CN104877032B - Cd33特异性嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CD33特异性嵌合抗原受体及其应用，该嵌合抗原受体由小鼠抗人CD33的单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内区、CD3ζ的胞内信号结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T淋巴细胞用于急性髓系白血病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及编码CD33特异性嵌合抗原受体的核酸和表达嵌合抗原受体的T细胞，可用于急性髓系白血病的过继细胞治疗药物(adoptive cell therapy,ACT)领域。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)是人工合成的T细胞受体，由胞外靶向连接区(由单链抗体或配体)，以及T细胞的激活信号结构域(铰链区、跨膜区、胞内信号转导区)组成。胞外靶向连接区由单链抗体或配体构成，具有特异性结合靶抗原的功能。铰链区往往采用CD8、CD4或IgG4分子的铰链区。跨膜区由亲脂性的氨基酸序列组成，往往采用CD8、CD28的跨膜区段。胞内信号转导区由CD3ζ链或FcεRⅠγ链以及共刺激信号分子CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、ICOS、CD244等构成。仅含有CD3ζ链或FcεRⅠγ链为第一代CAR，包含1个共刺激信号分子为第二代CAR，含有2个及以上共刺激信号分子的CAR被划分为第三代。CAR修饰的T细胞通过胞外靶向连接区识别肿瘤表面抗原，然后通过胞内信号转导区将识别信号传递到细胞内，激活T细胞并发挥杀伤肿瘤细胞作用。
CAR能够识别细胞表面未经加工处理的蛋白，不受MHC限制；且CAR与配体之间的结合力较正常T细胞受体与肽-MHC间的结合力更大；CAR的识别也不受共刺激分子协同表达的限制。因此，CAR修饰T细胞过继治疗可较好地克服肿瘤细胞的下调MHC分子或者减少共刺激因子表达等免疫逃避机制。
CD33是髓系分化抗原，在85～98％的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞中高表达，在正常髓系祖细胞、髓系细胞中低表达。因此，CD33是AML有针对性的肿瘤靶抗原。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种CD33特异性嵌合抗原受体及其应用，所述CAR特异性结合到靶抗原上，并发挥针对AML的细胞毒效应。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种CD33特异性嵌合抗原受体，嵌合抗原受体由小鼠抗人CD33的单链抗体scFv、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域及CD3ζ的胞内信号结构串联构成；嵌合抗原受体含有CD33特异性的单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；嵌合抗原受体的轻链和重链之间由氨基酸序列为Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser的连接肽连接而成。
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述嵌合抗原受体以CD8α铰链区及CD28、CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构域为T细胞刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述的CD33特异性嵌合抗原受体在急性髓系白血病治疗中的应用。
本发明的有益效果是：本发明从分泌CD33杂交瘤细胞中提取RNA，逆转成cDNA，经通用小鼠Fab框架区引物扩增出轻链、重链可变区片段，并经重叠延伸PCR技术加入linker形成CD33特异性scFv。并将构建的scFv片段克隆到含有信号肽和CD8-CD28-CD3ζ的慢病毒表达载体中，包装成携带scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ编码基因的慢病毒载体。利用慢病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。通过流式细胞术、LDH细胞毒性分析实验、以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达CD33的AML具有特异杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ可在AML治疗中应用。
附图说明
图1是本发明所述的CD33单抗的轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、以及两者连接后的单链抗体片段的PCR扩增电泳图(1泳道：2kb核酸分子量标准；2泳道：VL；3泳道：VH；4泳道：CD33scFv)。
图2是本发明所述慢病毒表达载体scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图。其中，1泳道：15kb核酸分子量标记；2泳道：用核酸内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切慢病毒表达质粒scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ所得到的编码scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ的DNA片段(1411bp)和载体片段(7309bp)；3泳道：未酶切的CAR载体。
图3是本发明所述的慢病毒表达载体示意图，其中逆时针序列是正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图4是流式细胞术检测本发明构建的scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ修饰T细胞中CAR分子的表达。其中，A为未转染的T细胞；B转染CAR的T细胞。
图5是流式细胞术检测AML细胞系HL-60、THP-1、U937、Kasumi-1、KG-1、KG-1a、K562细胞中CD33靶抗原分子的中位荧光强度。
