KR20230107619A - 유전자 치료를 위한 변형된 바이러스 입자 - Google Patents

유전자 치료를 위한 변형된 바이러스 입자 Download PDF

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KR20230107619A
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폴 알렉산더 헤펜스톨
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유럽피안 몰레큘러 바이올로지 래보러토리
보레아 테라퓨틱스 에스.알.엘.
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Abstract

본 발명은 신규한 표면 변형된 바이러스 캡시드 및 이를 포함하는 재조합 비리온에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 표면 변형된 바이러스 캡시드의 제조를 위한 중간체에 관한 것이다. 표면 변형된 바이러스 캡시드는 선택적으로 및/또는 보다 효율적으로 유전자 요법을 전달하도록 설계된다. 표면 변형된 바이러스 캡시드는 재조합 비리온에 혼입될 때 유전적 이상을 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

유전자 치료를 위한 변형된 바이러스 입자
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 11월 11일에 출원된 미국 임시 출원 제63/112,457호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 참조로 포함된다.
서열목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 포함하며 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. ___________에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 _____sequencelisting.txt이고 크기는 _____바이트이다.
기술분야
본 발명은 유전자 전달 및 유전자 요법을 위한 개선된 표면 변형된 바이러스 캡시드에 관한 것이다. 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 입자가 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 또한 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드에서 천연 결합 부위를 제거하고 리간드를 상기 캡시드에 도입하여 AAV에 향상된 형질도입 효율을 제공하고/제공하거나 표적 세포를 선택적으로 형질도입함으로써 본 발명의 개선된 표면 변형된 바이러스 캡시드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가 양태는 질환의 치료에 사용하기 위한 표면 변형된 바이러스 캡시드, 및 표면 변형된 바이러스 캡시드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 예를 들어 기초 연구에서 유전자 전달 도구로서, 세포의 형질감염을 위한 본 발명의 표면 변형된 바이러스 캡시드에 관한 것이다.
세포에 유전 정보를 전달하는 분자를 도입하는 것은 현대 의학과 기초 연구에서 유용한 도구이다. 바람직한 방법은 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노 관련 바이러스를 포함하는 바이러스로부터 유래된 유전자 전달 비히클의 사용을 포함한다. 이들 중 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV)는 병원성 부족, 복제 불능 및 안정적인 발현으로 인해 생체 내 유전자 치료에 바람직한 바이러스가 되었다. AAV 기반 벡터를 이용한 100건 이상의 임상시험이 진행 중이며, 두 개의 AAV 유전자 치료제가 최근 FDA의 승인을 받았으며, 즉 유전성 망막 질환 치료를 위한 Voretigene neparvovec-rzyl(LUXTURNA)과 척수성 근위축 치료를 위한 Onasemnogene abeparvovec-xioi(ZOLGENSMA)이다.
아데노 관련 바이러스는 파르보바이러스과의 디펜도바이러스속의 구성원이다. 이 바이러스는 외피가 없고, 바이러스 게놈이 20면체 단백질 캡시드 내에 함유되어 있다. 포유류 세포 표면 다당류, 단백질 및 당단백질과 단백질 캡시드의 상호작용은 포유류 표적 세포에 의한 비리온의 내재화를 유발한다. 천연 AAV 단리물 사이에서 단백질 캡시드의 아미노산 서열의 차이는 포유류 세포 표면 단백질에 대한 결합의 상이한 패턴을 유도하고, 따라서 상이한 패턴의 세포 감염성 또는 향성(tropism)을 유도한다.
Kern et al.(문헌[J. Virology 77(20):11072-11081, 2003])은 아데노 관련 바이러스(AAV) 유형 2(AAV-2)로의 세포 감염이 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 대한 결합에 의해 매개되고 헤파린에 의해 경쟁될 수 있음을 개시한다. AAV-2 캡시드 단백질의 돌연변이 분석은 염기성 아미노산 그룹(아르기닌 484, 487, 585, 588 및 라이신 532)이 헤파린 및 HeLa 세포 결합에 기여한다는 것을 보여주었다. 이들 아미노산은 AAV-2 캡시드의 3중 스파이크 영역에서 3개의 클러스터에 위치한다. R484 및 R585에서 돌연변이된 재조합 AAV-2 마우스의 조직 분포는 야생형 재조합 AAV 감염과 비교하여 간 감염이 현저하게 감소했음을 나타내었지만 심장 감염은 계속되었다. 그들은 헤파린 결합이 AAV-2의 감염성에 영향을 미치기는 하지만 필요하지 않은 것 같다고 제안했다. Afione et al.(문헌[J. Virology 89(3):1660-1672, 2014])는 AAV5에 의해 포유류 세포 결합에 기여하는 캡시드 잔기를 확인하기 위해 유사한 분석을 수행하였다.
현재 AAV 유전자 요법에 사용되는 캡시드는 유용성이 제한적이다. 원하는 조직의 열악한 형질도입 효율은 역가가 높은 재조합 바이러스의 투여를 유도하여 표적외 형질도입 및 독성, 특히 간 독성을 유발한다. 현재 접근법의 또 다른 한계는 많은 현재 AAV 캡시드가, 효과적인 치료를 위해 유전자 카고가 전달되어야 하는 특정 세포 유형을 형질도입하는 데 비효율적이라는 것이다.
유전자 치료에 사용하기 위해 재조합 AAV의 세포 결합 특이성을 변경하는 변형된 캡시드를 조작하기 위해 다양한 접근법이 사용되고 있다.
한 가지 접근 방식은 인간, 비인간 영장류 및 기타 포유류에서 새로운 자연 분리주를 찾는 것이다. 예를 들어, WO 2018/160582; WO 2015/121501; WO 2020/223232 참조한다. 이러한 접근법은 원하는 향성을 갖는 캡시드가 발견될 것이라는 확신을 제공하지 않는다.
또 다른 접근법은 펩티드 삽입 없이 치환을 통해 캡시드 단백질의 1차 아미노산 서열을 돌연변이시키는 것이다. 전형적으로 라이브러리는 캡시드 표면의 원하는 영역에 클러스터된 랜덤 아미노산 돌연변이로 작제된다. 그런 다음 라이브러리는 특정 조직에서 회수하여 확인된 특정 조직 및 세포를 형질도입할 수 있는 캡시드 및 생체 내에서 스크리닝된다. 관련 접근법은 알려진 AAV 단리물의 캡시드 서열로부터 외삽하여 조직 및 세포 유형 향성을 변경했을 수 있는 새로운 작용성 캡시드를 예측하기 위해 인 실리코 방법을 적용하는 것이다. 이러한 예측된 캡시드는 합성되고 조직 형질도입 패턴에 대해 생체 내에서 스크리닝된다. 예를 들어, US 9,695,220; US 10,738,087, 및 WO 2019/217911를 참조한다. 이러한 경험적 접근 방식은 고도로 복잡한 라이브러리의 제조 및 경험적 평가에 의존한다. 결과적으로 원하는 향성의 식별은 뜻밖의 발견에 의존한다.
더 직접적인 접근 방식은 캡시드(CAP) 유전자에 세포 표적 펩티드 코딩 영역의 인프레임 삽입을 통해 특정 세포 유형에 결합하는 것으로 알려진 펩티드를 삽입하여 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 변경하는 것이다. 예를 들어, WO 2019/207132; WO 2021/077000; WO 2017/100671; 및 WO 2020/068990를 참조한다. 그러나 이 접근법에는 한계가 있다: 삽입은 재조합 생성물의 생산 중에 비리온 조립을 크게 방해하지 않도록 위치해야 하며, 포유류 세포 표면 표적과의 생산적인 상호 작용 및 후속 내재화를 구동하기 위해 바이러스 캡시드에 위치해야 한다.
또한, 캡시드 조작에 대한 이러한 모든 접근 방식은 광범위한 전임상 및 임상 특성화 없이는 유전자 치료에 사용할 수 없는 완전히 새로운 단백질 캡시드를 생성한다.
우연한 발견에 의존하지 않고 생산 효율을 감소시키지 않거나 투여 시 형질도입 효율을 감소시키지 않는 AAV 캡시드의 조직 특이성을 변경하는 새로운 방법이 필요하다.
WO 2020/225363은 알려진 세포-표적 특이성을 갖는 리간드의 화학적 접합을 사용하여 온전한 비리온의 AAV 캡시드의 조립후 변형을 위한 방법을 개시하고, 이러한 방법에 의해 제조된 표면-변형된 캡시드를 개시한다. 이러한 조립 후 변형 접근 방식을 확장하고 최적화할 필요가 있다.
위의 제한 사항을 고려하여, 관심 있는 특정 세포의 형질도입을 개선하고/개선하거나 더 낮은 역가에서 전달될 때 효과적일 수 있는 관련 표적 조직에 대한 더 높은 형질도입 효율 및 특이성을 가진 새로운 바이러스 플랫폼을 개발할 필요성이 남아 있다.
본 발명의 일 양태는 리간드 부착을 수용하고 관심 리간드를 상기 캡시드에 부착하기 위한 바이러스 캡시드의 화학적 변형이다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드의 천연 결합 부위는 리간드 부착을 수용하도록 바이러스를 변형시키기 전에 제거된다.
본 개시내용의 일 양태에서, 링커를 통해 바이러스 캡시드 단백질에 공유 결합된 리간드 중 하나 이상을 포함하는 표면 변형된 바이러스 캡시드로서, 링커는 가교제 반응성 쌍의 제1 및 제2 구성원 사이의 반응에 의해 형성되는 가교 모이어티; 및 하나 이상의 선택적인 스페이서를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍의 제1 및 제2 구성원은 하기로부터 선택된 반응에 참여한다: Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 시클로첨가(CuAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-아지드 시클로첨가(SPAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-니트론 시클로첨가(SPANC) 반응, 역 전자 요구 디엘스-알더(IEEDD) 반응, 및 슈타우딩거 결찰 및 [4+1] 시클로첨가 반응.
일부 실시형태에서, 가교 모이어티는 8원 고리 및 트리아졸 고리 중 적어도 하나를 포함한다. 특정 실시형태에서, 가교 모이어티는 바이시클릭 모이어티를 형성하기 위해 융합된 8원 고리 및 트리아졸 고리를 모두 포함한다.
일부 실시형태에서, 반응은 변형-촉진 알킨-아지드 시클로첨가(SPAAC) 반응이다. 이들 중 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 시클로옥틴 및 아지드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 시클로옥틴은 디벤질시클로옥틴(DIBO), 디벤조아자시클로옥틴(DBCO), 및 바이아릴아자시클로옥티논 (BARAC), 또는 이들의 유도체로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 시클로옥틴은 DBCO이다.
일부 실시형태에서, 가교 모이어티는 하기 구조를 포함하고:
Figure pct00001
상기 식에서 R1 및 R2는 링커에 대한 부착점을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 반응은 역 전자 요구 디엘스-알더(IEEDD) 반응이다. 이들 중 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 트랜스시클로옥텐 및 테트라진을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가교 모이어티는 하기 구조를 포함하고:
Figure pct00002
상기 식에서 R1 및 R2는 링커에 대한 부착점을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 스페이서를 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 스페이서는 에틸렌 글리콜 단량체이고, 바이러스와 리간드 사이의 링커에 있는 에틸렌 단량체의 총 수는 50개 단량체 미만이다. 특정 실시형태에서, 바이러스와 리간드 사이의 링커에 있는 에틸렌 단량체의 총 수는 25개 단량체 미만이다. 대안적인 실시형태에서, 하나 이상의 스페이서는 1 내지 20개의 에틸렌 글리콜 단량체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 스페이서 각각은 2 내지 8개의 에틸렌 글리콜 단량체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 스페이서 각각은 4개의 에틸렌 글리콜 단량체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 각각 폴리에틸렌 글리콜의 4개의 단량체를 포함하는 적어도 2개의 스페이서를 포함한다.
일부 실시형태에서, 리간드는 세포 유형 특이적 리간드이다. 특정 실시형태에서, 리간드는 사이토카인, 성장 인자, 렉틴, 독소, 단일 사슬 항체, 펩티드 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 링커는 캡시드 단백질 1차 서열의 1차 아미노기에 공유적으로 부착된다. 특정 실시형태에서, 1차 아미노기는 N-말단 아미노기, 라이신 아미노산 잔기 및 아르기닌 아미노산 잔기로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 1차 아미노기는 라이신 아미노산 잔기의 측쇄이다.
일부 실시형태에서, 링커는 리간드의 1차 아미노기를 통해 리간드에 공유적으로 부착된다.
일부 실시형태에서, 링커는 리간드의 1차 서열의 비천연 아미노산 잔기를 통해 리간드에 공유적으로 부착된다. 특정 실시형태에서, 비천연 아미노산 잔기는 하기로부터 선택된 반응에 참여하는 가교제 반응성 쌍의 구성원을 포함한다: Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 시클로첨가(CuAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-아지드 시클로첨가(SPAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-니트론 시클로첨가(SPANC) 반응, 역 전자 요구 디엘스-알더(IEEDD) 반응, 슈타우딩거 결찰 및 [4+1] 시클로첨가 반응. 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 아지드, 시클로옥틴, 시클로옥텐 또는 1,2,4,5 테트라진 모이어티를 포함한다.
대안적인 실시형태에서, 링커는 리간드와 링커의 융합 단백질의 일부이다.
일부 실시형태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 하나 이상의 천연 다당류 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드는 천연 다당류 결합 부위를 제거하도록 변형되지 않았다. 특정 실시형태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 동일한 혈청형의 변형되지 않은 바이러스 캡시드에 비해 증가된 감염성을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드는 하나 이상의 천연 다당류 결합 부위를 제거하도록 변형되었다. 특정 실시형태에서, 제거는 헤파린 설페이트의 결합을 매개하는 것으로 알려진 아미노산의 돌연변이를 통해 이루어진다. 특정 실시형태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 변형되지 않은 바이러스 캡시드와 비교하여 변경된 향성을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 변형되지 않은 바이러스 캡시드와 비교하여 개선된 형질도입 효율을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드는 아데노바이러스 캡시드, 아데노 관련 바이러스 캡시드, 레트로바이러스 캡시드, 렌티바이러스 캡시드, 단순 헤르페스 바이러스 캡시드 및 바쿨로바이러스 캡시드로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드는 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드이다. 특정 실시형태에서, VP1의 585 및 588 또는 VP2 또는 VP3의 유사 위치에 있는 아르기닌 잔기 중 적어도 하나가 돌연변이되었다. 특정 실시형태에서, VP1의 585 및 588에 있는 아르기닌 잔기가 알라닌 잔기로 돌연변이되었다.
일부 실시형태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 캡시드의 표면에 연결된 분산된 PEG 올리고머 또는 PEG 중합체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 기존 중화 항체의 회피, 낮은 면역원성 및 면역 스텔스를 입증한다.
본 개시내용의 일 양태에서, 화학식 I에 따른 리간드에 연결된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 표면 변형된 바이러스 캡시드가 제공된다:
Figure pct00003
상기 식에서,
Figure pct00004
는 바이러스 캡시드이고;
Y 및 Y'는 독립적으로 부착 모이어티이고;
n 및 n'은 독립적으로 0 또는 1 내지 50의 정수이고,
Sp 및 Sp'는 독립적으로 선택적인 스페이서이고;
L은 리간드이고;
x는 바이러스 캡시드에 대한 리간드의 비이고 50 내지 250 범위이고; 및
Q는 하기로부터 선택됨:
Figure pct00005
상기 식에서, Z는 7 또는 8원 시클릭 또는 헤테로환 구조이다. 특정 실시형태에서, x는 80 내지 120 범위이다.
본 개시내용의 일 양태에서, 화학식 I-1에 따른 리간드에 연결된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 표면 변형된 바이러스 캡시드가 제공된다:
Figure pct00006
상기 식에서,
Figure pct00007
는 바이러스 캡시드이고;
n 및 n'은 독립적으로 0 내지 30의 정수이고;
L은 리간드이고; 및
x는 1 내지 300의 정수임.
본 개시내용의 일 양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 표면 변형된 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 바이러스 캡시드에 대한 평균 리간드 비는 50 내지 250이다.
본 개시내용의 일 양태에서, 비리온을 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 비리온은 본원에 제공된 바와 같은 표면 변형된 바이러스 캡시드를 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 일 양태에서 유전적 이상이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 방법은 비리온을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 비리온은 본원에 제공된 바와 같은 표면 변형된 바이러스 캡시드를 포함하고 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 일 양태에서, 가교제 반응성 쌍의 구성원 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서를 포함하는 표면 작용화된 바이러스 캡시드로서, 가교제 반응성 쌍의 구성원을 포함하는 작용화된 리간드와의 반응에 적합하고, 가교제 반응성 쌍의 구성원은 하기로부터 선택되는 반응에 참여하는, 표면 작용화된 바이러스 캡시드가 제공된다: Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 시클로첨가(CuAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-아지드 시클로첨가(SPAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-니트론 시클로첨가(SPANC) 반응, 역 전자 요구 디엘스-알더(IEEDD) 반응, 및 슈타우딩거 결찰 및 [4+1] 시클로첨가 반응.
본 개시내용의 양태는 본원에 기재된 표면 변형된 바이러스 캡시드를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) 바이러스 캡시드 단백질을 가교제 반응성 쌍의 제1 구성원 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서를 포함하는 캡시드 반응성 링커와 반응시켜 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 수득하는 단계;
ii) 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 가교제 반응성 쌍의 제2 구성원 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서를 포함하는 작용화된 리간드와 접합시키는 단계,
여기서 가교제 반응성 쌍의 제1 및 제2 구성원은 반응하여 가교 모이어티 Q를 형성함; 및
iii) 표면 변형된 바이러스 캡시드를 수득하는 단계.
본 발명의 각 양태의 바람직한 특징은 필요한 부분만 약간 수정하여 다른 양태 각각과 같다. 본원에 언급된 인용 문헌은 법이 허용하는 최대 범위까지 포함된다. 본 발명 및 그 장점이 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화, 대체 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
본 개시내용의 특징, 양태 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시형태를 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 SNAP-태깅된 융합 리간드와 반응하여 유전자 카고의 개선된 향성 및/또는 형질도입 효율을 갖는 표면 변형된 바이러스를 생성하는 BG 기로 작용화된 바이러스 캡시드 표면의 표면 변형의 개략도를 보여준다.
도 2는 본 개시내용에 따른 ㆍHSPG 바이러스 캡시드가 잔여 감염 활성을 갖지 않는다는 것을 나타낸다(어두운 그림); 헤파린 결합 부위가 제거된 작제물을 형광 리포터 마우스 모델의 감각 뉴런에서 시험했다. 삽도는 세포의 위상차 현미경 이미지를 보여준다.
도 3은 밀 배아 응집소(WGA) 융합 리간드로 변형된 캡시드 표면이 도 2에 사용된 것과 유사한 형광 리포터 마우스 모델에서 감각 뉴런에 대해 시험할 때 바이러스 형질도입 효율을 100%(형광 세포)로 완전히 되돌렸다는 것을 보여준다.
도 4a 내지 도 4c는 신경영양 인자 NGF(도 4a), NT3(도 4b) 및 BDNF(도 4c)가 캡시드 표면에 접합될 때 바이러스를 상이한 뉴런 집단에 전달함을 보여준다. 삽도는 세포의 위상차 현미경 이미지를 보여준다. 작제물은 도 2와 유사하게 형광 리포터 마우스 모델에서 감각 뉴런에 대해 시험되었다.
도 5는 콜레라 독소 B 서브유닛으로 변형된 캡시드 표면이 피부에 주사되었을 때 신경 세포체에 역행적으로 바이러스를 수송함을 보여준다. 삽도는 세포의 현미경 이미지를 보여준다. 작제물은 도 2와 유사하게 형광 리포터 마우스 모델에서 감각 뉴런에 대해 시험되었다.
도 6a 내지 도 6c는 TrkA에 대한 항체(NGF에 대한 수용체, 도 6b)로 염색된 본 발명에 따른 NGF 리간드 IV(도 6a)로 바이러스를 주사한 지 3주 후 삼차신경절의 감각 뉴런 조직을 보여준다. 적어도 80%의 겹침을 볼 수 있다(도 6c).
도 7은 NF200 및 IB4에 대한 항체로의 도 6a의 섹션의 염색을 나타내며, 이는 주로 다른 뉴런을 표시한다(각각 기계적 수용체(녹색/회색) 및 비펩티드성 통각수용체(파란색/어두운 회색)). 빨간색(밝은 회색) 감염된 세포는 주로 녹색 및 파란색 세포와 다르다.
도 8a 내지 도 8b는 유전자 전달이 리간드 바이러스로 더 효율적임을 보여준다. 도 8a는 정상적인 AAV9 변이체 PHP.S를 보여준다; 도 8b는 WGA로 추가 변형된 도 8a의 PHP.S 변이체를 보여준다. WGA 변형된 작제물로 인해 전달이 크게 증가했다.
도 9a 내지 도 9f는 상이한 변형 비에서 DRG 뉴런의 NGFR121W-SNAP::AAV2-ㆍHSPG 형질도입을 나타낸다. 삽도는 위상차 이미지를 보여준다.
도 10a 내지 도 10c는 DRG 뉴런의 뉴로트로핀-AAV2-ㆍHSPG 형질도입을 보여준다. 도 10a 내지 도 10c는 NGFR121W, BDNF 및 NT3(각각) 결합된 AAV2-ㆍHSPG가 세포의 형태학적으로 구별되는 아형을 표적으로 한다는 것을 보여준다.
도 11a 내지 도 11f는 NGFR121W-SNAP::AAV2-ㆍHSPG의 형질도입 효율에 대한 링커 길이의 영향을 상이한 감각 신경절에 걸쳐 보여준다. 3E+10 바이러스 게놈(VG) 안와후 주입되었다. 도 11a 내지 도 11c는 더 짧은 BG-GLA 링커에 대한 결과를 보여주고, 도 11d 내지 도 11f는 더 긴 BG-PEG13 링커에 대한 결과를 보여준다.
도 12a 내지 도 12d는 DRG에서 형질도입 효율에 대한 주사 경로의 영향을 보여준다. 다양한 주사 경로에 대한 DRG의 형질도입 효율에 대한 조직학적 분석. 피부(도 12a) 또는 신경(도 12b)에 국소 주사. 전신 주사 IP(도 12c) 또는 IV(도 12d).
도 13a 내지 도 13d는 DRG에서 TrkA+ 세포에 대한 NGFR121W-SNAP::AAV2-ㆍHSPG의 선택성을 확인한다. 3E+10 VG 입자의 안와후 주입 후 DRG에서 형질도입 선택성의 조직학적 분석: 도 13a는 NGFR121W-SNAP::AAV2-ㆍHSPG(적색)의 형광 tdTomato 신호를 보여준다; 도 13b는 TrkA에 대한 항체(녹색)를 사용하여 확인된 녹색의 TrkA+ 세포를 보여준다; 도 13c는 병합된 이미지(주황색)이다. 도 13d는 TrkA 양성 세포인 감염된 세포의 수와 감염된 TrkA 양성 세포의 수를 정량화한다.
도 14a 내지 도 14c는 야생형 마우스 각질세포의 생체 내 IL31K134A-AAV2-ㆍHSPG 감염을 나타낸다. 3E+10 VG 입자의 피하 주사 후 야생형 마우스의 피부에서 형질도입 선택성의 조직학적 분석: 도 14a는 IL31K134ASNAP::AAV2-ㆍHSPG(적색)로부터의 형광 tdTomato 신호를 나타낸다. 도 14b는 K14(녹색)에 대한 항체를 사용하여 확인된 각질세포를 나타낸다. 도 14c는 병합된 이미지(주황색)를 보여준다.
도 15a 내지 도 15c는 IL31K134A-AAV2-ㆍHSPG가 Il31RA 수용체의 부재 하에 각질세포를 감염시키지 않는다는 것을 보여준다. 3E+10 VG 입자의 피하 주사 후 IL31RA-/- 마우스의 피부에서 형질도입 선택성의 조직학적 분석: 도 15a는 IL31K134A::AAV2-ㆍHSPG로부터의 형광 신호의 부재를 보여준다. 도 15b는 K14(녹색)에 대한 항체를 사용하여 확인된 각질세포를 나타낸다. 도 15c는 병합된 이미지(주황색)를 보여준다.
도 16a 내지 도 16c는 시험관 내 및 생체 내 CTB-ㆍHSPG-AAV 형질도입을 보여준다.
도 17a 내지 도 17b는 시험관 내 WGA-ㆍHSPG-AAV 형질도입을 보여준다.
도 18a 내지 도 18c는 WGA::AAV2-ㆍHSPG의 신생아 IV 주사를 나타낸다. 1E+9 VG의 WGA::AAV2-ㆍHSPG를 신생아 마우스의 IV에 주사했다. 강력한 tdTomato 형광이 피부(도 18a), DRG(도 18b) 및 척수(도 18c)의 뉴런에서 관찰되었다.
도 19a 내지 도 19c는 마우스 뇌에서 WGA::AAV2-ㆍHSPG의 역행 수송을 나타낸다. 6E+8 VG의 WGA::AAV2-ㆍHSPG를 성체 마우스의 전두엽 피질에 주사했다. 강력한 tdTomato 형광이 주사 부위(도 19a) 및 시상(도 19b 내지 도 19c)에서 관찰되었으며, 이는 말단에서 세포체로의 역행 수송을 나타낸다.
도 20a 내지 도 20f는 상이한 바이러스:리간드 비에서 WGA-ㆍHSPG-AAV를 사용하는 DRG에서 PHP.S 형질도입 효율의 부스팅을 보여준다.
도 21은 배양에서 DRG 뉴런에 대한 IB4::AAV2-ㆍHSPG의 적용을 나타낸다. 1E+9 VG의 IB4::AAV2-ㆍHSPG를 배양 중인 DRG 뉴런에 적용했다. 대부분의 소형 뉴런에서 강력한 tdTomato 형광이 관찰되었다.
도 22a 내지 도 22d는 성체 마우스에서 IB4::AAV2-ㆍHSPG의 생체 내 주사를 보여준다. 피하, 신경내 및 척수내 주사 경로를 통한 IB4::AAV2-ㆍHSPG의 주사. (도 22a) 피하 주사 후 IB4::AAV2-ㆍHSPG의 혈관계 라벨링. (도 22b) 좌골 신경에 IB4::AAV2-ㆍHSPG를 주사한 마우스로부터의 전체 마운트 DRG. (도 22c) 왼쪽 좌골 신경에 IB4::AAV2-ㆍHSPG를 주입하고 IB4-488로 염색한 마우스의 척수 절편. 동측의 신호 중첩. (도 22d) 척수에 IB4::AAV2-ㆍHSPG를 주사한 마우스로부터의 표지된 미세아교세포.
도 23은 PC12 세포에 적용된 야생형 AAV2(도 24a 내지 도 24f의 이미지에 해당) 및 IB4-AAV2(도 24g 내지 도 24l의 해당 이미지)의 농도 증가에 따른 형질도입 효율의 플롯을 보여준다.
도 24a 내지 도 24l은 야생형 AAV2(도 24a 내지 도 24f) 및 IB4-AAV2(도 24g 내지 도 24l)의 각각의 농도에서 처리된 PC12 세포의 GFP 형광을 보여준다.
도 25는 PC12 세포에 적용된 야생형 AAV9(도 26a 내지 도 26f의 이미지에 해당) 및 IB4-AAV9(도 26g 내지 도 26l의 해당 이미지)의 농도 증가에 따른 형질도입 효율의 플롯을 보여준다.
도 26a 내지 도 26l은 야생형 AAV9(도 26a 내지 도 26f) 및 IB4-AAV9(도 26g 내지 도 26l)의 각각의 농도에서 처리된 PC12 세포의 GFP 형광을 보여준다.
도 27a 내지 도 27d는 스페이서 없이 증가하는 몰비에서 ㆍHSPG-AAV2에 접합되고 PC12 세포에 적용된 IB4에 대한 대표적인 GFP 형광 이미지를 보여준다.
도 28a 내지 도 28d는 대표적인 이미지가 짧은 n=3 PEG 스페이서와 함께 증가하는 양의 반응성 링커로 제조되고 PC12 세포에 적용된 IB4:ㆍHSPG-AAV2 작제물에 대한 것임을 보여준다.
도 29a 내지 도 29d는 중간 n=8 PEG 스페이서를 사용하여 증가하는 양의 캡시드 반응성 링커로 제조되고 PC12 세포에 적용된 IB4 :·ㆍHSPG-AAV2 작제물에 대한 대표적인 이미지를 보여준다.
도 30a 내지 도 30d는 긴 PEG=16 스페이서를 사용하여 증가하는 양의 캡시드 반응성 링커로 제조되고 PC12 세포에 적용된 IB4 :·ㆍHSPG-AAV2 작제물에 대한 대표적인 이미지를 보여준다.
도 31은 상이한 링커 길이(n=3, 평균 +/- SEM)를 갖는 증가하는 리간드 대 바이러스 몰비에 대한 각각의 세포에서의 평균 GFP 형광 강도의 정량화를 나타낸다.
도 32a 내지 도 32s는 상이한 스페이서 길이를 갖는 링커를 포함하는 WGA : AAV2·HSPG 바이러스 작제물의 PC12 세포에서의 형질도입 효율에 상응하는 GFP 형광 이미지를 나타낸다(즉, 바이러스 측(V) 및 WGA 리간드 측(L) 상의 PEGn(에틸렌 글리콜 단위)의 (n), 바이러스는 다양한 몰량의 링커로 작용화된다).
도 33은 상이한 링커 스페이서를 갖는 WGA로 변형된 AAV2ㆍHSPG 바이러스로 형질도입된 PC12 세포의 평균 GFP 형광 강도의 차트를 나타낸다. 플로팅된 데이터는 평균 형질도입 효율에 해당한다.
도 34는 미변형 바이러스(적색 점선)와 비교하여 상이한 링커 스페이서를 갖는 WGA로 표면 변형된 AAV2ㆍHSPG 바이러스 작제물로 처리된 PC12 세포의 개별 세포 형질도입 효율 차트를 보여준다.
도 35는 미변형 바이러스와 비교하여 상이한 링커 스페이서를 갖는 WGA로 표면 변형된 AAV2ㆍHSPG 바이러스 작제물로 처리된 PC12 세포의 평균 형질도입 효율을 보여준다.
도 36은 성능이 더 나쁜 개별 및 분산 PEG 조합만을 나타내는 발현의 정량화를 나타낸다.
도 37a 내지 도 37d는 바이러스가 다양한 몰량의 링커로 작용화되는 TCO/테트라진 결찰을 사용하여 제조된 AAV2ㆍHSPG-WGA 작제물로 처리된 PC12 세포에서의 tdTomato 형광 이미지를 보여준다. 도 37e는 미변형 바이러스를 나타내고; 도 37f는 3E+9 VG : 1.73 nmol 바이러스:링커 비에서 DBCO/아지드 가교제 반응성 쌍을 사용하여 제조된 AAV2ㆍHSPG-WGA로 처리된 PC12 세포에서의 tdTomato 형광 이미지를 보여준다.
도 38 및 도 39는 3E+9 VG: 1.73 nmol 바이러스:링커 비에서 DBCO/아지드를 사용하여 제조된 AAV2ㆍHSPG-WGA에 대해 수득한 것과 비교하여 상이한 바이러스 대 링커 비에서 TCO/테트라진 결찰을 사용하여 제조된 AAV2ㆍHSPG-WGA 작제물로 처리된 PC12 세포에서 각각 평균 형질도입 효율 및 개별 세포 형질도입 효율을 제공하기 위한 tdTomato 형광 이미지의 정량화를 나타낸다.
도 40a 내지 도 40d는 상이한 비의 바이러스 대 링커 비에서 포스핀-NHS/아지드 결찰을 사용하여 제조된 AAV2ㆍHSPG-WGA 작제물로 처리된 PC12 세포에서의 tdTomato 형광 이미지를 보여준다. 도 40e는 미변형 바이러스를 나타내고; 도 40f는 3E+9 VG : 1.73 nmol 바이러스:링커 비에서 DBCO/아지드 가교제 반응성 쌍을 사용하여 제조된 AAV2ㆍHSPG-WGA로 처리된 PC12 세포에서의 tdTomato 형광 이미지를 보여준다.
