JPH0462473A - 好中球の殺菌能検査法およびその検査用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生体中に存在する白血球の１種である好中球の
殺菌能検査法およびその検査用試薬に関する。さらに詳
しくは、本発明においては、好中球の産生ずる過酸化水
素を定量する。

（従来の技術） 白血球はその核の形状から多形核白血球と単核球に大別
され、さらに、多形核白血球は核内顆粒の染色性により
好中球、好酸球、好塩基球に分類される。好中球はヒト
の血液中にある全白血球数の約５％を占める。

好中球は細菌等の異物が生体内に侵入してきた際に、遁
走、貧食、殺菌という機能を発揮して、その異物を消化
し生体を防御する役割を担っている。また、最近の研究
かみ、好中球が特異的免疫反応にも関与することか判っ
てきた。したがって、これらの機能が正常に働かない場
合、生体は各種の細菌により容易に感染されることにな
る。これら機能のうち、主に殺菌能の欠損による先天性
疾壱の代表例として慢性肉芽腫症、チェディアック東症
候群、ホンキン病等が挙げられる。ま１こ、未熟な新生
児では好中球の機能か低下することが知られている。さ
らに、二次的に好中球の機能が低下する疾患として、栄
養失調症、悪性腫瘍、ダウン症候群、重症感染症、熱傷
、外傷、糖尿病、慢性腎不全、慢性関節リュウマチ等が
挙げられる。

かくして、好中球の機能不全や機能低下の検査をするこ
とは病気の予防あるいは治療において非常に重要である
。すなわち、癌患者の免疫能の評価、糖尿病等の昼感染
性患者の解析、好中球の先天性機能欠損症のスクリーニ
ング、その他の個体の防御機能が把握でき、これら疾患
像の解析および治療方針の決定に重要な役割を果たすこ
とが考えられる。

従来、この目的のための好中球殺菌能検査法として、ニ
トロブルーテトラゾリウム還元試験、試験管内食菌反応
、アルカリ性ホスファターゼなどの好中球内の諸酵素の
生化学的測定、ベルオキングーゼ、ミエロペルオキシダ
ーゼ染色等（臨床検査医学辞典、執念書店発行、３０６
−３０７頁、１９８２年）カリ「１られている。また、
好中球のスーパーオキサイド産生能のル１ｊ定に化学発
光法であるウミホタルルンフエリン誘導体を用いる方法
（中野稔、木村博−著、［スーパーオキシドの測定法」
、臨床検査、ｖｏｌ、　３３　　Ｎｏ、　３．２５６−
２６１頁、１９８９年３月）やチトロームＣを用いる方
法（特開昭６１−８５３２３号、特開昭６２−１７４０
２４号）も提案されている。

一方、過酸化水素の測定としては一般にパーオキシダー
ゼを用いる方法が良く知られているか、パーオキシダー
ゼの代わりに金属ポルフィリンを用いる方法（特開昭６
３−２５０５６５号）も提案されている。しかし、この
方法は、中性付近のｐＨ（ｐＨ８，５）での使用であり
、また、樹脂カラムに結合させての使用であって、酸性
域にお（＋る使用は全く示唆していない。

（発明が解決しようとする課題） 前記した公知の好中球殺菌能検査法は、臨床検査として
実用化するにｊよ、その手技が余りに困難であり、また
十分に確立された手技てないため、検査の場でルーチン
的には行われていないのか実状である。

