KR20020035101A - 물질 측정 방법 및 이 측정 방법에 사용되는 측정 시약 - Google Patents

Abstract

본 발명의 물질 측정 방법은 시료 조제와 광열 변환 검출법에 의한 검출을 마이크로 칩의 모세관 중에서 행하기 때문에, 생체 성분 유래 시료 중의 헤모글로빈, ALP 등의 물질의 양을 극미량의 생체 성분 유래 시료에서 간편하고 또한, 단시간에 측정할 수 있다. 또한, 측정에 의해 발생되는 폐기물도 적다.

또한, 여기광으로서 장파장의 레이저를 사용하기 때문에 광열 변환 검출 장치를 염가로 제조할 수 있고, 저비용으로 측정을 할 수 있다.

따라서, 본 발명의 물질 측정 방법은 POC 분석 등에 바람직하게 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 물질 측정 방법에 의하면 유미화를 나타내는 혈액 시료에서도 광열 변환 검출법에 의해 간편하게 측정할 수 있다.

또한, 본 발명의 측정 시약을 사용하면 극미량의 생체 성분 유래 시료 중 헤모글로빈, ALP 등의 물질의 양을 광열 변환 검출법에 의해 안정적으로 측정하는 것이 가능하다.

Description

물질 측정 방법 및 이 측정 방법에 사용되는 측정 시약{Method for Measuring Substance and Measurement Reagent to be used in the Method}

의료 진단에 필요한 측정을 환자 가까이에서 행하는 임상 진단용 분석 (POC (point of care) 분석) 및 하천이나 폐기물 중의 유해 물질 분석을 하천이나 폐기물 처리장 등의 현장에서 행하는 것이나, 식품의 조리, 수확, 수입의 각 현장에서 오염 검사 등과 같은 분석 측정을 필요로 하는 현장 또는 그 근처에서 분석·측정을 행하는 것 (이하, "POC 분석 등"이라고 총칭함)의 중요성이 주목받고 있다. 그리고, 최근에 이러한 POC 분석 등에 알맞는 측정법 및 장치 개발이 중요시되고 있다.

이러한 POC 분석 등에서는 염가로 간편하며 또한 단시간에 측정이 가능한 것을 요구하게 되었다. 또한, 의료 진단을 위한 분석에 대해서는 분석 시간의 단축 및 분석에 필요한 검체 (혈액 등)의 양 및 측정 후의 폐기물량의 미량화가 요망되고 있다.

상기와 같은 POC 분석 등의 측정법에서는 통상, 흡광도법이 많이 이용되었다. 흡광도 측정시의 광로 길이는 측정 감도의 점에서는 1 cm가 표준이지만 수밀리미터 정도로 짧아져도 감도가 약간 저하되긴 하지만 측정은 가능하다.

이와 같은 짧은 광로 길이에서의 흡광도 측정은 예를 들어 일본국 특허공개공보 평성10년 제501340호 및 일본국 특허공개공보 평성9년 제504732호에 기재된 것 (이상의 2건은 아베끄시스사에 의한 출원) 및, 일본국 특허공개공보 평성9년 제196920호 (면역 물질), 일본국 특허공개공보 평성8년 제114539호 (생화학 물질), 일본국 특허공개공보 평성9년 제196739호 (용해액 선단 검지), 일본국 특허공개공보 평성9년 제138195호 (다공성 재료의 투과 광측정에 의한 분석)에 기재된 것 (이상의 4건은 일본 메디피직스사에 의한 출원)이 있다.

그러나, 검체량이 더욱 미량이 되면 밀리미터 단위의 광로 길이를 갖는 검출 큐베트(셀)에서는 용적이 지나치게 크고, 셀의 용적에 시료량을 합하려고 하면, 시료 중의 검체 농도가 너무 흐려져서 분석할 수 없는 경우가 있다.

이러한 문제를 해결하기 위해 μTAS (micro total analysis system) 또는 Lab-on-Chip으로 총칭되는 분석법의 개념이 제창되고 있다 (Sensors and Actuators, B1(1990), 244-248, A.Manz 외). 여기에는 종래 사용되어 온 분석 장치를 소형화하고 또한, 수 ㎛에서 수백 ㎛의 폭 및 깊이의 모세관을 갖는 수 cm 각 정도 크기의 칩을 사용하여 시료의 분리 및 반응을 행하고 미량 분석을 간편하게 행하는 것을 목표로 하고 있다.

μTAS는 미량인 시료에서도 분석이 가능한 측정 방법으로 연구가 진행되고 있다 (일본국 특허공개공보 평성2년 제245655호 참조). 이 μTAS는, 10 cm에서 수cm 각 정도 이하의 유리, 실리콘, 유기 중합체 등의 칩 표면에 깊이 및 폭이 수 ㎛에서 수백 ㎛ 정도의 홈(모세관)을 설치하고, 그 중에서 시료의 분리, 반응 나아가 측정을 행하는 것이다. 이러한 마이크로 칩을 사용할 경우에는 검체량, 분석에 필요한 시약량, 분석에 사용할 소모품 등의 폐기물, 폐액의 양이 모두 소량으로 끝나고 분석에 필요한 시간도 대체로 짧은 시간으로 종료된다는 이점이 있다.

그러나, 상기와 같은 홈을 갖는 마이크로 칩을 사용한 경우는 광로 길이를 수 ㎛에서 수백 ㎛ 정도밖에 취할 수 없기 때문에, 흡광도법으로는 만족할만한 측정을 할 수 없는 경우가 많다. 왜냐하면, 흡광도법은 원리적으로 입사광과 투과광의 비를 검출하기 때문에 높은 정밀도의 결과를 얻기 위해서는 광로 길이를 길게 해야 할 필요가 있기 때문이다.

그러므로 마이크로 칩 중의 홈에 액체의 유동 방향 (홈의 길이 방향)에 대하여 수직으로 빛을 쏘이지 않고 액체의 유동 방향에 따라 빛을 쏘이는 연구도 진행되고 있지만 (일반적인 홈 중, 흡광도 측정의 예로는 예를 들어 일본국 특허공개공보 평성8년 제304339호가 있음), 평면 칩에 형성된 홈(모세관)의 경우, 액체의 유동 방향에서의 검출은 용이하지 않고, 또한 긴 광로 길이를 얻기 위해서는 마이크로 칩 및 검출부 구조가 복잡해지는 결점이 있다.

또한, 미량 성분의 검출법으로는 형광법 및 발광법도 잘 알려져 있다. 그러나, 측정 시료 중의 측정 대상 물질 (헤모글로빈 등)에 직접 또는 간접적으로 효소 및 형광 색소로 표시된 항체 등을 결합시킬 필요가 있기 때문에, 검출을 위한 반응이 매우 복잡해진다.

한편, 미량 검체 중의 물질의 별도 검출법으로는 여기광에 의해 시료를 여기하여, 소위 열렌즈를 형성시키고 프로브광에 의해 그 열렌즈의 변화를 측정하는 광열 변환 검출법 (열렌즈 검출법)이 이전부터 알려져 왔다. 예를 들면, 일본국 특허공개공보 소화60년 제174933호, 문헌[A.C.Boccara et.al., App1. Phys. Lett. 36,130,1980], [J. Liquid Chromatography 12, 2575-2585(1989)], 일본국 특허공개공보 평성10년 제142177호 (분자 바이오 포토닉스), 일본국 특허공개공보 평성4년 제369467호 (요꼬가와 덴끼 주식회사) 등에 기재된 것이 있다.

우선, 광열 변환 현상에 의해 형성되는 열렌즈를 이용한 검출법, 즉 광열 변환 검출법 (열렌즈 검출법)의 원리를 설명한다.

용액에 용해된 측정 대상 물질이 흡수하는 파장의 광 (여기광)을 측정 시료에 조사한다. 그렇게 하면, 측정 대상 물질은 여기광에 의해 여기되어, 열을 발생시킨다 (광열 변환 효과). 여기에서, 용액 중에 존재하는 측정 대상 물질 이외의 불순물이 이 여기광을 흡수하지 않도록 여기광의 파장을 선택하는 것이 중요하다.

발생된 열은 여기광이 조사된 부분 근처의 용매에 전달되고 국소적인 밀도 변화, 나아가서는 굴절률 변화를 발생시킨다. 이 때문에, 여기광을 흡수하는 물질의 존재하에서는 여기광이 조사된 부분은 마치 오목 렌즈가 형성된 것처럼 된다. 이 오목 렌즈가 형성된 부분에 여기광의 파장과는 상이한 프로브광을 조사한다. 프로브광은 열렌즈에 의해 굴절되기 때문에, 프로브광을 포착하는 수광 소자가 파악하는 프로브광의 광량은 열렌즈가 형성됨으로써 저하된다.

광열 변환 효과의 정도는 측정 대상 물질의 농도에 따라 변화하기 때문에,상기 광량의 저하 정도를 측정함으로써 측정 대상 물질의 정량을 행할 수 있다. 실제로는, S/N 비의 개선을 위해 여기광을 초핑하고 그 주파수에 동기되어 있는 프로브광의 광량 변화만을 록인앰프로 검출하는 것이 일반적으로 행해지고 있다.

상기한 바와 같이 열렌즈 검출법에서는 여기광과 프로브광의 통상 2종의 광원 (레이저 등)이 필요하다. Ar 레이저와 He-Ne 레이저를 사용하여 광열 변환 검출법 (열렌즈 검출법)으로 검출을 행하는 예로서, 홈이 새겨진 칩의 외부에서 펌프로 송액하는 모세관 분석 장치에 적용시킨 예도 있다 (분석 No. 4,280-284,1997, M. Harada, et. al., Anal. Chem. Vo1. 65,2938-2940, 1993, 가와니시 외, 일본 분석 화학회 제44회 강연 요지집, p119, 1995).

이러한 열렌즈 검출법을 사용하여 검체 중의 측정 대상 물질의 양을 측정하는 것이 검토되고 있다.

예를 들어 사또 (K. Sato), 기따모리 (T. Kitamori) 등은 Ar 레이저광 (파장:488 nm)을 여기광, He-Ne 레이저광 (파장:632.8 nm)을 프로브광으로 사용하여, 색소인 선셋옐로우의 측정을 행하고 있다 (Analytical Sciences Vol.15, 525-529, 1999).

기따모리 등이 개량한 열렌즈 검출법은 마이크로 칩이 갖는 수십 ㎛ 정도의 깊이 및 폭의 모세관 중의 미량 물질을 측정하기 위해서 현미경을 사용하여 여기광 및 프로브광을 모세관에 집광하도록 한 것으로, 현미 열렌즈라고도 한다.

이러한 현미 열렌즈에서는 모세관 중의 미소한 공간에 여기광 및 프로브광의 촛점을 연결시키기 때문에 광원으로는 색수차가 없는 파장을 갖는 레이저가 바람직하다.

또한, Nd:YAG 레이저광 (파장: 355 nm) 등을 여기광, He-Ne 레이저광 (파장: 632.8 nm)을 프로브광으로 사용하여, β카로틴의 양을 측정한 예도 있다 (예를 들면, S. Luterotti, et.al., J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 21(1999), 901-909 및 J. Amador-Hernandez, et. al., Applied Spectroscopy Vo1.52, 1465-1471, 1998 등).

또한, Ar 레이저광 (파장: 514.5 nm)을 여기광, He-Ne 레이저광 (파장: 632.8 nm)을 프로브광으로 사용하여, 의약 등에 유용한 클렌부테롤을 측정한 예도 있다 (예를 들면, Y. Martin Biosca, et. al., J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41(1996), 1037-104 등).

이러한 방법에서는 검체 중의 측정 대상 물질 그 자체의 흡수를 이용하여, 그 물질의 흡수에 알맞는 파장을 갖는 여기 광원을 사용하여, 열렌즈 검출법에 의해 측정을 하고 있다. 그러나, 측정 대상 물질이 항상 상태가 양호한 흡수 파장을 갖는다고는 볼 수 없다.

일반적으로, Ar 레이저 및 He-Ne 레이저 등의 가스 레이저는 고가이므로 간편한 POC 분석 등에는 염가로 입수 가능한 반도체 레이저를 광원으로 사용하는 것이 바람직하다. 현재, 염가로 입수 가능한 반도체 레이저는 파장이 대강 580 nm 이상이며, 더욱 염가로는 600 nm 이상, 보다 염가로는 630 nm 이상이다.

따라서, 흡수 파장이 상기한 파장 이하인 측정 대상 물질에 대해서는 어떠한 방법으로 측정 대상 물질로부터 580 nm 이상의 흡수하는 물질 (이후는, 장파장 물질이라 칭함)을 생성시켜, 그 장파장 물질을 측정함으로써 측정 대상의 물질의 양을 간접적으로 측정하는 방법을 사용할 필요가 있다.

열렌즈 검출법에 의한 측정법에 대해서는 본 출원인에 의해서도 일본국 특허출원 평성10년 제181586호 명세서 ("혼합 분석 장치 및 혼합 분석 방법"), 일본국 특허출원 평성10년 제181587호 명세서 ("모세관 광열 변환 분석 장치"), 일본국 특허출원 평성10년 제167603호 명세서 ("분석 장치"), 국제 출원 PCT/JP99/03158호 명세서 ("광열 변환 분광 분석 장치"), 일본국 특허출원 2000년 제2057호 명세서 등이 출원되어 있다.

이들 명세서에서는 미량의 혈액 시료의 성분을 분석하는 방법의 예로서, 혈중 총 콜레스테롤 및 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나아제(GOT)를 측정하는 방법이 기재되어 있다. 이들 측정 방법에서는 측정 대상 물질을 출발 물질로 하여 효소를 이용한 반응에 의해 과산화수소를 발생시키는 것이 요점이다.

이와 같이, 과산화수소를 발생시킴으로써 장파장 물질을 생성시켜 측정 대상 물질의 양을 간접적으로 측정하는 방법은 흡광도법에서도 알려져 있다.

예를 들어, 혈중 총 콜레스테롤을 측정하는 경우는 콜레스테롤 에스테르를 콜레스테롤 에스테라제에 의해 가수 분해하여 콜레스테롤을 얻고, 원래 유리되어 있던 콜레스테롤과 함께 콜레스테롤 옥시다아제에 의해 산화시켜 과산화수소를 발생시킨다.

그리고, 이 과산화수소에 의해 3,5-디메톡시-N-에틸-N-(2'-하이드록시-3'-술포프로필) 아닐린나트륨 (이후는, DAOS라고 함)과 4-아미노안티피린 (이후는, 4-AA라고 함)을 산화 축합시켜, 반응 생성물로 하여 청색 색소를 생성시킨다. 그리고, 이 청색 색소의 흡광도 (파장: 600 nm)를 측정함으로써, 혈중 총 콜레스테롤량을 구한다. 이 측정 방법에 대해서는 와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사의 총 콜레스테롤 측정용 HA 테스트 와꼬, 콜레스테롤 E-HA 테스트 와꼬에 첨부된 설명서에 기재되어 있다.

또한, DAOS를 대신해서 N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (이후는, EMSE라고 함)을 사용하여, 흡광도법 (파장:555 nm)에 의해 측정된 예가 임상 검사법 제요(가네이 이즈미 저서, 긴바라 출판, 1998년, p 555 내지 556)에 기재되어 있다.

또한, GOT 측정의 경우는 L-아스파라긴산나트륨과 α-케토글루타르산을 기질로 하여 검체 중의 GOT에 의해 옥살로아세테이트를 생성시키고, 이어서 옥살로아세테이트를 옥살로아세테이트 옥시다아제에 의해 피루베이트로 유도하고 또한 피루베이트를 산소와 피루베이트 옥시다아제에 의해 산화시켜 과산화수소를 생성시킨다.

그리고, 생성된 과산화수소와 퍼옥시다아제에 의해 4-AA와 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘나트륨 (이후는, TOOS라고 칭함)를 산화 축합시켜 색소를 생성시킨다. 그리고, 이 색소의 흡광도 (파장: 555 nm)를 측정함으로써 GOT의 양을 구하는 것이다. 이 측정에 대해서는 주식회사 카이노스의 체외 진단용 의약품 첨부 문서집 1998년 판의 279 내지 280 페이지에 기재되어 있다.

이와 같이, 측정 대상 물질에 그 종류에 따른 옥시다아제를 작용시켜 과산화수소를 생성시킬 수 있으면, DAOS (또는 EMSE, TOOS 등의 유사 색소)와 4-AA와의 산화 축합물을 비교적 쉽게 생성시킬 수 있다. 그리고, 장파장의 레이저광을 여기광으로 이용하여 열렌즈 검출법에 의해 이 산화 축합물 (청색 색소 등)을 측정함으로써, 측정 대상 물질의 측정을 간접적으로 행할 수 있다.

그러나, 모든 물질에서 과산화수소를 유도해낼 수 있는 것은 아니다.

예를 들면, 임상 진단에 유용한 혈액 분석에서는 헤모글로빈, 알칼리포스파타아제 등이 측정 대상 물질이다. 그러나, 헤모글로빈, 알칼리포스파타아제 등에서 과산화수소를 발생시키는 반응은 일반적이지 않다. 따라서, 이러한 측정 대상 물질에 관해서는 상기한 것과 같은 과산화수소의 생성을 수반하는 반응을 이용한 측정 방법은 행해지지 않았다.

따라서, 헤모글로빈 등과 같이 과산화수소로 유도하기 어려운 물질에 대해서는 헤모글로빈 등에서 장파장 물질을 생성시키는 것과 같은 시약 및 반응을 발견하는 것이 필요하다.

특히, 모세관 중에서 측정을 행하는 경우는 침전의 생성이 측정에 많은 악영향을 미치기 때문에, 침전 및 미세결정이 발생되지 않는 시약이나 반응을 발견할 필요가 있다.

다음으로 이러한 물질의 종래의 측정법을 상술한다. 우선, 헤모글로빈에 대해서 설명한다.

혈액 시료 중의 헤모글로빈을 측정하는 것은 빈혈증이나 다혈증 등의 임상 진단에 있어서 중요하다.

종래의 흡광도법을 사용한 헤모글로빈 측정 방법은 모두 데스크탑으로부터 벤치탑 정도의 비교적 대형의 자동 검사기에 적합하도록 개량되어 왔다. 그 때문에, 측정용의 큐베트(셀)는 수백 ㎕에서 1 ㎖ 정도의 큰 것이고, 측정에 필요한 광로 길이를 2 내지 10 mm 정도로 하는 것이 가능하기 때문에 흡광도법으로 검출하는 것이 가능하였다.

종래의 헤모글로빈의 측정 방법으로는 시안메트헤모글로빈법, SLS법, 아자이드메트헤모글로빈법, 일칼리헤마틴법 등이 있지만 모두 흡광도법에 의해 측정하는 방법이다.

전혈을 용혈시켜 헤모글로빈을 흡광도로 측정하는 방법으로는 시안메트헤모글로빈법이 많이 이용되고 있고, 국제 기준법으로도 정해져 있다. 여기에서, 시안메트헤모글로빈법에 의한 헤모글로빈의 측정 방법을 간단하게 설명한다.

우선, 혈액 시료에 비이온성 계면 활성제 등을 포함하는 적혈구 용해제를 첨가하여, 적혈구 중에 포함되는 헤모글로빈을 용출한다. 다음으로 용출된 헤모글로빈을 페리시안화칼륨 등의 산화제로 산화하여, 메트헤모글로빈으로 전화시킨다. 그리고, 시안 이온을 첨가함으로써, 메트헤모글로빈을 시안메트헤모글로빈으로 전환시켜, 안정적인 헤모글로빈 측정 시료를 조제한다.

