CN111918877A - 抗cd33嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

抗cd33嵌合抗原受体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明的实施方案提供了对CD33具有抗原特异性的嵌合抗原受体(CAR)。公开了与CAR相关的核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群和药物组合物。还公开了检测哺乳动物中癌症的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物的癌症的方法。

Description

抗CD33嵌合抗原受体及其用途
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2018年3月14日提交的美国临时专利申请第62/643,015号的权益，将其通过引用整体并入本文。
关于联邦赞助的研发的声明
本发明是由国立卫生研究院国家癌症研究所在项目号ZIA BC011565的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
通过引用并入电子提交的材料
通过引用整体并入本文的是同时提交并通过如下识别的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名为“741580_ST25.txt”的一个69,707个字节的ASCII(文本)文件，日期为2019年3月14日。
发明背景
急性髓细胞白血病是高度侵袭性的急性白血病，代表发生在儿童，青少年和青年(AYA)中的第二常见的白血病。尽管当前的治疗方案包括强化的多药化疗周期，和通常通过同种异体供体干细胞移植巩固以实现治愈，但只有60％的患有AML的儿童和AYA可以实现长期缓解。需要新的治疗策略来提高缓解率，减少复发并改善总体生存率。
发明内容
本发明的实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含对CD33具有特异性的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域。本发明的另一个实施方案提供了包含本文所述氨基酸序列的CAR构建体。
本发明的其它实施方案提供与本发明的CAR构建体相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群以及药物组合物。
本发明的另外的实施方案提供检测哺乳动物中癌症的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物的癌症的方法。
附图的简要说明
图1A和1B示出了本发明的某些CAR实施方案的图。Mylo：吉妥单抗，靶向人CD33的人源化抗体hP67.6。M195：靶向人CD33的人源化单克隆鼠IgG2a抗体(M195)，其来自用活人白血病成髓细胞免疫的小鼠。Hu195：靶向人CD33的人源化抗体。
图2A-2F示出了显示CAR的转导效率的图。
图3A和3B示出了显示白血病细胞上CD33和CD123靶抗原表达(指示为萦光强度)的流式细胞术分析的图。
图4A-4F示出了显示体外刺激后CD33和CD123 CAR T细胞产生的细胞因子的图。如图所示，将CD33或CD123 CAR转导的T细胞与靶白血病细胞一起孵育。通过ELISA检测上清液中的干扰素γ或IL-2水平。
图5A-5C示出了显示IncuCyte杀伤测定的图。如图所示，将CD33 CAR转导的T细胞与靶白血病细胞一起孵育。绘制了活白血病细胞相对于原始接种细胞的差异。
图5D和5E示出了IncuCyte杀伤测定的图。如图所示，将CD123 CAR转导的T细胞与靶白血病细胞一起孵育。将活白血病细胞的差异相对于只有肿瘤的对照归一化。5D：MOLM14细胞的杀伤。5E：THP1细胞的杀伤。
图6A-6E示出了生物发光图像，其用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展，如图所示。抗CD19 CAR对CD33抗原是非特异性的。
图7A显示了用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展的生物发光图像。在第-7天将1百万个PDX白血病细胞JMM117注射到NSG小鼠中。在第7天用CAR T细胞处理小鼠。
图7B和7C是显示在第二周的脾脏中的(图7B)人AML JMML117细胞和(图7C)CD33CAR T细胞的图。两幅图的数字如在图7B的图例中所示。
图8是显示白血病细胞上CD33靶抗原表达(指示为萦光强度)的流式细胞术分析的图。缩写如实施例2中所述。
图9A和9B是柱状图，其显示了在体外刺激后CD33Hu195-CD28Z CAR T细胞产生的细胞因子。如图所示，将CD33Hu195-CD28Z CAR-转导的T细胞与靶白血病细胞孵育16小时。通过ELISA检测上清液中的干扰素γ或IL-2水平。
图10示出了生物发光图像，其用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展，如图所示。在第-7天将一百万个MOLM14白血病细胞注射到NSG小鼠中。7天后，将小鼠用生理盐水处理，未处理或用CAR T细胞处理(图像列上方列出的细胞数)。较暗的区域代表更大的肿瘤负担。“数值范围(scale)”涉及萦光强度，其基于显示的数值范围(如果将范围置于较低的值，则萦光强度看起来会非常高，但是如果将范围置于较高的值，则强度看起来会变暗)。
图11A和11B：CD33Hu195-CD28z临床载体的验证。图11A：用生物素化的人Siglec-3进行的CD33 CAR表达检测。图11B：生物发光图像，其用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展。在第0天将一百万个白血病细胞MOLM14注射到NSG小鼠中。在第3天用5E6个CAR T细胞处理小鼠。
图12A-12C：CAR共刺激结构域对细胞代谢的影响。将CD33.2-28z和CD33.2-BBzCAR T细胞与MOML14共孵育，并在7天后用Seahorse机器测试其代谢特征。图12A(顶部曲线为5天-CD33.2-28，底部曲线为5天-CD33.2-BB)：在第7天，CD33.2-28z和CC33.2-BBz CAR T细胞在基础代谢条件下并响应线粒体抑制剂的耗氧率(OCR)。图12B(左为CD33.2-28，右为CD33.2-BB)：基础OCR水平vs最大呼吸水平。图12C(左为CD33.2-28，右为CD33.2-BB)：质子泄漏相关的OCR和ATP产生相关的OCR。
图12D-124F：CAR共刺激结构域对细胞能量表型的影响。将CD33.2-28z和CD33.2-BBz CAR T细胞与MOML14共孵育，并在7天后使用Seahorse机器测试其细胞能量表型，(图12D，左曲线为CD33.2-28，右曲线为CD33.2-BB)细胞能量表型。(图12E，左为CD33.2-28，右为CD33.2-BB)耗氧率。(图12F，左为CD33.2-28，右为CD33.2-BB)胞外酸化速率。
图13示出了生物发光图像，其用于跟踪利用体内不同处理的白血病进展，如图所示。较暗的区域代表更大的肿瘤负担。
发明的详细描述
急性骨髓性白血病(AML)是一种侵袭性恶性肿瘤，当该疾病变得细胞毒性化疗难以治疗时，通常使用强化的细胞毒性化疗方案和有限的替代治疗选择来治疗。
CAR为人工构建的杂合蛋白或多肽，所述杂合蛋白或多肽含有连接至T细胞信号传导结构域的一种或多种抗体的抗原结合结构域(如，单链可变片段(scFv))。CAR的特性包括它们能够利用单克隆抗体的抗原结合性质，以非-MHC-限制的方式重定向T细胞对选定的靶标的特异性和反应性。非-MHC限制的抗原识别使表达CAR的T细胞能够不依赖抗原加工而识别抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。本文使用的短语“抗原特异性”和“引起抗原特异性应答”是指CAR可以特异性结合抗原并在免疫学上识别抗原，使得CAR与抗原的结合引起免疫应答。
CD33在绝大多数AML原始细胞和原始细胞危象中的慢性骨髓性白血病的表面表达。它还在T细胞急性成淋巴细胞性白血病的子集中异常表达。正常组织的表达仅限于正常骨髓细胞。
本发明的一实施方案提供了这样的CAR，其包含hP67.6(Cowan等人，Front.Biosci.(Landmark Ed.),18:1311-1334(2013)和美国专利第5,739,116号，每篇通过引用并入本文)，M195(Co等人，J.Immunol.，148：1149-1154(1992)，通过引用并入本文)或Hu195(Co等ren，同上的抗CD33抗原结合结构域。抗原结合结构域能与CD33特异性结合。在这方面，本发明的一优选实施方案提供了包含抗CD33抗原结合结构域的CAR，所述抗CD33抗原结合结构域包含hP67.6、M195或Hu195的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)，由其组成或基本上由其组成。
抗CD33抗原结合结构域可以包含轻链可变区和/或重链可变区，例如，hP67.6的轻链可变区和/或重链可变区。在本发明的一实施方案中，重链可变区包含CDR1区，CDR2区和CDR3区。在本发明的一实施方案中，抗CD33抗原结合结构域的轻链可变区可包含轻链CDR1区、轻链CDR2区和轻链CDR3。
抗CD33抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。抗CD33抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。因此，在本发明的一实施方案中，抗CD33抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，抗CD33抗原结合结构域包含SEQ ID NO：3和5的氨基酸序列。
抗CD33抗原结合结构域可以包含轻链可变区和/或重链可变区，例如，M195的轻链可变区和/或重链可变区。在本发明的一实施方案中，重链可变区包含CDR1区，CDR2区和CDR3区。在本发明的一实施方案中，抗CD33抗原结合结构域的轻链可变区可以包含轻链CDR1区，轻链CDR2区和轻链CDR3。
抗CD33抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。抗CD33抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。因此，在本发明的一实施方案中，抗CD33抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，抗CD33抗原结合结构域包含SEQ ID NO：13和14的氨基酸序列。
抗CD33抗原结合结构域可以包含轻链可变区和/或重链可变区，例如，Hu195的轻链可变区和/或重链可变区。在本发明的一实施方案中，重链可变区包含CDR1区，CDR2区和CDR3区。在本发明的一实施方案中，抗CD33抗原结合结构域的轻链可变区可以包含轻链CDR1区，轻链CDR2区和轻链CDR3。
抗CD33抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。抗CD33抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。因此，在本发明的一实施方案中，抗CD33抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，抗CD33抗原结合结构域包含SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列。
在Hu195中，序列SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQ(SEQ ID NO：31)可以改为SGVPSRFSGSGSGTDFTLNISSLQPDDFATYYCQ(SEQ ID NO：32)。在Mylo中，序列AYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLA(SEQ ID NO：33)可以改为AYMELSSLRSEDTDFYYCVNGNPWLA(SEQ ID NO：34)。
抗CD33抗原结合结构域可以包含抗CD33抗体的任何抗原结合部分。抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点的任何部分，例如Fab、F(ab′)2、dsFv、scFv、双抗体和三抗体。优选地，抗原结合部分是单链可变区片段(scFv)抗体片段。scFv是截短的Fab片段，其包括通过合成的肽接头与轻抗体链的可变(V)结构域连接的抗体重链的V结构域，其可以使用常规重组DNA技术产生。类似地，可以通过重组DNA技术制备二硫键稳定的可变区片段(dsFv)。
在本发明的一实施方案中，抗CD33抗原结合结构域的轻链可变区和重链可变区可以通过接头彼此连接。接头可包含任何合适的氨基酸序列。在本发明的一实施方案中，接头是长度为约1至约100，约3至约20，约5至约30，约5至约18或约3至约8个氨基酸的Gly/Ser接头，并且由顺序的甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。因此，Gly/Ser接头可以由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。优选地，Gly/Ser接头包含GGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)，并且在接头内可以存在多个SEQ ID NO：17。任何接头序列都可以用作抗原结合结构域和跨膜结构域之间的间隔子。
在一实施方案中，抗CD33抗原结合结构域包含轻链可变区，重链可变区和接头。在这方面，包含轻链可变区，重链可变区和接头的抗CD33抗原结合结构域的实施方案包含SEQID NO：3、4和5；13、4和14；或15、4和16的全部，由其组成或基本上由其组成。
在一实施方案中，抗原结合结构域包含一个或多个前导序列(信号肽)。在本发明的一实施方案中，前导序列可以位于CAR构建体中抗CD33 CAR的氨基末端。前导序列可包含任何合适的前导序列，例如，本文所述的任何CAR可包含本文所述的任何前导序列。在一实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：12的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在本发明的一实施方案中，虽然前导序列可以促进释放的CAR在细胞表面上的表达，但是在表达的CAR中存在前导序列不是CAR发挥功能所必需的。在本发明的一实施方案中，CAR在细胞表面上表达后，前导序列可以被切除。因此，在本发明的一实施方案中，释放的CAR没有前导序列。在本发明的一实施方案中，CAR构建体内的CAR没有前导序列。
在本发明的一实施方案中，CAR构建体包含铰链结构域。在本发明的一实施方案中，铰链结构域是CD8铰链结构域。在优选的实施方案中，CD8铰链结构域是人的。优选地，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO：6，由SEQ ID NO：6组成或基本上由SEQ ID NO：6组成。在本发明的一实施方案中，铰链结构域是CD28铰链结构域。在优选的实施方案中，CD28铰链结构域是人的。优选地，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO：10，由SEQ ID NO：10组成或基本上由SEQ ID NO：10组成。