このような事情に鑑み、本発明者らは検査の場でルーチ
ンとして行える、正確かつ簡便な好中球の殺菌能検査法
を確立すべく鋭意研究を重ねた。

その結果、好中球を活性化させることにより、過酸化水
素を産生させた後、反応を停止させ、産生した過酸化水
素を定量するに際し、細胞内酵素を完全に失活させるた
め、ｐＨ４以下の酸性とし、その条件下で水溶性金属ポ
ルフィリンを用いて過酸化水素を定量することにより、
その目的が達成できることを見出した。前記のごとく、
過酸化水素の定量にはパーオキシダーゼを用いる方法が
良く知られているが、パーオキシダーゼではこの酸性条
件下で活性を示さず変性を起こすので用いることはでき
ない。また、特開昭６３−２５０５６５号の金属ポルフ
ィリンを用いる方法も、その発明者による別の報告［ワ
イ・サイトウら、ケミカル・アンド・ファーマノニーテ
ィカル・ブレティン（Ｙ、　　５ａｉｔｏ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　　Ｃｈｅｍ、　ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、、）
３４（１２）５０１６−５０１９（１９８６）コによれ
ば、ｐＨは中性付近の使用か最適であり、ｐＨ４以下の
酸性での使用は好ましくないという結果か示されている
。前記の如く、好中球の産生した過酸化水素を定量する
に際し、細胞内酵素を完全に失活させろためにはＩ）８
４以下の酸性にすべきであり、この様にして処理した溶
液の過酸化水素を従来のパーオキシダーゼや特開昭６３
−２５０５６５号の方法で定量するためには、この溶液
を中和する必要があり、操作が煩雑となり、また、経済
的でない。そこで前処理としてのｐＨ４以下の酸性溶液
をそのまま過酸化水素測定に利用できる方法を鋭意研究
の結果、意外にも、水溶性金属ポルフィリンかｐＨ４以
下の酸性条件下で水溶性で安定であり、特異的に過酸化
水素の反応を触媒するとし１う性質を持つことを見出し
、本発明を完成するに至った。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、好中球を活性化させた後、反応を停止させ、
好中球か産生した過酸化水素（スーパーオキサイドは溶
液中で過酸化水素に速やかに変換するため、好中球か産
生したスーパーオキサイ）・も含まれる）をｐＨ４以下
の酸性条件下で水溶性金属ポルフィリンを用いて測定す
ることを特徴とする好中球の殺菌能検査法を提供するも
のである。

また、本発明は、好中球分離用試薬、好中球活性化試薬
、最終的にｐＨ４以下とするためのｐＨ調整試薬、酸化
により発色または蛍光を発する物質からなる定色試薬お
よび水溶性金属ポルフィリン試薬を組み合せてなること
を特徴とする好中球殺菌能検査用試薬も提供するもので
ある。

本発明の方法によると、好中球を活性化後、反応を停止
させ、好中球が産生した過酸化水素を、細胞内酵素が失
活し、活性が発現できないｐＨ４以下の酸性条件下で過
酸化水素量を正確、かつ、簡便に測定し、好中球の殺菌
能を正確、かつ、簡便に検査できることが可能になる。

本発明で使用する水溶性金属ポルフィリンは市販品のポ
ルフィリンを利用することにより簡単に調製出来、この
様に調製した水溶性金属ポルフィリンは酵素のように失
活することのない安定な物質であって、経済性や試薬と
しての取扱に優れてｔ）る。

かくして、本発明の方法を実施するには、まず、好中球
を血液等のごとき検体より、常法に従って分離する。血
液からの好中球の分離はヘパリン加末稍血よりモノ−ポ
リ・レゾルピング・メディウム［（Ｍｏｎｏ−Ｐｏｌｙ
　　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　　Ｍｅｄｉｕｍ）、フロー・
ラボラドリース社（Ｆ　Ｉｏｔｖ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）、米国］やデキストラン（平均分子量１８
０，０００、ナカライテスク（株））処理により行われ
る。例えば、ヘパリン加ヒト末梢血と６％デキストラン
を５・１の割合で混合し、室温に３０分間静置する。

その上清５ｍｌを５８％パーコル（比重１０７７ｇ／ｃ
ｍ３．４°Ｃ）５ｍｆに重層し、４℃で４００　〉ｇに
て、３０分間遠心分離後、ベレットに０８％塩化アンモ
ニウム水溶液を１０ｍ１加え、赤血球を溶血させる。残
った好中球をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等で洗浄する
。５８％パーコルの代りにフィコール・コンレイ液ｇＦ
　１ｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ液、造影剤Ｃｏｎｒａｙ４
００　（６６、８％）（第一製薬（昧乃を等量の蒸留水
で希釈した液と、９％フィコール水溶液を１０２４の割
合で混合し、２５°Ｃてで比重１．０７８に調整コを用
いてもよく、その場合は、フィコール・コンレイ液３Ｊ
に上記上清１ｍｆｌを重層し、室温で５００　ｘｇで１
５分間遠心分離する。

