JP7203873B2 - ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を有する操作されたメガヌクレアーゼ - Google Patents
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-
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-
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-
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-
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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-
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Description
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、2015年12月23
日に出願された「ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を有する操作さ
れたメガヌクレアーゼ」と題された米国仮特許出願第62/387318号及び2016
年11月2日に出願された「ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を有
する操作されたメガヌクレアーゼ」と題された米国仮特許出願第62/416513号に
基づく優先権を主張する。
2ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を認識及び切断するように操作された組換
えメガヌクレアーゼに関する。本開示は更に、遺伝子改変真核細胞を作製する方法におけ
るこのような組換えメガヌクレアーゼの使用、及びβ-2ミクログロブリンの細胞表面発
現が低下した遺伝子改変細胞の集団に関する。
本出願と共に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表の紙コピーが提出
されている。この紙コピーは、同様にその全体が参照により本明細書に組み込まれるAS
CII形式のコピーに対応する。2016年12月20日に作成された前記ASCIIコ
ピーは、2000706-00181WO1.txtという名前で、サイズが74169
3バイトである。
の腫瘍関連抗原に対するそれらの特異性を高めるために遺伝子改変された単離されたヒト
T細胞を利用する。遺伝子改変は、抗原特異性をT細胞に移植するためのキメラ抗原受容
体(CAR)又は外因性T細胞受容体の発現を含み得る。外因性T細胞受容体とは対照的
に、CARはモノクローナル抗体の可変ドメインからその特異性を得る。従って、CAR
を発現するT細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)非制限様式で腫瘍免疫反応性
を誘導する。今日まで、T細胞養子免疫療法は、B細胞悪性腫瘍(例えば、急性リンパ芽
球性白血病(ALL)、B細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)、及び慢性リンパ球性白血
病)、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膠芽腫、進行した神経膠腫、卵巣がん、中皮腫、黒
色腫、及び膵がんを含むいくつかのがんのための臨床療法として利用されている。
織と同種異系CAR T細胞との間のアロ反応性によって制限されてきた。アロ反応性の
1つの原因は、CAR T細胞の細胞表面上の非宿主MHCクラスI分子の存在に起因す
る。MHCクラスI分子は、2つのポリペプチド鎖α及びβからなる。ヒトでは、α鎖が
、第6染色体上の多型ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子によってコードされるα1、α2
、及びα3の3つのサブユニットからなる。同種異系CAR T細胞は外来MHCクラス
I分子を有するので、HLA遺伝子座及びコードされたα鎖サブユニットの可変性は、同
種異系CAR T細胞を、宿主免疫系によって外来細胞として見えるようにし得る。結果
として、患者に投与されたCAR T細胞は宿主対移植片(HvG)拒絶を受け、宿主の
細胞傷害性T細胞によって認識され、死滅させられ得る。
M)遺伝子(配列番号1)によってコードされるβ-2ミクログロブリンからなる。β-
2ミクログロブリンはα3サブユニットに非共有結合し、全てのMHCクラスI分子に共
通である。更に、細胞表面でのMHCクラスI分子の発現は、β-2ミクログロブリンと
の会合を必要とする。よって、β-2ミクログロブリンは、CAR T細胞上のMHCク
ラスI分子の発現を抑制するための論理的標的となり、細胞を宿主細胞傷害性T細胞に見
えなくし、アロ反応性を低下させ得る。
発現である。T細胞受容体は、典型的には、可変α鎖及びβ鎖、又はより少数の可変γ鎖
及びδ鎖からなる。T細胞受容体は、CD3を含むアクセサリータンパク質と複合体化し
、細胞表面共受容体(例えば、CD4及びCD8)と共に機能して、抗原提示細胞上のM
HC分子に結合した抗原を認識する。同種異系CAR T細胞の場合、内因性T細胞受容
体の発現が、患者への投与後に細胞に宿主MHC抗原を認識させ、移植片対宿主病(GV
HD)の発症をもたらし得る。
て、キメラ抗原受容体を組み込み、次いで、同じ対象に再注入する自家CAR T細胞の
使用に大きく焦点を当てている。自家アプローチは、投与されたCAR T細胞に免疫寛
容を提供するが、このアプローチは、患者のがんが診断された後に患者特異的CAR T
細胞を作製するのに必要な時間と費用の両方によって制約される。
ン及びMHCクラスI分子の発現を欠く同種異系CAR T細胞の開発が必要とされてい
る。
切断するように操作された組換えメガヌクレアーゼを提供する。このようなメガヌクレア
ーゼは、β-2ミクログロブリン遺伝子を破壊し、結果として、内因性MHCクラスI受
容体の発現及び/又は機能を破壊するために有用である。メガヌクレアーゼ切断は、非相
同末端結合の突然変異誘発作用によって、又は相同組換えを介して外因性ポリヌクレオチ
ドの遺伝子への導入を促進することによって遺伝子機能を破壊することができる。本開示
は更に、遺伝子改変真核細胞を作製するために、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は
組換えメガヌクレアーゼをコードする遺伝子の真核細胞への送達を含む方法を提供する。
/又は内因性T細胞受容体の発現を更に欠くので、アロ反応性でなく、HvG拒絶もGV
HDも誘発しない、第三者ドナーからのT細胞を用いて調製された、「既製の」CAR
T細胞を提供する。このような製品は、診断に先立って作製及び検証され、必要に応じて
すぐに患者に利用可能にすることができる。
れた、部位特異的、希少切断、ホーミングエンドヌクレアーゼ(「メガヌクレアーゼ」と
も呼ばれる)の使用に関する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノム
に一般的に見られる15~40塩基対切断部位を認識する天然ヌクレアーゼの群である。
これらは、1群自己スプライシングイントロン及びインテイン等の寄生性DNAエレメン
トとしばしば関連している。これらは、染色体に二本鎖破壊を生じさせることによって宿
主ゲノムの特定の位置での相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進し、細胞のDNA修復
機構を補充する(Stoddard(2006)、Q.Rev.Biophys.38:
49~95)。ホーミングエンドヌクレアーゼは、通常、LAGLIDADG(配列番号
11)ファミリー、GIY-YIGファミリー、His-Cysボックスファミリー及び
HNHファミリーの4つのファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及
び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、LAGLIDADG(配
列番号11)ファミリーのメンバーは、保存されたLAGLIDADG(配列番号11)
モチーフの1つ又は2つのコピーを有することを特徴とする(Chevalierら(2
001)、Nucleic Acids Res.29(18):3757~3774)
。LAGLIDADG(配列番号11)モチーフの単一コピーを有するLAGLIDAD
G(配列番号11)ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成するが、LAGL
IDADG(配列番号11)モチーフの2つのコピーを有するメンバーは単量体として見
出される。
ある。I-CreI(配列番号10)は、藻類コナミドリムシ(Chlamydomon
as reinhardtii)の葉緑体染色体中の22塩基対の認識配列を認識及び切
断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのLAGLIDADG(配列番号11)ファミリ
ーのメンバーである。野生型I-CreI切断部位の優先性を改変するために、遺伝子選
択技術が使用されている(Sussmanら(2004)、J.Mol.Biol.34
2:31~41;Chamesら(2005)、Nucleic Acids Res.
33:e178;Seligmanら(2002)、Nucleic Acids Re
s.30:3870~9、Arnouldら(2006)、J.Mol.Biol.35
5:443~58)。より最近では、哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウイルスゲノム
中の部位を含む広く多岐にわたるDNA部位を標的とするI-CreI及び他のホーミン
グエンドヌクレアーゼを包括的に再設計することができる、モノ-LAGLIDADG(
配列番号11)ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載された(国
際公開第2007/047859号パンフレット)。
-CreI及びその操作された誘導体は、通常二量体であるが、第1のサブユニットのC
末端を第2のサブユニットのN末端に結合する短いペプチドリンカーを用いて単一ポリペ
プチドに融合することができる(Liら(2009)Nucleic Acids Re
s.37:1650~62;Grizotら(2009)Nucleic Acids
Res.37:5405~19)。従って、機能的「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一
転写産物から発現され得る。このような操作されたメガヌクレアーゼは、極めて頻度の低
いオフターゲット切断を示す。一本鎖メガヌクレアーゼをコードする遺伝子を細胞に送達
することによって、β-2ミクログロブリン遺伝子を特異的且つ優先的に標的化、切断、
及び破壊することが可能である。
レアーゼの使用は、国際公開番号WO2008/102199号パンフレット(「199
号出願」)及び国際公開第2008/102274号パンフレット(「274号出願」)
で以前開示された。199号出願及び274号出願はそれぞれ、β-2ミクログロブリン
遺伝子に見られる認識配列に関するメガヌクレアーゼの選択性を増加させることを意図し
たアミノ酸置換を有するI-CreI変異体を開示している。しかしながら、記載された
メガヌクレアーゼは、酵母又はCHOレポーター細胞系におけるβ-2ミクログロブリン
DNA標的に対する活性を有することしか示されなかった。本開示は、ヒトT細胞のβ-
2ミクログロブリン遺伝子の認識配列を効率的に標的化及び切断する組換えメガヌクレア
ーゼを提供することによって、先行技術の教示を改善する。
の認識配列を認識及び切断する組換えメガヌクレアーゼを提供する。このような組換えメ
ガヌクレアーゼは、第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、第1のサブユニ
ットは認識配列の第1の認識半部位に結合し、第1の超可変(HVR1)領域を含み、第
2のサブユニットは認識配列の第2の認識半部位に結合し、第2の超可変(HVR2)領
域を含む。
。
2~96のいずれか1つの残基198~344又は配列番号97~100のいずれか1つ
の残基7~153と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少な
くとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第2のメガヌクレアーゼサブユ
ニットが、配列番号12~96のいずれか1つの残基7~153又は配列番号97~10
0のいずれか1つの残基198~344と少なくとも80%、少なくとも85%、少なく
とも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
1つの215位;又は(b)配列番号97~100のいずれか1つの24位に相当する位
置にYを含む。別のこのような実施形態では、HVR1領域が、(a)配列番号12~9
6のいずれか1つの261位;又は(b)配列番号97~100のいずれか1つの70位
に相当する位置にFを含む。別のこのような実施形態では、HVR1領域が、(a)配列
番号12~96のいずれか1つのそれぞれ215位及び261位;又は(b)配列番号9
7~100のいずれか1つのそれぞれ24位及び70位に相当する位置にY及びFの1又
は複数を含む。
1つの24位;又は(b)配列番号97~100のいずれか1つの215位に相当する位
置にYを含む。別のこのような実施形態では、HVR2領域が、(a)配列番号12~9
6のいずれか1つの42位;又は(b)配列番号97~100のいずれか1つの233位
に相当する位置にYを含む。別のこのような実施形態では、HVR2領域が、(a)配列
番号97~100のいずれか1つのそれぞれ24位及び42位;又は(b)配列番号97
~100のいずれか1つのそれぞれ215位及び233位に相当する位置にY及びYの1
又は複数を含む。
残基215~270又は配列番号97~100のいずれか1つの残基24~79を含む。
別のこのような実施形態では、HVR2領域が、配列番号12~96のいずれか1つの残
基24~79又は配列番号97~100のいずれか1つの残基215~270を含む。
~96のいずれか1つの残基198~344又は配列番号97~100のいずれか1つの
残基7~153を含む。別のこのような実施形態では、第2のメガヌクレアーゼサブユニ
ットが、配列番号12~96のいずれか1つの残基7~153又は配列番号97~100
のいずれか1つの残基198~344を含む。
ヌクレアーゼであり、リンカーが、第1のサブユニットと第2のサブユニットを共有結合
する。
ずれか1つのアミノ酸配列を含む。
。
01~111のいずれか1つの残基7~153又は配列番号112若しくは113のいず
れか1つの残基198~344と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90
%、又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第2のメガヌクレ
アーゼサブユニットが、配列番号101~111のいずれか1つの残基198~344又
は配列番号112若しくは113のいずれか1つの残基7~153と少なくとも80%、
少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を含む。
れか1つの24位;又は(b)配列番号112若しくは113のいずれか1つの215位
に相当する位置にYを含む。
れか1つの215位;又は(b)配列番号112若しくは113のいずれか1つの24位
に相当する位置にYを含む。別のこのような実施形態では、HVR2領域が、(a)配列
番号101~111のいずれか1つの233位;又は(b)配列番号112若しくは11
3のいずれか1つの42位に相当する位置にWを含む。別のこのような実施形態では、H
VR2領域が、(a)配列番号101~111のいずれか1つのそれぞれ215位及び2
33位;又は(b)配列番号112若しくは113のいずれか1つのそれぞれ24位及び
42位に相当する位置にY及びWの1つ又は複数を含む。
つの残基24~79又は配列番号112若しくは113のいずれか1つの残基215~2
70を含む。別のこのような実施形態では、HVR2領域が、配列番号101~111の
いずれか1つの残基215~270又は配列番号112若しくは113のいずれか1つの
残基24~79を含む。
1~111のいずれか1つの残基7~153又は配列番号112若しくは113のいずれ
か1つの残基198~344を含む。別のこのような実施形態では、第2のメガヌクレア
ーゼサブユニットが、配列番号101~111のいずれか1つの残基198~344又は
配列番号112若しくは113のいずれか1つの残基7~153を含む。
ヌクレアーゼであり、リンカーが、第1のサブユニットと第2のサブユニットを共有結合
する。
いずれか1つのアミノ酸配列を含む。
。
14~118のいずれか1つの残基7~153又は配列番号119~124のいずれか1
つの残基198~344と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又
は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第2のメガヌクレアーゼ
サブユニットが、配列番号114~118のいずれか1つの残基198~344又は配列
番号119~124のいずれか1つの残基7~153と少なくとも80%、少なくとも8
5%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
む。
れか1つの44位;又は(b)配列番号119~124のいずれか1つの235位に相当
する位置にSを含む。別のこのような実施形態では、HVR1領域が、(a)配列番号1
14~118のいずれか1つの46位;又は(b)配列番号119~124のいずれか1
つの237位に相当する位置にFを含む。別のこのような実施形態では、HVR1領域が
、(a)配列番号114~118のいずれか1つのそれぞれ44位及び46位;又は(b
)配列番号119~124のいずれか1つのそれぞれ235位及び237位に相当する位
置にS及びFの1つ又は複数を含む。
れか1つの215位;又は(b)配列番号119~124のいずれか1つの24位に相当
する位置にYを含む。
つの残基24~79又は配列番号119~124のいずれか1つの残基215~270を
含む。別のこのような実施形態では、HVR2領域が、配列番号114~118のいずれ
か1つの残基215~270又は配列番号119~124のいずれか1つの残基24~7
9を含む。
4~118のいずれか1つの残基7~153又は配列番号119~124のいずれか1つ
の残基198~344を含む。別のこのような実施形態では、第2のメガヌクレアーゼサ
ブユニットが、配列番号114~118のいずれか1つの残基198~344又は配列番
号119~124のいずれか1つの残基7~153を含む。
ヌクレアーゼであり、リンカーが、第1のサブユニットと第2のサブユニットを共有結合
する。
いずれか1つのアミノ酸配列を含む。
む。
25の残基7~153又は配列番号126の残基198~344と少なくとも80%、少
なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ
酸配列を含み、第2のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号125の残基198~
344又は配列番号126の残基7~153と少なくとも80%、少なくとも85%、少
なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(b)配列番号126の215位に相当する位置にYを含む。別のこのような実施形態で
は、HVR1領域が、(a)配列番号125の28位;又は(b)配列番号126の21
9位に相当する位置にWを含む。別のこのような実施形態では、HVR1領域が、(a)
配列番号125の42位;又は(b)配列番号126の233位に相当する位置にGを含
む。別のこのような実施形態では、HVR1領域が、(a)配列番号125のそれぞれ2
4位、28位、及び42位;又は(b)配列番号126のそれぞれ215位、219位、
及び233位に相当する位置にY、W、及びGの1つ又は複数を含む。
は(b)配列番号126の42位に相当する位置にVを含む。
配列番号126の残基215~270を含む。別のこのような実施形態では、HVR2領
域が、配列番号125の残基215~270又は配列番号126の残基24~79を含む
。
5の残基7~153又は配列番号126の残基198~344を含む。別のこのような実
施形態では、第2のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号125の残基198~3