在本发明的一实施方案中，CAR构建体包含跨膜(TM)结构域。在本发明的一实施方案中，TM结构域是CD8 TM结构域。在优选的实施方案中，CD8 TM结构域是人的。优选地，CD8TM结构域包含SEQ ID NO：7，由SEQ ID NO：7组成或基本上由SEQ ID NO：7组成。在本发明的一实施方案中，TM结构域是CD28 TM结构域。在优选的实施方案中，CD28 TM结构域是人的。优选地，CD28 TM结构域包含SEQ ID NO：11，由SEQ ID NO：11组成或基本上由SEQ ID NO：11组成。
在本发明的一实施方案中，CAR构建体包含胞内T细胞信号传导结构域。在本发明的一实施方案中，胞内T细胞信号传导结构域包含4-1BB胞内T细胞信号传导序列。4-1BB，也称为CD137，向T细胞传递有效的共刺激信号，从而促进T淋巴细胞的分化并提高其长期存活。优选地，4-1BB胞内T细胞信号传导序列是人的。在优选的实施方案中，4-1BB胞内T细胞信号传导序列包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。
在本发明的一实施方案中，胞内T细胞信号传导结构域包含CD3ζ胞内T细胞信号传导序列。CD3ζ与TCR缔合以产生信号，并包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。优选地，CD3ζ胞内T细胞信号传导序列是人的。在优选的实施方案中，CD3ζ胞内T细胞信号传导序列包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。
可以将本文所述的CAR与例如自切割肽制备在构建体中，使得所述CAR构建体是抗CD19、CD22、TSLPR、CD123、FLT3 CAR等的双顺反子的，三顺反子的等，其中肽切割后释放单独的CAR。
图1示出了根据本发明实施方案的示例性CAR构建体的示意图。
本发明的另外的实施方案提供了全长CAR构建体，其包含以下表1-6中列出的任何一种或多种氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。
表1–CD33Mylo-BBZ CAR
Figure BDA0002673010700000081
Figure BDA0002673010700000091
表2–CD33Mylo-CD28Z CAR
Figure BDA0002673010700000092
表3–CD33M195-BBZ CAR
Figure BDA0002673010700000101
表4–CD33M195-CD28Z CAR
Figure BDA0002673010700000102
Figure BDA0002673010700000111
表5–CD33Hu195-BBZ CAR
Figure BDA0002673010700000112
Figure BDA0002673010700000121
表6–CD33Hu195-CD28Z CAR
Figure BDA0002673010700000122
CDR序列在下文以带下划线的粗体显示。
Hu195和M195:
Figure BDA0002673010700000131
Hu195的加框的T为N
CDR:
DYNMH(SEQ ID NO:41)
YIYPYNGGTGYNQKFKSKA(SEQ ID NO:42)
GRPAMDYWGQ(SEQ ID NO:43)
RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO:44)
AASNQGS(SEQ ID NO:45)
QQSKEVPWT(SEQ ID NO:46)
Mylo:
Figure BDA0002673010700000132
CDR:
GYTITDSN(SEQ ID NO:47)
IYPYNGGT(SEQ ID NO:48)
VNGNPWLAY(SEQ ID NO:49)
ESLDNYGIRF(SEQ ID NO:50)
AAS(SEQ ID NO:51)
QQTKEVPWS(SEQ ID NO:52)
在一实施方案中，CAR构建体(在本文表示为CD33Mylo-BBZ)具有以下序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTITDSNIHWVRQAPGQSLEWIGYIYPYNGGTDYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASESLDNYGIRFLTWFQQKPGKAPKLLMYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTKEVPWSFGQGTKVEVKRTSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:18)。
在一实施方案中，CAR构建体(在本文表示为CD33Mylo-CD28Z)具有以下序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTITDSNIHWVRQAPGQSLEWIGYIYPYNGGTDYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASESLDNYGIRFLTWFQQKPGKAPKLLMYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTKEVPWSFGQGTKVEVKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:19).
在一实施方案中，CAR构建体(在本文表示为CD33M195-BBZ)具有以下序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLNISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKTSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:20).
在一实施方案中，CAR构建体(在本文表示为CD33M195-CD28Z)具有以下序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLNISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKTSSGAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:21).
在一实施方案中，CAR构建体(在本文表示为CD33Hu195-BBZ)具有以下序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:22).
在一实施方案中，CAR构建体(在本文表示为CD33Hu195-CD28Z)具有以下序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKSGAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:23)。RVKFSRSADAPAYQ(SEQ ID NO:37)中的Q可以用K取代。
GS的序列可以在本文所述的任何CAR的C-末端。
包括在本发明范围内的是本文所述的本发明CAR构建体的功能部分。当参照CAR使用时，术语“功能部分”是指本发明CAR构建体的任何部分或片段，该部分或片段保留了其为之一部分的CAR构建体(亲本CAR构建体)的生物活性。功能部分涵盖例如CAR构建体的保留与亲本CAR构建体相似程度、相同程度或比亲本CAR构建体更高程度地识别靶细胞或检测，治疗或预防癌症的能力的那些部分。参照亲本CAR构建体，功能部分可包含亲本CAR的例如约10％、约25％、约30％、约50％、约68％、约80％、约90％、约95％或更多。
功能部分可在该部分的氨基或羧基末端或在两个末端包含另外的氨基酸，该另外的氨基酸在亲本CAR构建体的氨基酸序列中不存在。可取的是，另外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能，例如，识别靶细胞，检测癌症，治疗或预防癌症等。更可取的是，相比亲本CAR构建体的生物活性，另外的氨基酸增强生物活性。
本发明的范围包括本文所述的本发明的CAR构建体的功能变体。本文使用的术语“功能变体”指与亲本CAR构建体具有大量的或显著的序列同一性或相似性的CAR构建体、多肽或蛋白，所述功能变体保留了该变体所来源的CAR的生物活性。功能变体涵盖例如本文所述CAR构建体(亲本CAR构建体)的保留与亲本CAR构建体相似程度、相同程度或比亲本CAR构建体更高程度地识别靶细胞的能力的那些变体。提及亲本CAR构建体，功能变体的氨基酸序列与亲本CAR构建体的氨基酸序列可，例如，具有至少约30％、约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的同一性。
功能变体可以，例如包含具有至少一个保守氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。可选地或另外，功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸置换的亲本CAR构建体的氨基酸序列。在这种情况下，非保守氨基酸置换优选不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸置换可以增强功能变体的生物活性，以使与亲本CAR构建体相比，功能变体的生物活性增加。
本发明的CAR构建体的氨基酸置换优选保守氨基酸置换。保守氨基酸置换为本领域已知的，并且包含这样的氨基酸置换，其中具有某些物理和/或化学特性的一个氨基酸被换成具有相同或相似化学或物理特性的另一氨基酸。例如，保守氨基酸置换可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸被另一酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如Asp或Glu)置换，具有非极性侧链的氨基酸被另一具有非极性侧链的氨基酸(例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)置换，碱性/带正电荷的极性氨基酸被另一碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如Lys、His、Arg等)置换，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸被另一具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)置换，具有β分支侧链的氨基酸被另一具有β分支侧链的氨基酸(例如Ile、Thr和Val)置换，具有芳香族侧链的氨基酸被另一具有芳香族侧链的氨基酸(例如His、Phe、Trp和Tyr)置换等。
CAR构建体可以基本上由本文所述的一条或多条指定的氨基酸序列组成，以使其它组分(例如其它氨基酸)不实质性改功能变体的生物活性。
本发明的实施方案的CAR构建体(包括功能部分和功能变体)可以是任何长度，即可以包含任何数目的氨基酸，条件是所述CAR构建体(或其功能部分或功能变体)保留它们的生物活性，例如特异性结合抗原、检测哺乳动物中的患病细胞或者治疗或预防哺乳动物中的疾病等的能力。例如，CAR的长度可以是约50至约5000个氨基酸，如长度为50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。
本发明的实施方案的CAR构建体(包括本发明的功能部分和功能变体)可以包含合成的氨基酸代替一个或多个天然存在的氨基酸。此类合成的氨基酸为本领域已知的，并且包括例如，氨基环己羧酸、正亮氨酸、α-氨基n-癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-羟脯氨酸和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苯甲基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸以及α-叔-丁基甘氨酸。
本发明的实施方案的CAR构建体(包括功能部分和功能变体)可以被糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫桥环化、或者转变为酸加成盐和/或任选地二聚化或多聚化或缀合。
本发明的实施方案的CAR构建体(包括其功能部分和功能变体)可以通过本领域已知的方法获得。可以通过制备多肽或蛋白质的任何合适的方法，包括从头合成，来制得CAR构建体。另外，可以使用标准重组方法，使用本文所述的核酸重组产生CAR构建体。参见，例如Green等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY 2012。此外，本发明的一些CAR构建体(包括其功能部分和功能变体)的一部分可以从诸如植物、细菌、昆虫、哺乳动物例如大鼠，人等的来源中分离和/或纯化。分离和纯化的方法是本领域众所周知的。可选地，本文所述的CAR构建体(包括其功能部分和功能变体)可以通过公司商业合成，例如，Synpep(Dublin,CA)、PeptideTechnologies Corp.(Gaithersburg,MD)和Multiple Peptide Systems(San Diego,CA)。在这方面，本发明的CAR构建体可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
本发明的实施方案还提供了包含编码本文所述的任何CAR构建体(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列的核酸。本发明的核酸可以包含编码本文所述的前导序列、抗原结合结构域、跨膜结构域、接头和/或胞内T细胞信号传导结构域中的任一种的核苷酸序列。
在一实施方案中，核酸包含编码本文所述的任何CAR构建体的核苷酸序列。在本发明的一实施方案中，核酸可以包含以下任一项的核苷酸序列，由其组成或基本上由其组成。
CD33Mylo-BBZ CAR
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCCAGACCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCATCACCGACAGCAACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCCAGAGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGAACCGGGCCACCCTGACCGTGGACAACCCCACCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCTTCTACTACTGCGTGAACGGCAACCCCTGGCTGGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGCGGAGGCGGATCTGGAGGGGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCAGCACCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCCTGGACAACTACGGCATCCGGTTTCTGACCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATGTACGCCGCCAGCAATCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGAACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGACCAAAGAGGTGCCCTGGTCCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAGTGAAGCGGACTAGTTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO:24)
CD33Mylo-CD28Z CAR