이 시안메트헤모글로빈은 540 nm에서 흡수하기 때문에, 540 nm의 흡광도를 측정하는 것으로 헤모글로빈을 정량할 수 있다. 그러나, 시안메트헤모글로빈은 540 nm에서 흡수하지만 6OO nm 이상에서는 흡수하지 않는다. 따라서, 현재 염가로 입수 가능한 반도체 레이저가 600 nm 이상이기 때문에 염가인 반도체 레이저를 여기광 또는 흡수 광원으로 한 헤모글로빈의 측정 방법에 시안메트헤모글로빈법은 적용할 수 없다.

게다가, 이 방법에서는 측정 시약이 독물인 시안화 칼륨을 함유하고 있기 때문에 측정 시약의 취급에 위험이 따른다. 또한, 측정 후의 폐액은 차아염소산나트륨 등을 이용하여 시아니드를 분해한 후에 폐기할 필요가 있고, 폐기 처리가 복잡하다.

이러한 독물 문제를 해결하는 방법으로 중성 완충액 중에 음이온성 계면 활성제인 도데실황산나트륨 또는 라우릴황산나트륨 (이후는 SLS라고 칭함) 및 트리톤 X-100 (상품명)을 함유하는 헤모글로빈 측정 시약이 클리니컬·바이오케미스트리 15권 83 (1982)에 개시되어 있다.

이 방법에서는 적혈구를 SLS 및 트리톤 X-100의 기능으로 용해시켜, 용출된 헤모글로빈을 SLS와 산소의 기능으로 메트헤모글로빈으로 전환시킴과 동시에 SLS 헤모글로빈으로 전환시킨다. 이 SLS 헤모글로빈은 540 nm에서 흡수하기 때문에, 540 nm 에서 흡광도를 측정함으로써 헤모글로빈을 정량할 수 있다.

이 방법에서는 측정 시약이 시아니드를 함유하지 않기 때문에, 복잡한 폐액 처리는 불필요하다. 그러나, SLS 헤모글로빈은 시안메트헤모글로빈과 동일하게 540 nm에서는 흡수하지만 600 nm 이상에서는 흡수하지 않는다. 그 때문에 600 nm 이상의 파장을 갖는 염가의 반도체 레이저를 광원으로 하는 광학적 측정 방법에는 적용할 수 없다.

또한, 헤모글로빈 자체의 퍼옥시다아제 활성을 이용한 정량법도 알려져 있다. 일본국 특허공개공보 소화 59년 제222766호 (데루모 주식회사)에는 헤모글로빈 자체의 퍼옥시다아제 활성을 이용하여 시약으로 첨가된 과산화수소에 의해 테트라메틸벤지딘을 산화시켜, 그 생성물의 흡광도 (파장: 660 nm)를 아세트산 중에서 측정함으로써 헤모글로빈을 측정하는 방법이 기재되어 있다.

또한, 일본국 특허공개공보 평성2년 제122267호 (녹십자사)에는, 헤모글로빈 자체의 퍼옥시다아제 활성을 이용하여, 시트르산 용액 중의 테트라메틸벤지딘을 과산화스트론튬에 의해 산화시켜, 그 생성물의 흡광도 (파장: 650 nm)를 측정함으로써 헤모글로빈을 측정하는 방법이 기재되어 있다.

이러한 방법은 모두 적혈구의 용혈 공정은 포함되어 있지 않기 때문에 혈장, 혈청, 뇨 등에 포함되는 가용화된 미량의 헤모글로빈 (전혈 중의 헤모글로빈 양(수십 g/㎗)에 비교하여 100 분의 1 정도의 저농도)를 측정한 것으로서, 전체 헤모글로빈을 측정한 것은 아니다. 또한, 이러한 방법은 혈장 등에 존재하는 헤모글로빈 퍼옥시다아제 활성 저해 인자에 의해, 검량선의 제조가 용이하지 않다. 또한, 흡광도 측정이기 때문에 마이크로 칩 등을 사용한 미량의 검체 측정에는 적합하지 않다.

한편, 일본국 특허공개공보 평성9년 제278786호 (포라 가세이사)에는 통상으로는 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하는 시안메트헤모글로빈법을 개량하여 펙틴 및 올리고갈락튜론산을 첨가함으로써, 흡광도를 증강시켜 감도를 향상시킨 측정법이 기재되어 있다. 이 방법에서는 흡광도가 증강됨과 동시에 흡수 파장이 장파장 측으로 시프트되어 680 내지 685 nm 에서의 측정이 가능해진다. 그러나, 흡광도가증강되었다고는 해도 이 방법에는 흡광도 측정의 감도의 한계 (검체량의 한계)가 있고 또한, 시안을 사용해야 하는 문제점이 있다.

또한, 열렌즈 검출법을 이용하여 백혈병 백혈구 중의 이상 헤모글로빈 생산을 검출한 예가 알려져 있다 (Wu, Kitamori, Sawada, Ana. Chem. 63,217-219,1991,기다모리, 사와다, 분석 3, 178-187, 1994). 이 방법은, 현미경 검경하에 슬라이드 유리 상에서 백혈구 세포를 하나 분리하여 세포를 파괴하지 않고 그대로 헤모글로빈의 420 nm의 흡수를 Xe 램프로 여기한다. 그리고, He-Ne 레이저를 프로브광으로 하여 백혈구 외부의 상부 공간에 형성되는 열렌즈를 검출함으로써, 백혈병으로 이상해진 백혈구가 생산하는 헤모글로빈을 측정하고 있다.

그러나, 혈액 중의 헤모글로빈 농도를 구하기 위해서는 소정 체적의 혈액을 용혈시켜, 그 속에 존재하는 전체 적혈구 유래의 헤모글로빈을 측정하는 것이 필요하기 때문에, 이 방법으로는 빈혈 등의 진단에 필요한 혈액 중의 적혈구 헤모글로빈 양을 측정할 수 없다. 게다가, 여기광의 파장이 420 nm이기 때문에 염가인 반도체 레이저를 사용하기도 어렵다.

또한, 겔 전기 영동으로 분리된 헤모글로빈을 싱글빔법의 열렌즈 검출법에 의해 측정한 예도 알려져 있다 (MA Thompson, et. al., Applied Spectroscopy, Vo1. 46, 945-947, 1992). 그러나, 이 예에서도 여기광의 광원에는 고가의 Ar 레이저 (파장: 514.5 nm)가 사용되고 있다. 또한 측정에는 18 cm×16 cm×75O ㎛이라는 큰 슬라브겔, 즉 고체상(相)을 사용하고 있고 마이크로 칩 중에서 액체 시료를 측정하는 것은 아니다.

이와 같이, 전혈 중의 헤모글로빈 농도를 극미량의 혈액 시료로부터 600 nm 이상의 파장을 갖는 레이저를 사용하여 측정하는 방법은 알려져 있지 않다.

다음으로 혈액 시료 중의 포스파타아제의 측정 방법에 관해서 설명한다. 포스파타아제의 측정 방법으로는 p-니트로페닐인산에스테르를 기질로 사용하는 방법이 기준법으로 널리 행해지고 있다 (임상 검사법 제요, 가네이 이즈미 저서, 긴바라 출판, 1998년, p613 내지 615). 이 방법은, 포스파타아제에 의해 p-니트로페닐 인산을 가수 분해하여 생성된 p-니트로페놀을 파장 405 nm에서 흡광도에 의해 측정한 것이다.

p-니트로페놀은 파장 550 nm 이상에서는 실질적으로 흡수하지 않기 때문에 염가인 레이저를 사용한 열렌즈 검출법에 이 반응계를 이용하는 것은 불가능하다. 이는 덴카 세이켄 주식회사의 ALP-S 시약의 첨부서 등에도 기재되어 있다.

또한, 생성된 p-니트로페놀과 4-AA를 메트과요오드산나트륨으로 산화 축합하여 적색 퀴논 색소를 생성시켜 파장 500 nm에서 흡광도로 비색 정량하는 방법도 알려져 있다 (주식회사 카이노스의 "체외 진단용 의약품 첨부 문서집 1998년 판"의 277 내지 278 페이지에 기재).

또한, 일본국 특허공개공보 평성7년 제33789호 (후지필름 주식회사)에 기재된 바와 같이, 더욱 장파장 측에서 흡수를 갖는 알칼리포스파타아제 (이후는 ALP라고 칭함)의 기질로 아조 색소를 사용하는 방법도 검토되어 왔다. 그러나, 이 방법은 흡광도법에 의한 측정을 위한 것으로써 광열 변환 검출법에 의한 측정을 위한 것이 아니다.

한편, 혈액 유래의 검체를 흡광도로 측정할 경우의 일반적인 문제로 유미를 들 수 있다. 유미 (chyle)는 소화 과정에서 장의 유미관에서 받아들이는 혼탁한 백색 또는 흐린 황색의 액체로 임파선에 의해 흉관을 거쳐 순환기 중에 운반된다.

유미는 림프액 중의 카이로마이크론에 의해 우유같은 외관을 나타내고 있다 (스테드만, 의학 대사전, 메디칼뷰사). 즉, 혈액 중에서 콜레스테롤이나 중성 지방이 마이셀 및 리포좀 등을 형성하여 백탁의 상태를 나타내고 있다.

유미가 발생되는 혈액 검체로 "혼탁"이 발생되기 때문에, 흡광도 측정인 경우는 측정 결과에 악영향이 발생된다. 즉, 흡광도 측정에서는 혼탁에 의한 흡수와 측정 대상 물질 및 반응 생성물의 흡수와의 구별이 어렵기 때문에 통상은 측정 대상 물질이나 반응 생성물의 흡수가 없는 700 내지 800 nm의 장파장에서 대조 흡광도를 측정하고 다음으로 측정 대상 물질이나 반응 생성물의 흡수파장에서 흡광도를 측정하여 두 흡광도의 차이를 측정치로 하고 있다 (상술된 임상 검사법 제요 및 주식회사 카이노스의 "체외 진단용 의약품 첨부 문서집 1998년 판" 등에 기재되어 있다).

이와 같은 조작에 의해, 흡광도계의 셀 (큐베트)의 오염 등에 의한 영향도 보정할 수 있지만, 한 샘플에 대해 다른 2가지 파장에서 측정을 행할 필요가 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로, 그 목적은 POC 분석 등을 적용하는 데 바람직한 측정 방법으로 염가인 장파장의 레이저를 여기광의 광원으로 하는 열렌즈 검출법에 의해 모세관 중에서 미량의 생체 성분 유래 시료 중의 물질을 염가로 간편하고 또한 단시간에 측정할 수 있는방법을 제공하는 데에 있다.

특히, 헤모글로빈, 포스파타아제 등과 같이 과산화수소로 유도하기 어려운 물질을 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.

또한, 본 발명은 유미화를 나타내는 혈액 시료에서도 1회만의 측정으로 혈액 시료 중의 물질을 정량할 수 있는 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기한 측정 방법에서 바람직하게 사용되어, 미량의 생체 성분 유래 시료 중의 물질을 안정적으로 측정할 수 있는 측정 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.

<발명의 개시>

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 다음과 같은 구성으로 이루어진다. 즉, 본 발명의 물질 측정 방법은 생체 성분 유래 시료 중의 물질을 검출하거나 또는 그 농도의 측정을 행하는 방법으로서, 시료 조제 공정과 광열 변환 검출 공정을 구비하고 있고, 상기 시료 조제 공정은 상기 생체 성분 유래 시료와 측정 시약을 혼합 반응시켜, 과산화수소를 유도하지 않고 상기 물질과는 흡수 파장이 다른 반응 생성물을 상기 물질의 양에 대응하는 양만 생성시켜 측정 시료를 조제하는 공정이고, 상기 광열 변환 검출 공정은 상기 측정 시료에 여기광을 조사하여 그 결과 발생하는 부분적인 온도 변화에 따른 물리량 변화를 측정하는 공정이며, 상기 반응 생성물은 수용성이고, 또한 상기 여기광의 파장 영역에서 상기 반응 생성물의 흡광도는 상기 온도 변화를 발생시키는 데에 충분한 것을 특징으로 한다.

상기 물리량 변화를 굴절률 변화라고 하면, 상기 광열 변환 검출 공정은 상기 굴절률 변화에 의해 형성되는 열렌즈에 검출용 프로브광을 입사시켜, 상기 열렌즈에 의해 발생하는 상기 프로브광의 변화를 측정할 수 있다.

또한, 상기 여기광의 파장은 600 nm 이상인 것이 바람직하다. 또한, 상기 생체 성분 유래 시료와 상기 측정 시약을 모세관을 갖는 마이크로 칩에 장입(裝入)하여, 상기 시료 조제 공정과 상기 광열 변환 검출 공정을 상기 마이크로 칩의 모세관 내부에서 행할 수 있다.

상기 모세관은 판면에 홈을 구비한 한쌍의 평판상 부재를 상기 홈을 구비한 판면을 내측으로 하여 접합시킴으로써 형성될 수도 있다. 또한, 상기 홈은 상기 한쌍의 평판상 부재 중 적어도 한쪽에 구비되어 있을 수 있다.

또한, 상기 생체 성분 유래 시료를 혈액 시료, 상기 물질을 헤모글로빈으로 하여, 상기 시료 조제 공정을 상기 혈액 시료와 상기 측정 시약을 혼합하여 용혈시켜 상기 측정 시료를 조제하는 공정으로 하면, 혈액 시료 중의 헤모글로빈을 측정할 수 있다.

이 때, 상기 여기광의 파장 범위를 610 nm 내지 650 nm으로 하고, 상기 프로브광의 파장을 상기 여기광보다도 장파장으로 하는 것이 바람직하다.

상기 여기광의 파장 범위를 620 nm 내지 640 nm으로 하고, 또한 상기 프로브광의 파장을 상기 여기광보다 장파장으로 할 수도 있다.

또한, 상기 측정 시약은 적혈구를 용혈시키는 농도의 중성 계면 활성제와, 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 농도의 산화제와, pH의 범위를 5 내지 7로 유지시키는 농도의 완충제를 포함할 수 있다.

또한, 상기 측정 시약은 시아니드를 함유하지 않는 것이 바람직하다.

또한, 상기 혈액 시료와 상기 측정 시약과의 혼합비 범위는 1:1 내지 1:250이 바람직하다.

또한, 상기 물질을 포스파타아제로 하고 상기 측정 시약이 상기 포스파타아제에 대한 기질을 함유함으로써, 상기 시료 조제 공정을 상기 생체 성분 유래 시료와 상기 측정 시약을 혼합하여 상기 생체 성분 유래 시료 중의 포스파타아제와 상기 측정 시약 중의 상기 기질을 반응시켜 측정 시료를 조제하는 공정으로 하면, 생체 성분 유래 시료 중의 포스파타아제를 측정할 수 있다.

상기 기질은 인산 에스테르 결합을 가질 수 있다.

또한, 상기 기질은 5-브로모-4-클로로-3-인독실포스페이트 및 그의 염 중 어느 하나인 것이 바람직하다.

또한, 상기 포스파타아제는 일칼리포스프타아제일 수도 있다.

또한, 상기 측정 시료 중의 상기 기질의 농도의 범위는 1 내지 15 mM인 것이 바람직하다.

또한, 상기 생체 성분 유래 시료와 상기 측정 시약을 혼합하고 나서, 상기 물리량 변화를 측정하기까지의 바람직한 시간은 3 내지 15 분이다.

또한, 본 발명의 물질 측정 방법은 유미화를 나타내는 혈액 시료 중의 물질을 검출하거나 또는 그 농도의 측정을 행하는 방법으로서, 상기 혈액 시료와 측정 시약을 혼합하여 측정 시료를 조제하는 시료 조제 공정과, 상기 측정 시료에 여기광을 조사하여 그 결과 발생되는 부분적인 온도 변화에 따른 물리량 변화를 측정하는 광열 변환 검출 공정을 구비하는 것을 특징으로 한다.

상기 물리량 변화를 굴절률 변화라고 하면, 상기 광열 변환 검출 공정에서는 상기 굴절률 변화에 의해 형성되는 열렌즈에 검출용 프로브광을 입사하여, 상기 열렌즈에 의해 발생하는 상기 프로브광의 변화를 측정할 수 있다.

또한, 상기 혈액 시료와 상기 측정 시약을 모세관을 갖는 마이크로 칩에 장입하여 상기 시료 조제 공정과 상기 광열 변환 검출 공정을 상기 마이크로 칩의 모세관 내부에서 행할 수 있다.

상기 모세관은, 판면에 홈을 구비한 한쌍의 평판상 부재를 상기 홈을 구비한 판면을 내측으로 하여 접합시킴으로써 형성되는 것일 수도 있다. 또한, 상기 홈은 상기 한쌍의 평판상 부재 중 적어도 한쪽에 구비되어 있을 수도 있다.

또한, 본 발명의 측정 시약은 상기 물질이 헤모글로빈인 경우의 측정 방법에서 이용되는 측정 시약으로서, 적혈구를 용혈시키는 농도의 중성 계면 활성제와, 헤모글로빈을 메트헤모글로빈에 산화시키는 농도의 산화제와, pH의 범위를 5 내지 7로 유지시키는 농도의 완충제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 측정 시약은 상기 물질이 포스파타아제인 경우의 측정 방법에서 이용되는 측정 시약으로서, 인산에스테르 결합을 갖는 기질을 구비하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 기질은 5-브로모-4-클로로-3-인독실포스페이트 및 그의 염 중 어느 하나인 것이 바람직하다.

이하에, 본 발명을 상세하게 설명한다.

혈액, 뇨 등의 생체 유래의 검체 및 환경 분석 등의 검체에 포함되는 성분을 측정하는 방법으로는 검체의 양이 미량인 경우에는 모세관을 갖는 마이크로 칩과 열렌즈 검출법을 조합하는 방법이 유용하다. 배경 기술의 항에서 상술한 바와 같이 수십에서 수백 ㎛ 정도의 깊이 및 폭을 갖는 모세관 중에서 열렌즈 검출법에 의해 물질을 측정하기 위해서는 여기광과 프로브광이 모세관에 집광되는 것이 바람직하다.

그 때문에 상기 두 광의 광원으로는 색수차 등의 문제를 갖는 백색광 광원이 아니라, 파장이 갖추어진 레이저 및 발광 다이오드 등이 바람직하다. 단, 단파장의 레이저 및 발광 다이오드는 매우 고가이며 또한, 열렌즈를 형성하기 위해서는 여기광의 광원이 어느 정도의 출력을 갖는 것이 필요하다. 따라서, 현재 비교적 염가이고, 어느 정도의 출력을 갖는 장파장의 반도체 레이저가 바람직하다. 또한, 수 mW 정도 이상의 출력을 갖는 것이면 발광 다이오드도 염가인 광원으로 본 발명에서 사용할 수 있다.

여기광 및 프로브광의 파장은 580 nm보다 장파장으로 한다. 특히, 600 nm 이상, 630 nm 이상인 파장의 반도체 레이저 및 발광 다이오드가 염가이므로 바람직하다.

이러한 배경하에 모세관 내부의 물질을 열렌즈 검출법에 의해 측정하기 위한 조건을 이하에 설명한다.

a) 측정 대상 물질 그 자체 또는 효소적·화학적으로 유도되는 물질 (이후, 반응 생성물이라 칭함)이 여기광의 파장 영역에서 열렌즈를 형성하기 위해 충분한흡광도를 갖을 것.

b) 측정 대상 물질 및 반응 생성물이 모세관 중에서 침전을 발생하지 않을 것.

