CN107290526A - 一种四环素的化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四环素的化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：吖啶酯标记的四环素抗原或抗体、磁微粒偶联的抗体或抗原、四环素系列标准品溶液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系。与现有技术相比，本发明试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等优点。

Description

一种四环素的化学发光检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体是一种四环素的免疫化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
四环素是四并苯或萘并苯的衍生物，是一种光谱抗菌药。它是由链霉菌培养液中提取或经半合成而得的抗生素，因其分子中含有4个环而得名。在水产、牛奶、鸡蛋、蜂王浆等中加入四环素，可用于抑制多种细菌及立克次氏体、衣原体、支原体等所引起的感染。但是四环素类药物主要通过肾小球滤出，这类药物中含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物。如与钙或镁离子形成不溶性的钙盐或镁盐、与铁离子形成红色络合物。在体内四环素会与钙离子形成黄色络合物而沉积在骨骼和牙齿上，小儿服用会发生牙齿变黄，孕妇服用后其产儿可能发生牙齿变色，进而影响牙齿和骨骼的发育。此外，这类药物还会引起肝损害，会使肠道菌群失调、易诱导耐药菌株。因而食品中四环素残留会对人们的身体健康带来极大的隐患。国家质量监督检验检疫局在2008年对牛奶和奶粉中四环素的残留量做出规定，2009年对蜂蜜中四环素的残留量做出规定，因此我们对食品中残留的四环素的检测具有非常重要的意义。
目前四环素的检测方法有: 微生物法、酶联免疫法、高效液相色谱法、胶体金法、化学发光法。微生物法特异性差，操作繁琐，检测周期较长且结果误差较大。CN 1707265 A（2005年12月）公开了一种酶联免疫法检测四环素的试剂盒,采用酶联免疫法进行检测的缺点是辣根过氧化酶或碱性磷酸标记物易失活，显色底物见光易分解，灵敏度低，对结构类似的化合物具有一定的交叉反应，造成测试结果不准确，并且只适用于微量物质的检测和鉴定。CN 102401818 A（2012年4月）公开了一种高效液相色谱法检测四环素的方法,采用高效液相色谱法的缺点为样品前处理复杂，费力费时，检测成本高。CN 103105490 A（2011年11月）公开了一种胶体金检测四环素的试剂盒,采用胶体金法进行检测的缺点是最后检测结果是以肉眼可见的颜色进行表征，误差较大，并且操作繁琐，流程较多，更易出现误差，灵敏度低。本发明采用方法为直接化学发光法，采用吖啶酯作为化学发光标记物的优点是：①背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；②闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；③吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，提高系统整体灵敏度；④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑤标记物稳定，不受环境氧化剂的影响，在2-8℃下可保存数月之久。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。
本发明采用的方法为化学发光法，其优点为：灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、线性范围宽，检测结果具有更高的准确性与重复性。
发明内容
本发明提供了一种具有较高灵敏度和特异性的检测食品中四环素的试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种四环素的化学发光检测试剂盒及制备方法，本发明所提供的化学发光法检测四环素的试剂盒，可以采取四环素抗体偶联磁微粒，吖啶酯标记四环素，也可以采取四环素抗原偶联磁微粒，吖啶酯标记四环素抗体。试剂盒还包括四环素校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
作为本发明进一步的方案，所述化学发光标记物为吖啶酯，如：NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记的是四环素抗原或四环素抗体。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记四环素抗原或抗体的标记缓冲液为pH 8.0-11.0、浓度为0.1mol/L的Na2CO3-NaHCO3，优选pH为10.0。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯与抗原或抗体的摩尔比为5-100:1，优选摩尔比为7.4:1。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯溶于DMSO或DMF中，且所配制溶液的最终浓度为0.1-100 mmol/L，优选浓度为6.5 mmol/L。
作为本发明进一步的方案，所述的磁微粒可直接与四环素抗体或抗原偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记四环素抗体或抗原。
作为本发明进一步的方案，所述磁珠的表面修饰基团为羧基、氨基、链霉亲和素-生物素或对甲苯磺酰基。磁珠使用前固相的不完全沉降会影响精确度，因此选择时应选分散性好，长时间放置磁珠抱团个数少，沉降速度慢的磁珠。
作为本发明进一步的方案，所述的校准品是用含有0.5-5.0% BSA和0.1-0.5%PC300的Tris-HCl缓冲液为基质，加入四环素纯品配置而成，校准品形态为液态。
作为本发明进一步的方案，所述的四环素校准品溶液浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L、62.5 μg/L。
作为本发明进一步的方案，本发明所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2质量分数为0.05-5%，HNO3浓度为0.05-2.5 mol/L。
作为本发明进一步的方案，本发明所述的化学发光激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的浓度为0.05-2.0 mol/L，NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。
作为本发明进一步的方案，所述的清洗液包括以下组分：pH值7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris-HCl溶液，其中含有浓度为0.05-0.50 mmol/L的NaCl及质量分数为0.01-0.25% 的Tween-20。
本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与吖啶酯发光的高度灵敏性结合起来，利用吖啶酯捕捉反应产生的光子检测产物浓度。
本发明的优点在于采用竞争法联合磁微粒化学发光技术以测定食品中的四环素的含量。吖啶酯作为标记物的直接化学发光具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。
具体实施方式
本发明提供了一种四环素的化学发光检测试剂盒，为使本发明目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进行详细说明。