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCCAGACCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCATCACCGACAGCAACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCCAGAGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAACGGCGGCACCGACTACAACCAGAAGTTCAAGAACCGGGCCACCCTGACCGTGGACAACCCCACCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCTTCTACTACTGCGTGAACGGCAACCCCTGGCTGGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGGCGGAGGCGGATCTGGAGGGGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGACATCCAGCTGACCCAGAGCCCCAGCACCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGAGCCTGGACAACTACGGCATCCGGTTTCTGACCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATGTACGCCGCCAGCAATCAGGGCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGAACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGACCAAAGAGGTGCCCTGGTCCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAGTGAAGCGGACTAGTTCCGGAGCCGCCGCCATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGATAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGTCCCAGCCCCCTGTTTCCCGGCCCTAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGCGGAGTGCTGGCCTGCTACAGCCTCCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAGGTCCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAATATGACCCCCAGAAGGCCCGGCCCCACCAGAAAGCACTATCAGCCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTTGCCGCCTACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCCCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAATACGACGTGCTGGATAAGAGGAGGGGAAGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCATGACGGCCTGTACCAAGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCCAGGGGATCCTAA(SEQ ID NO:25)
CD33M195-BBZ CAR
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本文使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意为DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链，合成的或从天然来源获得的(例如分离的和/或纯化的)，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间连键，如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，替代存在于未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或置换。然而，在一些情况下，如本文所述，核酸包含一个或多个插入、缺失、倒位和/或置换可能是合适的。在一些实施方案中，核酸可以编码不影响CAR构建体的功能并且在宿主细胞表达核酸时可以翻译或可以不翻译的其它氨基酸序列。
在一实施方案中，本文的任何核苷酸序列可以是密码子优化的。不受特定理论或机制的束缚，据信核苷酸序列的密码子优化增加了mRNA转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可以包括将天然密码子替换为编码相同氨基酸，但是可以通过在细胞内更容易获得的tRNA进行翻译的另一个密码子，从而提高翻译效率。核苷酸序列的优化还可以减少将干扰翻译的二级mRNA结构，从而提高翻译效率。在本发明的一实施方案中，密码子优化的核苷酸序列可以包含本文所述的核酸序列的任一种，由其组成或基本上由其组成。
本发明的实施方案的核酸可以是重组体。本文使用的术语“重组体”指(i)通过将天然的或合成的核酸区段与可在活细胞中复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或者(ii)由以上(i)中所述的那些分子的复制而产生的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
重组核酸可以是具有非天然存在的序列或者具有通过对序列的两个原本分离的区段的人工组合而制备的序列的核酸。该人工组合通常通过化学合成来完成，或者更通常通过人工操纵分离的核酸区段来完成，例如通过基因工程技术来完成，诸如以上的Green等人中所述的那些技术。可以利用本领域已知的程序，基于化学合成和/或酶连接反应构建核酸。参见，例如以上的Green等人。例如，可以利用天然存在的核苷酸或者设计以增加分子的生物稳定性或者增加杂交时所形成的双链体的物理稳定性的不同修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)来化学合成核酸。可用于产生核酸的修饰的核苷酸的实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫脲苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌酐、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶以及2,6-二氨基嘌呤。可选地，本发明的核酸中的一种或多种可购自例如Macromolecular Resources(Fort Collins,CO)和Synthegen(Houston,TX)的公司。
核酸可以包含编码CAR构建体或其功能部分或功能变体的任一种的任何分离或纯化的核苷酸序列。可选地，核苷酸序列可包含任何序列简并的核苷酸序列或简并序列的组合。
本发明的实施方案还提供分离或纯化的核酸，其包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或者包含在严紧条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严紧条件下杂交的核苷酸序列可以在高度严紧条件下杂交。“高度严紧条件”意为核苷酸序列以可检测地比非特异性杂交更强的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高度严紧条件包括将含有准确互补序列的多核苷酸或者仅含有一些分散的错配的多核苷酸与恰巧具有匹配核苷酸序列的一些小的区域(例如3-10个碱基)的随机序列区分开的条件。此类小的互补区域比14-17个或者更多个碱基的全长互补体更易解链，并且高度严紧杂交使其易于区分。相对高度严紧的条件将包括，例如低盐和/或高温条件，如由约0.02-0.1M NaCl或等同物，在约50-70℃的温度下所提供的条件。此类高度严紧条件容忍极少(如果存在)核苷酸序列与模板或靶标链之间的错配，并且特别适合于检测任何本发明的CAR构建体的表达。普遍认为通过添加增加量的甲酰胺可以导致更严紧的条件。
本发明还提供这样的核酸，其包含与本文所述的任何核酸具有至少约70％或者更多，例如约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核苷酸序列。
在一实施方案中，可以将本发明的核酸并入重组表达载体中。就这点而言，本发明的实施方案提供包含本发明的任何核酸的重组表达载体。出于本文的目的，术语“重组表达载体”意为遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，并且在足以使mRNA、蛋白、多肽或肽在宿主细胞内表达的条件下将载体与细胞接触时，其允许细胞表达mRNA、蛋白、多肽或肽。本发明的载体作为整体不是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的，合成的或者部分由天然来源获得的，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间连键或者这两种类型的连键。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连键不妨碍载体的转录或复制。示例性的载体主链是SEQ ID NO：30的慢病毒载体主链。
在一实施方案中，本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以被用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计以用于增殖和扩增或者用于表达或者用于这两种的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自：pUC系列(FermentasLife Sciences,Glen Burnie,MD)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)以及pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。也可使用诸如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149的噬菌体载体。植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。
在一实施方案中，可以使用例如以上Green等人中所述的标准重组DNA技术来制备本发明的重组表达载体。可以将环状或线性表达载体的构建体制备为含有在原核或真核宿主细胞中发挥功能的复制系统。复制系统可以来源于，例如ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
重组表达载体可以包含调控序列，如转录和翻译起始和终止密码子，视情况而定并且考虑载体是基于DNA的还是基于RNA的，其对于待引入载体的宿主细胞的类型(例如细菌、真菌、植物或动物)是特异的。重组表达载体还可以包含限制位点以促进克隆。
重组表达载体可以包含允许对转化或转染的宿主细胞进行选择的一种或多种标志物基因。标志物基因包括抗微生物剂抗性(例如对抗生素、重金属等的抗性)，在营养缺陷型宿主中互补以提供原营养等。用于本发明的表达载体的合适的标志物基因包括，例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因以及氨苄西林抗性基因。
重组表达载体可以包含与以下序列可操作地连接的天然或非天然的启动子：编码CAR构建体(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列或者与编码CAR构建体的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择，例如强、弱、可诱导的、组织特异性的和发育特异性的，在本领域普通技术人员的能力内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在本领域普通技术人员的能力内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子或鼠干细胞病毒的长末端重复中存在的启动子。
可以将本发明的重组表达载体设计为瞬时表达、稳定表达或者设计为这两种。另外，可以将重组表达载体制备为组成型表达或诱导型表达。
此外，可以将重组表达载体制备为包含自杀基因。本文使用的术语“自杀基因”指引起表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是这样的基因，其赋予基因在其中表达的细胞针对试剂(例如药物)的敏感性，并且当细胞与所述试剂接触或者暴露于所述试剂时引起细胞死亡。自杀基因为本领域已知的，并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
本发明的范围包括缀合物，例如生物缀合物，其包含本发明的CAR构建体(包括其功能部分或变体中的任一种)、核酸、重组表达载体、宿主细胞或宿主细胞群中的任一种。缀合物以及通常合成缀合物的方法是本领域已知的。
本发明的实施方案还提供包含本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。本文使用的术语“宿主细胞”指可以含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类；或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接由生物体如人分离到的细胞。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。合适的宿主细胞为本领域已知的，并且包括，例如DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。出于扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以是原核细胞，例如DH5α细胞。出于产生重组CAR构建体的目的，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。尽管宿主细胞可以是任何类型的细胞、可以来源于任何类型的组织，并且可以处于任何发育阶段，但是宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。宿主细胞可以是T细胞或NK细胞。
出于本文的目的，T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如原代T细胞；或者是来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等；或者是获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，T细胞可以获自多种来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或者其它组织或液体。T细胞也可以是富集的或纯化的。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、初始T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