この様にして分離された好中球は１０”ｌＯｆ′個／ｍ
Ｑ、好ましくは１０’個／ｍ（！程度となるように活性
化物質を含む緩衝液に浮遊させる。活性化物質は好中球
に貧食させる物質で、ガラス、ンリカ等の無機粒子、ポ
リスチレン等のラテックス粒子のような有機重合体粒子
、アルブミンで安定化したパラフィン油滴などのｍ粒子
または微生物等であり、通常、市販のザイモザンＡ（米
国、シグマ社製）をオプソニン化したオブソニン化ザイ
モザンを利用するのが好ましい。緩衝液としてはＰＢＳ
、クレブス・リンゲル・リン酸緩衝液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒ
ｉｒ＋ｇｅｒ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｂｕｆｆｅｒ）
、　ハンクスの平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ　　Ｂａ１ａ
ｎｃｅｄ　　５ａｌｔＳ　ｏｌｕｔｉｏｎ）等が利用で
き、ｐＨは６．４〜８．４、好ましくは７２〜７６の範
囲である。また、好中球を活性化させるため、０〜４５
℃、好ましくは３５〜３８℃の温度にて、好中球が活性
化されるに十分な時間、例えば、１０〜１２０分インキ
ユベーンヨンする。好中球を活性化後、最終的にｐＨ４
以下となる濃度とｐＨのｐＨｆｍ整試薬の溶液を添加し
、細胞の反応を停止させ、遠心分離後、上清液に酸化に
より発色または蛍光を発する物質からなる定色試薬を含
む溶液および水溶性金属ポルフィリン試薬を含む溶液を
添加する。あるいは、定色試薬および水溶性金属ポルフ
ィリン試薬は一緒にした溶液として加えてもよい。好中
球の活性化後、ｐＨ調整試薬液または酸性の試薬の添加
により細胞の反応を停止させた後の遠心分離を省略する
ことも可能である。各試薬の添加後、インキュベーショ
ンを行い、発色または蛍光により定量を行う。

ｐＨ調整試薬としては塩酸、硫酸、酢酸、トリクロロ酢
酸、リン酸等の酸が挙げられ、必要に応してｐＨを調節
した水溶液として用いる。最終ｐＨは０１〜４０、好ま
しくは、０８〜２５とする。

水溶性金属ポルフィリン試薬は水溶性のポルフィリンか
ら誘導される。かかるポルフィリンとじては、α、β、
γ、δ−テトラキス（４−Ｎ−メチルピリジル）ポルフ
ィン、テトラ（ｐ−トルエンスルホン酸塩ＸＴＭＰｙＰ
）、α、β、γ、δ−テトラフェニルポルフィンテトラ
スルホン酸、二硫酸塩、四水和物（ＴＰＰＳ）、α、β
、γ、δ−テトラキス（４−Ｎ−）リメチルアミノフェ
ニル）ポルフィンテトラ（ｐ−トルエンスルホン酸塩Ｘ
ＴＴＭＡＰＰ）α、β、γ１δ−テトラキス（５−スル
ホチエニル）ポルフィン（Ｔ（５−ＳＴ）Ｐ）等や、こ
れらポルフィリンにハロゲンを導入ｉ、たちの等が挙げ
られ、酸性溶液中で溶解する水溶性金属ポルフィリンと
なるものであれば何れのものでもよい。これらポルフィ
リン類は、例えば、（株）同位化学研究所より市販され
ており、これが利用できる。水溶性金属ポルフィリンの
金属としては、鉄、マンガン、クロム、コバルト、ルテ
ニウム、ロジウム等が用Ｌ）られるが金属の毒性面と反
応速文面から鉄か好ましい。水溶性金属ポルフィリンの
調製は一般的によ水溶液中で前記のような水溶性ポルフ
ィリンと金属塩を混合することにより容易に行うことか
できる。水溶性金属ポルフィリンの使用濃度は最終反応
液濃度として、０．０１〜１０００μＭ、好ましくは１
〜５０μＭである。

本発明て用いられる定色試薬はｐＨ４以下の酸性溶液中
で溶解するものであればよく、例えば、３−メチル−２
−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩と　Ｎ、Ｎ−ジ
メチルアニリン、２．２’アジノジ−３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、３．３’　
、５．５’−テトラメチルベンチジン、０−ジアニンノ
ンなどの発色剤が挙げられ、例えば、３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩とＮ　、　Ｎ−ジ
メチルアニリンを用いると、水溶性金属ポルフィリンの
触媒により、過酸化水素はこれらの物質を酸化縮合して
、５９０ｎｍ付近に極大吸収をもつ発色を生じさせる。