图6是本发明所述的scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ修饰T细胞与CD33阳性的U937细胞系按效靶比1：2共培养6小时、72小时后残留的U937细胞其中，CAR为scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ修饰T细胞的实验组；NTD为不加修饰T细胞的对照组。
图7是本发明所述的scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ修饰T细胞对U937细胞系(效靶比1：2)杀伤作用的LDH释放检测。其中，CAR-T为scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ修饰T细胞的实验组；NTD-T为不加修饰的T细胞的对照组。
图8是本发明所述的scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ修饰T细胞与HL-60、THP-1、U937、Kasumi-1、KG-1、KG-1a、K562细胞系按效靶比1：1共培养12小时后，T细胞释放的细胞因子IFN-γ(图中A)、IL-2(图中B)、TNF-α(图中C)水平。其中，CD33CAR为scFv CD33-CD8-CD28-CD3ζ修饰T细胞的实验组；NTD-T为不加修饰的T细胞的对照组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的CD33特异性嵌合抗原受体，嵌合抗原受体由小鼠抗人CD33的单链抗体scFv、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域及CD3ζ的胞内信号结构串联构成；嵌合抗原受体含有CD33特异性的单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；嵌合抗原受体的轻链和重链之间由氨基酸序列为Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(如SEQ ID NO.6所示)的连接肽连接而成。
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述嵌合抗原受体以CD8α铰链区及CD28跨膜区和胞内信号结构域、CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构域为T细胞刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述的CD33特异性嵌合抗原受体在抗急性髓系白血病药物中的应用。本发明提供了CD33特异性的嵌合抗原受体，所述CAR特异性结合到靶抗原上，并发挥针对AML的细胞毒效应。该嵌合抗原受体以CD33特异性单链抗体、CD8hinge区及CD28跨膜区和胞内信号结构域、CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO.1所示；其编码的基因序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
所述的嵌合抗原受体CD33scFv-CD8-CD28-CD3ζ用于AML肿瘤治疗。该嵌合抗原受体采用慢病毒感染T细胞，制备嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)，用于AML的细胞免疫治疗。
实施例1：嵌合抗原受体CD33特异性单链抗体的构建
本发明以分泌抗CD33单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系(余鸣等，1994，单克隆抗体通讯，10：3，18－21)的Fab序列设计合成的抗CD33scFv。
(一)提取分泌CD33单抗杂交瘤细胞系的总RNA：5×106杂交瘤细胞团块中加入RNAiso Plus(Takara)1mL，吹打混匀。加入200μl三氯甲烷，上下颠倒、涡旋振荡混匀。4℃，12000rpm，离心5分钟。吸取上清至1.5ml EP管，加入同体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀。4℃，12500rpm，离心15分钟。4℃预冷75％乙醇沉淀RNA 2次后，50μl DEPC水溶解总RNA。
(二)逆转录合成cDNA第一链：配制PCR反应体系(20μl)如下：Oligo d(T)15Primers:2μl；M-MLV(200u/μl):1μl；dNTP(each 2.5mM):1μl；DTT(0.1M):2μl；Firststrand buffer(5×):4μl；CD33-RNA:2μg；DEPC水:补足至20μl。反应条件：37℃，60分钟，70℃10分钟。
(三)PCR扩增CD33单克隆抗体VL、VH的基因片段：
P1：5’GAC ATT GTG CTC ACC CAG WCT SMH 3’
P2：5’CCG TTA GTA CTC CAR BTT KGT SCS 3’
P3：5’CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG 3’
P4：5’TGA GGA GAC KGT GAC HGT GGT SCC 3’
配制VL、VH PCR反应体系(20μl)如下：2×Taq PCR Master Mix(TianGen公司):10μl；10μM P1(VL)/P3(VH):1μl；10μM P2(VL)/P4(VH):1μl；cDNA:1μl；ddH2O:补足至20μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环33次：94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 1分钟；最后，72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)通过T4连接酶(Takara公司)进行连接，送检测序，保留测序正确克隆。连接反应体系及反应条件如下：VL PCR产物/VH PCR产物各50ng，pMD19-T(simple)载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl，16℃连接过夜。连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，扩大培养后，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，经酶切和测序检测，将正确的质粒名称分别命名为L和H。