本发明的实施方案还提供包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群。细胞群可以是除了至少一种其它细胞外还包含含有任何所述重组表达载体的宿主细胞的异质群体，所述其它细胞为例如不包含任何重组表达载体的宿主细胞(例如T细胞)或者除了T细胞之外的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。可选地，细胞群可以是基本同质的群体，其中所述群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如基本上由含有重组表达载体的宿主细胞组成)。群体也可以是克隆细胞群，其中群体的所有细胞均为含有重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，以使群体的所有细胞均包含重组表达载体。在本发明的一实施方案中，细胞群为包含含有本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
本发明的CAR构建体(包括其功能部分和变体)、核酸、重组表达载体和宿主细胞(包括其群体)在下文中统称为“本发明的CAR构建体材料”，其可以是分离的和/或纯化的。本文使用的术语“分离的”意为已从其天然环境中移出。术语“纯化的”或“分离的”不要求绝对的纯度或分离；而是其意图作为相对术语。因此，例如纯化的(或分离的)宿主细胞制备物是一种这样的制备物，其中宿主细胞比其体内天然环境中的细胞更纯。此类宿主细胞可以，例如通过标准纯化技术产生。在一些实施方案中，将宿主细胞制备物进行纯化，以使宿主细胞代表制备物总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以是至少约50％，可以高于约60％、约70％或约80％，或者可以是约100％。
可以将本发明的CAR构建体材料配制为组合物，如药物组合物。就这点而言，本发明的实施方案提供包含本文所述的任何本发明的CAR构建体材料以及药学可接受的载体的药物组合物。含有任何本发明的CAR构建体材料的本发明的药物组合物可以包含多于一种本发明的CAR构建体材料，例如CAR构建体和核酸，或者两种或更多种不同的CAR构建体。可选地，药物组合物可以包含与其它药学活性剂或药物组合的本发明的CAR构建体材料，所述其它药学活性剂或药物如化疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉酚、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等。在优选的实施方案中，药物组合物包含本发明的宿主细胞或其群体。
关于药物组合物，药学可接受的载体可以是常规使用的任何载体，并且仅受化学物理考虑因素(例如溶解性和缺乏与活性剂的反应性)以及施用途径的限制。本文所述的药学可接受的载体，例如媒介物，佐剂，赋形剂和稀释剂，是本领域技术人员众所周知的，并且易于公众获得。优选的是，药学可接受的载体是在使用条件下没有有害副作用或毒性的载体。
载体的选择将部分地由特定的本发明的CAR构建体材料以及用于施用本发明的CAR构建体材料的特定方法决定。因此，本发明的药物组合物有多种合适的制剂。制备可施用(肠胃外可施用)组合物的方法为本领域技术人员已知的或显而易见的，并且更详细地描述于，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,PharmaceuticalPress；第22版(2012)。
本发明的CAR构建体材料可以任何合适的方式施用。优选地，本发明的CAR构建体材料通过注射(例如，皮下，静脉内，肿瘤内，动脉内，肌肉内，皮内，腹膜内或鞘内)施用。优选地，本发明的CAR构建体材料静脉内施用。对于本发明的CAR构建体材料，用于注射的合适的药学可接受的载体可以包括任何等张载体，如例如生理盐水(含约0.90％w/v NaCl的水，含约300mOsm/L NaCl的水，或者每升水约9.0g NaCl)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter,Deerfield,IL)、含约5％葡萄糖的水或者乳酸林格氏液。在实施方案中，用人血清白蛋白补充药学可接受的载体。
“有效量”或“治疗有效量”指足以预防或治疗个体癌症的剂量。用于治疗或预防用途的有效量将取决于，例如被治疗的疾病或病症的阶段和严重程度，患者的年龄、体重和整体健康状态，以及处方医师的判断。剂量的大小也将由选定的活性、施用方法、施用的时间和频率、可能伴随施用具体的活性的任何不良副作用的存在、性质和程度，以及期望的生理效果来决定。本领域技术人员将理解的是，不同的疾病或病症可能需要涉及多次施用的延长治疗，可能在每次施用或多轮施用中使用本发明的CAR构建体物质。举例而非限制本发明，当本发明的CAR构建体材料是宿主细胞时，宿主细胞的示例性剂量可以是至少一百万个细胞(1×106个细胞/剂量)。
出于本发明的目的，施用的本发明的CAR构建体材料的量或剂量应当足以在合理的时间框内在对象或动物中产生治疗应答或预防应答。例如，本发明的CAR构建体材料的剂量应当足以在离施用时间约2小时或更长，例如约12至约24或者更多个小时的时间段内结合抗原，或者检测或者治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间段甚至可能更长。剂量将由具体的本发明的CAR构建体材料的效力和动物(例如人)的情况以及待治疗的动物(例如人)的体重决定。
出于本发明的目的，可以使用下述分析来确定向哺乳动物施用的起始剂量：其包括例如比较各给予不同剂量的表达本发明的CAR构建体的释放的CAR的T细胞的一组哺乳动物中，在向哺乳动物施用给定剂量的此类T细胞时，靶细胞裂解的程度和/或此类T细胞分泌IFN-γ或IL-2的程度。可以通过本领域已知的方法来分析施用某一剂量时，靶细胞裂解和/或IFN-γ或IL-2分泌的程度。
当将本发明的CAR构建体材料与一种或多种另外的治疗剂一起施用时，一种或多种另外的治疗剂可以共施用至哺乳动物。“共施用”意为在时间上足够接近地施用一种或多种另外的治疗剂和本发明的CAR构建体材料，以使本发明的CAR构建体材料可以增强一种或多种另外的治疗剂的作用，反之亦然。就这点而言，可以首先施用本发明的CAR构建体材料，之后施用一种或多种另外的治疗剂，反之亦然。可选地，可以同时施用本发明的CAR构建体材料和一种或多种另外的治疗剂。可以与CAR构建体材料共施用的示例性治疗剂为IL-2。
考虑可以将本发明的CAR构建体材料用于治疗或预防哺乳动物的疾病的方法中。不受特定理论或机制的束缚，本发明的CAR构建体具有生物活性，例如识别抗原例如CD33的CAR，以使当由细胞表达时，CAR能够介导针对表达抗原例如CD33的细胞的免疫应答。就这点而言，本发明的实施方案提供治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，其包括向哺乳动物施用有效治疗或预防哺乳动物的癌症的量的本发明的CAR构建体、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群和/或药物组合物中的任一种。
本发明的实施方案还包括在施用本发明的CAR构建体材料前，对哺乳动物进行淋巴细胞清除。淋巴细胞清除的实例包括但可能不限于：非骨髓根除性淋巴细胞清除化疗、骨髓根除性淋巴细胞清除化疗、全身辐射等。
出于其中施用宿主细胞或细胞群的本发明的方法的目的，细胞可以是与哺乳动物同种异体的细胞或是其自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。
本文提及的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本文使用的术语“哺乳动物”指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，如小鼠和仓鼠；以及兔形目的哺乳动物，如兔。哺乳动物可以来自食肉目，包括猫科(猫)和犬科(狗)。哺乳动物可以来自偶蹄目，包括牛科(牛)和猪科(猪)；或者来自奇蹄目，包括马科(马)。哺乳动物可以来自灵长目、猿(Ceboids)目或猴(Simoids)目(猴)，或者来自类人猿目(人和类人猿)。优选地，哺乳动物为人。
关于本发明的治疗方法，癌症可以是任何癌症，包括急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌症(例如，膀胱癌)、骨癌、脑癌(例如，髓母细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻癌腔或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌肿瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液态肿瘤、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B慢性淋巴细胞白血病、B原始急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、B细胞前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)、B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、大网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体肿瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和输尿管癌。优选地、癌症是血液系统恶性肿瘤(例如，白血病或淋巴瘤，包括但不限于霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、CLL、急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、B-慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)(也称为“急性成淋巴细胞性白血病”)、B-ALL、BCP-ALL、B细胞淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤)。优选地，癌症的特征在于CD33的表达。
本文使用的术语“治疗”和“预防”以及由其衍生的词语不一定意指100％或完全的治疗或预防。而是，存在本领域普通技术人员认为具有潜在益处或治疗效果的不同程度的治疗或预防。在这方面，本发明的方法可以提供任何量任何水平的对哺乳动物的癌症的治疗或预防。此外，本发明的方法提供的治疗或预防可以包括被治疗或预防的疾病(例如癌症)的一种或多种病况或症状的治疗或预防。另外，出于本文的目的，“预防”可以涵盖延迟疾病或其症状或病况的发作。
本发明的另一实施方案提供本发明的CAR构建体、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或药物组合物用于治疗或预防哺乳动物的癌症的用途。
本发明的另一实施方案提供了检测哺乳动物中癌症的存在的方法，其包括：(a)使包含来自哺乳动物的一种或多种细胞的样品与本发明的CAR构建体，核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群或药物组合物接触，从而形成复合物，(b)并检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示哺乳动物中癌症的存在。
样品可以通过任何合适的方法获得，例如活检或尸检。活检是从个体中去除组织和/或细胞。这种去除可以是从个体收集组织和/或细胞，以便对去除的组织和/或细胞进行实验。该实验可以包括确定个体是否患有和/或正患有某种病况或疾病状态的实验。该病况或疾病可以是例如癌症。
关于本发明的检测哺乳动物中癌症的存在的方法的实施方案，包含哺乳动物细胞的样品可以是包含全细胞，其裂解物或全细胞裂解物的一部分，例如，核或细胞质部分，完整蛋白质部分或核酸部分的样品。如果样品包含全细胞，则细胞可以是哺乳动物的任何细胞，例如任何器官或组织的细胞，包括血细胞或内皮细胞。
为了本发明的检测方法的目的，接触可以相对于哺乳动物在体外或体内进行。优选地，接触是体外的。
同样，可以通过本领域中已知的多种方式来进行复合物的检测。例如，本文所述的本发明的CAR构建体，核酸，重组表达载体，宿主细胞或细胞群可以用可检测的标记物标记，例如放射性同位素、萦光团(例如，异硫氰酸萦光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如金颗粒)。
测试CAR识别靶细胞的能力和抗原特异性的方法是本领域已知的。例如，Clay等人，J.Immunol.，163：507-513(1999)，教导了测量细胞因子(例如，干扰素γ、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子a(TNF-α)或白介素2(IL-2))的释放的方法。另外，如Zhao等人，J.Immunol.，174：4415-4423(2005)中所述，可以通过测量细胞的细胞毒性来评估CAR功能。
以下包括本发明的某些方面。
1.嵌合抗原受体(CAR)，其包含对CD33具有抗原特异性的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域，其中
(a)所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含Hu195的CDR1、CDR2和CDR3区；或
(b)所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含Hu195的CDR1、CDR2和CDR3区，
其中所述CDR区是SEQ ID NOS：41-46中的CDR区。
2.根据方面1的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：15的重链可变区。
3.根据方面1或2的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：16的轻链可变区。
4.根据方面1-3中任一项的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：4的接头序列。
5.根据方面1-4中任一项的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：15、4和16的抗原结合结构域。
6.根据方面1-5中任一项的CAR，其中所述CAR包含(i)SEQ ID NO：7的CD8跨膜结构域和SEQ ID NO：6的CD8铰链结构域，或(ii)SEQ ID NO：11的CD28跨膜结构域和SEQ ID NO：10的CD28铰链结构域。
7.根据方面1-6中任一项的CAR，其中所述胞内T细胞信号传导结构域包含SEQ IDNO：8的4-1BB胞内T细胞信号传导结构域，SEQ ID NO：9的CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域，或上述两者。
8.根据方面1-7中任一项的CAR，其中所述CAR还包含间隔子。
9.嵌合抗原受体(CAR)，其包含对CD33具有抗原特异性的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域，其中
(a)所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含hP67.6的CDR1、CDR2和CDR3区；和/或
(b)所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含hP67.6的CDR1、CDR2和CDR3区，
其中所述CDR区是SEQ ID NOS：47-52中的CDR区。
10.根据方面9的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：3的重链可变区。
11.根据方面9或10的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：5的轻链可变区。