도 41 및 도 42는 3E+9 VG: 1.73 nmol 바이러스:링커 비에서 DBCO/아지드 가교 반응성 쌍을 사용하여 제조된 AAV2ㆍHSPG-WGA에 대해 수득한 것과 비교하여 상이한 바이러스 대 링커 비에서 포스핀-NHS/아지드 결찰을 사용하여 제조된 AAV2ㆍHSPG-WGA 작제물로 처리된 PC12 세포에서 각각 평균 형질도입 효율 및 개별 세포 형질도입 효율을 제공하기 위한 tdTomato 형광 이미지의 정량화를 보여준다.
도 43은 최적의 형질도입 효율에서 AAV9당 PEG4-DBCO 분자의 수 및 AAV9당 WGA-PEG4-아지드 분자의 수를 예시한다.
도 44는 AAV9-PEG4-DBCO::WGA-SNAP-TMR-PEG4-아지드 작제물에 대한 AAV 입자당 리간드의 수를 예시하고 대조군 AAV9는 DBCO-PEG4-NHS 링커에 의해 먼저 작용화되지 않고 WGA-SNAP-TMR-PEG4-아지드로만 배양되었다.
도 45a 내지 도 45e는 다양한 바이러스:링커 비로 제조된 변형되지 않은 야생형 AAV3(도 45a) 및 WGA-AAV3(도 45b 내지 도 45e)로 처리된 PC12 세포에서의 GFP 또는 RFP 형광을 예시한다.
도 46 및 도 47은 제조된 AAV3ㆍHSPG-WGA 작제물로 처리된 PC12 세포에서 각각 평균 형질도입 효율 및 개별 세포 형질도입 효율을 제공하기 위한 형광 이미지의 정량화를 나타낸다.
도 48a 내지 도 48e는 다양한 바이러스:링커 비로 제조된 변형되지 않은 야생형 AAV5(도 48a) 및 WGA-AAV3(도 48b 내지 도 48e)로 처리된 PC12 세포에서의 GFP 또는 RFP 형광을 예시한다.
도 49 및 도 50은 도 48에서와 같이 제조된 AAV6ㆍHSPG-WGA 작제물로 처리된 PC12 세포에서 각각 평균 형질도입 효율 및 개별 세포 형질도입 효율을 제공하기 위한 형광 이미지의 정량화를 나타낸다.
도 51a 내지 도 51e는 다양한 바이러스:링커 비로 제조된 변형되지 않은 야생형 AAV6(도 51a) 및 WGA-AAV6(도 51b 내지 도 51e)로 처리된 PC12 세포에서의 GFP 또는 RFP 형광을 예시한다.
도 52 및 도 53은 도 51에서와 같이 제조된 WGA-AAV6 작제물로 처리된 PC12 세포에서 각각 평균 형질도입 효율 및 개별 세포 형질도입 효율을 제공하기 위한 tdTomato 형광 이미지의 정량화를 나타낸다.
도 54a 내지 도 54e는 다양한 바이러스:링커 비로 제조된 변형되지 않은 야생형 AAV8(도 54a) 및 WGA-AAV8(도 54b 내지 도 54e)로 처리된 PC12 세포에서의 GFP 또는 RFP 형광을 예시한다.
도 55 및 도 56은 도 54에서와 같이 제조된 WGA-AAV8 작제물로 처리된 PC12 세포에서 각각 평균 형질도입 효율 및 개별 세포 형질도입 효율을 제공하기 위한 형광 이미지의 정량화를 나타낸다.
도 57은 FACS에 의해 분석된 바와 같이 AAV2에 의한 HEK293 세포의 형질도입을 예시한다(회색: 형질도입되지 않은 세포, 및 검은색: 형질도입된 세포).
도 58a는 현미경으로 분석한 AAV2에 의한 HEK293 세포의 형질도입을 예시한다. 도 58b는 AAVR 유전자의 결실 시 AAV2에 의한 HEK293 세포의 형질도입을 예시한다.
도 59a 내지 도 59b는 WT AAV2 벡터(도 59a) 및 (도 59b) WGA-AAV2에 의한 AAVR-KO HEK293 세포의 형질도입의 대표적인 이미지이다.
도 60a 내지 도 60b는 각각 평균 형광 강도(MFI) 및 tdtomato 양성 세포의 %이며, WT AAV2 벡터 및 WGA-AAV2에 의한 AAVR KO HEK293 세포의 형질도입을 특성화하는 데이터이다.
도 61은 상류 GP64 신호 서열 및 하류 Sortag, SNAP-태그 및 6xHis 태그를 함유하는 네몰리주맙 SNAP의 합성된 아미노산 서열이다. GP 64 신호 서열은 이탤릭체로 표시하고, 네몰리주맙은 굵게, Sortag는 밑줄, Snap 태그는 회색으로, 6xHIS는 회색으로 굵게 표시하고(SEQ ID NO. 3), 별표는 정지 코돈을 나타낸다.
도 62a 내지 도 62c는 네몰리주맙-AAV2ㆍHSPG 작제물의 3 E+ 10 VG 입자를 피하 주사한 후 야생형 마우스의 피부에서 형질도입 선택성의 조직학적 분석을 예시한다. 도 62a는 네몰리주맙 SNAP AAV2ㆍHSPG 바이러스 감염 세포(적색)의 형광 tdTomato 신호를 보여준다. 도 62b는 K14(녹색)에 대한 항체를 사용하여 확인된 각질세포를 나타낸다. 도 62c는 바이러스 감염된 각질세포(주황색)의 병합된 이미지를 보여준다.
도 63a 내지 도 63b는 상이한 양의 DBCO-PEGn 링커를 사용하여 작용화된 표면 변형된 AAV2의 인간 항체-매개 인식 및 중화를 예시한다. 도 63a는 상이한 양의 DBCO-PEGn 링커를 사용하여 작용화되고, ELISA에 의해 측정되고 450 nm 광에서 측정된 광학 밀도(OD) 단위로 표현되는 AAV2에 대한 풀링된 인간 혈청에 함유된 IgG의 결합. 도 63b는 풀링된 인간 혈청의 상이한 희석액과 사전 배양된 변형되지 않은 바이러스 및 변형된 바이러스를 사용하여 HEK293T 세포에서 수행된 중화 분석을 예시하며, 형질도입 억제의 백분율은 각각의 혈청 희석액에 대해 표시된다.
도 64a 내지 도 64c는 바이러스 및 리간드 모두에서 다양한 PEG 길이를 갖는 링커를 사용하여 AAV2의 화학적 변형 시 항체 인식 및 중화를 예시한다. 도 64a는 바이러스 및 리간드에 대해 상이한 링커 PEG 길이로 변형된 AAV2에 결합하는 인간 IgG를 도시하며, 도 63a에서와 같이 측정된다. 도 64b 내지 도 64c는 도 63b에서와 같이 인간 풀링된 혈청의 상이한 희석액과 함께 사전 배양된 미변형 바이러스 및 변형 바이러스에 대한 인간 항체의 중화 활성을 예시한다(여기서 4 바이러스 = DBCO PEG4; 2K 바이러스 = DBCO-PEG2000; 5K 리간드 = WGA-PEG5000-아지드; 4 리간드 = WGA-PEG4-아지드).
도 65a 내지 도 65n은 PC12 세포에서 비변형 및 AAV2-WGA를 사용한 중화 검정을 예시한다. 미변형(도 65a 내지 도 65g) 및 PEG4-아지드를 사용하여 변형된 AAV2-WGA(도 65h 내지 도 65n)를 PC12 세포에 첨가하기 전에 AAV2-면역화 마우스 혈청의 2배 연속 희석액과 배양하였다.
도 66a 내지 도 66f는 미변형(도 66a 내지 도 66c) 및 PEG4-아지드를 사용하여 변형된 AAV2-WGA(도 66d 내지 도 66f)를 사용하는 1차 DRG 뉴런을 이용한 중화 검정을 예시한다. 미변형 및 AAV2-WGA는 DRG 배양물에 첨가하기 전에 AAV2에 대한 항체를 함유하는 마우스 혈청의 희석액과 사전 배양되었다.
a. 정의
본원에서 사용되는 용어 "rAAV"는 AAV 캡시드 내에 패키징된 재조합 핵산 작제물을 포함하는 재조합 비리온을 지칭한다.
재조합 핵산 작제물(동의어로 "재조합 바이러스 게놈")은 AAV 역위 말단 반복부 사이에 위치한 폴리뉴클레오티드 페이로드(동의어로 "카고")를 포함한다. 페이로드는 발현 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 상동성 지시 수리를 위한 주형을 제공하는 DNA 작제물일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 발현 가능한 폴리뉴클레오티드는 단백질(예를 들어, 치료 단백질을 코딩하는 이식유전자)을 인코딩하거나, miRNA, siRNA, 또는 CRISPR, ADAR 및 ADAT와 같은 유전자 편집 또는 RNA 편집 기계를 위한 가이드 RNA를 인코딩한다.
용어 "AAV", "아데노 관련 바이러스", "AAV 바이러스", "AAV 비리온", "AAV 바이러스 입자", "AAV 입자", "아데노 관련 바이러스 벡터" 및 "AAV 벡터"는 본원에서 rAAV에 대해 동의어로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 포유류 세포 표면 단백질, 다당류 또는 프로테오글리칸에 대한 "캡시드의 결합" 또는 "표면-변형된 캡시드의 결합"은 상기 캡시드 또는 표면-변형된 캡시드를 포함하는 재조합 비리온, 전형적으로 rAAV의 결합을 의도한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 가장 광범위하게 허용되는 임상적 의미로 사용된다. 용어는 다음을 포함하며 이에 제한되지 않는다: 질환의 징후 또는 증상 완화; 질환의 징후 또는 증상 개선; 증상 완화; 질환 정도의 감소; 질환 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음); 질환 진행의 지연 또는 둔화; 질환 병태의 개선 또는 완화; 감지 가능하거나 감지할 수 없는 완화(부분 또는 전체); 치유; 치료를 받지 않는 경우 예상 생존 기간과 비교하여 생존 기간 연장.
"유효량"은 질환을 치료하는 데 효과적인 본 발명의 AAV 입자의 양이다.
본원에서 사용되는 용어 "예방" 또는 "예방하는"은 대상체의 맥락에서 사용될 때 일반적으로 예를 들어 게놈 돌연변이의 존재에 의해 질환이 발병할 위험이 있는 대상체에서 질병의 예방을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "향성"은 특정 세포 또는 조직의 바이러스 캡시드에 의한 우선적 감염 및/또는 형질도입을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, AAV 캡시드의 향성을 변형하기 위해, 캡시드는 그들이 자연적으로 소유하지 않는 표적 세포 표면 상의 수용체에 대한 특정 친화도와 같은 특정 특징을 부여받는다.
본 발명의 맥락에서, 특정 실시형태에서 사용된 용어 "대상체"는 바람직하게는 마우스, 래트, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 원숭이와 같은 포유류, 또는 바람직하게는 인간을 지칭한다. 용어 "환자"는 바람직하게는 마우스, 래트, 기니피그, 토끼, 말, 소, 카우, 고양이, 개, 원숭이와 같은 포유류, 또는 바람직하게는 인간, 예를 들어 예후 또는 치료가 필요한 인간 환자를 지칭한다. 본 발명의 대상체는 세균 감염, 바이러스 감염, 진균 감염 또는 기생충 감염과 같은 질환에 걸릴 위험이 있을 수 있다. 본 발명의 맥락에서 관련된 의학적 적응증에 대한 보다 상세한 설명은 본원의 다른 곳에서 제공된다.
용어 "선택적으로 치환된"은 주어진 화학적 모이어티(예를 들어, 알킬기)가 다른 치환기(예를 들어, 헤테로원자)에 결합될 수 있음(그러나 반드시 그래야 하는 것은 아님)을 의미한다. 예를 들어, 선택적으로 치환된 알킬기는 완전히 포화된 알킬 사슬(예를 들어, 순수한 탄화수소)일 수 있다. 대안적으로, 동일한 선택적으로 치환된 알킬기는 수소와 다른 치환체를 가질 수 있다. 예를 들어, 사슬을 따라 임의의 지점에서 할로겐 원자, 하이드록실기 또는 본원에 기재된 임의의 다른 치환기에 결합될 수 있다. 따라서, "선택적으로 치환된"이라는 용어는 주어진 화학 모이어티가 다른 작용기를 함유할 가능성이 있지만 반드시 추가 작용기를 가질 필요는 없음을 의미한다. 기재된 기의 선택적 치환에 사용되는 적합한 치환체는 제한 없이 하기를 포함한다: 할로겐, 옥소, -OH, -CN, -COOH, -CH2CN, -O-(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)할로알킬, (C1-C6)할로알콕시, -O-(C2-C6)알케닐, -O-(C2-C6)알키닐, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, -OP(O)(OH)2, -OC(O)(C1-C6)알킬, -C(O)(C1-C6)알킬, -OC(O)O(C1-C6)알킬, -NH2, -NH((C1-C6)알킬), -N((C1-C6)알킬)2, -NHC(O)(C1-C6)알킬, -C(O)NH(C1-C6)알킬, -S(O)2(C1-C6)알킬, -S(O)NH(C1-C6)알킬, 및 S(O)N((C1-C6)알킬)2. 치환체는 그 자체가 선택적으로 치환될 수 있다. 본원에서 사용된 "선택적으로 치환된"은 또한 그 의미가 아래에 기술된 치환된 또는 미치환된 것을 지칭한다. 추가적인 치환을 포함하는 모이어티는 본원에서 치환된 모이어티의 "유도체"로 지칭된다. 예를 들어, 알킬 치환된 니트론은 니트론 모이어티의 유도체의 예이다.
용어 "치환된"은 특정 기 또는 모이어티가 하나 이상의 적합한 치환기를 보유하고 치환기가 하나 이상의 위치에서 특정 기 또는 모이어티에 연결될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 시클로알킬로 치환된 아릴은 시클로알킬이 결합을 통해 또는 아릴과 융합하고 2개 이상의 공통 원자를 공유함으로써 아릴의 하나의 원자에 연결됨을 나타낼 수 있다.
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, "아릴"은 1 내지 3개의 방향족 고리를 갖는 시클릭 방향족 탄화수소기를 의미하며, 페닐, 바이페닐 또는 나프틸과 같은 모노시클릭 또는 바이시클릭 기를 포함한다. 2개의 방향족 고리(바이시클릭 등)를 함유하는 경우, 아릴기의 방향족 고리는 선택적으로 단일 지점에서 연결되거나(예를 들어, 바이페닐) 융합된다(예를 들어, 나프틸). 아릴기는 임의의 부착 지점에서 하나 이상의 치환기, 예를 들어 1 내지 5개의 치환기로 선택적으로 치환된다. 예시적인 치환기는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: -할로겐, 옥소, -OH, -CN, -COOH, -CH2CN, -O-(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)할로알킬, (C1-C6)할로알콕시, -O-(C2-C6)알케닐, -O-(C2-C6)알키닐, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, -OP(O)(OH)2, -OC(O)(C1-C6)알킬, -C(O)(C1-C6)알킬, -OC(O)O(C1-C6)알킬,-NH2, -NH((C1-C6)알킬), -N((C1-C6)알킬)2, -NHC(O)(C1-C6)알킬, -C(O)NH(C1-C6)알킬, -S(O)2(C1-C6)알킬, -S(O)NH(C1-C6)알킬, 및 S(O)N((C1-C6)알킬)2.
치환체는 그 자체가 선택적으로 치환된다. 또한, 2개의 융합 고리를 함유하는 경우, 아릴기는 선택적으로 완전 포화 고리와 융합된 불포화 또는 부분 포화 고리를 갖는다. 이들 아릴기의 예시적인 고리 시스템은 페닐, 바이페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페날레닐, 페난트레닐, 인다닐, 인데닐, 테트라하이드로나프탈레닐, 테트라하이드로벤조안눌레닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
할로겐 또는 "할로"는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
"알킬"은 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소를 의미한다. (C1-C6) 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸 및 이소헥실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"알콕시"는 사슬에 말단 "O"를 함유하는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소, 예를 들어 -O(알킬)을 의미한다. 알콕시기의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, t-부톡시 또는 펜톡시기를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"알케닐"은 2 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 불포화 탄화수소를 의미한다. "알케닐" 기는 사슬에 적어도 하나의 이중 결합을 함유한다. 알케닐기의 이중 결합은 비공액이거나 다른 불포화 기에 공액일 수 있다. 알케닐기의 예는 에테닐, 프로페닐, n-부테닐, 이소부테닐, 펜테닐 또는 헥세닐을 포함한다. 알케닐기는 미치환 또는 치환될 수 있고 직쇄형 또는 분지형일 수 있다.
"알키닐"은 2 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 불포화 탄화수소를 의미한다. "알키닐" 기는 사슬에 적어도 하나의 삼중 결합을 함유한다. 알케닐기의 예는 에티닐, 프로파르길, n-부티닐, 이소부티닐, 펜티닐 또는 헥시닐을 포함한다. 알키닐기는 미치환 또는 치환될 수 있다.
"시클로알킬" 또는 "카보시클릴"은 3 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 포화 탄소 고리를 의미한다. 시클로알킬기의 예는 제한 없이 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵타닐, 시클로옥타닐, 노르보라닐, 노르보레닐, 바이시클로[2.2.2]옥타닐, 또는 바이시클로[2.2.2]옥테닐 및 이들의 유도체를 포함한다. (C3-C8)시클로알킬은 3 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 시클로알킬기이다. 시클로알킬기는 융합되거나(예를 들어, 데칼린) 가교될 수 있다(예를 들어, 노르보만).
"할로알킬"은 하나 이상의 할로겐으로 치환된 알킬기를 의미한다. 할로알킬기의 예는 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 트리클로로메틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"할로알콕시"는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 알콕시기를 의미한다. 할로알킬기의 예는 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 펜타플루오로에톡시, 트리클로로메톡시 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는"은 생리학적으로 허용가능하고 인간에게 투여될 때 일반적으로 독성 또는 알레르기 또는 이와 유사한 바람직하지 않은 반응, 예를 들어 위장 장애, 현기증 등을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 동물용, 특히 인간용 약전에 등재된 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "치료 지수"는 활성 약물의 치료 효율을 발현하는 매개변수이다. 예를 들어 치료 효능을 달성하기 위해 고농도의 활성 물질이 필요하거나 효능을 수득하기 위해 필요한 용량이 독성을 유발할 때 낮다. 반대로 높은 치료 지수는 치료 효능을 제공하기 위해 활성 물질에 필요한 용량이 낮고/낮거나 활성 약물의 독성이 낮을 때를 의미한다.
b. 기타 해석 규칙
본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 물질의 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기술된다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "항체 또는 항원 결합 단편"에 대한 언급은 복수의 이러한 항체 및 항원 결합 단편을 포함하고, "재조합 아데노 관련 바이러스"에 대한 언급은 하나 이상의 재조합 아데노 관련 바이러스 및 당업계에게 공지된 이의 등가물에 대한 언급을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 이와 같이, 이 진술은 청구항 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직" 등과 같은 배타적 용어 사용에 대한 선행 근거 역할을 하기 위한 것이다.
명료함을 위해 별도의 실시형태의 맥락에서 설명된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 실시형태에서 조합되어 제공될 수 있음이 이해된다. 역으로, 간결함을 위해 단일 실시형태의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 관한 실시형태의 모든 조합은 본 발명에 구체적으로 포함되며 각각의 및 모든 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 실시형태의 모든 하위 조합 및 그 요소는 또한 본 발명에 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 및 모든 이러한 하위 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 공개에 대해서만 제공된다. 제공되는 공개 날짜는 실제 공개 날짜와 다를 수 있으므로 독립적으로 확인해야 할 수 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 범위의 인용된 종점이 포함되는 것으로 이해된다. 또한, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각 개재 값은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 하한 단위의 10분의 1까지, 그리고 그 언급된 범위에서 임의의 다른 언급되거나 개재된 값은 본 발명 내에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 본 발명 내에 포함된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
본원에 인용된 범위는 인용된 종점을 포함하여 범위 내의 모든 값에 대한 속기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 11 내지 48 또는 39 내지 41과 같은 하위 범위를 포함하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로 이루어진 군의 임의의 숫자, 숫자의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 예를 들어 명시된 값 또는 명시된 범위 한계의 10% 내에서 값 또는 범위의 변동 정도를 허용할 수 있다.
c. 표면 변형된 바이러스 캡시드
본 개시내용에 따르면, 가교 모이어티 Q를 포함하는 링커를 통해 바이러스 캡시드 단백질에 공유적으로 접합된 리간드를 포함하는 표면 변형된 바이러스 캡시드가 제공된다. 또한 표면 변형된 바이러스 캡시드를 포함하는 재조합 비리온이 제공된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 동일한 1차 아미노산 서열을 갖지만 리간드에 가교결합하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 변형되지 않은 바이러스 캡시드를 포함하는 변형되지 않은 재조합 비리온과 비교할 때, 제공된 표면 변형된 바이러스 캡시드는 그것이 일부인 재조합 비리온에 개선된 형질도입 효율, 개선된 세포 유형 선택성, 또는 개선된 형질도입 효율 및 개선된 세포 유형 선택성 모두를 부여한다.
본 개시내용에 따르면, 가교제 반응성 쌍의 제1 구성원을 포함하는 표면 작용화된 바이러스 캡시드가 제공된다. 또한 가교제 반응성 쌍의 제2 구성원을 포함하는 작용화된 리간드가 제공되며, 가교제 반응성 쌍의 제1 및 제2 구성원은 가교 모이어티 Q를 형성하기 위해 반응한다. 표면 작용화된 바이러스 캡시드는 가교제 반응성 쌍의 상보적 구성원을 갖는 리간드에 가교결합, 즉 접합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물 중 표면 변형된 바이러스 캡시드는 x 접합된 리간드를 포함하며, 여기서 x는 조성물 중 캡시드당 접합된 리간드의 평균 수이고, 본원에서는 캡시드당 리간드 비 또는 LCR로도 지칭된다. 일부 실시형태에서, x는 1 내지 500이다. 특정 실시형태에서, x는 1 내지 300이다. 특정 실시형태에서, x는 100 내지 200이다. 특정 실시형태에서, x는 110 내지 190이다. 특정 실시형태에서, x는 130 내지 170이다. 일부 실시형태에서, x는 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295 또는 300, 또는 앞의 두 숫자로 정의된 범위이다. 특정 실시형태에서, x는 약 1350, 약 140, 약 145, 약 150, 약 155, 약 160, 약 165, 약 170, 약 175 또는 약 180이다. 특정 실시형태에서, x는 약 55 내지 약 85이다. 특정 실시형태에서, x는 약 140 내지 약 160이다. 특정 실시형태에서, x는 약 135 내지 약 165이다. 특정 실시형태에서, x는 약 130 내지 약 170이다. 특정 실시형태에서, x는 약 150이다. 특정 실시형태에서, x는 위에 제공된 숫자 중 임의의 두 숫자 사이의 범위에 있다.
또한 본 개시내용은 (i) 바이러스 캡시드 단백질에 공유 부착할 수 있는 캡시드 반응성 모이어티 및 (ii) 가교제 반응성 쌍의 구성원을 포함하는 캡시드-반응성 링커를 제공한다.
본 개시내용의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드는 하기 단계에 의해 생성된다:
i) 바이러스 캡시드 단백질을, 가교제 반응성 쌍의 제1 구성원 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서를 포함하는 캡시드 반응성 링커와 반응시켜 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 수득하는 단계; 및
ii) 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 가교제 반응성 쌍의 제2 구성원을 포함하는 작용화된 리간드와 접합시키는 단계,
여기서 가교제 반응성 쌍의 제1 및 제2 구성원은 반응하여 가교 모이어티 Q를 형성함; 및
iii) 표면 변형된 바이러스 캡시드를 수득하는 단계.
a. 가교제 반응성 쌍
리간드를 바이러스 캡시드에 공유 접합시켜 표면 변형된 바이러스 캡시드를 생성하기 위해, 재조합 비리온을 표면 작용화하여 표면 작용화된 바이러스 캡시드 단백질을 생성하고, 이어서 작용화된 리간드와 반응시킨다. 표면 작용화된 캡시드 및 작용화된 리간드는 각각 가교제 반응성 쌍의 구성원을 포함한다. 가교제 반응성 쌍 구성원은 반응하여 바이러스 캡시드를 리간드에 공유 가교결합시키는 모이어티 Q를 형성한다.
전형적인 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍 구성원은 생체직교이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 생체직교 화학이라는 용어는 천연 생화학적 과정을 방해하지 않고 살아있는 시스템 내부에서 일어날 수 있거나 반응 생성물의 생화학적/생물학적 활성을 방해하지 않고 시험관 내에서 일어날 수 있는 임의의 화학적 과정을 지칭한다. 하기를 포함하는 생물학적 직교성의 요구 사항을 충족하는 여러 가지 화학적 접합 전략이 개발되었다: 아지드와 시클로옥틴 사이, 니트론과 시클로옥틴 사이의 1,3-쌍극자 시클로첨가(구리 무함유 클릭 화학이라고도 함), 알데하이드 및 케톤으로부터의 옥심/하이드라존 형성, 테트라진 결찰, 예를 들어 s-테트라진 및 트랜스-시클로옥텐 유도체의 시클로첨가 또는 이소시아나이드 기반 클릭 반응, 그리고 가장 최근에는 쿼드리사이클란 결찰.
a. CuAAC
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 시클로첨가(CuAAC)에 참여하는 화학적 모이어티로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 아지드 및 알킨을 포함한다. 원하는 화학 반응성을 유지하는 이들 모이어티의 유도체도 본원에서 고려된다. 특정 실시형태에서, 가교 모이어티 Q는 5원 헤테로원자 고리를 포함한다. 특정 실시형태에서, 가교 모이어티 Q는 1,4 트리아졸을 포함한다.
b. SPAAC 및 SPANC
CuAAC와 달리, Cu 무함유 클릭 화학은 세포독성 구리 촉매를 제거함으로써 생체직교성이 되도록 수정되어 반응이 신속하게 진행되고 생세포 독성이 발생하지 않도록 한다. 구리 대신에, 반응은 변형-촉진 알킨-아지드 시클로첨가(SPAAC)이다. 구리 무함유 클릭 화학은 아지드보다 1,3-쌍극자로 니트론을 사용하도록 조정되었으며 펩티드의 변형에 사용되었다.
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 변형 촉진 알킨-니트론 시클로첨가(SPANC)에 참여하는 화학적 모이어티로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 아지드 및 니트론을 포함한다. 원하는 화학 반응성을 유지하는 이들 모이어티의 유도체도 본원에서 고려된다. 특정 실시형태에서, 가교 모이어티 Q는 이속사졸린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 하기 예시된 바와 같이 아지드 및 니트론이고, 여기서 R기는 캡시드-반응성 링커 또는 작용화된 리간드에 대한 부착점을 나타낸다. 원하는 화학 반응성을 유지하는 이들 모이어티의 유도체도 본원에서 고려된다. 예를 들어, 니트론 쌍극자의 탄소 및 질소 원자 모두에 대한 치환 비시클릭 및 엔도시클릭 니트론은 모두 허용된다.
Figure pct00008
일부 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 시클로옥틴 유사체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 시클로옥틴 유사체, 예를 들어 R기가 캡시드-반응성 링커 또는 작용화된 리간드에 대한 부착점을 나타내는 하기에 예시된 것들을 포함한다. 원하는 화학 반응성을 유지하는 이들 모이어티의 유도체도 본원에서 고려된다.
Figure pct00009
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 군 디벤질시클로옥틴(DIBO), 디벤조아자시클로옥틴(DIBAC 또는 DBCO), 및 바이아릴아자시클로옥티논(BARAC)으로부터 선택되는 디벤질시클로옥틴 유사체를 포함한다. 원하는 화학 반응성을 유지하는 이들 모이어티의 유도체도 본원에서 고려된다.
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 하기 구조에 따른 니트론을 포함하며, 여기서 R1기는 캡시드 반응성 링커 또는 작용화된 리간드에 대한 부착점을 나타낸다. R2 및 R3은 특별히 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, R2 및 R3는 수소 및 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 기와 같은 C-C4 알킬기로부터 독립적으로 선택된다. 원하는 화학 반응성을 유지하는 이들 모이어티의 유도체도 본원에서 고려된다.
Figure pct00010
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 상기 확인된 바와 같은 디벤질시클로옥틴 유사체 및 1,3-니트론 또는 아지드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 하기에 나타낸 바와 같이 디벤질시클로옥틴(또는 이의 유사체) 및 1,3-니트론 또는 아지드를 포함하며, 여기서 R1기는 바이러스 캡시드 또는 캡시드-반응성 링커에 대한 부착점을 나타내고, 아지드 또는 니트론 상의 R2기는 작용화된 리간드에 대한 부착점을 나타낸다. 대안적인 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 아래에 나타낸 바와 같이 디벤질시클로옥틴(또는 이의 유사체) 및 1,3-니트론 또는 아지드를 포함하며, 여기서 R1기는 리간드에 대한 부착점을 나타내고, 아지드 또는 니트론 상의 R2기는 표면 작용화된 바이러스 캡시드 또는 캡시드-반응성 링커에 대한 부착점을 나타낸다.
Figure pct00011
특정 실시형태에서, 가교 모이어티 Q는 하기 예시된 것 중 임의의 하나에 따른 시클릭 모이어티를 포함하며, 여기서 R1 및 R2는 바이러스 캡시드에 대한 부착점을 나타낸다. R3 및 R4는 H 또는 본원에 기재된 임의의 치환체일 수 있으며, 단 치환된 유도체가 원하는 화학 반응성을 유지하는 경우에도 본원에서 고려된다.
Figure pct00012
c. IEDDA
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 역 전자 요구 디엘스-알더(IEDDA) 반응에 참여하는 화학적 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 전자 부족 디엔 및 전자 풍부 친디엔체를 포함한다. 이러한 그룹의 예는 당업계에 알려져 있고 예를 들어 문헌[F. Thalhammer, et al., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 6851-6854]; 및 문헌[B. L. Oliveira, Chem. Soc. Rev., 2017, 46, 4895-4950]설명되어 있다. 일부 실시형태에서, 전자 부족 디엔은 하기에 예시된 바와 같이 디엔 상에 치환된 전자 끄는 기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 전자 풍부 친디엔체는 하기 예시된 바와 같이 친디엔체 상에 치환된 전자 공여 기를 갖는다.
Figure pct00013
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 디엘스-알더 [4+2]-시클로첨가에 참여하는 화학 모이어티를 포함하며, 디엔과 친디엔체 사이의 반응은 디엔의 4π 전자와 친디엔체의 2π 전자의 상면/상면 상호작용을 통해 π4s + π2s 방식으로 6원 고리를 형성한다. 전자가 풍부한 디엔이 전자가 부족한 친디엔체와 반응하는 일반적인 전자 요구 디엘스-알더 반응과 대조적으로, 역-전자-요구 디엘스-알더 반응(IEDDA)에서는, 전자가 풍부한 친디엔체가 전자 부족 디엔과 반응한다. 알킨 친디엔체는 반응 시 각각의 피리다진을 직접 생성한다.
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 트리아진(예를 들어, 1, 2, 4 트리아진), 테트라진(Tz)(예를 들어, 1,2,4,5-테트라진, s-테트라진이라고도 함) 또는 변형된 친디엔체, 예컨대 노로보렌, 트랜스시클로옥텐(TCO), 시클로프로펜, 또는 N-아실라제틴을 포함한다. 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 하기에 예시된 모이어티를 포함하며, 여기서 R기는 캡시드-반응성 링커, 표면 작용화된 바이러스 캡시드 또는 본 개시내용의 작용화된 리간드에 대한 부착점을 나타낸다. 원하는 화학 반응성을 유지하는 이들 모이어티의 유도체도 본원에서 고려된다. 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 TCO 및 테트라진을 포함한다.
