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－０４８及びＺＦＨＤ－０２２を有し、ＡＣＺで処理したＪｕｒｋａｔ細胞では、ＤＭＳＯで処理した同じ細胞株と比較しておよそ２．１倍増加したことを示した（図９Ｃ）。このデータは、ＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子が、Ｊｕｒｋａｔ細胞中においてリガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得ることを示している。
実施例１１：ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子を含む単一ベクター転写因子系のリガンド依存性活性
本実施例は、単一の核酸構築物によってコードされる転写因子系のリガンド応答を実証する。本実施例では、２つの例示的な単一ベクター転写因子系を分析する（図１０Ａ～図１０Ｂ）。本実施例の両方の核酸構築物は各々、転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列、転写因子活性化ドメインをコードする核酸配列、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列、及びペイロードをコードする核酸配列を含み、ペイロードの発現を、転写因子ＤＮＡ結合ドメインの結合部位を含む誘導性プロモーターによって駆動する。本実施例の転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインを、転写因子融合タンパク質として発現し、融合タンパク質をｅｃＤＨＦＲ親タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結する。本明細書で示すように、細胞中における転写因子融合タンパク質のレベルをｅｃＤＨＦＲリガンドで制御し得る。さらに、制御した転写因子融合タンパク質は、リガンド依存的にペイロードの発現を誘導し得る。
細胞株：本実施例では、非形質導入（親）Ｕ２ＯＳ細胞及び以下の構築物から作製したレンチウイルスで形質導入したＵ２ＯＳ細胞を分析した：（１）ＺＦＨＤ－００５、（２）ＺＦＨＤ－００７、（３）構築物ＺＦＨＤ－００５から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方、（４）構築物ＺＦＨＤ－００５から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－０１０から作製したレンチウイルスの両方、（５）ＺＦＨＤ－０１２、ならびに（６）ＺＦＨＤ－０１８。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞株を、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：各細胞株を２４ウェルプレートの６～８ウェルに２５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。培地を除去し、１０μＭトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む１ｍＬの培地を各細胞株のウェルの半分に添加した。残りのウェルには、０．１％ＤＭＳＯを含む１ｍＬの培地を入れた。細胞を４８時間インキュベートし、収集のために０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出した。各処理条件の３つのウェルをフローサイトメトリーによって分析した。残存する試料を用いて、収集した細胞をペレット化し、培地を除去して細胞ペレットを後のイムノブロット分析のために－２０℃で保存した。
フローサイトメトリー：収集した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁してフローサイトメトリーによって分析した。
イムノブロットアッセイ：イムノブロットアッセイの手順は、実施例４で上に記載した通りに従った。
結果：イムノブロット分析によって、単一の核酸構築物（すなわち、本明細書で実証したような、ＺＦＨＤ－０１２またはＺＦＨＤ－０１８）に対応するレンチウイルスで形質導入した細胞が、ＤＭＳＯ処理と比較してＴＭＰ処理を行った場合により高いレベルの転写因子ポリペプチドを示したことが明らかとなった（図１０Ｃ～１０Ｄ）。このデータは、ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤに機能的に連結した転写因子のタンパク質レベルを、単一ベクター転写因子系においてｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤリガンドで制御し得ることを示している。
単一ベクター系は、中央蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した通り、ＤＭＳＯ処理と比較してＴＭＰ処理を行った場合にＧＦＰ発現の増加を示した（図１０Ｅ～１０Ｆ）。しかしながら、ペイロードの基底発現、ペイロードの誘導発現、及びＭＦＩの倍率変化は、２つのベクター系と比較して単一ベクター系では低かった。このデータは、ｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤ制御転写因子が、単一ベクター転写因子系においてリガンド依存的にペイロードのある程度の発現を誘導し得ることを示している。
本実施例は、単一ベクターからの転写因子及びペイロードの発現がリガンド依存性活性を示し得ることを示している。
実施例１２：Ｊｕｒｋａｔ細胞中におけるＣＡ２ ＤＲＤ制御転写因子を含む単一ベクター転写因子系のリガンド依存性活性
本実施例は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＡ２－ＤＲＤを含む単一ベクター転写因子系のリガンド応答を特徴付ける。本実施例では、転写因子系を、転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列、転写因子活性化ドメインをコードする核酸配列、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする核酸配列、及びペイロードをコードする核酸配列を含む核酸構築物によってコードし、ペイロードの発現を、転写因子ＤＮＡ結合ドメインの結合部位を含む誘導性プロモーターによって駆動する（図１１Ａ）。本実施例の転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子活性化ドメインを、転写因子融合タンパク質として発現し、融合タンパク質をＣＡ２親タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結する。構築物はまた、ペイロード配列に連結したポリアデニル化（ポリ－Ａ）シグナルも含む。
細胞株：本実施例では、以下の構築物から作製したレンチウイルスで形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞株を分析した：（１）ＺＦＨＤ－０２２、（２）Ｊｕｒｋａｔ ＺＨＦＤ－０３６、ならびに（３）構築物ＺＨＦＤ－０３６から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－０２２から作製したレンチウイルスの両方。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞株を、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：各細胞株を１ｅ６細胞／ウェルの密度で、１００μＬを９６ウェルＵ底プレートに播種した。２０μＭアセタゾラミド（ＡＣＺ）または０．２％ＤＭＳＯのいずれかを含む培地を、１００μＬで添加した。細胞を４８時間インキュベートして収集し、ペレット化して細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で洗浄し、形質導入マーカー抗体を含む細胞染色緩衝液中に再懸濁してインキュベートし、洗浄して１％ＱＳｏｌ（商標）緩衝液（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）を含む細胞染色緩衝液中に再懸濁して、フローサイトメトリーによって分析した。染色に使用した抗体は、１：１００のＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１抗マウスＣＤ９０．２（Ｔｈｙ－１．２）抗体であった。
結果：フローサイトメトリー分析は、非選別Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるポリ－Ａシグナルを含む単一ベクター転写因子系によるある程度のリガンド依存性活性を示した（図１１Ｂ）が、観察したリガンド依存性活性は、実施例１０に示したものなどの２つのベクター系と比較して低かった。
実施例１３：転写因子構築物バリアントの特徴付け
本実施例は、転写因子構築物の異なるバリアントを含む転写因子系のリガンド応答を特徴付ける。本実施例では、３つの転写因子構築物を研究している。３つの転写因子構築物は全て、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、転写因子活性化ドメイン、及びｅｃＤＨＦＲ親タンパク質に由来する薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする（図１２Ａ）。構築物ＺＦＨＤ－００５も上に例示し、これは転写因子活性化ドメインをコードする核酸配列の５’側にある転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列を含み、転写因子活性化ドメインそれ自体がＤＲＤをコードする核酸配列の５’側にある。構築物ＺＦＨＤ－００８は、ＤＲＤをコードする核酸配列の５’側にある転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ＤＲＤそれ自体が転写因子活性化ドメインをコードする核酸配列の５’側にある。構築物ＺＦＨＤ－００９は、構築物ＺＦＨＤ－００５と同じ配置を有する核酸配列を含み、転写因子活性化ドメインとＤＲＤとの間にリンカーをコードする核酸配列をさらに含む。本実施例における転写因子構築物を、同じペイロード構築物のＺＦＨＤ－００７を含む転写因子系の一部として分析した。本明細書で示すように、ｅｃＤＨＦＲ－ＤＲＤを含む３つの転写因子系は全て、リガンド依存的にペイロードの発現誘導を示す。
細胞株：本実施例では、非形質導入（親）Ｕ２ＯＳ細胞及び以下の構築物から作製したレンチウイルスで形質導入したＵ２ＯＳ細胞を分析した：（１）ＺＦＨＤ－００７、（２）構築物ＺＦＨＤ－００４から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方、（３）構築物ＺＦＨＤ－００５から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方、（４）構築物ＺＦＨＤ－００８から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方、ならびに（５）構築物ＺＦＨＤ－００９から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞株を、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：各細胞株を２４ウェルプレートの６～８ウェルに２５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。培地を除去し、１０μＭトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む１ｍＬの培地を各細胞株のウェルの半分に添加した。残りのウェルには、０．１％ＤＭＳＯを含む１ｍＬの培地を入れた。細胞を４８時間インキュベートし、収集のために０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出した。収集した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁してフローサイトメトリーによって分析した。
結果：本実施例におけるＤＲＤを含む３つの転写因子系の各々は、ＭＦＩによって測定したように、リガンド依存性のペイロード発現の誘導を達成した（図１２Ｂ）。試験した異なる細胞株にわたって観察した制御の順位分析は行わなかったが、そのような分析を、構築物のコピー数の違いを考慮した後で実施できた。