12.根据方面9-11中任一项的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：4的接头序列。
13.根据方面9-12中任一项的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：3、4和5的抗原结合结构域。
14.根据方面9-13中任一项的CAR，其中所述CAR包含(i)SEQ ID NO：7的CD8跨膜结构域和SEQ ID NO：6的CD8铰链结构域，或(ii)SEQ ID NO：11的CD28跨膜结构域和SEQ IDNO：10的CD28铰链结构域。
15.根据方面9-14中任一项的CAR，其中所述胞内T细胞信号传导结构域包含SEQID NO：8的4-1BB胞内T细胞信号传导结构域，SEQ ID NO：9的CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域，或上述两者。
16.根据方面9-15中任一项的CAR，其中所述CAR还包含间隔子。
17.CAR，其包含SEQ ID NO：16或17或20或21。
18.核酸，其包含编码根据方面1-17中任一项的CAR的核苷酸序列。
19.根据方面18的核酸，其中所述核苷酸序列是密码子优化的。
20.重组表达载体，其包含根据方面18或19的核酸。
21.分离的宿主细胞，其包含方面20的重组表达载体。
22.细胞群，其包含至少一种方面21的宿主细胞。
23.药物组合物，其包含方面1-17中任一项的CAR、方面18或19的核酸、方面20的重组表达载体、方面21的宿主细胞或方面22的细胞群和药学可接受的载体。
24.检测癌症存在的方法，包括：
(a)使包含一种或多种细胞的样品与方面1-17中任一项的CAR、方面18或19的核酸、方面20的重组表达载体、方面21的宿主细胞、方面22的细胞群或方面23的药物组合物接触，从而形成复合物，以及
(b)检测复合物，其中检测到复合物指示癌症的存在。
25.根据方面24的方法，其中所述癌症是急性骨髓性白血病。
26.方面1-17中任一项的CAR、方面18或19的核酸、方面20的重组表达载体、方面21的宿主细胞、方面22的细胞群或方面23的药物组合物，其用于治疗或预防哺乳动物的癌症的用途。
27.方面26的CAR，核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群体或药物组合物，其中所述癌症是急性骨髓性白血病。
28.治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的方面1-17中任一项的CAR、方面18或19中的核酸、方面20的重组表达载体、方面21的宿主细胞、方面22的细胞群或方面23的药物组合物。
29.根据方面29的方法，其中所述癌症是急性骨髓性白血病。
下述实施例进一步阐明本发明，但是当然不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
本实施例显示了根据本发明实施方案的CAR的使用。
CAR构建体
开发了CAR构建体，并将其克隆到第三代慢病毒质粒中，该CAR构建体具有靶标特异性单链片段可变序列(scFv)，其与跨膜结构域连接，并与4-1BB或CD28共刺激结构域，CD3δ信号传导结构域配对。CD33 CAR构建体的scFv来自以下化合物：林妥珠单抗(Hu195，SGN-33)(Co等人,J.Immunol.,148:1149-54(1992))和CD33Mylo(吉妥单抗，商品名：Mylotarg，公司：Wyeth，人源化mAb/calicheamicin，CD33；美国专利第5,739,116号；Cowan等人，FrontBiosci(Landmark Ed).，18：1311-34(2013))。CD123 CAR来自32716-scFv(国际专利申请公开号WO 2014/144622)。这些CAR被亚克隆到pELNS慢病毒载体主链中。所有限制酶均购自New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)。通过在Macrogen(Rockville，MD，USA)进行测序来确认所有CAR构建体的序列。参见图1A和1B。
细胞系
表达GFP和萦光素酶的AML细胞系MV411，THP1和MOLM14含有不同水平的CD33表达，并且外显子2剪接变异的不同基因型(Laszlo等人，Oncotarget，7：43281-94(2016))被用来测试CAR的功效。通过DNA分离，发现MOLM14具有CC基因型并且不包含SNP，而THP1和MV411对于SNP都是杂合的，具有CT基因型(Lamba等人，J.Clin.Oncol.，35：2674-82(2017))。该细胞系既不表达CD33也不表达CD123。MV411是从一名患有急性单核细胞白血病(AML FAB M5)的10岁男孩建立的一种急性单核细胞白血病系。MOLM14是一种急性骨髓性白血病系，其从一名在最初的骨髓增生异常综合征(MDS，难治性贫血伴原始细胞增多，RAEB)之后于1995年复发时患有急性骨髓性白血病AML FAB M5a的20岁男性的外周血建立。THP-1是源自急性单核细胞白血病患者的人单核细胞系。K562是从一名53岁的女性慢性髓细胞白血病患者建立并衍生的一种人红白血病白血病系。
CAR T细胞生成
通过瞬时转染Lenti-X 293T慢病毒包装细胞系产生了编码CD33或CD123 CAR的慢病毒载体。将Lenti-X 293T细胞接种到聚D赖氨酸包被的15-cm平板(BD Biosciences,SanJose,CA,USA)中。第二天，使用脂质体3000(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)，利用编码CAR的质粒以及包装和包膜载体(pMDLg/pRRE，pMD-2G和pRSV-Rev)一起转染Lenti-X 293T细胞。转染后24和48小时收获慢病毒上清液，以3000RPM离心10分钟以除去细胞碎片，在干冰上冷冻并保存在-80℃。使用NIH批准的方案从正常供体中获得人PBMC，并在含有40IU/mL重组IL-2和5％FBS的AIM-V培养基中以1：3比例的CD3/CD28微珠(DynabeadsHuman T-Expander CD3/CD28，Thermo Fisher Scientific，Cat#11141D)激活24小时。将激活的T细胞在6孔板中以每2mL慢病毒上清液加含有10mcg/mL硫酸鱼精蛋白和100IU/mL IL-2的1mL新鲜AIM-V培养基中200万个细胞进行重悬。将板在32℃以1000×g离心2小时，并在37℃孵育过夜。第二天，通过重复上述相同的转导程序进行第二次转导。转导后第三天，将CD3/CD28珠去除，并将细胞以300,000个细胞/mL在含有100IU/mL IL2的AIM-V中培养，每2-3天添加新鲜的含IL2的培养基，直至第8天或第9天收获。
流式细胞术
使用蛋白-L(Themo Fisher)或生物素化的人Siglec-3/CD33蛋白(AcroBiosystems，Newark，DE，USA)，然后与链霉亲和素-PE(BioLegend,San Diego,CA,USA)孵育，通过流式细胞术确定CD33CAR转导的T细胞的表面表达。用蛋白-L检测CD123 CAR表达。使用来自eBioscience(Thermo Fisher)的以下抗体检测CD33，CD123和其它细胞表面标志物的表达：CD33、CD45、CD3、CD8a、CD4、CD10。
PDX
在过继CAR T细胞转移之前一周，将一百万个PDX白血病细胞JMM117注射到NSG小鼠中。在第0天用CAR T细胞处理小鼠。两周后将小鼠取下并进行白血病细胞和CAR T细胞的分析。
细胞毒性测定
将100μl RPMI培养基中的5E4个靶肿瘤细胞加载到96孔板(
Figure BDA0002673010700000371
(Croning,NY)BioCoatTM聚-L-赖氨酸96孔透明TC处理的平底平底测定板)中。第二天，将等量的CAR T细胞加入指定的孔中。将初始的incucyte凋亡标志物(Essen BioScience,Ann Arbor,MI,USA)稀释在100μl PBS中，并将1μl稀释液添加到每个孔中。使用
Figure BDA0002673010700000372
系统每30分钟扫描一次板的GFP和/或RFP萦光表达，持续40小时，以监测细胞凋亡。在每个时间点杀死的细胞的百分比均经过基线校正。
细胞因子产生的分析
靶肿瘤细胞和转导的CAR阳性T细胞用1XPBS洗涤3次，并以1E6/ml重悬于RPMI中。将100μl肿瘤细胞和100μl CAR阳性T细胞的加载到96孔板的每个孔中。建立只有T细胞和只有肿瘤细胞的对照。所有测试均重复进行两次或三次。将细胞在37℃下孵育18小时，并收获120μl的培养物上清液以检测细胞因子的产生。使用ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)或多重分析(Meso Scale Discovery,Rockville,MD,USA)测量上清液中的细胞因子水平。
生物能分析
对于糖酵解应激测试，将CAR-T细胞悬浮在补充有L-谷氨酰胺(200mM)和NaCl(143mM)的无血清无缓冲DMEM培养基(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)中。加入0.6mL的0.5％酚红溶液(SigmaP0290)，终浓度为3mg/L，并将pH值调节至7.35+/-0.05。将CAR-T细胞接种到Seahorse细胞板上(每孔3E5个细胞)，该板包被了Cell-Tak(Corning)以促进T细胞附着。简言之，在测定前一天使盒水合。在测定当天，将板用Cell-Tak包被，并将细胞接种在Cell-Tak包被的板中，并置于XF24分析仪上进行测定。详细步骤如下。首先将测定盒用200μl/孔的XF校准溶液进行水合，添加水合增强剂(hydro booster)，并包裹在石蜡膜中，然后将传感器盒置于通用板的顶部，并在37℃无CO2下孵育过夜。然后将细胞培养板按以下步骤用Cell-Tak包被：对于1个板，将46μl Cell-Tak稀释在204μl TC水和1ml NaHCO3中。将混合物分配在每个孔中50μl，并将板在室温下孵育至少20分钟。去除Cell-Tak溶液后，使用250μl TC水清洗每个孔。将CAR-T细胞(3E5/孔)接种在158μl测定培养基中。然后将细胞培养板在缓慢加速并且不减速下以450rpm旋转1秒，然后将板在缓慢加速并且不减速下以650rpm反方向旋转1秒。然后将板在37℃ 0％CO2下孵育25-30分钟。孵育25-30分钟后，使用手动P200移液器将158μl温的测定培养基缓慢且轻轻地沿壁的侧面添加到每个孔的顶部。将细胞板孵育15-25分钟。15-25分钟后，将板放在XF24分析仪上(校准完成后)。进行XF分析。通过三个端口依次注入溶液：端口A：葡萄糖80mM(3ml测定培养基中的96μl原液)。端口B：寡霉素18μM(3ml测定培养基中的10.8μl原液)。端口C：2DG使用原液。糖酵解应激测试是通过在盒端口加载75μl药物溶液后测量稳态下的ECAR(mpH/min)来进行的。对于线粒体应激测试，将CAR T细胞悬浮在具有D-葡萄糖(25mM)和丙酮酸钠(1mM)的无血清无缓冲DMEM培养基中。通过在稳态下以及依次注射寡霉素(0.5μM)，FCCP(0.5μM)，鱼藤酮(1μM)和抗霉素A(1μM)(Sigma-Aldrich)后测量OCR(pmol/min)，以与上述类似的方式进行线粒体应激测试。使用Seahorse系统的实验采用以下测定条件：2分钟混合；等待2分钟；和3分钟测量。所有样品均进行六次重复测试。
萦光显微镜成像和分析
将MOLM14(4x105)肿瘤细胞接种在ibidiμ-Dish 35mm的Cell-tak包被的内孔的1ml温RPMI中，并在37℃的培养箱中过夜孵育。然后将肿瘤细胞用Hoechst染料(2.5μg/ml)染色。转导T细胞以使其表达CAR-mCherry融合蛋白。分选CAR-T阳性细胞，然后将7.5E5个这些CAR-T细胞与培养皿中的固定MOLM14细胞孵育一个小时。随后将细胞洗涤并用新鲜制备的4％多聚甲醛固定，并固定在非硬化固定介质中以准备成像。
为了评估免疫突触处肌动蛋白的表达，对上述方案进行了修改，并在多聚甲醛固定后用0.1％Triton x使样品透化。细胞用鬼笔环肽640(165nM)染色，然后在固定前洗涤。
使用Zeiss LSM 880采集Airyscan图像。整个实验的曝光设置相同。以z堆栈形式收集图像，以覆盖免疫突触的整个体积。
使用具有63倍物镜的Nikon Eclipse Ti2转盘共聚焦显微镜采集了一些图像。在三个通道(405、488、640nm)的焦平面之上和之下，在10μM范围内，平行获取厚度为0.5μM的z堆栈。每个通道都以50％的激光强度激发，其405、488和640的曝光时间分别为300ms，1s和300ms。使用ImageJ软件进行数据分析。
对于CD33-28和CD33-BBz CAR构建体均观察到免疫突触(IS)处的CAR聚集。相对于未接合两种CAR构建体的细胞，在IS处相关地观察到F-肌动蛋白的积累增加。对每种CAR进行n>10个免疫突触的定量分析，以评估CAR和肌动蛋白的积累。具体而言，测定了突触处的平均萦光强度(MFI)比率vs.T细胞表面其余部分的MFI比率。其它参数包括IS处MFI*体积vs.T细胞其余部分的MFI*体积，IS的MFI*体积vs.T细胞的MFI*体积，以及胞内CAR信号vs.胞外CAR信号。对于肌动蛋白，将IS处的萦光强度针对基线肌动蛋白T细胞表达进行归一化。测定了IS处肌动蛋白的MFI*体积，并减去未接合的T和肿瘤细胞的MFI*体积，以说明基线肌动蛋白表达。
mCherry的序列为：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(SEQ ID NO:40)
体内实验
根据NCI贝塞斯达动物护理和使用委员会(NCI Bethesda Animal Care and UseCommittee)批准的方案进行动物实验。将AML细胞系和异种移植的人AML样本静脉注射到NSG小鼠中。对于表达萤光素酶的品系，使用Xenogen IVIS Lumina(Caliper LifeSciences,Hopkinton,MA,USA)检测白血病。向NSG腹膜内注射3mg D-萤光素(Caliper LifeSciences)，并在4分钟后利用1分钟的曝光时间对AML细胞系进行成像。使用Living Image版本4.1软件(Caliper Life Sciences)分析每只小鼠的总生物发光信号通量，以光子/秒计。取下时，通过流式细胞术评估收获的小鼠的骨髓，脾脏和肝脏。
统计分析
使用Prism 7.0软件进行统计分析。曲线表示为平均值+/-SD。使用未配对的学生t检验计算所有数据的统计显著性。p<0.05被认为是显著的。
CD33和CD123 CAR的开发
使用结合了4-1BB或CD28共刺激结构域的两种scFv开发了第二代CAR。对于抗CD33CAR，CD33.1 CAR包含吉妥单抗抗体，其也被称为Mylotarg；CD33.2 CAR包含称为林妥珠单抗的抗体或人源化M195(Hu195)。抗CD123 CAR衍生自32716，这是一种与人CD123特异性结合的小鼠单克隆抗体。转导后，蛋白L检测表明，具有相同scFv的CAR具有相似量的转导效率，而与共刺激结构域无关。转导效率的差异似乎与scFv有关。在CD123 CAR中，转导效率更高；但是，CAR表面表达密度通常看起来低于CD33 CAR。参见图2A-2F。
评估AML上的CD33和CD123表面表达
使用抗CD33流抗体评估了四种细胞系K562，MV411，MOLM14和THP1的CD33表面表达。MV411，MOLM14和THP1以CD33表面表达增加的升序表达CD33。对于CD123表面表达，按K562，THP1，MOLM14和MV411的顺序增加表面表达。这三种AML细胞系具有广泛的表面表达，因此被选择用于进一步的实验。参见图3A和3B。