Figure pct00014
7.1.1.1 슈타우딩거 결찰
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 반응하여 이미노포스포란을 생성할 수 있는 아지드, 포스핀(PPh2) 또는 포스파이트와 같은 슈타우딩거 반응에 참여하는 화학적 모이어티로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 모이어티는 트리페닐포스핀, 예컨대 하기에 나타낸 트리페닐포스핀이며, 여기서 R기는 본 개시내용의 캡시드-반응성 링커에 대한 부착점을 나타낸다. 원하는 화학 반응성을 유지하는 이 모이어티의 유도체도 본원에서 고려된다.
Figure pct00015
d. [4+1] 시클로첨가
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 쌍은 [4+1] 시클로첨가에 이어 N2의 역-디엘스-알더 제거에 참여하는 화학 모이어티, 예를 들어 이소시아나이드 또는 1,2,4,5, 테트라진으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 가교제 반응성 모이어티는 하기 나타낸 바와 같은 이소시아나이드이며, 여기서 R기는 예를 들어 캡시드-반응성 링커에 대한 부착점을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 가교제 반응성 부분은 하기에 나타낸 바와 같은 1,2,4,5, 테트라진이며, 여기서 R1 또는 R2 기는 예를 들어 리간드에 대한 부착점을 나타낸다. 원하는 화학 반응성을 유지하는 이들 모이어티의 유도체도 본원에서 고려된다.
Figure pct00016
7.1.1.1. 태그 반응
특정 실시형태에서, 가교제 반응성 모이어티는 당업계에 알려진 생체직교 태그, 예컨대 SNAP-태그, CLIP 태그, Halo-태그, 또는 LUMIO-태그 또는 이들 태그와 반응하는 화학기, 예를 들어 벤질구아닌기, 벤질시토신기 또는 클로로알칸 기이다. 특정 실시형태에서, 가교제 반응성 부분의 한 구성원은 SNAP-태그를 포함하고 가교제 반응성 모이어티의 다른 구성원은 벤질구아닌기를 포함한다.
b. 가교 모이어티 - Q
본 개시내용의 양태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 본원에 기재된 바와 같은 가교제 반응성 쌍 사이의 반응에 의해 형성된 모이어티인 모이어티, Q를 포함한다.
특정 실시형태에서, Q는 CuAAC 반응의 생성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 SPAAC 반응의 생성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 SPANC 반응의 생성물이다. 특정 실시형태에서, Q는 IEEDD 반응의 생성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 슈타우딩거 결찰의 생성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 [4+1] 시클로첨가 반응의 생성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, Q는 예를 들어 SPAAC, SPANC 및 IEEDD와 같은 변형 촉진 반응의 생성물을 포함한다.
특정 실시형태에서, Q는 시클릭 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 바이시클릭 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 트리시클릭 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 O, S 또는 N으로부터 선택된 0 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 8원 카보시클릭 고리를 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 O 및 N으로부터 선택된 0 내지 1개의 헤테로원자를 포함하는 8원 고리를 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 O 및 N으로부터 선택된 0 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 5원 고리를 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 트리아졸 고리이다. 특정 실시형태에서, Q는 O 및 N으로부터 선택된 0 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 6원 고리를 포함한다. 특정 실시형태에서, Q는 2개의 N 헤테로원자를 포함하는 6원 고리를 포함한다.
Q가 시클릭 모이어티를 포함하는 일부 실시형태에서, Q는 하기 구조에 따르며, 여기서 Z는 O 또는 N으로부터 선택된 0 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 7 또는 8원 카보사이클이다.
Figure pct00017
일부 실시형태에서, Q는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00018
c. 표면 작용화된 바이러스 캡시드
본 개시내용의 양태에서, 표면 작용화된 바이러스 캡시드가 제공되며, 여기서 바이러스 캡시드의 표면은 가교제 반응성 쌍의 구성원을 포함하도록 작용화된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드 단백질은 캡시드-반응성 링커와의 반응에 의해 작용화된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드의 표면은 가교제 반응성 모이어티를 포함하는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드는 적어도 하나의 캡시드 단백질의 1차 서열에 생체직교 태그를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본 개시내용의 실시형태예에서, 바이러스 캡시드의 표면이 캡시드-반응성 링커와의 반응에 의해 작용화된 표면 작용화된 바이러스 캡시드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 표면 작용화된 바이러스 캡시드는 y 캡시드-반응성 링커기를 포함하며, 여기서 y는 각각의 바이러스 캡시드에 부착된 캡시드-반응성 링커의 수이다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 Y는 각각의 캡시드에 부착된 캡시드-반응성 링커의 평균 수이다.
a. 캡시드-반응성 링커
본 발명에 따른 캡시드-반응성 링커는 하기를 포함한다: i) 캡시드 표면과 공유 부착을 형성하기 위해 이용 가능한 캡시드 표면 반응성 모이어티, 및 ii) 본 개시내용의 리간드 상에서 작용화된 가교제 반응성 쌍의 다른 구성원과 상호 반응하도록 선택된 가교제 반응성 쌍의 구성원.
a. 스페이서
캡시드-반응성 링커는 선택적으로 하나 이상의 스페이서 모이어티를 추가로 포함한다. 스페이서 모이어티는 특별히 제한되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 스페이서일 수 있다. 일부 실시형태에서 스페이서는 에틸렌 글리콜의 하나 이상의 단량체, 즉 폴리에틸렌 글리콜, -(O-CH2-CH2)n- 또는 [PEG]n("개별 폴리에틸렌 글리콜"의 경우 "dPEG n"으로도 알려짐)을 포함하며, 여기서 "n"은 에틸렌 옥사이드(또는 "에틸렌 글리콜") 단위의 수이다. 특정 실시형태에서, n은 0이다. 특정 실시형태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100이다.
b. 캡시드 표면 반응성 모이어티
본 개시내용에 있어서, 캡시드 표면 반응성 모이어티는 특별히 제한되지 않으며 원하는 캡시드 표면에 공유적으로 부착할 수 있는 임의의 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, 캡시드 표면 반응성 모이어티는 잔기 특이적 단백질 라벨링에서 알려진 기술을 사용하여 캡시드 단백질 1차 서열의 표면 노출된 아미노산 잔기에 공유적으로 부착된다.
일부 실시형태에서, 아미노산 잔기는 야생형 캡시드 단백질에 존재한다. 다른 실시형태에서, 아미노산 잔기는 캡시드의 1차 아미노산 서열로 조작된다.
a. 캡시드 표면 1차 아민
일부 실시형태에서, 캡시드 표면 반응성 모이어티는 1차 아민(-NH2)과 반응하는 화학기를 포함한다. 1차 아민은 각 캡시드 단백질의 N-말단과 캡시드 단백질 서열의 라이신(Lys, K) 아미노산 잔기의 측쇄에 존재한다. 1차 아민과 반응하는 예시적인 화학기는 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실 아지드, NHS 에스테르, 설포닐 클로라이드, 알데하이드, 글리옥살, 에폭사이드, 옥시란, 카르보네이트, 아릴 할라이드, 이미도에스테르, 카르보디이미드, 무수물 및 플루오로페닐 에스테르를 포함한다. 이들 중 대부분은 아실화 또는 알킬화에 의해 아민에 접합된다. 일부 실시형태에서, 캡시드 표면 반응성 모이어티는 NHS 에스테르 또는 이미도에스테르, 예를 들어 R기가 캡시드-반응성 링커에 대한 부착점을 나타내는 아래에 예시된 것들을 포함한다.
Figure pct00019
일부 실시형태에서, 캡시드 표면 반응성 모이어티는 캡시드 단백질 1차 서열의 표면 노출된 라이신 잔기에 공유적으로 부착된다. 이들 중 특정 실시형태에서, 캡시드 표면 반응성 모이어티는 하기에 나타낸 바와 같이 NHS-에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 또는 벤질 플루오라이드를 포함하며, 여기서 R기는 캡시드-반응성 링커에 대한 부착점을 나타내고
Figure pct00020
기호는 캡시드 단백질 서열에서 라이신 잔기의 부착점을 나타낸다.
Figure pct00021
일부 실시형태에서, 캡시드-반응성 링커는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS 에스테르)를 포함한다. NHS 에스테르는 카르복실레이트 분자의 카르보디이미드 활성화에 의해 형성된 반응성 기이다. NHS 에스테르-활성화된 캡시드 반응성 링커는 생리학적 내지 약알칼리성 조건(pH 7.2 내지 9)에서 1차 아민과 반응하여 안정적인 아미드 결합을 생성한다. 반응은 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 방출한다.
일부 실시형태에서, 캡시드-반응성 링커는 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르를 포함한다. TFP 에스테르는 카르복실레이트 분자의 카르보디이미드 활성화에 의해 형성된 반응성 기이다. 카르복실산의 TFP 에스테르는 1차 아민과 NHS 에스테르 사이의 반응에 의해 형성된 것과 동일한 공유 아미드 결합을 형성하는 NHS 에스테르와 동일한 속도로 1차 아민과 반응한다.
b. 캡시드 표면 설프하이드릴기
일부 실시형태에서, 캡시드 표면 반응성 모이어티는 표면 노출된 설프하이드릴기에 공유적으로 부착된다. 일부 실시형태에서, 캡시드 표면 반응성 모이어티는 캡시드 단백질 1차 서열의 표면 노출된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다.
이들 중 특정 실시형태에서, 캡시드 표면 반응성 모이어티는 하기에 예시된 바와 같이 말레이미드, 요오도아세트아미드, 2-티오피리딘 또는 3-아릴프로피올로니트릴을 포함하며, 여기서 R기는 캡시드-반응성 링커에 대한 부착점을 나타내고
Figure pct00022
기호는 캡시드 단백질 서열에서 라이신 잔기의 부착점을 나타낸다.
Figure pct00023
일부 실시형태에서, 캡시드-반응성 링커는 말레이미드를 포함한다. 말레이미드 및 그 유도체는 말레산 무수물로부터 아민으로 처리한 다음 탈수하여 제조된다. 말레이미드기는 반응 혼합물의 pH가 6.5 내지 7.5일 때 설프하이드릴기와 특이적으로 반응한다; 그 결과 가역적이지 않은 안정한 티오에테르 결합이 형성된다.
c. 비천연 아미노산
일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드의 표면은 가교제 반응성 모이어티를 포함하는 비천연 아미노산을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 비천연 아미노산은 하기로부터 선택된다: 1: 3-(6-아세틸나프탈렌-2-일아미노)-2-아미노프로판산(Anap), 2: (S)-1-카르복시-3-(7-하이드록시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)프로판-1-아미늄(CouAA), 3: 3-(5-(디메틸아미노)나프탈렌-1-술폰아미드) 프로판산(단실알라닌), 4: N ㆍ-p-아지도벤질옥시카르보닐 라이신(PABK), 5: 프로파길-L-라이신(PrK), 6: N ㆍ-(1-메틸시클로프로프-2-엔카르복사미도) 라이신(CpK), 7: N ㆍ-아크릴라이신(AcrK), 8: N ㆍ-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)카르보닐)L-라이신(CoK), 9: 바이시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메탄올 라이신(BCNK), 10: 트랜스-시클로옥트-2-엔 라이신(2'-TCOK), 11: 트랜스-시클로옥트-4-엔 라이신(4'-TCOK), 12: 디옥소-TCO 라이신(DOTCOK), 13: 3-(2-시클로부텐-1-일)프로판산(CbK), 14: N ㆍ-5-노르보르넨-2-일옥시카르보닐-L-라이신(NBOK), 15: 시클로옥틴 라이신(SCOK), 16: 5-노르보르넨-2-올 티로신(NOR), 17: 시클로옥트-2-이놀 티로신(COY), 18: (E)-2-(시클로옥트-4-엔-1-일옥실)에탄올 티로신(DS1/2), 19: 아지도호모알라닌(AHA), 20: 호모프로파길글리신(HPG), 21: 아지도노르류신(ANL), 및 22: N ㆍ-2-아지데오에틸옥시카르보닐-L-라이신(NEAK)(아래 예시된 바와 같음).
Figure pct00024
d. 작용화된 리간드
본 발명의 양태에서, 가교제 반응성 쌍의 구성원을 포함하도록 작용화된 리간드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 리간드는 리간드-반응성 링커와의 반응에 의해 작용화된다. 일부 실시형태에서, 리간드는 폴리펩티드이고, 폴리펩티드는 가교제 반응성 모이어티를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하도록 돌연변이된다. 일부 실시형태에서, 리간드는 리간드의 1차 서열에 생체직교 태그를 포함하는 융합 단백질이다.
a. 리간드-반응성 링커
본 개시내용에 따른 리간드-반응성 링커는 하기를 포함한다: i) 리간드 표면과 공유 부착을 형성하는 데 이용 가능한 리간드-반응성 모이어티, 및 ii) 본 개시내용의 표면 작용화된 바이러스 캡시드와의 생체직교 접합에 이용 가능한 가교제 반응성 쌍의 구성원.
a. 스페이서
리간드-반응성 링커는 선택적으로 적어도 하나의 스페이서 모이어티를 추가로 포함한다. 스페이서 모이어티는 특별히 제한되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 스페이서일 수 있다. 일부 실시형태에서 스페이서는 에틸렌 글리콜의 단량체, 즉 폴리에틸렌 글리콜, -(O-CH2-CH2)n- 또는 [PEG]n("개별 폴리에틸렌 글리콜"의 경우 "dPEG n"으로도 알려짐)을 포함하며, 여기서 "n"은 에틸렌 옥사이드(또는 "에틸렌 글리콜") 단위의 수이다. 특정 실시형태에서, n은 0이다. 특정 실시형태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100이다. 특정 실시형태에서, n은 4이다.
b. 리간드-반응성 모이어티
본 개시내용에 따르면, 리간드-반응성 부분은 특별히 제한되지 않으며 원하는 리간드에 공유적으로 부착될 수 있는 임의의 모이어티를 포함한다.
리간드가 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드인 일부 실시형태에서, 리간드-반응성 모이어티는 잔기 특이적 단백질 라벨링에서 알려진 기술을 사용하여 리간드 단백질 1차 서열의 아미노산 잔기에 부착된다.
일부 실시형태에서, 아미노산 잔기는 야생형 리간드 단백질에 존재한다. 다른 실시형태에서, 아미노산 잔기는 리간드의 1차 아미노산 서열로 조작된다.
a. 리간드 1차 아민
일부 실시형태에서, 리간드-반응성 모이어티는 1차 아민(-NH2)과 반응하는 화학기를 포함한다. 리간드가 폴리펩티드인 실시형태에서, 1차 아민은 각각의 리간드 단백질의 N-말단에 그리고 리간드 단백질 서열에서 라이신(Lys, K) 아미노산 잔기의 측쇄에 존재한다. 1차 아민과 반응하는 예시적인 화학기는 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실 아지드, NHS 에스테르, 설포닐 클로라이드, 알데하이드, 글리옥살, 에폭사이드, 옥시란, 카르보네이트, 아릴 할라이드, 이미도에스테르, 카르보디이미드, 무수물 및 플루오로페닐 에스테르를 포함한다. 이러한 화학기의 대부분은 아실화 또는 알킬화에 의해 아민에 접합된다. 일부 실시형태에서, 리간드 표면 반응성 모이어티는 NHS 에스테르 또는 이미도에스테르, 예를 들어 R기가 리간드 반응성 링커에 대한 부착점을 나타내는 아래에 예시된 것들을 포함한다.
Figure pct00025
리간드가 폴리펩티드인 일부 실시형태에서, 리간드-반응성 모이어티는 리간드 단백질 1차 서열의 표면 노출된 라이신 잔기에 공유적으로 부착된다. 이들 중 특정 실시형태에서, 리간드 표면 반응성 모이어티는 하기에 나타낸 바와 같이 NHS-에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 또는 벤질 플루오라이드를 포함하며, 여기서 R기는 리간드-반응성 링커에 대한 부착점을 나타내고
Figure pct00026
기호는 리간드 단백질 서열에서 라이신 잔기의 부착점을 나타낸다.
Figure pct00027
일부 실시형태에서, 리간드-반응성 링커는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS 에스테르)를 포함한다. NHS 에스테르는 카르복실레이트 분자의 카르보디이미드 활성화에 의해 형성된 반응성 기이다. NHS 에스테르-활성화된 리간드 반응성 링커는 생리학적 내지 약알칼리성 조건(pH 7.2 내지 9)에서 1차 아민과 반응하여 안정적인 아미드 결합을 생성한다. 반응은 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 방출한다.
b. 리간드 설프하이드릴기
일부 실시형태에서, 리간드-반응성 모이어티는 표면 노출된 설프하이드릴기에 공유적으로 부착된다. 리간드가 폴리펩티드인 일부 실시형태에서, 리간드-반응성 모이어티는 리간드 단백질 1차 서열의 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된다.
이들 중 특정 실시형태에서, 리간드 반응성 모이어티는 하기에 예시된 바와 같이 말레이미드, 요오도아세트아미드, 2-티오피리딘 또는 3-아릴프로피올로니트릴을 포함하며, 여기서 R기는 리간드-반응성 링커에 대한 부착점을 나타내고
Figure pct00028
기호는 리간드 단백질 서열에서 라이신 잔기의 부착점을 나타낸다.
Figure pct00029
일부 실시형태에서, 리간드-반응성 링커는 말레이미드를 포함한다. 말레이미드 및 그 유도체는 말레산 무수물로부터 아민으로 처리한 다음 탈수하여 제조된다. 말레이미드기는 반응 혼합물의 pH가 6.5 내지 7.5일 때 설프하이드릴기와 특이적으로 반응한다; 그 결과 가역적이지 않은 안정한 티오에테르 결합이 형성된다.
c. 비천연 아미노산
일부 실시형태에서, 리간드는 가교제-반응성 모이어티를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하도록 돌연변이된 폴리펩티드이다.
특정 실시형태에서, 리간드 폴리펩티드는 하기로부터 선택된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 돌연변이된다: 1: 3-(6-아세틸나프탈렌-2-일아미노)-2-아미노프로판산(Anap), 2: (S)-1-카르복시-3-(7-하이드록시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)프로판-1-아미늄(CouAA), 3: 3-(5-(디메틸아미노)나프탈렌-1-술폰아미드) 프로판산(단실알라닌), 4: N ㆍ-p-아지도벤질옥시카르보닐 라이신(PABK), 5: 프로파길-L-라이신(PrK), 6: N ㆍ-(1-메틸시클로프로프-2-엔카르복사미도) 라이신(CpK), 7: N ㆍ-아크릴라이신(AcrK), 8: N ㆍ-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)카르보닐)L-라이신(CoK), 9: 바이시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메탄올 라이신(BCNK), 10: 트랜스-시클로옥트-2-엔 라이신(2'-TCOK), 11: 트랜스-시클로옥트-4-엔 라이신(4'-TCOK), 12: 디옥소-TCO 라이신(DOTCOK), 13: 3-(2-시클로부텐-1-일)프로판산(CbK), 14: N ㆍ-5-노르보르넨-2-일옥시카르보닐-L-라이신(NBOK), 15: 시클로옥틴 라이신(SCOK), 16: 5-노르보르넨-2-올 티로신(NOR), 17: 시클로옥트-2-이놀 티로신(COY), 18: (E)-2-(시클로옥트-4-엔-1-일옥실)에탄올 티로신(DS1/2), 19: 아지도호모알라닌(AHA), 20: 호모프로파길글리신(HPG), 21: 아지도노르류신(ANL), 22: N ㆍ-2-아지데오에틸옥시카르보닐-L-라이신(NEAK).
Figure pct00030
d. 태그 반응성 분자가 있는 융합 단백질
본 발명의 실시형태에서, 리간드는 SNAP-태그, CLIP-태그, Halo 태그, Lumio 태그 및 당업자에게 공지된 다른 것들과 같이 고친화도로 상응하는 대응물에 결합할 수 있는 태그를 포함하는 융합 단백질이다.
벤질구아닌, 벤질시토신 및 클로로알칸은 SNAP와 같은 "자살" 효소에 의해 인식된다. 본 발명의 맥락에서, 벤질구아닌 또는 벤질시토신은 선택적으로 치환되어 벤질구아닌 또는 벤질시토신의 유도체를 형성할 수 있다. 벤질구아닌 유도체 또는 벤질시토신 유도체는 변형되었지만 그럼에도 불구하고 자살 효소에 의해 인식되는 벤질구아닌 또는 벤질시토신기를 의미하는 것으로 이해된다.
태그 분자는 추가 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 생체분자일 수 있다. 예는 SNAP-태그, CLIP-태그, Lumio-Tag 또는 Halo-Tag를 포함할 수 있다. 예를 들어, 친화성 태그는 알킬구아닌-DNA 알킬트랜스퍼라제의 돌연변이인 SNAP-태그일 수 있다. 중요한 것은 SNAP 태그의 기질 중 하나가 벤질구아닌이라는 것이다. 본 발명에 유용한 시판 제품은 예를 들어 Promega의 HaloTag, Life Technologies의 Lumio 태그 및 NEB의 SNAP/CLIP 태그를 포함한다.
자가 표지 단백질 태그는 다양한 발현 벡터에서 상업적으로 이용 가능하다. SNAP-태그는 182개의 잔기 폴리펩티드(19.4 kDa)로 관심 있는 임의의 단백질에 융합될 수 있으며 형광 염료와 같은 적합한 리간드로 특이적으로 그리고 공유적으로 태그를 붙일 수 있다. SNAP 태그 단백질은 O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT) 유전자에 의해 인간에서 인코딩되는 유비쿼터스 포유류 효소 AGT의 조작된 버전이다. SNAP-태그는 손상된 DNA에서 알킬화된 구아닌 유도체를 복구하는 대신 O6-벤질구아닌 유도체를 받아들이는 hAGT 변이체로 이어지는 유도 진화 전략을 사용하여 수득되었다.
CLIP-태그는 O6-벤질구아닌 대신 기질로서 O2-벤질시토신 유도체를 수용하도록 SNAP-태그로부터 추가로 조작되었다. 단백질 보완 분석 및 단백질-단백질 상호 작용 연구에 적합한 분할-SNAP-태그 버전이 나중에 개발되었다.
HaloTag는 자가 표지 단백질 태그이다. 합성 리간드에 공유 결합하도록 설계된 박테리아 효소에서 파생된 297개의 잔기 펩티드(33kDa)이다. HaloTag는 유전적으로 변형된 활성 부위를 가지고 있는 가수 분해 효소로, 반응성 클로로알칸 링커에 특이적으로 결합하고 리간드 결합 속도를 증가시킨다. 단백질 태그와 클로로알칸 링커 사이에 결합을 형성하는 반응은 빠르며 링커 부분의 말단 염소로 인해 생리학적 조건 하에서 본질적으로 비가역적이다. 앞서 언급한 반응에서 클로로알칸 반응성 링커의 친핵성 공격은 할로겐을 아미노산 잔기로 대체하여 공유 알킬-효소 중간체를 형성한다. 이 중간체는 야생형 가수분해효소 내의 아미노산 잔기에 의해 가수분해될 것이다. 이는 반응 후 효소의 재생으로 이어질 것이다. 그러나, 변형된 할로알칸 탈할로게나제(HaloTag)에서는, 반응 중간체는 효소의 돌연변이로 인해 가수분해가 불가능하여 후속 반응을 진행할 수 없다. 이로 인해 중간체는 관련된 역반응이 없는 안정한 공유 부가물로서 지속된다.
이 시스템을 사용하는 데는 두 단계가 있다: SNAP-태그® 융합체로서 관심 단백질의 클로닝 및 발현, 선택한 SNAP-태그 기질로 융합체의 라벨링. SNAP-태그는 DNA 복구 단백질인 인간 O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라제(hAGT)를 기반으로 하는 작은 단백질이다. 이 경우 SNAP 태그 기질은 벤질 링커에 연결된 구아닌 이탈기이다. 라벨링 반응에서 기질의 치환된 벤질 기는 SNAP-태그에 공유적으로 부착된다.
SNAP-태그 단백질 라벨링 시스템은 거의 모든 분자를 관심 있는 단백질에 특이적으로 공유 부착할 수 있게 한다.
e. 반응성 링커의 예
하기 반응성 링커는 본 개시내용의 다양한 실시형태에 따라 캡시드-반응성 링커 또는 리간드-반응성 링커로서 사용하기에 적합하다.
a. TCO-PEG4-NHS
Figure pct00031
동의어(들): 트랜스-시클로옥텐-PEG4-NHS; 실험식(힐 표기법): C24H38N2O10; 분자량:514.57.
b. 테트라진-PEG5-NHS
Figure pct00032
테트라진-PEG5-NHS 에스테르는 단백질, 펩티드 또는 테트라진 모이어티가 있는 아민 변형 올리고뉴클레오티드의 변형에 자주 사용되는 아민 반응성 링커이다.
c. 아지도-PEG4-NHS
Figure pct00033
본원에서는 "아지드-PEG4-NHS"라고도 한다.
d. 포스핀-NHS
Figure pct00034
분자량: 461.40.
e. DBCO-PEG12-TFP 에스테르
Figure pct00035
f. 말레이미드-PEG8-숙신이미딜 에스테르
Figure pct00036
말레이미드 PEG8 숙신이미딜 에스테르, 31-(2,5-디하이드로-2,5-디옥소-1H-피롤-1-일)-29-옥소-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자헨트리아콘탄산 2,5-디옥소-1-피롤리디닐 에스테르, 말레이미드-PEG8-NHS 에스테르, 31-(2,5-디하이드로-2,5-디옥소-1H-피롤-1-일)-29-옥소-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자헨트리아콘탄산 2,5-디옥소-1-피롤리디닐 에스테르, 말레이미드-PEG8-NHS 에스테르.
7.1.1 화학식 I의 표면 변형된 바이러스 캡시드
특정 실시형태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 화학식 I에 따른다:
Figure pct00037
상기 식에서,
Figure pct00038
는 바이러스 캡시드이고; Y는 부착 모이어티이고;
Y'는 부착 모이어티이고;
Q는 가교 모이어티이고;
PEG는 에틸렌 글리콜의 단량체이고;
n 및 n'은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고,
Sp 및 Sp'는 독립적으로 선택적인 스페이서이고;
L은 리간드이고; 및
x는 1 내지 300, 100 내지 200, 120 내지 180 또는 약 150의 정수이다.
특정 실시형태에서, 부착 모이어티 Y는 캡시드-반응성 모이어티와 캡시드 단백질 사이의 반응에 의해 형성된다. 특정 실시형태에서, 부착 모이어티 Y는 NHS 에스테르와 캡시드 단백질 아미노산의 1차 아미노기 사이의 반응에 의해 형성된다. 일부 실시형태에서, 아미노기는 캡시드 단백질의 1차 서열에 존재하는 라이신의 측쇄이다. 일부 실시형태에서, 아미노기는 AAV 캡시드 단백질의 야생형 1차 서열에 존재하는 라이신이다.
특정 실시형태에서, 부착 모이어티 Y'는 리간드-반응성 모이어티와 리간드 사이의 반응에 의해 형성된다. 특정 실시형태에서, 부착 모이어티 Y'는 NHS 에스테르와 리간드의 아미노기 사이의 반응에 의해 형성된다.
특정 실시형태에서, Q는 가교제 반응성 쌍의 구성원 사이의 반응에 의해 형성된 생성물이다. 특정 실시형태에서, Q는 DBCO와 아지도기의 반응에 의해 형성된 가교 모이어티이다.
특정 실시형태에서, Q는 하기로부터 선택된다:
Figure pct00039
또는
Figure pct00040
상기 식에서, Z는 7 또는 8원 시클릭 또는 헤테로환 구조이다.
특정 실시형태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 화학식 I-1에 따른다:
Figure pct00041
상기 식에서,
Figure pct00042
는 바이러스 캡시드이고;
n 및 n'은 독립적으로 0 내지 30으로부터 선택되는 정수이고;
L은 리간드이고; 및
x는 50 내지 250의 정수임.
특정 실시형태에서, n은 0 내지 100으로부터 선택된 정수이다. 특정 실시형태에서, n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 및 100으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, n'는 0 내지 100으로부터 선택된 정수이다. 특정 실시형태에서, n'는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 및 100으로부터 선택된다.
f. 리간드
본 개시내용과 함께 사용하기 위한 리간드는 리간드가 본원에 기재된 바와 같이 바이러스 캡시드 표면에 접합될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 리간드는 수용체와 같은 포유류 세포의 표면에 위치하는 동족을 갖는 단백질 리간드로부터 선택된다. 이들 실시형태 중 일부에서, 동족 단백질은 표면 변형된 바이러스 캡시드의 형질도입에 관여한다.
일부 실시형태에서, 리간드는 세포 유형 특이적 리간드이다. 특정 실시형태에서, 리간드는 폴리펩티드, 단백질, 단당류 또는 다당류, 스테로이드 호르몬, RGD 모티프 펩티드, 비타민, 소분자 또는 표적화 펩티드로부터 선택된다. 항체(예를 들어, 단일 사슬) 및 나노바디; 프로테아제, 글리코시다아제, 리파아제, 펩티다아제와 같은 효소; CD47(먹지 마세요 신호)과 같은 면역글로불린; IdeZ 및 IdeS와 같은 IgG 프로테아제; 예방접종을 위한 단백질 기반 및 소분자 보조제가 또한 고려된다.
일 실시형태에 따르면, 세포 유형 특이적 리간드는 트랜스페린, 표피 성장 인자 EGF, 염기성 섬유아세포 성장 인자 bFGF와 같은 단백질로부터 유도된다.
일 실시형태에 따르면, 세포 유형 특이적 리간드는 갈락토스, N-아세틸갈락토사민 및 만노스와 같은 단당류 또는 다당류로부터 유도된다.
일 실시형태에 따르면, 세포 유형 특이적 리간드는 엽산과 같은 비타민으로부터 유도된다.
일 실시형태에 따르면, 세포 유형 특이적 리간드는 나프록센, 이부프로펜 또는 다른 공지된 단백질 결합 분자를 포함하는 소분자로부터 유도된다.
특정 실시형태에서, 리간드는 단백질 리간드, 예컨대 성장 인자 또는 사이토카인; 독소 서브유닛, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유닛; 렉틴, 예컨대 이소렉틴 B4 또는 밀 배아 응집소; 부착 인자, 예컨대 락타데린; 항체 또는 이의 단일 사슬 가변 단편, 예컨대 항 CD-34 항체; 보다 구체적으로, 대장균 재조합 scFv CD-34 항체 단편, 펩티드, 예컨대 델토르핀 오피오이드 수용체 리간드; 및 유전자 편집 뉴클레아제, 예컨대 Cas9로부터 선택된다.
g. 바이러스 캡시드
본 개시내용의 실시형태에서, 바이러스 캡시드는 특별히 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드는 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스와 같은 외피가 없는 바이러스로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 캡시드는 외피 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 및 배큘로바이러스로부터 선택된다. 실시형태는 비-천연 발생 캡시드를 포함하고, 1차 아미노산 서열의 변화 이외에 또는 이에 더하여 자연 발생 캡시드 단백질의 생물학적 또는 화학적 변경 또는 변이를 포함한다.
a. AAV
모든 재조합 아데노 관련 바이러스(본원에서 상호 교환적으로 사용되는 rAAV, 또는 AAV)는 본 개시내용의 틀 내에서 구현될 수 있다. 이러한 AAV 입자는 포유류의 광범위한 생체내 유사분열 후 세포, 예를 들어 근육 세포, 간세포 및 뉴런(이에 제한되지는 않음)을 형질도입할 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 자연 발생 AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV는 비-자연 발생 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 이들 중 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 단백질은 자연 발생 캡시드와 1차 아미노산 서열이 상이하다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 캡시드는 1차 아미노산 서열의 변화 이외의 또는 추가의 자연 발생 AAV 캡시드 단백질의 생물학적 또는 화학적 변경 또는 변이를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3B, AAV5, AAV6, AAV8, 또는 AAV9 자연 발생 AAV 혈청형의 단백질이다. 다양한 실시형태에서, 캡시드 단백질은 본원에 그 전체를 참조로 포함되는 PCT/US2014/060163, USP9695220, PCT/US2016/044819, PCT/US2018/032166, PCT/US2019/031851, 및 PCT/US2019/047546에 개시된 캡시드 단백질로부터 선택된다.