本发明提供一种四环素的化学发光检测试剂盒及制备方法，其中，本发明所提供的化学发光方法检测四环素的试剂盒，可以采取四环素抗体偶联磁微粒，吖啶酯标记四环素，也可以采取四环素抗原偶联磁微粒，吖啶酯标记四环素抗体。试剂盒还包括四环素校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
具体地，本发明在制备磁微粒偶联的过程中，所述偶联抗原的缓冲液为pH值5.0、浓度为0.1 mol/L MES的缓冲液；所述偶联抗体的缓冲液为pH值6.0、浓度为0.1 mol/L MES的缓冲液。
具体地，本发明在制备磁微粒偶联抗原或抗体的过程中，所述封闭缓冲液为含1%BSA的缓冲液。
具体地，本发明所述校准品是用含有1% BSA 和0.1% PC300 的Tris-HCl的缓冲液为基质，加入四环素纯品配置而成，校准品形态为液态。
具体地，本发明所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2的质量分数为1.5%，HNO3的浓度为0.1 mol/L。
具体地，本发明所述化学发光激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的浓度为0.1 mol/L，NaOH的浓度为0.35 mol/L。
具体地，本发明所述清洗液为pH 7.2、浓度为25 mmol/L的Tris-HCl，其中含有浓度为0.15 mmol/L的NaCl及0.05% Tween-20。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：一种四环素的化学发光检测试剂盒1的组建及制备方法
1. 试剂盒1的组建
吖啶酯标记的四环素抗原；
磁微粒偶联的四环素抗体；
四环素系列校准品溶液，浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L、62.5 μg/L；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
清洗液，包括以下组分：pH 7.2、浓度为25 mmol/L的Tris-HCl，其中含有浓度为0.15mmol/L的NaCl及0.05% Tween-20。
2. 偶联四环素抗体的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入一定量0.1 mol/L的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入一定量MES（pH为6.0）缓冲液，涡旋。
（2）加入15 μL（15 μg）四环素抗体，涡旋，旋转反应管，室温孵育17 min。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育2 h。
（4）去上清，加入200 μL的清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。
（5）用含1% BSA缓冲液进行封闭，反复封闭4 次，每次10 min。将该磁微粒混悬液置于2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记四环素抗原的制备
（1）纯化四环素抗原：将一定量的四环素抗原置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液至少更换3次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH10.1、浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取1.6 mg的吖啶酯NSP-DMAE-NHS，溶于无水二甲基甲酰胺DMF中，配成6.5mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液。
（3）将透析后的四环素抗原置于1.5mL离心管内（避光反应），加入200 μL pH10.1、浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3的缓冲液，加入195 μL，6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液，室温下反应0.5 h，加入10 g/L赖氨酸100 μL，继续反应15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ag与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液pH 6.3、浓度为0.1 mol/L的PBS平衡并淋洗层析柱。
（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280 nm吸光度值。
（6）收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA（体积）后分装冰冻保存。
4. 四环素系列校准品溶液的配制
用含有1% BSA 和0.1% PC300 的Tris-HCl 缓冲液为基质，加入四环素纯品配成标示浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L、62.5 μg/L。
5. 发光激发液A、B的配制
（1）化学发光预激发液A由H2O2和HNO3组成。其中，其中H2O2的质量分数为1.5%，HNO3的浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100 和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100的浓度为0.1 mol/L，NaOH的浓度为0.35 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
实施例2：一种四环素的化学发光检测试剂盒2的组建及制备方法
1. 试剂盒2的组建
吖啶酯标记的四环素抗体；
磁微粒偶联的四环素抗原；
四环素系列校准品溶液，浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L、62.5 μg/L；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
清洗液，包括以下组分：pH 7.2、浓度为25 mmol/L的Tris-HCl，其中含有浓度为0.15mmol/L的NaCl及0.05% Tween-20。
2.偶联四环素抗原的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入一定量0.1 mol/L的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入一定量MES（pH为5.0）缓冲液，涡旋。
（2）加入25 μL（25 μg）四环素抗原，涡旋，旋转反应管，室温孵育17 min。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育2 h。
（4）去上清，加入200 μL的清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。
（5）用含1% BSA的缓冲液进行封闭，反复封闭4 次，每次10 min。将该磁微粒混悬液置于2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记四环素抗体的制备