体外细胞因子产生和细胞毒性测定证实CAR对肿瘤靶标的活性
体外细胞因子测定用于评估AML CAR的功效。通常，细胞因子的产生与靶抗原表达水平相关，并且揭示了在多个AML细胞系中，配备CD28的CAR始终比配备4-1BB的CAR产生更多的干扰素-γ。通常，CD33.2和CD123 CAR产生的IFN-γ低于CD33.1 CAR。值得注意的是，CD33.1 BBz和CD28z以及CD33.2 BBz CAR在没有肿瘤抗原刺激的情况下具有一定的产生IFN-γ的活性，而CD33.28z CAR却没有可检测到水平的IFN-γ。
IL-2被认为是CAR功效的更可靠的制造者。仅当与CD33高抗原表达THP1细胞系孵育时，CD33.1-28z和CD33.1-BBz才会产生大量的IL-2。相比之下，CD33.2-28z CAR针对THP1系产生相当水平的IL-2，并且针对MOLM14(其具有中等水平的靶抗原表达)产生适量的IL-2。CD123 CAR还针对MOLM14和THP1产生了适量的IL-2，但针对MV411无可检测水平的IL-2。CD33.1和CD33.2 CAR均针对MV411产生了低水平的IL-2，表明低体内活性可能归因于表面抗原表达低，也表明体内活性可能低。参见图4A-4F。
在IncuCyte杀伤测定中，将CD33 CAR转导的T细胞与靶白血病细胞一起孵育。绘制了活白血病细胞相对于原始接种细胞的百分比。该图显示了THP1，MV411和MOLM14白血病的体外有效杀伤。参见图5A-5E。
28z CAR在AML模型上比4-1BB CAR更有效，并且BBz CAR显示出髓外疾病复发模式
为了在体内转化这些发现，将THP1 AML细胞注射入异种移植模型并用CD33 CAR T细胞处理。通过生物发光成像，CD33.1 CAR显示出比CD33.2 CAR更多的毒性，这与用体重减轻，低体温症和嗜睡观察到的一样。CD33.2-CD28z处理的小鼠没有可检测到的疾病，而CD33-4-1BB处理的小鼠患有白血病，这表明配备28z的CAR在消除AML方面比4-1BB CAR更有效。这与ALL模型中的观察结果不同。用THP1模型上的CD123 CAR，MOLM14模型上的CD33.1CAR进一步证实了这一现象。
结合的体外和体内结果表明，共刺激结构域确实在CAR T细胞功能中起关键作用，并且可能在不同的肿瘤模型中产生不同的影响。为了确认通过生物发光检测到的小鼠中AML的存在，对小鼠组织进行了流式细胞术。CD33-4-1BB处理的动物在骨髓中没有任何白血病，表明存在髓外疾病(EMD)。效力较低的CD33-4-1BB CAR处理的小鼠中EMD的发展表明，CAR免疫压力可能足以有效清除白血病的主要部位(如骨髓)，但不能消除AML可以播种的继发组织疾病。
为了进一步研究这两个共同刺激因子的作用，使用了另一种AML模型MV411，即使没有CAR压力，该模型也经常与EMD一起出现。在针对MV411使用CD33.2-CD28的情况下，在骨髓中有清除，但是CD33.2-CD28 CAR不能阻止EMD的发展。这些实验表明，尽管在THP1中CD28共刺激结构域比4-1BB更有效，但CD28的效力仍不能在所有模型中克服EMD。
在MOLM14模型中，当收获组织以观察小鼠中白血病和CAR T细胞的表型时，使用流式细胞术分析这些细胞类型。在GFP CAR处理的小鼠中，在骨髓区和脾脏区中发现了CD33+白血病和转导的T细胞。在CD33.1 BBz CAR处理的疾病中，在骨髓和脾脏中发现少量的CD33+白血病，在腿部和肠周围包裹的实体瘤中发现了大量CD33+白血病。肿瘤细胞的流式分析表明，AML仍保留CD33表面表达，转变是CD33的量减少。
为了证实CD33.2 CAR的功效，在侵袭性MOLM14肿瘤模型上进行了剂量滴定。CD33.2-28z CAR用低至500万个CAR+T细胞就可以有效清除白血病。
参见图6A-6E。
CD33.2-CD28z CAR根除PDX的有效活性
使用临床相关的原代儿童期AML PDX模型来验证CD33 CAR的活性。在第-7天将一百万个PDX白血病细胞JMM117注射入NSG小鼠，然后在第0天注射入ADT的1E6个CAR T细胞。CD28CAR优于BBz CAR，并且CD33.2-BBz在体内表现优于CD33.1-BBz CAR(图7A)。在第2周的流式分析证实了这一点，即经CD33.1处理的小鼠脾脏具有可检测的白血病水平，而在CD33.2 CAR组中则接近于无(图7B)。此外，此PDX模型显示具有41-BBz共刺激结构域的CAR保持升高的时间更长(图7C)。当查看CAR持久性时，观察到在CD33.1和CD33.2 CAR上，4-1BBz版本以远高于CD28z CAR的量保持可检测，这可能与AML模型中BBz CAR的高毒性有关。
与4-1BB CAR相比，含有CD28z的CAR显示出增加的效力，但是没有增加的毒性。尽管CD19 CAR-T细胞处理后延长的B细胞发育不全可能是可接受的结果，但考虑到髓细胞定向CAR-T细胞方法后的骨髓抑制和持久性发育不全延长的问题，基于较不持久的CD28z的CAR可能更有利，其不仅更有效地根除疾病，而且在CAR的自我限制的持久性的情况下允许正常的造血恢复。耗尽CD123 CAR的策略或考虑在AML定向的CAR之后进行造血干细胞移植(HSCT)代表了其他有效消除持久性CAR并恢复有效造血功能的策略。
基于以上所述，与所有其他构建体相比，CD33.2-CD28z CAR是最有效的CAR，毒性较小。共刺激结构域对抗CD33 CAR的影响与针对抗CD19或抗CD22 CAR的观察结果相反。
实施例2
本实施例显示了白血病细胞上CD33靶抗原表达的流式细胞术分析。
参见图8：U937是从37岁男性患者的组织细胞性淋巴瘤中分离出的髓细胞谱系的组织细胞性淋巴瘤。THP1是从一名患有急性单核细胞白血病的1岁男孩的血液中培养的人急性单核细胞白血病系。NALM6是从一名患有急性成淋巴细胞性白血病的19岁男性的外周血建立的一种人B细胞前体白血病系。MV411是从一名患有急性单核细胞白血病(AML FABM5)的10岁男孩建立的一种急性单核细胞白血病系。MOLM14是一种急性骨髓性白血病系，其从一名在最初的骨髓增生异常综合征(MDS，难治性贫血伴原始细胞增多，RAEB)之后于1995年复发时患有急性骨髓性白血病AML FAB M5a的20岁男性的外周血建立；携带FLT3的内部串联重复；细胞系携带CBLΔExon8突变体。
实施例3
本实施例显示了根据本发明实施方案的CAR的使用。
对构建体的体外测试显示，在多个AML细胞系中，抗CD33CD28 CAR一致地产生比抗CD33 4-1BB CAR更多的IL-2和干扰素-γ。图9A和9B示出了CD33Hu195-CD28Z CAR的结果。
为了在体内转化这些发现，向异种移植模型(小鼠：NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ库存号#005557)注射了MOLM14AML细胞，并用抗CD33 CD28 CAR或抗CD334-1BB CAR T细胞处理。通过生物发光成像，抗CD33 CD28 CAR处理的小鼠没有可检测到的疾病，而抗CD33 4-1BB CAR处理的小鼠则患有白血病。参见图10。
结合的体外和体内结果表明，共刺激结构域确实在CAR T细胞功能中起作用并且可以改善CAR效力。
为了确认通过生物发光检测到的小鼠中AML的存在，对来自模拟和抗CD33 4-1BBCAR处理的小鼠的组织进行了流式细胞术。在模拟T细胞处理的小鼠的骨髓中未发现白血病。相比之下，抗CD33 4-1BB CAR处理的动物在骨髓中没有任何白血病，表明存在髓外疾病(EMD)。效力较低的CD33-4-1BB CAR处理的小鼠中EMD的发展表明，CAR免疫压力可能足以有效清除白血病的主要部位(如骨髓)，但不能消除AML可以播种的继发组织疾病。化疗对AML的治疗通常会导致绿色瘤形式的髓外疾病的发展。
另一种AML模型THP1，即使在没有CAR压力的情况下，也经常与EMD一起出现。在针对THP1使用抗CD33 CD28 CAR的情况下，在骨髓区中有清除，但是抗CD33 CD28 CAR不能阻止EMD的发展。这些实验表明，尽管在MOLM14中CD28共刺激结构域比4-1BB更有效，但CD28的效力仍不能在所有模型中克服EMD。
实施例4
本实施例显示了根据本发明实施方案的CAR的使用。
图11-12示出了附加数据。
图11A：与生物素化的Siglec-3的结合证实了CD33.2 CAR在体外的功能。
图11B：证实了CD33.2-28Z在不同的慢病毒产生环境中的有效活性。
图12A-C：CD33-C28z显示出更强的线粒体呼吸并具有更多的呼吸潜力(sparerespiratory capacity)和更好的ATP产生相关的耗氧率。
图12D-F：令人惊讶的是，CD33-28z还具有增强的糖酵解代谢以及更高的胞外酸化速率。
对于用生物素化的人Siglec-3/CD33蛋白进行的CD33 CAR检测：用以下方法进行CAR检测：添加2μl生物素化的人Siglec-3/CD33蛋白，[Avi Tag(AvitagTM)AcroBiosystems,Newark,DE,USA]，孵育20分钟，洗涤一次，然后与0.5μl的链霉亲和素-PE孵育，再孵育10分钟，洗涤一次，进行FACS分析。
RNAseq数据的主成分分析表明，在与相等数量的MOLM14靶细胞共孵育后6小时或24小时，与CD33.2-28z和CD33.2-BBz CAR相关的不同基因表达谱。
CD33.2-28z显示出无或最低的原位肿瘤毒性。将1E5个CAR+T细胞的与相等数量的代表正常组织的iPS细胞系共同孵育。用来自R&D的IFNg试剂盒检测培养物上清液中的IFNg水平。
实施例5
本实施例显示了根据本发明实施方案的CAR的使用。
NALM6用作非CD33表达肿瘤模型，并与MOLM14模型进行比较。使用CD33.2-28z CAR进行处理。在NALM6模型中，肿瘤继续发展，而在MOLM14模型中，CAR处理3天后肿瘤负荷减轻。参见图13。
在此将本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用并入，其程度如同将各参考文献单独且明确指明通过引用并入，并且在本文整体示出一样。
术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”和“所述(the)”以及类似的指代物在描述本发明的上下文中(特别是在下述权利要求的上下文中)的使用被解释为既涵盖单数又涵盖复数，除非本文另外指明或者上下文明显矛盾。术语“至少一(种)个”之后是一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一个”)的使用应理解为是指从所列项目(A或B)中选择的一个项目或两个或更多个所列项目的任意组合(A和B)，除非本文另外指明或者上下文明显矛盾。术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”以及“含有(containing)”被解释为开放式术语(即，意为“包括但不限于”)除非另外标注。本文数值范围的叙述仅意图作为单独指落入范围内的各独立数值的速记法，除非本文另外指明，并且各独立的数值并入说明书如同本文单独对其进行叙述一样。可以以任何合适的顺序实施本文所述的所有方法，除非本文另外指明或者在其它方面与上下文明显矛盾。本文提供的任何或所有实施例或者示例性语言(例如“如”)的使用仅意图更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制，除非另外声明。说明书中的语言均不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必要的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。经阅读前述描述，那些优选实施方案的改变对于本领域普通技术人员而言可以变得显而易见。发明人期望本领域技术人员视情况应用此类改变，并且发明人意图以与本文具体所述的不同的方式实践本发明。因此，如适用的法律所允许的，本发明包括在此所附的权利要求中所述的主题的所有修饰和等同物。此外，本发明涵盖以上所述元素的所有可能的改变的任何组合，除非本文另外指明或者在其它方面与上下文明显矛盾。
序列表
<110> 美国卫生和人力服务部
秦海瑛
特里·J·弗莱
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<151> 2018-03-14
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Ala Phe Tyr Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
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Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
165 170 175
Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe
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Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser
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Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
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Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln
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260 265 270
Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
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450 455 460
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485
<210> 20
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 20
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro
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65 70 75 80
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100 105 110
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<223> 合成的
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成的
<400> 23
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Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
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Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
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485
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<210> 25
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 25