44又は配列番号126の残基7~153を含む。
ヌクレアーゼであり、リンカーが、第1のサブユニットと第2のサブユニットを共有結合
する。
のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
NAが、本明細書に記載される単一組換えメガヌクレアーゼをコードすることができる。
他の実施形態では、mRNAが、本明細書に記載される少なくとも1つのメガヌクレアー
ゼ及び1つの更なる遺伝子をコードするポリシストロン性(polycistronic
)mRNA(例えば、バイシストロン性(bicistronic)、トリシストロン性
(tricistronic)等)である。特定の実施形態では、ポリシストロニックm
RNAが、同じ遺伝子内の異なる認識配列を標的化する本開示の2以上のメガヌクレアー
ゼをコードすることができる。他の実施形態では、ポリシストロン性mRNAが、本明細
書に記載されるメガヌクレアーゼ及び同じ遺伝子内の異なる認識配列を標的化する、又は
別の遺伝子内の異なる認識配列を標的化する第2のヌクレアーゼをコードすることができ
る。具体的な実施形態では、ポリシストロン性mRNAが、本明細書に記載されるB2M
認識配列を認識及び切断する本明細書に記載されるメガヌクレアーゼ、並びにT細胞受容
体α定常領域内の認識配列を認識及び切断するヌクレアーゼをコードすることができる。
核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む組換えDNA構築物を提供する。一実
施形態では、組換えDNA構築物がウイルスベクターをコードする。いくつかの実施形態
では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであり得る。特定の実施形
態では、ウイルスベクターが組換えAAVベクターである。
核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。一実施
形態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、又はAAVベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクタ
ーが組換えAAVベクターである。
遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、(a)本明細書に記載される組換えメガヌ
クレアーゼをコードする核酸配列;及び(b)対象となる配列を含む核酸配列を含む1つ
又は複数の核酸で真核細胞をトランスフェクトすることを含み;組換えメガヌクレアーゼ
が配列番号2、配列番号4、配列番号6、又は配列番号8を含む認識配列で染色体中に切
断部位を生成し、対象となる配列が切断部位で染色体に挿入される、方法を提供する。
て低下する。
た場合、又は対象に投与された場合に、低下したアロ反応性及び/又は減少したアロゲニ
シティ(allogenicity)を示す。
同な配列をさらに含み、対象となる配列が相同組換えによって切断部位で挿入される。
を欠いており、対象となる配列が非相同末端結合によって染色体に挿入される。
の別の実施形態では、対象となる配列が外因性T細胞受容体をコードする。
ーによって真核細胞に導入される。本方法の別の実施形態では、組換えメガヌクレアーゼ
をコードする核酸配列及び対象となる配列をコードする核酸配列が、同じウイルスベクタ
ー又は別個のウイルスベクターによって真核細胞に導入される。本方法のいくつかの実施
形態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、又はAAVベクターである。本方法の特定の実施形態では、ウイル
スベクターが組換えAAVベクターである。
NA鋳型を用いて真核細胞に導入される。
容体の細胞表面発現を示すように遺伝子改変されている。
ゼをコードする核酸で真核細胞をトランスフェクトすること;又は(b)第2の認識配列
を認識及び切断するエンドヌクレアーゼを真核細胞に導入することを更に含むことができ
;第二の認識配列が内因性T細胞受容体の成分をコードする遺伝子に位置し、遺伝子改変
真核細胞が、対照細胞と比較して低下したβ-2ミクログロブリン及び内因性T細胞受容
体の細胞表面発現を示す。
。別のこのような実施形態では、第2の認識配列が配列番号127に示されるように、ヒ
トT細胞受容体α定常領域遺伝子に位置する。別のこのような実施形態では、第2の認識
配列が配列番号128、129、又は130(即ち、それぞれTRC1-2、TRC3-
4、及びTRC5-6認識配列)を含むことができる。
と第2の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼの両方をコードするポリシスト
ロン性mRNAである。
遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、(a)本明細書に記載される組換えメガヌ
クレアーゼを真核細胞に導入することと;(b)対象となる配列を含む核酸で真核細胞を
トランスフェクトすることと、を含み;組換えメガヌクレアーゼが配列番号2、配列番号
4、配列番号6、又は配列番号8を含む認識配列で染色体中に切断部位を生成し、対象と
なる配列が切断部位で染色体に挿入される、方法を提供する。
て低下する。
た場合又は対象に投与された場合に、低下したアロ反応性及び/又は減少したアロゲニシ
ティ(allogenicity)を示す。
同な配列を更に含み、対象となる配列が相同組換えによって切断部位で挿入される。
を欠いており、対象となる配列が非相同末端結合によって染色体に挿入される。
の別の実施形態では、対象となる配列が外因性T細胞受容体をコードする。
真核細胞に導入される。本方法のいくつかの実施形態では、ウイルスベクターがレトロウ
イルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はAAVベクタ
ーである。特定の実施形態では、ウイルスベクターが組換えAAVベクターである。
用いて真核細胞に導入される。
容体の細胞表面発現を示すように遺伝子改変されている。
アーゼをコードする核酸で真核細胞をトランスフェクトすること;又は(b)第2の認識
配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼを真核細胞に導入することを更に含むことが
でき;第二の認識配列が内因性T細胞受容体の成分をコードする遺伝子に位置し、遺伝子
改変真核細胞が、対照細胞と比較して低下したβ-2ミクログロブリン及び内因性T細胞
受容体の細胞表面発現を示す。
。別のこのような実施形態では、第2の認識配列が配列番号127に示されるように、ヒ
トT細胞受容体α定常領域遺伝子に位置する。別のこのような実施形態では、第2の認識
配列が配列番号128、129、又は130(即ち、それぞれTRC1-2、TRC3-
4、及びTRC5-6認識配列)を含むことができる。
子改変真核細胞を作製する方法であって、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼ
をコードする核酸で真核細胞をトランスフェクトすること、又は本明細書に記載される組
換えメガヌクレアーゼを真核細胞に導入することを含み;メガヌクレアーゼが配列番号2
、配列番号4、配列番号6、又は配列番号8を含む認識配列で染色体中に切断部位を生成
し、標的配列が切断部位で非相同末端結合によって破壊される、方法を提供する。このよ
うな方法では、遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較して低下したβ-2ミクログロブ
リンの細胞表面発現を示す。
場合又は対象に投与された場合に、低下したアロ反応性及び/又は減少したアロゲニシテ
ィを示す。
容体の細胞表面発現を示すように遺伝子改変されている。
アーゼをコードする核酸で真核細胞をトランスフェクトすること;又は(b)第2の認識
配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼを真核細胞に導入することを更に含む。この
ような実施形態では、エンドヌクレアーゼが組換えメガヌクレアーゼである。別のこのよ
うな実施形態では、第2の認識配列が内因性T細胞受容体の成分をコードする遺伝子に位
置し、遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較して低下したβ-2ミクログロブリンと内
因性T細胞受容体の両方の細胞表面発現を示す。
2の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼの両方をコードするポリシストロン
性mRNAである。
の別の実施形態では、対象となる配列が外因性T細胞受容体をコードする。
フェクトすることを更に含む。このような実施形態では、対象となる外因性配列を含む核
酸が第2の切断部位に隣接する配列と相同な配列を更に含み、対象となる配列が相同組換
えによって第2の切断部位で挿入される。別のこのような実施形態では、対象となる配列
を含む核酸が切断部位との実質的な相同性を欠いており、対象となる配列が非相同末端結
合によって染色体に挿入される。
。別のこのような実施形態では、対象となる外因性が外因性T細胞受容体をコードする。
スベクターによって真核細胞に導入される。別のこのような実施形態では、エンドヌクレ
アーゼをコードする核酸配列及び対象となる配列をコードする核酸配列が、同じウイルス
ベクター又は別個のウイルスベクターによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形
態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ
ウイルスベクター、又はAAVベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクター
が組換えAAVベクターである。
を用いて真核細胞に導入される。
記載される方法により遺伝子改変非ヒト真核細胞を作製することと;(b)遺伝子改変非
ヒト真核細胞を増殖させて、遺伝子改変非ヒト生物を作製することとを含む方法を提供す
る。
、及びプロトプラスト細胞からなる群から選択される。
含む遺伝子改変細胞であって、改変β-2ミクログロブリン遺伝子が、5’から3’まで
、:(a)ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子の5’領域;(b)外因性ポリヌクレオチ
ド;及び(c)ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子の3’領域を含む、遺伝子改変細胞を
提供する。遺伝子改変細胞は、遺伝子改変ヒトT細胞又はヒトT細胞に由来する遺伝子改
変細胞であり得る。更に、遺伝子改変細胞は、未改変対照細胞と比較して低下したβ-2
ミクログロブリンの細胞表面発現を有することができる。
含み、キメラ抗原受容体が細胞外リガンド結合ドメイン及び1又は複数の細胞内シグナル
伝達ドメインを含む。
認識配列)、配列番号4(即ち、B2M5-6認識配列)、配列番号6(即ち、B2M7
-8認識配列)、又は配列番号8(即ち、B2M11-12認識配列)を含む認識配列内
の位置でβ-2ミクログロブリン遺伝子に挿入される。
変真核細胞を提供する。本開示は更に、それを必要とする対象の疾患を治療するための医
薬品の製造における、本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞の使用を提供する。1つ
のこのような実施形態では、医薬品ががんの治療に有用である。別の実施形態では、医薬
品が免疫療法を用いたがんの治療に有用である。
団が、少なくとも1×106個、2×106個、5×106個、1×109個、2×10
9個、5×109個、又はそれ以上の遺伝子改変真核細胞を含む。
%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上が、対照細胞と比較して低下し
た内因性T細胞受容体の細胞表面発現を示し、遺伝子改変真核細胞の少なくとも80%、
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上が、対照細胞と
比較して低下したβ-2ミクログロブリンの細胞表面発現を示す。
%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少な
くとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも7
5%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又
はそれ以上がキメラ抗原受容体を発現する。
ある。
核細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態で
は、遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変T細胞又はそれに由来する細胞である。特定の実施
形態では、遺伝子改変T細胞が、キメラ抗原受容体を発現し、β-2ミクログロブリン及
び内因性T細胞受容体の低下した細胞表面発現を示す。本開示のこのような医薬組成物は
、がんを治療するための免疫療法としての使用に適している。
は対象に投与された場合に、低下したアロ反応性及び/又は減少したアロゲニシティを示
す。
細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。このような方
法は、がんを治療するための免疫療法を表す。
外リガンド結合ドメイン又は部分と、1又は複数のシグナル伝達ドメイン及び/又は共刺
激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結
合ドメイン又は部分が、特定のエピトープ又は抗原(例えば、がん細胞又は他の疾患を引
き起こす細胞若しくは粒子等の細胞の表面上に優先的に存在するエピトープ又は抗原)に
対する特異性を提供するモノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント(scFv
)の形態である。scFvはリンカー配列を介して結合している。細胞外リガンド結合ド
メインは、対象となる任意の抗原又はエピトープに特異的である。いくつかの実施形態で
は、scFvがヒト化又は完全ヒトである。キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、
Bリンパ球上の自己抗原特異的B細胞受容体によって認識される自己抗原(Payneら
(2016)Science、第353巻(6295):179~184参照)を含み、
従ってT細胞を標的に特異的に向け、抗体媒介自己免疫疾患において自己反応性Bリンパ
球を死滅させることができる。このようなCARはキメラ自己抗体受容体(CAAR)と
呼ばれ、その使用は本開示に包含される。
参照することによって、より完全に理解され得る。明確にするために、別個の実施形態の
文脈で記載される本開示の一定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供
され得る。実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あたかも
それぞれの及び全ての組み合わせが個別的に又は明示的に開示されているかのように本明
細書に開示される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載される本開示
の種々の特徴は、別々に又は任意の適切な部分組み合わせでも提供され得る。実施形態で
列挙される特徴の全ての部分組み合わせも、本開示によって具体的に包含され、あたかも
それぞれの及び全てのこのような部分組み合わせが本明細書に個別的に又は明示的に開示
されているかのように本明細書に開示される。本明細書に開示される本開示の各態様の実
施形態は、必要な変更を加えて本開示の各他の態様に適用される。
配列番号1は、ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子の核酸配列を示す。
。
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す。
す。
す。
列を示す。
列を示す。
列を示す。
列を示す。
列を示す。
列を示す。
列を示す。
列を示す。
列を示す。
を示す。
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位結合サブユニットを示す。
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3半部位結合サブユニットを示す。
3半部位結合サブユニットを示す。
3半部位結合サブユニットを示す。
3半部位結合サブユニットを示す。
3半部位結合サブユニットを示す。
3半部位結合サブユニットを示す。
3半部位結合サブユニットを示す。
3半部位結合サブユニットを示す。
3半部位結合サブユニットを示す。
サブユニットを示す。
合サブユニットを示す。
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4半部位結合サブユニットを示す。
14半部位結合サブユニットを示す。
4半部位結合サブユニットを示す。
4半部位結合サブユニットを示す。
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4半部位結合サブユニットを示す。
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4半部位結合サブユニットを示す。
4半部位結合サブユニットを示す。
サブユニットを示す。
合サブユニットを示す。
合サブユニットを示す。
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ユニットを示す。
ニットを示す。
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ユニットを示す。
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ニットを示す。
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ユニットを示す。
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ユニットを示す。
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ユニットを示す。
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ユニットを示す。
ユニットを示す。
ニットを示す。
ユニットを示す。
ニットを示す。
ユニットを示す。
ユニットを示す。
ユニットを示す。
ニットを示す。
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ニットを示す。
ユニットを示す。
ユニットを示す。
ユニットを示す。
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ニットを示す。
ユニットを示す。
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ユニットを示す。
ニットを示す。
ニットを示す。
ニットを示す。
ユニットを示す。
ユニットを示す。
ユニットを示す。
合サブユニットを示す。
サブユニットを示す。
合サブユニットを示す。
サブユニットを示す。
示す。
す。
す。
す。
す。
示す。
す。
す。
す。
す。
細書に引用されるGenBankデータベース配列を含む、発行された米国特許、許可さ
れた出願、公開された外国出願、及び参考文献は、それぞれが具体的且つ個別的に参照に
より組み込まれることを示されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的且つ完全であり、開
示の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して例示さ
れる特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例示される特徴
をその実施形態から削除することができる。更に、本開示から逸脱しない本明細書で示唆
される実施形態に対する多数の変形及び追加は、本開示に照らして当業者に明らかであろ
う。
属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の開示の説明で
使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本開示を限定する
ことを意図していない。
が参照により本明細書に組み込まれる。
味することができる。例えば、細胞(「a」cell)は単一細胞又は多数の細胞を意味
することができる。
は」の包括的な意味で使用され、「いずれか/又は」の排他的な意味で使用されるもので
はない。
認識配列で二本鎖DNAに結合するエンドヌクレアーゼを指す。好ましくは、本開示のメ