또한, 필수 조건은 아니지만 프로브광의 파장은 여기광의 파장보다 장파장인 것이 바람직하다.

상기한 조건에 대해 이하에 상술한다.

혈액, 뇨 등의 생체 유래의 검체 중에 존재하는 물질 중, 그 자체가 580 nm 이상의 파장의 흡수, 특히 630 nm 이상인 파장의 흡수를 갖는 물질은 매우 적다. 상당한 장파장의 흡수를 갖는 헤모글로빈조차, 540 내지 577 nm의 흡수가 크고, 생체 중에 겨우 존재하는 메트헤모글로빈에 유래하는 약한 흡수가 630nm일 뿐이다.

빌리루빈 등도 630 nm 이상의 파장의 흡수는 상당히 약하기 때문에 정량적인 측정이 곤란하다.

또한, 혈중에 존재하는 효소 등은 통상은 자외 영역에서만 흡수를 갖지 않는 백색 단백질인 것이 많고, 또한 각 효소 및 단백질과 같은 불순물의 흡수가 중첩되기 때문에 정량적인 측정이 곤란하다. 그 때문에, 혈중 효소를 정량할 때는 그 효소에 의해 장파장 영역에서 흡수를 갖는 물질 (반응 생성물)에 따른 특이적인 기질을 이용하여 반응 생성물을 생성시켜 이 반응 생성물을 정량함으로써 효소의 양 (정확하게는 효소 활성)을 정량하는 것이 필요하다. 또한, 이후에는 이러한 반응을 장파장화 반응이라 칭한다.

또한, 콜레스테롤 등과 같은 효소 이외의 혈중 물질을 정량할 때에는, 선택적으로 그 물질을 기질 (효소와 반응하는 물질)로 하는 효소의 작용 및 화학 반응에 의해, 장파장 영역에서 흡수를 갖는 반응 생성물로 상기 혈중 물질을 유도할 필요가 있다.

따라서, 염가인 여기광 광원을 사용하는 측정을 가능하게 하기 위해서는 상기 반응 생성물의 흡수 파장이 580 nm 이상, 더욱 염가로는 600 nm 이상, 보다 염가로는 630 nm 이상이 되도록 측정 대상 물질로부터 상기 반응 생성물로 유도하는 반응 및 측정 시약을 발견할 필요가 있다. 반응 생성물이 충분한 양의 여기광을 흡수하고 또한 광원이 염가이면, 흡수 파장의 상한은 특별히 한정되지 않지만 통상 800 nm 이하가 잘 이용된다.

임상 화학 분석에서 발색 시약 개발의 흐름의 하나로, 혈액 중의 간섭 물질의 분석에 대한 영향을 저하시키는 것이 있다. 이를 위한 수단으로 생체 성분에 고유의 흡수 파장을 피하는 것과 같이 장파장을 흡수하는 발색 시약이 검토되었다. 현재에도 용혈 검체 중의 헤모글로빈 및 황달 환자의 검체 중의 빌리루빈의 흡수 파장보다도 장파장 측에서 λmax를 갖는 발색 시약의 개발이 계속되고 있다 (아오야마 노리히또 (靑山典仁), 임상 검사, 41, 9, 1014 (1997)). 혈액 중의 헤모글로빈 및 빌리루빈의 영향을 저하시키기 위해서는 적어도 600 nm 이상의 파장 영역에서 측정할 필요가 있다 (간섭 체크·A플러스 첨부 참조 데이터 (고꾸사이 시야꾸 주식회사)). 한편, 헤모글로빈 양의 측정에 대해서는 산성 분위기하에 메트헤모글로빈이 630 nm의 흡수를 나타내기 때문에 헤모글로빈과 다른 생화학 항목을 공통된 광원으로 측정할 경우에는 광원의 파장으로 600 내지 650 nm의 영역이 중요하다.

마이크로 칩의 모세관 내부에서 혼합 반응시키고 또한 측정을 행하기 때문에 상기한 장파장화 반응에서 침전이 발생되는 것은 바람직하지 않다. 마이크로 칩의 모세관 내부 및 마이크로 칩의 모세관 이외의 부분에서 액체 (측정 시료)의 유동의 장해가 되는 크기의 침전이 발생되는 것은 피해야만 한다. 액체의 유동이 조금이라도 흐트러지면, 정량적인 혼합 및 반응 시간의 제어에 대하여 악영향이 생길 우려가 있기 때문이다.

또한, 마이크로 칩의 검출부에 침착된 침전은 여기광 및 프로브광의 산란이 발생되기 때문에, 측정의 정량성을 크게 저하시킬 가능성이 있다. 또한, 본 발명자들은 흡광도법에서는 거의 문제가 되지 않는 장파장화 반응의 반응 생성물의 작은 석출물(미세침전물, 미세결정)이 열렌즈 검출법에서는 큰 문제가 되는 것을 발견하였다.

일례로, ALP의 측정에 관해서 설명한다. ALP의 정량은 ALP의 활성을 측정함으로써 행하는 것이 일반적이다. 즉, 기질 중의 인산 에스테르 부분이 ALP에 의해 가수 분해되어 기질 유래의 색소가 발색되기 때문에 그 색소를 측정하는 것이다.

통상은 p-니트로페놀인산에스테르를 기질로 하여 가수분해에 의해 생성된 p-니트로페놀의 405 nm 부근의 흡수를 흡광도계로 측정한다. 그러나, 염가인 여기광 광원을 사용할 경우에 상술된 바와 같이, 보다 장파장에서 흡수를 갖는 반응 생성물을 발생하게 할 필요가 있다. 630 nm 부근에서 흡수되는 반응 생성물이 발생하는 ALP의 기질로서 시판되는 연구 시약으로는 5-브로모-4-클로로-3-인독실포스페이트를 들 수 있다.

이 기질이 가수 분해된 5-브로모-4-클로로-3-히드록시인돌은 산소에서 산화되어 이량화됨으로써, 600 nm 이상에서 흡수를 하는 청색의 색소가 된다. 이 이량체는 물에 용해도가 높지 않기 때문에 ALP농도, 기질 농도, 및 반응 시간 등의 조건, 즉 이들의 조합의 결과에 의한 장파장화 반응의 반응 생성물의 농도에는 열렌즈 검출법에 알맞는 범위가 존재하게 된다. 그리고, 그 범위보다도 반응 생성물의 농도가 높아지면 후술하는 비교예 1과 같이 미세결정이 발생되어 열렌즈 검출법에 의한 측정이 곤란해진다.

이러한 미세결정은 통상의 취급에서는 용액에 부유, 분산되어 하루동안 방치해도 침전되지는 않는다. 이 미세결정은 흡광도 측정에서는 거의 악영향을 미치지 않지만 열렌즈 검출법에서는 측정 불능이 될 정도의 악영향을 미치는 경우가 있다. 따라서, 강한 원심 조작을 행하는 등으로 미세결정을 침전시킬 필요가 있다.

단, 여기광을 흡수하는 미세결정 (미세침전물)이 부유, 분산되어 있으면 열렌즈 검출법에 의한 출력 (열렌즈 신호)이 불안정해지는 이론적인 이유에 대해서는 명확하지 않다. 또, 동일 미립자에서도 여기광을 흡수하지 않는 폴리스티렌 등의 라텍스비드 (직경 500 nm 정도)가 존재하더라도 열렌즈 검출법에 의한 출력은 측정 가능하다.

이와 같이 여기광을 흡수하지 않는 혼탁물 및 미립자가 존재해도 열렌즈 검출법에 의한 측정이 가능한 것은, 유미화를 나타내는 혈액 시료 중의 물질을 측정할 때 특히 유리하게 기능한다.

즉, 배경 기술의 항에서 설명한 바와 같이, 유미는 넓은 파장 범위에서 흡광도 측정에 악영향을 제공한다. 그 때문에, 측정 대상 물질의 흡수 파장에서 측정과, 유미에만 영향을 주는 혼탁도 측정을 위한 보다 장파장에서의 측정의, 이 2가지 파장에서의 측정이 필수가 된다.

이에 대하여, 열렌즈 검출법인 경우는 후술하는 바와 같이 적절한 희석을 행하면, 유미가 측정에 악영향을 제공할 가능성은 거의 없다. 이것은 여기광을 100내지 3000 Hz 정도의 주파수로 초핑 (on/off)하여, 그에 동기하는 프로브광의 광량 변화만을 추출하여 열렌즈 검출법에 의한 출력을 검출하기 때문이다. 여기광을 흡수하지 않는 혼탁물은, 흡광도의 절대치가 경시 변화없이 크게 보이지만 초핑된 여기광과 동기한 열 변화를 측정 시료 중에서 발생시키는 것은 없다.

헤모글로빈을 열렌즈 검출법에 의해 측정하기 위해서는 헤모글로빈으로부터 과산화수소를 유도하여 이 과산화수소에 의해 장파장 물질을 생성시키는 방법 (측정 시약, 반응)을 발견할 필요가 있다. 즉, 헤모글로빈에 특이적인 산화 효소 (과산화수소를 발생함)를 발견하거나, 배경 기술의 항에 기재된 헤모글로빈 자신의 퍼옥시다아제 활성을 전혈 중의 헤모글로빈의 측정에 응용할 수 있도록 반응계를 개량하거나 할 필요가 있다. 그렇게 하면, 과산화수소 및 퍼옥시다아제로부터 예를 들면 DAOS와 4-AA의 산화 축합 생성물 (장파장 물질)을 생성시킬 수 있다.

그러나, 상기한 어느 것에서도 산화 효소를 쉽게 입수할 수 없고, 전혈 중에서의 헤모글로빈의 퍼옥시다아제 활성을 정량적으로 활용하기 어려운 등의 과제가 있다. 따라서, 장파장 물질로는 헤모글로빈 자신의 장파장 물질, 즉 메트헤모글로빈을 이용하는 것이 염가인 여기광의 광원을 사용하는 경우에는 적합하다.

메트헤모글로빈은 수용성이 높기 때문에 측정시에 침전이 생성되는 등의 문제는 없다. 단, 메트헤모글로빈은 불안정하기 때문에, 후술하는 것과 같은 연구를 부가함으로써 안정되고 정량적인 측정을 가능하게 하였다.

이하, 헤모글로빈 및 ALP를 측정하는 방법에 대해서 더욱 상술한다.

<헤모글로빈의 흡수 파장에 관해서>

혈액 중 대부분의 헤모글로빈은 2가의 철에 산소가 결합된 옥시헤모글로빈 및 산소가 분리된 데옥시헤모글로빈의 상태로 존재하며, 극히 일부가 산소와 결합할 수 없는 3가의 철로 산화된 메트헤모글로빈으로 되어 있다.

옥시헤모글로빈의 흡수는 540 nm와 577 nm에서 일어나고, 데옥시헤모글로빈은 555 nm에서 흡수한다. 또한, 메트헤모글로빈은 pH에 의해서 흡수가 변화되는데, 산성에서는 630 nm, 강염기성에서는 보다 단파장 영역에서 흡수하여 붉은 빛이 증가한다.

이와 같이 혈액 중의 헤모글로빈은 옥시헤모글로빈, 데옥시헤모글로빈만으로도 3가지 흡수를 갖기 때문에 이대로 전체 헤모글로빈의 정량은 어렵다. 그 때문에, 종래에는 일단 혈액 시료를 용혈시켜 그에 페리시안화 칼륨과 같은 산화제를 첨가함으로써 모든 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시켰었다. 생성된 메트헤모글로빈은 불안정하기 때문에, 청산가리(KCN) 등을 첨가하여 CN 이온을 햄철에 배위시켜, 540 nm에서 흡수를 하는 안정적인 시안메트헤모글로빈으로 유도하고 나서, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그러나, 상술된 바와 같이 마이크로 칩 중에서 헤모글로빈의 정량을 행하는경우에는 흡광도법에 의한 측정은 곤란하고 열렌즈 검출법에 의해 검출하는 것이 바람직하다. POC 분석 등에서의 사용을 생각하면, 고가의 가스 레이저가 아닌 염가의 반도체 레이저를 사용할 수 있는 파장으로 헤모글로빈을 여기하고, 열렌즈의 변화를 검출하는 것이 바람직하다. 현재 염가인 반도체 레이저나 발광 다이오드의 파장은 600 nm 이상이기 때문에, 그 이상의 흡수를 갖도록 혈액 중의 모든 헤모글로빈을 유도할 필요가 있다.

그래서, 여기광이 조사되어 있는 상태하의 메트헤모글로빈의 흡수 안정성을 검토하였다. 즉, 열렌즈 검출법에서 마이크로 칩의 모세관에 조사하는 여기광과 동일 파장으로, 그 측정 시료(반응 후의 액체)를 광로 길이를 1 cm로 길게 한 큐베트 속에 넣고 흡광도 측정을 하였다.

만일, 흡광도가 불안정하면 원리적으로 열렌즈 검출법에 의한 출력도 불안정해지기 때문에, 흡광도가 안정적이고 또한 고정밀도로 측정할 수 있는 것이 열렌즈 검출법에 대한 필요 조건이 된다.

후술하는 실험예 1에 나타낸 바와 같이, 청산가리를 첨가하지 않고 630 nm에서 흡수하는 메트헤모글로빈으로 헤모글로빈을 산화시켰다. 그리고, 이에 633 nm의 레이저광을 조사하여, 그 흡광도 변화가 용량 의존성이 있는지를 검토하였다. 그 결과, 630 nm의 파장에서도 헤모글로빈을 정량하는 것이 가능하였다.

(혈액 시료와 측정 시약의 혼합비에 대해서)

그러나, 본 발명자들의 검토에 의해, 혈액 시료와 헤모글로빈 측정 시약을 혼합하여 측정 시료로 할 때의 통상의 혼합비(1:250 이상)에서는 열렌즈 검출법에의한 출력이 시간에 따라 약간 불안정하고, 경시적으로 조금씩 감소되어 가는 것을 알 수 있었다. 예를 들면, 1:250에서는 630 nm의 흡광도가 20 분에 8.5 ％ 감소될 뿐이지만, 1:415에서는 16 ％의 감소, 1:1250에서는 31 ％ 정도 감소되어, 임상 진단에는 적용하기 어려운 정밀도가 된다.

비교적 낮은 정밀도의 헤모글로빈 측정이면 이것으로도 측정은 가능하지만 높은 정밀도로 측정을 행하기 위해서는 개선이 필요하였다. 본 발명자들은 여러가지 검토한 결과, 혈액 시료와 후술하는 조성을 갖는 측정 시약과의 혼합비를 1:1 내지 1:250 이하로 하면, 이 열렌즈 검출법에 의한 출력의 경시 변화 (감소)를 피할 수 있는 것을 발견하였다.

또한, 마이크로 칩 중에서 헤모글로빈 측정을 할 경우에는 혈액 시료와 측정 시약과의 혼합비가 1:250을 초과할 경우, 예를 들면 1:500 등인 경우에는 마이크로 칩 내부에서 혼합하기는 어렵다. 왜냐하면, 우선, 혈액 시료가 미량이라도 대량의 측정 시약이 필요하기 때문에 마이크로 칩 내부의 측정 시약 저장기가 지나치게 커지는 결점이 있다.

또한, 1:500의 혼합은 마이크로 칩이 가는 모세관 중에서 균일하게 혼합되는 것이 곤란하다. 따라서, 균일한 혼합을 실현하기 위한 특수한 유로 구조 (방해판, 교반 등) 및 현저하게 긴 유로 등이 필요해진다. 그 점에서도 혼합비를 작게 하는 것은 바람직하다.

본 발명에서 혈액 시료와 측정 시약과의 바람직한 혼합비는 1:1 내지 1:250이 고, 보다 바람직하게는 1:1 내지 1:50, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 1:10이다.이 혼합비가 1:1 보다 작으면, 예를 들어 1:0.1 등이 되면, 용혈에 충분한 측정 시약 침투압을 제공하기 어렵게 되고 마이크로 칩 내부의 송액에서 혈액 점도의 영향을 무시할 수 없게 된다.

(측정 시약의 조성에 대해서)

본 발명의 헤모글로빈의 측정 방법에 있어서 사용되는 측정 시약 중에 포함되는 중성 계면 활성제는 전체 적혈구를 용해시키기에는 충분한 계면 활성 능력이 있으면 특별히 한정되지 않는다. 중성 계면 활성제의 종류로는 구체적으로는, 6-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (예를 들면, 시그마사의 트리톤 X-100) 등의 폴리옥시에틸렌에테르류 및 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 (예를 들면, ICI사 및 시그마사의 트윈 20), 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레이트 (예를 들면, ICI사, 시그마사 등의 트윈 80) 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄류 (트윈) 등을 사용할 수 있다.

또한, SLS 등의 음이온성 계면 활성제 및 세틸트리부틸암모늄브로마이드 (CTAB) 등의 양이온성 계면 활성제 등을 이용할 수 있는 경우도 있다. 용혈시에 pH 변화를 일으키지 않는 정도이면 이들 이온성 계면 활성제도 사용 가능하다. 계면 활성제의 상세한 리스트는 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, 문헌[Gower 사의 Handbook of Surfactant 제2판, 제1권 및 제2권(1997년)] 등이다.

본 발명에서 측정 시약은 혈액 시료 중의 적혈구를 전부 용혈시키는 양으로 첨가할 수 있다. 본 발명에서 측정 시약은 1:1 내지 1:250의 비로 혈액 시료에 첨가된다. 그 결과, 얻어지는 혼합물 중의 계면 활성제의 바람직한 농도는 0.5 내지1.1 중량％이고, 보다 바람직하게는 0.7 내지 0.9 중량％, 보다 바람직하게는 0.8 중량％이다.

또한, 측정 시약 중에 사용할 수 있는 산화제는 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 페리시안화칼륨이다. 본 측정 시약은 전체 헤모글로빈을 산화시키는 데 충분한 양을 혈액 시료에 첨가한다.

후술하는 실험예 1에 산화제 농도의 검토 결과를 나타낸 바와 같이, 열렌즈 검출법의 필요 조건인 메트헤모글로빈의 산화는 혈액 시료 1 ㎕에 대하여 산화제가 50 내지 10000 nmol(절대량)인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 혈액 시료 1㎕에 대하여 산화제가 100 내지 4000 nmol(절대량)이다.

또한, 본 측정 시약의 pH치는 메트헤모글로빈의 흡수를 630 nm으로 유지시키기 때문에, 약산성 내지 약알칼리성인 것이 바람직하다. 실험예 1과 동일하게 열렌즈 검출법의 필요 조건인, 여기광이 조사되어 있는 상태하의 메트헤모글로빈의 흡수 안정성을 검토한 결과 (후술하는 실험예 2를 참조), 그 pH는 4 내지 8인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 pH 5.0 내지 7.0이고, 더욱 바람직하게는 pH 5.7 내지 6.3이다. 상기한 것과 같은 pH치를 유지하기 위해 PBS 등의 인산 버퍼 및 여러가지의 양호한 버퍼 등, 통상의 완충제가 사용된다.

본 발명의 측정 방법에서 반응계 및 반응 생성물의 성상의 필요 조건은,

c) 과산화수소를 경유하지 않은 반응계일 것,

d) 반응 생성물이, 염가인 반도체 레이저의 파장에서 흡수하는 색소계의 물질일 것,

e) 반응 생성물의 성상은 레이저의 광 직경에 대해 충분한 균일성을 갖는 용액상일 것, 등이다

현재 시판되고 있는 반도체 레이저 중에서 염가인 것은 대략 635 내지 645 nm 이상의 파장인 것이다. 따라서, 본 발명의 측정 방법에 있어서의 반응계로는 상기 파장에서 흡수하는 색소계의 물질을 생성시키는 반응이 바람직하다.