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cccaagctgc tgatctacgc cgccagcaat cagggcagcg gcgtgcccag cagattcagc 720
ggctctggca gcggcaccga cttcaccctg aacatcagca gcctgcagcc cgacgacttc 780
gccacctact actgccagca gagcaaagag gtgccctgga ccttcggaca gggcaccaag 840
gtggaaatca agactagttc cggaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 900
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 960
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 1020
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1080
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1140
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1200
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1260
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1320
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440
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gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 1536
<210> 27
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 27
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cccctggctc tgctgctgca tgccgccaga 60
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aaggtgtcct gcaaggccag cggctacacc ttcaccgact acaacatgca ctgggtgcgc 240
caggctccag gccagggact ggaatggatc ggctacatct acccctacaa cggcggcacc 300
ggctacaacc agaagttcaa gagcaaggcc accatcaccg ccgacgagag caccaacacc 360
gcctacatgg aactgagcag cctgcggagc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 420
ggcagacccg ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc tagcggaggc 480
ggaggctctg gcggcggagg aagtggcgga ggcggcagcg atatccagat gacccagagc 540
cccagcagcc tgagcgccag cgtgggcgac agagtgacca tcacctgtcg ggccagcgag 600
agcgtggaca actacggcat cagcttcatg aactggttcc agcagaagcc cggcaaggcc 660
cccaagctgc tgatctacgc cgccagcaat cagggcagcg gcgtgcccag cagattcagc 720
ggctctggca gcggcaccga cttcaccctg aacatcagca gcctgcagcc cgacgacttc 780
gccacctact actgccagca gagcaaagag gtgccctgga ccttcggaca gggcaccaag 840
gtggaaatca agactagttc cggagccgcc gccatcgaag tgatgtaccc ccctccctac 900
ctggataacg agaagagcaa cggcaccatc atccacgtga agggaaagca cctgtgtccc 960
agccccctgt ttcccggccc tagcaagccc ttctgggtgc tggtggtggt cggcggagtg 1020
ctggcctgct acagcctcct ggtgaccgtg gccttcatca tcttctgggt gaggagcaag 1080
aggtccaggc tgctgcacag cgactacatg aatatgaccc ccagaaggcc cggccccacc 1140
agaaagcact atcagcccta cgcccccccc agggactttg ccgcctacag gagcagggtg 1200
aagttcagca gatccgccga tgcccctgct taccagcagg gccagaacca gctgtataac 1260
gagctgaacc tgggcaggag ggaggaatac gacgtgctgg ataagaggag gggaagggac 1320
cccgagatgg gcggaaagcc caggaggaag aacccccagg agggcctgta caatgagctg 1380
cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gaggaggagg 1440
ggcaagggcc atgacggcct gtaccaaggc ctgtccaccg ccaccaagga tacctacgac 1500
gccctgcaca tgcaggccct gcctcccagg ggatcctaa 1539
<210> 28
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 28
atggctctgc ccgtcacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgccgccaga 60
cctcaggtgc agctcgtgca gagcggcgct gaggtgaaga aacctggcag cagcgtgaag 120
gtgagctgca aggcctccgg ctacaccttc accgactaca acatgcactg ggtgaggcaa 180
gcccctggcc agggactgga gtggatcggc tacatctacc cttacaacgg cggcacaggc 240
tacaaccaga agttcaagtc caaggccacc atcaccgccg atgagtccac caataccgcc 300
tacatggagc tcagcagcct gaggtccgag gacacagccg tctactactg cgccaggggc 360
aggcccgcta tggactactg gggccagggc accctggtga cagtgagctc tggtggcggc 420
ggatccggcg gcggcggcag cggcggcggc ggctccgaca ttcagatgac ccagagccct 480
agcagcctga gcgcttccgt gggagacagg gtgaccatca catgcagggc ctccgagagc 540
gtggacaatt acggcatcag cttcatgaac tggttccagc agaagcccgg caaggccccc 600
aaactgctga tctatgccgc cagcaatcag ggctccggcg tgcctagcag gttttccggc 660
agcggcagcg gcaccgactt taccctgacc atctccagcc tgcagcctga cgatttcgcc 720
acctactact gccagcagag caaggaggtg ccttggacct ttggacaggg cacaaaggtg 780
gagatcaagt ccggaaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa 1020
ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1080
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1140
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440
cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1467
<210> 29
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 29
atggctctgc ccgtcacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgccgccaga 60
cctcaggtgc agctcgtgca gagcggcgct gaggtgaaga aacctggcag cagcgtgaag 120
gtgagctgca aggcctccgg ctacaccttc accgactaca acatgcactg ggtgaggcaa 180
gcccctggcc agggactgga gtggatcggc tacatctacc cttacaacgg cggcacaggc 240
tacaaccaga agttcaagtc caaggccacc atcaccgccg atgagtccac caataccgcc 300
tacatggagc tcagcagcct gaggtccgag gacacagccg tctactactg cgccaggggc 360
aggcccgcta tggactactg gggccagggc accctggtga cagtgagctc tggtggcggc 420
ggatccggcg gcggcggcag cggcggcggc ggctccgaca ttcagatgac ccagagccct 480
agcagcctga gcgcttccgt gggagacagg gtgaccatca catgcagggc ctccgagagc 540
gtggacaatt acggcatcag cttcatgaac tggttccagc agaagcccgg caaggccccc 600
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acctactact gccagcagag caaggaggtg ccttggacct ttggacaggg cacaaaggtg 780
gagatcaagt ccggagccgc cgccatcgaa gtgatgtacc cccctcccta cctggataac 840
gagaagagca acggcaccat catccacgtg aagggaaagc acctgtgtcc cagccccctg 900
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ctgctgcaca gcgactacat gaatatgacc cccagaaggc ccggccccac cagaaagcac 1080
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catgacggcc tgtaccaagg cctgtccacc gccaccaagg atacctacga cgccctgcac 1440
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<210> 30
<211> 7691
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 30
gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt 60
gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc 120
cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag 180
ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc 240
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cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg 360
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ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc 480
ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 540
cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt 600
cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt 660
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cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 900
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acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1980
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 2040
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 2100
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tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 2340
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aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 2760
ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 2820
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2880
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2940
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 3000
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 3060
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 3120