ガヌクレアーゼの認識配列は22塩基対である。メガヌクレアーゼは、I-CreIに由
来するエンドヌクレアーゼであり、例えばDNA結合特異性、DNA切断活性、DNA結
合親和性、又は二量化特性に関して、天然I-CreIに対して改変されたI-CreI
の操作された変異体を指すことができる。I-CreIのこのような改変された変異体を
作製する方法は、当技術分野で公知である(例えば、国際公開第2007/047859
号パンフレット)。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本
鎖DNAに結合する。メガヌクレアーゼはまた、一対のDNA結合ドメインがペプチドリ
ンカーを用いて単一ポリペプチドに連結されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であって
もよい。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という
用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、本明細書に記載される方法を用いて測
定した場合に、細胞生存率への有害効果もメガヌクレアーゼ切断活性の有意な低下も観察
することなく、細胞を37℃でトランスフェクト及び維持することができるように、細胞
、特にヒトT細胞で発現した場合に実質的に非毒性である。
って連結された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。一本鎖メガ
ヌクレアーゼは、構成:N末端サブユニット-リンカー-C末端サブユニットを有する。
2つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列において同一ではなく、
同一でないDNA配列を認識するであろう。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的
には、偽回文構造又は非回文構造認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは、実際
には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレア
ーゼ」と呼ばれる。明確にするために、他に指定しない限り、「メガヌクレアーゼ」とい
う用語は、二量体又は一本鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。
ユニットを単一ポリペプチドに連結させるために使用される外因性ペプチド配列を指す。
リンカーは、天然タンパク質に見られる配列を有してもよく、又は天然タンパク質には見
られない人工配列である。リンカーは、可撓性であり、二次構造が欠如している、又は生
理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有し得る。リンカーは、限定されない
が、米国特許第8445251号明細書に包含されるものを含むことができる。いくつか
の実施形態では、リンカーが、配列番号12~126のいずれか1つの残基154~19
5を含むアミノ酸配列を有し得る。
インの任意の部分に融合した16~22個のTALドメインリピートを含むDNA結合ド
メインを含むエンドヌクレアーゼを指す。
ーミングエンドヌクレアーゼの任意の部分に任意の配向で融合した16~22個のTAL
ドメインリピートを有するDNA結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。
用語は、FokI制限酵素のヌクレアーゼドメインに融合したジンクフィンガーDNA結
合ドメインを含むキメラエンドヌクレアーゼを指す。ジンクフィンガードメインを、合理
的又は実験的手段を通して、長さが約18塩基対であり、2~10塩基対で分離された1
対の9塩基対半部位を含む所定のDNA配列に結合するタンパク質を作製するよう再設計
することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断は、可変長の平滑末端又は
5’オーバーハンド(しばしば4塩基対)を作り出すことができる。
と、ゲノムDNA中の認識部位にハイブリダイズすることによってカスパーゼのDNA切
断を指向するガイドRNAとを含むカスパーゼに基づくエンドヌクレアーゼを指す。
ホーミングエンドヌクレアーゼを有する転写アクチベータ様エフェクター(TALE)D
NA結合ドメインを含む一本鎖ヌクレアーゼを指す。
質をコードする核酸及びタンパク質を発現する細胞又は生物に遺伝子工学技術を適用した
結果として変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、「組換え」と
いう用語は、遺伝子工学技術を適用した結果として変化した核酸配列を有することを意味
する。遺伝子工学技術には、それだけに限らないが、PCR及びDNAクローニング技術
;トランスフェクション、形質転換、及び他の遺伝子導入技術;相同組換え;部位特異的
突然変異誘発;並びに遺伝子融合が含まれる。この定義によると、天然タンパク質と同一
のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニング及び発現によって産生されたタン
パク質は、組換えとはみなされない。
ドされるポリペプチドがその元の機能を有する、同種の遺伝子の対立遺伝子集団における
最も一般的な天然対立遺伝子(即ち、ポリヌクレオチド配列)を指す。「野生型」という
用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。野生型対立遺
伝子(即ち、ポリヌクレオチド)及びポリペプチドは、1又は複数の野生型配列に対する
1又は複数の突然変異及び/又は置換を含む突然変異体又は変異体の対立遺伝子及びポリ
ペプチドと区別される。野生型対立遺伝子又はポリペプチドは、生物において正常な表現
型を付与することができるが、突然変異体又は変異体の対立遺伝子又はポリペプチドは、
場合によっては、変化した表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは、組換
え又は非天然ヌクレアーゼとは区別可能である。
列(例えば、野生型又は天然配列)に対する組換え配列中のアミノ酸残基の任意の挿入、
欠失、又は置換を意味する。
て結合及び切断されるDNA配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、4塩基
対によって分離された1対の逆位9塩基対「半部位」を含む。一本鎖メガヌクレアーゼの
場合、タンパク質のN末端ドメインが第1の半部位に接触し、タンパク質のC末端ドメイ
ンが第2の半部位に接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、4塩基対の3’「オーバ
ーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「付着末端」は、二本鎖DNA配列のエン
ドヌクレアーゼ切断によって産生され得る短い一本鎖DNAセグメントである。I-Cr
eIに由来するメガヌクレアーゼ及び一本鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは
、22塩基対の認識配列の塩基10~13を含む。コンパクトTALENの場合、認識配
列は、I-TevIドメインによって認識される第1のCNNNGN配列、引き続いて長
さ4~16塩基対の非特異的スペーサー、引き続いてTAL-エフェクタードメインによ
って認識される長さ16~22bpの第2の配列(この配列は、典型的には5’T塩基を
有する)を含む。コンパクトTALENによる切断は、2塩基対の3’オーバーハングを
生じる。CRISPRの場合、認識配列は、典型的には16~24塩基対の配列であり、
これにガイドRNAが結合してCas9切断を誘導する。CRISPRによる切断は平滑
末端を生じた。
ゼの認識配列を含む細胞の染色体DNAの領域を指す。
メガヌクレアーゼが参照DNA分子(例えば、認識配列又は任意の配列)と非共有結合す
る傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Kdによって測定される。本明細書で使用さ
れる場合、ヌクレアーゼは、参照認識配列に対するヌクレアーゼのKdが、参照ヌクレア
ーゼに対して統計学的に有意な(p<0.05)量だけ増加又は減少した場合、「変化し
た」結合親和性を有する。
て相同DNA配列を使用して二本鎖DNA切断が修復される天然の細胞プロセスを指す(
例えば、Cahillら(2006)、Front.Biosci.11:1958~1
976)。相同DNA配列は、細胞に送達された内因性染色体配列又は外因性核酸である
。
鎖DNA切断が2つの非相同DNAセグメントの直接接合によって修復される天然の細胞
プロセスを指す(例えば、例えば、Cahillら(2006)、Front.Bios
ci.11:1958~1976)。非相同末端結合によるDNA修復は間違いを起こし
やすく、頻繁に修復部位でのDNA配列のテンプレート化されていない付加又は欠失が起
こる。いくつかの例では、標的認識配列における切断が、標的認識部位におけるNHEJ
を生じる。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断に引き続くNHEJ
によるDNA修復が、遺伝子機能を破壊するフレームシフト突然変異等の突然変異をコー
ド配列に導入し得る。このように、操作されたヌクレアーゼを使用して、細胞の集団中の
遺伝子を有効にノックアウトすることができる。
ー細胞(例えば、ヒトT細胞)上に抗原に対する特異性を移植する操作された受容体を指
す。キメラ抗原受容体は、典型的には、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分と、1又は
複数の刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リ
ガンド結合ドメイン又は部分が、特定のエピトープ又は抗原(例えば、がん細胞又は他の
疾患を引き起こす細胞若しくは粒子の表面上に優先的に存在するエピトープ又は抗原)に
対する特異性を提供するモノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント(scFv
)の形態であり得る。scFvはリンカー配列を介して結合し得る。細胞外リガンド結合
ドメインは、対象となる任意の抗原又はエピトープに特異的であり得る。特定の実施形態
では、リガンド結合ドメインがCD19に特異的である。他の実施形態では、scFvが
ヒト化又は完全ヒトであり得る。キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、Bリンパ球
上の自己抗原特異的B細胞受容体によって認識され得る自己抗原(Payneら(201
6)Science、第353巻(6295):179~184参照)を含むことができ
、従って、T細胞を標的に特異的に向け、抗体媒介自己免疫疾患において自己反応性Bリ
ンパ球を死滅させることができる。このようなCARはキメラ自己抗体受容体(CAAR
)と呼ばれ得、その使用は本開示に包含される。
連表面抗原、例えば、CD19、CD123、CD22、CS1、CD20、ErbB2
(HER2/neu)、FLT3R、癌胎児性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(Ep
CAM)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、EGFR変異体III(EGFRvIII
)、CD30、CD40、CD44、CD44v6、ジシアロガングリオシドGD2、管
上皮ムチン、gp36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、Bヒト絨
毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、チログロ
ブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU
2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロ
スターゼ(prostase)、プロスターゼ特異的抗原(PSA)、PAP、NY-E
SO-1、LAGA-1a、p53、プロスタイン、PSMA、生存及びテロメラーゼ、
前立腺癌腫腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ
、エフリンB2、インスリン増殖因子(IGF1)-1、IGF-II、IGFI受容体
、メソテリン、腫瘍特異ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体(MH
C)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチ
ンのエクストラドメインA(EDA)及びエクストラドメインB(EDB)並びにテネイ
シン-CのA1ドメイン(TnC AI)並びに線維芽細胞関連タンパク質(fap);
系列特異又は組織特異抗原、例えばCD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD
33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7
-2(CD86)、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子、BCMA
(CD269、TNFRSF17)、又はウイルス特異表面抗原、例えばHIV特異抗原
(HIV gpl20等);EBV特異抗原、CMV特異抗原、HPV特異抗原、ラッサ
ウイルス特異抗原、インフルエンザウイルス特異抗原、並びにこれらの表面マーカーの任
意の誘導体又は変異体に対する特異性を有することができる。本発明の特定の実施形態で
は、リガンド結合ドメインがCD19に特異的である。
る1又は複数の細胞質シグナル伝達ドメインを含むことができる。細胞内刺激ドメインは
、対象となる任意の細胞内刺激ドメインであり得る。このような細胞質シグナル伝達ドメ
インには、限定されないが、CD3-ζが含まれ得る。細胞内刺激ドメインはまた、リガ
ンド結合後に増殖及び/又は細胞生存シグナルを伝達する1又は複数の細胞内共刺激ドメ
インを含むことができる。細胞内共刺激ドメインは、対象となる任意の細胞内共刺激ドメ
インであり得る。このような細胞内共刺激ドメインには、限定されないが、CD28ドメ
イン、4-1BBドメイン、OX40ドメイン、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。
キメラ抗原受容体は、ヒンジ又はスペーサー配列を介して細胞外リガンド結合ドメインに
結合した膜貫通ドメインを含む追加の構造エレメントを更に含むことができる。
Rを内因的に発現してもしなくてもよい免疫エフェクター細胞(例えば、ヒトT細胞)の
ゲノムにその配列が導入されるTCRを指す。免疫エフェクター細胞上の外因性TCRの
発現は、特定のエピトープ又は抗原(例えば、がん細胞又は他の疾患を引き起こす細胞若
しくは粒子の表面上に優先的に存在するエピトープ又は抗原)に対する特異性を付与する
ことができる。このような外因性T細胞受容体は、α及びβ鎖を含むことができる、ある
いは、γ及びδ鎖を含むことができる。本開示において有用な外因性TCRは、対象とな
る任意の抗原又はエピトープに対する特異性を有し得る。
の又は対照細胞と比較した場合の、内因性ポリペプチド(例えば、β-2ミクログロブリ
ン、内因性T細胞受容体等)の発現の任意の低下を指す。「低下した」という用語はまた
、対照細胞の集団と比較した場合の細胞表面で内因性ポリペプチドを発現する細胞の集団
における細胞の割合の低下を指すことができる。どちらの場合でも、このような低下は、
最大5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%
、95%、又は最大100%である。従って、「低下した」という用語は、内因性ポリペ
プチドの部分的ノックダウンと完全ノックダウンの両方を包含する。
配列同一性」、「類似性割合」、「配列類似性」等の用語は、整列されたアミノ酸残基又
はヌクレオチド間の類似性を最大化し、同一又は類似の残基又はヌクレオチドの数、全残
基又はヌクレオチドの数、並びに配列アラインメント中のギャップの存在及び長さの関数
である配列のアラインメントに基づく2つの配列の類似性の程度の尺度を指す。標準的な
パラメータを使用して配列類似性を決定するための種々のアルゴリズム及びコンピュータ
プログラムが利用可能である。本明細書中で使用される場合、配列類似性は、共にNat
ional Center for Biotechnology Informati
on(www.ncbi.nlm.nih.gov)を通して入手可能であり、例えば、
Altschulら(1990)、J.Mol.Biol.215:403~410;G
ish及びStates(1993)、Nature Genet.3:266~272
;Maddenら(1996)、Meth.Enzymol.266:131~141;
Altschulら(1997)、Nucleic Acids Res.25:33
89~3402);Zhangら(2000)、J.Comput.Biol.7(1~
2):203~14に記載されている、アミノ酸配列についてはBLASTpプログラム
及び核酸配列についてはBLASTnプログラムを用いて測定される。本明細書で使用さ
れる場合、2つのアミノ酸配列の類似性%は、BLASTpアルゴリズムについての以下
のパラメータに基づくスコアである:ワードサイズ=3;ギャップオープニングペナルテ
ィ=-11;ギャップ伸長ペナルティ=-1;及びスコアリングマトリックス=BLOS
UM62。本明細書で使用される場合、2つの核酸配列の類似性%は、BLASTnアル
ゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである:ワードサイズ=11;ギャ
ップオープニングペナルティ=-5;ギャップ伸長ペナルティ=-2;一致報酬=1;及
び不一致ペナルティ=-3。
相当する」という用語は、2つのタンパク質を標準的な配列アラインメント(例えば、B
LASTpプログラムを用いる)に供した場合に、第1のタンパク質における特定の改変
が第2のタンパク質における改変におけるのと同じアミノ酸残基の置換であること、及び
第1のタンパク質における改変のアミノ酸位置が、第2のタンパク質における改変のアミ
ノ酸位置に相当する又はこれと一列に整列することを示すために使用される。従って、残
基XとYが配列アラインメントで互いに相当する場合、XとYが異なる数であるという事
実にもかかわらず、第1のタンパク質における残基「X」のアミノ酸「A」への改変は、
第2のタンパク質における残基「Y」のアミノ酸「A」への改変に相当する。
位」という用語は、ホモ二量体若しくはヘテロ二量体メガヌクレアーゼの単量体によって
、又は一本鎖メガヌクレアーゼの1つのサブユニットによって認識される二本鎖DNA分
子中の核酸配列を意味する。
アミノ酸を含むメガヌクレアーゼモノマー又はサブユニット内の局在配列を指す。超可変
領域は、約50~60個の連続残基、約53~57個の連続残基、又は好ましくは約56
個の残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基が、配列番号
12~126のいずれか1つの24~79位又は215~270位に相当し得る。超可変
領域は、認識配列中のDNA塩基と接触する1個又は複数の残基を含むことができ、単量
体又はサブユニットの塩基優先度を変更するように改変することができる。超可変領域は
また、メガヌクレアーゼが二本鎖DNA認識配列と会合すると、DNA骨格に結合する1
個又は複数の残基を含むことができる。このような残基を、DNA骨格及び標的認識配列
に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変化させるように改変することができる。本開
示の異なる実施形態では、超可変領域は、可変性を示す約1~21個の残基を含み、塩基
優先度及び/又はDNA結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる。いくつ
かの実施形態では、超可変領域内の可変残基が、配列番号12~126のいずれか1つの
24位、26位、28位、29位、30位、32位、33位、38位、40位、42位、
44位、46位、48位、66位、68位、69位、70位、72位、73位、75位、
及び77位の1又は複数に相当する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基が、配
列番号12~126のいずれか1つの215位、217位、219位、220位、221
位、223位、224位、229位、231位、233位、235位、237位、239
位、248位、257位、259位、260位、261位、263位、264位、266
位、及び268位の1又は複数に相当する。