(알칼리포스파타아제 활성의 정량 측정에 대해서)

포스파타아제 활성을 측정하는 방법으로는 페닐 인산의 분해물인 페놀과 4-AA를 산화 축합시킨 적색 퀴논 색소 (λmax : 500 nm)의 흡수 스펙트럼을 600 nm 이상의 파장 영역에서 측정하는 방법이 있다. 또한, 글리세로포스페이트를 직접 기질로 이용하여 생성된 글리세롤을 글리세롤 데히드로게나제와 산화형 니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드 (이하, NAD+라고 칭함)를 이용하여, 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드 (이후는 NADH라고 칭함)와 디히드록시세톤과 환원시키는 방법도 있다 (A.Bianchi, etal., J.Biochem. Biophys. Methods, 28, 35, 1994).

또한, 글리세로포스페이트를 기질로 하는 반응계로는 NADH 및 테트라졸륨염, 구체적으로는 주식회사 도진 가가꾸 겡뀨쇼의 WST 시리즈를 기질로 사용하여 페나진메타설페이트 (이후는 PMS라고 칭함) 또는 디아포라아제 활성에 의해 환원시켜 발색시키는 반응계를 첨가하여 600 nm 이상의 파장에서 측정하는 방법을 들 수 있다.

그러나, λmax가 500 nm의 적색 퀴논 색소를 600 nm 이상의 파장에서 측정하는 방법에서는 포스파타아제 활성의 측정에 있어서 분해 능력이 작아진다. 또한, 글리세로포스페이트를 기질로 하는 반응계는 유효하다고 생각되지만, 다단층 반응이기 때문에 기질 반응계의 조합 등의 최적화가 필요하다. 따라서, 본 발명의 측정 방법에서 반응계로 사용하기 위해서는 더욱 많은 검토 기간이 필요하다.

포스파타아제 활성 측정용 기질로 600 nm 이상의 발색을 나타내는 것으로는 예를 들면, 일본국 특허공개공보 평성7년 제33789호에 개시되어 있는 것이 있다. 이것은 644 nm에서 흡수하는 수용성 포스파타아제 기질에서 ALP 측정용 기질로서 본 발명의 측정 방법에서 이용할 수 있지만 쉽게 입수되는 것은 아니다. 시판품 중에서 입수 가능한 것으로는 5-브로모-4-클로로-3-인독실포스페이트 (이후는 BCIP라고 칭함)가 분해되어 615 nm에서 또한, 3-인독실포스페이트가 680 nm에서 발색하는 것이 알려져 있다 (SUBSTRTE and Reagent, BIOSYNTH사 카탈로그).

본 발명의 측정 방법의 유효성을 나타내는 일례로 ALP 측정용 기질로서 B CIP를 사용한 예를 나타낸다. 5-브로모-4-클로로-3-인독실 (이후는 BCI라고 칭함)는 ALP 활성을 이용한 유전자 등의 발현 확인, 또는 조직 염색에서의 검출에 이용되는 것이 넓게 알려져 있다 (J.P.Horwitz, etal., J.Med. Chem., 9, 447, 1966). 또한, 5-브로모-4-클로로-3-히드록시인돌의 이량체 (이후는 BCI2라고 칭함)는 수용성이 나쁘고 가용화되기 어려운 것도 일반적으로 알려져 있다 (J.J.Leary, etal., Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 80, 4045, 1983).

따라서, ALP 활성의 정량에서 BCI를 액상으로 측정하는 것이 곤란한 것은 자명하다. 그러나, 본 발명자는 예의 검토한 결과, 측정 시료 중의 BCIP의 농도를최적으로 함으로써 임상 화학에서 사용되는 ALP 활성의 측정에 본 발명의 측정 방법이 유효하다는 것을 발견하였다.

구체적으로 직경 범위가 약 0.1 내지 1 ㎛ 이하인 BCI2의 색소 입자의 생성이 억제되는 BCIP의 농도 및 반응 시간을 규정하였다.

더욱 구체적으로는 완충액을 JSCC 상용 기준법에 따라서 제작하였다. 즉, 1.01 M 2-에틸아미노에탄올-HCl (알드리치사)/0.505 mM MgCl₂(ph 9.87)의 완충액을 제작하였다 (이후는 완충액 1이라고 칭함). 혈액 시료와 반응시키기 직전에 기질로서 BCIP (와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)를 최종 농도가 1 내지 15 mM이 되도록 완충액 1에 용해시켜 ALP 측정 시약 (측정 시약)을 제조하였다.

또한, 최종 농도란 혈액 시료와 측정 시약을 혼합하여 측정 시료로 하였을 때의 농도이다.

그리고, 반응 시간을 3분 내지 15분, 더욱 바람직하게는 3 내지 6분으로 하였다.

(BCIP의 용해도에 대해서)

기질인 BCIP의 순수의 용해도는 나트륨염인 경우, 20 mg/㎖, 즉 54 mM이다 (시그마 종합 카탈로그, SIGMA 사). 완충액 1에 대한 BCIP의 용해도는 약 70 mM이었다. BCIP의 최적 농도를 구할 목적으로 완충액 1에 최종 농도로 70 mM의 BCIP를 용해시킨 ALP 측정 시약을 조제하여, 이것을 완충액 1에서 단계적으로 희석하여 BCIP의 최종 농도가 70 mM, 35 mM, 15 mM, 10 mM, 6.25 mM, 5 mM, 2.5 mM, 1.25 mM인 ALP 측정 시약을 각각 조제하였다.

ALP 검체로 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사) 2500 ㎕로 용해하여, ALP 활성이 계산치로 800 IU/ℓ가 되도록 조제하고 스톡 용액으로 하였다. 다음으로 스톡 용액을 정제수로 희석하여, 계산치로 400 IU/ℓ 및 50 IU/ℓ의 ALP 활성을 포함하는 용액을 조제하였다.

(ALP 활성의 흡광도계에 의한 측정에 관해서)

ALP 측정 시약 1000 ㎕과 상기 검체 25 ㎕를 시험관 중에서 충분히 혼합하여 37 ℃에서 정확하게 2분 30초간 보온한다. 그 후, 반응액 전량을 광로 길이 1 cm의 석영 셀에 넣고 37 ℃에 공기 항온되어 있는 흡광도계에 의해, 반응 개시로부터 12분 30초까지 635 nm에서 흡수도를 측정하였다.

그 결과, 모든 BCIP 농도의 ALP 측정 시약에서 농도 의존성을 갖는 검량선을 얻을 수 있고 측정이 가능한 것을 알 수 있다 (도 12 참조).

(ALP 활성의 열렌즈 검출법에 의한 측정에 대해서)

ALP 측정 시약 1000 ㎕와 상기 검체 25 ㎕를 시험관 중에서 충분히 혼합하여, 37 ℃에서 정확하게 2분 30초간 보온한다. 그 후, 반응액 전량을 광로 길이 50 ㎛의 석영셀에 넣고 37 ℃에서 공기 항온되어 있는 스테이지에 얹어 반응 개시에서 5 분까지 열렌즈 검출법에 의해 측정을 행하였다.

그 결과, 70 mM, 35 mM 이외의 BCIP 농도의 ALP 측정 시약에 있어서 농도 의존성을 갖는 검량선을 얻을 수 있고 측정이 가능한 것을 알 수 있다 (도 10, 도 11참조).

여기에서 흡광도계로는 모든 BCIP 농도에서 측정이 가능하지만 열렌즈 검출법으로는 측정이 곤란한 BCIP 농도가 있는 것을 알 수 있다. 이 이유를 유색 미립자 (색소 입자)가 존재하는 것이 원인이라고 가정하여 각 BCIP 농도의 ALP 측정 시약에 대해서 반응 생성물의 입도 분포를 측정하였다.

(레이저 회절/산란식 입도 분포계에 의한 BCI2 입경 측정에 대해서)

BCIP 농도가 70 mM 및 6.25 mM의 ALP 측정 시약 25 ㎖를 미리 37 ℃에서 예비 가온하였다. 여기에 ALP 활성을 계산치로 800 IU/ℓ로 조제한 표준 혈청 (혈액시료)을 이하와 같이 혼합한 것(시료 1 내지 4)을 각각 준비하였다.

우선, 시료 1은 BCIP 농도가 70 mM인 ALP 측정 시약에 상기 표준 혈청 2500㎕를 혼합하고 37 ℃에서 3일간 반응한 것이다.

다음으로, 시료 2는 BCIP 농도가 70 mM인 ALP 측정 시약에 상기 표준 혈청 625 ㎕을 혼합하여 37 ℃에서 3일간 반응한 것이다.

또한, 시료 3은 BCIP 농도가 6.25 mM의 ALP 측정 시약에 상기 표준 혈청 625㎕을 혼합하여 37 ℃에서 3 시간 반응한 것이다.

또한, 시료 4는 BCIP 농도가 6.25 mM의 ALP 측정 시약 그 자체이다 (상기 표준 혈청은 혼합하지 않음).

또한, 측정 장치에는 HORIBA LA-910형 레이저 회절/산란식 입도 분포 측정 장치를 이용하여 상기 장치의 메뉴얼에 따라 입도 분포 측정을 행하였다. 구체적으로는 약 50 ㎖의 정제수를 넣은 상기 측정 장치가 수반된 초음파 분산 버스에 10㎖의 시료 1 내지 4를 첨가하여 측정을 행하였다. 입도 분포의 측정 조건인 상대 굴절률은 1.26-0.00i로 하였다.

측정 결과, ALP 측정 시약과 표준 혈청을 혼합 반응하여 얻어진 것 중에는, 상기 반응 결과 생성된 BCI2가 존재하는 것을 알 수 있었다. 그리고, 그 BCI2의 입자(미세결정)는 대략 수백 nm의 입경을 갖는 것을 알 수 있다 (도 16 참조).

또한, 입도 분포의 측정 결과에서 수 ㎛의 크기의 입자도 존재하는 것이 분명해졌다. 단, 반응 시간이 장시간인 시료, 즉 반응 시간이 3일간인 시료 1, 2인 경우는 입경이 수백 nm의 입자가 주로 존재하는 것으로 수 ㎛의 크기의 입자는 BCIP이라고 생각된다. 그러나, 이 BCIP의 입자가 어떠한 상태로 존재되는지는 불분명하다.

따라서, 열렌즈 검출법에 알맞는 측정 시약으로는 측정 시약과 생체 성분 유래 시료와의 반응 생성물로서 색소 입자를 생성하지 않는 것이 필요하다. 또한, ALP 측정 시약의 BCIP 농도 및 반응 시간이 적절한 것으로 할 필요가 있다.

또한, 측정 시약과 생체 성분 유래 시료와의 반응 이전에, BCI2의 입자 등의 유색 미세결정이 존재하는 것이 바람직하지 않은 것은 설명할 필요도 없다.

(락테이트데히드로게나아제 활성의 정량 측정에 관해서)

락테이트데히드로게나아제 (이후는 LDH라고 칭함) 활성을 측정하는 경우는 LDH 활성에 의해 락테이트와 NAD+를, 피루베이트와 NADH로 변화시키고 또한, NADH와 NTB를 디아포라제 활성에 의해 NAD+와 불용성 디포르마잔과 정량적으로 변환시킨다. 그리고, 불용성 디포르마잔을 0.1 N-HCl로 가용화하여 570 nm의 파장으로측정을 행한다. 또한, 디아포라제를 대신하여 페나딘메타술페이트 (이후는 PMS라고 칭함)를 사용할 수도 있다.

가용화된 색소(불용성 디포르마잔)는 흡수 파장 스펙트럼에서 600 nm 이상의 영역에서 충분하게 정량 측정이 가능하다.

또한, NTB를 대신해서 수용성 포르마잔 기질을 응용하는 방법이 알려져 있다 (이시야마 무네다까 (石山 宗孝), 임상 검사, 41, 9, 995, 1997). 주식회사 도진 가가꾸 겐뀨소의 수용성 포르마진 중에서도 WST-4 및 WST-5는 용액의 pH 변화에 대하여 스펙트럼 변화가 인정되지 않는 특성이 있다 (이시야마 무네다까, D0JIN News, 82, 10, 1996), 최대 흡수 파장이 550 nm 이지만, 흡수 파장 스펙트럼에서 600 nm 이상의 영역에서 정량 측정이 가능하다.

또한, WST-1, WST-3, WST-8은 최대 흡수 파장이 각각 438 nm, 433 nm, 460 nm이고, 600 nm 이상에서는 흡수 파장 스펙트럼이 인정되지 않는다. 그러나, 상기 반응 종료 후에 알칼리를 이용하여 pH를 크게 함으로써 600 nm 이상에서 흡수할 수 있기 때문에 (스펙트럼 시프트), 본 발명의 측정 방법에 적용할 수 있다.

그러나, 불용성 색소의 가용화 및 스펙트럼 시프트를 목적으로 강산, 강알칼리에 의한 pH의 조제를 마이크로 칩 중에서 행하거나, 용매 등에 의한 불용성 색소의 가용화를 마이크로 칩 중에서 행하는 것은 마이크로 칩을 구성하는 중합체 등에 용해 등의 손상이 발생될 가능성이 있다. 그렇게 하면, 모세관의 단면적 등이 변화되어 모세관 내부를 유동하는 액체 유량이 경시 변화될 가능성이 있으므로 바람직하지 않다.

그래서, 수용성 기질로 WST-4 및 WST-5를 응용하였다. 본 발명자는, WST-4 및 WST-5를 사용함으로써 임상 검사에서 측정되는 LDH 활성의 범위에서 본 발명의 측정 방법의 유효성을 나타낼 수 있었다.

다음으로 과산화수소를 경유하지 않는 반응계의 예를 표시하여 본 발명 측정 방법의 유효성을 나타낸다.

(혈액 총 단백질의 정량 측정에 관해서)

측정 대상 물질에서 과산화수소를 유도하는 반응을 사용하지 않고 혈액 총 단백질 (이후는 TP라고 칭함)을 측정하는 방법으로는 뷰레트 비색법에 의한 방법이 있다. 이것은, 알칼리 분위기 중에서 Cu 이온과 펩티드쇄 중의 질소 원자와의 착체 발색을 540 내지 550 nm의 파장에서 정량 측정하는 것이다.

또한, 피로갈롤 적색 색소를 이용한 600 nm에서의 정량 방법도 일반적이다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사 1997). 그러나, 피로갈롤 적색 색소를 이용한 측정법은 정량 측정할 수 있는 혈액 총 단백질의 농도가 낮고 혈액 중의 TP 측정을 행하기 위해서는 혈액을 천배 이상 희석해야 할 필요가 있다.

마이크로 칩 중에서 정량적인 희석은 가능하다. 그러나, 천배 이상의 희석을 행하기 위해서는 마이크로 칩 중에 설치된 희석용 저장기가 지나치게 커지므로 현실적으로는 불가능하다.

본 발명자는 뷰레트 비색법인 측정 시약의 시판품 (카이노스 오토 시리즈 TP 시약, 카이노스 주식회사 제조)의 흡광도 스펙트럼을 확인하고 635 nm에서 TP의 정량 측정이 가능한 것을 발견하였다.

(요소 질소의 정량 측정에 관해서)

혈액 중의 요소 질소를 측정하는 방법으로는 디아세틸모노옥심법, 우레아제·인도페놀법, 우레아제·UV법, 효소법에 의해 과산화수소를 정량적으로 생성시켜 정량하는 방법 등이 있다. 일반적으로는 우레아제·인도페놀법이 가장 사용되고 있다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사 1997).

우레아제·인도페놀법은 측정 대상 물질에서 과산화수소를 유도하는 반응을 이용하지 않는 방법으로 570 nm의 흡수 파장에서 정량 측정을 행하는 것이다.

본 발명자는 우레아제·인도페놀법 측정 시약의 시판품 (자동 분석용 시약 「세이켄(生硏)」 UN-I, 덴카 세이켄 주식회사 제조)을 이용하여, 우레아제·인도페놀법의 스펙트럼을 확인하고 635 nm에서 요소 질소의 정량 측정이 가능한 것을 발견하였다.

(총 빌리루빈의 정량 측정에 대해서)

혈액 중의 총 빌리루빈을 측정하는 방법으로는 디아조 색소와 빌리루빈을 결합시켜 아조빌리루빈을 생성하는 디아조법 및 빌리루빈옥시다아제에 의해 빌리루빈을 산화시키는 효소법이 일반적이다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사 1997).

그러나, 효소법은 빌리루빈의 산화에 의해 특유의 흡수 파장 (450 nm 부근)이 감소되는 것을 이용하여 정량함으로써 본 발명의 측정 방법에 이용하는 것은 불가능하다.

본 발명자는 일칼리 아조빌리루빈법 (측정 파장: 600 nm)을 이용하여 600 nm 이상의 영역에서 정량 측정이 가능한 것을 확인하였다.

(γ-GTP 활성의 정량 측정에 관해서)

혈액 중의 γ-GTP 활성을 측정하는 방법으로는 p-니트로아닐리드법 또는 카르복시-p-니트로아닐리드법 (405 내지 415 nm), 3-카르복시-4-히드록시아닐리드법 (410 내지 635 nm), 디메틸아미노아닐리드법 또는 디에틸아미노아닐리드법 (660 nm), γ-Glu-DBHA 법 (600 내지 610 nm) 등이 일반적이다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사 1997).

그러나, p-니트로아닐리드법 또는 카르복시-p-니트로아닐리드법은 반응 생성물의 흡수 파장이라는 점에서 본 발명의 측정 방법에는 적용할 수 없다. 3-카르복시-4-히드록시아닐리드법, 디메틸아미노아닐리드법 또는 디에틸아미노아닐리드법, γ-Glu-DBHA 법은 측정 대상 물질에서 과산화수소를 유도하는 반응을 이용하지 않는 방법으로서 본 발명의 측정 방법에 적용 가능하다.

본 발명자는 γ-Glu-DBHA 법이 본 발명의 측정 방법에 적응 가능한 것을 확인하였다.

(알부민의 정량 측정에 관해서)

혈액 중의 알부민을 측정하는 방법으로는 브로모크레졸그린법(이후는 BCG 법이라 칭함) 또는 브로모크레졸퍼플법 (이후는 BCP 법이라 칭함)이 일반적이다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사 1997).

두 방법 모두 알부민에 색소를 결합시킴으로써 알부민을 발색시켜, 정량을 행하는 것이다. 이러한 방법은 측정 대상 물질에서 과산화수소를 유도하는 반응을 이용하지 않는 방법이고, 또한 600 nm 이상의 파장 영역에서 측정이 가능하다.

본 발명자는 BCG 법이 본 발명의 측정 방법에 적응 가능한 것을 확인하였다.

(과산화수소를 경유하는 측정 항목에 관한 예)

예를 들어 과산화수소의 생성을 경유하여 측정 대상 물질을 정량 측정하는 반응에 본 발명의 측정 방법이 유용한 것을 상술한다.

우선, 측정 대상 물질에 특이적인 효소에 의한 반응에 의해서 과산화수소를 생성한다. 그리고, 이 과산화수소에 의해서 퍼옥시다아제 활성을 통하여 4-AA와 색 원소를 산화 축합한다. 이 때, 적당한 색 원소를 선택함으로써 발색되는 파장을 선택할 수 있다. 즉, 6OO nm 이상의 파장 영역에서 측정하는 것이 가능해진다.

이하에 8개의 구체예를 상술한다.