아데노 관련 바이러스 캡시드는 모든 확인된 천연 혈청형, 특히 AAV2, AAV3b, AAV5, AAV8, AAV9 및 AAV 10 중에서 선택될 수 있고 더욱 특히 AAV2일 수 있다.
또한, 아데노 관련 바이러스는 다음과 같으나 이에 제한되지 않는 비-천연 방법에 의해 생성된 합성 혈청형 중에서 선택될 수 있다: 캡시드 돌연변이 유발, 캡시드 서열로의 펩티드 삽입 또는 결실, 다양한 혈청형으로부터의 캡시드 셔플링 또는 조상 재구성.
본 개시내용과 함께 사용하기 위한 AAV 캡시드는 제한 없이 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성된다. 예를 들어, AAV 캡시드는 하기를 포함하는 여러 방법으로 생산될 수 있다: HEK293 세포의 일시적 형질감염, Ad 또는 HSV로 감염된 안정한 세포주, Ad 또는 HSV로 감염된 포유류 세포(rep-cap 및 이식유전자 발현) 또는 배큘로바이러스 벡터로 감염된 곤충 세포(rep-cap 및 이식유전자 발현). 임의의 이들 방법에 의해 생성된 AAV 캡시드는 본원에 기술된 표면 작용화되고 표면 변형된 바이러스 캡시드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 벡터는 인산칼슘-HeBS 방법으로 HEK293 세포를 2개의 플라스미드로 일시적 형질감염시켜 생산된다: pHelper, PDP2-KANA 인코딩 AAV Rep2-Cap2 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자(E2A, VA RNA, 및 E4) 및 pVector ss-CAG-eGFP(제공된 실시예에 예시됨).
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 캡시드는 필요에 따라 바이러스외 기원으로부터의 하나 이상의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, AAV의 캡시드는 고유한 VP1 N-말단, VP1/VP2 공통 부분 및 VP1, VP2 및 VP3에 공통인 부분을 함유하는 3개의 중첩 캡시드 단백질(VP1, VP2, VP3)로 구성된다.
특정 실시형태에서 하나 이상의 캡시드 단백질은 자연적으로 발생하는 아미노기를 포함하며, 즉 1차 서열은 야생형 캡시드 단백질에 상응한다. 대안적인 실시형태에서, 하나 이상의 캡시드 단백질의 1차 서열은 야생형 캡시드 단백질 서열로 조작된 아미노산을 포함한다. 이들 중 특정 실시형태에서, 조작된 아미노산은 캡시드의 표면에 존재하는 하나 이상의 아미노기를 포함하고 하나 이상의 캡시드 단백질의 표면 작용화에 관여한다. 특정 실시형태에서, 캡시드의 표면 작용화에 관여하는 자연 발생 또는 조작된 아미노기는 라이신, 아르기닌 및 시스테인으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 아미노산은 라이신이다.
특정 실시형태에 따르면, AAV 캡시드는 자연 발생 혈청형으로부터의 하나 이상의 야생형 캡시드 단백질을 포함한다.
다른 특정 구현형태에 따르면, AAV 캡시드는 유전적으로 변형된 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 유전적으로 변형된 캡시드 단백질은 하나 이상의 유전적 변형(돌연변이, 삽입 또는 결실)을 포함하도록 조작된 자연 발생 혈청형이다. 대안적인 실시형태에서, rAAV 캡시드는 하나 이상의 합성 캡시드 단백질로 구성된다. 특정 실시형태에서, AAV 캡시드는 예를 들어 헤파린 결합을 감소시키기 위해 자연 향성을 변형시키도록 조작된다.
본 개시내용의 틀에서, 합성 캡시드에는 자연에 존재하는 것으로 알려지지 않은 새로운 AAV 바이러스 캡시드를 조립하고 생성할 수 있는, 천연, 유전자 조작 및 인위적으로 생성된 혈청형(무작위 돌연변이, 시퀀스 셔플링, 인 실리코 디자인 등)으로부터의 캡시드 단백질의 임의의 조합이 포함된다.
현재, 상이한 세포 유형을 형질도입할 수 있는 특정 세포 표면 수용체에 대한 캡시드 단백질의 결합 능력이 상이한 확인된 100개 초과의 AAV 혈청형이 있다. AAV2는 박테리아 플라스미드에 클로닝된 최초의 혈청형이었으며 이후 다른 혈청형을 식별하기 위한 비교로 사용되었다. 12가지 혈청형(AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12)이 특정 세포 유형을 변환하는 능력에 대해 철저하게 시험되었으며 세포 부착을 위해 특정 세포 표면 수용체에 결합하는 캡시드 단백질 모티프 간에 분화되었다. 본 발명의 맥락에서, AAV 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12로부터 선택되는 것이 바람직하다. 그러나, 임의의 다른 AAV 캡시드가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 아데노 관련 바이러스(AAV) 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로부터 선택된다. 현재까지 가장 일반적으로 사용되는 유전자 전달 시스템은 바이러스의 유도체, 예를 들어 아데노 관련 바이러스 2형(AAV2), AAV9 및 AAV8이다. 특정 실시형태에서, rAAV 캡시드 AAV-2 및 AAV-9는 캡시드 단백질이 선택적으로 추가로 조작되어 천연 향성을 감소시키거나 변형시키도록, 예를 들어 헤파린 결합을 감소시킨다.
b. 천연 결합 모이어티 제거
본 개시내용의 아데노 관련 바이러스(rAAV) 캡시드의 특정 실시형태에서, rAAV는 제거된 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 결합할 수 있는 자연 세포 결합 부위를 갖는 자연 발생 혈청형으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 헤파린 결합의 제거는 VP1의 아르기닌 585 또는 아르기닌 588 및/또는 VP2 또는 VP3의 유사한 아르기닌 중 적어도 하나를 상이한 아미노산, 예컨대 알라닌으로 대체함으로써 조작되었다. 일부 실시형태에서, VP2의 아르기닌 448 및 아르기닌 451 또는 VP3의 383 및 386 중 적어도 하나가 변경된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드는 야생형으로부터 돌연변이된 적어도 하나의 단백질로 구성되며, 예를 들어, 조작된/돌연변이된 단백질은 VP1, VP2 및/또는 VP3인 야생형 단백질로부터 선택된다. 대안적으로, 상기 캡시드 내의 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3 중 2개가 돌연변이되거나, 상기 캡시드 내의 단백질 VP1, VP2 및 VP3 중 3개 모두가 변형된다. 특정 실시형태에서, 상기 캡시드에서 변형될 적어도 하나의 단백질의 적어도 하나의 부분, 예를 들어, 하나의 아미노산이 돌연변이(교체, 삽입 또는 결실)된다. 그러나, 상기 캡시드에서 단백질 VP1, VP2 및 VP3의 여러 부분, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10과 같은 여러 아미노산, 또는 다른 수의 부분 또는 아미노산을 돌연변이시키는 것도 가능하다. 특정 실시형태에서, VP1의 아르기닌 484, 487, 585 및 588 및 라이신 532 중 적어도 하나, 및/또는 VP2 또는 VP3의 유사한 아르기닌은 이들을 알라닌과 같은 상이한 아미노산으로 교체함으로써 제거된다.
7.1.1 PEG 면역 클로킹
또 다른 특정 실시형태에 따르면, 바이러스 캡시드 표면은 중화 항체와의 상호작용을 피하기 위한 입체 차폐제를 포함하도록 당업계에 알려진 방법에 따라 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 입체 차폐제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 pHPMA와 같은 합성 중합체로부터 유도된다. PEG의 중합체는 중합 공정에 의해 제조되며, 다분산 지수(PDI), 분산 지수 또는 단순히 분산도로도 알려진, 사슬 길이와 분자량의 포아송 분포로 특징지어질 수 있는 크기와 분자량의 불균일한 혼합물을 포함한다("ㆍ"기호로 표시). 보고된 분자량은 평균 분자량이며 ㆍ(또는 PDI)는 샘플의 분자량 범위를 나타낸다.
h. 캡시드 카고
본 발명의 표면 변형된 rAAV 캡시드 내부에 패키징된 핵산 카고는 rAAV에 의해 세포로 유용하게 형질도입되는 임의의 종류의 핵산 분자일 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 캡시드의 페이로드 또는 카고는 발현가능한 폴리뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 발현가능한 폴리뉴클레오타이드는 단백질을 인코딩한다(예를 들어, 치료 단백질을 인코딩함). 특정 실시형태에서, 발현가능한 폴리뉴클레오타이드는 이식유전자를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 발현가능한 폴리뉴클레오타이드는 전사되어 가이드 RNA, 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA), 메신저 RNA(mRNA), 마이크로RNA(miRNA) 또는 shRNA를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 페이로드는 상동성 지정 수리를 위한 DNA 상동성 작제물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산 분자는 세포내 항체 인코딩(예를 들어, 세포 내부의 특정 단백질을 중화하기 위해), 펩티드 독소를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 통증 경로에서 이온 채널 차단), 광유전적 액추에이터(예를 들어, 빛을 사용하여 신경 활동을 켜거나 끄기 위해)를 인코딩하는 핵산 분자, 약물유전학적 도구를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 약리학적 효과를 방해하지 않는 화학적 리간드를 사용하여 신경 신호를 켜거나 끄기 위해), 정밀 유전자 편집을 위한 CRISPR 기반 편집기를 인코딩하는 핵산 분자, 유전자 발현을 조절하는 CRISPR-후생유전학 도구를 인코딩하는 핵산 분자, 및/또는 세포 사멸을 유도하는 자살 유전자를 인코딩하는 핵산 분자이다.
바람직하게는, 카고가 Cas9와 같은 유전자 편집 뉴클레아제를 포함하는 경우, 카고는 숙주 게놈에 삽입될 gRNA 및/또는 특이적 DNA와 같은 핵산 분자를 추가로 포함한다. 이들 중 특정 실시형태에서, 카고는 유전적 장애와 관련된 것으로 알려진 이식유전자를 포함한다.
당업자는 Cpfl, TALEN, ZFN 또는 귀소 엔도뉴클레아제와 같은 Cas9 외에 다른 유전자 편집 뉴클레아제를 알고 있다. 또한, DNA 유도 아르고노트 간섭 시스템(DAIS)을 사용하여 조작하는 것이 편리할 수 있다. 기본적으로, 상기 아르고노트(Ago) 단백질은 상기 Ago 단백질에 대한 절단의 특이성을 미리 선택된 유전자좌로 제공하는 적어도 하나의 외인성 올리고뉴클레오티드(DNA 가이드)의 존재 하에 상기 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드로부터 이종 발현된다. TALEN 및 Cas9 시스템은 각각 WO 2013/176915 및 WO 2014/191128에 기재되어 있다. 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 문헌[Kim, YG; Cha, J.; Chandrasegaran, S. ("Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain" (1996). Proc Natl Acad Sci USA 93 (3): 1156-60)]에 처음 기재되어 있다. Cpfl은 Zhang 등이 설명한 클래스 2 CRISPR Cas 시스템이다(문헌[Cpfl is a single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRIPR-Cas System. (2015). Cell;163:759-771]). 아르고노트(AGO) 유전자 군은 처음에 Guo S, Kemphues KJ에서 기술되었다(문헌[Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. (1995). Cell;81(4):611-20]).
d. 표면 변형된 바이러스 캡시드의 제조 방법
본 개시내용의 또 다른 양태는 표면-변형된 재조합 바이러스 캡시드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 제공된 캡시드는 핵산을 진핵 세포, 전형적으로 포유류 세포, 특히 인간 세포로 형질도입하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 표면-변형된 바이러스 캡시드는 재조합 아데노바이러스 비리온이다. 일부 실시형태에서, 표면-변형된 바이러스 캡시드는 재조합 AAV 비리온이다.
방법은 가교 모이어티 Q를 포함하는 링커를 통해 리간드를 바이러스 캡시드 단백질에 가교시키는 단계, 즉 공유적으로 접합시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 리간드는 적어도 하나의 포유류 세포 표면 표적 결합 부위를 상기 캡시드에 도입하고, 선택적으로 상기 캡시드 내의 천연 세포 표면 표적 결합 부위는 이전에 제거된 것과 같이 제거된다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 표면 변형된 바이러스 캡시드를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) 바이러스 캡시드 단백질을, 가교제 반응성 쌍의 제1 구성원 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서를 포함하는 캡시드 반응성 링커와 반응시켜 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 수득하는 단계;
ii) 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 가교제 반응성 쌍의 제2 구성원 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서를 포함하는 작용화된 리간드와 접합시키는 단계,
여기서 가교제 반응성 쌍의 제1 및 제2 구성원은 반응하여 가교 모이어티 Q를 형성함; 및
iii) 표면 변형된 바이러스 캡시드를 수득하는 단계.
위에서 언급한 바와 같이, 상기 캡시드 내의 상기 천연 포유류 세포 표면 표적 결합 부위가 존재하고 제거되지 않고, 캡시드가 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 리간드를 포함하도록 표면 변형된 경우, 제공된 표면 변형된 바이러스 캡시드는 본원에 기술된 바와 같이 표면 변형되지 않은 캡시드와 비교하여 더 높은 감염률(즉, 개선된 형질도입 - 더 큰 효율 또는 더 낮은 역가에서 유사한 효율)을 갖는다. 대안적인 실시형태에서, 상기 캡시드에서 상기 천연 포유류 세포 표적 결합 부위가 제거되면, (예를 들어, 알려진 헤파린 결합 부위의 유전적 변형) 리간드를 포함하도록 캡시드의 표면 변형 전에, 제공된 표면 변형된 캡시드는 본원에 기재된 바와 같이 표면 변형되지 않은 캡시드와 비교하여 i) 개질된 향성 및 ii) 개선된 형질도입 중 하나 이상을 갖는다.
상기 방법에 의해 생성된 아데노 관련 바이러스(AAV) 입자는 바람직하게는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, hu68, rh.10 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
상기 방법에 의해 생성되는 아데노 관련 바이러스(AAV) 입자의 임의의 단백질은 변형될 수 있다. 바람직하게는, 상기 캡시드 내의 단백질 VP1, VP2 또는 VP3 중 적어도 하나는 상기 방법에서 변형된다. 대안적으로, 상기 캡시드 내의 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3 중 2개가 변형되거나, 상기 캡시드 내의 단백질 VP1, VP2 및 VP3 중 3개 모두가 변형된다. 바람직하게는, 적어도 하나의 부분, 예를 들어 상기 캡시드에서 변형될 단백질 중 적어도 하나의 아미노산이 변형된다. 그러나, 상기 캡시드에서 단백질 VP1, VP2 및 VP3의 여러 부분, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10과 같은 여러 아미노산, 또는 다른 수의 부분 또는 아미노산을 변형시키는 것도 가능하다. 바람직하게는, VP1의 아르기닌 484, 487, 585 및 588 및 라이신 532 중 적어도 하나 및/또는 VP2 또는 VP3의 유사한 아르기닌은 이들을 알라닌과 같은 상이한 아미노산으로 교체함으로써 제거된다.
VP1, VP2 또는 VP3과 같은 천연 AAV 혈청형(원하는 경우 추가로 유전적으로 변형됨)의 캡시드 단백질은 특정 아미노산에서 화학적으로 변형된다. 이러한 변형의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 예를 들어, 문헌[R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005](본원에 참조로 포함됨)에 요약되어 있다. 아미노산의 화학적 변형에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 아실화, 아미드화, 라이신의 피리독실화, 환원성 알킬화, 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)을 사용한 아미노기의 트리니트로벤질화, 카르복실기의 아미드 변형 및 시스테인의 시스테산으로의 과포름산 산화에 의한 술피드릴 변형, 수은 유도체의 형성, 다른 티올 화합물과의 혼합 이황화물의 형성, 말레이미드와의 반응, 요오도아세트산 또는 요오도아세트아미드와의 카르복시메틸화 및 알칼리성 pH에서 시아네이트와의 카르바모일화. 이와 관련하여 당업자는 문헌[Current Protocols in Protein Science, Eds. Coliganet al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000, 그 전체 내용은 본원에 명시적으로 포함됨)]의 15장에서 단백질의 화학적 변형과 관련된 보다 광범위한 방법론을 참조한다.
개선된 아데노 관련 바이러스(AAV)를 생산하기 위한 상기 방법의 일부 실시형태에서, 캡시드 변형은 천연 결합 부위의 제거 및 예를 들어 캡시드 표면 반응성 모이어티로 캡시드 표면의 작용화를 통한 리간드 결합 부위의 도입을 모두 포함한다. 특정한 다른 실시형태에서, AAV 캡시드의 천연 결합 부위는 변경되지 않고, 즉 제거되지 않으며, 적어도 하나의 리간드 결합 부위 또는 리간드가 본 개시내용에 따라 도입된다.
일부 실시형태에서 천연 결합 부위는 개선된 아데노 관련 바이러스(AAV) 입자를 생성하기 위한 상기 방법에 의해 제거되며, 천연 결합 부위는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 대한 결합을 가능하게 한다. 이들 중 특정 실시형태에서, 천연 결합 부위는 VP1의 아르기닌 585 및 588 및/또는 VP2 또는 VP3의 유사한 아르기닌 중 적어도 하나를 상이한 아미노산, 예컨대 알라닌으로 대체함으로써 제거된다.
일부 실시형태에서 본 발명에 따라 도입된 리간드 결합 부위는 리간드의 공유 부착을 가능하게 하는 것이다. 이들 중 특정 실시형태에서 리간드 결합 부위는 보다 바람직하게는 상기 캡시드를 벤질구아닌 N-하이드록시숙신이미드(BG-NHS) 및/또는 벤질시토신 N-하이드록시숙신이미드(BC-NHS)와 반응시킴으로써 이용가능한 라이신 잔기에 부착된 벤질구아닌기로부터 선택된다.
본 발명은 바람직하게는 SNAP-태그, CLIP-태그, Halo-태그, Lumio-태그 등과 같은 그들의 특정 리간드에 고친화도로 결합할 수 있는 태그를 이용한다. 상기 방법에서 도입된 태그 분자는 추가 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 생체분자일 수 있다. 예는 SNAP-태그, CLIP-태그, Lumio-Tag 또는 Halo-Tag를 포함할 수 있다. 예를 들어, 친화성 태그는 알킬구아닌-DNA 알킬트랜스퍼라제의 돌연변이인 SNAP-태그일 수 있다. 중요한 것은 SNAP 태그의 기질 중 하나가 벤질구아닌이라는 것이다. 본 발명에 유용한 시판 제품은 예를 들어 Promega의 HaloTag, Life Technologies의 Lumio 태그 및 NEB의 SNAP/CLIP 태그를 포함한다. 도입된 상기 리간드 결합 부위는 바람직하게는 상기 이용가능한 라이신 잔기의 엡실론-아미노기 또는 1차 아민에 부착된다.
따라서, 개선된 아데노 관련 바이러스(AAV) 입자를 생산하기 위한 상기 방법이 추가로 바람직하며, 상기 방법은 리간드를 상기 벤질구아닌 및/또는 상기 벤질시토신기, 특히 HaloTagTM, SNAP-tagTM 또는 CLIP-tagTM에 부착시키는 단계를 추가로 포함한다.
부착될 상기 리간드는 상기 임의의 종류의 리간드일 수 있지만, 바람직하게는 단백질 리간드, 예컨대 성장 인자 또는 사이토카인; 독소 서브유닛, 예컨대 콜레라 독소 B 서브유닛; 렉틴, 예컨대 이소렉틴 B4 또는 밀 배아 응집소; 부착 인자, 예컨대 락타데린; 항체, 예컨대 항 CD-34 항체; 펩티드, 예컨대 델토르핀 오피오이드 수용체 리간드; 및 유전자 편집 뉴클레아제, 예컨대 Cas9로부터 선택된다.
e. 제형
본 발명의 또 다른 실시형태는 질환 치료에 사용하기 위한 전술한 표면 변형된 바이러스 캡시드에 관한 것이며, 상기 AAV는 액체, 건조 또는 반고체 형태, 예를 들어 정제, 코팅 정제, 발포성 정제, 캡슐, 분말, 과립, 당의정, 로젠지, 알약, 앰플, 드롭, 좌약, 유제, 연고, 젤, 팅크, 페이스트, 크림, 습포, 양치액, 식물 주스, 비강제, 흡입 혼합물, 에어로졸, 구강 세척제, 마우스 스프레이, 코 스프레이 또는 룸 스프레이의 형태로 대상체에게 투여된다.
특정 실시형태에서, 재조합 비리온을 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 재조합 비리온은 재조합 핵산 카고가 함유된 본원에 제공된 바와 같은 표면 변형된 바이러스 캡시드를 포함하고, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 가용화제, 충전제, 방부제 및/또는 부형제를 추가로 포함한다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 가용화제, 충전제, 방부제 및/또는 부형제는 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000]에서 확인할 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제와 함께, 즉 약학적으로 허용되는 첨가제, 담체, 희석제, 용매, 필터, 윤활제, 부형제, 결합제 또는 안정제와 함께 본 발명에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 조성물은 스프레이, 코팅제, 폼, 로션, 겔, 구강 세척제, 경구 제형 또는 주사제의 형태로 대상체에게 투여된다. 상기 조성물은 상기 대상체에게 전신적으로, 경구적으로 또는 임의의 다른 임상적으로/의학적으로 허용되는 방법에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 하기를 포함하는 키트에 관한 것이다: a) 본 개시내용에 따라 개시되고/되거나 사용하기 위한 표면 변형된 바이러스 캡시드, 또는 본 개시내용에 따라 개시된 표면 변형된 바이러스 캡시드를 포함하는 약학 조성물, b) 상기 표면 변형된 바이러스 캡시드 또는 상기 약학 조성물을 상기 표적에 적용하기 위한 서면 지침; 및 선택적으로, 사용을 위한 표면 변형된 바이러스 캡시드 또는 조성물 및 서면 지침을 담는 용기.
본 발명의 또 다른 양태는 치료를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 예방, 치료 및/또는 억제하기 위한 상기 기술된 키트의 용도에 관한 것이다.
f. 질환 치료 방법
본 개시내용은 또한 단일유전자 또는 다유전자 유전 질환을 포함하는 질환의 발병 및/또는 진행의 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함하며, 본 개시내용에 의해 제공되는 바와 같은 AAV 입자의 치료적 유효량이 환자에게 투여된다. 이러한 맥락에서, 치료학적 유효량은 증상의 해결에 의해 유전 질환과 같은 질환을 치료하기에 충분한 AAV 입자의 양을 설명한다. 치료학적 유효량은 또한 유전 질환과 같은 질환의 증상이 발생하는 것을 예방하기에 충분한 양일 수 있다. 질환에 대한 위험이 있는 것은 예를 들어 질환에 소인이 되는 유전적 및/또는 표현형 증상으로부터 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 질환에 대한 위험이 있는 환자는 유전 질환과 관련된 유전자를 보유하거나 결핍된 것으로 결정되었다.
본 개시내용의 추가 양태는 본 개시내용에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 유전자 요법에 의해 치료될 수 있는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 표면 변형된 바이러스 캡시드로 처리될 세포 및/또는 대상체는 바람직하게는 인간 기원과 같은 포유류 기원이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 세포로의 진입 메카니즘의 유사성에 따라 수의학, 세포 배양 절차, 또는 심지어 식물 세포 질환에서도 유리하게 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료될 상기 세포는 포유류 세포, 원핵 세포 또는 식물 세포이다. 특정 실시형태에서, 치료될 상기 세포는 인간 세포이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 개시내용에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 전술한 질환 치료 방법에 관한 것이며, 상기 표면 변형된 바이러스 캡시드는 액체, 건조 또는 반고체 형태, 예를 들어 정제, 코팅 정제, 발포성 정제, 캡슐, 분말, 과립, 당의정, 로젠지, 알약, 앰플, 드롭, 좌약, 유제, 연고, 젤, 팅크, 페이스트, 크림, 습포, 양치액, 식물 주스, 비강제, 흡입 혼합물, 에어로졸, 구강 세척제, 마우스 스프레이, 코 스프레이 또는 룸 스프레이의 형태로 대상체에게 투여된다.
표면 변형된 바이러스 캡시드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질환 치료 방법에 의해 치료되는 질병. 특정 실시형태에서, 질환은 하기로부터 선택된다: 암, 유전성 단일 유전자 질환, 예컨대 유전성 망막 질환, 유전성 피부 질환, 예컨대 옴스테드 증후군 또는 가족성 원발성 국소 피부 아밀로이드증, 전염병, 부신백질이영양증, 알파-1 항트립신 결핍증, 방향족 L-아미노산 결핍증, 바텐병, 베커 근이영양증, 베타 지중해빈혈, 카나반병, 만성 육아종증, 크리글러-나자르 증후군, 낭포성 섬유증, 뒤시엔느 근이영양증, 파브리병, 가족성 선종성 용종증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 결핍증, 판코니 빈혈, 갈락토시알리드증, 고셔병, 회전위축, 혈우병 A, 혈우병 B, 헐러 증후군(점액다당류증 I형), 헌터 증후군(점액다당류증 II형), 헌팅턴 무도병, 접합부 수포성 표피 박리증, 후기 영아 신경 세로이드 리포푸스증, 백혈구 유착 결핍증, 사지 거들 근이영양증, 지단백 리파아제 결핍증, 이색성 백질이영양증, 슬라이 증후군(뮤코다당증 VII형), 네더톤 증후군, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍증, 폼페병, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 결핍증, 열성 이영양성 수포성 표피박리증, 산필리포 A(점액다당류증 유형 IIIA), 산필리포 B(점액다당류증 IIIB형), 낫적혈구병, 중증 복합 면역결핍, 척수성 근위축증, 테이삭스병, 비스코트-알드리치 증후군, 폰 기르케병(글리코겐 축적병 Ia형), X-연관 근세관 근병증, 말기 신질환의 빈혈, 협심증(안정성, 불안정성, 불응성), 관상동맥 협착증, 중증 하지 허혈, 심부전, 간헐적 파행, 심근 허혈, 말초 혈관 질환, 폐고혈압, 정맥 궤양, 아데노바이러스 감염, 사이토메갈로바이러스 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염, B형 간염 감염, C형 간염 감염, HIV/AIDS, 인플루엔자, 일본 뇌염, 말라리아, 소아 호흡기 질환, 호흡기 세포융합 바이러스, 파상풍, 결핵, 부인암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 외음부암, 신경계암, 교모세포종, 연수막 암종증, 신경아교종, 성상세포종, 신경모세포종, 망막모세포종, 위장관암, 대장암, 결장직장암, 간전이, 간염후 간암, 췌장암, 담낭암, 간세포암종, 비뇨생식기암, 전립선암, 신장암, 방광암, 항문생식기종양, 피부암, 흑색종(악성/전이성), 두경부암, 비인두암, 편평세포암종, 식도암, 폐암, 선암종, 소세포/비소세포암, 중피종, 혈액암, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 육종, 생식세포암, Li-Fraumeni 증후군, 갑상선암, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 수근관 증후군, 만성 외상성 뇌손상, 팔주방 증후군, 당뇨병성 신경병증, 간질, 거대 축삭 신경병증, 후기 영아 신경 세로이드 리포푸스증증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 통증, 파킨슨병, 말초신경병증, 제2형 척수성 근위축증, 색맹, 연령 관련 황반 변성, 맥락막 혈증, 당뇨병성 황반 부종, 녹내장, 레베르 선천 흑암증, 황반 모세혈관 확장 2형, 색소성 망막염, 표면 각막 혼탁, X연관 망막분리증, 관절염(류마티스, 염증, 퇴행성), 퇴행성관절질환, 직장의 중증염증성질환, 궤양성대장염, 만성신질환, 당뇨병성궤양, 족부궤양, 배뇨근과활동성, 발기부전, 골절, 난청, 유전성 봉입체 근병증, 이식편대숙주병/이식 환자, 구강 점막염, 이하선 타액 기능저하, 전신성 경피증, I형 당뇨병 및 상처 치유 또는 이들의 조합.
또한, 본 개시내용에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 표면 변형된 바이러스 캡시드는 예를 들어 약학적으로 허용되는 첨가제, 담체, 희석제, 용매, 필터, 윤활제, 부형제, 결합제 또는 안정제와 함께 약학 조성물의 형태로 대상체 또는 세포에 투여된다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 스프레이, 코팅제, 폼, 로션, 겔, 구강 세척제, 경구 제형 또는 주사제의 형태로 대상체에게 투여된다. 상기 조성물은 상기 대상체에게 전신적으로, 경구적으로 또는 임의의 다른 임상적으로/의학적으로 허용되는 방법에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 예를 들어 연구에서 유전자 전달 도구로서 세포의 형질감염에 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드에 관한 것이다. 상기 용도는 또한 미용 목적을 위한 것일 수 있으며, 본 발명은 본원에 개시된 의학적 치료와 유사한 미용 치료 방법을 포함한다. 이를 위해, 본 개시내용에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드를 대상체 또는 세포에 투여하는 것도 화장료 조성물의 형태로 이루어질 수 있으며, 예를 들어 미용적으로 안전하고 허용 가능한 첨가제, 담체, 희석제, 용제, 필터, 윤활제, 부형제, 결합제 또는 안정제와 함께 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 스프레이, 코팅제, 폼, 로션, 겔, 구강 세척제, 경구 제형 또는 주사제의 형태로 대상체에게 투여된다. 상기 조성물은 상기 대상체에게 전신적으로, 경구적으로 또는 임의의 다른 임상적으로/미용적으로 허용되는 방법에 의해 투여될 수 있다.
당업자는 WO 93/09239, US4797368, US 5139941 및 EP 488 528에 기술된 것과 같이 시험관 내 및 생체 내에서 유전자를 전달하기 위해 AAV로부터 유래된 벡터를 사용하는 방법을 알고 있다.