」等の用語は互換的に使用され、配列番号1に示されるNCBI遺伝子識別番号567(
受託番号NG_012920.1)によって特定されるヒト遺伝子及び機能的B2Mポリ
ペプチドをコードするヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子の天然変異体を指す。
遺伝子」等の用語は互換的に使用され、配列番号127に示されるNCBI遺伝子識別番
号28755によって特定されるヒト遺伝子、並びに機能的ポリペプチドをコードするT
細胞受容体α定常領域遺伝子の天然変異体を指す。
キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えDNA断片」という用語は、本明細書で互換
的に使用され、核酸断片である。組換え構築物は、限定されないが、天然には一緒には見
られない調節配列及びコード配列を含む、核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば
、組換えDNA構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供
給源に由来し、天然に見られるものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列
を含み得る。このような構築物は、単独で使用される、又はベクターと合わせて使用され
る。
主細胞におけるポリペプチドコード配列の転写及び翻訳が可能な複製系及び配列を含む構
築物である。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように宿主細
胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターには、限定されないが、プ
ラスミドベクター及び組換えAAVベクター、又は本開示のメガヌクレアーゼをコードす
る遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当技術分野で公知の任意の他のベクターが含ま
れ得る。当業者であれば、本開示の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含
む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択、及び増殖させるために、ベクター上に存在しなけ
ればならない遺伝要素を十分に認識している。
ウイルスベクターには、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)が含まれ得
る。
即ち、シストロン)を含み、2以上のタンパク質をコードする単一メッセンジャーRNA
を指す。ポリシストロン性mRNAは、それだけに限らないが、IRESエレメント、T
2Aエレメント、P2Aエレメント、E2Aエレメント、及びF2Aエレメントを含む、
同じmRNA分子からの2以上の遺伝子の翻訳を可能にする当技術分野で公知の任意のエ
レメントを含むことができる。
れたT細胞を指す。ヒトT細胞及びこれに由来する細胞には、培養で継代されていない単
離されたT細胞、不死化しないで細胞培養条件下で継代及び維持されたT細胞、並びに不
死化され、細胞培養条件下で無限に維持されるT細胞が含まれる。
又は表現型における変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例
えば:(a)野生型細胞、即ち、遺伝子改変細胞を生じた遺伝子改変のための出発材料と
同じ遺伝子型の細胞;(b)遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌル構築物
(即ち、対象となる形質に対して既知の効果を有さない構築物)で形質転換された細胞;
(c)遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型又は表現型の発現を誘
導する条件、刺激又は更なる遺伝子改変に曝されない細胞を含み得る。
かに等しい変数で実施されることを伝えることを意図している。従って、本質的に離散的
な変数については、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しい。同様
に、本質的に連続する変数については、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実
数値に等しい。一例として、限定ではないが、変数が本質的に離散的である場合、0~2
の値を有すると記載される変数は、0、1、又は2の値をとることができ、変数が本質的
に連続する場合、0.0、0.1、0.01、0.001、又は0以上2以下の任意の他
の実数をとることができる。
ンポリペプチドの発現を破壊し、よってHLA遺伝子によってコードされる内因性MHC
クラスI受容体の集合及び活性化を妨害するように、操作されたヌクレアーゼがヒトβ-
2ミクログロブリン遺伝子(配列番号1)内に見られる認識配列を認識及び切断するため
に利用されるという仮説に基づく。更に、本開示によると、外因性ポリヌクレオチド配列
を、例えば、相同組換えによって、ヌクレアーゼ切断部位でβ-2ミクログロブリン遺伝
子に挿入する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、細胞内で同時に発現
される対象となる配列を含む。更に、本開示の操作されたヌクレアーゼは、1又は複数の
追加のノックアウト(例えば、内因性T細胞受容体のノックアウト)を示すように遺伝子
改変された、並びに/あるいは1又は複数の対象となるポリペプチド(例えば、キメラ抗
原受容体又は外因性T細胞受容体)を発現するように遺伝子改変された真核細胞における
β-2ミクログロブリンの細胞表面発現をノックアウトするために使用される。従って、
好ましい実施形態では、本開示は、細胞表面でβ-2ミクログロブリンと内因性T細胞受
容体の両方のノックアウトを示す一方で、キメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体を同
時に発現するT細胞等の遺伝子改変真核細胞の産生を可能にする。このような細胞は、対
象に投与されると、低下したアロ反応性及び/又は減少したアロゲニシティを示すことが
できる。
レアーゼ
能であり、このようなDNA破壊は突然変異誘発NHEJ修復を介して又はトランスジェ
ン性DNA配列との相同組換えを介してゲノムの持続改変をもたらすことができることが
当技術分野で知られている。NHEJは切断部位で突然変異誘発を生じ、対立遺伝子の不
活性化をもたらし得る。NHEJ関連突然変異誘発は、初期終止コドンの生成、異常な非
機能性タンパク質を産生するフレームシフト突然変異を介して対立遺伝子を不活性化し得
る、あるいは非センス媒介mRNA崩壊等の機序を誘引し得る。NHEJを介した突然変
異誘発を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特定の突然変異又は野生型対立遺伝子に
存在する配列を標的化するために使用され得る。標的遺伝子座における二本鎖破壊を誘導
するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的と相同である配列が隣接するトランス
ジェン性DNA配列の相同組換えを刺激することが知られている。このようにして、外因
性核酸配列を標的遺伝子座に挿入することができる。このような外因性核酸は、例えば、
キメラ抗原受容体、外因性TCR、又は対象となる任意の配列若しくはポリペプチドをコ
ードし得る。
有用である。一実施形態では、本開示が組換えメガヌクレアーゼを用いて実施される。別
の実施形態では、本開示がCRISPRヌクレアーゼ又はCRISPRニッカーゼを用い
て実施される。所定のDNA部位を認識するCRISPR及びCRISPRニッカーゼを
作製する方法は、例えば、Ranら(2013)Nat Protoc.8:2281~
308等、当技術分野で公知である。別の実施形態では、本開示が、TALEN又はコン
パクトTALENを用いて実施される。所定のDNA部位に結合するTALEドメインを
作製する方法は、例えば、Reyonら(2012)Nat Biotechnol.3
0:460~5等、当技術分野で公知である。更なる実施形態では、本開示が、メガTA
Lを用いて実施される。
ヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって連結された
N末端サブユニット及びC末端サブユニットを含む。2つのドメインの各々が、認識配列
の半分(即ち、認識半部位)を認識し、DNA切断の部位は、2つのサブユニットの界面
付近の認識配列の中央にある。DNA鎖切断は、メガヌクレアーゼによるDNA切断が1
対の4塩基対3’一本鎖オーバーハングを生成するように、4塩基対によって相殺される
。
配列番号2)を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレア
ーゼは、本明細書では「B2M13-14メガヌクレアーゼ」と総称される。代表的なB
2M13-14メガヌクレアーゼは、配列番号12~100で提供される。
)を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼは、本
明細書では「B2M5-6メガヌクレアーゼ」と総称される。代表的なB2M5-6メガ
ヌクレアーゼは、配列番号101~113で提供される。
6)を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼは、
本明細書では「B2M7-8メガヌクレアーゼ」と総称される。代表的なB2M7-8メ
ガヌクレアーゼは、配列番号114~124で提供される。
番号8)を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼ
は、本明細書では「B2M11-12メガヌクレアーゼ」と総称される。代表的なB2M
11-12メガヌクレアーゼは、配列番号125及び126で提供される。
ユニット及び第2の超可変(HVR2)領域を含む第2のサブユニットを含む。更に、第
1のサブユニットは、認識配列の第1の認識半部位(例えば、B2M13、B2M5、B
2M7、又はB2M11半部位)に結合し、第2のサブユニットは、認識配列の第2の認
識半部位(例えば、B2M14、B2M6、B2M8、又はB2M12半部位)に結合す
る。組換えメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、第1及び第
2のサブユニットが、HVR1領域を含み、第1の半部位に結合する第1のサブユニット
がN末端サブユニットとして配置され、HVR2領域を含み、第2の半部位に結合する第
2のサブユニットがC末端サブユニットとして配置されるように配向される。代替実施形
態では、第1及び第2のサブユニットが、HVR1領域を含み、第1の半部位に結合する
第1のサブユニットがC末端サブユニットとして配置され、HVR2領域を含み、第2の
半部位に結合する第2のサブユニットがN末端サブユニットとして配置されるように配向
される。本開示の代表的なB2M13-14メガヌクレアーゼを表1に提供する。本開示
の代表的なB2M5-6メガヌクレアーゼを表2に提供する。本開示の代表的なB2M7
-8メガヌクレアーゼを表3に提供する。本開示の代表的なB2M11-12メガヌクレ
アーゼを表4に提供する。
ーゼのB2M13結合サブユニット領域及びB2M14結合サブユニット領域と、B2M
13-14x.479メガヌクレアーゼの、それぞれ、B2M13結合サブユニット領域
及びB2M14結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
のB2M5結合サブユニット領域及びB2M6結合サブユニット領域と、B2M5-6x
.14メガヌクレアーゼの、それぞれ、B2M5結合サブユニット領域及びB2M6結合
サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
のB2M7結合サブユニット領域及びB2M8結合サブユニット領域と、B2M7-8x
.88メガヌクレアーゼの、それぞれ、B2M7結合サブユニット領域及びB2M8結合
サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
ーゼのB2M11結合サブユニット領域及びB2M12結合サブユニット領域と、B2M
11-12x.45メガヌクレアーゼの、それぞれ、B2M11結合サブユニット領域及
びB2M12結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
本開示は、ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子(配列番号1)内に見られる認識配列を
認識及び切断する操作されたヌクレアーゼを用いて遺伝子改変細胞を作製する方法を提供
する。このような認識配列での切断は、切断部位でのNHEJ及びβ-2ミクログロブリ
ンポリペプチドの発現破壊を可能にし、よってHLA遺伝子によってコードされる内因性
MHCクラスI受容体の集合及び活性化を妨害することができる。更に、このような認識
配列での切断は更に、外因性核酸配列の直接的なβ2ミクログロブリン遺伝子への相同組
換えを可能にすることができる。
伝子改変真核細胞を作製する方法を提供する。このような方法は、内因性T細胞受容体の
成分をコードする遺伝子に位置する認識配列を認識及び切断するように操作されたエンド
ヌクレアーゼを利用する。このような遺伝子には、限定されないが、ヒトT細胞受容体α
定常領域遺伝子(配列番号127)をコードする遺伝子が含まれ得る。この方法に有用な
エンドヌクレアーゼには、限定されないが、組換えメガヌクレアーゼ、CRISPR、T
ALEN、コンパクトTALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、メガTA
Lが含まれ得る。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼが組換えメガヌクレアー
ゼであり、メガヌクレアーゼ認識配列が配列番号128~130のいずれか1つを含む。
ヒトT細胞受容体α定常領域遺伝子における認識配列を認識及び切断するために有用な組
換えメガヌクレアーゼには、限定されないが、米国特許出願公開第62/237382号
明細書及び第62/237394号明細書に開示されるものが含まれ得る。TCR認識配
列での切断は、切断部位でのNHEJ及び内因性T細胞受容体の発現破壊を可能にするこ
とができる。更に、TCR認識配列での切断は更に、外因性核酸配列の直接的な標的化遺
伝子への相同組換えを可能にすることができる。
たヌクレアーゼをコードする核酸として、細胞に送達される。このような核酸は、DNA
(例えば、環状若しくは線状のプラスミドDNA又はPCR産物)又はRNAである。操
作されたヌクレアーゼコード配列がDNA形態で送達される実施形態では、これがメガヌ
クレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結されるべきである
。本開示に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期(CMV)プロモ
ータ(Thomsenら(1984)、Proc Natl Acad Sci USA
.81(3):659~63)又はSV40初期プロモータ(Benoist及びCha
mbon(1981)、Nature.290(5804):304~10)等の構成的
プロモータ、並びにテトラサイクリン誘導型プロモータ(Dingermannら(19
92)、Mol Cell Biol.12(9):4038~45)等の誘導型プロモ
ータが含まれる。
たヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる可能性を減らすので、
細胞に送達される。操作されたヌクレアーゼをコードするこのようなmRNAは、インビ
トロ転写等の当技術分野で公知の方法を用いて作製される。いくつかの実施形態では、m
RNAが7-メチル-グアノシンを用いてキャップ付加される。いくつかの実施形態では
、mRNAがポリアデニル化される。
内で同時に発現する2以上のヌクレアーゼをコードするポリシストロン性mRNAである
。ポリシストロン性mRNAは、同じ標的遺伝子内の異なる認識配列を標的化する本開示
の2以上のヌクレアーゼをコードすることができる。あるいは、ポリシストロン性mRN
Aは、本開示の1又は複数のヌクレアーゼ及び同じ遺伝子に位置する別個の認識配列を標
的化する第2のヌクレアーゼ、あるいは切断部位が両遺伝子において生成されるように、
第2の遺伝子に位置する第2の認識配列をコードし得る。ポリシストロン性mRNAは、
それだけに限らないが、IRESエレメント(例えば、配列番号362)、T2Aエレメ
ント(例えば、配列番号363)、P2Aエレメント(例えば、配列番号364)、E2
Aエレメント(例えば、配列番号365)、及びF2Aエレメント(例えば、配列番号3
66)を含む、同じmRNA分子からの2つの遺伝子(即ち、シストロン)の翻訳を可能
にする当技術分野で公知の任意のエレメントを含むことができる。開示
き、これによって、当技術分野で公知の様々な異なる機構による、対象となる配列を含む
切断部位での相同組換え又は非相同末端結合が可能になる。
ーゼをコードするDNA/mRNAを、細胞透過性ペプチド又は標的リガンドに結合して
細胞取り込みを促進する。当技術分野で公知の細胞透過性ペプチドの例としては、ポリア
ルギニン(Jearawiriyapaisarnら(2008)Mol Ther.1
6:1624~9)、HIVウイルス由来のTATペプチド(Hudeczら(2005
)、Med.Res.Rev.25:679~736)、MPG(Simeoniら(2
003)Nucleic Acids Res.31:2717~2724)、Pep-
1(Deshayesら(2004)Biochemistry43:7698~770
6)及びHSV-1 VP-22(Deshayesら(2005)Cell Mol
Life Sci.62:1839~49)が挙げられる。別の実施形態では、操作され
たヌクレアーゼ又は操作されたヌクレアーゼをコードするDNA/mRNAを、ヌクレア
ーゼタンパク質/DNA/mRNAが標的細胞に結合し、標的細胞によって内部移行され
るように、標的細胞上で発現される特異的細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合的又
は非共有結合的に結合させる。あるいは、操作されたヌクレアーゼタンパク質/DNA/
mRNAを、このような細胞表面受容体の天然リガンド(又は天然リガンドの一部)に共
有結合的又は非共有結合的に結合させる。((McCallら(2014)Tissue
Barriers.2(4):e944449;Dindaら(2013)Curr
Pharm Biotechnol.14:1264~74;Kangら(2014)C
urr Pharm Biotechnol.15(3):220~30;Qianら(
2014)Expert Opin Drug Metab Toxicol.10(1
1):1491~508)。
ーゼをコードするDNA/mRNAを、当技術分野で公知の方法(Sharmaら(20
14)Biomed Res Int.2014)を用いて、ナノ粒子に共有結合的、あ
るいは好ましくは非共有結合的に結合させる、又はこのようなナノ粒子内にカプセル化す
る。ナノ粒子は、その長さスケールが1μm未満、好ましくは100nm未満であるナノ
スケール送達システムである。このようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生物
学的高分子で構成されるコアを用いて設計され、組換えメガヌクレアーゼタンパク質、m
RNA又はDNAの複数のコピーがナノ粒子コアに結合又はカプセル化される。これによ
り、各細胞に送達されるタンパク質/mRNA/DNAのコピー数が増加し、従って、各
操作されたヌクレアーゼの細胞内発現が増加して、標的認識配列が切断される可能性が最
大化される。このようなナノ粒子の表面を、ポリマー又は脂質(例えば、キトサン、カチ
オン性ポリマー、又はカチオン性脂質)で更に修飾して、表面がペイロードの細胞送達及
び取り込みを増強するために追加の機能性を付与するコア-シェルナノ粒子を形成する(
Jianら2012)Biomaterials.33(30):7621~30)。有
利には、ナノ粒子を標的化分子に更に結合させて、ナノ粒子を適切な細胞型に導く、及び
/又は細胞取り込みの可能性を高めることができる。このような標的化分子の例としては
、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体の天然リガンド(又は天然リガンド
の一部)が挙げられる。
ドするDNA/mRNAを、リポソーム内にカプセル化する、あるいはカチオン性脂質(
例えば、Lipofectamine(商標)、Life Technologies
Corp.、Carlsbad、CA;Zurisら(2015)Nat Biotec
hnol.33:73~80;Mishraら(2011)J Drug Deliv.