<아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성의 정량 방법>

혈액 중의 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제 (이후 AST라고 칭함) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (이후는 ALT라고 칭함) 활성 정량 방법으로는 UV에 의한 측정법, 피루브산 옥시다아제 (이후는 POP라고 칭함)-퍼옥시다아제 (이후는 POD라고 칭함)법, 포르마잔 비색법, 라이트맨-프랑켈법 등이 알려져 있다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사 1997).

본 발명자는 POP-POD 법의 측정 시약의 시판품 (TA-LN 카이노스: 카이노스 주식회사)의 일부를 변형한 것을 본 발명의 측정 방법에 적용시켜 AST, ALT의 활성 정량이 가능한 것을 확인하였다.

<요산의 정량 방법>

혈액 중의 요산 정량 방법으로는 우리카아제 POD법, 우리카아제 카탈라제법 등이 알려져 있다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사, 1997).

본 발명자는 우리카아제 POD 법의 측정 시약의 시판품 (이아트로 QUA, 야트론 주식회사)를 본 발명의 측정 방법에 적용시켜 요산 정량이 가능한 것을 확인하였다.

<글루코스의 정량 방법>

혈액 중의 글루코스 정량 방법으로는 포도당 산화 효소 비색법, UV 법 등이 알려져 있다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사, 1997).

본 발명자는 포도당 산화 효소 비색법의 측정 시약의 시판품 (데타미나 GL-E, 교와 메덱스 주식회사)을 본 발명의 측정 방법에 적용시켜 글루코스의 정량이 가능한 것을 확인하였다.

<총 콜레스테롤의 정량 방법>

혈액 중의 총 콜레스테롤의 정량 방법으로는 콜레스테롤 옥시다아제법 등이 알려져 있다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사, 1997). 본 발명자는 콜레스테롤 옥시다아제법의 측정 시약의 시판품 (HA 테스트 와꼬 콜레스테롤 E-HA 테스트 와꼬, 와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)을 본 발명의 측정 방법에 적용시켜, 총 콜레스테롤의 정량이 가능한 것을 확인하였다.

<HDL-콜레스테롤의 정량 방법>

혈액 중 HDL-콜레스테롤의 정량 방법으로는 직접법 및 덱스트란 황산 Mg·인 텅스텐산 Mg법이 알려져 있다 (체외 진단용 의약품집 '99 추가보정판, 약사일보사,1999).

본 발명자는 직접법인 측정 시약의 시판품 (콜레스테스트 HDL, 다이이찌 가가꾸 야꾸힝 주식회사)를 본 발명의 측정 방법에 적용시켜 HDL-콜레스테롤의 정량이 가능한 것을 확인하였다.

<LDL-콜레스테롤의 정량 방법>

혈액 중 LDL-콜레스테롤의 정량 방법으로는 직접법이 알려져 있다 (체외 진단용 의약품집 '99추가 보정판, 약사일보사, 1999).

본 발명자는 직접법인 측정 시약의 시판품 (LDL-EX, 덴카 세이켄 주식회사)를 본 발명의 측정 방법에 적용시켜, LDL-콜레스테롤의 정량이 가능한 것을 확인하였다.

<중성 지방의 정량 방법>

혈액 중의 중성 지방의 정량 방법으로는 효소 비색법 등이 알려져 있다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사, 1997).

본 발명자는 효소 비색법의 측정 시약의 시판품 (자동 분석 장치용 시약-HR 트리글리세라이드-HR, 와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)을 본 발명의 측정 방법에 적용시켜, 중성 지방의 정량이 가능한 것을 확인하였다.

<크레아티닌의 정량 방법>

혈액 중 크레아티닌 정량 방법으로는 야페법(Yaffe), 효소비색법, 효소UV법 등이 알려져 있다 (체외 진단용 의약품집, 야꾸지닛뽀사, 1997).

본 발명자는 효소 비색법의 측정 시약의 시판품 (L 타입 와꼬 크레아티닌 F,와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)을 본 발명의 측정 방법에 적용시켜 크레아티닌의 정량이 가능한 것을 확인하였다.

(열렌즈 검출법의 유미 내성에 관해서)

여기광의 파장에 특이적인 흡수를 나타내지 않는 직경 수십 nm 정도의 미립자, 예를 들면 유미에 대하여 열렌즈 검출법이 내성을 갖는 예를 상술한다.

유미의 정도를 정량화하기 위해 간섭 체크·A플러스 (고쿠사이 시야꾸 주식회사)를 이용하였다. 일반적으로 강유미가 되는 2100 포르마진도의 혈청(검체)을 스이트롤 A (닛스이제약주식회사)를 이용하여 사용 설명서에 따라 제작하였다. 그리고, HA 테스트 와꼬 콜레스테롤 E-HA 테스트 와꼬 (와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)를 검체에 반응시킨 후, 열렌즈 검출법 및 흡광도법 (635 nm)에 의해 측정을 행하였다.

그 결과, 흡광도법에서는 백그라운드가 생기지만 열렌즈 검출법에서는 유미 의 영향이 발생되지 않는 것을 확인하였다. 이 결과에서 열렌즈 검출법은 유미에대하여 내성을 갖는 것을 알 수 있었다.

(여기광 및 프로브광에 대해서)

본 발명자들이 여기광에 633 nm의 파장을 갖는 He-Ne 레이저를 이용하여 프로브광에 488 nm의 파장을 갖는 Ar 레이저를 이용하여 열렌즈 검출법에 의한 헤모글로빈의 측정을 행한 바, 후술하는 참고예 1에 기록된 바와 같이 열렌즈 검출법에 의해 출력이 매우 크고, 나아가 경시적으로 상승되는 현상이 있었다.

이 여기광과 프로브광의 조합은 콜레스테롤 등의 생화학 물질을 DAOS 등의색소로 유도하여 측정한 경우에는 문제 없이 열렌즈 검출법에 의한 출력을 검출할 수 있고, 정량할 수 있는 조합이다.

이것은 예를 들면, 국제공개 WO 99-64846호(국제출원 PCT/JP99/03158 명세서, "분석 장치"), 일본국 특허공개공보 평성12년 제2675호(일본국 특허출원 평성10년 제181587호 명세서, "모세관 광열 변환 분석 장치"), 일본국 특허공개공보 평성12년 제2677호(일본국 특허출원 평성10년 제167603호 명세서, "분석 장치"), 일본국 특허출원 평성10년 제181586호 명세서("혼합 분석 장치 및 혼합 분석 방법"), 일본국 특허출원 평성10년 제167603호 명세서("분석 장치") 등에 기재되어 있다.

본 발명자들이 여러가지 검토한 결과, 488 nm 및 633 nm의 두 파장의 광이 메트헤모글로빈에 조사되면 광반응이 발생하여 다른 값이 되는 것을 알게 되었다. 그래서, 프로브광을 여기광보다 장파장인 메트헤모글로빈이 흡수하지 않는 파장의 레이저로 바꾸었더니 정상적인 열렌즈 검출법에 의한 출력을 얻을 수 있었고 헤모글로빈의 정량이 가능하게 되었다.

헤모글로빈의 측정을 위해 본 발명에서 이용하는 여기광의 광원은 메트헤모글로빈의 630 nm의 흡수대를 여기할 수 있는 파장으로 열렌즈를 형성시키는 데 충분한 출력을 구비한 것이 필요하다. 여기광의 파장은 메트헤모글로빈의 흡수의 경우 610 nm 내지 650 nm이 바람직하고, 보다 바람직하게는 630 nm±10 nm 이다. 여기광의 광원은 630 nm 부근에서 여기에 필요한 광도를 갖는다면, 특별히 한정하지 않는다.

예를 들면, 크세논 램프 등에서 필요로 하는 파장의 광을 프리즘을 이용하여 추출할 수도 있지만, 분광하면 출력이 작아진다.

측정 대상 물질을 여기시킬 수 있는 파장을 갖는 레이저 또는 충분한 출력을 구비한 발광 다이오드일 수도 있다. 레이저로는 633 nm의 He-Ne 레이저 등도 이용되지만, 반도체 레이저를 이용하면 검출 장치가 작아지고 POC 분석 등의 용도에 적합하다. 반도체 레이저로는 도시바에서 제조한 TOLD9450MC 등의 650 nm의 파장인 것도 이용되지만, 보다 바람직한 여기광 광원으로는 샤프에서 제조한 LT050MS 및 산요덴끼에서 제조한 DL-3088-011, DL4038-025 등의 635 nm의 파장의 반도체 레이저를 들 수 있다.

헤모글로빈 측정에 있어서 프로브광의 파장은 상술된 바와 같이 600 nm 보다 장파장이 바람직하고, 보다 바람직하게는 여기광의 파장인 630 nm±20 nm 보다 장파장인 것이다. 1064 nm의 YAG 레이저 및 900 내지 1200 nm에서 100 개 정도의 발진선을 갖는 탄산 가스 레이저 등도 사용할 수 있지만, 일본 과학 엔지니어링사가 제조한 LDT7830 및 산요덴끼에서 제조한 DL-4034-151 등의 780 nm의 파장을 갖는 반도체 레이저가 더욱 바람직하다. 산요덴끼에서 제조한 DL-7032-001 및 샤프에서 제조한 LT015PD 및 히다찌에서 제조한 HL8325G 등의 83O nm의 파장을 갖는 반도체 레이저도 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 여기광, 프로브광과 함께 모세관 부근에 촛점을 연결하도록 하기 위해서 집광 렌즈가 필요하다.

이상에서 상술된 여기광 및 프로브광의 광원은 헤모글로빈 이외의 것을 측정할 경우에도 사용할 수 있다.

열렌즈에 의한 프로브광의 변화는 포토 다이오드, CCD 카메라, 광전자 배증관 등으로 파악된다. 특히, 포토 다이오드가 검출 장치의 소형화에는 적합하다.

여기광은 초퍼 등으로 0.1 내지 20 m초 정도의 펄스 광 (주파수 50 Hz 내지 10000 Hz)이 되어, 그 초퍼와 동조하는 록인앰프 등으로 프로브광의 변화만을 추출하게 되어 있다. 보다 바람직한 초퍼의 주파수는 100 Hz 내지 4000 Hz이다.

록인앰프의 구조는 단기능의 반도체 소자 등으로 간략화가 가능하다. 또한, 여기광의 펄스화는 반도체 레이저를 전기적으로 변조시킴으로써 행할 수도 있다. 또한, 프로브광의 검출시, 일반적으로는 록인앰프를 사용하지만 일본국 특허공개공보 평성9년 제229883호에 개시된 암시야형 광열 변환 분광 분석 장치의 방법을 이용할 수도 있다. 즉, 차폐판으로 펌프광 및 프로브광의 광축 부근의 광속을 차폐하여 열렌즈에 의해 발산된 프로브광만을 검출하는 수단이다.

초퍼에 의해 펄스광이 된 여기광에 의해서 형성되는 열렌즈의 변화를 프로브광으로 검출할 때는 프로브광 중의 진동 성분 (여기광의 펄스와 동일 주파수)만을 검출하게 된다. 따라서, 산란 등에 의해서 광의 절대량 I가 감소되더라도 광량 I에 대한 진동 성분 i의 비 (i/I)는 불변하여 안정적이고 정확한 값을 얻는 것이 가능해진다.

(마이크로 칩에 관해서)

본 발명의 헤모글로빈의 측정 방법에서 사용되는 마이크로 칩은 그 내부에 혈액 시료 및 측정 시약 등이 흐르는 모세관을 갖고 있으면, 그 구성 등은 특별히 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, 이하와 같은 마이크로 칩은 본 발명에서 바람직한 형태의 하나이다. 즉, 마이크로 칩이 한쌍의 평판상 부재로 구성되어 있다. 한쌍의 평판상 부재 중 적어도 한쪽은 표면에 액체가 흐르는 홈을 갖고 있다. 그리고, 상기 평판상 부재의 상기 홈을 내측으로 하여 2개의 평판상 부재를 접합시킴으로써 내부에 모세관을 형성하고 있다.

이러한 마이크로 칩은 실리콘, 유리 등의 무기 재료 및 유기 중합체로 제조할 수 있다. 단, 열렌즈 검출법의 검출 부분은 여기광 및 프로브광에 대하여 투명한 것이 필요하다.

마이크로 칩을 실리콘 및 유리로 제조할 경우는 유리, 석영 또는 Si의 기판에 에칭 보호막 (Cr 등)을 진공 증착 등의 방법으로 수백 nm의 두께로 제막을 행한다. 그리고, 그 위에 패터닝 레지스트를 스피너 등을 이용하여 도포한다. 그 후, 포토리소용 마스크를 이용하여, 자외광으로써 레지스트를 노광하고 계속해서 현상 (미경화 부분을 용제로 제거)하여, 원하는 형상으로 패터닝한다.

다음으로 패터닝된 레지스트를 에칭 마스크로 하여 에칭 보호막을 페리시안화 칼륨수용액 등으로 용해 제거하여 패터닝한다. 계속해서, 패터닝된 레지스트 및 에칭 보호막을 마스크로 하여 기판을 예를 들면 불산 수용액으로 에칭하여 홈을 형성한다. 그 후, 레지스트 및 보호막을 에칭 제거한다. 또한, 상기 기판과는 별도로 레이저 및 초음파 가공 등의 방법으로 관통 구멍을 갖는 유리 등의 기판을 준비한다.

마지막으로, 홈을 설치한 기판과 관통 구멍을 갖는 기판을 홈을 내측으로 하여 접합시키고 예를 들어 진공로 중에서 가열 (유리 기판끼리인 경우에는, 600 ℃ 정도로 여러 시간 가열) 한 후, 자연 냉각하는 것으로 융착하여 마이크로 칩을 만들 수 있다.

마이크로 칩을 유기 중합체로 제조할 경우는 광학적 검출을 행하기 때문에, 측정에 이용되는 파장의 광에 대하여 투명성을 갖는 수지를 사용할 필요가 있다. 예를 들면, 광열 변환 검출법에 의한 측정인 경우는 ASTMD1003으로 측정되는 수지의 광선 투과율 범위가 600 nm 내지 800 nm에서 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상인 것을 사용할 수 있다. 상기한 광선 투과율은 마이크로 칩 표면에서의 반사율 및 유기 중합체 기재 그 자체에 의한 흡수율의 총 합계를 100 ％에서 뺀 값이다.

마이크로 칩 표면 등에서 산란되는 광은 유기 중합체에 대해 아무런 효과도 발휘할 수 없는 데에 대하여 유기 중합체 기재에 의해서 흡수되는 광은 유기 중합체에 대해서도 열을 발생시키는 효과를 갖는다. 따라서, 광이 유기 중합체를 통과할 때에 열렌즈와 동일한 효과가 발생하고 열렌즈 검출법에 의한 출력의 백그라운드가 되기 때문에 측정 오차의 원인이 된다. 따라서, 마이크로 칩의 제조에 앞서서 유기 중합체 재료의 평가를 행하여, 열렌즈 검출법에 영향을 주지 않는 투과율 범위를 조사할 필요가 있다.

흡광도법에 의해 측정하는 경우는 유기 중합체에 10 ％ 정도 흡수되어도 전체 광량을 90 ％로 저하시키는 것에 지나지 않으므로 검출 감도에는 큰 영향을 미치지 않는다. 그러나, 광열 변환 검출법인 경우는 10 ％ 이하의 흡수만으로도 유기 중합체로 제조된 마이크로 칩에 형성되는 열렌즈 때문에 측정 결과에 큰 영향을 미친다. 특히, 측정 대상 물질의 농도가 낮고 또한 모세관이 가느다란 경우 (홈이 얕음), 측정에 고감도가 요구될 경우에는 1 ％ 이하의 흡수만으로도 때로는 0.5 ％ 이하의 근소한 흡수만으로도 측정 결과에 악영향이 나올 가능성이 있다.

예를 들면, 1 cm의 큐베트에서의 흡광도가 0.1 정도의 물질(액체)의 측정은 임시로 50 ㎛의 모세관을 구비한 유기 중합체로 제조된 마이크로 칩을 이용하여 행한다 (즉, 광로 길이가 50 ㎛). 그렇게 하면, 1 cm의 광로 길이에서의 흡광도 0.1은 50 ㎛의 모세관에서의 흡수율 0.103 ％에 해당된다. 유기 중합체로 제조된 마이크로 칩의 유기 중합체 부분에 의한 흡수(열렌즈의 형성)를 이 10 배까지 허용한다고 하면 흡수율은 1 ％, 2 배로 하면 흡수율은 0.2 ％가 된다.

즉, 1 cm의 광로 길이인 경우의 흡광도가 0.1 정도의 측정을 본 발명의 측정 방법으로 행하기 위해서는 마이크로 칩을 형성하는 유기 중합체에 의한 광의 흡수가 1 ％ 이하, 보다 바람직하게는 0.2 ％ 이하인 것이 바람직하다.

단, 이 값은 측정 대상 물질의 농도 및 모세관의 가늘기 등의 차이에 의해 변화될 수 있다. 예를 들면, 측정 대상 물질의 농도를 높임으로써, 1 cm의 큐베트에서 흡광도를 0.5 정도까지 올리면, 50 ㎛의 모세관에서는 흡수율 0.342 ％에 해당된다. 따라서, 유기 중합체로 제조된 마이크로 칩에 의한 흡수(열렌즈의 형성)를 이 10 배까지 허용하면 유기 중합체로 제조된 마이크로 칩에 의한 흡수율은 대개 3.5 ％, 2 배까지 하면 흡수율은 대략 1 ％가 된다.

또한, 상기 평판상 부재에 홈을 설치할 때의 가공성도 수지 종류의 선택에있어서 중요한 요소이다. 가공성 면에서 양호하게 사용할 수 있는 것은 일반적인 용융 가공 가능한 열가소성 수지 및 UV 경화에 의해서 얻어진 수지를 들 수 있다. 특히 양호하게 사용할 수 있는 것은 표면에 홈을 갖는 평판상 부재를 대량으로 염가에 성형할 수 있다는 점에서 용융 가공 가능한 열가소성 수지이다. 그 중에서도 비결정성 열가소성 수지, 비결정성 수지가 주성분인 열가소성 중합체 혼합물, 또는 결정 화도가 낮은 일부의 결정성 열가소성 수지가 바람직하다.

또한, 혈액과의 친화성, 특히 응집, 응고, 및 혈소판의 활성화 등이 발생하지 않는 것도 바람직한 재료 조건 중의 하나이다.

이상과 같은 광의 투과성과 가공성을 만족하고, 특히 양호하게 사용할 수 있는 것은 구체적으로는 폴리스티렌, 스티렌-아크릴로니트릴 공중합체 등의 스티렌계수지, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 메틸메타크릴레이트-스티렌 공중합체 등의 메타크릴수지, 폴리카르보네이트 (PC), 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리에테르이미드, 폴리아릴레이트, 폴리메틸펜텐 등이다.

1,3-시클로헥사디엔계 중합체도 바람직하게 이용된다. 호모 중합체로 사용하는 것도 가능하지만 공중합체로 이용할 경우는 1,3-부타디엔, 이소프렌, 1,3-펜타디엔, 1,3-헥사디엔 등의 쇄상 공액 디엔계 단량체, 스티렌, α-메틸스티렌, p-메틸스티렌, 1,3-디메틸스티렌, 비닐나프탈렌, 비닐스티렌 등의 비닐 방향족계 단량체, 메타크릴산메틸, 아크릴산메틸, 아크릴로니트릴, 메틸비닐케톤, α-시아노아크릴산메틸 등의 극성 비닐 단량체 또는 에틸렌옥시드, 프로필렌옥시드, 환상락톤, 환상락탐, 환상실록산 등의 극성 단량체, 또는 에틸렌, α-올레핀계 단량체와의 공중합체를 들 수 있다. 이 경우의 바람직한 공중합비는 중량비로 1,3-시클로헥사디엔 단량체/공단량체=75/25 내지 100/0이다.