本実施例は、転写因子構築物バリアント（例えば、転写因子活性化ドメインをコードする核酸配列とＤＲＤをコードする核酸配列との間に位置するリンカーをコードする核酸配列を含むバリアントに加えて、転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列と転写因子活性化ドメインをコードする核酸配列との間に位置するＤＲＤをコードする核酸配列を含むバリアント）は、転写因子系におけるペイロードの発現をリガンド依存的に誘導し得る。
実施例１４：バリアントｅｃＤＨＦＲ制御転写因子構築物を有する転写因子系のリガンド依存性活性の時間経過
本実施例は、転写因子構築物の異なるバリアントを含む転写因子系のリガンド応答の時間経過を示す。本実施例では、実施例１３で上に記載した転写因子構築物ＺＦＨＤ－００５、ＺＦＨＤ－００８、及びＺＦＨＤ－００９を試験した。本実施例における転写因子構築物を、同じペイロード構築物のＺＦＨＤ－００７と組み合わせ、別個の転写因子系としてＵ２ＯＳ細胞中に導入した。本明細書で示すように、ｅｃＤＨＦＲ－ＤＲＤを含む３つの転写因子系は全て、リガンド依存的にペイロードの発現誘導を示し、経時的にペイロード発現の増加も示した。
細胞株：本実施例では、実施例１３で上に記載したものと同じ細胞株を分析した。１０％ＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：各細胞株を１２ウェルプレートに８０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。培地を除去し、１０μＭトリメトプリム（ＴＭＰ）または０．１％ＤＭＳＯのいずれかを含む交換培地を添加した。細胞を２４時間、４８時間、及び７２時間の時点でインキュベートした。各時点で、細胞を収集のために０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出した。ＴＭＰまたはＤＭＳＯの添加前に、０時間の時点でも収集した。収集した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁してフローサイトメトリーによって分析した。
結果：本実施例におけるＤＲＤを含む３つの転写因子系の各々は、示した時点でリガンド依存性のペイロード発現の誘導を示した（図１３）。ＤＭＳＯに対してＴＭＰで処理した条件に関するＭＦＩの倍率変化を表７に示す。
Figure 2023509770000039
表７及び図１３に示した通り、ＭＦＩの倍率変化は、７２時間の時間経過にわたって各転写因子系で増加した。このデータは、試験した転写因子構築物バリアントが、リガンドの添加後に転写因子系でペイロードの発現を誘導し続けることを示している。
実施例１５：ペイロード構築物配向バリアントの特徴付け
本実施例は、ペイロード構築物の異なるバリアントを含む転写因子系のリガンド応答を特徴付ける。本実施例では、２つのペイロード構築物を試験した（図１４Ａ～図１４Ｂ）。ペイロード構築物ＺＦＨＤ－００７は、プロモーター及び転写因子結合部位の３’側にあるペイロードドメインをコードする核酸配列を含む。ペイロード構築物ＺＦＨＤ－０１７は、ポリＡシグナルの３’側にあり、プロモーター及び転写因子結合部位の５’側にあるペイロードドメインをコードする核酸配列を含む。本実施例における２つのペイロード構築物を、同じ転写因子構築物のＺＦＨＤ－００５を含む転写因子系の一部として分析した。
細胞株：本実施例では、非形質導入（親）Ｕ２ＯＳ細胞及び以下の構築物から作製したレンチウイルスで形質導入したＵ２ＯＳ細胞を分析した：（１）ＺＦＨＤ－００５、（２）ＺＦＨＤ－００７、（３）構築物ＺＦＨＤ－００５から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００７から作製したレンチウイルスの両方、（４）ＺＦＨＤ－０１７、ならびに（５）構築物ＺＦＨＤ－００５から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－０１７から作製したレンチウイルスの両方。安定に組み込んだ構築物を有する形質導入細胞株を、実施例２に記載した方法に従って調製及び選択した。１０％ＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ培地中で細胞を培養した。
リガンド処理：各細胞株を２４ウェルプレートの６～８ウェルに２５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。培地を除去し、１０μＭトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む１ｍＬの培地を各細胞株のウェルの半分に添加した。残りのウェルには、０．１％ＤＭＳＯを含む１ｍＬの培地を入れた。細胞を４８時間インキュベートし、収集のために０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出した。収集した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁してフローサイトメトリーによって分析した。
結果：本実施例の両方の転写因子系は、ペイロード発現のリガンド依存性誘導を達成した（図１４Ｃ～図１４Ｄ）。構築物ＺＦＨＤ－０１７からのペイロードの発現は、構築物ＺＦＨＤ－００７からの発現と比較しておよそ１００分の１に減少した。これらの２つの例示した転写因子系からのペイロード発現の差を、図１４Ｃにおいて図１４Ｄと比較して１００倍スケールの差として図示する。
本実施例は、ペイロードドメインをコードする核酸配列をプロモーター及び転写因子結合部位の５’側に配置すること（例えば、ペイロード構築物ＺＦＨＤ－０１７と同様に）が、転写因子系のリガンドに応答してペイロード発現の誘導を維持することを実証しているが、ペイロードの発現は、プロモーター及び転写因子結合部位の３’側にあるペイロードドメインをコードする核酸配列を含むペイロード構築物（例えば、ペイロード構築物ＺＦＨＤ－００７と同様に）と比較して減少している。
実施例１６：分泌ＩＬ１２ペイロードを含む転写因子系のリガンド依存性活性
本実施例は、分泌ＩＬ１２ペイロードを含む転写因子系によるリガンド依存性応答を実証する。本実施例では、転写因子系は、実施例４で上に記載した転写因子構築物ＺＦＨＤ－００５、及び分泌ＩＬ１２をコードする核酸配列を含むペイロード構築物ＺＦＨＤ－０１３によってコードされる。
細胞株：本実施例では、非形質導入（親）Ｕ２ＯＳ細胞及び以下の構築物から作製したレンチウイルスで形質導入したＵ２ＯＳ細胞を分析した：（１）ＺＦＨＤ－０１３、（２）ＺＦＨＤ－００５、（３）構築物ＺＦＨＤ－０１３から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００４から作製したレンチウイルスの両方、ならびに（４）構築物ＺＦＨＤ－０１３から作製したレンチウイルス及び構築物ＺＦＨＤ－００５から作製したレンチウイルスの両方。
リガンド処理：各細胞株を２４ウェルプレートの６～８ウェルに２５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。培地を除去し、１０μＭトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む１ｍＬの培地を各細胞株のウェルの半分に添加した。残りのウェルには、０．１％ＤＭＳＯを含む１ｍＬの培地を入れた。細胞を７２時間インキュベートした。インキュベーション後、２００μＬの馴化培地を各ウェルから収集し、後のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）分析のために－２０℃で保存した。収集した上清を、ＩＬ１２ ＭＳＤバイオマーカーアッセイ（Ｖ－ＰＬＥＸ Ｐｌｕｓ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１２ｐ７０ Ｋｉｔ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって製造業者のプロトコールに従って分析した。
結果：安定に組み込んだ構築物ＺＦＨＤ－００５及びＺＦＨＤ－０１３を有する細胞は、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較してＴＭＰ処理を行った場合に分泌ＩＬ１２のレベル増加を示した（図１５）。このデータは、ＤＲＤ制御転写因子がリガンド依存的に分泌ＩＬ１２ペイロードの発現を誘導し得ることを実証している。
実施例１７：ｃ－Ｊｕｎ及びＦＯＸＰ３転写因子のリガンド依存性制御
本実施例は、上記実施例の操作した転写因子と比較して構造的に異なる２つの転写因子の制御を示す結果を提供する。本実施例は、本開示によるＤＲＤ－ＴＦ構築物の設計及び調製によって、ＤＲＤ技術を用いた構造的に多様な転写因子の制御が可能になることを実証している。
本実施例で試験した転写因子はｃ－Ｊｕｎ及びＦＯＸＰ３であって、その各々がＣＡ２親タンパク質に由来するＤＲＤに機能的に連結された。本実施例で試験したＤＲＤ－ＴＦ構築物、対応する対照構築物、及び構築物構成要素の説明を、表２に提供する。表２における構築物の各々のプロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターであった。表２に列挙した構築物を、表２の構築物に使用した導入ベクターがｐＥＬＮＳ（図１９及び配列番号：６９）であったことを除いて、実施例２に記載したクローニング方法に従って調製した。
細胞株：本実施例では、親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び次の構築物：（１）ｃｊｕｎ－００１、（２）ｃｊｕｎ－００２、（３）ｃｊｕｎ－００３、（４）ＦＯＸＰ３－０１３、（５）ＦＯＸＰ３－０１４、または（６）ＦＯＸＰ３－０１５のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を分析した。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中で培養し、以下の通りにトランスフェクトした：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を組織培養プレート上に播種し、増殖培地（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中で７０～８０％コンフルエントになるまで維持した。細胞を、上に記載したように調製した導入ベクターを用いて、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、培地を１００μＭアセタゾラミドまたは０．１％ＤＭＳＯのいずれかを含む増殖培地で置き換えた。２４時間後、イムノブロットアッセイのために細胞を収集した。
リガンド処理：各細胞株を１２または２４ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。培地を除去し、リガンドまたは０．１％ＤＭＳＯを含む１ｍＬの培地を添加した。細胞を２４時間インキュベートし、収集のために０．２５％トリプシンを用いてプレートから取り出した。収集した細胞をペレット化し、培地を除去して細胞ペレットを後のイムノブロットアッセイのために－２０℃で保存した。
イムノブロットアッセイ：細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液（Ｔ－ＰＥＲ（商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中に再懸濁した。細胞溶解物を、ベータ－メルカプトエタノールまたは還元試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有するＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に添加し、３００ｒｐｍで攪拌しながら９６℃で６分間インキュベートした。試料を、ＢＯＬＴ抗酸化剤を含むＢＯＬＴ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液中のＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、次の抗体：ウサギ抗ｃ－Ｊｕｎ抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ウサギ抗ＦｏｘＰ３抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、及びマウス抗チューブリン抗体（１：４０００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でプローブした。二次抗体は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤロバ抗マウス（１：４０００、ＬＩ－ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）またはＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷロバ抗ウサギ（１：３０００、ＬＩ－ＣＯＲ）であった。