(四)构建VL-linker-VH方向anti-CD33scFv片段
P5:5’GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CCA 3’
P6:5’ACC AGA TCC ACC TCC ACC CGA GCC ACC GCC ACC CCG TTT GAG CTC CAATTT GGT GCC 3’
P7:5’TCG GGT GGA GGT GGA TCT GGT GGT GGC GGT TCG CAG GTC AAG CTG CAGCAG TCT G 3’
P8:5’TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT 3’
分别配制L、H的第一步重叠延伸PCR反应体系(20μl)：2×pfu PCR Master mix(TianGen公司):10μl；10μM P5引物(VL)、P6引物(VL):各1μl/10μM P7引物(VH)、P7引物(VH)/P8引物(VH):各1μl；L质粒:150ng/H质粒:150ng；ddH2O补足至20μl。反应条件：94℃ 4分钟预变性；重复如下循环30次：94℃ 30秒，59℃ 30秒，72℃ 1分钟；然后，72℃延伸5分钟。琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。
配制第二步重叠延伸PCR反应体系(25μl):2×Taq PCR Master Mix(TianGen公司)；10μM P5引物:1μl；10μM P8引物:1μl；VL、VH片段：各200ng；ddH2O：补足至20μl。反应条件：94℃ 5分钟预变性；重复如下循环28次：94℃ 30秒，58℃ 1分钟，72℃ 1分钟30秒；然后，72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分离并回收scFv片段(如图1)。将回收后的scFv片段与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)通过T4连接酶(Takara公司)进行连接，连接反应体系及反应条件如下：scFv PCR产物50ng，pMD19-T(simple)载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl，16℃连接过夜。连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，扩大培养后，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，经酶切和测序检测，将正确的质粒名称命名为LH-scFv。
(五)构建anti-CD33scFv-CD8hinge-CD28-CD3CAR目的载体：1.采用BamH I、EcoRI核酸内切酶酶切前期构建的含有CD8-CD28-CD3Z片段的质粒，获得CD8-CD28-CD3Z片段。2.设计两端分别带有BamH I、EcoR I酶切位点的引物，扩增anti-CD33scFv片段。3.将LH-scFv片段与目的载体进行连接，将构建的anti-CD33scFv-CD8hinge-CD28-CD3CAR目的载体用BamHⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定(如图2酶切结果表明阳性克隆含有目的条带且测序鉴定正确)。
实施例2：嵌合抗原受体anti-CD33scFv-CD8hinge-CD28-CD3慢病毒修饰T细胞的制备
(一)采用EndoFree Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒(QIAGEN公司)提取CD33scFv-CD28-CD3ζ转移质粒和包装质粒psPAX2、PMD.2G。三种质粒用4：3：1比例用Turbofect转染试剂(Thermo公司)进行转染(具体方法见Turbofect转染试剂说明书)。转染后24小时、48小时分别收取病毒上清，于4℃，3000rpm，离心10分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用50000g，4℃，3小时超速离心后浓缩10倍，后转入-80℃保存。
(二)T细胞的制备：取新鲜健康人外周血10ml，采用RosetteSep T cellenrichment Cocktail(Stemcell公司)和Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare公司)提取T细胞(具体步骤按照RosetteSep T cell enrichment Cocktail说明书)。按细胞：磁珠＝1：1比例加入抗CD3/CD28磁珠(Gibco公司)，培养24小时即为转染前的T细胞。
(三)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养：从-80℃中取出病毒上清，室温下融化，按每1×106T细胞加入100μl病毒上清，加入Polybrene至终浓度为8μg/ml。32℃，1800rpm，离心1.5小时，转入5％CO2，37℃孵箱培养。
(四)流式细胞术检测CAR修饰T细胞膜表面CAR的表达：使用Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG(Fab’)2抗体(Jackson ImmunoResearch公司)染色，冰上孵育30分钟后，进行流式细胞术分析T细胞表面CAR的表达效率为58％(见图4)。
实施例3：嵌合抗原受体anti-CD33scFv-CD8hinge-CD28-CD3慢病毒修饰T细胞对AML细胞的杀伤作用
(一)多种AML细胞系中CD33表达水平：HL-60、THP-1、U937、Kasumi-1、KG-1、KG-1a、K562细胞系均购自美国ATCC。分别培养后，各吸取5×105细胞悬液，PBS洗2次后，标记APC抗人CD33单抗(Biolegend公司)，以标记APC-isotype为对照组，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各种AML细胞系的CD33表达的水平。HL-60、THP-1、U937、Kasumi-1、KG-1、KG1-a、K562细胞系表达CD33的百分率分别为100％、99.2％、99.6％、98.9％、95.3％、69.8％、0.21％；中位荧光强度(median fluorescence intensity,MFI)分别为4377、4312、3219、2305、1440.4、463、0(见图5)。