광 투과성이 높은 시클로헥사디엔계 중합체에 관해서는 일본국 특허출원 평성9년 제277045호 명세서 및 일본국 특허출원 평성10년 제287007호 명세서에 상세하게 기술되어 있다. 상기 중합체는 200 nm 이상의 파장에서 흡수는 거의 없다.

상기와 같은 홈을 갖는 유기 중합체로 제조된 평판상 부재는 평판에서의 절삭가공, 레이저 등에 의한 에칭 가공, 형 내부에서의 단량체 및 마크로 단량체의 UV 경화 및 열경화, 열가소성 수지의 용융 가공 및 소성 가공 등의 방법에 의해 성형할 수 있다. 양호하게 사용할 수 있는 성형 가공법으로는 상기 평판상 부재를 대량으로 염가에 성형 가공할 수 있는 것에서 열가소성 수지의 용융 가공 및 소성 가공을 들 수 있다. 보다 양호하게 사용될 수 있는 것은 금형을 이용한 열가소성 수지의 사출성형법, 압축성형법, 엠보싱성형법이다.

특히, 수지의 금형 공동에의 충전 공정 중에 금형에 접하는 수지 표면의 고화 온도를 저하시키면서 사출 성형하는 사출성형법 (일본국 특허공개공보 평성10년 제128783호, 일본국 특허출원 평성10년 제46665호 명세서에 개시되어 있음)은 성형정밀도가 높은 미세한 홈을 갖는 평판상 부재를 높은 생산성으로 성형할 수 있다. 이 사출 성형 방법의 구체예로는 공동 내부에 탄산 가스를 채우고 사출 성형하는 방법을 들 수 있다. 이 경우의 탄산 가스의 압력은 10 MPa 이하, 보다 바람직하게는 0.3 내지 2 MPa이다.

또한, 성형 직전에 고주파 유도 가열로 금형 표면을 가열하여 성형하는 사출성형 방법 (일본국 특허공개공보 소화62년 제58287호, 미국 특허 제4439492호 등에 기재) 및 성형 직전에 복사 가열로 금형 표면을 가열하여 성형하는 사출 성형 방법 (성형 가공 심포지아 '95, 241<1995>, 성형 가공 '96, 69<1996>, 합성 수지, 42권(1), 48<1992> 등에 기재) 등의 금형 표면을 가열하여 성형하는 사출 성형 방법도 본 발명에서 마이크로 칩 제조에 바람직한 성형 방법이다.

즉, 상기 성형 방법은 금형 온도를 낮게 설정하여 고주파 유도 가열 및 할로겐 램프 등의 열원에 의해 성형 직전에 금형 표면만을 선택적으로 가열하고 형 표면 전사성과 성형 사이클과의 양립을 도모하는 성형 방법이기 때문이다.

이러한 마이크로 칩 성형용의 금형은 철 또는 철을 주성분으로 하는 강재, 알루미늄, 알루미늄을 주성분으로 하는 합금, 아연 합금, 베릴륨 구리 합금 등의, 일반적으로 합성 수지의 성형에 사용되는 금속을 포함한 금형을 바람직하게 사용할 수 있다.

금형 제작 방법의 한 예를 들면, 우선 금속, 플라스틱, 실리콘, 유리 등의 재료에서 절삭가공, 에칭가공, 자외선 경화 수지의 포토리소그래피 가공 등의 방법에 의해 목적하는 미세한 홈을 갖는 유기 중합체로 제조된 평판상 부재의 표면 형상을 갖는 모형(母型)을 하나 제조한다. 그리고, 이 모형에서 니켈 등의 전기 화학적 주조법에 의해 금형이 제작된다.

또한, 일본국 특허공개공보 평성6년 제283830호의 레지스트 패턴을 형성하는 방법을 이용하여 금형을 만드는 것도 가능하다. 금속 기판에 레지스트 패턴을 형성한 후, 레지스트가 없는 부분을 금속 도금으로 매립한다. 그리고, 레지스트를제거하여 기판 표면에 미세한 패턴을 실시한 금속판을 형성한다. 이 금속판을 금형으로 수지 및 소결 유리 등의 가공을 행하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 사용되는 유기 중합체로 제조된 마이크로 칩을 상술한 일본국 특허공개공보 평성6년 제283830호의 회로 기판을 제조하는 방법에 기초하여 제조하는 것도 가능하다.

또한, 유리 기판을 사용하여 마이크로 칩을 제조할 경우, 유리 기판상에 레지스트 패턴을 형성하고 샌드·블러스트법으로 유리 기판을 가공하는 방법을 들 수 있다. 이 방법에 의하면 날아다니는 입자 방향이 두꺼운 레지스트에 의해 수직 방향으로 정렬되기 때문에 통상의 얇은 레지스트에 비해 섬세한 가공이 가능하고, 고 어스펙트비의 홈을 만들 수 있다.

또한, 유리 및 수지 기판상에 감광성 레지스트를 도포하여 홈 이외의 부분을 노광한 후, 미경화 부분을 제거하고 홈 형상의 레지스트 패턴을 기판상에 형성하는 수법도 이용 가능하다.

또한, 레이저 등으로 양면을 관통하는 홈을 설치한 유리 평판을 별도의 2장의 유리 평판에서 끼우는 것에 따라 본 발명에서 사용되는 마이크로 칩을 제조하는 것이 가능하다.

또한, 유리 기판상에 레지스트 패턴을 형성한 후, 불화 수소 등에 의한 웹 에칭에 의해서 유리 기판상에 홈을 형성하는 방법도 이용할 수 있다.

또한, 홈을 갖는 평판상 부재를 포함하는 상기 마이크로 칩은 홈의 내면을 폴리에틸렌글리콜 등으로 단백질 흡착 방지 처리를 할 수도 있다. 또한, 후술할전기 침투류를 송액 수단으로 사용할 경우는 안정된 전기 침투류를 발생시키기 위한 표면 처리를 할 수도 있다.

본 발명에서 마이크로 칩은 2장의 평판상 부재로 구성되는 것이 바람직하다. 적어도 한쪽은 상기한 것과 같은 홈을 갖고 있고 상기 홈을 갖는 면을 내측으로 하여 다른쪽의 평판상 부재와 접합시킨다. 그리고, 초음파융착, 열융착, 고온용융접착제 및 UV 접착제 등의 접착제에 의한 접착, 점착제에 의한 점착, 직접 또는 얇은 탄성 시트를 통한 압접 등의 방법으로 일체화하여 만들 수 있다.

홈을 갖지 않는 평판상 부재 (이후는, 덮개 평판이라 칭함)의 재료는 상기 홈을 갖는 평판상 부재에 이용되는 재료 중에서 선택할 수 있다. 또한, 얇은 유리판 등도 사용할 수 있다. 2개의 평판상 부재의 재료는 동일하거나 상이한 재료일 수도 있다. 두께는 측정의 장해가 되지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 0.05 내지 수 mm 정도가 바람직하다. 어느 재료로 사용하던 간에 열렌즈 검출법에 의한 검출부에서는 여기광 및 프로브광의 흡수율이 상술한 바와 같이 5 ％ 이하, 보다 바람직하게는 1 ％ 이하인 것이 중요하다.

또한, 본 발명에 있어서 마이크로 칩의 구성은 가공 생산성이라는 점에서는 상기한 바와 같이 2매의 평판상 부재로 구조되는 것이 바람직하다. 그리고, 적어도 한쪽은 홈을 갖고 있고 상기 홈을 갖는 면을 내측으로 하여 다른쪽의 평판상 부재와 접합시킨 구조인 것이 바람직하다. 단, 관통 홈을 갖는 평판상 부재를 다른 평판상 부재 2매에 끼워 홈을 형성시킨 3매의 구성으로 하는 것도 가능하다.

상기 덮개 평판에는 저장기용의 관통구가 열려 있을 수도 있고 덮개 평판으로부터 돌출된 형태로 원통형의 저장기 (폐액 저장소를 포함함)가 장착되어 있을 수도 있다. 이 저장기의 크기는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 높이가 1 내지 수 mm, 직경이 1 내지 수 mm 정도가 바람직하다. 홈을 갖는 평판상 부재 및 덮개 평판이 수 mm 정도의 두께를 갖는 경우 상기 관통 구멍이 액체 저장소를 겸할 수 있다.

또한, 본 발명에서 유량이란 홈(모세관) 내부를 일정 시간 내에 이동하는 액체 체적을 의미한다.

또한, 상기 평판상 부재의 표면에 있는 액체가 흐르는 홈의 단면 형상은 사각 형태인 것이 바람직하지만 삼각형 등의 다른 다각형의 형상, 반원형, 반타원형 등, 다른 형상일 수 있다. 또한, 마이크로 칩이 여러 종류의 상이한 형상의 홈을 조합시켜 이루어지는 유로를 갖고 있을 수 있다. 단, 열렌즈 검출법에 의한 검출부에 관해서는 홈의 단면 형상은 직사각형인 것이 바람직하다. 또한, 홈의 상부면 (개방면)의 폭은 홈의 하부면 (바닥)의 폭과 동일하거나 더 넓을 수도 있다.

또한, 이 홈이 너무 지나치게 작으면 측정 시료 등에 혼입된 미립자가 혈구등에 의한 블로킹의 원인이 된다. 또한, 너무 지나치게 크면 두 액이 합류했을 때의 확산에 의한 혼합 효율이 저하된다. 그 때문에, 혈액 시료의 통과 부분은 폭이 20 내지 500 ㎛, 깊이가 20 내지 1000 ㎛ 인 것이 필요하다. 바람직하게는, 폭이 50 내지 300 ㎛, 깊이가 30 내지 200 ㎛ 이다.

헤모글로빈 측정 등으로 혈구를 용혈할 경우는 용혈한 후의 유로는 폭이 1내지 1000 ㎛, 깊이가 0.1 내지 1000 ㎛, 단면적이 1 내지 1,000,000 ㎛²인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 폭이 30 내지 1000 ㎛, 깊이가 20 내지 1000 ㎛, 단면적이 600 내지 1,000,000 ㎛²이고, 폭은 깊이와 동등 이상이다.

상기 평판상 부재의 홈의 치수 정밀도는 극미량 성분의 분석 및 정량 분석 등을 행하기 위해서는 우수한 것이 바람직하다. 즉, 홈의 치수 정밀도 (치수 전사 정밀도)는 조작 정밀도 및 개개의 분석 장치간의 재현성을 얻기 위해서 설계 치수에 대해 폭 및 깊이가 ±5 ％ 이내, 단면적이 ±7 ％ 이내인 것이 바람직하다. 또한, 고정밀도의 정량 분석을 행하기 위해서는 폭 및 깊이가 ±2 ％ 이내, 단면적이 ±4 ％ 이내의 치수 정밀도를 갖는 것이 보다 바람직하다.

(송액 방법에 관해서)

본 발명에서는 마이크로 칩 내부에서의 정량 반응을 마이크로 칩 내부 또는 외부에서 혈액 시료와 측정 시약을 계량조에 의해 각각 일정량 칭량하여 혼합함으로써 행할 수 있거나 측정 시약에 대한 혈액 시료의 유량비를 제어함으로써, 측정 시약과 혈액 시료를 일정 비율로 혼합하여 적어도 일정 시간 이상 연속적으로 반응시키는 방법에 의해 행할 수도 있다 (상술된 일본국 특허출원 평성10년 제181586호 명세서, "혼합 분석 장치 및 혼합 분석 방법").

송액 방법으로는 칩 외부의 펌프, 원심력 및 중력을 송액 수단으로 하는 방법을 사용할 수 있다.

또한, 홈(모세관) 내부의 액체에 전계를 인가하여 전기 영동 및 전기 침투류에 의해 송액을 행할 수도 있다 ("모세관 전기 영동", 고단사 등에 자세히 기재되어 있다).

전기 침투류는 모세관 내부 표면의 이온 이동에 의해 모세관 내부의 액체가 함께 이동하는 것이다. 모세관이 유리 및 실리콘으로 형성될 경우는 유리 표면의 규산의 프로톤 등이 이동력이 된다. 또한, PMMA 및 PC 등의 유기 중합체 등을 포함하는 마이크로 칩의 경우 모세관 내면에 특별한 이온 종류가 존재하지 않을 경우에도 모세관 내부를 흐르는 액체의 조성에 따라서 그 액체 중의 전해질을 모세관 내면에 흡착시켜, 그 전해질의 이동에 의해 전기 침투류가 발생될 수 있다. 안정된 전기 침투류를 발생시키기 위해 모세관 내부 표면에 술폰산기 및 카르복실산기를 갖는 유기 중합체를 그래프트 중합 등으로 부가할 수도 있다. 또한, 수산화나트륨 수용액 등에서 PMMA 등의 표면을 가수 분해하고 모세관 내부의 표면에 카르복실산기를 형성하는 것도 유효하다.

전기 침투류에서는 전압 제어에 의해 가늘고 즉응(卽應)적으로 또한, 설정된 프로그램에 따라서 정확한 유량을 제어할 수 있다. 따라서, 마이크로 칩 내부에서의 반응 및 분리를 높은 정밀도로 제어할 수 있기 때문에 바람직하다.

전기 침투류를 발생시키는 전원으로는 고전압 전원 장치 (예를 들면, Model HCZE-30PN0, 25, 마쯔사다 프래시죤, 30 kV까지 인가 가능)를 이용한다. 고전압 전원 장치는 인터페이스 보드 (예를 들면, DAQCard-1200, CB-50 커넥터 블럭, 내셔널 인스트루먼트)를 통해 외부의 컴퓨터로 출력 제어할 수 있다. 전압 인가 타이밍 등의 프로그램은 예를 들면 NI-DAQ 드라이브 소프트 웨어 (Lab VIEW) 등으로 제작할 수 있다.

중력을 구동력으로 송액을 행하는 것도 가능하고, 이 송액법에 대해서는 본출원인에 의해 출원되어 있다 (일본국 특허출원 평성11년 제352445호 명세서).

(마이크로 칩의 모세관(유로) 형태에 대해서)

측정 시약 및 혈액 시료의 혼합 및 희석을 주된 목적으로 한 마이크로 칩의 유로(모세관) 형상에는 1개의 유로에 다른 유로를 합류시킨 형상 및 1개의 유로에 복수개의 유로를 한 장소에서 합류시킨 형상을 이용할 수 있다. 1개의 유로에 다른 유로 또는 복수의 유로를 합류시켜 하나의 유로로 함으로써, 혼합 조작 및 희석 조작을 행할 수 있다. 또한, 이 때, 각각의 유량을 바꿈으로써 상이한 비율에서의 혼합 및 희석도 가능하다.

혼합 및 희석의 비율은 송액 방법이 펌프에 의한 경우에는 합류할 각 유로의 유량을 기계적으로 바꿈으로써 결정할 수 있다. 또한, 전기 침투류에 의한 경우에는 합류하는 각 유로의 단면 사이즈 및 길이를 바꾸거나, 각 유로에의 전압 제어 방법을 바꾸거나, 각 유로의 모세관 내부 표면의 하전 상태를 표면 처리 등에 의해 바꿈으로써 합류하는 각 유로의 유량을 조절할 수 있다.

또한, 원심력에 의한 송액에서는 중심으로부터의 거리, 회전수 등도 고려하여 유로 설계를 할 필요가 있다.

혈액 시료와 측정 시약을 반응시킨 후, 분리를 위해 일정량을 칭량하지 않고 혼합에서 반응, 측정까지 일관된 유로로 연속적인 처리가 가능하다.

이러한 유량비로 혼합 비율을 규정하는 방법은 반응을 장시간 연속적으로 행할 필요는 없다. 예를 들면, 혼합하는데 10 초가 걸리면 최저 10 초간 (통상은 약간 많게 20초 정도), 혈액 시료와 측정 시약의 합류를 행하여, 이 혈액 시료와 측정 시약의 혼합물을 반응에 충분한 시간동안 유로 내부를 이동시켜, 그 후에 다른 측정 시약과의 합류를 동일하게 최저 10 초간 행할 수 있다. 그 다음에 필요 시간, 유로 중을 흐르게 반응시키고 나서 측정을 행한다.

또한, 마이크로 칩 중에 계량조 (메스 실린더)를 설치하여, 이 계량조로 혈액 시료 및 측정 시약을 계량하여 그것을 혼합하여 열렌즈 검출 장치에 제공할 수도 있다.

본 발명에서 혈액 시료와 측정 시약과의 반응은 혼합을 위한 반응의 완결을 위해 2 내지 10분 정도의 시간이 바람직하다.

(실험예 1: 혈액 시료와 측정 시약과의 혼합비 및 산화제 농도에 대한 검토)

열렌즈 검출법의 필요 조건으로 파장 633 nm의 여기광의 흡광도에 대한 측정 시약의 혼합비의 영향을 검토하였다. 측정 시약 (용혈 산화 시약액)으로는 페리시안화칼륨(K₃Fe(CN)₆), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(이후는 MES라고 칭함), 트리톤 X-100을 각각 0.61 mM, 10 mM, 0.8 중량％의 농도로 용해시킨 용액 (pH 6.0)을 이용하였다.

혈액 시료는 건강인에게서 헤파린 채혈된 것을 이용하였다. 혈액 시료와 상기 측정 시약과의 혼합비가 1:250인 경우에는 혈액 시료 4 ㎕에 대해 상기 측정 시약을 996 ㎕, 혼합비 1:415에서는 PBS(인산 완충액)에서 60 ％로 희석한 혈액 시료4 ㎕에 대해 상기 측정 시약을 996 ㎕, 혼합비 1:1245에서는 PBS에서 20 ％로 희석된 혈액 시료 4 ㎕에 대해 상기 측정 시약을 996 ㎕ 첨가하였다.

첨가 직후에 경시적인 흡광도 변화를 도 1 (혼합비 1:250), 도 2 (혼합비 1:415), 도 3 (혼합비 1:1245)에 나타낸다. 첨가 직후에 비교하여 1200초 (20 분) 후의 흡광도의 저하는 혼합비 1:250에서 8.5 ％, 혼합비 1:415에서 16.3 ％, 혼합비 1:1245에서 31 ％였다.

혼합비를 1:4로 한 경우는 상기 측정 시약 800 ㎕와 혈액 시료 200 ㎕를 혼합하여 실온하에서 5 분간 방치해도 도 4에 나타낸 바와 같이 메트헤모글로빈의 산화가 불충분했다.

그래서, 측정 시약 중의 산화제의 농도를 올려 페리시안화칼륨, MES, 트리톤 X-100의 농도를 각각 10 mM, 12.5 mM, 1 중량％로 하였다 (pH 6.0).

혈액 시료 200 ㎕와 이 산화제의 농도를 높인 측정 시약 800 ㎕를 혼합하여 5 분 후의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 헤모글로빈의 산화가 진행되고 있었다. 이 조건에서 혼합 후부터 30초 후, 10분 후, 20분 후의 흡수 스펙트럼을 도 6에 나타낸다. 이 경우, 혼합 직후에 비교된 1200초 (20분) 후의 흡광도의 저하는 2.9 ％로 안정적이었다.