分析：構築物を、マーカー（ｃＪｕｎ構築物の場合はｍＣｈｅｒｒｙ、ＦｏｘＰ３構築物の場合はＲＱＲ８）を共発現するように設計し、これらのマーカーをフローサイトメトリーによって定量化して、試料間のトランスフェクションまたは形質導入効率における差の正規化を可能にできた。ウェスタン分析と並行して、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、％ｍＣｈｅｒｒｙまたは％ＲＱＲ８陽性細胞を決定した。ウェスタンブロットを定量化し、シグナルを、フローサイトメトリーによって測定したようなチューブリンシグナル及び％ｍＣｈｅｒｒｙ陽性（ｃ－Ｊｕｎ構築物）または％ＲＱＲ８陽性（ＦｏｘＰ３構築物）を基準として正規化した。ＤＭＳＯを用いたｃＪｕｎ－００２またはＤＭＳＯを用いたＦＯＸＰ３－０１４の正規化したシグナルを１に設定した。
結果：ｃｊｕｎ－００２構築物を含むプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、コードした転写因子及びＤＲＤポリペプチドが、ＤＭＳＯ処理細胞と比較してリガンド処理細胞においてより高いレベルで存在したことを示した（図１６Ａ～図１６Ｂ）。比較すると、構築物ｃｊｕｎ－００１（野生型ＣＡ２構成要素を含む）またはｃｊｕｎ－００３（ＣＡ２構成要素を一切含まない）を含むプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をＤＭＳＯ及びリガンド処理条件の両方で検出したことを示し、２つの条件の間ではほとんど変化がなかった。
ＦＯＸＰ３－０１４構築物を含むプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、コードした転写因子及びＤＲＤポリペプチドが、ＤＭＳＯ処理細胞と比較してリガンド処理細胞においてより高いレベルで存在したことを示した（図１６Ｃ～図１６Ｄ）。比較すると、構築物ＦＯＸＰ３－０１３（野生型ＣＡ２構成要素を含む）またはＦＯＸＰ３－０１５（ＣＡ２構成要素を一切含まない）を含むプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３タンパク質をＤＭＳＯ及びリガンド処理条件の両方で検出したことを示し、２つの条件の間ではほとんど変化がなかった。
本実施例は、ＤＲＤに機能的に連結した構造的に多様な転写因子を含む転写因子構築物のリガンド依存性発現を実証した。これらのデータは、本開示の転写因子系のモジュール性に対する追加の裏付けを提供し、ＤＲＤに機能的に連結した異なる転写因子のタンパク質レベルがＤＲＤに対するリガンドで制御され得ることを裏付ける。したがって、本開示の転写因子系を、実施例１及び本開示の他の箇所で述べたものなどの操作した転写因子を含む、他の構造的に多様な転写因子を有するＤＲＤ－ＴＦ構築物を含むように設計できる。
実施例１８：Ｊｕｒｋａｔ細胞中に安定に組み込んだｃ－Ｊｕｎ転写因子構築物のリガンド依存性制御
本実施例は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中に安定に組み込んだ後のｃ－Ｊｕｎ転写因子構築物のリガンド依存性制御を実証する。実施例１７で上に記載したように導入ベクターで調製した構築物ｃｊｕｎ－００１及びｃｊｕｎ－００２を試験して比較した。
細胞株：本実施例では、非形質導入（親）Ｊｕｒｋａｔ細胞ならびに構築物ｃｊｕｎ－００１及びｃｊｕｎ－００２から作製したレンチウイルスで形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を分析した。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中で細胞を培養した。細胞を形質導入後８日間培養し、次いで６ウェルプレートに播種して、１００μＭアセタゾラミドまたは０．１％ＤＭＳＯのいずれかで処理した。２４時間後、イムノブロットアッセイのために細胞を収集した。
イムノブロットアッセイ：イムノブロットアッセイの手順は、実施例１７で上に記載した通りに従った。以下の抗体を使用した：ウサギ抗ｃ－Ｊｕｎ抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ウサギ抗ホスホ－ｃ－Ｊｕｎ抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、及びマウス抗チューブリン抗体（１：４０００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。二次抗体は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤロバ抗マウス（１：４０００、ＬＩ－ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）またはＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷロバ抗ウサギ（１：３０００、ＬＩ－ＣＯＲ）であった。
分析：イムノブロットシグナルの定量化を、実施例１７に記載したように％ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を基準として正規化した。
結果：構築物ｃｊｕｎ－００２から作製したレンチウイルスで形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞は、コードしたｃ－Ｊｕｎ及びＤＲＤポリペプチドが、ＤＭＳＯ処理細胞と比較してリガンド処理細胞においてより高いレベルで存在したことを示した（図１７Ａ～図１７Ｂ）。対応するｃ－Ｊｕｎリン酸化の増加もリガンド処理で観察した。比較すると、親Ｊｕｒｋａｔ細胞及び構築物ｃｊｕｎ－００１から作製したレンチウイルスで形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞は、ｃ－Ｊｕｎ及びリン酸化ｃ－ＪｕｎをＤＭＳＯ及びリガンド処理条件の両方で検出したことを示し、２つの条件の間ではほとんど変化がなかった。このデータは、ＤＲＤに機能的に連結した転写因子のタンパク質レベルをＤＲＤのリガンドで制御し得ることを裏付けている。
実施例１９：がんまたは自己免疫疾患の処置
本実施例は、疾患の処置または予防を、それを必要とする対象において行うために、上記の詳細な説明に記載した転写因子系の原理及び構成要素を適用する例示的な方法を示す。転写因子系の用途及び使用を、本開示の「用途及び使用」節などにおいて上に記載した様々な方法に適用できるが、本実施例は、がんまたは自己免疫疾患を有する対象の処置方法を実証する。
転写因子系またはその構成要素を用いるがんまたは自己免疫疾患を処置または予防する様々な方法を上に提供する。本実施例の例示的な方法は、以下を含む：（ａ）細胞集団を提供すること、（ｂ）少なくとも１つの核酸分子を細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、得られた細胞（複数可）が転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せを含むことになること、（ｃ）得られた細胞（複数可）を対象に送達すること、及び（ｄ）転写因子系のポリヌクレオチドによってコードされるＤＲＤを安定化させるリガンドを対象に投与すること。以下は、例示した方法のこれらの（ａ）～（ｄ）部分の各々に関する追加の詳細である。以下の追加の詳細は、本実施例の方法の各部分をより具体的に提供するが、これらの特定の詳細は、本開示による疾患の処置方法または予防方法で用いられてよい各部分（ａ）～（ｄ）の他の変化形態を限定するものと解釈されるべきではなく、その変化形態を上記の詳細な説明でさらに詳述している。
Ａ．細胞集団を提供すること：
自己または同種免疫細胞の集団を提供する。細胞を、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から選択してよい。集団が自己細胞である場合、細胞は処置される対象に由来し、単離及び処理後に細胞を同じ対象に投与する。集団が同種細胞である場合、細胞を、処置される対象以外のドナー対象から単離及び／または調製する。対象から細胞を得る方法は当該技術分野において既知であり、白血球アフェレーシスによる末梢血Ｔ細胞の単離または切除した腫瘍からのＴＩＬの単離を含んでよい。
Ｂ．少なくとも１つの核酸分子を細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入すること：核酸分子を細胞中に導入する様々な方法が利用可能であり、ウイルス性及び非ウイルス性の送達方法ならびに上に記載した、例えば、上記の詳細な説明の「投薬、送達及び投与」節などにおける他の方法を含む。本実施例では、送達方法は、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターから選択した１つ以上のウイルスベクターによる送達であってよい。
送達が成功すると、得られた細胞（複数可）は、転写因子系の１つ以上のポリヌクレオチドの組合せを含むことになる。本実施例では、１つ以上のポリヌクレオチドの組合せは、以下を含む：転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列（転写因子活性化ドメイン及び／または転写因子ＤＮＡ結合ドメインが、ＤＲＤに機能的に連結される）、ならびにがんまたは自己免疫疾患を処置する目的のタンパク質（「ペイロード」とも称される）をコードする第４核酸配列（第４核酸配列は、特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される）。第１、第２、第３、及び第４核酸配列を含むポリヌクレオチドを、単一のベクターまたは複数のベクター、例えば、第１、第２、及び第３核酸配列を含む第１ベクターならびに第４核酸配列を含む第２ベクターなどで細胞に送達してよい。
コードした転写因子活性化ドメイン、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）、及び目的のタンパク質を別個に選択してよい。転写因子系のこれらの構成要素を選択するモジュール性に関する追加の詳細を、本開示全体を通して他の箇所に提供する。本実施例では、ペイロードは、サイトカイン、抗体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から選択してよい治療用タンパク質である。サイトカインペイロードとしては、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、またはそれらのサイトカインの膜結合型を含む、そのバリアントが挙げられる。
Ｃ．得られた細胞（複数可）を対象に送達すること：
細胞を対象に送達する方法は当該技術分野において既知であり、「投与」節などにおける詳細な説明で上に提供した方法を含む。本実施例では、細胞を注入によって対象に送達してよい。
Ｄ．リガンドを対象に投与すること
対象に対して治療効果を達成するために、ＤＲＤを安定化させるリガンドを対象に投与する。例示的な本方法の部分（Ｂ）で上に記載した通り、転写因子活性化ドメイン及び／または転写因子ＤＮＡ結合ドメインはＤＲＤに機能的に連結される。リガンドを対象に投与し、リガンドが転写因子活性化ドメイン及び転写因子ＤＮＡ結合ドメインの発現を可能にするのに十分なほどＤＲＤを安定化し、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量でそれが行われるようにする。したがって、目的のタンパク質の発現を、対象におけるリガンドの存在によって制御する。リガンドを、治療有効量の目的のタンパク質を生成するのに十分な量及び／または持続時間で対象に投与すべきである。ＡＣＺをリガンドとしてｈＣＡ２ ＤＲＤと共に使用してよく、メトトレキサートをｈＤＨＦＲ ＤＲＤと共に使用してよく、トリメトプリムをｅｃＤＨＦＲ ＤＲＤと共に使用してよい。リガンドを、治療有効量の目的のタンパク質を生成するのに効果的な任意の量及び任意の投与経路を使用して、対象または細胞に投与してよい。リガンドの１日の総投与量を、妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定してよい。