(二)CAR修饰的T细胞与U937细胞系共培养后流式残留U937细胞：将U937细胞按6.3×105细胞/孔接种24孔培养板，加入6.3×105CAR修饰的T细胞，未转染T细胞(NTD-T)设为对照组，于孵箱中共培养。将共培养后的细胞于标记APC抗人CD33单抗(Biolegend公司)，流式细胞术检测残留U937细胞。结果显示在CAR-T与U937以效靶比共培养6小时，共培养体系中表型为CD33+、CD3-的U937细胞已不存在；而在NTD-T与U937即使共培养72小时，仍然存在CD33+、CD3-的U937细胞(见图6)。
(三)LDH释放法分析CAR修饰的T细胞对U937细胞的杀伤作用：将CAR-T及NTD-T细胞分别与U937细胞按照效靶比1：2进行共培养，应用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)检测共培养上清中U937细胞溶解后释放LDH来计算细胞毒效应。方法如下：按每孔1×104细胞接种96孔圆底细胞培养板中。设立CAR-T组、NTD-T组、CAR-T自发释放组、NTD-T自发释放组，培养基背景、体积校正、U937细胞自发LDH释放、U937细胞最大LDH释放，每组设4个复孔。每个孔的终体积相同且不少于100μl。250g离心4分钟，在37℃、5％CO2孵箱中培养6小时。离心前45分钟，向U937最大释放孔加入10μl裂解液(10×)，体积校正孔中加入等量裂解液。室温，250g，离心培养板，4分钟。从每孔转移50μl上清至新的96孔板中，再加入50μl底物溶液，室温避光30min。每孔加入50μl终止液，1h内测定OD490吸光度。根据公式计算溶解百分率：细胞毒性(％)＝[(D实验孔－D培养基背景孔)－(D效应细胞自发LDH释放孔－D培养基背景孔)－(D靶细胞自发LDH释放孔－D培养基背景孔)]/[(D靶细胞最大LDH释放孔－D体积校正孔)－(D靶细胞自发LDH释放孔－D培养基背景孔)]×100％。CAR-T组、NTD-T组的溶解百分率分别为54.3±15.6％、8.7±4.9％，两者具有显著性差异(P＝0.007)(见图7)。
(四)ELISA检测AML细胞系与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平：分别将HL-60、THP-1、U937、Kasumi-1、KG-1、KG-1a、K562细胞系按照6.3×105细胞/孔接种24孔板。按每孔6.3×105细胞分别加入CAR-T、NTD-T细胞，补充培养液至1.5mL，于孵箱中共培养12小时后。采用人IFN-γ、TNFα、IL-2ELISA检测试剂盒(Biolegend公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。表达CD33的AML细胞系HL-60、THP-1、U937、Kasumi-1、KG-1、KG-1a在与CAR-T共培养上清中IFN-γ(图8中A)、IL-2(图8中B)、TNF-α(图8中C)细胞因子水平均较NTD-T组有显著性升高(P<0.001)，但在不表达CD33的K562细胞的共培养上清中的IFN-γ、IL-2、TNF-α细胞因子水平没有统计学差异(P>0.05)。结果表明，嵌合抗原受体anti-CD33scFv-CD8hinge-CD28-CD3修饰的T细胞在表达CD33的AML细胞系刺激下，能够分泌Th1类细胞因子。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (5)
1.一种CD33特异性嵌合抗原受体，其特征在于：嵌合抗原受体由小鼠抗人CD33的单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内信号结构域及CD3ζ的胞内信号结构串联构成；嵌合抗原受体含有CD33特异性的单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其编码氨基酸的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；嵌合抗原受体的轻链和重链之间由氨基酸序列为Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser的连接肽连接而成。
2.根据权利要求1所述的CD33特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的CD33特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求2所述的CD33特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体以CD8α铰链区及CD28跨膜区和胞内信号结构域、CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构域为T细胞刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.如权利要求1中所述的CD33特异性嵌合抗原受体在制备治疗抗急性髓系白血病的药物中的应用。
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| CN104140974A (zh) * | 2013-05-08 | 2014-11-12 | 上海益杰生物技术有限公司 | 编码gpc-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc-3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞 |
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2015
- 2015-06-26 CN CN201510362934.4A patent/CN104877032B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104140974A (zh) * | 2013-05-08 | 2014-11-12 | 上海益杰生物技术有限公司 | 编码gpc-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc-3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞 |
Non-Patent Citations (3)
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