(실험예 2: pH치의 영향에 대한 검토)

페리시안화칼륨, 트리톤 X-100을 각각 0.61 mM, 0.8 중량％의 농도로 용해시킨 용액을 측정 시약으로 사용하여, pH치의 검토를 행하였다. pH치는 이하에 나타낸 pH치 제조용 시약을 사용하여 제조하였다. pH 2 및 pH 4는 10 mM 시트르산 버퍼를 NaOH로 제조한 것, pH 6은 10 mM의 MES 버퍼, pH 8은 10 mM의 TRIZMA (시그마사 제조) 버퍼, pH l0은 약 1 mM인 NaOH 용액, pH 12는 약 10 mM의 NaOH 용액을 사용하여 각각 제조하였다.

633 nm에서 흡광도를 도 7에 나타내었다. 메트헤모글로빈의 흡수 (630 nm)는 pH 2, 6, 10에서는 피크를 나타내지만 pH 4, 8, 12에서는 숄더가 되어 피크를 나타내지 않았다. 700 nm 에서의 백그라운드 흡광도는 pH 2에서 0.34, pH 4에서 0.05, pH 6에서 0.02, pH 8에서 0.00, pH 10에서 0.00, pH 12에서 0.00이었다.

이렇게 하여, 본 발명 물질 측정 방법에 의하면 미량의 검체, 특히 혈액이나 뇨 등의 생체 유래의 검체에서 헤모글로빈 등의 물질의 농도 측정이 가능하다. 또한, 여기광으로 장파장의 레이저를 이용할 수 있기 때문에 열렌즈 검출 장치가 염가로 제조될 수 있고 경제적이다. 따라서, 본 발명 물질 측정 방법 및 상기 측정 방법에 사용되는 측정 시약은 POC 분석 등에 바람직한 측정 방법 및 측정 시약이다.

또한, 본 발명의 헤모글로빈 측정 방법은 독물인 시안화칼륨 등의 시아니드를 측정 시약 중에 함유하지 않기 때문에 복잡한 폐액 처리가 불필요하다.

본 발명은 미량 검체 중의 물질을 간편하게 측정하는 방법 및 이 측정 방법에 사용되는 측정 시약에 관한 것이다.

도 1은 실험예 1에서 혈액 시료와 측정 시약과의 혼합비가 1:250인 경우의 635 nm (상부 곡선)과 780 nm (하부 곡선)에서 측정 시료의 흡광도의 경시 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 실험예 1에서 혈액 시료와 측정 시약과의 혼합비가 1:415인 경우의635 nm(상부 곡선)과 780 nm (하부 곡선)에서 측정 시료의 흡광도의 경시 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 실험예 1에서 혈액 시료와 측정 시약과의 혼합비가 1:1245인 경우의 635 nm (상부 곡선)과 780 nm (하부 곡선)에서 측정 시료의 흡광도의 경시 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 실험예 1에서 혈액 시료와 측정 시약을 1:4로 혼합하여 5 분간 반응시킨 후의 측정 시료의 흡수 스펙트럼이다 (측정 시약 중의 산화제 농도는 도 1 내지 도 3의 경우와 동일).

도 5는 실험예 1에서 혈액 시료와 측정 시약을 1:4로 혼합하여 5 분간 반응시킨 후의 측정 시료의 흡수 스펙트럼이다 (측정 시약 중의 산화제 농도를 도 4의 경우보다 올린 경우).

도 6은 실험예 1에서 혈액 시료와 측정 시약을 1:4로 혼합한 후의 측정 시료의 흡수 스펙트럼의 경시 변화이다 (측정 시약 중의 산화제 농도는 도 5와 동일). (a)는 혼합 후 30초 후, (b)는 10 분 후, (c)는 20 분 후를 나타낸다.

도 7은 실험예 2에서 pH 2, 4, 6, 8, 10, 12의 각 조건하에서 측정 시료의 흡수 스펙트럼이다.

도 8에서 (a)는 실험예 3에서 헤모글로빈 농도와 열렌즈 검출법에 의한 출력 관계를 나타낸 그래프이다. (b)는 (a)의 횡축 헤모글로빈 농도의 저농도 부분을 확대시킨 그래프이다. 또한, 횡축 상단의 g/㎗ 단위의 숫자는 혈액 시료 중의 헤모글로빈 농도를 나타내고 횡축 하단의 ㎍/㎖ 단위의 숫자는 측정 시료 중의 헤모글로빈 농도를 나타낸다.

도 9는 유기 중합체로 제조된 마이크로 칩의 유로 형상을 나타낸 도면이다.

도 10은 유리로 제조된 큐베트 중에서 광열 변환 검출법에 의한 ALP 활성의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 11은 비교예 1에서 광열 변환 검출법에 의한 ALP 활성의 측정 결과를 나타낸 측정 차트이다.

도 12는 흡광도법에 의한 ALP 활성의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 13은 실시예 5에서의 송액계의 구성을 나타낸 개략도이다.

도 14는 도 13 중의 페리스타 펌프의 구성을 설명하는 개략도이다.

도 15는 수지로 제조된 마이크로 칩 중에서 광열 변환 검출법에 의한 ALP 활성의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 16은 BCI2의 입도 분포의 측정 결과를 나타낸 도면이다.

도 17은 광열 변환 검출법에 의한 LDH 활성의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 18은 광열 변환 검출법에 의한 총 단백질 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 19는 광열 변환 검출법에 의한 요소 질소 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 20은 광열 변환 검출법에 의한 총 빌리루빈 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 21은 광열 변환 검출법에 의한 γ-GTP 활성의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 22는 광열 변환 검출법에 의한 알부민 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 23은 광열 변환 검출법에 의한 AST 활성의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 24는 광열 변환 검출법에 의한 요산 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 25는 광열 변환 검출법에 의한 글루코스 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 26은 광열 변환 검출법에 의한 총 콜레스테롤 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 27은 광열 변환 검출법에 의한 HDL-콜레스테롤 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 28은 광열 변환 검출법에 의한 HDL-콜레스테롤 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 29는 광열 변환 검출법에 의한 중성 지방 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 30은 광열 변환 검출법에 의한 크레아티닌 농도의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 31은 유미화를 나타내는 검체 중의 총 콜레스테롤 농도의 광열 변환 검출법에 의한 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 32는 유미화를 나타내는 검체 중의 총 콜레스테롤 농도의 흡광도법에 의한 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

<발명을 실시하기 위한 최량의 형태>

<실시예 1>

He-Ne 레이저를 여기광으로 사용한 열렌즈 검출법에 의한 헤모글로빈의 측정에서 혈액 시료의 희석 정도와 열렌즈 검출법에 의한 출력과의 직선성에 대해서 검토를 행하였다. 이하에, 그 내용을 설명한다.

광열 변환 검출 장치의 구성은 이하와 같다. 현미경에는 스테이지 상에서 측정 시료의 취급의 용이함을 감안하여, 도립형(到立型) 현미경(IX70, Olympus 제조)를 사용하였다. 이것은 낙사형(落射型)의 현미경이어도 상관없다. 이 현미경은 현미경 외부의 광학계에 의해 동축으로 된 레이저광을 도입할 수 있도록 개조되어 있다.

레이저는 여기용에는 He-Ne 레이저 (633 nm, 10 mW, 에드몬트사이엔티픽 제조)를 검출용 (프로브광)에는 반도체 레이저 (780 nm, 일본 과학 엔지니어링사 LDT 7830)를 사용하였다. 미러, 빔 익스팬더 등의 광학계는 메스글리오사 제품으로 통일하였다.

여기용 레이저광은 라이트 초퍼에 의해 변조된 후, 다이클로익 미러에 의해 검출용 레이저와 동축으로 되어 현미경에 유도된 측정 시료에 조사된다. 측정 시료를 조사한 후, 동축으로 된 레이저광의 내부, 여기광만을 선택적으로 필터에 의해 제거하여 포토 센서로 유도한다. 레이저광 수광 부분의 소자에는 취급의 간편성을 고려하여 파이버 부착 포토 센서 엠프 (C6386, 하마마쯔 포토닉스사 제조)를 사용하였다. 이 포토 센서 수광부는 핀홀을 갖는 커버로 덮어져 있다. 포토 센서 및 센서 증폭기에서의 출력은 저잡음 프리 엠프(LI-75 A, 엔에프 회로 블럭사 제조)로 증폭된 후 록인앰프에 유도되어 신호 처리된다.

이러한 열렌즈 검출 장치를 이용하여 혈액 시료의 희석 정도와 헤모글로빈의 정량성과의 관계를 이하와 같이 검토하였다.

헤파린을 첨가한 건강인의 혈액 (헤모글로빈 농도는 16 g/㎗)을 혈액 시료로 이용하였다. 측정 시약에는 페리시안화칼륨, MES, 트리톤 X-100을 각각 8 mM, 10 mM, 0.8 중량％의 농도로 용해시킨 용액(pH 6.0)을 이용하였다.

측정 시료 중의 헤모글로빈(Hb) 농도가 6400 ㎍/㎖인 경우는 혈액 시료 40 ㎕에 상기 측정 시약을 960 ㎕ 첨가 (혼합비는 1:24), 혼합하여 실온에서 5 분 이상 정치한 후에, 열렌즈 검출법에 의해 측정하였다. 측정 시료 중의 Hb 농도가 640 ㎍/㎖인 경우는 혈액 시료 4 ㎕에 측정 시약 996 ㎕을 첨가 혼합하여, 측정 시료 중의 Hb 농도가 384 ㎍/㎖인 경우는 PBS에서 60 ％로 희석한 혈액 시료 4 ㎕에 측정 시약 996 ㎕을 첨가 혼합하여 측정 시료 중의 Hb 농도가 128 ㎍/㎖인 경우는 PBS에서 20 ％로 희석한 혈액 시료 4 ㎕에 측정 시약 996 ㎕을 첨가 혼합하였다.

이렇게 해서 얻어진 각 측정 시료를 50 ㎛의 깊이, 수 mm의 폭의 홈을 갖는 평판 유리로 제조된 큐베트 (GL Sciences사 제조 Quartz Cell Type AB20-SQ-0.05)로 옮겨, 이 큐베트를 도립 현미경의 스테이지 상에 설치하였다. 이 큐베트는 복잡한 홈 패턴을 갖는 마이크로 칩의 모델판으로 폭이 넓지만 홈 깊이는 마이크로 칩과 동일한 정도인 것을 이용하였다. 열렌즈 검출법에서 홈의 폭은 수십 ㎛ 이상이면 그것보다 넓어도 큰 지장은 없다 (단, 홈 내부에서의 확산 혼합 등에는 영향이 있음). 홈 깊이는 수지로 제조된 마이크로 칩 등에서 금형 모형 제작이라는 점에 제한이 있고, 열렌즈 검출법의 감도에도 큰 영향이 있다. 따라서, 본 실시예에서 이용한 평판 유리로 제조된 큐베트와 후술할 수지로 제조된 마이크로 칩과는 거의 동일한 정도의 홈 깊이로 하였다.

대물 렌즈의 촛점 맞춤에는 여기용 레이저를 사용하였다. 즉, 모니터 화면을 참조하면서 유리로 제조된 큐베트의 홈의 모서리변의 위치에서 촛점 맞춤을 실시하였다. 그리고, 그 후, 홈의 거의 중앙부에서 열렌즈 검출을 행하였다.

여기용 레이저는 라이트 초퍼에 의해 3289 Hz로 변조되어, 메트헤모글로빈을 여기하여 발열을 발생시켰다. 이 라이트 초퍼에 의한 변조 주파수는 S/N 비 등의 영향에 의한 변경도 있을 수 있다. 이 발열에 의해 발생한 열렌즈에 의해 검출용 레이저의 촛점 위치가 틀어짐으로써 핀홀을 통한 포토 센서의 수광량이 발열량에 따라 변화된다. 포토 센서로부터의 신호는 록인앰프에 의해 처리되지만 여기에서는 시정수로 1초를 사용하여 라이트 초퍼와 동일 주파수 3289 Hz의 신호만을 선택적으로 출력하여 사용하였다.

이 결과를 도 8에 나타낸다. 종축은 열렌즈 검출법에 의한 출력 강도(mV), 횡축 상단은 혈액 시료 중의 헤모글로빈 농도, 횡축 하단은 측정 시약을 혼합한 후의 측정 시료 중의 헤모글로빈 농도이다.

<실시예 2>

유기 중합체로 제조된 마이크로 칩을 이용하여 여기광으로 635 nm의 반도체 레이저를 이용하여 혈액 시료 중의 헤모글로빈의 측정을 행하였다. 이하에 그 내용을 설명한다.

마이크로 칩을 구성하는 표면에 홈을 갖는 평판상 부재는 사출 성형에 의해 성형하였다. 사출 성형에 사용된 수지는 메타크릴 수지 (아사히 가세이 고교 제조 델페트 80 NH)이다. 가스로는 순도 99 ％ 이상의 이산화탄소를 사용하여 그 압력은 1 MPa로 하였다. 성형기는 스미또모 쥬기까이 고교 제조 SG50을 사용하였다. 성형품은 두께 2 mm, 종횡이 120 mm, 60 mm의 평판상 부재이다.

이 평판상 부재의 표면에는 폭 100 ㎛, 깊이 50 ㎛, 길이 3 cm의 직선형 홈이 설치되어 있다. 그리고 그 홈의 양끝에는 측정 시료를 도출입시키는 관통 구멍을 설치하기 위한 원형 홈 (직경 3 mm, 깊이 50 ㎛)이 형성되어 있다. 그 원형 홈에 드릴 등에 의해 직경 2 mm의 관통 구멍을 뚫고 측정 시료의 도출입부로 하였다.

또한, 금형의 모형은 실리콘을 RIE의 수법으로 에칭한 것 및 DFR(드라이 필름 레지스트)로 광경화시킨 것을 사용할 수 있다. 모형을 전기 주조하여 스탬퍼를 제조한 후, 평판상 부재를 사출 성형하여, 이들을 비교한 바 어느 모형에서나 거의 동일한 성형품이 얻어졌다.

또한, 금형 표면 상태의 전사성은 광학 현미경에 의한 관찰 및 레이저 현미경에 의한 형상 측정으로 평가한다. 또한, 성형품도 광학 현미경에 의한 관찰, 절단 단면의 홈형상 광학 현미경 및 전자 현미경에서의 관찰, 레이저 현미경에 의한 형상 측정 등으로 관찰한다.

이렇게 해서 얻어진 평판상 부재의 홈을 갖는 면에 200 ㎛ 두께의 메타크릴수지 시트에 광경화형 접착제를 도포한 것을 접합시켰다. 그리고, UV 광을 조사하여 양끝만이 개방된 모세관을 형성시켜 이것을 측정용 마이크로 칩으로 하였다.

광열 변환 검출 장치로는 기본적으로 실시예 1에 기재된 장치를 이용하였다. 단, 여기광용 레이저를 633 nm의 He-Ne 가스 레이저로부터 635 nm의 발광을 갖는 반도체 레이저 (산요 덴끼사 제조 DL-4038-025)로 바꾸어 그에 따라 광학계를 제조하였다.

측정 시료로는 헤파린을 첨가한 건강인 혈액 (헤모글로빈 농도는 16 g/㎗)을, 측정 시약 (페리시안화 칼륨, MES, 트리톤 X-100을 각각 8 mM, 10 mM, 0.8 중량％의 농도로 용해시킨 용액 (pH 6.0)과 혼합 반응시킨 것을 이용하였다.

즉, 측정 시료 중의 헤모글로빈 농도가 6400 ㎍/㎖인 경우는 상기 혈액 시료 40 ㎕에 상기 측정 시약을 960 ㎕ 첨가 혼합하여, 측정 시료 중의 헤모글로빈 농도가 640 ㎍/㎖인 경우는 혈액 시료 4 ㎕에 PBS 36 ㎕을 첨가한 것에 측정 시약액 996 ㎕을 첨가 혼합하여 각각 실온에서 5분 이상 정치한 것을 사용하였다.

이들 측정 시료 2 ㎕ (이것에 포함되어 있는 검체 혈액량은 40 nℓ 및 4 nℓ)을 상술된 바와 같이 작성된 마이크로 칩의 관통 구멍에서 모세관에 도입하여 열렌즈 검출법에 의한 출력을 측정하였다. 그 결과, 헤모글로빈 농도 640 ㎍/㎖에서는 0.5 mV, 6400 ㎍/㎖에서는 5 mV 정도의 출력이 검출되었다.

<실시예 3>

다음으로 혈액 시료와 측정 시약을 혼합 반응시키는 측정 시료의 조제와 열렌즈 검출법에 의한 측정 시료의 헤모글로빈 측정을 유기 중합체로 제조된 마이크로 칩 중에서 행한 예에 대해서 그 내용을 설명한다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 2와 동일한 것을 이용하였다.

또한, 마이크로 칩에 대해서도 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였다. 우선, 도 9와 같은 표면에 홈을 갖는 PMMA 제조의 평판상 부재 (31)을 사출 성형에 의해 성형하였다. 상기 평판상 부재 (31)의 외형 치수는 실시예 2와 동일하다. 그리고, 이 평판상 부재 (31)의 원형 홈 (1, 2) 부분에 드릴로 직경 1 mm의 관통 구멍을 뚫어 혈액 시료 및 측정 시약의 도입부로 하였다. 또한, 마찬가지로 원형홈 (3) 부분에 관통 구멍을 뚫어 폐액의 도출부로 하였다.

이렇게 하여 얻어진 관통 구멍을 갖는 평판상 부재 (31)의 홈을 갖는 면에 두께 200 ㎛의 메타크릴 수지 시트에 광경화형 접착제를 도포한 것을 접합시켰다. 그리고, UV 광을 조사하여 홈 단부만이 개방된 모세관을 형성시켜 이것을 측정용 마이크로 칩으로 하였다.

도 9는 형성된 모세관의 유로 형상을 나타낸 것이다. 유로 단부에는 혈액시료용 저장기 (1), 측정 시약용 저장기 (2) 및 폐액 저장소 (3)이 설치되어 두 저장기 (1, 2) 및 폐액 저장소 (3)의 관통 구멍 부분을 제외한 크기는 직경 3 mm, 깊이 50 ㎛ 이다.

모세관 (유로)은 모두 깊이 50 ㎛, 폭 150 ㎛이고, 길이는 유로 (11)이 9mm, 유로 (12)가 9 mm, 유로 (13)이 65 mm 이다. 유로 (13)에는 광열 변환 검출법 (열렌즈 검출법)에 의한 검출부 (21)이 설치되어 있고 유로 (11)과 유로 (12)와의 합류점 (22)에서 검출부 (21)까지의 거리는 60 mm이다.

측정 시약으로는 페리시안화 칼륨, MES, 트리톤 X-100을 각각 8 mM, 10 mM, 0.8 중량％의 농도로 용해시킨 용액 (pH 6.0)을 이용하였다. 혈액 시료로는 헤파린을 첨가한 건강인 혈액 (헤모글로빈 농도는 16 g/㎗), 및 그것을 PBS로 희석하여 헤모글로빈 농도를 10 g/㎗로 조정한 것을 사용하였다.

25 ㎕의 마이크로시린지(해밀턴사 제조)에 혈액 시료를 4 ㎕ 채취하여 상기 마이크로시린지를 테플론 튜브에 의해 혈액 시료용 저장기 (1)의 관통 구멍에 연결하였다. 또한, 별도의 마이크로시린지에 측정 시약을 20 ㎕ 채취하여, 상기 마이크로시린지를 별도의 테플론 튜브에 의해, 측정 시약용 저장기 (2)의 관통 구멍에 연결하였다.