本実施例によって示す通り、本明細書に記載した転写因子系を使用して、がんまたは自己免疫疾患を有する対象を処置するために治療用ペイロードを送達及び制御し得る。すでに上で述べた通り、提供した方法及び他の方法の変化形態もまた、本開示の転写因子系の適用のために企図される。
本開示は、いくつかの記載された実施形態に関してある程度の長さ及びある程度の特殊性をもって記載されてきたが、そのような任意の詳細もしくは実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきであると意図するものではなく、添付の特許請求の範囲を参照し、先行技術に照らしてそのような請求項の最も幅広く可能な解釈を提供することにより、意図される本開示の範囲を効果的に包含するように解釈されるべきである。
節の見出し、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
本開示はまた、本明細書に記載される組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
第１ポリヌクレオチドを含む改変細胞であって、前記第１ポリヌクレオチドが、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、
前記転写因子活性化ドメイン、前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが相互作用して、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると第４核酸配列の転写を活性化できる転写因子を形成し、
前記第４核酸配列が目的のタンパク質をコードし、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される、前記改変細胞。
（項目２）
第１ポリヌクレオチドを含む改変細胞であって、前記第１ポリヌクレオチドが、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、
前記転写因子活性化ドメイン、前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが相互作用して、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると第４核酸配列の転写を活性化できる転写因子を形成し、
前記第４核酸配列が目的のタンパク質をコードし、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に機能的に連結される、前記改変細胞。
（項目３）
前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される、項目２に記載の改変細胞。
（項目４）
前記目的のタンパク質が異種タンパク質である、項目１～３のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目５）
前記第４核酸配列が、前記第１ポリヌクレオチド上に位置する、項目１～４のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目６）
第２ポリヌクレオチドをさらに含み、前記第２ポリヌクレオチドが前記第４核酸配列を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目７）
前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが、ＺＦＨＤ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、及びＴＡＬからなる群から選択される親タンパク質に由来する、項目１～６のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目８）
前記転写因子活性化ドメインが親タンパク質に由来し、前記親タンパク質がｐ６５である、項目１～７のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目９）
薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１核酸配列及び転写因子をコードする第２核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む改変細胞であって、前記転写因子が前記ＤＲＤに機能的に連結され、
前記転写因子が、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、目的のタンパク質をコードする第３核酸配列の転写を活性化でき、前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される、前記改変細胞。
（項目１０）
薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１核酸配列及び転写因子をコードする第２核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む改変細胞であって、前記転写因子が前記ＤＲＤに機能的に連結され、
前記転写因子が、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、目的のタンパク質をコードする第３核酸配列の転写を活性化でき、前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に機能的に連結される、前記改変細胞。
（項目１１）
前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される、項目１０に記載の改変細胞。
（項目１２）
前記目的のタンパク質が異種タンパク質である、項目９～１１いずれか１項に記載の改変細胞。
（項目１３）
前記第３核酸配列が、前記第１核酸配列及び前記第２核酸配列を含む前記ポリヌクレオチド上に位置する、項目９～１２のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目１４）
前記第３核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドをさらに含む、項目９～１２のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目１５）
前記ＤＲＤが、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＦＲ（ｅｃＤＨＦＲ）、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５を含む群から選択される親タンパク質に由来する、項目１～１４のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目１６）
前記ＤＲＤが、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドの存在下で安定化する、項目１～１５のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目１７）
前記目的のタンパク質が野生型タンパク質である、項目１～１６のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目１８）
前記目的のタンパク質が治療用タンパク質である、項目１～１７のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目１９）
前記目的のタンパク質が、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される、項目１８に記載の改変細胞。
（項目２０）
前記目的のタンパク質が、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される、項目１～１７のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目２１）
前記目的のタンパク質が分泌タンパク質である、項目１～１７のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目２２）
前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目２３）
前記細胞が、幹細胞、肝臓細胞、血液細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼細胞、筋細胞、または骨細胞である、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変細胞。
（項目２４）
核酸分子であって、
ａ．特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１核酸配列と、
ｂ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列と
を含む、前記核酸分子。
（項目２５）
ｃ．転写因子活性化ドメインをコードする第３核酸配列をさらに含み、（ｉ）前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが前記ＤＲＤに機能的に連結されるか、（ｉｉ）前記転写因子活性化ドメインが前記ＤＲＤに機能的に連結されるか、または（ｉｉｉ）前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び前記転写因子活性化ドメインの組合せが、前記ＤＲＤに機能的に連結されるかのいずれかである、項目２４に記載の核酸分子。
（項目２６）
ｄ．目的のタンパク質をコードする第４核酸配列をさらに含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される、項目２４または２５に記載の核酸分子。
（項目２７）
前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが、ＺＦＨＤ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、及びＴＡＬからなる群から選択される親タンパク質に由来する、項目２４～２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２８）
前記転写因子活性化ドメインが親タンパク質に由来し、前記親タンパク質がｐ６５である、項目２４～２７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２９）
核酸分子であって、
ａ．特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化できる転写因子をコードする第１核酸配列と、
ｂ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列と
を含み、前記転写因子が前記ＤＲＤに機能的に連結される、前記核酸分子。
（項目３０）
ｃ．目的のタンパク質をコードする第３核酸配列をさらに含み、前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される、項目２９に記載の核酸分子。
（項目３１）
前記ＤＲＤが、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５を含む群から選択される親タンパク質に由来する、項目２４～３０のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３２）
前記ＤＲＤが、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドの存在下で安定化する、項目２４～３１のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３３）
前記目的のタンパク質が野生型タンパク質である、項目２６～２８または３０～３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３４）
前記目的のタンパク質が治療用タンパク質である、項目２６～２８または３０～３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３５）
前記目的のタンパク質が、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される、項目３４に記載の核酸分子。
（項目３６）
前記目的のタンパク質が、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される、項目２６～２８または３０～３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３７）