본 발명의 추가 양태는 하기를 포함하는 키트에 관한 것이다: a) 세포 형질감염을 위한 표면 변형된 바이러스 캡시드, b) 세포 형질감염을 위한 표면 변형된 바이러스 캡시드를 사용하기 위한 서면 지침; 및 선택적으로, 표면 변형된 바이러스 캡시드 및 서면 지침을 담는 용기.
a. 적응증
본 발명의 또 다른 양태는 질환 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드를 포함하는 재조합 비리온, 및 본원에 기재된 표면 변형된 캡시드를 포함하는 재조합 비리온의 유효량을 투여함으로써 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 조성물은 유전자 요법을 포함하는 치료에 사용하기 위한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 유전자 요법용 약제의 제조를 위한 표면 변형된 바이러스 캡시드 조성물의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 표면 변형된 바이러스 캡시드 조성물의 투여를 포함하는 유전자 요법을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 표면 변형된 바이러스 캡시드에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 질환의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 표면 개질된 바이러스 캡시드에 의해 치료 또는 예방될 질병은 유전자 요법에 의해 치료될 수 있는 다음과 같은 질환을 포함한다: 암, 유전성 단일 유전자 질환, 예컨대 유전성 망막 질환, 유전성 피부 질환, 예컨대 옴스테드 증후군 또는 가족성 원발성 국소 피부 아밀로이드증, 전염병, 운동실조, 부신백질이영양증, 알파-1 항트립신 결핍증, 방향족 L-아미노산 결핍증, 바텐병, 베커 근이영양증, 베타 지중해빈혈, 카나반병, 만성 육아종증, 크리글러-나자르 증후군, 낭포성 섬유증, 뒤시엔느 근이영양증, 파브리병, 가족성 선종성 용종증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 결핍증, 판코니 빈혈, 갈락토시알리드증, 고셔병, 회전위축, 혈우병 A, 혈우병 B, 헐러 증후군(점액다당류증 I형), 헌터 증후군(점액다당류증 II형), 헌팅턴 무도병, 접합부 수포성 표피 박리증, 후기 영아 신경 세로이드 리포푸스증, 백혈구 유착 결핍증, 사지 거들 근이영양증, 지단백 리파아제 결핍증, 이색성 백질이영양증, 슬라이 증후군(뮤코다당증 VII형), 네더톤 증후군, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍증, 폼페병, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 결핍증, 열성 이영양성 수포성 표피박리증, 산필리포 A(점액다당류증 유형 IIIA), 산필리포 B(점액다당류증 IIIB형), 낫적혈구병, 중증 복합 면역결핍, 척수성 근위축증, 테이삭스병, 비스코트-알드리치 증후군, 폰 기르케병(글리코겐 축적병 Ia형), X-연관 근세관 근병증, 말기 신질환의 빈혈, 협심증(안정성, 불안정성, 불응성), 관상동맥 협착증, 중증 하지 허혈, 심부전, 간헐적 파행, 심근 허혈, 말초 혈관 질환, 폐고혈압, 정맥 궤양, 아데노바이러스 감염, 사이토메갈로바이러스 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염, B형 간염 감염, C형 간염 감염, HIV/AIDS, 인플루엔자, 일본 뇌염, 말라리아, 소아 호흡기 질환, 호흡기 세포융합 바이러스, 파상풍, 결핵, 부인암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 외음부암, 신경계암, 교모세포종, 연수막 암종증, 신경아교종, 성상세포종, 신경모세포종, 망막모세포종, 위장관암, 대장암, 결장직장암, 간전이, 간염후 간암, 췌장암, 담낭암, 간세포암종, 비뇨생식기암, 전립선암, 신장암, 방광암, 항문생식기종양, 피부암, 흑색종(악성/전이성), 두경부암, 비인두암, 편평세포암종, 식도암, 폐암, 선암종, 소세포/비소세포암, 중피종, 혈액암, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 육종, 생식세포암, Li-Fraumeni 증후군, 갑상선암, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 수근관 증후군, 만성 외상성 뇌손상, 팔주방 증후군, 당뇨병성 신경병증, 간질, 거대 축삭 신경병증, 후기 영아 신경 세로이드 리포푸스증증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 통증, 파킨슨병, 말초신경병증, 제2형 척수성 근위축증, 색맹, 연령 관련 황반 변성, 맥락막 혈증, 당뇨병성 황반 부종, 녹내장, 레베르 선천 흑암증, 황반 모세혈관 확장 2형, 색소성 망막염, 표면 각막 혼탁, X연관 망막분리증, 관절염(류마티스, 염증, 퇴행성), 퇴행성관절질환, 직장의 중증염증성질환, 궤양성대장염, 만성신질환, 당뇨병성궤양/족부궤양, 배뇨근과활동성, 발기부전, 골절, 난청, 유전성 봉입체 근병증, 이식편대숙주병/이식 환자, 구강 점막염, 이하선 타액 기능저하, 전신성 경피증, I형 당뇨병 및/또는 상처 치유.
특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 치료되는 운동실조는 소뇌 또는 척추의 퇴행으로 이루어진 유전성 장애와 관련된 운동실조이고, 심지어 중복 소뇌 및 감각 운동실조로 나타날 수 있다. 운동실조를 유발하는 유전 장애에는 다음이 포함된다: 척수소뇌성 운동실조증, 우발성 운동실조증, 치성두팔돌체위축증과 같은 상염색체 우성 질환뿐만 아니라 프리드라이히 운동실조증(감각 및 소뇌, 전자가 우세함) 및 니만 픽병, 모세혈관확장성 운동실조증(감각 및 소뇌, 후자 우세) 및 무베타지방단백혈증. X-연관 운동실조 상태의 예는 희귀한 취약한 X-연관 떨림/운동실조 증후군 또는 FXTAS이다.
특정 실시형태에서, 치료할 적응증은 지단백질 리파아제 결핍증, 큰 B 세포 림프종, 베타 지중해 빈혈, 맨틀 세포 림프종, 혈관 내피 성장 인자 말초 동맥 질환, 두경부 편평 세포 암종, 척수 근육 위축, 아데노신 데아미나제 결핍증(ADA-SCID), 재발성 피부 병변이 있는 환자의 흑색종, B 세포 림프구성 백혈병 또는 레버 선천성 흑암시이다.
특정 실시형태에서, 치료할 적응증은 다음을 포함한다: 샤르코마리투드병(모든 유형), 강글리오시드증(모든 유형), 유전성 간질(예를 들어, 드라베), 결절성 경화증 복합, 척수 손상, 모든 탈수초성 유전 운동 및 감각 신경병증(HMSN), 크라베병, 진행성 골화성 섬유이형성증, 신경섬유종증 1 및 2, 본태성 떨림, 취약 X 증후군, 레슈니한 증후군, 근긴장성 이영양증, 다계통 위축(MSA), 젤위거 증후군, 시신경척수염 또는 데빅병, 중추 뇌교 수초 용해증, 척수매독(매독성 척수병증)과 같은 골수병증, 진행성 다초점 백질뇌병증, 백질이영양증, 길랑-바레 증후군 및 만성 대응물인 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증과 같은 백질뇌병증.
특정 실시형태에서, 치료할 적응증은 항-MAG 말초 신경병증, 또는 구리 결핍 관련 병태(말초 신경병증, 척수병증 및 드물게 시신경병증), 또는 진행성 염증성 신경병증이다.
b. 투여 방식
본 발명의 또 다른 양태는 질환 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드의 투여 방식에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드는 당업계에 알려진 적합한 수단을 사용하여 직접적으로 또는 간접적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법 및 용도는 본 발명 조성물에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드를 전신적으로, 국소적으로 또는 국부적으로, 또는 임의의 경로, 예를 들어 주사, 주입, 경구로(예를 들어, 섭취 또는 흡입) 또는 국소적으로(예를 들어, 경피적으로) 전달 및 투여하는 것을 포함한다. 예시적인 투여 및 전달 경로는 다음을 포함한다: 정맥내(i.v.), 관절내, 복강내(i.p.), 동맥내, 근육내, 비경구, 피하, 흉막내, 국소, 진피, 피내, 경피, 비경구, 예를 들어, 경점막, 두개내, 척수내, 구강(소화), 점막, 호흡, 비강내, 삽관, 폐내, 폐내 점적, 협측, 설하, 혈관내, 척수강내, 강내, 이온영동, 안구내, 눈, 시각, 선내, 기관내, 림프관내, 척수강내, 대수조내. 본 발명의 조성물에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드를 개인 또는 상기 개인의 세포, 조직, 기관에 제공하는 수단의 개선은 지금까지 이미 달성된 진전을 고려할 때 예상된다. 이러한 미래의 개선은 물론 본 발명의 언급된 효과를 달성하기 위해 통합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드를 투여하는 단계에서, 캡시드 조성물은 전달 방법에 적합한 용액에 용해된다. 특정 실시형태에서 정맥내, 피하, 근육내, 척수강내, 관절내 및/또는 심실내 투여용 제형은 생리학적 염 용액으로 제제화된 캡시드 조성물이다.
g. 실시예
실험 관찰 요약
재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 기본 연구와 임상 사용 모두에서 선택한 생체 내 유전자 전달 벡터로 부상했다. 재조합 AAV 벡터는 숙주 게놈에서 부위 특이적 통합을 거치지 않으며, 이는 적절한 면역원성과 함께 유전자 치료를 위한 가장 안전한 전략 중 하나가 된다(문헌[Naso MF, Tomkowicz B, Perry WL, 3rd, Strohl WR. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs 2017;31:317-34]). 생체 내 사용을 위한 다른 바이러스 벡터에 비해 명확한 이점에도 불구하고 AAV에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있다. 예를 들어, 이들은 일부 세포 유형을 변환하는 데 비효율적이고, 결과적으로 효율적인 유전자 전달을 위해 종종 높은 역가가 필요하다. 이는 부적절한 세포 유형의 형질도입을 통해 비표적 효과를 유발하고 생산 비용을 크게 증가시키며 독성을 유발한다.
AAV 매개 유전자 전달을 개선하기 위한 노력은 초기에 상이한 세포 유형에 대해 뚜렷한 향성을 나타내는 야생형 혈청형을 이용하는 데 집중되었다. 혈청형 2의 ITR과 다른 야생형 혈청형의 캡시드가 측면에 있는 이식유전자를 함유하는 유사형 AAV를 생성함으로써 재조합 벡터의 형질도입 특이성을 변형할 수 있다. 보다 최근에는 유도 진화 또는 합리적 설계에서 유래된 캡시드 단백질을 함유하는 합성 AAV 캡시드가 조작되었다(문헌[Colella P, Ronzitti G, Mingozzi F. Emerging Issues in AAV-Mediated In vivo Gene Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev 2018;8:87-104]). 이 접근 방식은 중추 및 말초 신경계를 변환하는 조작된 AAV-PHP.eB 및 AAV-PHP.S 캡시드의 개발로 예시된다(문헌[Chan KY, Jang MJ, Yoo BB, Greenbaum A, Ravi N, Wu WL, et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci 2017;20:1172-9]). 이러한 변이체는 전체 뇌 또는 말초 신경절을 표적으로 하기 위해 마우스에 전신적으로 주입될 수 있다. 그러나, 이러한 접근 방식의 성공에도 불구하고, 캡시드 단백질, VP1, VP2, 및/또는 VP3의 1차 아미노산 서열이 조작된 AAV 벡터는 전신 형질도입에 필요한 높은 역가와 같은 몇 가지 단점과 설치류 모델을 넘어서는 번역 가능성에 대한 의문을 여전히 안고 있다.
이러한 문제에 대한 우리의 해결책의 일 양태는 캡시드화된 카고와 함께 바이러스 캡시드(재조합 AAV 비리온의 일부로서)의 선택 세포로의 표적 전달을 용이하게 하는 단백질 화학 기반 방법을 제공하는 것이었다. 본 개시내용에서 우리는 향성을 개선하고/개선하거나 형질도입 효율을 향상시키기 위해 생체직교 화학을 통해 AAV 캡시드에 대한 리간드의 가교결합을 제공한다. 특정 실시형태에서, 표면 변형된 바이러스 캡시드의 리간드는 포유류 세포 표면의 동족 수용체에 결합하여 적절한 동족 수용체를 나타내는 세포 유형으로 선택적으로 유전자 전달을 매개하여 표적 바이러스 유전자 전달을 가능하게 한다.
아래에 설명된 특정 실험에서, 캡시드에서 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 결합 모티프의 돌연변이를 통해 비감염성 AAV 혈청형 2 바이러스를 생성한 다음(문헌[Kern A, Schmidt K, Leder C, Muller OJ, Wobus CE, Bettinger K, et al. Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids. Journal of Virology 2003;77:11072-81]) (R585/588A, AAV2-ㆍHSPG로 지칭), 화학적으로 변형된 표면은 조립된 ㆍHSPG-AAV2 캡시드 상의 라이신 잔기를 가교제 반응성 쌍의 구성원을 포함하는 반응성 링커, 예를 들어 벤질구아닌(BG) 및 사이클로옥틴(DBCO)과 함께 노출시켰다. 그런 다음 SNAP 태그 융합 또는 아지드 작용기가 있는 작용화된 리간드를 바이러스에 가교 연결하고 수용체 의존 방식으로 바이러스 감염성을 복원할 수 있었다.
우리는 처음에 뉴로트로핀 및 사이토카인(IL31)과 같은 단백질 리간드를 사용하여 시스템을 시험했는데, 이러한 분자에 대한 수용체가 피부 및 말초 신경계의 세포 하위 집합에서 발현되기 때문이다. 그런 다음, 리간드 표적화를 개선하는지 여부를 이해하기 위해 동일한 수용체에 대해 단일 사슬 항체(scFv)와 같은 단백질 리간드를 비교했다. 또한 예를 들어 CTB의 경우 역행 수송 또는 렉틴의 경우 세포 표면 탄수화물에 대한 향상된 결합과 같이 리간드가 보유한 것과 동일한 작용기를 AAV로 코딩하는 것을 목표로 콜레라 독소 B(CTB) 및 다양한 렉틴과 같은 리간드의 다른 부류를 탐구했다.
동시에, 우리는 또한 BG-SNAP 태그 접합 및 더 긴 스페이서를 링커에 혼입하는 효과 외에 다른 생체직교 화학을 평가했다. 디벤조시클로옥틴(DBCO)과 아지도기 사이의 변형-촉진 아지드-알킨 클릭 화학(SPAAC) 반응이 놀랍게도 효율성을 더욱 향상시킨다는 것을 발견했다. 이를 통해 SNAP 융합 단백질을 생성할 필요 없이 AAV를 상업적으로 이용 가능한 펩티드 및 단백질 리간드에 쉽게 접합할 수 있다.
요약하면, 우리의 데이터는 우리의 화학적 변형 접근법이 서열-변형된 AAV 캡시드에 비해 많은 장점을 가지고 있음을 나타낸다. 집중적인 연구 노력에도 불구하고 인간 조직 특이적 변이체가 아직 정의되지 않은 서열 수정된 캡시드와 달리, 우리의 접근 방식은 향성을 유도하기 위해 알려진 수많은 인간 세포 수용체-리간드 상호 작용을 활용한다. 조직 향성이 경험적으로 결정되어야 하는 서열 변형된 캡시드와 달리, AAV 캡시드의 천연 세포 결합 부위를 제거할 때 우리의 접근 방식은 부착된 리간드의 수용체 특이성에 의해 구동되는 세포 표적화의 높은 특이성을 제공한다. 그리고 천연 캡시드 세포 결합 부위를 제거하거나 변경하지 않고 형질도입을 증가시키는 리간드가 부착되면 알려진 향성을 크게 변경하지 않고도 더 큰 형질도입 효율을 수득할 수 있다.
또한, 우리의 접근 방식은 모든 AAV 생산 플랫폼과 호환되며 바이러스 수율에 영향을 미치지 않는다. 본원에 제공된 방법은 또한 수행하기에 저렴하고 소규모 연구 적용에서 임상 규모 생산으로 확장 가능하다. 마지막으로, AAV 캡시드의 표면을 변형하기 위해 제공된 플랫폼은 모듈식이므로 본질적으로 모든 바이러스/리간드 조합을 허용하며 이는 설치류 모델에서 인간 환자로의 번역을 용이하게 해야 한다.
하기 표 1은 하기 실시예 1 내지 8에 상세히 추가로 기재된 일부 리간드-AAV 실험을 요약한다.
Figure pct00043
후속 실험에서 우리는 리간드를 작용화하기 위해 SNAP 태그 융합을 추가할 필요가 없는 다른 가교제-반응성 쌍을 사용했다.
실시예 1 AAV2에서 천연 결합 부위의 제거
초기 실험의 한 가지 목표는 바이러스가 관심 있는 세포를 선택적으로 형질도입하도록 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드를 조작하는 것이었다. 이는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이에 의해 천연 AAV 캡시드 단백질(들)에서 세포에 대한 천연 결합 부위를 제거함으로써 달성되었다. 캡시드는 작용화된 리간드와 접합하기 위해 화학적으로 작용화되었다. 생체직교적으로 작용화된 리간드는 바이러스에 공유적으로 결합되어 세포에 대한 시험관 내 및 마우스의 생체 내에서 시험되었다. AAV2, AAV9 및 PHP.S가 탐색되었지만 이러한 예는 다른 바이러스 캡시드에도 쉽게 적용될 수 있다.
AAV2는 아르기닌 585 및 588을 통해 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 결합한다. 이러한 위치는 알라닌으로 돌연변이되어 CAP 유전자 R585A+R588A에 돌연변이가 있는 결실 ㆍHSPG를 만든다.
플라스미드 pTAV2-0은 pBluescript II의 BamHI 부위에 클로닝된 두 역 말단 반복부를 포함하여 pAV-2의 전체 AAV-2 게놈을 포함한다. AAV-2의 적합한 단편을 함유하는 하위 플라스미드를 생성하여 부위 지정 돌연변이 유발 반응을 위한 주형으로 사용했다. 돌연변이 유발은 제조업체의 프로토콜에 따라 Stratagene(Amsterdam, The Netherlands) QuikChange 사이트 지정 돌연변이 유발 키트를 사용하여 수행되었다. 각각의 돌연변이에 대해, 2개의 상보적인 PCR 프라이머는 돌연변이의 각 면에 15 내지 20개의 상동 염기쌍이 측면에 있는 치환 서열을 포함하도록 설계되었다. 돌연변이 플라스미드는 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 그런 다음 적합한 돌연변이를 함유하는 단편을 나머지 단백질을 함유하는 플라스미드 백본(예를 들어, pTAV2-0)으로 서브클로닝하고 완전한 단편을 시퀀싱하여 추가 PCR 돌연변이를 확인했다.
CAP 유전자 R585A+R588A에 돌연변이가 있고(문헌[Kern A, Schmidt K, et al. Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids. Journal of virology 2003;77:11072-81]) 카고로서 CAG 프로모터 하에 tdTomato를 운반하는 재조합 AAV2-ㆍHSPG는 이전에 기술된 바와 같이 HEK293 세포 또는 SF21 곤충 세포에서 생산되었다(문헌[Grieger JC, et al. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc 2006;1:1412-28; Wu Y, et al. A Recombinant Baculovirus Efficiently Generates Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Cultured Insect Cells and Larvae. Mol Ther Methods Clin Dev 2018;10:38-47]). 감염 5일 후 세포를 수확하고, 0.5%에서 Triton X-100으로 용해하고, 뉴클레아제 처리하고, 접선 흐름 여과로 농축하고, 등밀도 초원심분리를 사용하여 정제했다(문헌[Dias Florencio G, et al. Simple downstream process based on detergent treatment improves yield and in vivo transduction efficacy of adeno-associated virus vectors. Mol Ther Methods Clin Dev 2015;2:15024]). 벡터 게놈 적정은 바이러스 카고의 프로모터 영역을 표적으로 하는 프라이머와 함께 Q-PCR을 사용하여 수행되었다(Grieger 2006).
실시예 2. SNAP 태그 리간드를 수용하기 위한 ㆍHSPG의 BG-NHS 작용화
단백질에 대한 리간드의 선택적 부착, 예를 들어 단백질 라벨링은 종종 생체직교 기를 단백질에 혼입한 후 화학선택적 변형에 의해 달성된다. 이 접근 방식은 "태그 및 수정"이라고도 한다. 다양한 생물학적 직교 반응이 개발되었으며 다음과 같이 분류될 수 있다: (1) 카르보닐을 통한 축합 반응, (2) 아지드를 통한 "클릭" 반응, (3) 역 전자 요구 디엘스-알더 시클로첨가(DAINV) 및 기타 시클로첨가 반응, (4) 전이 금속 촉매된 커플링 및 분해 반응, 및 (5) 위에서 논의된 시스테인 잔기에서의 라벨링 반응.
첫 번째 실험 세트에서, 바이러스를 벤질구아닌 NHS 에스테르(SNAP 태그 기질, BG-NHS 또는 BG-GLA-NHS라고도 함)와 반응시켜 벤질구아닌(BG)을 노출된 라이신에 부착했다. 이를 위해, 바늘을 사용하여 비수성 DMSO를 건조 SNAP 태그 리간드 BG-NHS와 함께 실온에서 원하는 최종 농도(예를 들어, 20 mM)로 바이알에 첨가했다. 아민 작용화될 단백질을 용매(PBS)에서 원하는 최종 농도로 희석하였다. 두 제제를 혼합하고 실온에서 180분 동안 배양한 후 원심분리 100 Kda MWCO 필터 유닛을 사용하여 미반응 성분을 제거하였다.
BG-GLA-NHS:
Figure pct00044
실시예 3. C 말단 SNAP 태그가 있는 재조합 리간드
이 시스템을 사용하는 데는 두 단계가 있다: SNAP-태그® 융합체로서 관심 단백질의 클로닝 및 발현, 선택한 SNAP-태그 기질로 융합체의 라벨링. SNAP-태그는 DNA 복구 단백질인 인간 O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라제(hAGT)를 기반으로 하는 작은 단백질이다. 이 경우 SNAP 태그 기질은 벤질 링커에 연결된 구아닌 이탈기이다. 라벨링 반응에서 기질의 치환된 벤질 기는 SNAP-태그에 공유적으로 부착된다.
SNAP-태그 단백질 라벨링 시스템은 거의 모든 분자를 관심 있는 단백질에 특이적으로 공유 부착할 수 있게 한다(현재 실험에 대해서는 아래 실시예 4 참조).
C 말단 SNAP 태그가 있는 재조합 리간드는 E. Coli 또는 포유류 세포에서 생성되었다. 공유 부착을 위해, 포화 농도의 SNAP 태그 리간드를 첨가하고 실온에서 밤새 배양함으로써 SNAP-태그 리간드를 BG-변형 바이러스에 부착시켰다(도 1 참조). 과량의 미반응 리간드는 반응물을 원심분리 100 Kda MWCO 필터 유닛에 통과시켜 제거하였다.
본 발명의 경우, 실험은 관심 있는 유전자를 클로닝하기 위한 제한 부위 옆에 있는 SNAP-tag®를 코딩하는 포유류 발현 플라스미드(pSNAPf)를 함유하는 SNAP-Cell® 스타터 키트(NEB)의 지침에 따라 수행되었다(본 발명을 위한 수정 있음).
실시예 4. 표적화 및 부스팅 형질도입 - C 말단 SNAP 태그가 있는 재조합 리간드가 있는 BG-GLA-NHS 변형 ㆍHSPG AAV 캡시드의 시험관 내 및 생체 내 시험
상기 캡시드 표면 변형 전략은 리간드가 향성을 변경할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 여러 부류의 리간드, 즉 성장 인자, 사이토카인 등; 콜레라 독소 B 서브유닛과 같은 독소 서브유닛; 이소렉틴 B4 또는 밀 배아 응집소와 같은 렉틴; 락타데린과 같은 접착 인자; 항 CD-34(줄기 세포의 마커)와 같은 항체; 및 델토르핀 오피오이드 수용체 리간드와 같은 펩티드로 시험되었다.
실시예 4a. ㆍHSPG 캡시드는 감염되지 않으며, 표면 변형된 바이러스 캡시드는 형질도입 효율을 되돌림.
본 발명에 따른 ㆍHSPG 바이러스 입자는 형광 리포터 마우스 모델(도 2)에서 감각 뉴런에 대해 시험된 바와 같이 잔류 감염 활성이 없다는 것이 처음으로 나타났다. 밀 배아 응집소(WGA, 렉틴, 즉 WGA-SNAP) 융합(BG/SNAP 링커 화학을 통해 WGA로 변형된 바이러스 캡시드 표면)은 동일한 형광 리포터 마우스 모델(도 3)의 감각 뉴런에서 시험했을 때 바이러스 전달 효율을 100% 이상으로 향상시켰다.
그런 다음, 여러 리간드를 시험했으며, 신경영양 인자 NGF, NT3 및 BDNF(단백질 리간드)는 바이러스를 다른 특정 뉴런 집단에 전달했으며, 즉, 이들은 형광 리포터 마우스 모델에서 시험된 캡시드 작제물에 사용된 인자에 따라 다른 향성을 부여했다(도 4a 내지 도 4c). 콜레라 독소 B 서브유닛(독소)은 특히 신경 세포체(즉, 세포 구획/부분 특이적)에 역행적으로 바이러스를 지시한다(도 5). 유사한 시험에서 락타데린(접착 인자)은 포스파티딜세린을 노출시키는 대식세포와 뉴런에 바이러스를 특이적으로 지시했고, 델토르핀(펩티드)은 뮤 및 델타 오피오이드 수용체를 발현하는 뉴런에 특이적으로 바이러스를 지시했다.
도 6a 내지 도 6b에 도시된 실험에서, NGF 리간드 IV로 변형된 캡시드 표면을 삼차신경절에 주입한 후, 감각 신경 조직을 채취하여 3주 후에 분석하였다. 절단된 조직은 TrkA(NGF 수용체)에 대한 항체로 염색되었고 매우 훌륭한 중첩이 발견되었다. TrkA 항체 염색은 완벽하지 않으므로 80% 중첩이 매우 적합하다.
도 7에 도시된 실험에서, 도 6a 내지 도 6c의 섹션은 NF200 및 IB4에 대한 항체로 염색되었으며, 이는 다른 뉴런(각각 기계적 수용체 및 비펩티드성 통각수용체)을 라벨링한다. 다시 말하지만, 이러한 마커는 완벽하지 않지만 녹색 및 청색 세포가 적색 감염 세포와 다르다는 것을 알 수 있다.
음성 대조군으로서, IL31 리간드를 IL31 수용체 녹아웃 마우스에 바이러스로 도입하는 것은 감염을 일으키지 않는다.
요약하자면, 모든 리간드-표지된 바이러스는 시험관 내에서 배양된 세포에 적용될 때 및 마우스에 생체 내 주사될 때(즉, 전신적으로 또는 국소적으로 주사될 수 있고 선택적으로 상이한 세포 집단을 표적으로 할 수 있음) 각각의 수용체를 발현하는 세포만을 성공적으로 그리고 특이적으로 형질도입했다.
실시예 4b. TrkA+ 통각수용체 표적화
본 실시예에서, 말초 신경계의 TrkA+ 통각수용체는 캡시드 표면 변형 작제물로 표적화되었다. TrkA에 결합하지만 활성화하지는 않는 NGFR121W 리간드는 tdTomato 카고를 사용하여 ㆍHSPG-AAV2(위에서 설명한 대로 준비된 캡시드)에 가교되었다. 작제물을 마우스에 피하, 신경내, 안와후 및 복강내 주사하였다. 3주 후, TrkA 항체를 사용하여 형광을 검출하고 정량하였다.
안와후 적용의 경우 TrkA+ 세포의 80%가 NGF-AAV에 의해 감염된 것으로 밝혀졌다. NGF-AAV 감염 세포의 83%는 TrkA+였다. 또한 투여 경로에 따라 매우 효과적인 결과가 크게 다르지 않은 것으로 나타났다.
실시예 4c. IL31RA+ 가려움 수용체 표적화
이 실시예에서 IL31RA는 IL31RA에 결합하지만 활성화하지는 않는 IL31K134A 표적화 리간드를 포함하도록 표면 변형된 AAV로 표적화되었다. IL31RA는 tdTomato 카고를 사용하여 ㆍHSPG-AAV2(위에 설명된 캡시드)에 가교되었다. 작제물은 야생형 및 IL31RA 녹아웃 마우스에 주사되었다. 3주 후, 리포터 유전자의 형광을 검출하고 케라틴 14 항체를 사용하여 중복 정량화했다. 표적 세포는 기본적으로 K14에 대해 완전히 양성인 것으로 밝혀졌다. IL31RA 녹아웃 마우스에서 중요한 점은 토마토 발현이 검출되지 않았다.
실시예 4d. 이소렉틴 B4를 사용한 표적화
이 실시예에서, 이소렉틴 B4(IB4)는 tdTomato 카고와 함께 상기 기재된 바와 같이 ㆍHSPG-AAV2에 접합되었다. IB4는 맥관구조, 비펩티드성 통각수용체 및/또는 미세아교세포에 대한 마커로 사용될 수 있다. 작제물을 피하, 신경내 또는 척수내 주사하였다. 3주 후, 형광이 검출되었다. 표적 세포는 투여 경로에 관계없이 기본적으로 완전히 양성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 4e. 밀 배아 응집소를 사용한 표적화
이 실시예에서, 밀 배아 응집소(WGA)는 tdTomato 카고와 함께 상기 기재된 바와 같이 ㆍHSPG-AAV2에 접합되었다. WGA는 대부분의 뉴런의 세포막에서 N-아세틸글루코사민에 결합하고 (시냅스 통과) 추적자로 사용된다. 작제물을 마우스에 P1 신생아에서 i.v., 또는 성체 마우스에서 피질내 주사하였다. 3주 후, 리포터 유전자의 형광이 검출되었다.
유전자 전달이 리간드 바이러스로 더 효율적이라는 것이 밝혀졌다(도 8a 내지 도 8b 참조). 배양된 DRG 뉴런을 AAV9 변이체 PHP.S(1E+9 벡터 게놈(VG))로 감염시켰고, 상기 WGA 변형 작제물이 강력한 전달 증가를 야기함을 확인하였다(도 8b 참조).
실시예 5. 뉴로트로핀 리간드를 사용한 표적화
우리는 AAV2-ㆍHSPG에 접합하기 위해 뉴로트로핀 리간드 NGF, BDNF 및 NT3를 선택했는데, 그 수용체가 말초 감각 뉴런의 기능적으로 뚜렷한 집단을 표시하기 때문이다. 우리는 또한 TrkA에 결합하지만 TrkA를 통해 신호를 보내지 않는 돌연변이 NGFR121W를 생성했다. 따라서 NGFR121W는 AAV의 리간드 표적화를 평가하기 위해 선택되었다.
접합 전략으로서, 우리는 먼저 이작용성 링커를 통해 SNAP-태그된 리간드를 부착하기 위해 AAV2 VP2 단백질의 N-말단에서 CLIP-태그를 코딩하려고 시도했다. 이 접근법은 AAV 바이러스 캡시드가 CLIP-태그의 혼입을 지원할 수 없고 대신 캡시드에 VP1 및 VP3 단백질만으로 생산되었기 때문에 성공하지 못했다. 우리는 리간드-Spycatcher 융합에 대한 최종 컨쥬게이션을 위해 Spytag와 같은 더 작은 태그의 삽입을 추가로 탐색했다. 바이러스 캡시드의 위치 588에 Spytag를 삽입하면 Spytag를 함유하는 바이러스 입자가 생성되지만 수율은 10배 이상 감소했다. 이들 실험은 표적화 리간드의 부착을 위해 AAV 캡시드를 유전적으로 조작하는 것과 관련된 어려움을 예시한다.
이 문제를 해결하기 위해, 우리는 AAV 캡시드가 그 표면에 많은 수의 노출된 라이신 잔기를 가지고 있기 때문에(1000개 이상), N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르와 같은 아민 반응성 화학기를 통해 변형이 가능해야 한다고 추정했다. 따라서, 이론적으로, NHS-BG 프로브와의 라벨링 반응을 통해 SNAP 태그 반응성 벤질구아닌(BG) 기로 AAV 캡시드를 장식할 수 있다. 따라서 우리는 AAV2-ㆍHSPG에 대한 BG-GLA-NHS의 몰비 범위로 반응을 설정하고 정제된 산물을 분리된 배근 신경절(DRG) 뉴런에 적용했다. 이 실험에서 우리는 NGFR121W 변형된 AAV2-ㆍHSPG가 실제로 BG-GLA-NHS 대 AAV2-ㆍHSPG의 최적 몰비인 바이러스의 3E+9 VG 대 1.73 nmol 링커에서 DRG 뉴런 집단을 형질도입하는 반면 AAV2-ㆍHSPG 단독은 효과가 없었다는 것을 결정했다(도 9a 내지 도 9f). 우리는 이후 반응을 최적화했으며(아래 방법 참조) 각 AAV 준비에 대한 최적의 비가 경험적으로 결정되면 변형은 광범위한 반응성 링커(예를 들어, NHS 에스테르 유도체, 바이러스 농도 및 순도, 리간드 클래스 포함)와 함께 작동한다는 것을 발견했다.
방법
재조합 AAV2-ㆍHSPG를 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
실시예 5a. NGF R121W -SNAP::AAV2-ㆍHSPG를 사용한 표적화
NGFR121W-SNAP은 이전에 설명한 대로 포유류 세포에서 생산되었다(문헌[Nocchi L, et al. Nerve growth factor-mediated photoablation of nociceptors reduces pain behavior in mice. Pain 2019]). AAV에 접합하기 위해, 정제된 AAV2-ㆍHSPG를 BG-GLA-NHS (NEB) 또는 BG-PEG13-NHS(맞춤형 합성)와 실온에서 3시간 동안 PBS pH 7.2에서 바이러스의 3E+9 VG 대 1.73 nmol 링커의 겉보기 VG 대 NHS 링커 몰비로 반응시켰다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고 실온에서 밤새 5 μM NGFR121W-SNAP와 함께 추가로 배양했다. 과량의 미반응 NGFR121W-SNAP을 100 Kda MWCO 원심분리 장치를 2회 통과시켜 제거하고, 가교된 생성물을 PBS에 재현탁시켰다.