これら、発色剤の濃度は過酸化水素の定量に十分なａ変
であり、−船釣には１〜１０ｍ＼４程度のａ変が好まし
い。インキュヘーノヨン温度は０〜８０℃、好ましくは
２５〜５０℃であり、インキクヘーンヨン時間は１〜１
２０分、好ましくは１０〜６０分である。発色後、分光
光度計で比色定量する。また、例えば、ｐ−ヒドロキシ
フェニルプロピオン酸のような蛍光を発生する物質も用
いることができ、蛍光光度計で測定できる。その使用濃
度は一般に過酸化水素測定に用いられる濃度でよく、イ
ンキュベーションの温度、時間は発色剤を用いる場合と
同様である。　かくして得られた比色定量値あるいは蛍
光測定値から、例えば、既知濃度の過酸化水素を用いて
、別途作製した検量線より過酸化水素濃度を求め、好中
球の殺菌能を検査することかできる。

本発明の好中球の殺菌能検査用試薬は、前記した各試薬
を組み合せてなる。かかる試薬は溶液でも、乾燥品、好
ましくは、凍結乾燥品でもよく、乾燥品は使用に際して
、精製水または適当な緩衝液で所定の濃度に復元する。

所望により、安定化剤、賦形剤、防腐剤等の添加剤を加
えてもよい。

（実施例） つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

（１）水溶性鉄ポルフィリンの調製 ２００、ｖρの三ロフラスコに還流冷却器、及び窒素導
入口（注射針）をつけ、浦浴中て約１７０°Ｃに加温し
、ＴＭＰｙＰ（４０９ｕ９）のジメチルホルムアミドｆ
５０ｍｆ！中溶液を入れ、還流しｆコ。これに塩化第一
鉄１．Ｏｆ？を入れ、窒素を流し、脱気しながら１時間
５０分還流を続けた。反応溶液（約１ｓｏｍ（りをエバ
ポレーターで８０ｍＱに濃縮した後、スターラーで攪拌
しながらアセトン２００π（を徐々に加えて沈澱させた
。沈澱を濾別し、１０１のアセトンで数回に分けて洗浄
した。濾液をエバポレーターで蒸発乾固させた。これを
少量の精製水に溶かし、ＣＭ−セルロースカラムに付し
、精製水、ジメチルホルムアミドで洗浄後、００１Ｎの
塩酸で溶出させた。溶出液をエバポレーターで乾固した
。残査を少量のメタノールに溶かし、不溶物を濾別した
後、２００ｍθのアセトンを滴下して再結晶させ、これ
を濾取しｆコ。この操作を数回繰り返し、精製した、１
４３ｕ９の水溶性鉄ポルフィリン（ＦｅＴＭＰｙＰ（Ｏ
Ｍｅ）ｓ）を得た。

（２）水溶性鉄ポルフィリンによる過酸化水素の定量水
溶性鉄ポルフィリン（Ｆ　ｅＴ　Ｍ　Ｐ　ｙＰ　（（Ｏ
Ｍｅ）５）９．２９Ｍを秤量し、蒸留水で１００ｍｆｆ
とした（ｌ液）。Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン　０．２５
０９を秤量し、０，１ｍｏＱ／Ｑ塩酸で１００ｉＲとし
た（２液）。

３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩
０．１０９を秤量し、０　、１．　ｍｏｆｆ／　ｌ塩酸
で１００ｉｆｆとした（３液）。これら１．２．３液を
等量ずつ混合して試薬とした。試薬５πＱに、過酸化水
素液１００μρを加え、よく混合した後、室温で６０分
間放置し、分光光度計にて５９０μｍの吸光度を測定し
た。この時の試薬のｐＨをｐＨ試験紙で測定するとｐＨ
１であった。各物質の最終濃度は水溶性鉄ポルフィリン
、３３ＭＭＸＮ、Ｎ−ツメチルアニリン：　６．９ｍＭ
、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸
塩・　１４ｍＭであった。過酸化水素濃度はチオ硫酸ナ
トリウム溶液の滴定により、求めた。その過酸化水素濃
度と、吸光度との関係を添付の第１図に示す。過酸化水
素の最終濃度０〜３６．８μＭ（０〜１．２５ｐｐｍ）
の間で吸光度と良好な直線関係（相関係数　ｒ＝０９９
９８）か得られ、測定精度（変動係数　ｃｖ−１，７４
％）も良好であり、過酸化水素が正確に測定されること
が認められた。