前記目的のタンパク質が分泌タンパク質である、項目２６～２８または３０～３２に記載の核酸分子。
（項目３８）
項目２４～３７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（項目３９）
前記ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、項目３８に記載のベクター。
（項目４０）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスに由来する、項目３９に記載のベクター。
（項目４１）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、項目３９に記載のベクター。
（項目４２）
第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドであって、前記第１ポリヌクレオチドが、
転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び
薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、前記転写因子活性化ドメイン、前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
前記第２ポリヌクレオチドが、
目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結され、
前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが相互作用して、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると転写を活性化できる転写因子を形成し、前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドが、各々単一のベクターに担持されるか、または前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドが別々のベクターに担持される、前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチド。
（項目４３）
第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドであって、前記第１ポリヌクレオチドが、
転写因子をコードする第１核酸配列及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含み、前記転写因子が前記ＤＲＤに機能的に連結され、前記転写因子が、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると転写を活性化でき、
前記第２ポリヌクレオチドが、
目的のタンパク質をコードする第３核酸配列を含み、前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結され、
前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドが、各々単一のベクターに担持されるか、または前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドが別々のベクターに担持される、前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチド。
（項目４４）
前記ＤＲＤが、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５を含む群から選択される親タンパク質に由来する、項目４２または４３に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
（項目４５）
前記ＤＲＤが、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドの存在下で安定化する、項目４２～４４のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
（項目４６）
前記目的のタンパク質が野生型タンパク質である、項目４２～４５のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
（項目４７）
前記目的のタンパク質が治療用タンパク質である、項目４２～４５のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
（項目４８）
前記目的のタンパク質が、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される、項目４７に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
（項目４９）
前記目的のタンパク質が、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される、項目４２～４５のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
（項目５０）
前記目的のタンパク質が分泌タンパク質である、項目４２～４５のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
（項目５１）
改変細胞の作製方法であって、前記方法が、
ａ．特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１核酸配列と、
ｂ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列と
を含む核酸分子を細胞中に導入することを含む、前記方法。
（項目５２）
前記核酸分子が、転写因子活性化ドメインをコードする第３核酸配列をさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
（ｉ）前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが前記ＤＲＤに機能的に連結されるか、（ｉｉ）前記転写因子活性化ドメインが前記ＤＲＤに機能的に連結されるか、または（ｉｉｉ）前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び前記転写因子活性化ドメインの組合せが、前記ＤＲＤに機能的に連結されるかのいずれかである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を、前記細胞中に導入することをさらに含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記目的のタンパク質が異種タンパク質である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記第４核酸配列が、前記第１核酸配列、前記第２核酸配列及び前記第３核酸配列と同じ核酸分子上にある、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５７）
前記第４核酸配列が、前記第１核酸配列、前記第２核酸配列及び前記第３核酸配列とは異なる核酸分子上にある、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５８）
前記目的のタンパク質が、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される、項目５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
前記目的のタンパク質が、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される、項目５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記目的のタンパク質が分泌タンパク質である、項目５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記核酸分子が、プラスミドまたはウイルスベクターによって前記細胞中に導入される、項目５１～６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスに由来する、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記核酸分子が、非ウイルス送達方法によって前記細胞中に導入される、項目５１～６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、項目５１～６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記細胞が、幹細胞、肝臓細胞、血液細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼細胞、筋細胞、または骨細胞である、項目５１～６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
疾患の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、
ａ．細胞集団を提供すること、
ｂ．少なくとも１つの核酸分子を前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、前記少なくとも１つの核酸分子が、
ｉ．転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドを含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
ｉｉ．前記疾患、またはその症状を予防または処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドを含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、
ｃ．前記細胞を前記対象に送達すること、ならびに
ｄ．前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つの発現を可能にするのに十分なほど前記ＤＲＤを安定化させるリガンドを、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、前記細胞中で前記目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で前記対象に投与し、
前記目的のタンパク質の発現が、前記対象において前記リガンドの存在によって制御され、リガンド投与の前記量及び／または持続時間が、治療有効量の前記目的のタンパク質を生成するのに十分であることを含む、前記方法。
（項目６８）
疾患の処置または予防を必要とする対象への改変細胞の導入方法であって、前記方法が、
ａ．細胞集団を提供すること、
ｂ．少なくとも１つの核酸分子を前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、前記少なくとも１つの核酸分子が、
ｉ．転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドを含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
ｉｉ．前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドを含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、ならびに
ｃ．前記細胞を前記対象に送達することを含む、前記方法。
（項目６９）
疾患の処置または予防を必要とする対象への改変細胞の導入方法であって、前記方法が、
ａ．細胞集団を提供すること、
ｂ．項目２４～３７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子または項目４２～５０のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを、前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入すること、ならびに
ｃ．前記細胞を前記対象に送達することを含む、前記方法。
（項目７０）
疾患の処置または予防を必要とする対象中における１つ以上の細胞の遺伝子改変方法であって、前記方法が、
ａ．少なくとも１つの核酸分子を前記対象の少なくとも１つの細胞中に導入し、前記少なくとも１つの核酸分子が、