Figure pct00045
BG-GLA-NHS
Figure pct00046
BG-PEG13-NHS
생체 내 주사 및 조직 처리
생체 내 주사 실험을 위해, 마우스를 2 내지 2.5% 이소플루란으로 마취시킨 다음, 피하, 신경내, 복강내 또는 안와후(IV) 경로를 통해 주사하였다. 피하 주사를 위해, 10 ul 중의 NGFR121W-SNAP::AAV2-ㆍHSPG의 3E+10 VG를 발의 발바닥 표면에 주사하였다. 신경주사로는 2 ul 중 3E+9 VG NGFR121W-SNAP::ㆍHSPG-AAV2를 좌골 신경에 주사하였다. 복강내 주사 및 안와후 주사를 위해 NGFR121W-SNAP::ㆍHSPG-AAV2의 8E+10 VG 또는 3E+10 VG를 주사하였다. 3주 후 후근 신경절과 삼차신경절을 수확하여 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 ScaleS에서 제거하여 홀마운트(wholemount) 샘플로 준비했다. 일부 실험에서는 DRG를 10 μm에서 절편화하고 PBS에 5% 혈청 및 0.3% Triton-X를 함유하는 차단 용액과 함께 30분 동안 배양한 다음 차단 용액에서 항-TrkA 항체(R&D systems, 1:200)와 4℃에서 밤새 배양했다. 2차 항체를 차단 용액에 1 내지 2시간 동안 첨가하고 슬라이드를 연장 금으로 장착했다. 이미지는 Leica SP5 공초점 현미경으로 촬영하고 ImageJ에서 분석했다.
결과
시험관 내에서 바이러스 형질도입을 시험하기 위해, PBS 100 ul 중의 1E+9 VG를 96웰 플레이트에서 후근 신경절 뉴런에 적용하였다. 형광을 매일 모니터링했으며 일반적으로 24시간 후에 분명해졌으며 4일 후에 최고조에 달했다. 도 10a 내지 도 10c에 도시된 바와 같이, NGFR121W, BDNF 및 NT3 결합 AAV2-ㆍHSPG는 세포의 형태학적으로 구별되는 아형을 표적으로 한다.
생체 내에서 바이러스 형질도입을 시험하기 위해 PBS 10 ul 중 NGFR121W::AAV2-ㆍHSPG를 안와내, 복강내, 신경내 또는 피하로 마우스에 주사했다. 3주 후 마우스를 희생시키고 조직을 수확하여 여러 기관에 걸친 리포터 유전자의 형광을 모니터링했다.
실시예 5b. DRG에서 형질도입 NGF R121W ::AAV2-ㆍHSPG에 대한 링커 길이에 대한 영향
초기 실험에서 우리는 NEB에서 시판되는 BG-GLA-NHS라는 짧은 링커와 사내에서 합성한 BG-PEG13-NHS라는 "긴 링커"라는 두 가지 반응성 링커를 시험했다. BG-GLA-NHS 또는 BG-PEG13-NHS로 변형된 NGFR121W::AAV2-ㆍHSPG의 등가량(3E+10 VG)을 마우스에 궤도 내로 주사하고 DRG를 수확하여 형질도입 효율을 평가했다. 도 11a-11f 참조. 이러한 실험으로부터 더 긴 링커가 더 짧은 링커보다 훨씬 더 잘 수행된다는 것이 분명해졌으며, 이론에 얽매이지 않고, 생체 내에서 더 큰 안정성 및/또는 잠재적인 면역 회피 때문일 수 있다.
NGFR121W::AAV2-ㆍHSPG에 대한 주사 경로를 추가로 비교하였고 전신 주사가 국소 피하 또는 신경내 주사와 비교하여 DRG에서 더 높은 수준의 바이러스 형질도입을 생성함을 발견하였다. 도 12a-12d 참조. 이것은 우리가 다른 변형되지 않은 AAV 혈청형을 전신적으로 주사했을 때, 안와내 주입 시 기능하는 것으로 보고된 PHP.S의 경우에도 형질도입이 거의 관찰되지 않았기 때문에 예상치 못한 일이었다(문헌[Chan KY, et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci 2017;20:1172-9]). 이 데이터는 우리 접근 방식의 효율성을 보여준다.
마지막으로, 감염된 동물로부터 DRG를 수확하고, 절편화하고, NGF 수용체 TrkA에 대한 항체로 염색함으로써 NGFR121W::AAV2-ㆍHSPG 매개 유전자 전달의 특이성을 평가하였다. 바이러스에 감염된 세포와 TrkA 수용체의 존재 사이에 강한 상관관계를 관찰했다: TrkA 양성 세포의 80%가 NGFR121W::AAV2-ㆍHSPG에 의해 감염되었고, NGFR121W::AAV2-ㆍHSPG 감염 세포의 83%가 TrkA 양성이었다. 도 13a-13d 참조.
실시예 5c. IL31 K134A ::AAV2-ㆍHSPG를 사용한 표적화
인터루킨 31(Il31)가 표적 리간드로 선택되었는데 이의 수용체 IL31RA 및 OSMR이 각질세포에서 고도로 발현되고 염증성 가려움증에서 중요한 역할을 하기 때문이다(문헌[Furue M, et al. Emerging role of interleukin-31 and interleukin-31 receptor in pruritus in atopic dermatitis. Allergy 2018;73:29-36]). IL31RA에 결합하지만 이를 통해 신호를 보내지 않는 돌연변이 IL31K134A를 생성하고(문헌[Nocchi L, et al. Interleukin-31-mediated photoablation of pruritogenic epidermal neurons reduces itch-associated behaviours in mice. Nat Biomed Eng 2019;3:114-25]) 이를 위에서 설명한 대로 AAV2-ㆍHSPG에 접합했다. IL31K134A::AAV2-ㆍHSPG를 마우스에 3E+10 VG로 피하 주사하고 3주 후에 피부를 수확하고 절개하고 각질세포의 마커인 항-K14 항체로 염색했다. 도 14a 내지 도 14c에 도시된 바와 같이, 바이러스 감염된 세포와 K14 양성 각질세포 사이의 거의 100% 중복을 관찰했다. 중요한 것은 형광이 마우스에서 8 내지 10일 표피 회전율보다 더 오래 지속되기 때문에(문헌[Potten CS, Saffhill R, Maibach HI. Measurement of the transit time for cells through the epidermis and stratum corneum of the mouse and guinea-pig. Cell Tissue Kinet 1987;20:461-72]), 우리의 데이터는 표피 줄기 세포도 이 실험에서 표적이 되고 있음을 나타낸다. 실제로, 트랜스크립토믹스 연구는 IL31RA가 여포 간 및 여포 표피의 기저 각질 세포에서 발현되며, 그 중 다수는 표피 줄기 세포임을 나타낸다(문헌[Joost S, Zeisel A, Jacob T, Sun X, La Manno G, Lonnerberg P, et al. Single-Cell Transcriptomics Reveals that Differentiation and Spatial Signatures Shape Epidermal and Hair Follicle Heterogeneity. Cell Syst 2016;3:221-37 e9]).
IL31K134A::AAV2-ㆍHSPG 유전자 전달의 선택성을 추가로 조사하기 위해 IL31RA 녹아웃 마우스 라인(IL31RA-/-)을 사용했다(Nocchi 2018). IL31K134A::AAV2-ㆍHSPG를 피하 주사한 IL31RA-/- 마우스에서 리포터 tdtomato의 어떠한 신호도 검출할 수 없었으며, 이는 형질도입이 실제로 수용체 특이적임을 나타낸다(도 15a 내지 도 15c 참조).
재료 및 방법
AAV 벡터 생산
재조합 AAV2-ㆍHSPG를 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
AAV2-ㆍHSPG에 대한 IL31 K134A -SNAP의 화학적 변형 및 커플링
IL31K134A-SNAP은 이전에 기재된 바와 같이 생성되었다(Nocchi 2019). AAV를 표면 변형하기 위해, 정제된 AAV2-ㆍHSPG를 BG-PEG13-NHS(맞춤형 합성)와 실온에서 3시간 동안 PBS pH 7.2에서 바이러스의 3E+9 VG 대 1.73 nmol 링커의 겉보기 VG 대 NHS 링커 몰비로 반응시켰다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고 실온에서 밤새 5 μM IL31K134A-SNAP와 함께 추가로 배양했다. 과량의 미반응 작용화된 리간드는 100 KDa MWCO 원심분리 장치를 2회 통과시켜 제거하고, 접합된 생성물을 PBS에 재현탁시켰다.
생체 내 주사 및 조직 처리
생체 내 주사 실험을 위해, 야생형 또는 IL31RA-/- 마우스를 2 내지 2.5% 이소플루란으로 마취시킨 다음, PBS 10 ul 중 IL31K134A-SNAP::AAV2-ㆍHSPG의 3E+10 VG를 귀에 피하 주사하였다. 3주 후, 피부를 수확하고 밤새 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 40 μm로 절단했다. 절편을 5% 염소 혈청 + 0.3% Triton-X를 함유하는 PBS에서 토끼 항-K14 항체(Covance 1:200 희석)로 4℃에서 밤새 염색했다. 2차 항-토끼 Alexa488 항체를 1:1000으로 희석하고 어두운 곳에서 실온에서 2시간 동안 배양했다. 슬라이드를 연장 금으로 장착하고 이미지를 Leica SP5 공초점 현미경으로 촬영하고 ImageJ에서 분석했다.
결과
Il31가 표적 리간드로 선택되었는데 이의 수용체 IL31RA 및 OSMR이 각질세포에서 고도로 발현되고 염증성 가려움증에서 중요한 역할을 하기 때문이다(Furue 2018). 또한, 우리는 이전에 IL31RA에 결합하지만 신호를 보내지 않는 돌연변이 IL31K134A를 생성했으며(Nocchi 2019), 이것이 가려움증 경로를 표적으로 삼는 데 사용될 수 있음을 입증했다.
IL31K134A::AAV2-ㆍHSPG를 마우스에 피하 주사하고 피부 절편을 각질세포 마커인 K14와 중첩되는지 검사했다. 도 14a 내지 도 14c에 도시된 바와 같이, 바이러스 감염된 세포와 K14 양성 각질세포 사이의 거의 100% 중복을 관찰했다. 중요한 것은 형광이 마우스에서 8 내지 10일 표피 회전율보다 더 오래 지속되기 때문에(Potten 1987), 우리의 데이터는 표피 줄기 세포도 이 실험에서 표적이 되고 있음을 나타낸다. 실제로, 트랜스크립토믹스 연구는 IL31RA가 여포 간 및 여포 표피의 기저 각질 세포에서 발현되며, 그 중 다수는 표피 줄기 세포임을 나타낸다(Joost 2016).
IL31K134A::AAV2-ㆍHSPG 유전자 전달의 선택성을 추가로 조사하기 위해 이전에 생성한 IL31RA 녹아웃 마우스 라인(IL31RA-/-)을 활용했다(Nocchi 2019). IL31K134A::AAV2-ㆍHSPG를 피하 주사한 IL31RA-/- 마우스에서 tdtomato 리포터 유전자로부터 어떠한 신호도 검출할 수 없었으며(도 15a 내지 도 15c), 이는 형질도입이 실제로 수용체 특이적임을 나타낸다.
실시예 6. 콜레라 독소 B 독소 서브유닛을 이용한 표적화
배경
콜레라 독소 B 서브유닛(CTB)은 그것이 고전적인 역행 추적자이기 때문에 선택되었고, 우리는 그것을 AAV에 커플링함으로써 신경 말단에서 다시 세포체로 AAV의 수송을 달성할 수 있을 것이라고 추론했다. 역행 수송에 대한 야생형 AAV 혈청형의 자연적 성향은 낮고, 따라서 프로젝션 뉴런을 따라 AAV의 트래피킹을 가능하게 하는 플랫폼을 생산하기 위한 유전자 치료 및 기초 과학 모두에 대한 충족되지 않은 요구가 있다. 이 문제를 해결하기 위한 이전의 시도는 역행 기능을 AAV2(rAAV2-레트로)의 캡시드로 조작하기 위해 방향성 진화를 사용했다(문헌[Tervo DG, et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron 2016;92:372-82]). 그러나 우리는 CTB(및 잠재적으로 다른 모든 역행 추적자)가 AAV의 역행 전송을 촉진한다면 모든 AAV를 역행 AAV로의 간단한 사후 변환을 허용할 것이라고 추론했다.
방법
우리는 처음에 E. Coli에서 CTB-SNAP 융합 단백질을 생산했지만 SNAP 태그의 존재가 역행 수송을 감소시키는 것을 발견했다. 따라서 변형되지 않은 CTB를 구입하여 아지도-PEG4-NHS 에스테르로 라벨링했다. 간략하게, CTB를 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 PBS 중의 아지도-PEG4-NHS 에스테르의 10배 몰당량과 반응시켰다. 미반응 아지도기는 2 kDa MWCO 멤브레인으로 투석을 통해 제거되었다. AAV에 접합하기 위해, 상기에서 제조된 바와 같이 정제된 AAV2-ㆍHSPG를 PBS pH 7.2에서 바이러스의 3E+9 VG 대 1.73 nmol 링커의 VG 대 몰비로, 실온에서 3시간 동안 DBCO-PEG4-NHS와 반응시켰다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고 실온에서 밤새 5 μM CTB-PEG4-아지드와 함께 추가로 배양했다. 과량의 미반응 리간드는 100 KDa MWCO 원심분리 유닛을 2회 통과시켜 제거하고 CTB-ㆍHSPG-AAV를 PBS에 재현탁시켰다.
결과
시험관 내에서 바이러스 형질도입을 시험하기 위해, PBS 100 ul 중 CTB-ㆍHSPG-AAV의 1E+9 VG를 96웰 플레이트에서 후근 신경절 뉴런에 적용하였다. 형광을 매일 모니터링했으며 일반적으로 24시간 후에 분명해졌으며 4일 후에 최고조에 달했다. CTB는 큰 DRG 뉴런(기계적 수용체로 추정됨)에 라벨을 붙이는 것으로 알려져 있으며, 실제로 CTB-ㆍHSPG-AAV는 도 16a에 나타낸 바와 같이 큰 뉴런을 형질도입한다.
생체 내 바이러스 형질도입을 시험하기 위해, 3E+9 VG의 CTB-ㆍHSPG-AAV를 마우스에 피하 주사하였다. 3주 후 마우스를 희생시키고 세포 형광을 모니터링하기 위해 조직을 수확했다. 좌골 신경의 섬유 및 DRG의 큰 뉴런에서 형광 신호를 관찰했다(각각 도 16b 및 도 16c 참조).
진행 중인 실험에서, 우리는 또한 야생형 AAV2에 CTB를 접합하고 이를 마우스의 뇌에 주입했다. 우리의 목표는 CTB-AAV2의 역행 수송을 야생형 AAV2와 직접 비교하는 것이다.
실시예 7. 렉틴을 사용한 표적화
렉틴은 세포 부착을 위해 AAV에 의해 사용되는 동일한 세포 표면 탄수화물에 특이적으로 결합하기 때문에 선택되었다. 따라서 우리는 렉틴을 AAV2-ㆍHSPG에 접합함으로써 천연 AAV 혈청형을 모방하고 개선할 수 있다고 추론했다. 초기 실험에서 기관형 척수 배양에서 형질도입 능력을 위해 여러 렉틴-AAV2-ㆍHSPG 접합체를 스크리닝했다. 그런 다음 향후 렌즈 컬리나리스 렉틴(Lens) 및 위스테리아 플로리분다 렉틴(WFL)도 검사할 목적으로 추가 특성화를 위해 밀 배아 응집소(WGA) 및 이소렉틴 B4(IB4)를 선택했다.
일반적인 방법
렉틴을 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 PBS 중의 아지도-PEG4-NHS 에스테르의 20배 몰 당량과 반응시켰다. 미반응 아지도 기는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거되었다. AAV를 작용화하기 위해, 상기에서 제조된 바와 같이 정제된 AAV2-ㆍHSPG를 PBS pH 7.2에서 바이러스의 3E+9 VG 대 1.73 nmol 링커의 VG 대 링커 몰비로, 실온에서 3시간 동안 DBCO-PEG4-NHS와 반응시켰다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고 실온에서 밤새 5 μM 렉틴-PEG4-아지드와 함께 추가로 배양했다. 과량의 미반응 리간드는 100 KDa MWCO 원심분리 유닛을 2회 통과시켜 제거하고 생성된 렉틴-ㆍHSPG-AAV 작제물을 PBS에 재현탁시켰다.
실시예 7a. WGA::AAV2-ㆍHSPG를 사용한 표적화
AAV2-ㆍHSPG에 대한 WGA의 화학적 변형 및 커플링
WGA는 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 PBS 중 아지도-PEG4-NHS 에스테르의 20배 몰 당량으로 작용화되었다. 미반응 반응성 링커는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거하였다. AAV로 표면 작용화하기 위해, 상기에서 제조된 바와 같이 정제된 AAV2-ㆍHSPG를 PBS pH7.2에서 바이러스의 3E+9 VG 대 1.73 nmol 링커의 겉보기 VG 대 DBCO-PEG4-NHS 몰비로, 실온에서 3시간 동안 DBCO-PEG4-NHS와 반응시켰다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고 실온에서 밤새 5 μM WGA-PEG4-아지드와 함께 추가로 배양했다. 과량의 미반응 작용화된 리간드는 100 KDa MWCO 원심분리 유닛을 2회 통과시켜 제거하고 생성된 WGA-ㆍHSPG-AAV 작제물을 PBS에 재현탁시켰다.
시험관 내에서 바이러스 형질도입을 시험하기 위해, PBS 100 ul 중의 1E+9 VG WGA::AAV2-ㆍHSPG를 96웰 플레이트에서 후근 신경절 뉴런에 적용하였다. 형광을 매일 모니터링하고 24시간 후에 분명해졌고, 4일 후에 최고조에 달했다(도 17a 참조). WGA::AAV2-ㆍHSPG는 본질적으로 접시의 모든 세포를 형질도입했다. 이러한 명백한 높은 효율성을 감안할 때 마우스 초기 배아와 같은 다른 세포 유형을 변환하기 어려운 WGA::AAV2-ㆍHSPG도 시도했다. 배반포를 마우스에서 해부하고 1.6E+9 VG의 WGA::AAV2-ㆍHSPG를 함유하는 KSOM 배지 100 ul에서 시험관 내에서 성장시켰다. 형광을 매일 모니터링하고 24시간 후에 명백해졌으며, 세포의 100%가 형광이 되는 시점인 4일 후에 최고조에 달했다(도 17b 참조).
모든 이미지는 Leica SP5 공초점 현미경으로 촬영하고 ImageJ에서 분석했다.
WGA::AAV2-ㆍHSPG가 마우스에서 생체내 말초 뉴런을 표적화하는지 결정하기 위해, 우리는 신생 마우스에서 전신 주사를 수행하였다. 신생아 마우스 실험을 위해 P1 새끼에게 1 ul PBS 중 1E+9 VG의 WGA::AAV2-ㆍHSPG를 이전에 설명한 대로 표재 측두 정맥에 주사했다(문헌[Stoica L, Ahmed SS, Gao G, Sena-Esteves M. Gene transfer to the CNS using recombinant adeno-associated virus. Curr Protoc Microbiol 2013;Chapter 14:Unit14D 5]). 5주 후 마우스를 희생시키고, 피부, 배근 신경절(DRG) 및 척수를 수확하고 4% 파라포름알데하이드에 고정시켰다. ScaleS로 피부를 제거하고 홀마운트 샘플로 준비하고 DRG와 척수를 10 μm로 절단하여 유리 슬라이드에 장착했다.
1E+9 VG의 WGA::AAV2-ㆍHSPG를 IV 주사한 신생 마우스에서 피부, DRG 및 척수의 말초 신경계 전체에 걸쳐 강력한 형질도입을 감지했지만 중추신경계에서는 그렇지 않았다. 도 18a-18c 참조. 우리는 피부의 신경 섬유(도 18a), DRG의 세포체(도 18b) 및 척수의 중앙 말단(도 18c)으로 명백한 말초 신경계 전반에 걸쳐 강력한 tdTomato 형광을 검출했다. 우리는 WGA::AAV2-ㆍHSPG가 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않는다는 것을 나타내는 중추 신경계에서 형광을 관찰하지 않았다.
또한 WGA::AAV2-ㆍHSPG가 변형된 바이러스를 전두엽 피질에 주입하고 형광에 대해 시상에 있는 프로젝션 뉴런의 세포체를 검사하여 뇌에서 역행 수송을 겪는지 여부를 조사했다.
성체 마우스 뇌에 주사하기 위해, 마우스를 2 내지 2.5% 이소플루란으로 마취시켰다. 개두술을 수행하고 500 nl PBS 중 6E+8 VG의 WGA::AAV2-ㆍHSPG를 다음 좌표에서 표준 정위 기술을 사용하여 전두엽 피질에 주입했다: M/L = 0.500, A/P = -1.700, D/V = -1.8(Stoica 2013). 5주 후, 마우스에 4% 파라포름알데하이드를 관류하고, 뇌를 수확하고, 100 μm로 관상 절편을 만들었다. 이미징 전에 섹션을 DAPI로 염색했다.
도 19a 내지 도 19c에서 볼 수 있는 바와 같이, 주사 부위의 뇌 절편(도 19a) 및 시상의 프로젝션 뉴런의 세포체(도 19b 및 19c)에서 강력한 신호를 검출하였다.
실시예 7b. WGA::PHP.S로 부스팅
WGA 리간드를 사용한 표면 작용화가 합성 AAV 벡터의 형질도입 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 이전에 DRG 뉴런을 효과적으로 형질도입하는 것으로 입증된 작용화된 PHP.S를 표면화한다. 위와 같이 정제된 PHP.S를 준비하였고, 실온에서 3시간 동안 PBS pH 7.2에서 0.43 nmol, 0.87 nmol, 1.73 nmol, 2.6 nmol, 또는 3.47 nmol DBCO-PEG4-NHS에 대한 1E+9 VG의 VG:링커 몰비에서 DBCO-PEG4-NHS와 반응시켰다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고 실온에서 밤새 0.1 nmol WGA-PEG4-아지드와 함께 추가로 배양했다. 과량의 미반응 작용화된 WGA는 100 KDa MWCO 원심분리 유닛을 2회 통과시켜 제거하고 생성된 WGA-PHP.S 작제물을 PBS에 재현탁시켰다. 미변형 및 변형 PHP.S를 100 ul PBS에서 1E+9 VG로 DRG 뉴런에 적용했다. 도 20a 내지 도 20f에서 볼 수 있는 바와 같이, WGA-PHP.S는 미변형 PHP.S(1E+9 VG)와 동등한 역가에서 DRG 뉴런에 적용될 때 형질도입 효율을 상당히 증가시켰다. 이는 0.43 nmol 내지 3.47 nmol의 DBCO-PEG4-NHS 몰량 범위에서 명백하였다.
실시예 7c. IB4::AAV2-ㆍHSPG를 사용한 표적화
IB4는 DRG에서 비펩티드성 감각 뉴런 주변의 맥관구조 및 중추신경계에서 미세아교세포의 마커로 사용된다. 따라서 마우스에서 IB4::AAV2-ㆍHSPG의 피하, 신경내 및 척수내 주사를 시험했다.
AAV2-ㆍHSPG에 대한 IB4의 화학적 변형 및 커플링
IB4를 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 PBS 중의 아지도-PEG4-NHS 에스테르의 20배 몰당량과 반응시켰다. 미반응 아지도 링커는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거하였다. AAV에 접합하기 위해, 정제된 AAV2-ㆍHSPG를 PBS pH7.2에서 바이러스의 3E+9 VG 대 1.73 nmol 링커의 겉보기 VG 대 DBCO-PEG4-NHS 몰비로 실온에서 3시간 동안 DBCO-PEG4-NHS와 반응시켰다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고 실온에서 밤새 5 μM IB4-PEG4-아지드와 함께 추가로 배양했다. 과량의 미반응 IB4는 100 KDa MWCO 원심분리 유닛을 2회 통과시켜 제거하고 IB4-ㆍHSPG-AAV를 PBS에 재현탁시켰다.
생체 내 적용, 생체 내 주사 및 조직 처리
배양된 감각 뉴런에서의 실험을 위해, DRG를 마우스로부터 수확하고 37℃에서 각각 25분 동안 1 mg/ml 콜라게나아제 IV 및 0.05% 트립신에서 배양하였다. 세포를 여과하고 DMEM, 10% 열 불활성화 태아 소 혈청, 0.8% 포도당 및 100 U의 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배지에 현탁시키고, 폴리-L-라이신으로 처리된 유리 커버슬립에 플레이팅하였다. 다음날, 배지를 제거하고 100 ul의 PBS 중 1E+9 VG의 IB4::AAV2-ㆍHSPG의 를 세포에 첨가하였다. 2시간 후 PBS를 배지로 교체하고 Zeiss AxioObserver A1 현미경으로 이미징하기 전에 세포를 37℃에서 5일 동안 유지했다.
생체 내 주사 실험을 위해, 마우스를 2 내지 2.5% 이소플루란으로 마취시킨 다음, 피하, 신경내 또는 척수내 경로를 통해 주사하였다. 피하 주사를 위해, 10 ul 중 3E+10 VG의 IB4::AAV2-ㆍHSPG를 발의 발바닥 표면에 주사하였다. 신경내 주사를 위해 2 ul 중 3E+9 VG IB4::ㆍHSPG-AAV2를 좌골 신경에 주사하였다. 척추내 주사를 위해 1 ul 중 6E+8 VG의 IB4::ㆍHSPG-AAV2를 요추 척수에 주사했다. 3주 후, 조직을 수확하고, 4% 파라포름알데하이드에 고정하고, ScaleS에서 제거하고, 홀마운트 샘플로 준비했다. 신경내 주사의 경우 척수를 10 μm로 절단하고 이전에 설명한 대로 IB4-488로 염색했다(문헌[Dhandapani R, Arokiaraj CM, Taberner FJ, Pacifico P, Raja S, Nocchi L, et al. Control of mechanical pain hypersensitivity in mice through ligand-targeted photoablation of TrkB-positive sensory neurons. Nature communications 2018;9:1640]). 이미지는 Leica SP5 공초점 현미경으로 촬영하고 ImageJ에서 분석했다.
결과
말초 신경계에서 IB4는 비펩티드성 감각 뉴런의 마커로 사용된다. 따라서 먼저 IB4::AAV2-ㆍHSPG가 시험관 내에서 이 뉴런 집단을 형질도입하는지 여부를 시험했다. 도 21에 도시된 바와 같이, 주로 직경이 작은 세포에 국한된 배양된 DRG 뉴런에서 강력한 tdTomato 형광을 관찰했으며, 이는 비펩티드성 감각 뉴런을 나타낸다. IB4는 또한 말초의 맥관구조 및 중추신경계의 미세아교세포의 마커로 사용된다. 따라서 IB4::AAV2-ㆍHSPG가 생체 내에서 이러한 구조를 표적으로 하는지 여부를 결정하기 위해 마우스에서 다른 주사 경로를 시험했다. IB4::AAV2-ㆍHSPG의 피하 주사 후 혈관 주변의 내피 및 평활근 세포에서 tdTomato 발현을 검출했다(도 22a). 왼쪽 좌골 신경에 3E+9 VG IB4::ㆍHSPG-AAV2를 주사하면 DRG의 비펩티드성 뉴런에서 형광이 관찰되고(도 22b) 척수에서 이들의 종결이 관찰된다(도 22c). 이 발현이 IB4 양성 뉴런과 일치하는지 확인하기 위해 척수 절편을 형광 표지된 IB4-488로 염색했다. 도 22c에 도시된 바와 같이, 우리는 IB4::ㆍHSPG-AAV2 형질도입된 뉴런과 반대측 척수에는 없는 IB4-488 염색 사이의 동측 척수에서 명확한 중첩을 관찰했다. 마지막으로, IB4::ㆍHSPG-AAV2를 척수에 주사한 후 소교세포에서 tdTomato의 강력한 발현을 검출했다(도 22d).
실시예 7d. IB4::AAV2-HSPG 및 IB4::AAV9-HSPG로 상당한 부스팅
방법
AAV 생산
GFP 카고가 있는 재조합 AAV2 및 AAV9는 이전에 설명한 대로 각각 SF21 또는 HEK293에서 생산되었다(Grieger 2006 및 Wu 2018). 감염 5일 후 세포를 수확하고, 0.5%에서 Triton X-100으로 용해하고, 뉴클레아제 처리하고, 접선 흐름 여과로 농축하고, 등밀도 초원심분리를 사용하여 정제했다(문헌[Dias Florencio G, Precigout G, Beley C, Buclez PO, Garcia L, Benchaouir R. Simple downstream process based on detergent treatment improves yield and in vivo transduction efficacy of adeno-associated virus vectors. Mol Ther Methods Clin Dev 2015; 2:15024]). 벡터 게놈 적정은 바이러스 카고의 프로모터 영역을 표적으로 하는 프라이머와 함께 Q-PCR을 사용하여 수행되었다(Grieger 2006).
AAV2 또는 AAV9에 대한 IB4의 화학적 변형 및 커플링
IB4를 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 PBS 중의 아지도-PEG4-NHS 에스테르의 20배 몰당량과 반응시켰다. 미반응 아지도 링커는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거하였다. AAV에 접합하기 위해, 정제된 AAV2 또는 AAV9를 바이러스의 3E+9 VG 대 1.73 nmol 링커의 겉보기 VG 대 DBCO-PEG4-NHS 몰비로 PBS pH7.2에서 실온에서 3시간 동안 DBCO-PEG4-NHS와 반응시켰다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고 실온에서 밤새 5 μM IB4-PEG4-아지드와 함께 추가로 배양했다. 과량의 미반응 IB4는 100 KDa MWCO 원심분리 유닛을 2회 통과시켜 제거하고 IB4-AAV2 또는 IB4-AAV9를 PBS에 재현탁시켰다.
PC12 세포에 대한 시험관내 적용
PC12 세포는 5% 말 혈청, 5% 태아 소 혈청 및 100 U 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃로 유지되었다. 다양한 농도의 야생형 AAV2, 야생형 AAV9, IB4-AAV2 또는 IB4-AAV9를 PBS에서 PC12 세포와 함께 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음 배지를 교체하고 세포를 37℃에서 5일 동안 유지한 후 4% PFA에 고정하고 DAPI로 라벨링하고 Zeiss AxioObserver A1 현미경으로 이미징했다. 각 DAPI 양성 세포에서 GFP 형광을 측정하고 각 역가에 대한 평균 +/- SEM으로 플로팅하여 이미지를 분석했다.
결과
PC12 세포는 AAV2 또는 AAV9와 같은 야생형 AAV 혈청형을 사용하여 형질도입하기 어렵다. 따라서 우리는 AAV2 또는 AAV9를 IB4에 컨쥬게이션하면 이 세포 유형에서 AAV 형질도입 효율이 증가하는지 여부를 질문했다. 도 23의 플롯 및 도 24a 내지 도 24f에 도시된 바와 같이, 우리는 2E+7 내지 5E+9 VG의 임의의 농도에서 AAV2로 처리된 세포에서 GFP 형광을 검출할 수 없었다. 그러나, AAV에 대한 IB4의 컨쥬게이션은 형질도입 효율을 실질적으로 증가시켜(도 24g 도 24l) 산란된 GFP 양성 세포가 5E+8VG에서 명백하고 이것이 5E+9VG에서 80% 초과의 효율로 증가하였다. 이러한 값(모든 세포에 걸쳐 GFP 형광 강도로 측정됨)의 정량화는 5E+8 VG에서 AAV2에 대한 IB4의 접합은 효율을 15배 증가시킨 반면, 1E+9 VG에서는 증가가 38배인 반면, 5E+9 VG에서는 효율 증가가 104배였다.