2011:863734)を用いて複合体化する。リポソーム及びリポプレックス製剤は
、ペイロードを分解から保護し、細胞の細胞膜との融合及び/又は破壊を通して細胞取り
込み及び送達効率を促進することができる。
ーゼをコードするDNA/mRNAを、ポリマー足場(例えば、PLGA)内にカプセル
化する、あるいはカチオン性ポリマー(例えばPEI、PLL)を用いて複合体化する(
Tamboliら(2011)Ther Deliv.2(4):523~536)。
ーゼをコードするDNA/mRNAを、ミセルに自己組織化する両親媒性分子と組み合わ
せる(Tongら(2007)J Gene Med.9(11):956~66)。ポ
リマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、細胞外の非特異的相互作用を
減少させることができる親水性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)で形成され
たミセルシェルを含み得る。
ーゼをコードするDNA/mRNAを、細胞への送達のために、エマルジョン又はナノエ
マルジョン(即ち、1nm未満の平均粒径を有する)に製剤化する。「エマルジョン」と
いう用語は、限定されないが、水不混和相が水相と混合されると、極性残基(例えば、長
い炭化水素鎖)を水から離し、極性頭部基を水に向ける疎水力の結果として形成すること
ができる水中油型、油中水型、水中油中水型、若しくは油中水中油型の分散液又は液滴(
脂質構造を含む)を指す。これらの他の脂質構造としては、限定されないが、単層、少層
(paucilamellar)、及び多層脂質小胞、ミセル並びにラメラ相が挙げられ
る。エマルジョンは、水相及び親油相(典型的には油及び有機溶媒を含有する)で構成さ
れる。エマルジョンはまた、しばしば、1種又は複数の界面活性剤を含有する。ナノエマ
ルジョン製剤は、例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出
願第2002/0045667号明細書及び第2004/0043041号明細書並びに
米国特許第第6015832号明細書、第6506803号明細書、第6635676号
明細書、及び第6559189号明細書に記載されているように周知である。
ーゼをコードするDNA/mRNAを、多官能性ポリマーコンジュゲート、DNAデンド
リマー、及びポリマーデンドリマーと共有結合させる又は非共有結合的に会合させる(M
astorakosら(2015)Nanoscale.7(9):3845~56;C
hengら(2008)J Pharm Sci.97(1):123~43)。デンド
リマー生成は、ペイロードの容量及びサイズを制御することができ、高いペイロード容量
を提供することができる。更に、複数の表面基の表示を活かして、安定性を向上させ、非
特異的相互作用を低減する。
クターを用いて細胞に導入する。このようなベクターは、当技術分野で公知であり、レト
ロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随
伴ウイルス(AAV)ベクターが含まれる(Vannucciら(2013 New M
icrobiol.36:1~22)に概説)。本開示で有用な組換えAAVベクターは
、ウイルスの細胞への形質導入及びヌクレアーゼ遺伝子の細胞ゲノムへの挿入を可能にす
る任意の血清型を有することができる。特定の実施形態では、組換えAAVベクターがA
AV2又はAAV6の血清型を有する。組換えAAVベクターはまた、それらが宿主細胞
において第2鎖DNA合成を必要としないように自己相補的であり得る(McCarty
ら(2001)Gene Ther.8:1248~54)。
スベクター(例えばAAV)を介して送達する場合、これらをプロモータに作動可能に連
結しなければならない。いくつかの実施形態では、これが、ウイルスベクター(例えば、
レンチウイルスベクターのLTR)の内因性プロモータ又は周知のサイトメガロウイルス
-若しくはSV40ウイルス-初期プロモータ等のウイルスプロモータである。好ましい
実施形態では、ヌクレアーゼ遺伝子を、標的細胞(例えば、ヒトT細胞)において遺伝子
発現を優先的に駆動するプロモータに作動可能に連結する。
子に挿入されるように、外因性核酸の細胞への導入を提供する。いくつかの実施形態では
、外因性核酸が、5’相同性アーム及び3’相同性アームを含み、核酸配列のヌクレアー
ゼ切断部位での細胞ゲノムへの組換えを促進する。
定の実施形態では、外因性核酸を、ウイルスベクター、好ましくは組換えAAVベクター
によって導入する。外因性核酸を導入するために有用な組換えAAVベクターは、ウイル
スの細胞への形質導入及び外因性核酸配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清
型を有することができる。特定の実施形態では、組換えAAVベクターがAAV2又はA
AV6の血清型を有する。組換えAAVベクターはまた、それらが宿主細胞において第2
鎖DNA合成を必要としないように自己相補的であり得る。
一本鎖DNAは、外因性核酸を含むことができ、好ましい実施形態では、相同組換えによ
る核酸配列のヌクレアーゼ切断部位への挿入を促進するための5’及び3’相同性アーム
を含むことができる。一本鎖DNAは、5’相同性アームの5’上流に5’AAV末端逆
位リピート(ITR)配列、及び3’相同性アームの3’下流に3’AAV ITR配列
を更に含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の遺伝子改変細胞又は遺伝子改変細胞の集
団と、医薬担体とを含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、公知の技術に
よって調製される。例えば、Remington、The Science and P
ractice of Pharmacy(第21版2005)を参照されたい。本開示
による医薬製剤の製造では、細胞が、典型的には、薬学的に許容される担体と混和され、
得られた組成物が対象に投与される。担体は、当然、製剤中の他の成分と相溶性であると
いう意味で許容されなければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形
態では、本開示の医薬組成物が、対象の疾患の治療に有用な1種又は複数の更なる薬剤を
更に含むことができる。遺伝子改変細胞が遺伝子改変ヒトT細胞(又はそれに由来する細
胞)である更なる実施形態では、本開示の医薬組成物が、インビボでの細胞増殖及び生着
を促進するサイトカイン(例えば、IL-2、IL-7、IL-15、及び/又はIL-
21)等の生物学的分子を更に含むことができる。本開示の遺伝子改変細胞を含む医薬組
成物は、更なる薬剤又は生物学的分子と同じ組成物で投与される、あるいは、別個の組成
物で同時投与される。
療するのに有用である。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物が、がんの治療に有用
である。このようながんには、限定されないが、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、白血病、
B細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、黒色腫、前立腺が
ん、結腸がん、腎細胞癌、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫が含ま
れ得る。一定の実施形態では、B細胞起源のがんには、限定されないが、B系列急性リン
パ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫が含まれ
る。
ターを提供する。組換えAAVベクターは、典型的には、HEK-293等の哺乳動物細
胞株において産生される。ウイルスcap遺伝子及びrep遺伝子は、その自己複製が1
又は複数の治療遺伝子(例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子)を送達する余地を作り出す
のを防ぐためにベクターから除去されるので、これらをパッケージング細胞株においてト
ランスで提供することが必要である。更に、複製を支持するために必要な「ヘルパー」(
例えば、アデノウイルス)成分を提供することが必要である(Cots D、Bosch
A、Chillon M(2013)Curr. Gene Ther.13(5):
370~81)。しばしば、組換えAAVベクターを、細胞株を、「ヘルパー」成分をコ
ードする第1のプラスミド、cap遺伝子及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並
びにウイルスにパッケージングされる介在DNA配列を含むウイルスITRを含む第3の
プラスミドでトランスフェクトする三重トランスフェクションを用いて作製する。次いで
、カプシドに包まれたゲノム(ITR及び対象となる1又は複数の介在遺伝子)を含むウ
イルス粒子を、凍結-解凍サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の
他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又は
アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、その後、対象となる1又は複数の遺
伝子、細胞、組織、又は生物(ヒト患者等)に送達する。
際に、部位特異的エンドヌクレアーゼがパッケージング細胞中で確実に発現されないよう
に注意を払わなければならない。本開示のウイルスゲノムは、エンドヌクレアーゼの認識
配列を含むので、パッケージング細胞株で発現される任意のエンドヌクレアーゼは、それ
がウイルス粒子にパッケージングされる前にウイルスゲノムを切断することができる。こ
れは、パッケージング効率の低下及び/又は断片化したゲノムのパッケージングを生じる
。以下を含むいくつかのアプローチが、パッケージング細胞におけるエンドヌクレアーゼ
発現を防止するために使用される:
モータの制御下に置かれる。例えば、筋組織への1又は複数のエンドヌクレアーゼ遺伝子
の送達のためのウイルスベクターを開発する場合、筋特異的プロモータを使用する。筋特
異的プロモータの例としては、C5-12(Liuら(2004)Hum Gene T
her.15:783~92)、筋特異的クレアチンキナーゼ(MCK)プロモータ(Y
uasaら(2002)Gene Ther.9:1576~88)又は平滑筋22(S
M22)プロモータ(Haaseら(2013)BMC Biotechnol.13:
49~54)が挙げられる。CNS(ニューロン)特異的プロモータの例としては、NS
E、シナプシン、及びMeCP2プロモータが挙げられる(Lentzら(2012)N
eurobiol Dis.48:179~88)。肝特異的プロモータの例としては、
アルブミンプロモータ(Palb等)、ヒトα1-抗トリプシン(Pa1AT等)、及び
ヘモペキシン(Phpx等)が挙げられる(Kramer,MGら、(2003)Mol
.Therapy 7:375~85)。眼特異的プロモータの例としては、オプシン、
及び角膜上皮特異的K12プロモータが挙げられる(Martin KRG、Klein
RL及びQuigley HA(2002)Methods(28):267~75)
(Tong Yら、(2007)J Gene Med、9:956~66)。これらの
プロモータ又は当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、HEK-293細胞に
おいて高度に活性ではなく、従って、本開示のウイルスベクターに組み込まれた場合にパ
ッケージング細胞において有意なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じることは
期待されない。同様に、本開示のウイルスベクターは、不適合組織特異的プロモータ(即
ち、周知のHeLa細胞株(ヒト上皮細胞)及び肝特異的ヘモペキシンプロモータを使用
)を用いる他の細胞株の使用を熟慮する。組織特異的プロモータの他の例としては、滑膜
肉腫PDZD4(小脳)、C6(肝臓)、ASB5(筋肉)、PPP1R12B(心臓)
、SLC5A12(腎臓)、コレステロール調節APOM(肝臓)、ADPRHL1(心
臓)、及び単一遺伝子奇形症候群TP73L(筋肉)が挙げられる。(Jacox Eら
、(2010)PLoS One v.5(8):e12274)。
ッケージングされる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳動物パッケージング細胞において
活性ではない、周知のサイトメガロウイルス-又はSV40ウイルス-初期プロモータ等
の哺乳動物プロモータを用いて、微生物、昆虫、又は植物細胞中で産生される。好ましい
実施形態では、ウイルス粒子が、Gaoら(Gao,H.ら(2007)J.Biote
chnol.131(2):138~43)によって記載されるバキュロウイルス系を用
いて昆虫細胞中で作製される。哺乳動物プロモータの制御下にあるエンドヌクレアーゼは
、これらの細胞で発現する可能性が低い(Airenne,KJら(2013)Mol.