ｉ．転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドを含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記細胞内での発現時に前記ＤＲＤに機能的に連結され、
ｉｉ．前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドを含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されることを含む、前記方法。
（項目７１）
疾患の処置または予防を必要とする対象中における１つ以上の細胞の遺伝子改変方法であって、前記方法が、
ａ．少なくとも１つの核酸分子を前記対象の少なくとも１つの細胞中に導入し、前記少なくとも１つの核酸分子が、
ｉ．転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドを含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記細胞内での発現時に前記ＤＲＤに機能的に連結され、
ｉｉ．前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドを含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、ならびに
ｂ．前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つの発現を可能にするのに十分なほど前記ＤＲＤを安定化させるリガンドを、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、前記細胞中で前記目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で前記対象に投与し、
前記目的のタンパク質の発現が、前記対象において前記リガンドの存在によって制御され、リガンド投与の前記量及び／または持続時間が、治療有効量の前記目的のタンパク質を生成するのに十分であることを含む、前記方法。
（項目７２）
疾患の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、
ａ．細胞集団を提供すること、
ｂ．第１核酸分子のうち少なくとも１つ及び第２核酸分子のうち少なくとも１つを、前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、
ｉ．前記第１核酸分子が、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記細胞内での発現時に前記ＤＲＤに機能的に連結され、
ｉｉ．前記第２核酸分子が、前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、
ｃ．前記細胞を前記対象に送達すること、ならびに
ｄ．前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインの発現を可能にするのに十分なほど前記ＤＲＤを安定化させるリガンドを、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、前記細胞中で前記目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で前記対象に投与し、
前記目的のタンパク質の発現が、前記対象において前記リガンドの存在によって制御され、リガンド投与の前記量及び／または持続時間が、治療有効量の前記目的のタンパク質を生成するのに十分であることを含む、前記方法。
（項目７３）
疾患の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、
ａ．細胞集団を提供すること、
ｂ．第１核酸分子のうち少なくとも１つ及び第２核酸分子のうち少なくとも１つを、前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、
ｉ．前記第１核酸分子が、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記細胞内での発現時に前記ＤＲＤに機能的に連結され、
ｉｉ．前記第２核酸分子が、前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、ならびに
ｃ．前記細胞を前記対象に送達することを含む、前記方法。
（項目７４）
前記核酸分子が、プラスミドまたはウイルスベクターによって前記細胞中に導入される、項目６７～７３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７５）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスに由来する、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
前記核酸分子が、非ウイルス送達方法によって前記細胞中に導入される、項目６７～７３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７８）
細胞中における目的のタンパク質の調節可能な発現のための系であって、前記系が、
ａ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に連結される転写因子をコードする第１ポリヌクレオチドであって、前記転写因子が、前記目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を選択的に転写する、前記第１ポリヌクレオチド、
ｂ．前記目的のタンパク質をコードする核酸配列の上流に隣接して配置された外因性転写因子結合部位を含む第２ポリヌクレオチド、
ｃ．前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドを前記細胞のゲノム中に安定に組み込むような条件下で、前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドを前記細胞中に導入すること、
ｄ．前記ＤＲＤを安定化させるリガンドを添加することによって前記転写因子の発現を調節すること
を含み、
前記転写因子が、前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列の上流に隣接して配置された転写因子結合部位に特異的に結合し、前記目的のタンパク質の前記発現が、前記細胞中に存在する前記転写因子の量によって制御される、前記系。

Claims (78)

  1. 第１ポリヌクレオチドを含む改変細胞であって、前記第１ポリヌクレオチドが、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、
    前記転写因子活性化ドメイン、前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが相互作用して、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると第４核酸配列の転写を活性化できる転写因子を形成し、
    前記第４核酸配列が目的のタンパク質をコードし、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される、前記改変細胞。
  2. 第１ポリヌクレオチドを含む改変細胞であって、前記第１ポリヌクレオチドが、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、
    前記転写因子活性化ドメイン、前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが相互作用して、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると第４核酸配列の転写を活性化できる転写因子を形成し、
    前記第４核酸配列が目的のタンパク質をコードし、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に機能的に連結される、前記改変細胞。
  3. 前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される、請求項２に記載の改変細胞。
  4. 前記目的のタンパク質が異種タンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の改変細胞。
  5. 前記第４核酸配列が、前記第１ポリヌクレオチド上に位置する、請求項１～４のいずれか１項に記載の改変細胞。
  6. 第２ポリヌクレオチドをさらに含み、前記第２ポリヌクレオチドが前記第４核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の改変細胞。
  7. 前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが、ＺＦＨＤ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、及びＴＡＬからなる群から選択される親タンパク質に由来する、請求項１～６のいずれか１項に記載の改変細胞。
  8. 前記転写因子活性化ドメインが親タンパク質に由来し、前記親タンパク質がｐ６５である、請求項１～７のいずれか１項に記載の改変細胞。
  9. 薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１核酸配列及び転写因子をコードする第２核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む改変細胞であって、前記転写因子が前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    前記転写因子が、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、目的のタンパク質をコードする第３核酸配列の転写を活性化でき、前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される、前記改変細胞。
  10. 薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１核酸配列及び転写因子をコードする第２核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む改変細胞であって、前記転写因子が前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    前記転写因子が、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、目的のタンパク質をコードする第３核酸配列の転写を活性化でき、前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に機能的に連結される、前記改変細胞。
  11. 前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結される、請求項１０に記載の改変細胞。
  12. 前記目的のタンパク質が異種タンパク質である、請求項９～１１いずれか１項に記載の改変細胞。
  13. 前記第３核酸配列が、前記第１核酸配列及び前記第２核酸配列を含む前記ポリヌクレオチド上に位置する、請求項９～１２のいずれか１項に記載の改変細胞。
  14. 前記第３核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載の改変細胞。
  15. 前記ＤＲＤが、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＦＲ（ｅｃＤＨＦＲ）、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５を含む群から選択される親タンパク質に由来する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の改変細胞。
  16. 前記ＤＲＤが、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドの存在下で安定化する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の改変細胞。
  17. 前記目的のタンパク質が野生型タンパク質である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の改変細胞。