유사하게, 처리된 PC12 세포에서 GFP 형광은 야생형 AAV9를 사용하여 임의의 농도에서 검출되지 않았다(플롯 도 25 및 도 26a 내지 26f 참조). 대조적으로, IB4-AAV9 처리된 세포는 5E+9VG에서 고효율로 5E+8 VG의 농도로부터 증가하는 수의 GFP 양성 세포를 나타냈다(플롯 도 25 및 도 26g 내지 26l 참조). 특히, 1E+9 VG로 처리된 PC12 세포에서 AAV9에 대한 IB4의 접합은 효율을 9배 증가시킨 반면, 5E+9 VG에서는 야생형에 비해 84배 증가했다.
실시예 8. 형질도입 효율에 대한 링커 길이의 영향
방법
AAV 생산
재조합 AAV2-ㆍHSPG를 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
AAV2-ㆍHSPG에 대한 IB4의 화학적 변형 및 커플링
IB4(8.8 nmol)를 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 PBS 중의 아지도-PEGn-NHS 에스테르(176 nmol)의 20배 몰 당량과 반응시켰다. 미반응 아지도 기는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거되었다. AAV에 접합시키기 위해, 6E+12 정제된 AAV2-ㆍHSPG를 실온에서 3시간 동안 PBS pH 7.2에서 0.17 nmol, 0.52 nmol, 1.73 nmol 또는 5.2 nmol DBCO와 반응시켰다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고 실온에서 밤새 0.1 nmol IB4-PEG4-아지드와 함께 추가로 배양했다. 과량의 미반응 IB4는 100 KDa MWCO 원심분리 유닛을 2회 통과시켜 제거하고 변형된 AAV를 PBS에 재현탁시켰다.
표 2의 다음 링커 조합을 조사했다(및 상업적 분자 공급원):
Figure pct00047
PC12 세포에 대한 시험관내 적용
PC12 세포는 5% 말 혈청, 5% 태아 소 혈청 및 100 U 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃로 유지되었다. 상이한 몰비 및 다양한 링커 길이로 접합된 IB4::AAV2-ㆍHSPG 입자를 PBS에서 PC12 세포와 함께 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음 배지를 교체하고 세포를 37℃에서 5일 동안 유지한 후 4% PFA에 고정하고 DAPI로 라벨링하고 Zeiss AxioObserver A1 현미경으로 이미징했다. 각 DAPI 양성 세포에서 GFP 형광을 측정하고 각 역가에 대한 평균 +/- SEM으로 플로팅하여 이미지를 분석했다. 도 30 참조.
결과 및 해석
이들 실험에서 우리는 형질도입 효율에 대한 링커 길이(즉, 에틸렌 글리콜 단량체 스페이서 없음)의 영향을 조사했다. PC12 세포는 표준 AAV 벡터를 사용하여 형질도입하기 어렵기 때문에(따라서 배경이 감소됨) 표적 세포주로 PC12 세포를 선택했고, IB4는 이러한 세포에 강력하게 결합하기 때문에 표적 리간드로 선택했다. 우리는 4개의 서로 다른 링커 길이에 대해 실험을 수행하고 다양한 몰비의 범위를 사용하여 각 링커의 효율성을 측정했다. 여기서 추론은 각 링커가 바이러스 또는 리간드와 다르게 반응할 수 있고 변형 비율의 범위를 사용하여 반응 효율의 모든 변화를 포착할 수 있고 궁극적으로 최종 작제물의 형질도입 효율을 포착할 수 있다는 것이다.
도 31에 도시된 데이터를 보면 AAV와 리간드 사이에 스페이서가 없는 것이 형질도입 효율에 강한 부정적인 영향을 미친다는 것이 분명하다. 0.17 nmol, 0.52 nmol 및 1.73 nmol NHS-DBCO로 생성된 표면 변형된 캡시드로 극소수의 세포가 형질도입되었으며, 5.2 nmol에서만 상당한 감염이 관찰된다. 이것은 리간드와 바이러스 사이에 스페이서가 없는 경우에도 여전히 세포를 형질도입할 수 있음을 보여주기 때문에 흥미롭다. 그러나, 이를 위해서는 작제물을 준비하기 위해 AAV에 대한 NHS-DBCO의 고농도가 필요하다. 이론에 얽매이지 않고 한 가지 가능성은 아마도 표적 리간드-아지드와 AAV-DBCO 사이의 가교 반응이 입체 장애에 의해 제한되고 반응이 진행되기 위해서는 바이러스에 DBCO 기의 최적 침착이 필요하다는 것이다. 총 길이가 짧은 PEGn=3 PEG 스페이서는 스페이서가 없는 것보다 성능이 더 좋았지만, 다시 낮은 몰비(0.17 nmol)에서 효율이 감소했다. 흥미롭게도, 더 높은 수정 비율에서 이 스페이서 길이는 다른 모든 것보다 적당히 더 잘 수행되었다. 중간(n=8) 및 긴(n=16) 스페이서를 갖는 작제물은 유사하게 수행되었고 AAV:리간드의 0.17 nmol 링커에 대한 바이러스의 3E+9 VG의 몰비에서 생성될 때 더 높은 형질도입 효율을 나타냈다. 이러한 데이터는 이 범위 내에서 스페이서 길이를 늘리면 특히 차선 수정 비에서 형질도입 효율이 증가함을 시사한다.
실시예 9. PEG 링커의 크기 제한
다양한 링커 길이를 제공하는 개별 PEG(dPEG) 및 분산 PEG(pPEG) 스페이서를 포함하는 AAV 작제물의 PC12 세포에서 AAV 형질도입 효율에 미치는 영향을 조사했다. 그 목적을 위해, (i) DBCO-PEGn-NHS(여기서 n은 4, 12, 약 45(dPEG 2K), 약 114(dPEG 5K), 약 228(dPEG10K), 약 682(dPEG 30K)) 또는 DBCO-PEGn-TFP(여기서 n은 24임)로부터 선택된 캡시드 반응성 링커로 작용화된 캡시드를 (ii) 리간드 반응성 링커로 작용화된 WGA 리간드: 아지드-PEGn-NHS(여기서 n은 4, 12, 24 또는 약 114임(dPEG 5K))와 조합함으로써 WGA 리간드로 AAV2ㆍHSPG 캡시드를 표면 변형했다 조사된 다양한 링커/PEG 스페이서에 해당하는 작제물은 캡시드 반응성 링커가 "TFP"로 표시되지 않는 한 DBCO-PEGn-NHS인 표 3에 추가로 설명되어 있다.
Figure pct00048
방법
재조합 AAV2-ㆍHSPG를 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
링커가 다른 WGA와 AAV2ㆍHSPG의 화학적 변형 및 커플링
WGA(1.7 nmol)는 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 100 ul PBS에서 리간드 반응성 링커 아지드-PEGn-NHS(54 nmol)(여기서 n은 4, 12 또는 24임)의 20배 몰 당량과 반응하여 작용화되었다. 미반응 링커는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거하였다. 작용화된 리간드를 AAV에 접합시키기 위해, 먼저 표각각의 캡시드 반응성 링커: DBCO-PEGn-NHS(여기서 n은 4, 12 또는 24임) 및 DBCO-PEGn-TFP(여기서 n은 4, 12 또는 24임)에 대해 면 작용화된 AAV 캡시드를 준비했다. 각 캡시드/리간드 작제물의 형질도입 효율은 캡시드 대 리간드 비의 범위에서 각 작제물을 준비함으로써 최적화되었다. 구체적으로, 각각의 표면 작용화된 AAV 캡시드는 3E+9 VG 정제된 AAV2ㆍHSPG를 PBS pH 7.2에서 0.17 nmol, 0.52 nmol, 1.73 nmol 및 5.2 nmol의 선택된 반응성 링커와 실온에서 3시간 동안 반응시켜 제조하였다. 다음으로, 수득된 각각의 표면 작용화된 캡시드를 0.1 nmol의 WGA-PEGn-아지드(작용화된 표적 리간드)와 함께 실온에서 1시간 동안 그리고 4℃에서 밤새 배양하여 다양한 WGA-AAV2ㆍHSPG 표면 변형 작제물을 수득하였다.
PC12 세포에 대한 시험관내 적용
PC12 세포는 5% 말 혈청, 5% 태아 소 혈청 및 100 U 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃로 유지되었다. PC12 세포를 PBS에서 2시간 동안 다양한 WGA-AAV2ΔHSPG 작제물의 3E+9 VG와 함께 배양하였다. 그런 다음 배지를 교체하고 세포를 37℃에서 5일 동안 Hoechst로 표지하고 Zeiss AxioObserver A1 현미경으로 이미징했다. 각 Hoechst 양성 세포에서 GFP 형광을 측정하여 이미지를 분석하고 각 역가에 대한 평균 +/- SEM으로 플로팅했다.
결과
함께, 도 32 내지 도 36에 도시된 데이터는 바이러스를 변형시키는 데 사용되는 PEG 링커의 크기가 형질도입 효율에서 원하는 부스트를 달성하기 위해 제어하는 데 중요하고 PEG12 주변의 시험된 시스템에서 최적인 것으로 보인다는 것을 입증한다. 리간드 측면에서는, 분산 PEG 5000을 포함하여 더 긴 링커가 허용되는 것으로 보이지만 이상적이지는 않다.
도 32a 내지 도 32s는 제조된 각각의 WGA-AAV2ㆍHSPG 표면 변형된 작제물로 처리된 Hoechst 표지된 PC12 세포의 이미지이다. 도 32a 내지 도 32s 및 도 33 내지 도 36에 도시된 바와 같이, 효율적인 형질도입을 나타내는 가장 밝은 이미지는 링커가 4 내지 24(또는 4 내지 12) 범위의 "n"을 갖는 다양한 PEG 길이(즉, 에틸렌 글리콜 단량체)를 포함하고 전체 링커가 8 내지 24(또는 8 내지 16) PEG 단위의 총 "n"을 포함하는 실험에서 수득되었다. 최적의 조합은 바이러스에 대하여 DBCO-PEG4 및 리간드에 대하여 아지드-PEG4(총 n = 8)(도 32a), 이어서 바이러스에 대하여 DBCO-PEG12 및 리간드에 대하여 아지드-PEG4(총 n = 16)(도 32d), 바이러스에 대하여 DBCO-PEG4 및 리간드에 대하여 아지드-PEG12(총 n = 8)(도 32b), 및 바이러스에 대하여 DBCO-PEG12 및 리간드에 대하여 아지드-PEG12(총 n = 24)(도 32e)였다. 일부 신호를 나타내는 분산된 PEG를 사용하는 유일한 조건은 바이러스에서 DBCO-PEG4와 반응한 WGA-아지드-PEG 5000이었다(도 32n). 별개의 PEG 4L+4V 및 12L+12V 조합은 더 오래 분산된 pPEG보다 분명히 더 나은 성능을 보인다.
도 33 및 도 34는 개별 PEG 링커 스페이서(즉, 에틸렌 글리콜 단량체)를 갖는 WGA로 표면 변형된 AAV2ΔHSPG 바이러스 작제물로 처리된 PC12 세포의 개별 및 평균(각각) 세포 형질도입 효율에 대한 부스트를 추가로 확인하며 여기서 총 n(바이러스 캡시드와 리간드 사이에 형성된 링커의 PEG 단량체 합계)는 8 내지 24이다.
도 35 및 36은 비변형 바이러스와 비교하여 선택된 개별 및 분산 PEG 조합에 대한 평균 형질도입 효율을 비교한다. 도 35에서, 별개의 PEG 4L+4V 및 12L+12V 조합이 더 오래 분산된 PEG 스페이서보다 확실히 더 우수하게 수행됨을 알 수 있다. 도 36은 성능이 가장 낮은 개별 및 분산 PEG 조합에만 초점을 맞춘다. 흥미롭게도, 5KL+4V만이 대조군보다 성능이 우수하며, 이는 링커의 바이러스 측에 있는 제한된 스페이서 길이가 원하는 부스트된 형질도입을 수득하는 데 도움이 될 수 있음을 시사하는 반면, 링커의 리간드 측면에 있는 스페이서 길이는 더 긴 스페이서를 사용하는 것이 더 적합할 수 있다.
실시예 10. DBCO-아지드 가교제 반응성 쌍은 WGA-AAV2ㆍHSPG 작제물에 대하여 가장 잘 수행됨
우리는 다음으로 우리가 이미 탐구한 DBCO-아지드 화학을 넘어 PC12 세포에서 상이한 링커 화학이 AAV 형질도입 효율을 향상시킬 것인지를 조사했다. 이 목적을 위해 우리는 TCO/테트라진 결찰 및 별도로 슈타우딩거 결찰을 통해 반응하는 포스핀-NHS/아지드 가교제 반응성 쌍을 사용하여 AAV2ㆍHSPG-WGA 작제물을 준비했다.
TCO/테트라진 결찰 화학은 트랜스-시클로옥텐과 테트라진 반응 쌍 사이의 역-여구 디엘스-알더 시클로첨가 반응을 기반으로 하며, 디하이드로피리다진 결합을 형성하고 다른 생체직교 결찰 쌍과 비교할 수 없는 초고속 동역학(> 800 M-1s-1)을 갖는 것으로 알려져 있다.
NHS-아지드 및 NHS-포스핀 이작용성 링커는 아민 반응성이고 단백질의 1차 아민 유도체화에 적합한 NHS 에스테르를 포함한다. 단백질(캡시드 또는 리간드)이 아지드 또는 포스핀 작용화되면 효과적이고 안정적인 접합을 위해 두 성분이 혼합된다. 포스핀기는 슈타우딩거 반응을 통해 아지드와 반응하여 안정한 공유 아미드 결합을 형성하도록 포획된 아자-일리드 중간체를 생성한다.
방법
재조합 AAV2-ㆍHSPG를 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
이러한 실험에 사용된 작용화된 표적 리간드를 준비하기 위해 테트라진-PEG5-NHS 및 아지도-PEG4-NHS의 150 mM 스톡 용액을 DMSO에서 준비했다. WGA(27 uM, 1 mg/ml)를 PBS 중의 테트라진-PEG5-NHS(540 uM) 또는 아지도-PEG4-NHS(540 uM)의 20배 몰당량과 pH 7.2에서 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 미반응 링커는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거하였다.
이들 실험에서 사용하기 위한 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 제조하기 위해 20 mM TCO-PEG4-NHS 또는 포스핀-NHS 스톡 용액을 DMSO에서 준비했다. AAV 캡시드를 표면 개질하기 위해, 3E+9 VG의 정제된 AAV2ㆍHSPG를 0.17 nmol, 0.52 nmol, 1.73 nmol 및 5.2 nmol TCO-PEG4-NHS 또는 포스핀-NHS와 20 ul PBS pH 7.2에서 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 TCO 또는 Phos 표면 변형된 AAV를 각각 0.1 nmol의 WGA-PEG5-테트라진 또는 WGA-PEG4-아지드와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 4℃에서 밤새 배양한다.
PC12 세포에 대한 시험관내 적용
PC12 세포는 5% 말 혈청, 5% 태아 소 혈청 및 100 U 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃로 유지되었다. PC12 세포는 2시간 동안 PBS에서 위에서 설명한 다양한 AAV:링커 비로 제조된 WGA-AAV2ㆍHSPG 작제물과 함께 배양되었다. 그런 다음 배지를 교체하고 세포를 37℃에서 5일 동안 Hoechst로 표지하고 Zeiss AxioObserver A1 현미경으로 이미징했다. 각 Hoechst 양성 세포에서 GFP 형광을 측정하고 각 역가에 대한 평균 +/- SEM으로 플로팅하여 이미지를 분석했다.
결과
도 37a 내지 도 37f 및 도 38 내지 도 39에 도시된 바와 같이, TCO/테트라진 결찰을 사용하여 WGA와 접합된 AAV2ㆍHSPG로 처리된 세포에서 매우 낮은 수준의 tdTomato 형광이 검출되었으며, 이는 비효율적인 형질도입을 나타낸다. 포스핀-NHS/아지드(도 40a 내지 도 40d 및 도 41 내지 도 42)를 사용하여 WGA와 접합된 AAV2ㆍHSPG로 처리된 세포에서 약간 더 많은 형질도입이 명백하였다; 그러나, 관찰된 형질도입은 변형되지 않은 AAV2ㆍHSPG와 비교할 때 최소한으로만 개선되었다(도 37e 및 도 40e). 가장 높은 형질도입 효율을 나타내는 화학적 변형은 DBCO-아지드 가교제 반응성 쌍을 사용하여 제조된 AAV 적재물로 남아 있다(도 37f 및 도 40f).
실시예 11. AAV 입자의 정량화 및 바이러스 표면의 화학적 변형
배경
AAV 캡시드의 표면 변형 정도를 정량화하기 위해 캡시드 농도가 알려진 표준 AAV9(Innovavector에서 구입)를 사용했다. 이 표준을 사용하여 다음 두 가지 전략을 사용하여 수정 범위를 정량화했다: (1) NHS-PEG4-DBCO를 바이러스와 반응시키고 DBCO 발색단의 흡광도로부터 캡시드당 DBCO 분자의 수를 계산했다. 그런 다음 WGA-PEG4-아지드를 변형된 AAV9에 접합하고 DBCO 흡광도의 감소로부터 캡시드당 리간드 수를 계산했다. (2) 형광 표지된 아지도 리간드(WGA-SNAP-TMR-PEG4-아지드)를 바이러스에 접합하여 바이러스당 리간드 수를 평가하고 다시 흡광도 측정을 사용했다.
방법
AAV9를 DBCO로 변형한 후 WGA 아지도와 가교
3.6E+10 VG AAV9를 최종 부피 97 ul의 DBCO-PEG4-NHS 52 nmol과 함께 실온에서 진탕기에서 3시간 동안 배양하였다. 이 양의 링커는 AAV9에 접합되고 PC12 세포에 적용될 때 최적의 형질도입 효율을 제공하기 때문에 선택되었다.
WGA-아지도 리간드로 바이러스를 변형시키기 위해, 2.8 nmol의 WGA를 최종 부피 100 ul의 PBS에서 20배 몰 당량의 아지도-PEG4-NHS 에스테르(56 nmol)와 pH 7.2에서 실온(RT)에서 3시간 동안 반응시켰다. 이어서, 미반응 아지도 기는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거되었다. 그 후, 242.5 nmol의 WGA-아지도를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 변형 후 샘플을 100 KDa 분자 MWCO와 함께 PBS에서 Pluronic F68 0.001% NaCl 200 mM을 사용하여 3회 헹궈 과잉의 결합되지 않은 시약을 제거했다. 컬럼에서 수집된 20 ul를 고속 진공으로 농축하고 PBS 중 10 ul Pluronic F68 0.001% NaCl 200 mM에 재현탁했다. WGA-아지도와 반응하는 것 외에도 1) AAV9 단독 및 2) AAV9가 DBCO와 함께 배양되는 또 다른 두 그룹이 있다. 반응 및 정제 중 바이러스 손실을 보정하기 위해 5 ul의 샘플을 사용하여 ddPCR 분석을 실행했다.
바이러스에 대한 PEG4-DBCO 및 WGA-PEG4-아지도 화학적 변형 정도 평가
DBCO에 내장된 발색단의 흡광도 피크인 307 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. AAV9-PEG4-DBCO와 WGA-PEG4-아지도 사이의 반응은 DBCO에 존재하는 발색단의 손실로 이어져야 하므로, 샘플 PEG4-DBCO 및 PEG4-DBCO+ WGA-PEG4-아지드에 있는 PEG4-DBCO 분자의 총 수와의 차이는 바이러스에 결합된 리간드 분자의 수를 제공해야 한다.
로우 데이터는 다음과 같이 처리되었다:
ㆍ PEG4-DBCO의 농도에 대한 흡광도의 표준 곡선을 사용하여 샘플 흡광도(AAV9 단독의 흡광도 및 반응 정화 후 미반응 NHS-PEG4-DBCO의 잔류 흡광도에 대해 보정됨)에 기초한 PEG4-DBCO 분자의 총 수 계산;
ㆍ 총 DBCO 분자의 수를 총 캡시드의 수로 나누어 각 캡시드 상의 PEG4-DBCO 분자의 수 계산;
ㆍ 샘플 PEG4-DBCO에서만 샘플 PEG4-DBCO + WGA-PEG4-아지도에 존재하는 PEG4-DBCO 분자의 수를 빼서 바이러스에 결합된 리간드 분자의 수 계산.
형광 표지된 리간드로 바이러스 변형
형광 표지된 리간드로 바이러스를 변형시키기 위해, 2.8 nMol의 WGA-SNAP를 최종 부피 100 ul의 PBS에서 20배 몰 당량의 아지도-PEG4-NHS 에스테르(56 nMol)와 pH 7.2에서 실온(RT)에서 3시간 동안 반응시켰다. 미반응 아지도 기는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거되었다. 그런 다음 형광 BG-테트라메틸로다민(NEB의 BG-TMR)을 등몰 농도로 WGA-SNAP 아지도와 실온에서 1시간 동안 배양하여 WGA-SNAP-TMR-PEG4-아지드를 수득하였다.
WGA-SNAP-TMR-PEG4-아지드로 바이러스를 변형하기 위해, 3.6E+10 VG AAV9를 최종 부피 97 ul의 DBCO-PEG4-NHS 52 nmol과 함께 실온에서 진탕기에서 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 242.5 nmol의 WGA-SNAP-TMR-PEG4-아지드를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 대조군으로 하기를 사용하였다: 1) AAV9 단독; 2) DBCO-PEG4-NHS 링커 없이 TMR-WGA-아지도로만 배양된 AAV9; 및 3) WGA-아지도와 배양된 AAV9. 변형 후 샘플을 100 KDa 분자 MWCO와 함께 PBS에서 Pluronic F68 0.001% NaCl 200 mM을 사용하여 3회 헹궈 과잉의 결합되지 않은 시약을 제거했다. 컬럼에서 수집된 20 ul은 흡광도 측정 및 ddPCR 분석을 위해 수집되었다.
AAV9 캡시드당 형광 리간드 수 평가.
ㆍ TMR의 흡광도 피크인 544 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 로우 데이터는 다음과 같이 처리되었다:
ㆍ AAV9-PEG4-DBCO::WGA-SNAP-TMR-PEG4-아지드의 총 흡광도 값에서 AAV9 단독의 흡광도 값을 빼서 TMR의 흡광도 및 흡광 계수에 기초한 TMR 분자의 총 수 계산;
ㆍ 총 TMR 분자의 수를 총 캡시드의 수로 나누어 캡시드 상의 TMR 분자(따라서 리간드 분자)의 수 계산;
결과
DBCO의 흡광도에 기초하여 우리는 바이러스당 PEG4-DBCO 분자의 수를 약 210개로 계산한 반면, WGA-PEG4-아지드 리간드의 수는 캡시드당 대략 150개 분자였다(도 43). 형광 WGA-SNAP-TMR-PEG4-아지드를 사용한 측정으로부터, 캡시드당 170개의 분자인 리간드의 수를 추정하였다(도 44). 두 가지 전략으로 수득한 수치는 가장 풍부한 AAV 캡시드 단백질 VP3(비리온당 VP3의 50카피)에 노출된 10개의 라이신이 있다는 사실과 일치하며, 이는 링커 DBCO-PEG4-NHS에 대한 대략 500개의 결합 부위를 의미하므로 리간드에 대한 것이다.
실시예 12. 임상적으로 관련된 캡시드의 감염성 증가
방법
AAV 생산
GFP 카고가 있는 재조합 AAV3 및 AAV8은 Innovavector에서 구입한 반면, tdTomato 카고가 있는 AAV5는 Addgene(플라스미드 #59462)에서 구입했다. tdTomato 카고가 있는 AAV6는 이전에 설명한 대로 HEK293T에서 생산되었다(Grieger 2006, Wu 2018). 감염 5일 후 세포를 수확하고, 0.5%에서 Triton X-100으로 용해하고, 뉴클레아제 처리하고, 접선 흐름 여과로 농축하고, 등밀도 초원심분리를 사용하여 정제했다(Dias 2015). 벡터 게놈 적정은 바이러스 카고의 프로모터 영역을 표적으로 하는 프라이머와 함께 Q-PCR을 사용하여 수행되었다(Grieger 2006).
AAV3, AAV5, AAV6 및 AAV8에 대한 WGA의 화학적 변형 및 커플링
WGA(1.7 nmol)를 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 100 ul PBS 중의 아지도-PEG4-NHS 반응성 링커(54 nmol)의 20배 몰 당량과 반응시켜 작용화된 표적화 WGA 리간드를 생성하였다. 미반응 반응성 링커는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거하였다. AAV에 접합하기 위해, 정제된 AAV3, AAV5, AAV6 및 AAV8 각각의 3E+9 VG를 20 ul PBS pH 7.2에서 0.17 nmol, 0.52 nmol, 1.73 nmol 및 5.2 nmol DBCO-PEGn-NHS와 실온에서 3시간 동안 반응시켜 최적화된 캡시드 대 링커 비를 확인하여 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 형성한다. 각각의 수득된 표면 작용화된 바이러스 캡시드 생성물을 0.1 nmol의 WGA-PEG4-아지드와 실온에서 1시간 동안 및 4℃에서 밤새 배양하여 상응하는 WGA 표면 변형된 바이러스 캡시드를 생성하였다.
PC12 세포에 대한 시험관내 적용
PC12 세포는 5% 말 혈청, 5% 태아 소 혈청 및 100 U 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃로 유지되었다. PC12 세포는 2시간 동안 PBS에서 전술한 바와 같이 제조된 각각의 WGA 표면 변형된 바이러스 캡시드 생성물의 3E+9 VG와 함께 배양되었다. 그런 다음 배지를 교체하고 세포를 37℃에서 5일 동안 유지한 후 4% PFA에 고정하고 DAPI로 라벨링하고 Zeiss AxioObserver A1 현미경으로 이미징했다. 각 DAPI 양성 세포에서 GFP 형광을 측정하고 각 역가에 대한 평균 +/- SEM으로 플로팅하여 이미지를 분석했다.
결과
PC12 세포는 AAV3, AAV6 및 AAV8와 같은 야생형 AAV 혈청형을 사용하여 형질도입하기 어렵다. 따라서 우리는 WGA에 대한 이러한 AAV 혈청형의 접합이 이 세포 유형에서 AAV 형질도입 효율을 증가시켜 변형되지 않은 야생형 바이러스와 비교하여 바이러스 감염을 촉진하는지 여부를 질문했다. 도 45a, 도 51a 및 도 54a에 도시된 바와 같이, 우리는 변형되지 않은 야생형 AAV 혈청형 AAV3, AAV6 및 AAV8로 처리된 세포에서 GFP 또는 RFP/tdTomato 형광을 검출할 수 없었다. 대조적으로, WGA에 의한 혈청형 AAV3, AAV6 및 AAV8의 표면 변형은 형질도입된 양성 세포가 상이한 반응성 링커 몰량에서 모든 혈청형에 대해 명백하도록 실질적으로 형질도입 효율을 증가시켰다(도 45b 내지 도 45e, 도 46 내지 도 47, 도 51b 내지 도 51e, 도 52 내지 도 53, 도 54b 내지 도 54e, 및 도 55 내지 56).
야생형 AAV5로 처리된 PC12 세포는 AAV3, AAV6 및 AAV8보다 더 높은 형질도입 수준을 나타냈다(도 48a). 본 발명에 따른 WGA를 사용한 AAV5의 표면 개질은 형질도입 효율을 실질적으로 증가시켰다(도 48b 내지 도 48e). 세포는 상이한 몰량의 반응성 링커로 제조된 모든 표면 변형된 바이러스 캡시드 생성물에 대해 tdTomato 양성 세포의 수가 증가함을 나타냈다(도 49 내지 도 50).
실시예 13. 변형된 벡터의 내재화를 위한 AAVR 요건
방법
AAVR KO HEK293 세포의 생성
CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 HEK293 세포에서 AAV 수용체(AAVR) 유전자(KIAA0319L)를 녹아웃시켰다. 요약하면, HEK293 세포를 퓨로마이신 및 하이그로마이신 선별 카세트를 함유하는 spCas9 및 gRNA(ATAGGTGTAACTACGTCACT)(SEQ ID NO: 1) 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 퓨로마이신 및 하이그로마이신을 포함하는 HEK293 배지에서 성장시켰다. 확장 후, AAVR2 녹아웃(KO) HEK293 세포는 AAV2 eGFP 감염 시 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 선택되었다. eGFP 형광에 대해 음성인 세포를 강화하고 퓨로마이신 및 하이그로마이신-배지에서 추가로 확장시켰다. HEK293 세포를 AAV2 eGFP로 감염시키고, FACS 정제하고, 총 4회 확장시켰다.
AAV2에 대한 WGA의 표면 변형 및 가교
표적화 리간드 WGA(1.7 nmol)를 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 100 ul PBS 중의 반응성 링커 아지드-PEG4-NHS(54 nmol)의 20배 몰당량과 반응시켜 작용화된 표적화 리간드를 형성하였다. 미반응 반응성 링커는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거하였다. 작용화된 표적 리간드를 AAV2에 접합시키기 위해, 1E+9 VG 정제된 AAV2를 실온에서 3시간 동안 20 ul PBS pH 7.2에서 0.17 nmol DBCO-PEG4-NHS와 반응시켰다. 수득된 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 0.1 nmol의 WGA-PEG4-아지드와 함께 실온에서 1시간 동안 그리고 4℃에서 밤새 배양하여 "WGA-AAV2" 표면 변형된 바이러스 캡시드를 생성하였다.
AAVR KO HEK293 세포에 대한 시험관 내 적용
WGA-AAV2 또는 변형되지 않은 AAV2를 1E+9 VG 역가로 AAVR KO HEK293에 첨가했다. 형질도입 5일 후, 세포를 이미징하고 ImageJ 오픈 소스 소프트웨어로 정량화했다.
결과
이들 실험에서 우리는 본 개시내용에 따라 변형된 표면을 갖는 AAV 벡터가 세포 진입 및 형질도입을 위한 AAVR 수용체의 요건을 우회할 수 있는지 여부를 조사하고자 했다. 이를 달성하기 위해, AAVR 유전자가 결실된 HEK293 세포주를 생성했다. 정상적인 HEK293 세포에서, 우리는 FACS 분석(도 57) 및 현미경 검사(도 58a)에 의해 나타난 바와 같이 AAV2에 의한 강력한 형질도입을 관찰하였다. AAVR KO에서 AAV2 tdTomato에 의한 HEK293 세포 형질도입은 극적으로 감소되었다(도 58b).
리간드 WGA가 AAVR KO 세포로의 AAV2 진입을 구출하기에 충분한지 여부를 추가로 조사했다. WGA-AAV2 감염이 대조군(AAV2 미변형)과 비교하여 tdTomato 양성 세포의 백분율 및 평균 형광 강도(MFI) 모두에서 유의하게 더 높은 수를 유도한다는 것을 발견했다(도 59a 내지 도 59b 및 도 60a 내지 도 60b). 이것은 WGA로 AAV2를 수정하면 AAVR이 없는 경우에도 벡터가 세포에 들어갈 수 있음을 나타내며, 이는 AAVR 매개 내재화를 우회하고 있음을 시사한다.
실시예 14. 네몰리주맙-SNAP-AAV2ㆍHSPG를 사용한 ScFv 표적화
방법
AAV 생산
재조합 AAV2-ㆍHSPG를 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
네몰리주맙-SNAP의 생산
네몰리주맙의 아미노산 서열은 IMGT/3D 구조 데이터베이스에서 수득하였다(http://imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=10064)(SEQ ID NO: 2). CDR은 상류 GP64 신호 서열, 및 하류 Sortag, SNAP-태그 및 6xHis 태그(SEQ ID NO. 3)를 함유하는 scFv 백본으로 클로닝되었으며, 이는 (도 61)에 예시되어 있다. 이는 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 생산을 위해 pFastBac에 클로닝되었다. 표준 방법을 사용하여 SF9 곤충 세포에서 단백질을 생산하고 친화성 크로마토그래피를 사용하여 세포 배지에서 정제했다.