（1）纯化四环素抗体：将一定量的四环素抗体置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液至少更换3次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH10.1、浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取1.6 mg的吖啶酯NSP-DMAE-NHS，溶于无水二甲基甲酰胺DMF中，配成6.5mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液。
（3）将透析后的四环素抗体置于1.5 mL离心管内（避光反应），加入200μL pH 为10.1、浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，加入195 μL，6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHSDMF溶液，室温下反应0.5 h，加入10 g/L赖氨酸100 μL，继续反应15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液pH 6.3、浓度为0.1 mol/L的PBS平衡并淋洗层析柱。
（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280 nm吸光度值。
（6）收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA（体积）后分装冰冻保存。
4. 四环素系列校准品溶液的配制
用含有1% BSA 和0.1% PC300 的Tris-HCl缓冲液为基质，加入四环素纯品配成标示浓度分别为：0 μg/L、0.02 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5 μg/L、12.5 μg/L、62.5 μg/L的溶液。
5. 化学发光激发液A、B的配制
（1）化学发光预激发液A由H2O2和HNO3组成。其中，其中H2O2的质量分数为1.5%，HNO3的浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100 和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100的浓度为0.1 mol/L，NaOH的浓度为0.35 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
实施例3：样品中四环素残留量的检测
样品的前处理
A. 蜂蜜样本的处理
取蜂蜜1.0g加入25 mL离心管中，加入2 mL浓度为 0.5 mol/L盐酸溶液，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解，于55-75℃的热水中温热数分钟，加入5 mL 浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠，调节pH值范围为4-6，再加入8mL的乙酸乙酯，振荡混匀。取4mL上层有机相至10mL干净的玻璃管中，于50℃氮气流下吹干，滴加0.5mL浓度为0.02 mol/L磷酸盐缓冲液，混匀，待检。
B. 牛奶样本的处理
取150 μL新鲜牛奶于500 μL离心管中，4℃离心10 min（3000 r/min），弃去上层脂肪。移取离心后的牛奶样本25 μL置于干净的玻璃试管中，加入950 μL浓度为0.02 mol/L磷酸盐缓冲液进行稀释。
实施例4：用试剂盒检测与结果分析
（1）将待测样本100 μL、偶联磁微粒混悬液150 μL、吖啶酯标记物150 μL，依次加入反应管中，振荡混匀，37℃孵育15 min。
（2）分离清洗5次。
（3）将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（4）加入100 μL化学发光预激发液A，1s后加入100 μL化学发光激发液B，测量其相对发光强度，样本中四环素的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例5：试剂盒的性能指标
1. 试剂盒的检测限
对零标准溶液进行20次重复测试，取零标准溶液测定的平均值加上3倍的标准偏差，即为本试剂盒的灵敏度。本试剂盒对四环素的灵敏度为0.03 μg/L。
2. 特异性
与四环素结构或功能相似的竞争药物：土霉素、强力霉素、金霉素、红霉素、泰乐菌素、泰妙霉素、大观霉素。按试剂盒步骤操作，分别加入：四环素、土霉素、强力霉素、金霉素、红霉素、泰乐菌素、泰妙霉素、大观霉素，制作抑制曲线，根据线性方程计算各药物的50% 抑制浓度。交叉反应率即为抗体对四环素的IC50与抗体对四环素竞争物的IC50之比的百分数。结果显示：试剂盒对四环素具有较高的特异性，对与四环素结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种四环素的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：吖啶酯标记的四环素抗原、偶联有四环素抗体的磁微粒、四环素系列标准品溶液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。
2.根据权利要求1所述的四环素化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
3.根据权利要求1所述的一种四环素的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的吖啶酯标记的是四环素抗原。
4.根据权利要求1所述的一种四环素的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的磁微粒可直接与四环素抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记四环素抗体。
5.根据权利要求1所述的一种四环素的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的校准品是以含有0.5-5.0% BSA 和0.1-0.5% PC300 的Tris-HCl 缓冲液为基质，加入四环素纯品配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。
6.根据权利要求1所述的一种四环素的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的化学发光预激发液A 由H2O2 和HNO3的混合液组成，化学发光激发液B由Triton X-100 和NaOH的混合液组成。
7.一种四环素的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：吖啶酯标记的四环素抗体、偶联有四环素抗原的磁颗粒、四环素系列标准品溶液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。
8.根据权利要求7所述的四环素化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
9.根据权利要求7所述的一种四环素的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的吖啶酯标记的是四环素抗体。
10.根据权利要求7所述的一种四环素的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的磁微粒可直接与四环素抗原偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记四环素抗原。
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