  18. 前記目的のタンパク質が治療用タンパク質である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変細胞。
  19. 前記目的のタンパク質が、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の改変細胞。
  20. 前記目的のタンパク質が、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変細胞。
  21. 前記目的のタンパク質が分泌タンパク質である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変細胞。
  22. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変細胞。
  23. 前記細胞が、幹細胞、肝臓細胞、血液細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼細胞、筋細胞、または骨細胞である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変細胞。
  24. 核酸分子であって、
    ａ．特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１核酸配列と、
    ｂ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列と
    を含む、前記核酸分子。
  25. ｃ．転写因子活性化ドメインをコードする第３核酸配列をさらに含み、（ｉ）前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが前記ＤＲＤに機能的に連結されるか、（ｉｉ）前記転写因子活性化ドメインが前記ＤＲＤに機能的に連結されるか、または（ｉｉｉ）前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び前記転写因子活性化ドメインの組合せが、前記ＤＲＤに機能的に連結されるかのいずれかである、請求項２４に記載の核酸分子。
  26. ｄ．目的のタンパク質をコードする第４核酸配列をさらに含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される、請求項２４または２５に記載の核酸分子。
  27. 前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが、ＺＦＨＤ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、及びＴＡＬからなる群から選択される親タンパク質に由来する、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
  28. 前記転写因子活性化ドメインが親タンパク質に由来し、前記親タンパク質がｐ６５である、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の核酸分子。
  29. 核酸分子であって、
    ａ．特定のポリヌクレオチド結合部位に結合して転写を活性化できる転写因子をコードする第１核酸配列と、
    ｂ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列と
    を含み、前記転写因子が前記ＤＲＤに機能的に連結される、前記核酸分子。
  30. ｃ．目的のタンパク質をコードする第３核酸配列をさらに含み、前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される、請求項２９に記載の核酸分子。
  31. 前記ＤＲＤが、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５を含む群から選択される親タンパク質に由来する、請求項２４～３０のいずれか１項に記載の核酸分子。
  32. 前記ＤＲＤが、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドの存在下で安定化する、請求項２４～３１のいずれか１項に記載の核酸分子。
  33. 前記目的のタンパク質が野生型タンパク質である、請求項２６～２８または３０～３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  34. 前記目的のタンパク質が治療用タンパク質である、請求項２６～２８または３０～３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  35. 前記目的のタンパク質が、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される、請求項３４に記載の核酸分子。
  36. 前記目的のタンパク質が、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される、請求項２６～２８または３０～３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  37. 前記目的のタンパク質が分泌タンパク質である、請求項２６～２８または３０～３２に記載の核酸分子。
  38. 請求項２４～３７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  39. 前記ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項３８に記載のベクター。
  40. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスに由来する、請求項３９に記載のベクター。
  41. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３９に記載のベクター。
  42. 第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドであって、前記第１ポリヌクレオチドが、
    転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び
    薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、前記転写因子活性化ドメイン、前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン、または前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインの組合せのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    前記第２ポリヌクレオチドが、
    目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結され、
    前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが相互作用して、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると転写を活性化できる転写因子を形成し、前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドが、各々単一のベクターに担持されるか、または前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドが別々のベクターに担持される、前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチド。
  43. 第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドであって、前記第１ポリヌクレオチドが、
    転写因子をコードする第１核酸配列及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列を含み、前記転写因子が前記ＤＲＤに機能的に連結され、前記転写因子が、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合すると転写を活性化でき、
    前記第２ポリヌクレオチドが、
    目的のタンパク質をコードする第３核酸配列を含み、前記第３核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結され、
    前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドが、各々単一のベクターに担持されるか、または前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドが別々のベクターに担持される、前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチド。
  44. 前記ＤＲＤが、ヒト炭酸脱水酵素２（ＣＡ２）、ヒトＤＨＦＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５を含む群から選択される親タンパク質に由来する、請求項４２または４３に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
  45. 前記ＤＲＤが、アセタゾラミド（ＡＣＺ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、及びトリメトプリム（ＴＭＰ）を含む群から選択されるリガンドの存在下で安定化する、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
  46. 前記目的のタンパク質が野生型タンパク質である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
  47. 前記目的のタンパク質が治療用タンパク質である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
  48. 前記目的のタンパク質が、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される、請求項４７に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
  49. 前記目的のタンパク質が、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
  50. 前記目的のタンパク質が分泌タンパク質である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチド。
  51. 改変細胞の作製方法であって、前記方法が、
    ａ．特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第１核酸配列と、
    ｂ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２核酸配列と
    を含む核酸分子を細胞中に導入することを含む、前記方法。
  52. 前記核酸分子が、転写因子活性化ドメインをコードする第３核酸配列をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  53. （ｉ）前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインが前記ＤＲＤに機能的に連結されるか、（ｉｉ）前記転写因子活性化ドメインが前記ＤＲＤに機能的に連結されるか、または（ｉｉｉ）前記転写因子ＤＮＡ結合ドメイン及び前記転写因子活性化ドメインの組合せが、前記ＤＲＤに機能的に連結されるかのいずれかである、請求項５２に記載の方法。
  54. 目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を、前記細胞中に導入することをさらに含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む誘導性プロモーターに機能的に連結される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記目的のタンパク質が異種タンパク質である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記第４核酸配列が、前記第１核酸配列、前記第２核酸配列及び前記第３核酸配列と同じ核酸分子上にある、請求項５４または５５に記載の方法。