Ther.21(4):739~49)。更に、昆虫細胞は、哺乳動物細胞とは異なるm
RNAスプライシングモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン(HGH)イント
ロン又はSV40ラージT抗原イントロン等の哺乳動物イントロンをエンドヌクレアーゼ
のコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞においてプレ
mRNA転写産物から効率的にスプライシングされないので、昆虫細胞は機能的エンドヌ
クレアーゼを発現せず、全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得られた組換えA
AV粒子が送達される哺乳動物細胞は、プレmRNAを適切にスプライシングし、機能的
エンドヌクレアーゼタンパク質を発現する。Haifeng Chenは、HGH及びS
V40ラージT抗原イントロンの使用が、昆虫パッケージング細胞中の毒性タンパク質バ
ルナーゼ及びジフテリア毒素断片Aの発現を減弱させ、これらの毒素遺伝子を有する組換
えAAVベクターの産生を可能にすることを報告した(Chen,H(2012)Mol
Ther Nucleic Acids.1(11):e57)。
クレアーゼ遺伝子が誘導型プロモータに作動可能に連結される。誘導型プロモータの例と
しては、Tet-Onシステム(Clontech;Chen H.ら、(2015)B
MC Biotechnol.15(1):4))及びRheoSwitchシステム(
Intrexon;Sowa G.ら、(2011)Spine、36(10):E62
3-8)が挙げられる。両システム及び当技術分野で公知の同様のシステムは、小分子ア
クチベータ(それぞれドキシサイクリン又はエクジソン)に応答して転写を活性化するリ
ガンド誘導型転写因子(それぞれTetリプレッサー及びエクジソン受容体の変異体)に
依存する。このようなリガンド誘導型転写アクチベータを用いた本開示の実施は、1)転
写因子のための1又は複数の結合部位を有するエンドヌクレアーゼ遺伝子を、対応する転
写因子に応答するプロモータの制御下に配置することと;2)転写因子をコードする遺伝
子をパッケージングされたウイルスゲノムに含めることとを含む。転写アクチベータも同
じ細胞に供給されない場合、組換えAAV送達後にエンドヌクレアーゼが標的細胞でも組
織でも発現されないので、後者のステップが必要である。次いで、転写アクチベータが、
同族小分子アクチベータで処理された細胞又は組織においてのみエンドヌクレアーゼ遺伝
子発現を誘導する。このアプローチは、小分子誘導物質がいつ及びどの組織に送達される
かを選択することによって、エンドヌクレアーゼ遺伝子発現を空間-時間的様式で調節す
ることができるので有利である。しかしながら、担持能力が著しく制限されたウイルスゲ
ノムに誘導物質を含める必要性が、このアプローチの欠点を生み出す。
げる転写リプレッサーを発現する哺乳動物細胞株において産生される。転写リプレッサー
は当技術分野で公知であり、Tetリプレッサー、Lacリプレッサー、Croリプレッ
サー、及びλリプレッサーを含む。エクジソン受容体等の多くの核内ホルモン受容体は、
それらの同族ホルモンリガンドの非存在下で転写リプレッサーとしても作用する。本開示
を実施するために、パッケージング細胞を、転写リプレッサーをコードするベクターでト
ランスフェクト/形質導入し、ウイルスゲノム(パッケージングベクター)中のエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を、リプレッサーがプロモータをサイレンシングするように、リプレッ
サーのための結合部位を含むように改変されたプロモータに作動可能に連結する。転写リ
プレッサーをコードする遺伝子は種々の位置に置かれる。これは別のベクターにコードさ
れる;これはITR配列の外側のパッケージングベクターに組み込まれる;これはcap
/repベクター又はアデノウイルスヘルパーベクターに組み込まれる;あるいは最も好
ましくは、これは構成的に発現されるようにパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込
まれる。転写リプレッサー部位を組み込むために一般的な哺乳動物プロモータを改変する
方法は、当技術分野で公知である。例えばChang及びRoninsonは強力な構成
的CMV及びRSVプロモータをLacリプレッサーのオペレーターを含むように改変し
、改変プロモータからの遺伝子発現がリプレッサーを発現する細胞で大いに減弱すること
を示した(Chang BD及びRoninson IB(1996)Gene 183
:137~42)。非ヒト転写リプレッサーの使用は、エンドヌクレアーゼ遺伝子の転写
が、リプレッサーを発現するパッケージング細胞においてのみ抑制され、得られる組換え
AAVベクターで形質導入された標的細胞でも組織でも抑制されないことを保証する。
ヌクレアーゼ及びその変異体を包含する。本開示の更なる実施形態は、本明細書に記載さ
れる組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及
びこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。
している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の1又は複数の内部部位での1又
は複数のアミノ酸の欠失又は付加、並びに/あるいは天然ポリペプチドの1又は複数の部
位での1又は複数のアミノ酸の置換によって、「天然」ポリペプチドから誘導されるポリ
ペプチドを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌク
レオチド又はポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形態によって包含さ
れる変異体ポリペプチドは生物学的に活性である。即ち、これらは天然タンパク質の所望
の生物学的活性;即ち、例えば、B2M13-14認識配列(配列番号2)、B2M5-
6認識配列(配列番号4)、B2M7-8認識配列(配列番号6)、及びB2M11-1
2認識配列(配列番号8)を含む、ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子(配列番号1)に
見られる認識配列を認識及び切断する能力を保持し続けている。このような変異体は、例
えばヒトの操作から生じ得る。実施形態の天然ポリペプチド(例えば、配列番号12~1
26)の生物学的に活性な変異体、又は本明細書に記載される認識半部位結合サブユニッ
ト(例えば、配列番号132~361)の生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇
所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される、
少なくとも約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、
約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、
約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%の天然ポリペプチド又は天然サ
ブユニットのアミノ酸配列との配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又はサブユ
ニットの生物学的に活性な変異体は、わずか約1~40アミノ酸残基、わずか約1~20
、わずか約1~10、わずか約5、わずか4、3、2、又は1アミノ酸残基しか、そのポ
リペプチド又はサブユニットと異ならない。
で改変される。このような操作の方法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、
アミノ酸配列変異体は、DNA中の突然変異によって調製される。突然変異誘発及びポリ
ヌクレオチド改変のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Kunkel(1
985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488~492;Kun
kelら(1987)Methods in Enzymol.154:367~382
;米国特許第4873192号明細書;Walker及びGaastra編(1983)
Techniques in Molecular Biology(MacMilla
n Publishing Company、ニューヨーク)、並びにこれらの文献に引
用されている参考文献を参照されたい。対象となるタンパク質の生物学的活性に影響を及
ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、参照により本明細書に組み込まれる
Dayhoffら(1978)Atlas of Protein Sequence
and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.、ワシン
トンD.C.)のモデルに見出される。あるアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸
で交換する等の保存的置換が最適である。
するように、単独で又は組み合わせて、DNA認識配列半部位内の個々の塩基で変えられ
た特異性を有する組換えメガヌクレアーゼをもたらす、野生型I-CreIメガヌクレア
ーゼのDNA認識ドメインに対する相当な数のアミノ酸改変が以前同定された(例えば、
米国特許第8021867号明細書)。表5は、認識半部位の各半部位位置(-1~-9
)に存在する塩基に基づいて特異性を増強するために組換えメガヌクレアーゼ単量体又は
サブユニットにおいてなされ得る潜在的置換を提供する。このような置換を、本明細書に
開示されるメガヌクレアーゼの変異体に組み込む。
での1又は複数のヌクレオチドの欠失及び/又は付加を含む。当業者であれば、オープン
リーディングフレームが維持されるように実施形態の核酸の変異体が構築されることを認
識するであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体には、遺伝暗号の縮重のために
、実施形態のポリペプチドの1つのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。変異体ポ
リヌクレオチドには、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて生成されるが、実施形態
の組換えメガヌクレアーゼを依然としてコードするポリヌクレオチド等の合成由来のポリ
ヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明
細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって
決定される、少なくとも約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%
、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%
、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、又はそれ以上の特定
のポリヌクレオチドとの配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチド(即ち
、参照ポリヌクレオチド)の変異体は、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポ
リペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列同一
性%を比較することによって評価することもできる。
において根本的な変化を生じることは期待されない。しかしながら、それに先立って置換
、欠失、又は挿入の正確な効果を予測することが困難な場合、当業者は、ヒトβ-2ミク
ログロブリン遺伝子(配列番号1)内に見られる認識配列を優先的に認識及び切断する能
力についてポリペプチドをスクリーニングすることによってその効果が評価されることを
理解するであろう。
べきではない。当業者であれば、日常的な実験にすぎないものを用いて、本明細書に記載
される特定の物質及び手順に対する多数の等価物を認識する、又は確認することができる
であろう。このような等価物は、以下の実施例に従う特許請求の範囲に包含されることが
意図される。
ゼ(配列番号12~100)は、ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子(配列番号1)に存
在するB2M13-14認識配列(配列番号2)を認識及び切断するように操作された。
各B2M13-14組換えメガヌクレアーゼは、SV40に由来するN末端ヌクレアーゼ
局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガ
ヌクレアーゼサブユニットを含む。各B2M13-14メガヌクレアーゼの第1のサブユ
ニットは配列番号2のB2M13認識半部位に結合する一方で、第2のサブユニットはB
2M14認識半部位に結合する(図1参照)。
VR1及びHVR2と呼ばれる56塩基対超可変領域を含む。B2M13結合サブユニッ
トは、80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除いてHVR1領域の外側で高度に
保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、HVR1領域内で高度に保存されて
いる。同様に、B2M14結合サブユニットも、80位又は271位(Q又はE残基を含
む)を除いてHVR2領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一で
ある。HVR1領域と同様に、HVR2領域も高度に保存されている。
て提供される。配列番号132~220の各々は、メガヌクレアーゼB2M13-14x
.479(配列番号12)のB2M13結合領域である配列番号132と少なくとも90
%の配列同一性を共有する。配列番号12~100のB2M14結合領域は、それぞれ配
列番号221~309として提供される。配列番号221~309の各々は、メガヌクレ
アーゼB2M13-14x.479(配列番号12)のB2M14結合領域である配列番
号221と少なくとも90%の配列同一性を共有する。
配列番号101~113)は、ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子(配列番号1)に存在
するB2M5-6認識配列(配列番号4)を認識及び切断するように操作された。各B2
M5-6組換えメガヌクレアーゼは、SV40に由来するN末端ヌクレアーゼ局在化シグ
ナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアー
ゼサブユニットを含む。各B2M5-6メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは配列番
号4のB2M5認識半部位に結合する一方で、第2のサブユニットはB2M6認識半部位
に結合する(図1参照)。
1及びHVR2と呼ばれる56塩基対超可変領域を含む。B2M5結合サブユニットは、
80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除いてHVR1領域の外側で高度に保存さ
れている、あるいは多くの場合、同一であり、HVR1領域内で高度に保存されている。
同様に、B2M5結合サブユニットも、80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除
いてHVR2領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、H
VR2領域内で高度に保存されている。
て提供される。配列番号310~322の各々は、メガヌクレアーゼB2M5-6x.1
4(配列番号101)のB2M5結合領域である配列番号310と少なくとも90%の配
列同一性を共有する。配列番号101~113のB2M6結合領域は、それぞれ配列番号
323~335として提供される。配列番号323~335の各々は、メガヌクレアーゼ
B2M5-6x.14(配列番号101)のB2M6結合領域である配列番号323と少
なくとも90%の配列同一性を共有する。
配列番号114~124)は、ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子(配列番号1)に存在
するB2M7-8認識配列(配列番号6)を認識及び切断するように操作された。各B2
M7-8組換えメガヌクレアーゼは、SV40に由来するN末端ヌクレアーゼ局在化シグ
ナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアー
ゼサブユニットを含む。各B2M7-8メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは配列番
号6のB2M7認識半部位に結合する一方で、第2のサブユニットはB2M8認識半部位
に結合する(図1参照)。
1及びHVR2と呼ばれる56塩基対超可変領域を含む。B2M7結合サブユニットは、
80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除いてHVR1領域の外側で高度に保存さ
れている、あるいは多くの場合、同一であり、HVR1領域内で高度に保存されている。
同様に、B2M8結合サブユニットも、80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除
いてHVR2領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、H
VR2領域内で高度に保存されている。
て提供される。配列番号336~346の各々は、メガヌクレアーゼB2M7-8x.8
8(配列番号114)のB2M7結合領域である配列番号336と少なくとも90%の配
列同一性を共有する。配列番号114~124のB2M8結合領域は、それぞれ配列番号
347~357として提供される。配列番号347~357の各々は、メガヌクレアーゼ
B2M7-8x.88(配列番号114)のB2M8結合領域である配列番号347と少
なくとも90%の配列同一性を共有する。
ゼ(配列番号125及び126)は、ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子(配列番号1)
に存在するB2M11-12認識配列(配列番号8)を認識及び切断するように操作され
た。各B2M11-12組換えメガヌクレアーゼは、SV40に由来するN末端ヌクレア
ーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2の
メガヌクレアーゼサブユニットを含む。各B2M11-12メガヌクレアーゼの第1のサ
ブユニットは配列番号8のB2M11認識半部位に結合する一方で、第2のサブユニット
はB2M12認識半部位に結合する(図1参照)。
VR1及びHVR2と呼ばれる56塩基対超可変領域を含む。B2M11結合サブユニッ
トは、80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除いてHVR1領域の外側で高度に
保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、HVR1領域内で高度に保存されて
いる。同様に、B2M12結合サブユニットも、80位又は271位(Q又はE残基を含
む)を除いてHVR2領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一で
あり、HVR2領域内で高度に保存されている。
9として提供される。配列番号358及び359は、99%の配列同一性を共有する。配
列番号125及び126のB2M12結合領域は、それぞれ配列番号360及び361と
して提供される。配列番号360及び361は、99%の配列同一性を共有する。
ーゼがそれらのそれぞれの認識配列(それぞれ配列番号2、4、6、及び8)を認識及び
切断することができるかどうかを決定するために、以前に記載されたCHO細胞レポータ
ーアッセイ(国際公開第2012/167192号パンフレット及び図8A~図8D参照