AAV2-ㆍHSPG 및 네몰리주맙-SNAP의 표면 변형 및 가교
정제된 AAV2-ㆍHSPG의 3E+10 VG를 실온에서 3시간 동안 200 μl PBS pH 7.2에서 17.3 nmol BG-PEG13-NHS(맞춤형 합성)와 반응시켜 BG 작용화된 바이러스 캡시드를 생성했다. 반응물을 100 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 정제하고, 실온에서 밤새 1 nmol 네몰리주맙-SNAP 작용화 리간드와 추가로 배양하여 "네몰리주맙-SNAP::AAV2-ㆍHSPG" 표면 변형된 바이러스 캡시드를 생성했다. 과량의 미반응 리간드는 100 KDa MWCO 원심분리 장치를 2회 통과시켜 제거하고, 표면 변형된 바이러스 캡시드를 PBS에 재현탁시켰다.
생체 내 주사 및 조직 처리
생체 내 주사 실험을 위해, 야생형 마우스를 2 내지 2.5% 이소플루란으로 마취시킨 다음, PBS 10 ul 중 3E+10 VG의 네몰리주맙-SNAP::AAV2-ㆍHSPG를 귀에 피하 주사하였다. 3주 후, 피부를 수확하고 밤새 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 40 μm로 절단했다. 절편을 5% 염소 혈청 + 0.3% Triton-X를 함유하는 PBS에서 토끼 항-K14(Covance 1:200 희석)로 4℃에서 밤새 염색했다. 2차 항-토끼 Alexa488 항체를 1:1000으로 희석하고 어두운 곳에서 실온에서 2시간 동안 배양했다. 슬라이드를 연장 금으로 장착하고 이미지를 Leica SP5 공초점 현미경으로 촬영하고 ImageJ 소프트웨어에서 분석했다.
결과
네몰리주맙은 IL31RA 수용체에 특이적이고 중등도 내지 중증 아토피성 피부염에 대한 임상 시험에서 어느 정도 유망한 것으로 나타났기 때문에 scFv로 선택되었다(1). 네몰리주맙-SNAP::AAV2-ㆍHSPG를 마우스에 피하 주사하고 피부 절편을 각질세포 마커인 K14와 중첩되는지 검사했다. 도 62a, 도 62b 및 도 62c에 도시된 바와 같이, 바이러스에 감염된 세포와 모낭 주위의 K14 양성 각질 세포 사이에 상당한 중복을 관찰했다. 중요한 것은 형광이 마우스에서 8 내지 10일 표피 회전율보다 더 오래 지속되기 때문에(2), 우리의 데이터는 표피 줄기 세포도 이 실험에서 표적이 되고 있음을 나타낸다. 실제로, 트랜스크립토믹스 연구는 IL31RA가 여포 간 및 여포 표피의 기저 각질 세포에서 발현되며, 그 중 다수는 표피 줄기 세포임을 나타낸다(3).
참고문헌
1. Nemoto O, Furue M, Nakagawa H, Shiramoto M, Hanada R, Matsuki S, et al. The first trial of CIM331, a humanized antihuman interleukin-31 receptor A antibody, in healthy volunteers and patients with atopic dermatitis to evaluate safety, tolerability and pharmacokinetics of a single dose in a randomized, double-blind, placebo-controlled study. The British journal of dermatology 2016;174:296-304
2. Potten CS, Saffhill R, Maibach HI. Measurement of the transit time for cells through the epidermis and stratum corneum of the mouse and guinea-pig. Cell Tissue Kinet 1987;20:461-72
3. Joost S, Zeisel A, Jacob T, Sun X, La Manno G, Lonnerberg P, et al. Single-Cell Transcriptomics Reveals that Differentiation and Spatial Signatures Shape Epidermal and Hair Follicle Heterogeneity. Cell Syst 2016;3:221-37 e9
실시예 15. 면역 스텔스 조사 ㆍ 중화 항체 회피
AAV 캡시드 단백질을 인식하는 중화 항체는 AAV-매개 유전자 요법에서 주요 장애물이다. 현재 항-AAV 중화 항체의 역가가 낮더라도 양성 반응을 보이는 환자는 AAV를 유전자 치료 벡터로 사용하는 임상 시험에서 제외된다. 인구의 대략 50%가 어린 나이부터 AAV에 대한 중화 항체를 가지고 있기 때문에, 체액성 면역을 회피/피하는 방법을 찾는 것은 적격 환자 풀을 확대함으로써 상당한 이점을 구성할 것이다. 현재 해당 분야의 많은 연구가 면역 회피 측면에 초점을 맞추고 있다(문헌[Wang M, et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Ther. 2015 Dec; 22(12):984-92.]). 본원에 기재된 반응성 링커 또는 링커와 리간드를 함께 사용하는 AAV의 표면 변형이 항체를 중화함으로써 인식을 감소시킬 수 있다는 가설을 세웠다.
AAV에 대한 체액성 면역에 대한 (i) 상이한 양의 반응성 링커로 바이러스를 작용화하는 것 및 (ii) 바이러스 측만 또는 리간드 및 바이러스 측 모두에 대한 링커 길이의 영향을 시험관 내에서 조사하였다. 첫 번째를 시험하기 위해, 리간드가 없는 상태에서 고정된 길이의 스페이서를 포함하는 다양한 몰량의 링커로 작용화된 야생형 AAV2에 대한 인간 IgG 결합 및 중화를 시험했다. 두 번째로, 고정된 양의 개별 PEG(dPEG) 및 분산 PEG(pPEG) 스페이서로 작용화된 AAV2에 대한 인간 IgG 결합 및 중화, 그리고 고정된 양의 개별 PEG(dPEG) 및 분산 PEG로 작용화된 WGA에 접합되지 않거나 접합된 상태로 남은 (pPEG) 스페이서를 시험했다. 중화는 야생형 AAV2 감염에 대해 다르게 허용되는 세포주 또는 1차 세포에서 시험되었다.
재료
AAV 벡터
tdtomato 카고를 갖는 재조합 AAV2는 HEK293T 세포에서 생성되었다. 형질감염 3일 후 세포를 수확하고, RNase의 존재 하에 Triton X-100으로 용해시켰다. 재조합 AAV2는 접선 흐름 여과에 의해 농축되었고 등밀도 초원심분리를 사용하여 정제되었다(Grieger 2006). 바이러스 카고의 ITR 영역을 표적으로 하는 프라이머와 함께 qPCR을 사용하여 AAV 적정을 수행했다(Dias 2015).
인간 풀 혈청 및 마우스 혈청
인간 풀 혈청은 Sigma(Cat. Nr.: H4522-20ML)에서 구입했다. 인간 혈청은 불활성 보체 또는 기타 비항체 바이러스 억제 인자에 대해 열 불활성화되었고 추가 사용을 위해 냉동 보관되었다. AAV2의 전신 주사 4주 후 마우스로부터 마우스 혈청을 수집하였다. 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 실온에서 30분 동안 방치하여 응고시켰다. 미리 냉각된 원심분리기에서 10분 동안 2000 g에서 원심분리 단계에 의해 덩어리를 제거했다. 혈청으로 이루어진 상등액을 수집하고 56℃에서 30분 동안 열 불활성화시켰다. 혈청은 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다.
방법
상이한 바이러스 대 반응성 링커 비를 사용하여 DBCO-PEG(12)-NHS 링커로 바이러스(AAV2)의 표면 변형
이전 실험에서 수행된 바와 같이, 0.52 nmol, 1.73 nmol, 5.2 nmol, 17.3 nmol, 52 nmol 또는 173.3 nmol DBCO-PEG(12)-NHS 링커를 실온에서 3시간 동안 20 ul PBS, pH 7.2에서 3E+9 VG AAV2에 접합시켰다.
PEG(n)-아지드-NHS 작용화된 WGA를 DBCO-PEG(n) 작용화된 AAV2 탐색 PEG 길이와 가교
실시예 9와 유사하게, 야생 AAV2 캡시드를 캡시드 반응성 DBCO-PEGn-NHS 링커(여기서 n은 4 또는 2k임)로 작용화하여 각각 "4 바이러스" 또는 "5k 바이러스" 작제물을 생성하였다. WGA 리간드는 리간드 반응성 아지드-PEGn-NHS 링커(여기서 n은 4 또는 5K)로 작용화되어 각각 "4 리간드" 또는 "5k 리간드"를 생성한다. 구체적으로, WGA(1.7 nmol)를 실온에서 3시간 동안 pH 7.2에서 100 ul PBS에서 아지드-PEGn-NHS(54 nmol)의 20배 몰당량과 반응시켰다. 미반응 링커는 10 KDa 분자 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 제거하였다. 0.1 nmol의 WGA-PEG(n)-아지드를 실온에서 1시간 동안 그리고 추가로 4℃에서 하룻밤 동안 가교 반응에서 표면 변형된 바이러스와 조합하였다.
ELISA
효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 AAV2-특이적 IgG 항체를 검출하였다. 96-웰 ELISA 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 1x10^9 vg/웰의 농도로 코팅 완충액(H2O 중 37 mM Na2CO3, 63 mM NaHCO3; pH 9.6)에 희석된 AAV2 입자로 코팅했다. 플레이트를 세척 완충액(0.05% Tween20을 포함하는 PBS)으로 3회 세척했다. 차단 용액(0.05% Tween20 및 5% 무지방 분유를 포함하는 PBS)을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 차단 플레이트를 세척 완충액으로 1회 세척하였다. 혈청 희석물을 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고 희석 완충액(0.05% Tween20 및 1% 무지방 분유를 포함하는 PBS)에 희석된 IgG에 대한 HRP-접합된 2차 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고 HRP의 기질인 TMB를 첨가하였다. 반응을 정지시키기 위해 산성 산을 함유한 정지 용액을 첨가하고 흡광도(광학 밀도 단위, OD로 표시)를 분광 광도계로 450 nm에서 측정했다. OD 값은 배경을 뺀 후 보고되며 고정화 항원(AAV)에 대한 항체의 결합 정도와 상관관계가 있다.
HEK293T 세포(허용 세포주)를 사용한 중화 검정
HEK293T 세포는 37℃ 및 5% CO2에서 5% FBS 및 100U 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM+Glutamax에서 유지되었다. 검정을 위해, 세포를 96-웰당 3x10^4개 세포로 시딩하고 AAV 바이러스를 37℃에서 1시간 동안 인간 또는 마우스 혈청의 2배 연속 희석액과 함께 사전 배양한 후 1000의 MOI로 첨가했다. 72시간 후 형질도입된 세포의 형광을 BioRad의 S3e 세포 분류기를 사용하여 유세포 분석으로 분석했다.
PC12 세포(허용성이 낮은 세포주)를 사용한 중화 검정
PC12 세포는 10% 말 혈청, 5% FBS 및 100U 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지되었다. 검정을 위해, 세포를 96-웰당 3x10^4개 세포로 시딩하고 AAV 바이러스를 37°C에서 1시간 동안 마우스 혈청의 2배 연속 희석액과 함께 사전 배양한 후 MOI 1000으로 첨가했다. 5일 후 Zeiss AxioObserver A1 현미경으로 형질도입된 세포의 형광을 획득했다.
1차 후근 신경절(DRG) 뉴런을 사용한 중화 검정
37℃에서 1시간 동안 폴리-L-라이신 용액(스톡 농도: 1 mg/ml, H2O로 1:10 희석) 15 μl 방울로 유리 바닥 접시를 코팅하였다. 1시간 후 방울을 제거하고 접시를 PBS로 2회 세척했다. 그런 다음 PBS에 1:50으로 희석된 Matrigel 15 μl를 접시에 첨가하고 37℃에서 배양했다. 세포를 시딩하기 전에 Matrigel 방울을 제거하고 접시를 공기 건조했다. 그 후 DRG는 성체 마우스로부터 단리되었다. 1차 세포(주로 뉴런 및 위성 세포)는 37℃에서 25분 동안 DRG의 콜라게나제 처리 후 세척 및 트립신과의 배양 단계에 의해 추가로 단리되었다. 500 μl의 완전 배지로 반응을 중단하고 세포 현탁액을 여과하고 원심분리하고 세포 배양 배지에 재현탁했다. 10 μl의 세포 현탁액을 각 접시에 첨가하였다. 1시간 후 100 μl의 배지를 부드럽게 하였다. 다음날 배지를 제거하고 200 μl의 신선한 배지를 접시에 첨가했다. 다음날 배지는 FBS가 없는 DMEM + Pen/Strep 100 μl로 변경되었다. 15분 후 무혈청 배지를 제거하고 혈청과 미리 배양한 변형되지 않은 PEG4-DBCO:아지드-PEG4-WGA 변형 바이러스를 세포에 첨가하고 15분 후에 배지 50 μl를 첨가했다. 다음날 DMEM/F12 배지 2 ml를 각 접시에 첨가했다. 형질도입된 세포의 이미징은 공초점 현미경으로 5일 후에 수행되었다.
결과
도 63a 및 도 63b에서, 본 발명자들은 상이한 양의 링커 DBCO-PEG4로 AAV2를 화학적으로 변형시키고 AAV2에 대한 항체를 함유하는 인간 풀 혈청으로 ELISA를 수행하였다(도 63a). 우리의 가설에 따르면, 바이러스당 링커의 양을 증가시키면 링커의 최고량(173.3 nmol)과 최저량(0.52 nmol)을 비교하여 OD 신호의 거의 80% 감소로 나타난 바와 같이 IgG 항체에 의한 바이러스 인식이 감소한다. 그러나, 이러한 증가된 링커 양에서는 바이러스의 형질도입 효율이 크게 감소한다. 이들 데이터는 본원의 확립된 실시예 8 및 9와 같이 향상된 형질도입 효율을 제공하는 것으로 나타난 작제물을 생성하기 위해 사용된 링커 대 바이러스 비에서 항체에 의한 바이러스 인식이 스페이서 길이와 결합 사이의 역상관 관계로 영향을 받는다는 것을 나타낸다.
우리는 또한 HEK293T 세포에서 중화 분석을 수행하여 증가된 링커 양에서 관찰된 DBCO-PEG12 링커를 사용하여 AAV2에 결합하는 감소된 IgG가 중화 활성의 손실과 상관관계가 있는지를 추가로 설명했다(도 63b). 도 63b에 도시된 바와 같이, 항체의 중화능은 바이러스의 3E+9 VG당 0.52 nmol, 1.73 nmol, 5.2 nmol, 17.3nmol, 52 nmol 또는 173.3 nmol의 링커 양(특히 향상된 형질도입과 여전히 호환되는 양)으로 제조된 작제물에 의해 영향을 받지 않았다. 따라서, 항체 결합의 감소에도 불구하고, 형질도입을 향상시키는 양립가능한 링커의 양에 의한 바이러스 작용화는 중화로부터 벗어날 가능성이 없다.
추가로 바이러스에만 부착된 링커 부분 또는 바이러스 및 리간드 둘 다에서 PEG 스페이서 길이를 증가시키는 것이 항체에 의한 인식에 영향을 미치는지 여부를 조사했다. DBCO-PEG4-NHS("4-바이러스"), DBCO-PEG2000-NHS("2K-바이러스")로 바이러스를 변형했으며 뿐만 아니라 먼저 DBCO-PEG4-NHS 링커로 표면 작용화되고 WGA-PEG5000-아지드로 가교결합하여 바이러스를 변형했으며("4-바이러스 5K 리간드"), 먼저 DBCO-PEG2000-NHS 링커로 표면 작용화되고 WGA-PEG4-아지드와 가교결합하여 바이러스를 변형했다("2K-바이러스 4 리간드")(도 64a). PEG 스페이서 길이를 증가시킴으로써, ELISA에 의한 항체에 의한 AAV의 인식에서 차이가 없음을 관찰하였다(도 64a). 따라서, DBCO-PEGn-NHS 링커의 PEG 길이를 증가시키거나 WGA-PEG-아지드의 PEG 길이를 변화시켜도 중화능의 차이는 없었다(도 64b 내지 도 64c).
고도로 허용적인 HEK293T 세포주를 사용하여 중화 검정에서 어떤 변화도 관찰하지 않았기 때문에, 우리는 덜 허용적인 뉴런 세포주 PC12 세포(도 65) 및 1차 DRG(도 66)로 변경했다. 이 실험에서 우리는 바이러스를 DBCO-PEG4-NHS로 표면 변형한 다음 WGA-PEG4-아지드와 가교 결합하고 표면 변형된 바이러스를 AAV2에 대한 항체를 함유하는 마우스 혈청의 일련의 희석액과 함께 배양했다. 도 65에 도시된 바와 같이, PC12 세포에서 변형되지 않은 AAV에 의한 형질도입은 시험된 모든 혈청 희석액에서 차단되는 반면, WGA 변형된 바이러스는 희석 1:16에서 시작하는 중화 항체에 의해 인식을 피하며, 이론에 얽매이지 않고, WGA 표면 변형된 바이러스가 다른 경로를 사용하여 PC12 세포에 들어갈 가능성을 제안하여 항체에 의한 억제를 우회한다. 본 발명자들은 또한 이 중화 검정을 DRG 배양물에 적용하였고 또한 여기에서 변형되지 않은 AAV2를 완전히 중화시킨 혈청 희석액에서 WGA 표면 변형된 바이러스의 탈출을 보여주었다(도 66).
서열목록
SEQ ID NO: 1
ATAGGTGTAACTACGTCACT
SEQ ID NO: 2 - 네몰리주맙의 아미노산 서열
ATGGTTTCTGCTATCGTGCTGTACGTGCTGCTGGCTGCTGCAGCTCACTCCGCTTTCGCTCAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGTGCTGAAGTGAAGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGTTACACTTTCACCGGCTACATCATGAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTCGAATGGATGGGCCTGATCAACCCCTACAACGGTGGCACCGACTACAACCCTCAGTTCCAGGACCGTGTGACCATCACCGCTGACAAGTCCACCTCCACCGCTTACATGGAACTGTCCAGCCTGCGTTCCGAGGACACCGCTGTTTACTACTGCGCTCGTGACGGTTACGACGACGGTCCCTACACTCTGGAAACCTGGGGACAGGGTACTCTGGTCACCGTGTCATCTGGTGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGTGGTGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCTTCAGTGGGCGACCGTGTCACTATCACTTGCCAGGCTTCCGAGGATATCTACTCCTTCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACAACGCTCAGACTGAGGCTCAGGGTGTCCCCTCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCTGGAACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCTACCTACTACTGCCAGCACCACTACGACTCCCCACTGACTTTCGGTGGTGGCACCAAGGTCGAGATCAAGTCCTCCTCCTCCGGATCTTCCTCCTCTGGTTCTGCTGCTCTGCCCGAGACTGGTGGTACCCATCACCATCATCATCACTAA
SEQ ID NO: 3 - 네몰리주맙 SNAP의 합성된 아미노산 서열
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
GYIMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGGTDYNPQFQDRVTITADKSTSTAY
MELSSLRSEDTAVYYCARDGYDDGPYTLETWGQGTLVTVSSGGGGSGGGG
SGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYSFVAWYQQKPGKAP
KLLIYNAQTEAQGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYDS
PLTFGGGTKVEIKSSSSGSSSSGSAALPETGGTMDKDCEMKRTTLDSPLG
KLELSGCEQGLHEIKLLGKGTSAADAVEVPAPAAVLGGPEPLMQATAWLN
AYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQQESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISYQQL
AALAGNPAATAAVKTALSGNPVPILIPCHRVVSSSGAVGGYEGGLAVKEW
LLAHEGHRLGKPGLCTHHHHHH
등가물 및 참조에 의한 통합
본 발명은 특히 바람직한 실시형태 및 다양한 대체 실시형태를 참조하여 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 형태 및 세부 사항에 대한 다양한 변경이 이루어질 수 있음은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
본 명세서의 본문 내에서 인용된 모든 참고 문헌, 발행된 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다.
PCT/EP2020/062713은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY LABORATORY BOREA THERAPEUTICS S.R.L. <120> MODIFIED VIRAL PARTICLES FOR GENE THERAPY <130> P207315WO <140> PCT/EP2021/081424 <141> 2021-11-11 <150> 63/112,457 <151> 2020-11-11 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 ataggtgtaa ctacgtcact 20 <210> 2 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 atggtttctg ctatcgtgct gtacgtgctg ctggctgctg cagctcactc cgctttcgct 60 caagtgcagc tggtgcagtc cggtgctgaa gtgaagaaac ccggtgcttc cgtgaaggtg 120 tcctgcaagg cttccggtta cactttcacc ggctacatca tgaactgggt ccgacaggct 180 cctggacagg gactcgaatg gatgggcctg atcaacccct acaacggtgg caccgactac 240 aaccctcagt tccaggaccg tgtgaccatc accgctgaca agtccacctc caccgcttac 300 atggaactgt ccagcctgcg ttccgaggac accgctgttt actactgcgc tcgtgacggt 360 tacgacgacg gtccctacac tctggaaacc tggggacagg gtactctggt caccgtgtca 420 tctggtggtg gcggttctgg cggtggtggt agcggaggtg gtggttctga catccagatg 480 acccagtctc catcctctct gtccgcttca gtgggcgacc gtgtcactat cacttgccag 540 gcttccgagg atatctactc cttcgtggct tggtatcagc agaagcccgg caaggctccc 600 aagctgctga tctacaacgc tcagactgag gctcagggtg tcccctctcg tttctccggt 660 tccggttctg gaaccgactt taccctgacc atcagctccc tgcagcctga ggacttcgct 720 acctactact gccagcacca ctacgactcc ccactgactt tcggtggtgg caccaaggtc 780 gagatcaagt cctcctcctc cggatcttcc tcctctggtt ctgctgctct gcccgagact 840 ggtggtaccc atcaccatca tcatcactaa 870 <210> 3 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 35 40 45 Phe Thr Gly Tyr Ile Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Gln Phe Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Leu 115 120 125 Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Phe Val Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Gln 195 200 205 Thr Glu Ala Gln Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser 260 265 270 Gly Ser Ala Ala Leu Pro Glu Thr Gly Gly Thr Met Asp Lys Asp Cys 275 280 285 Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu Gly Lys Leu Glu Leu 290 295 300 Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys Leu Leu Gly Lys Gly 305 310 315 320 Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala Pro Ala Ala Val Leu 325 330 335 Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Ala Thr Ala Trp Leu Asn Ala Tyr 340 345 350 Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro Val Pro Ala Leu His 355 360 365 His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg Gln Val Leu Trp Lys 370 375 380 Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile Ser Tyr Gln Gln Leu 385 390 395 400 Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Ala Ala Thr Ala Ala Val Lys Thr Ala 405 410 415 Leu Ser Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro Cys His Arg Val Val 420 425 430 Ser Ser Ser Gly Ala Val Gly Gly Tyr Glu Gly Gly Leu Ala Val Lys 435 440 445 Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu Gly Lys Pro Gly Leu 450 455 460 Cys Thr His His His His His His 465 470 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 4 His His His His His His 1 5

Claims (49)

  1. 표면 변형된 바이러스 캡시드로서,
    상기 표면 변형된 바이러스 캡시드는, 링커를 통해 바이러스 캡시드 단백질에 공유 결합으로 접합된 리간드 중 하나 이상을 포함하고
    상기 링커는 가교제 반응성 쌍의 제1 및 제2 구성원 사이의 반응에 의해 형성되는 가교 모이어티; 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서;를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가교제 반응성 쌍의 제1 및 제2 구성원이 하기로부터 선택된 반응에 참여하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드: Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 시클로첨가(CuAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-아지드 시클로첨가(SPAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-니트론 시클로첨가(SPANC) 반응, 역 전자 요구 디엘스-알더(IEEDD) 반응, 및 슈타우딩거 라이게이션 및 [4+1] 시클로첨가 반응.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가교 모이어티는 8원 고리 및 트리아졸 고리 중 적어도 하나를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  4. 제2항에 있어서, 상기 반응은 변형-촉진 알킨-아지드 시클로첨가(SPAAC) 반응인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교제 반응성 쌍이 시클로옥틴 및 아지드를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 시클로옥틴이 디벤질시클로옥틴(DIBO), 디벤조아자시클로옥틴(DBCO), 및 바이아릴아자시클로옥티논 (BARAC), 또는 이들의 유도체로부터 선택되는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 시클로옥틴이 DBCO인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교 모이어티는 하기 구조를 포함하고,
    Figure pct00049

    상기 식에서 R1 및 R2는 링커에 대한 부착점을 나타내는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  9. 제2항에 있어서, 상기 반응이 역 전자 요구 디엘스-알더(IEEDD) 반응인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  10. 제1항, 제2항 및 제9항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교제 반응성 쌍이 트랜스시클로옥텐 및 테트라진을 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  11. 제1항, 제2항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교 모이어티는 하기 구조를 포함하고,
    Figure pct00050

    상기 식에서 R1 및 R2는 링커에 대한 부착점을 나타내는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 하나 이상의 스페이서를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 스페이서가 폴리에틸렌 글리콜의 1 내지 20개의 단량체를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 스페이서가 폴리에틸렌 글리콜의 2 내지 8개의 단량체를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 스페이서 중 하나에서 폴리에틸렌 글리콜의 4개의 단량체를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  16. 제15항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 4개의 단량체를 포함하는 2개의 스페이서를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 세포 유형 특이적 리간드인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 사이토카인, 성장 인자, 렉틴, 독소, 단일 사슬 항체, 다중 사슬 항체 또는 항원 결합 항체 단편, 펩티드 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  19. 제1항에 있어서, 상기 링커가 캡시드 단백질 1차 서열의 1차 아미노기에 공유적으로 부착되는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 1차 아미노기는 N-말단 아미노기, 라이신 입실론 아미노기 및 아르기닌 아미노산기로부터 선택되는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 1차 아미노기는 라이신 아미노산 잔기의 입실론 아미노기인, 표면 개질된 바이러스 캡시드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 리간드의 1차 아미노기를 통해 리간드에 공유적으로 부착되는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 표적 리간드의 1차 서열의 비천연 아미노산 잔기를 통해 표적 리간드에 공유적으로 부착되는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  24. 제23항에 있어서, 상기 비천연 아미노산 잔기는 하기로부터 선택된 반응에 참여하는 가교제 반응성 쌍의 구성원을 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드: Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 시클로첨가(CuAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-아지드 시클로첨가(SPAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-니트론 시클로첨가(SPANC) 반응, 역 전자 요구 디엘스-알더(IEEDD) 반응, 슈타우딩거 라이게이션 및 [4+1] 시클로첨가 반응.
  25. 제24항에 있어서, 상기 가교제 반응성 쌍이 아지드, 시클로옥틴, 시클로옥텐 또는 1,2,4,5 테트라진 모이어티를 포함하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드의 단백질 서열이 포유류 세포 다당류 또는 프로테오글리칸에 대한 캡시드의 결합을 약화시키거나 없애도록 돌연변이된, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드의 단백질 서열이 포유류 세포 다당류 또는 프로테오글리칸에 대한 캡시드 단백질의 결합을 약화시키거나 없애도록 돌연변이되지 않은, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 동일한 캡시드 단백질 서열을 갖는 비변형 바이러스 캡시드에 비해 증가된 감염성을 특징으로 하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  29. 제1항 내지 제28항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드는 아데노바이러스 캡시드, 아데노 관련 바이러스 캡시드, 레트로바이러스 캡시드, 렌티바이러스 캡시드, 단순 헤르페스 바이러스 캡시드 및 바쿨로바이러스 캡시드로부터 선택되는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  30. 제29항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드가 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  31. 제30항에 있어서, 상기 VP1의 585 및 588에 있는 아르기닌 잔기, 또는 VP2 또는 VP3의 유사 위치에 있는 아르기닌 잔기 중 적어도 하나가 돌연변이된, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  32. 제31항에 있어서, 상기 VP1의 585 및 588에 있는 아르기닌 잔기가 알라닌 잔기로 돌연변이된, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 비변형된 바이러스 캡시드와 비교하여 변경된 향성(tropism)을 특징으로 하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면 변형된 바이러스 캡시드가 이미 존재하는 중화 항체의 회피를 입증하는, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  35. 화학식 I에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드로서,
    Figure pct00051

    상기 식에서,
    Figure pct00052
    는 바이러스 캡시드이고;
    Y 및 Y'는 독립적으로 부착 모이어티이고;
    n 및 n'은 독립적으로 0 또는 1 내지 50의 정수이고;
    Sp 및 Sp'는 독립적으로 선택적인 스페이서이고;
    L은 리간드이고;
    x는 1 내지 500 범위의 캡시드당 리간드 비이고; 및
    Q는 하기로부터 선택되고,
    Figure pct00053
    또는
    Figure pct00054

    상기 식에서, Z는 7 또는 8원 시클릭 또는 헤테로환 구조인, 표면 변형된 바이러스 캡시드
  36. 제35항에 있어서, x가 100 내지 200 범위인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  37. 제35항에 있어서, x가 130 내지 170 범위인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  38. 화학식 I-1에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드로서,
    Figure pct00055

    상기 식에서,
    Figure pct00056
    는 바이러스 캡시드이고;
    n 및 n'은 독립적으로 0 내지 30으로부터 선택되는 정수이고;
    T는 리간드이고; 및
    x는 1 내지 500의 정수인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  39. 제38항에 있어서, x가 100 내지 200 범위인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  40. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡시드 당 리간드 비(x)가 130 내지 170 범위인, 표면 변형된 바이러스 캡시드.
  41. 적어도 하나의 재조합 비리온을 포함하는 약학 조성물로서, 상기 재조합 비리온은 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드 및 재조합 폴리뉴클레오티드 카고를 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 가용화제, 충전제, 보존제, 부형제 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  42. 재조합 폴리뉴클레오티드 카고의 세포내 전달에 의해 치료가능한 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서,
    치료적 유효량의 제41항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 재조합 폴리뉴클레오티드 카고는 질환을 치료할 수 있는, 방법.
  43. 재조합 폴리뉴클레오티드 카고의 세포내 전달에 의해 치료가능한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 조성물로서,
    치료적 유효량의 제41항에 따른 약학 조성물을 포함하고,
    상기 재조합 폴리뉴클레오티드 카고는 질환을 치료할 수 있는, 조성물.
  44. 재조합 폴리뉴클레오티드 카고의 세포내 전달에 의해 치료가능한 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 표면 변형된 바이러스 캡시드의 용도.
  45. 표면 작용화된 바이러스 캡시드로서, 상기 표면 작용화된 바이러스 캡시드는, 가교제 반응성 쌍의 제1 구성원 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서를 포함하며, 상기 표면 작용화된 바이러스 캡시드는 가교제 반응성 쌍의 제2 구성원 및 선택적으로 하나 이상 스페이서를 포함하는 작용화 리간드와의 반응에 적합하고, 상기 가교제 반응성 쌍의 구성원은 하기로부터 선택되는 반응에 참여하는, 표면 작용화된 바이러스 캡시드: Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 시클로첨가(CuAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-아지드 시클로첨가(SPAAC) 반응, 변형-촉진 알킨-니트론 시클로첨가(SPANC) 반응, 역 전자 요구 디엘스-알더(IEEDD) 반응, 및 슈타우딩거 라이게이션 및 [4+1] 시클로첨가 반응.
  46. 표면 변형된 바이러스 캡시드의 제조 방법으로서,
    i) 바이러스 캡시드 단백질을 캡시드 반응성 링커와 반응시켜 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 수득하는 단계로서, 링커는 가교제 반응성 쌍의 제1 구성원 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서를 포함하는 단계;
    ii) 표면 작용화된 바이러스 캡시드를 가교제 반응성 쌍의 제2 구성원 및 선택적으로 하나 이상의 스페이서를 포함하는 작용화된 리간드와 접합시키는 단계;를 포함하고,
    상기 가교제 반응성 쌍의 제1 및 제2 구성원은 반응하여 가교 모이어티 Q를 형성하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 표면 변형된 바이러스 캡시드가 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따르는, 방법.
  48. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 표면 변형된 캡시드를 포함하는 재조합 비리온.
  49. 제48항에 있어서, 상기 재조합 비리온이 rAAV인, 재조합 비리온.
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