  57. 前記第４核酸配列が、前記第１核酸配列、前記第２核酸配列及び前記第３核酸配列とは異なる核酸分子上にある、請求項５４または５５に記載の方法。
  58. 前記目的のタンパク質が、サイトカイン、抗体、凝固因子、酵素、遺伝子編集タンパク質、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）からなる群から選択される、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記目的のタンパク質が、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、及びＣｒｅからなる群から選択される、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記目的のタンパク質が分泌タンパク質である、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記核酸分子が、プラスミドまたはウイルスベクターによって前記細胞中に導入される、請求項５１～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスに由来する、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
  64. 前記核酸分子が、非ウイルス送達方法によって前記細胞中に導入される、請求項５１～６０のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項５１～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記細胞が、幹細胞、肝臓細胞、血液細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼細胞、筋細胞、または骨細胞である、請求項５１～６４のいずれか１項に記載の方法。
  67. 疾患の処置または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、
    ａ．細胞集団を提供すること、
    ｂ．少なくとも１つの核酸分子を前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、前記少なくとも１つの核酸分子が、
    ｉ．転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドを含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    ｉｉ．前記疾患、またはその症状を予防または処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドを含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、
    ｃ．前記細胞を前記対象に送達すること、ならびに
    ｄ．前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つの発現を可能にするのに十分なほど前記ＤＲＤを安定化させるリガンドを、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、前記細胞中で前記目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で前記対象に投与し、
    前記目的のタンパク質の発現が、前記対象において前記リガンドの存在によって制御され、リガンド投与の前記量及び／または持続時間が、治療有効量の前記目的のタンパク質を生成するのに十分であることを含む、前記方法。
  68. 疾患の処置または予防を必要とする対象への改変細胞の導入方法であって、前記方法が、
    ａ．細胞集団を提供すること、
    ｂ．少なくとも１つの核酸分子を前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、前記少なくとも１つの核酸分子が、
    ｉ．転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドを含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    ｉｉ．前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドを含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、ならびに
    ｃ．前記細胞を前記対象に送達することを含む、前記方法。
  69. 疾患の処置または予防を必要とする対象への改変細胞の導入方法であって、前記方法が、
    ａ．細胞集団を提供すること、
    ｂ．請求項２４～３７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子または請求項４２～５０のいずれか１項に記載の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを、前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入すること、ならびに
    ｃ．前記細胞を前記対象に送達することを含む、前記方法。
  70. 疾患の処置または予防を必要とする対象中における１つ以上の細胞の遺伝子改変方法であって、前記方法が、
    ａ．少なくとも１つの核酸分子を前記対象の少なくとも１つの細胞中に導入し、前記少なくとも１つの核酸分子が、
    ｉ．転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドを含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記細胞内での発現時に前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    ｉｉ．前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドを含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されることを含む、前記方法。
  71. 疾患の処置または予防を必要とする対象中における１つ以上の細胞の遺伝子改変方法であって、前記方法が、
    ａ．少なくとも１つの核酸分子を前記対象の少なくとも１つの細胞中に導入し、前記少なくとも１つの核酸分子が、
    ｉ．転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含む第１ポリヌクレオチドを含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記細胞内での発現時に前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    ｉｉ．前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含む第２ポリヌクレオチドを含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、ならびに
    ｂ．前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つの発現を可能にするのに十分なほど前記ＤＲＤを安定化させるリガンドを、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、前記細胞中で前記目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で前記対象に投与し、
    前記目的のタンパク質の発現が、前記対象において前記リガンドの存在によって制御され、リガンド投与の前記量及び／または持続時間が、治療有効量の前記目的のタンパク質を生成するのに十分であることを含む、前記方法。
  72. 疾患の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、
    ａ．細胞集団を提供すること、
    ｂ．第１核酸分子のうち少なくとも１つ及び第２核酸分子のうち少なくとも１つを、前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、
    ｉ．前記第１核酸分子が、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記細胞内での発現時に前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    ｉｉ．前記第２核酸分子が、前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、
    ｃ．前記細胞を前記対象に送達すること、ならびに
    ｄ．前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインの発現を可能にするのに十分なほど前記ＤＲＤを安定化させるリガンドを、前記特定のポリヌクレオチド結合部位に結合し、前記細胞中で前記目的のタンパク質の発現を可能にする転写因子を形成するのに十分な量で前記対象に投与し、
    前記目的のタンパク質の発現が、前記対象において前記リガンドの存在によって制御され、リガンド投与の前記量及び／または持続時間が、治療有効量の前記目的のタンパク質を生成するのに十分であることを含む、前記方法。
  73. 疾患の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、
    ａ．細胞集団を提供すること、
    ｂ．第１核酸分子のうち少なくとも１つ及び第２核酸分子のうち少なくとも１つを、前記細胞集団内における少なくとも１つの細胞中に導入し、
    ｉ．前記第１核酸分子が、転写因子活性化ドメインをコードする第１核酸配列、特定のポリヌクレオチド結合部位に結合する転写因子ＤＮＡ結合ドメインをコードする第２核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第３核酸配列を含み、前記転写因子活性化ドメイン及び前記転写因子ＤＮＡ結合ドメインのうち少なくとも１つが、前記細胞内での発現時に前記ＤＲＤに機能的に連結され、
    ｉｉ．前記第２核酸分子が、前記疾患を処置する目的のタンパク質をコードする第４核酸配列を含み、前記第４核酸配列が、前記特定のポリヌクレオチド結合部位を含む外因性誘導性プロモーターに機能的に連結されること、ならびに
    ｃ．前記細胞を前記対象に送達することを含む、前記方法。
  74. 前記核酸分子が、プラスミドまたはウイルスベクターによって前記細胞中に導入される、請求項６７～７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスに由来する、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
  77. 前記核酸分子が、非ウイルス送達方法によって前記細胞中に導入される、請求項６７～７３のいずれか１項に記載の方法。
  78. 細胞中における目的のタンパク質の調節可能な発現のための系であって、前記系が、
    ａ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に連結される転写因子をコードする第１ポリヌクレオチドであって、前記転写因子が、前記目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を選択的に転写する、前記第１ポリヌクレオチド、
    ｂ．前記目的のタンパク質をコードする核酸配列の上流に隣接して配置された外因性転写因子結合部位を含む第２ポリヌクレオチド、
    ｃ．前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドを前記細胞のゲノム中に安定に組み込むような条件下で、前記第１ポリヌクレオチド及び前記第２ポリヌクレオチドを前記細胞中に導入すること、
    ｄ．前記ＤＲＤを安定化させるリガンドを添加することによって前記転写因子の発現を調節すること
    を含み、
    前記転写因子が、前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列の上流に隣接して配置された転写因子結合部位に特異的に結合し、前記目的のタンパク質の前記発現が、前記細胞中に存在する前記転写因子の量によって制御される、前記系。
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