（３）好中球の過酸化水素の測定 被検者からヘパリン加血漿１０ｍ（を得、これより好中
球をモノ−ポリ・レゾルピング・メディウムを用いて分
離し、純度が９５％以上であることをメイギムザ染色に
よる形態学的手法で確認した。

得られた好中球をＰＢＳて２回、！５ｉ：浄し、ハング
の平衡塩溶液１吋に＠濁した。細胞懸濁液は細胞数計−
１に一部用いｆ二後、２５０μｇずつ２本の試験管に移
した。このうち一方には蒸留水（ブランク）、他方には
オプソニン化ザイモザン（１０ｍ９／ｘ□をそれぞれ１
００μｇ加えた。３７°Ｃで１時間インキユヘーンヨン
した後、濃塩酸１滴を加えて反応を停止させた（ｐＨ１
）。この溶液を３０００　ｒｐｍにて５分間遠心分離し
、その上清０．２５ｍ（を別の試験管に移した。これに
、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、　３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩、水溶性鉄ポルフィリ
ン（ＦｅＴＭＰｙＰ（○Ｍｅ）ｓ）を各々終濃度６．９
ｍＭ、１．４ｍＭ。

３３μＭとなるように加え（全量１．５＋ＣｐＨ１）、
室温で１時間放置後、波長５９０ｎｍにおける吸光度を
、活性化しなかった好中球をブランクとして測定した。

その結果、過酸化水素の産生量は２５４　ｎｍｏｃ／　
１０　’細胞であった。

く至適ｐＨ範囲の検討〉 Ａ液：　Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン　０．２５ｇを０．
１ｍｏｆ！／Ｑのリン酸二水素ナトリウム溶液に溶解し
１００ｘＣとする。Ｂ液・３−メチル−２−ベンゾチア
ゾリノンヒドラゾン塩酸塩０．１９をＯＩｍｏｆ！、Ｑ
のリン酸二水素ナトリウム溶液に溶解し１００１１１１
２とする。Ｃ液　水溶性鉄ポルフィリン（Ｐ　ｅＴ　Ｍ
　Ｐ　ＹＰ　（ＯＭｅ）ｓ）　１０　ｍｇを精製水に溶
解し１００廣Ｃとする。

実験・Ａ、Ｂ、Ｃ液を各１ｘ＋２ずつ混和したものを４
本調製し、Ｎｏ、　１．２．３．４とした。Ｎ。

１．２．３．４をＩＮ塩酸またはＩＮ水酸化ナトリウム
を用いてそれぞれｐＨ１，ｏ、２．０．４．０．６０に
調製した。各々の液１ｍ０に対し過酸化水素水（１，８
ｘ　ｌ　０−３ｎｏｆ！１０１０μ９と精製水１０μａ
を入れ、波長５９０ｎｍでの光学的密度の変化を記録し
た結果を第２図に示す。第２図に示すごとく、よりｐＨ
が低いほど反応速度は遅く、中性に近いｐａｌであるほ
ど反応速度は速い。Ｉ）Ｈ６、０では予想される最終吸
光度（約０．６）を１５分までに大きく上回っており、
過酸化水素以外のものの影響を受けることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は過酸化水素濃度と吸光度の関係を示すグラ乙第
２図はｐＨと吸光度の関係を示すグラフである。 特許出願人　日　本　商　事　株　式　会　社代　理　
人　弁理士　青　山　葆　はが１名第 図 ＡＭｔｔｌ素１４　ｃｘ　＋ｏ　ｍｏｉ／ｌ＞第２図 晒間吟）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）好中球を活性化させた後、ｐＨ４以下の酸性条件
   下で水溶性金属ポルフィリンを用いて、好中球が産生し
   た過酸化水素を測定することを特徴とする好中球の殺菌
   能検査法。
2. （２）好中球分離用試薬、好中球活性化試薬、最終的に
   ｐＨ４以下とするためのｐＨ調整試薬、酸化により発色
   または蛍光を発する物質からなる定色試薬および水溶性
   金属ポルフィリン試薬を組み合せてなることを特徴とす
   る好中球殺菌能検査用試薬。
3. （３）該水溶性金属ポルフィリン試薬と定色試薬とを混
   合してなる請求項（２）記載の好中球殺菌能検査用試薬
   。