)を用いて、各組換えメガヌクレアーゼを評価した。アッセイを行うために、細胞のゲノ
ムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現カセットを保有する
CHO細胞レポーター株を作製した。各細胞株のGFP遺伝子を、メガヌクレアーゼによ
るいずれかの認識配列の細胞内切断が機能的GFP遺伝子をもたらす相同組換え事象を刺
激するように、一対の認識配列によって中断した。
1つの認識配列が、B2M13-14認識配列(配列番号2)、B2M5-6認識配列(
配列番号4)、B2M7-8認識配列(配列番号6)、又はB2M11-12認識配列(
配列番号8)であった。GFP遺伝子に挿入された第2の認識配列は、「CHO-23/
24」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによって認識及び切断されるCHO-23/24
認識配列であった。B2M13-14認識配列及びCHO-23/24認識配列を含むC
HOレポーター細胞は、本明細書で「B2M13-14細胞」と呼ばれる。B2M5-6
認識配列及びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、本明細書で「
B2M5-6細胞」と呼ばれる。B2M7-8認識配列及びCHO-23/24認識配列
を含むCHOレポーター細胞は、本明細書で「B2M7-8細胞」と呼ばれる。B2M1
1-12認識配列及びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、本明
細書で「B2M11-12細胞」と呼ばれる。
2M13-14細胞を、B2M13-14メガヌクレアーゼをコードするプラスミドDN
Aでトランスフェクトした)又はCHO-23/34メガヌクレアーゼをコードするプラ
スミドDNAでトランスフェクトした。各アッセイで、4e5CHOレポーター細胞を、
製造業者の指示に従って、Lipofectamine2000(ThermoFish
er)を使用して、96ウェルプレート中50ngのプラスミドDNAでトランスフェク
トした。トランスフェクションの48時間後に、細胞をフローサイトメトリーによって評
価して、トランスフェクトされていない陰性対照(例えば、B2M13-14bs)と比
較したGFP陽性細胞の割合を決定した。図4A~図4Jに示されるように、試験したB
2M13-14、B2M5-6、B2M7-8、及びB2M11-12メガヌクレアーゼ
は全て、陰性対照を有意に超える頻度で、それらの対応する認識配列を含む細胞株におい
てGFP陽性細胞を産生することが分かった。
6メガヌクレアーゼ、B2M11-12メガヌクレアーゼ、及びB2M13-14メガヌ
クレアーゼが、細胞内でそれらのそれぞれの認識配列を効率的に標的化及び切断すること
ができることを実証した。
、ドナーから得られたヒトT細胞のB2M13-14認識配列を切断し、B2M細胞表面
発現の抑制をもたらし得ることを実証した。B2MメガヌクレアーゼがヒトT細胞のB2
M13-14認識配列を切断することができるかどうかを試験するために、ドナー細胞を
抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、A
maxa 4D-Nucleofector(Lonza)を用いて、所与のB2M13
-14メガヌクレアーゼをコードするmRNA(1μg)を用いて電気穿孔した。陽性対
照として、細胞を疑似電気穿孔した。電気穿孔効率についての更なる対照では、細胞を、
GFPをコードするmRNA(1μg)を用いて電気穿孔した。電気穿孔の3日後、細胞
を、β-2ミクログロブリンを認識する抗体(BD Biosciences)で染色し
、フローサイトメトリーによって分析した。フロープロットを図5A~図5Nに示し、デ
ータを表6に要約する。
、それぞれ0.18%及び0.23%の細胞が陰性染色であった(図5A及び図5C、並
びに表6)。染色されていない対照細胞は、B2M染色について99.99%陰性であっ
た(図5B及び表6)。驚くべきことに、試験したB2M13-14メガヌクレアーゼの
全てがCHOレポーターアッセイにおいて成功したが、B2M13-14x.93は、B
2M遺伝子で挿入欠失をもたらし、B2M細胞表面発現を低下させ得る兆候を示した唯一
のメガヌクレアーゼであり、細胞の2.18%がB2Mについて陰性染色であった(図5
N及び表6)。試験した他のB2M13-14メガヌクレアーゼのいずれかを用いて電気
穿孔した細胞は、0.01%~0.14%陰性に及ぶ模擬電気穿孔対照とほぼ同等のB2
M陰性細胞を示した(図5A~5M及び表6)。これらの結果は、B2M遺伝子について
、レポーター細胞におけるB2M認識配列の成功した切断が、T細胞における認識配列の
切断、及びその後、B2Mの細胞表面発現低下を保証しないことを示した。
13-14メガヌクレアーゼの唯一のものであったので、このメガヌクレアーゼを更に改
変してヌクレアーゼ活性を増加させた。本発明者らは、以前、I-CreI由来メガヌク
レアーゼサブユニットのアミノ酸80位及び66位(それぞれ単鎖メガヌクレアーゼの2
71位及び257位に相当する)の突然変異が、おそらくは負に荷電したDNA骨格との
非特異的相互作用のために、ヌクレアーゼ活性に劇的に影響し得ることを示した。一般的
な置換には、アミノ酸80位のE又はQ、及びアミノ酸66位のY、K、又はRが含まれ
る。第1のメガヌクレアーゼサブユニット及び/又は第2のメガヌクレアーゼサブユニッ
トのアミノ酸80位を変化させることができ、以下の考えられる組み合わせを生み出す:
両メガヌクレアーゼサブユニットのE、両メガヌクレアーゼサブユニットのQ、第1のメ
ガヌクレアーゼサブユニットのE及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットのQ、又は第
1のメガヌクレアーゼサブユニットのQ及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットのE。
アミノ酸66位はメガヌクレアーゼサブユニットのいずれでも改変することができるが、
この場合、第1のメガヌクレアーゼサブユニットにおいてのみ改変する。元のB2M13
-14x.93メガヌクレアーゼは、両メガヌクレアーゼサブユニットにおいてアミノ酸
80位にQを有していた。
はQ、引き続いて第1のメガヌクレアーゼサブユニットの66位で行われたアミノ酸置換
により作製されたB2M13-14x.93変異体を示す。例えば、B2M13-14x
.93EQY66は、第1のメガヌクレアーゼサブユニットのアミノ酸80がEであり、
第2のメガヌクレアーゼサブユニットのアミノ酸80(即ち、271)がQであり、第1
のメガヌクレアーゼサブユニットのアミノ酸66がYであることを示す。
CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Am
axa 4D-Nucleofector(Lonza)を用いて、所与のB2M13-
14メガヌクレアーゼをコードするmRNA(1μg)を用いて電気穿孔した。電気穿孔
の3日後、細胞を、β-2ミクログロブリンを認識する抗体(BD Bioscienc
es)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーの結果
を表7に要約する。全てのB2M13-14x.93変異体が、1.58%~37%に及
ぶノックアウト効率でB2M遺伝子を破壊することができた(表7)。最も活性のB2M
13-14x.93変異体はB2M13-14x.93QEであり、これは37%のB2
M陰性細胞をもたらした(表7)。次の2つの最も活性のB2M13-14x.93メガ
ヌクレアーゼ変異体は共に、第2のメガヌクレアーゼサブユニットの80位にQを有し、
66位にYを有していた(B2M13-14x.93QQY66及びB2M13-14x
.93EQY66)。興味深いことに、変異体の大部分は元のB2M13-14x.93
メガヌクレアーゼと著しくは異なっていなかった(B2M13-14x.93EQ、QQ
K66、QQR66、EEY66、EEK66、EER66、EQK66、及びEQR6
6)。
ガヌクレアーゼよりB2M13-14認識配列に対して活性なB2M13-14x.93
メガヌクレアーゼをもたらしたが、更なる最適化を行って、B2M13-14メガヌクレ
アーゼの活性を最大化した。第1のメガヌクレアーゼサブユニットがB2M13-14x
.93と同じままであるが、第2のメガヌクレアーゼサブユニットがB2M13-14認
識配列と接触する位置に新しいアミノ酸置換を含む新たなB2M13-14メガヌクレア
ーゼを設計した。
3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Amax
a 4D-Nucleofector(Lonza)を用いて、所与のB2M13-14
メガヌクレアーゼをコードするmRNA(1μg)を用いて電気穿孔した。B2M13-
14x.93QEを、以前の変異体との比較を可能にするために含めた。電気穿孔の6日
後に、細胞を、β-2ミクログロブリンを認識する抗体(BD Biosciences
)並びにCD3を認識する抗体(BioLegend)、T細胞のマーカーで染色した。
フローサイトメトリープロットを図6A~図6Jに示す。
9%と比較して、21.2%のB2M陰性細胞を生じた(それぞれ図6B及び図6A)。
B2M13-14x.97、B2M13-14x.199、B2M13-14x.202
、B2M13-14x.169、及びB2M13-14x.275を含む新たな変異体の
いくつかは、B2M13-14x.93QEよりも有意に活性であり、B2Mノックアウ
ト効率が58.4%と高かった(図6J)。
細胞表面発現を排除するそれらの能力について評価した。これらのヌクレアーゼは、上記
変異体の1つであるB2M13-14x.169に基づいていた。第1のメガヌクレアー
ゼサブユニットに改変を行って代わりの塩基接触を導入した一方、第2のメガヌクレアー
ゼサブユニットはB2M13-14x.169と同じままであった。
者の指示に従って、Amaxa 4D-Nucleofector(Lonza)を用い
て、所与のB2M13-14メガヌクレアーゼをコードするmRNA(1μg)を用いて
電気穿孔した。B2M13-14x.202を、図6A~図6Jに示される以前の変異体
との比較を可能にするために含めた。B2M表面発現の喪失を探すために、細胞を、β-
2ミクログロブリンを認識する抗体(BD Biosciences)並びにCD3を認
識する抗体(BioLegend)、T細胞のマーカーで染色した。電気穿孔後3日目の
変異体パネル全体のフローサイトメトリーデータを表8に要約し、40%超のB2Mノッ
クアウト効率を示したB2M13-14メガヌクレアーゼのフロープロットを図7A~図
7Hに示す。
ト効率を示した(表8)。試験したB2M13-14変異体のいくつかは、40%を超え
るノックアウト効率を示し(図7A~図7H)、B2M13-14x.287及びB2M
13-14x.479の2つの変異体は、B2M13-14x.202の効率を上回り、
陰性染色集団はそれぞれ75.7%及び67.2%であった。
に設計されたメガヌクレアーゼの成功した操作、及びヒトT細胞におけるβ-2ミクログ
ロブリン遺伝子に突然変異を生成するためのこのようなメガヌクレアーゼの使用が、遺伝
子のノックアウトをもたらしたことを実証している。驚くべきことに、CHOレポーター
アッセイで成功した11種のB2M13-14メガヌクレアーゼのうちの1つのみが、実
際にB2M遺伝子の発現を排除することができた。更に、B2M遺伝子の欠失を引き起こ
した初期B2M13-14メガヌクレアーゼのただ1つであるB2M13-14x.93
は非常に低頻度でそうであった(2.18%、表6)。B2M13-14x.93を、そ
の活性及び特異性を最適化するために、数回の再設計に通し、最終的に60~75%の範
囲の効率でB2Mノックアウトを生成することができるいくつかのB2M13-14メガ
ヌクレアーゼを得た(表8)。
ることが望ましい場合がある。本発明者らは、同様に内因性TCRの細胞表面発現を破壊
するT細胞受容体α定常遺伝子(配列番号127)において二本鎖破壊を引き起こすよう
に設計されたメガヌクレアーゼを以前記載している。このようなメガヌクレアーゼの1つ
はTRC1-2x.87EE(配列番号131)と呼ばれ、配列番号128に示される認
識配列を標的化する。TCRの喪失は、TCRが発現されている場合にのみ細胞の表面上
に発現されるCD3タンパク質に対する抗体で細胞を染色することによって観察すること
ができる。
B2M遺伝子の両方がノックアウトされた細胞の集団を作製するために使用することがで
きるかどうかを試験するために、これらのメガヌクレアーゼをコードする別個のmRNA
をヒトT細胞に同時に送達する実験を行った。第1の試験で、ドナーヒトT細胞を抗CD
3抗体及び抗CD28抗体で2日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Amax
a 4D-Nucleofector(Lonza)を用いて、B2M13-14x.2
02をコードするmRNA(1μg)及びTRC1-2x.87EEをコードするmRN
A(1μg)を用いて同時電気穿孔した。対照として、ヒトT細胞を模擬電気穿孔した、
又はB2M13-14x.202若しくはTRC1-2x.87EEのいずれかの単一メ
ガヌクレアーゼをコードするmRNAを用いて電気穿孔した。電気穿孔の6日後、細胞を
CD3に対する抗体及びB2Mに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分
析した(図8A~図8D)。TRC1-2x.87EE単独で電気穿孔した細胞は、模擬
電気穿孔細胞(図8A)の2.35%と比較して57.6%のTCR陰性であり(図8B
)、B2M13-14x.202単独で電気穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞(図8A
)の0.72%と比較して、49.4%B2M陰性(図8C)であった。B2M13-1
4x.202をコードするmRNA及びTRC1-2x.87EEをコードするmRNA
を用いて同時電気穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞(図8A)の0.66%と比較して
、細胞の21.5%がB2M発現とTCR発現の両方について陰性である(図8D)はっ
きりした集団を示す。両メガヌクレアーゼについてmRNAを用いて同時電気穿孔した細
胞では、TCR及びB2Mに対する単一ノックアウト効率は、それぞれ28.3%及び1
6.7%であった。
次いで、製造業者の指示に従って、Amaxa 4D-Nucleofector(Lo
nza)を用いて、B2M13-14x.169をコードするmRNA(1μg)及びT
RC1-2x.87EEをコードするmRNA(1μg)を用いて同時電気穿孔した。対
照として、ヒトT細胞を模擬電気穿孔した、又はB2M13-14x.169若しくはT
RC1-2x.87EEのいずれかの単一メガヌクレアーゼをコードするmRNAを用い
て電気穿孔した。電気穿孔の6日後、細胞をCD3に対する抗体及びB2Mに対する抗体
で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図9A~図9D)。TRC1-2x
.87EE単独で電気穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞(図9A)の2.35%と比較
して57.6%のTCR陰性であり(図9B)、B2M13-14x.169単独で電気
穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞(図9A)の0.72%と比較して、28.1%B2
M陰性(図9C)であった。B2M13-14x.169をコードするmRNA及びTR
C1-2x.87EEをコードするmRNAを用いて同時電気穿孔した細胞は、模擬電気
穿孔細胞(図9A)の0.66%と比較して、細胞の15.4%がB2M発現とTCR発
現の両方について陰性であった(図9D)はっきりした集団を示す。両メガヌクレアーゼ
についてmRNAを用いて同時電気穿孔した細胞では、TCR及びB2Mに対する単一ノ
ックアウト効率は、それぞれ33.7%及び13.0%であった。
EメガヌクレアーゼをコードするmRNAを用いたヒトT細胞の同時電気穿孔は、B2M
/TCR二重陰性集団を作製するのに有効であるが、メガヌクレアーゼmRNAの逐次電
気穿孔を使用して、二重ノックアウト集団を作製するのも有用となり得る。
刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Amaxa 4D-Nucleofecto
r(Lonza)を用いて、B2M13-14x.93QEをコードするmRNA(1μ
g)を用いて電気穿孔した。電気穿孔の4日後、ビオチン化抗B2M抗体(BioLeg
end)及びヒトビオチン選択カクテルキット(StemCell technolog
ies)を用いてB2M陰性細胞を濃縮し、B2Mに対する抗体で染色した後のフローサ
イトメトリー分析によって示される88.15%B2M陰性(図10B)の細胞の集団を
得た。B2M陰性濃縮細胞を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間再刺激し、次いで
、製造業者の指示に従って、Amaxa 4D-Nucleofector(Lonza
)を用いて、TRC1-2x.87EEをコードするmRNA(1μg)を用いて電気穿
孔した。電気穿孔の5日後、細胞をB2M及びTCRに対する抗体で染色し、フローサイ
トメトリーによって分析した(図10C)。これらの細胞の31.67%は、出発集団(
図10A)の0.58%と比較して、B2MとTCRの両方の表面発現について陰性であ
り、B2M13-14及びTRC1-2メガヌクレアーゼをコードするmRNAを用いた
細胞の逐次電気穿孔もまたヒトT細胞のB2M/TCR二重陰性集団を作製する有効な方
法であることを示している。
かどうかを決定した。この試験では、ドナーヒト末梢血単核細胞(PMBC)を抗CD3
抗体及び抗CD28抗体で2日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Amaxa
4D-Nucleofector(Lonza)を用いて、B2M13-14x.93
QEをコードするmRNA(1μg)を用いて電気穿孔した。B2M陰性細胞を上記のよ
うに濃縮した。次いで、細胞を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間再刺激し、TR
C1-2x.87EEをコードするmRNAを用いて電気穿孔した。電気穿孔の6日後、
CD3陰性細胞を、CD3陽性選択キット(StemCell Technologie
s)を用いて濃縮し、引き続いてビオチン化抗B2M抗体及びビオチン選択キット(St
emCell Technologies)を用いてB2M陰性細胞を更に濃縮した。濃
縮細胞をIL-2、IL-7、及びIL-15の存在下で3日間インキュベートし、次い
で、B2M及びCD3に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(
図11A~図11C)。図11A及び図11Bは、抗CD3単独(図11A)又は抗CD
3と抗B2M(図11B)のいずれかで染色した出発PBMCを示す。B2M13-14
をコードするmRNAを用いた逐次電気穿孔、次いでTRC1-2x.87EEをコード
するmRNA、続いてCD3抗体及びB2M陰性細胞の濃縮により、98.5%のB2M
/TCR二重陰性である集団を得た(図11C)。
をコードするmRNAの同時電気穿孔は、B2M/TCR二重陰性ヒトT細胞の治療的に
関連する量(即ち、1000万個超の細胞)の製造及び作製を可能にし得る。1000万
個超のB2M/TCR二重陰性細胞を作製するため、ヒトT細胞を抗CD3抗体及び抗C
D28抗体で3日間刺激し、次いで、Amaxa 4D-Nucleofector(L
onza)を用いて、B2M13-14x.479をコードするmRNA及びTRC1-
2x.87EEをコードするmRNAを用いて電気穿孔する。典型的な実験では、各試料
について100万個の細胞を電気穿孔する。治療的に関連する量のB2M/TCR二重陰
性細胞を製造するために、1000万個もの細胞を電気穿孔する。電気穿孔後、細胞をI
L-2(30ng/mL)及びIL-7(10ng/mL)を含む培地で7日間インキュ
ベートする。B2M/TCR二重陰性細胞を、CD3陽性選択キット(StemCell