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agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 3240
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 3300
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 3360
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gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 3540
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ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc 3960
gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc 4020
ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 4080
atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc 4140
tgcaagctta atgtagtctt atgcaatact cttgtagtct tgcaacatgg taacgatgag 4200
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gtggtacgat cgtgccttat taggaaggca acagacgggt ctgacatgga ttggacgaac 4320
cactgaattg ccgcattgca gagatattgt atttaagtgc ctagctcgat acataaacgg 4380
gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 4440
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tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag 4560
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tataaattaa aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct 4860
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attatcgttt cagacccacc tcccaacccc gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga 5880
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gtatcgatta gactgtagcc caggaatatg gcagctagat tgtacacatt tagaaggaaa 6000
agttatcttg gtagcagttc atgtagccag tggatatata gaagcagaag taattccagc 6060
agagacaggg caagaaacag catacttcct cttaaaatta gcaggaagat ggccagtaaa 6120
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cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 7380
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ggtgtcgtga g 7691
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<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
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Cys Gln
<210> 32
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
1 5 10 15
Thr Leu Asn Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
20 25 30
Cys Gln
<210> 33
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr
1 5 10 15
Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala
20 25
<210> 34
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Asp Phe Tyr
1 5 10 15
Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala
20 25
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<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
130 135 140
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
145 150 155 160
Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Thr Ser Ser Gly
245
<210> 36
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala
130 135 140
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Val Lys Arg
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
1 5 10
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Thr Ser Ser Gly
1
<210> 39
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Ser Gly
1
<210> 40
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 40
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Asp Tyr Asn Met His
1 5
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
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Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser Lys Ala
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
1 5 10
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成的
<400> 46
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr
1 5
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<212> PRT
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<223> 合成的
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Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser Asn
1 5
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Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr
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Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr
1 5
<210> 50
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Glu Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe
1 5 10
<210> 51
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Ala Ala Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser
1 5

Claims (27)

1.嵌合抗原受体(CAR)，其包含对CD33具有抗原特异性的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域，其中
(a)所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含Hu195的CDR1、CDR2和CDR3区；或
(b)所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含Hu195的CDR1、CDR2和CDR3区，
其中所述CDR区是SEQ ID NOS：41-46中的CDR区。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：15的重链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：16的轻链可变区。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：4的接头序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：15、4和16的抗原结合结构域。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含(i)SEQ ID NO：7的CD8跨膜结构域和SEQ ID NO：6的CD8铰链结构域，或(ii)SEQ ID NO：11的CD28跨膜结构域和SEQ IDNO：10的CD28铰链结构域。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的CAR，其中所述胞内T细胞信号传导结构域包含SEQID NO：8的4-1BB胞内T细胞信号传导结构域，SEQ ID NO：9的CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域，或上述两者。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的CAR，其中所述CAR还包含间隔子。
9.嵌合抗原受体(CAR)，其包含对CD33具有抗原特异性的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域，其中
(a)所述抗原结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含hP67.6的CDR1、CDR2和CDR3区；和/或
(b)所述抗原结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含hP67.6的CDR1、CDR2和CDR3区，
其中所述CDR区是SEQ ID NOS：47-52中的CDR区。
10.根据权利要求9所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：3的重链可变区。
11.根据权利要求9或10所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：5的轻链可变区。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：4的接头序列。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO：3、4和5的抗原结合结构域。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含(i)SEQ ID NO：7的CD8跨膜结构域和SEQ ID NO：6的CD8铰链结构域，或(ii)SEQ ID NO：11的CD28跨膜结构域和SEQID NO：10的CD28铰链结构域。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的CAR，其中所述胞内T细胞信号传导结构域包含SEQ ID NO：8的4-1BB胞内T细胞信号传导结构域，SEQ ID NO：9的CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域，或上述两者。
16.根据权利要求9-15中任一项所述的CAR，其中所述CAR还包含间隔子。
17.CAR，其包含SEQ ID NO：16或17或20或21。
18.核酸，其包含编码权利要求1-17中任一项所述的CAR的核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述的核酸，其中所述核苷酸序列是密码子优化的。
20.重组表达载体，其包含权利要求18或19所述的核酸。
21.分离的宿主细胞，其包含权利要求20所述的重组表达载体。
22.细胞群，其包含至少一种权利要求21所述的宿主细胞。
23.药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项所述的CAR、权利要求18或19所述的核酸、权利要求20所述的重组表达载体、权利要求21所述的宿主细胞或权利要求22所述的细胞群以及药学可接受的载体。
24.检测癌症存在的方法，包括：
(a)使包含一种或多种细胞的样品与权利要求1-17中任一项所述的CAR、权利要求18或19所述的核酸、权利要求20所述的重组表达载体、权利要求21所述的宿主细胞、或权利要求22所述的细胞群或权利要求23所述的药物组合物接触，从而形成复合物，以及
(b)检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示癌症的存在。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述癌症是急性骨髓性白血病。
26.权利要求1-17中任一项所述的CAR、权利要求18或19所述的核酸、权利要求20所述的重组表达载体、权利要求21所述的宿主细胞、权利要求22所述的细胞群或权利要求23所述的药物组合物，其用于治疗或预防哺乳动物的癌症的用途。
27.根据权利要求26所述的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体或药物组合物，其中所述癌症是急性骨髓性白血病。
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