Technologies)を用いて濃縮し、引き続いてビオチン化抗B2M抗体及び
ビオチン選択キット(StemCell Technologies)を用いてB2M陰
性細胞を濃縮する。B2M及びCD3に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによっ
て純度を評価する。B2M/TCR二重陰性細胞を、IL-2(30ng/mL)及びI
L-7(10ng/mL)を含む培地で更に7日間インキュベート及び増殖させる。
この試験の目的は、B2MノックアウトT細胞がB2M陽性T細胞と比較して減少した
アロゲニシティを示すかどうかを実証することであった。
(C.T.L.-カタログ番号CTL-CP1ロット20060906(ドナー36)及
び20110525(ドナー75))から得た。彼らのHLAクラスIの分類は表9に示
されている。
対して各ドナーからのT細胞をプライミングすることであった。これらのアロ感作T細胞
は、細胞傷害性アッセイにおいてエフェクターとして役立った。手短に言えば、凍結PB
MCを解凍し、2%HABSを含むX-VIVO15(Lonza)中で培養することに
よって、DCを作製した。細胞をT75フラスコ中で培養し、1時間インキュベートして
単球前駆体を接着させた。非接着細胞を取り出し、10ng/mLのIL-2中で別々に
培養した。接着細胞を、800U/mL組換えヒト(rh)GM-CSF及び500U/
mL rhIL-4を補充したX-VIVO+2%HABS20mLで培養した。酵素を
含まない解離緩衝液(Life Technologies)を用いて接着DCを収穫し
た。次いで、収穫したDCを、5:1のT細胞:DC比で、磁気濃縮CD8+T細胞と共
に5日間共培養した。
ゼで編集した。B2M陰性及びB2M陽性T細胞が、細胞傷害性アッセイの標的として役
立った。手短に言えば、ドナーヒトT細胞を、抗CD3抗体、抗CD28抗体、及び抗C
D2抗体の多量体からなるStem Cell Technologiesから購入した
試薬ImmunoCultで刺激した。刺激は、製造業者の指示に従って、Amaxa
4D-Nucleofector(Lonza)を用いて、B2M13-14x479m
RNA1μgで電気穿孔する前に3日間行った。対照として、ヒトT細胞をmRNAの非
存在下で電気穿孔した。電気穿孔の6日後に、B2M13-14x.479mRNAで電
気穿孔した細胞を、B2Mに対するビオチン化抗体及び抗ビオチン磁気分離キット(St
em Cell Technologies)を用いてB2M陰性細胞について濃縮した
。B2M陰性及び対照B2M陽性細胞を、製造者の指示に従って2μMのCellTra
ce Violet(Life Technologies)で標識した。
対照)又はドナー75(同種異系試料)のいずれかからのB2M陽性又はB2M陰性Ce
llTrace Violet標識T細胞と共に培養した。同様にドナー75からのアロ
感作T細胞、及びドナー75(同系対照)又はドナー36(同種異系試料)のいずれかか
らのB2M陽性又はB2M陰性CellTrace Violet標識T細胞を用いて共
培養を行った。共培養は、5:1のエフェクター:標的比で7時間行った。インキュベー
ションの7時間後、細胞を、販売業者の推奨濃度でVAD-FMK-FITC(Casp
ACE-Promega)及びB2Mに対する蛍光抗体で標識した。複製プレートを18
時間培養し、IFNγ(ELISA、BioLegend製のキットを使用)及び乳酸脱
水素酵素(LDH)(Thermo-Fisher製のキットを使用)等の分泌物質の分
析のために上清を回収した。
細胞によって死滅した頻度を、そのVAD-FMK-FITCシグナルによって評価した
。CTLアッセイの結果を図12A~図12Hに示す。アロ感作T細胞は同系標的におい
て有意なVAD-FMK-FITCシグナルを誘導しないが、同種異系標的は24~27
%VAD-FMK-FITC+であり、エフェクター生成パーフォリンA及びグランザイ
ムBが不適合標的でアポトーシスを誘発していることを示している。VAD-FMK-F
ITCシグナルは、標的細胞がB2M十分である同種異系培養でのみ検出される。B2M
ノックアウト標的細胞は同種抗原感作T細胞によって死滅しない。
種異系T細胞分泌は、B2M陽性標的を含む培養物と比較して、B2M陰性標的を含む共
培養物において66~75%減少する(図13)。標的細胞がB2M発現を欠く場合、死
滅標的細胞によるLDH放出も同様に低下する(図14)。
る死滅に対する感受性低下を示すことが観察された。
T細胞のゲノムにキメラ抗原受容体をコードする外因性核酸配列を導入するように組換え
AAVベクターを設計する。各組換えAAVベクターを、以前に記載された三重トランス
フェクションプロトコルを用いて調製する。この試験のために調製した組換えAAVベク
ターは、自己相補的又は一本鎖AAVベクターであり得る。いずれの場合も、組換えAA
Vベクターは、一般に、5’ITR、5’相同性アーム、キメラ抗原受容体をコードする
核酸配列、SV40ポリ(A)シグナル配列、3’相同性アーム及び3’ITRを含む。
これらの試験は更に、AAV形質導入効率についての陽性対照として組み込まれるGFP
をコードするAAVベクター(GFP-AAV)の使用を含む。
ト。
7EEと合わせて組換えAAVベクターを同時に使用しながら、B2Mをノックアウトす
る効率を決定するための試験を行う。CARのTCRα定常領域への挿入は、内因性TC
Rの発現を排除するので、B2M13-14メガヌクレアーゼによってB2Mもノックア
ウトされた細胞は、CAR陽性、B2M/TCR二重陰性である。
1-2x.87EEをコードするmRNAで同時電気穿孔し、次いで直ちにTRC1-2
認識部位遺伝子座と相同性の隣接CARをコードするAAVベクターで形質導入する。B
2M13-14メガヌクレアーゼはB2M遺伝子の欠失を引き起こし、細胞表面でのB2
Mのノックアウトをもたらすが、TRC1-2メガヌクレアーゼはTRC1-2認識部位
での二本鎖破壊を引き起こし、相同組換えを通してAAVベクターによる組換えを刺激す
る。
間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Amaxa 4D-Nucleofect
or(Lonza)を用いて、TRC1-2x.87EEをコードするmRNA及びB2
M13-14メガヌクレアーゼをコードするmRNAを用いて同時電気穿孔する。細胞を
、TRC1-2認識部位遺伝子座と相同性の隣接CARをコードする組換えAAVベクタ
ーで直ちに形質導入する。B2M13-14メガヌクレアーゼはB2M遺伝子の欠失を引
き起こし、細胞表面でのB2Mのノックアウトをもたらすが、TRC1-2メガヌクレア
ーゼはTRC1-2認識部位での二本鎖破壊を引き起こし、相同組換えを通してAAVベ
クターによる組換えを刺激する。形質導入効率を確認するために、メガヌクレアーゼでト
ランスフェクトしたヒトCD3+T細胞の別の群を、上記のようにトランスフェクション
直後にGFP-AAV(細胞1個あたり1e5ウイルスゲノム)で形質導入する。形質導
入の72時間後にGFP発現についてフローサイトメトリーにより細胞を分析して、形質
導入効率を決定する。
Vベクターで形質導入する。メガヌクレアーゼのみの対照については、細胞をTRC1-
2x.87EEをコードするmRNAとB2M13-14メガヌクレアーゼをコードする
mRNAで同時トランスフェクトし、次いで、トランスフェクション直後に(水で)模擬
形質導入する。
って確認する。キメラ抗原受容体の細胞表面発現を、抗Fab又は特定の場合には抗CD
19抗体を用いるフローサイトメトリーによって確認する。細胞表面での内因性T細胞受
容体及びB2Mのノックアウトを、前記のフローサイトメトリーによって決定する。
ロン性mRNA
ヌクレアーゼを同時にコードするバイシストロン性mRNAの使用を評価することであっ
た。以下の通り、配列がIRES、T2A、P2A、E2A、又はF2A配列によって分
離された、いくつかの変異体mRNAを、異なる配向のTRC1-2x.87Eメガヌク
レアーゼ配列及びB2M13-14x.479配列を使用して設計した:
体の多量体からなるImmunoCult(Stem Cell Technologi
es)で刺激した。刺激は、製造業者の指示に従って、Amaxa 4D-Nucleo
fector(Lonza)を用いて、上記のバイシストロン性mRNAの1つ1μgで
電気穿孔する前に3日間行った。更に、ドナーヒトT細胞を、1μgのTRC1-2x.
87EE mRNA又はB2M13-14x.479RNAを用いて電気穿孔した。細胞
の更なる試料を、両方の個々のヌクレアーゼmRNAの各1μgを用いて電気穿孔した。
対照として、ヒトT細胞をmRNAの非存在下で電気穿孔した。電気穿孔の3日後及び7
日後に、バイシストロン性mRNAを用いて電気穿孔した細胞をCD3(TRCノックダ
ウンを決定するため)に対する抗体及びB2Mに対する抗体で染色し、フローサイトメト
リーによって分析した。
及び7日目に行った。サイトメトリー分析によって、TRAC遺伝子が編集された(TR
C KO)、B2M遺伝子が編集された(B2M KO)、又は両遺伝子が編集された(
dKO)細胞を同定した(図15A~図15N)。
、最高頻度のdKO細胞(17.1%)、引き続いてB2M-IRES-TRC(16.
3%)、B2M-T2A-TRC(12.8%)、B2M-E2A-TRC(12.6%
)、及びTRC-IRES-B2M(11.3%)をそれぞれもたらした。残りのヌクレ
アーゼは、約半分の頻度のdKO細胞を個々のRNAとして生成した。RNAは種々の程
度でT細胞に対する毒性を示した。更に、各個々のメガヌクレアーゼを使用すると最高の
dKO%をもたらしたが、産生されたdKO細胞の総数は、B2M-T2A-TRC(0
.891×10^6)、B2M-IRES-TRC(0.817×10^6)、及びTR
C-P2A-B2M(0.768×10^6)を用いた場合に最高であった。
的、この場合、TRC及びB2M認識配列を同時に編集及び/又はノックダウンするため
に、バイシストロン性mRNAを用いることの有用性を明らかに実証している。7日間の
培養期間にわたる細胞の生存率及び増殖を考慮すると、最高頻度のdKO細胞を含む培養
物は、必ずしも最大数のdKO細胞を含むものではなかった。B2M-T2A-TRC及
びB2M-IRES-TRCは、遺伝子と生存可能な編集された細胞の増殖の両方の最良
の編集を可能にした。
ストロン性mRNAの最適濃度を決定することであった。前の実施例に記載されるように
、ヒトT細胞における同時発現及び標的化のためのTRC1-2x.87EE配列及びB
2M-13-14x.479配列を含むいくつかのバイシストロン性mRNAを開発した
。試験した中でも、B2M-IRES-TRC、B2M-T2A-TRC、TRC-P2
A-B2M、及びTRC-T2A-B2Mを、更なる評価のために選択した。
M、又はTRC-T2A-B2M mRNAを、増加する濃度でドナーヒトT細胞に導入
し、細胞表面CD3のノックダウン率(TRCノックダウンを示した)及びB2Mを決定
した。手短に言うと、製造業者の指示に従ってAmaxa 4D-Nucleofect
or(Lonza)を使用して、上記のB2M-IRES-TRC、B2M-T2A-T
RC、TRC-P2A-B2M、又はTRC-T2A-B2M mRNA1、2、又は4
μgで電気穿孔する前に、ドナーヒトT細胞をImmunoCultで3日間刺激した。
比較のために、ドナーヒトT細胞をTRC1-2x.87EE1μg又はB2M13-1
4x.479 1μgを用いて電気穿孔した。更に、ドナーヒトT細胞を、0.5μgの
各ヌクレアーゼ又は1μgの各ヌクレアーゼの用量を使用して、別々のRNA分子にコー
ドされた両ヌクレアーゼを用いて電気穿孔した。対照として、ヒトT細胞をRNAなしで
電気穿孔した。電気穿孔の7日後に、細胞を計数し、トリパンブルーを用いて生存率を評
価した。細胞をCD3(TRCノックダウンを決定するため)に対する抗体及びB2Mに
対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析し、同様にゴースト色素780
で染色して死細胞を分析から除外した。
るバイシストロン性mRNAの量を増加させると、一般に、培養物中のdKO細胞の頻度
が増加したが、場合によっては、電気穿孔7日後に存在する生細胞の総数が減少した。
、dKO細胞の頻度又は数を必ずしも増加させなかった。B2M-T2A-TRCについ
ては、より多量のRNAが耐容性が良好であり、より高いdKO頻度及びより多くのdK
O細胞をもたらした。TRC-P2A-B2Mについてもこれが当てはまったが、より高
いRNA用量で細胞生存率は低下した。TRC-T2A-B2Mは高用量で耐容性が良好
であるように見えたが、堅牢な細胞増殖を明らかに可能にしなかった。この実験で、B2
M-T2A-TRCは、別個のmRNA分子上の2つのヌクレアーゼでT細胞を電気穿孔
するよりも、わずかに高い頻度及び数のdKO細胞を産生するようである。
び数のdKO細胞を達成することができた。具体的には、B2M-T2A-TRC4μg
が、この実験において最も多くの標的細胞をもたらし、それぞれTRC及びB2Mの各1
μgより優れていた。
作製
R-T細胞を製造するためのバイシストロン性mRNAの使用を評価することであった。
前の実施例に記載されるように、ヒトT細胞における同時発現及び標的化のためのTRC
1-2x.87EE配列及びB2M-13-14x.479配列を含むいくつかのバイシ
ストロン性mRNAを開発した。試験したものの中で、その最適濃度を決定した後、B2
M-IRES-TRCを更なる評価のために選択した。
体をコードする外因性核酸配列を、相同組換えを介して、TRC1-2認識配列でヒトT
細胞のゲノムに導入し、同時にT細胞受容体とB2Mの両方の細胞表面発現をノックアウ
トした。AAVベクターは、相同性アームが隣接した、前に記載した抗CD19CARコ
ード配列を含む核酸を含んでいた。CARカセットの発現をJeTプロモータによって駆
動した。AAVベクターは、ドナープラスミドからVirovek(Hayward、C
A)によって調製した。
Stem Cell Technologies)で3日間刺激した。次いで、3μg/
1×106個の細胞を、製造業者の指示に従ってAmaxa 4D-Nucleofec
tor(Lonza)を使用して、上記のバイシストロン性B2M-IRES-TRC
mRNAを用いて電気穿孔した。細胞を、TRC1-2認識部位遺伝子座との相同性アー
ムが隣接する抗CD19CARをコードする組換えAAVベクターで直ちに形質導入した
。対照として、細胞を、AAV形質導入の前に、1μgのTRC1-2x87EE RN
Aを用いて電気穿孔した。更に、B2M-IRES-TRC及びTRC1-2x.87E
E電気穿孔細胞を模擬形質導入した。
ウンを決定するため)に対する抗体及びB2Mに対する抗体並びにCARを検出するため
のビオチン化組換えCD19-Fc融合タンパク質で染色した。ストレプトアビジン-P
EをCAR染色のための二次検出試薬として使用した。CD3、B2m、及びCARレベ
ルをフローサイトメトリーによって評価した。
い、これを図17A~図17Hに示す。TRC1-2x.87EEはCD3-イベントの
集団(67.3%)を生成したが(図17A)、B2M発現は変化しなかった。B2M-
IRES-TRCは、CD3発現(17.3%)、B2M発現(19.7%)、又は両マ
ーカーの発現(30.7%)を欠く集団を生成した(17B)。模擬形質導入培養物を使
用して、CAR染色についてのベースラインを設定し(17C及び17D)、TRC1-
2x.87EE(22.2%CD3-/CAR+)(17E)又はB2M-IRES-T
RC(15.7%CD3-/CAR+)(17F)のいずれかで電気穿孔した形質導入培
養物についてCAR発現を決定した。CAR+/CD3-イベントのゲーティングは、B
2M-IRES-TRC培養物においてCAR T細胞の67%が細胞表面B2M発現を
欠いていたことを示している(17H)。
T細胞を作製するためにAAVと組み合わせて使用すると有効であった。
Claims (15)
- ヒトβ-2ミクログロブリン遺伝子内の配列番号2からなる認識配列と結合及び切断する組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むmRNAであって、
前記組換えメガヌクレアーゼは、第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、前記第1のサブユニットは前記認識配列の第1の認識半部位に結合し、第1の超可変(HVR1)領域を含み、前記第2のサブユニットは前記認識配列の第2の認識半部位に結合し、第2の超可変(HVR2)領域を含み、且つ
前記組換えメガヌクレアーゼは、配列番号12と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、mRNA。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号12の残基198~344と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号12の残基7~153と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のmRNA。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号12の残基198~344を含む、請求項1又は2に記載のmRNA。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号12の残基7~153を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のmRNA。
- 配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のmRNA。
- 生体外(エクスビボ)で、真核細胞(ヒト配偶子、ヒト接合子、ヒト胚盤胞、及びヒト胚性幹細胞を除く)の染色体に挿入された対象となる外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、
(a)請求項1~5のいずれか1項に記載の前記mRNA;及び
(b)前記対象となる配列を含む核酸配列を含むポリヌクレオチド;
を含む1又は複数の核酸を真核細胞に導入することを含み;
前記組換えメガヌクレアーゼが配列番号2からなる認識配列で前記染色体中に切断部位を生成し、前記対象となる配列が前記切断部位で前記染色体に挿入される、方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞が、細胞表面にβ-2ミクログロブリンを発現しない、請求項6に記載の方法。
- 前記対象となる配列を含む前記核酸が前記切断部位に隣接する配列と相同な配列を更に含み、前記対象となる配列が相同組換えによって前記切断部位で挿入される、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記対象となる配列がキメラ抗原受容体又は外因性T細胞受容体をコードする、請求項6~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記真核細胞がヒトT細胞又はそれに由来する細胞である、請求項6~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記真核細胞が、細胞表面に内因性T細胞受容体を発現しない、請求項6~10のいずれか1項に記載の方法。
- 生体外(エクスビボ)で、真核細胞(ヒト配偶子、ヒト接合子、ヒト胚盤胞、及びヒト胚性幹細胞を除く)の染色体中の標的配列を破壊することによって遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、
請求項1~5のいずれか1項に記載の前記mRNAを前記真核細胞に導入することを含み;
前記組換えメガヌクレアーゼが配列番号2からなる認識配列で前記染色体中に切断部位を生成し、前記標的配列が前記切断部位で非相同末端結合によって破壊される、方法。 - 前記遺伝子改変真核細胞が、細胞表面にβ-2ミクログロブリンを発現しない、請求項12に記載の方法。
- 前記真核細胞がヒトT細胞又はそれに由来する細胞である、請求項12又は13に記載の方法。
- 前記真核細胞が、細胞表面に内因性T細胞受容体を発現しない、請求項12~14のいずれか1項に記載の方法。
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