두 마이크로시린지를 2대의 마이크로시린지 펌프 (하버드사 제조)에 각각 장착하고, 혈액 시료의 유속이 0.2 ㎕/hr, 측정 시약의 유속이 4.8 ㎕/hr이 되도록 각 마이크로시린지 펌프를 설정하였다. 이것으로 혈액 시료와 측정 시약과의 혼합비는 1:24가 된다. 혼합 후의 반응 시간은 도 9의 유로 (13)을 흐르는 시간이기때문에 5.4 분 정도가 된다.

실온하에서 상기 두 마이크로시린지 펌프를 구동시켜, 열렌즈 검출법에 의한 출력을 측정하였다. 그 결과, 헤모글로빈 농도 16 g/㎗의 혈액 시료로 4.0 mV 정도의 출력을 얻을 수 있고, 헤모글로빈 농도 10 g/㎗로 제조한 희석 혈액 시료에서는 2.5 mV 정도의 출력을 얻을 수 있었다.

<참고예 1>

프로브광의 광원으로서 488 nm에 발광을 갖는 Ar 레이저를 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 헤모글로빈의 측정을 행하였다.

혈액 시료로는 헤파린을 첨가한 건강인 2명의 혈액 (헤모글로빈 농도는 16 g/㎗)을 검체 1 및 검체 2로 사용하였다. 이들 혈액 시료를 PBS로 희석하여 60 ％, 20 ％가 되도록 희석하여 0.6 ×검체, 0.2 ×검체로 하였다. 이 희석 검체 또는 희석하지 않는 혈액 시료 (1×검체) 4 ㎕에, 측정 시약 (페리시안화칼륨, MES, 트리톤 X-100을 각각 0.61 mM, 10 mM, 0.8 중량％의 농도로 용해시킨 용액 (pH 6.0))을 996 ㎕ 첨가, 혼합하여 실온에서 5분 이상 정치한 후에 열렌즈 검출법에 의한 측정을 행하였다.

그 결과를 표 1에 나타낸다. 또한, 표 1에서의 수치는 백그라운드를 뺀 후의 열렌즈 검출법에 의한 출력이다.

이 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 전체적으로 열렌즈 검출법에 의한 출력이 안정되지 않고, 특히 희석 검체에서 이상하게 높은 수치를 나타내었다. 이러한 현상은 상술된 각 실시예에서는 나타나지 않았다.

이러한 현상이 발생하는 원인 중 하나는 633 nm의 여기광과 488 nm의 프로브광이 동시에 조사됨으로써, 헤모글로빈의 여러가지 여기 상태가 야기되고 엑사이프렉스와 같은 광반응이 발생되거나 또는 혈액 중의 다른 성분이 488 nm의 광을 흡수하여 헤모글로빈과 상호 작용된 것을 생각할 수 있다. 그러나, 분명하지는 않다.

	검체 1	검체 2
20 ％ 희석	200 내지 300 mV	3 mV에서 10 분 후에는 250 mV까지 증가
60 ％ 희석	2 내지 6 mV	3 내지 6 mV 점증
희석하지 않음	6 mV 불안정	3.1 mV에서 안정

<실시예 4>

본 발명의 한 실시예로 광열 변환 검출법에 의해 혈청 중의 ALP 활성의 정량측정을 행한 결과를 나타낸다.

(광열 변환 검출계의 구성)

광열 변환 검출계 (광열 변환 검출 장치)에서는 실시예 1과 동일 기본 구성인 것을 이용하였다. 헤모글로빈 이외의 물질 측정에서 상기 광열 변환 검출계에 의한 측정의 일반적인 순서는 이하와 같다.

홈 패턴을 갖는 평판 마이크로 칩 (또는, 측정 시료를 넣은 유리로 제조된 셀. 상기 유리로 제조된 셀의 깊이는 50, 100, 200, 500 ㎛)을 도립 현미경의 스테이지 상에 얹어 둔다. 대물 렌즈의 촛점 맞춤에는 여기용 레이저를 사용하여 모니터 화면을 참조하면서 홈 패턴의 상부변 및 하부변의 위치에서 촛점 맞춤을 실시한 후, 그 중간점을 홈의 중심 위치로 하였다.

촛점 맞춤 후, 상술된 바와 같은 검체와 측정 시약과의 반응을 행하여 반응 생성물을 포함하는 용액을 검출 부분으로 유도한다. 여기용 레이저는 라이트 초퍼에 의해 1170 Hz로 변조되어, 홈 내부의 반응 생성물을 여기시켜 발열이 발생된다. 이 라이트 초퍼에 의한 변조의 주파수는 S/N비 등의 영향에 의해 변경될 수 있다.

이 발열에 의해 발생된 열렌즈에 의해 검출용 레이저의 촛점 위치가 틀어져,그것에 따라 핀 홀을 통한 포토 센서의 수광량이 발열량에 따라 변화한다. 측정 중에서 측정 시료는 유동이 정지된 상태 또는 유동 상태라도 상관없지만 본 실시예에서는 정지된 상태에서 측정 하였다. 포토 센서에서의 신호는 록인앰프에 의해 처리되지만 여기에서는 시정수로서 1초를 사용하여 라이트 초퍼와 동일 주파수 1170 Hz의 신호만을 선택적으로 출력하여 이용하였다. 록인앰프의 출력 전압은 여기광에 의해 여기되는 반응 생성물의 농도에 비례하기 때문에, 반응 생성물의 정량화가 가능하다.

(측정 시약의 조제)

JSCC 상용 기준법에 따라 상술된 바와 동일하게 완충액 1을 제작하였다. 그리고, 혈액 시료와 반응시키기 직전에 기질로 BCIP (와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)를 최종 농도로 30, 15 및 7 mM이 되도록 완충액 1에 용해하여, ALP 측정 시약 (측정 시약)을 제조하였다.

(검체: 표준 혈청의 조제)

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사) 2500 ㎕로 용해하여 ALP 활성이 계산치로 302 IU/ℓ가 되도록 조제하여 스톡 용액으로 하였다. 다음으로 스톡 용액을 정제수로 희석하여, 계산치로 101 IU/ℓ 및 51 IU/ℓ인 ALP 활성을 포함하는 용액을 조제하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

(ALP 활성의 검출)

ALP 측정 시약 1000 ㎕와 검체 25 ㎕를 시험관 중에서 충분하게 혼합하여 37 ℃에서 정확하게 2분 30초간 보온한다. 그 후, 상기 혼합 용액 (측정 시료)을 50 ㎛의 깊이를 갖는 평판 유리로 제조된 큐베트 (GL Sciences 사 제조 Quartz Cell Type AB20-SQ-0.05)에 옮기고 이 큐베트를 37 ℃의 공기 항온 장치가 부착된 도립 현미경의 스테이지 상에 설치한다. 대물 렌즈의 촛점 맞춤은 록인앰프의 출력치를 보면서 최고치를 나타내는 위치를 지표에 행한다.

측정 개시에서 약 15 분간의 열렌즈 검출법에 의한 출력을 상술한 소프트웨어 Lab VIEW에 의해 처리하였다. 즉, 얻어진 곡선을 직선 회귀시켜 회귀된 직선의 기울기를 1초당 발생된 반응량으로 수치화하였다. 그 사이 큐베트는 현미경의 스테이지 상에서 37 ℃에서 공기 항온되어 있다. 상기 측정에서 얻어진 결과를 도 10에 나타낸다.

<비교예 1>

본 발명의 한 비교예로서 불용성 기질 (BCI)의 침전이 발생됨으로써 열렌즈 검출법에 의한 측정이 곤란한 예를 나타낸다.

(광열 변환 검출계의 구성)

실시예 4와 동일한 구성이다.

(측정 시약의 제조)

실시예 4와 동일하게 제조하였다. 단, BCIP 농도는 70 mM으로 하였다.

(검체의 제조)

실시예 4와 동일하게 제조하였다. 단, ALP 활성은 800 IU/ℓ으로 하였다.

(ALP 활성의 검출)

실시예 4와 동일하게 행하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, BCIP 농도가 70 mM인 ALP 측정 시약에서는 안정된 열렌즈 검출법에 의한 출력이 얻어지지 않고 반응이 발생된 양을 측정할 수 없었다. 이에 대하여, BCIP 농도가 15 mM의 ALP 측정 시약에서는 경시적으로 안정된 기울기의 열렌즈 검출법에 의한 출력을 얻을 수 있었다.

또한, BCIP 농도가 70 mM인 ALP 측정 시약을 4 ℃에서 여러 시간 보냉한 결과, BCIP의 재결정이 인정되었다. 이 현상은 BCIP 농도가 35 mM의 ALP 측정 시약에서도 인정되었지만 BCIP 농도가 15 mM 이하인 ALP 측정 시약에서는 인정되지 않았다.

여기에서 열렌즈 검출법에 의한 출력이 안정되지 않았던 원인은 유색의 미세결정이 생성되어 이 미세결정 (미세 입자)에 의해 산란이 발생됐기 때문이라고 생각되었다.

<비교예 2>

본 발명의 한 비교예로서 불용성 기질 (BCI)의 미세결정이 발생된 경우에도 흡광도 측정은 가능한 예를 나타낸다. ALP 측정 시약 및 검체는 실시예 4와 동일하게 조제한 것을 이용하였다. 흡광도계는 시마즈사 UV 2200을 이용하였다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 BCIP 농도가 70 mM인 ALP 측정 시약을 이용한 경우에도 검량선이 얻어졌다.

<실시예 5>

모세관 (홈)을 구비한 수지로 제조된 마이크로 칩을 이용하여 ALP 측정 시약 및 검체의 유량을 제어하면서 ALP 활성의 정량을 행하였다. 송액 및 유량의 제어는 각 액체 저장소에 배관으로 연결된 마이크로시린지를 직렬로 연결한 한대의 시린지 펌프와 시린지 펌프를 개량시킨 미량 페리스타 펌프를 이용하여 구동함으로써 기계적으로 행하였다. 이하에 상세하게 설명한다.

(마이크로 칩의 제작)

마이크로 칩은 실시예 3과 거의 동일하게 제작하였다. 성형된 평판상 부재 (31)의 치수는 세로 120 mm, 가로 80 mm, 두께 5 mm으로 도 9와 동일한 패턴의 홈이 형성되어 있다.

액체 저장소 (1) 내지 (3)의 부분에는 직경 1.5 mm의 관통 구멍이 드릴 등에 의해 설치된다. 액체 저장소 (1)은 검체용, 액체 저장소 (2)는 측정 시약용, 액체저장소 (3)은 폐액용이다. 또한, 측정 시약을 2종 사용하여 측정할 경우는 홈 (13)의 합류점 (22)와 검출부 (21) 사이의 적당한 위치에 액체 저장소 (4)를 설치한 패턴을 갖는 마이크로 칩을 이용한다.

홈의 깊이는 전부 50 ㎛, 홈의 폭 및 길이는 홈 (11)은 폭 50 ㎛ 및 길이 5 mm, 홈 (12)는 폭 50 ㎛ 및 길이 5 mm, 홈 (13)은 폭 100 ㎛ 및 길이 9 mm이다. 이 평판상 부재 (31)의 홈을 갖는 면에 300 ㎛ 두께의 메타크릴 수지 시트를 메트아크릴레이트 단량체로 용해시킨 아크릴계 광경화성 접착제에 의해 접합시켰다.

그리고, 일회용 주사 바늘을 그 시작에서 3 mm 정도의 위치에서 절단하여 선단 부분을 제거함으로써 원추형의 외부 부착 액체 저장소를 제작하였다.

이 외부 부착 액체 저장소의 크기는 내부 직경 4 mm, 높이 10 mm이었다. 3개의 외부 부착 액체 저장소를 액체 저장소 (1) 내지 (3)에 각각 연통되도록 평판상 부재 (31)에 접착하여 마이크로 칩을 완성하였다.

(송액계의 구성)

마이크로시린지 (41), 시린지 펌프 (40) 및 시린지 펌프를 개량한 페리스타 펌프 (50)으로 구성되는 송액계를 도 13에 나타낸다. 또한, 페리스타 펌프 (50)의 구성을 설명하는 개략도를 도 14에 나타낸다.

시린지 펌프 (40) (하버드사 제조)에 부착된 마이크로시린지 (41, 41)(해밀턴사 제조, 용량은 500 ㎕)의 선단과, 페리스타 펌프 (50)에 부착된 페리스타 튜브 (51, 51) (내부 직경 250 ㎛)의 한쪽 단부가 에틸렌비닐아세테이트 튜브 (42, 42) (내부 직경 350 ㎛)에 의해 연결되어 있다. 그리고, 페리스타 튜브 (51, 51)의 나머지 단부가 마이크로 칩 (60)의 액체 저장소 (1, 2)에 연통된 2개의 외부 부착 액체 저장소 (61, 61)이 SUS로 제조된 튜브 (52, 52)에 의해 연결되어 있다.

페리스타 펌프 (50)에서는 튜브 스토퍼 (55)에 의해 페리스타 펌프 (50)에 고정된 페리스타 튜브 (51)이 롤러 (53)과 알루미늄 평판 (54)와의 사이에 끼워져 있다. 그리고, 롤러 (53)이 페리스타 튜브 (51)의 길이 방향으로 이동함으로써, 페리스타 튜브 (51) 내부의 액체가 중합체 칩 (60)의 방향으로 압출되게 되어 있다.

이러한 구성에 의해 ALP 측정 시약 및 검체가 유량을 제어하여 마이크로시린지 (41)에서 마이크로 칩 (60)에 송액되도록 되어 있다.

(광열 변환 검출계의 구성)

광열 변환 검출계 (광열 변환 검출 장치)에서는 실시예 1과 동일한 기본 구성인 것을 이용하였다. 단, 여기광용 레이저를 파장 633 nm의 He-Ne 가스 레이저로부터 635 nm의 발광을 갖는 반도체 레이저 (산요 덴끼사 제조 DL-4038-025)로 변경하였다. 그리고, 그 변경에 따라 광학계를 제조하였다.

(측정 시약의 제조)

실시예 4와 동일하게 제조하였다. 단, BCIP 농도는 15 mM으로 하였다.

(검체: 표준 혈청의 조제)

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사) 2500 ㎕로 용해하여, ALP 활성이 계산치로 350 IU/ℓ가 되도록 조제하여 스톡 용액으로 하였다. 다음으로 스톡 용액을 정제수로 희석하여, ALP 활성이 계산치로 175 IU/ℓ 및 100 IU/ℓ인 용액을 조제하였다. 또한, 상기 2개의 용액 및 정제수 각 20 ㎕에 480 ㎕의 완충액 1을 혼합하여, 이들을 검체로 이용하였다. 각 액체에는 유동을 확인하기 위한 직경 0.5 ㎛의 라텍스비드 (오오쯔까 덴시 주식회사 제조, 평판 시료용 셀모니터 입자)의 현탁액을 소량 (0.1 vol％) 첨가하였다.

(ALP 활성의 검출)

시린지 등을 이용하여 수동적으로 액체 저장소 (1)에 측정 시약을, 액체 저장소 (2)에 검체를 주입하였다. 두 액체를 주입한 마이크로 칩 (60)을 37 ℃의 공기 항온 장치를 부착시킨 도립 현미경의 스테이지 상에 설치하였다.

다음으로 마이크로 칩 (60)의 액체 저장소 (1) 및 액체 저장소 (2)와 페리스타 펌프 (50)에 부착된 페리스타 튜브 (51)을 SUS 튜브에 연결하여 도 13에 나타낸 바와 같은 구성의 송액계를 완성하였다.

시린지 펌프 (41)을 구동시킴으로써 측정 시약 및 검체를 600 ㎕/h의 유량으로 약 3분간 흐르게 하고 마이크로 칩 (60)의 모세관 중에 상기 두 액체를 보내었다. 그 후, 시린지 펌프 (41)을 정지하여, 실시예 4와 동일한 방법에 의해 ALP 활성의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<실시예 6>

(입도 분포 측정)

ALP 측정 시약과 검체 (생체 성분 유래 시료)를 혼합하여 얻어진 측정 시료에는 미세결정이 존재하는 경우가 있다. 이 미세결정의 입도 분포를 측정하였기때문에 그 결과에 관해서 설명한다.

BCIP 농도가 70 mM 및 6.25 mM인 ALP 측정 시약 25 ㎖와 ALP 활성을 계산치로 800 IU/ℓ에 조제한 표준 혈청 (검체)를 이하와 같이 혼합한 것 (시료 1 내지 4)를 각각 준비하였다.

우선, 시료 1은 BCIP 농도가 70 mM인 ALP 측정 시약에 표준 혈청 2500 ㎕을 혼합하여 37 ℃에서 3일간 반응한 것이다.

다음으로, 시료 2는 BCIP 농도가 70 mM인 ALP 측정 시약에 표준 혈청 625 ㎕을 혼합하여 37 ℃에서 3일간 반응한 것이다.

또한, 시료 3은 BCIP 농도가 6.25 mM인 ALP 측정 시약에 표준 혈청 625 ㎕을혼합하여 37 ℃에서 3시간 반응한 것이다.

또한, 시료 4는 BCIP 농도가 6.25 mM인 ALP 측정 시약 그 자체이다 (표준 혈청은 혼합하지 않음).

측정 장치에는 HORIBA LA-910형 레이저 회절/산란식 입도 분포 측정 장치를 이용하여, 입도 분포 측정을 행하였다. 구체적으로는 약 5O ㎖의 정제수가 들어 간 상기 측정 장치 부착 초음파 분산 버스에 10 ㎖의 시료 1 내지 4를 첨가하여 측정을 행하였다. 입도 분포의 측정 조건인 상대 굴절률은 1.26-0.00i로 하였다.

측정 결과를 도 16에 나타낸다. ALP 측정 시약과 표준 혈청을 혼합 반응하여 얻어진 측정 시약 중에는 상기 반응의 결과 생성된 BCI2가 존재한다. 그리고, 그 BCI2의 입자(미세결정)는 대략 수백 nm의 입경을 갖는 것을 알 수 있었다.

또한, 입도 분포의 측정 결과에서 수 ㎛의 크기의 입자도 존재하는 것이 분명해졌다. 단, 반응 시간이 장시간인 시료, 즉, 반응 시간이 3일 동안이었던 시료 1, 2인 경우는 입경이 수백 nm의 입자가 주로 존재하는 것으로부터, 수 ㎛의 크기의 입자는 BCIP라고 생각된다. 그러나, BCIP의 입자가 어떠한 상태로 존재하는지는 불분명하다.

따라서, 열렌즈 검출법에 적합한 측정 시약으로는 측정 시약과 생체 성분 유래 시료와의 반응 생성물로 색소 입자를 생성하지 않는 것이 필요하다. 또한, ALP 측정 시약의 BCIP 농도 및 반응 시간을 적절하게 할 필요가 있다.

또한, 측정 시약과 생체 성분 유래 시료와의 반응 이전에 BCI2의 입자 등의 미세결정이 존재하는 것이 바람직하지 않은 것은 물론이다.

<실시예 7>

본 발명의 한 실시예에서 혈청 중의 LDH 활성의 정량 측정을 행한 결과를 나타낸다. 또한, 상기 측정은 수지로 제조된 마이크로 칩 내부에서 광열 변환 검출법에 의해 행하였다.

(광열 변환 검출계의 구성)

광열 변환 검출계 (광열 변환 검출 장치)에서는 실시예 1과 동일한 기본 구성인 것을 이용하였다. 단, 여기광용 레이저를 파장이 633 nm의 He-Ne 가스 레이저에서 635 nm의 발광을 갖는 반도체 레이저 (산요 덴끼사 제조 DL-4038-025)로 변경하였다. 그리고, 이 변경에 따라 광학계를 제조하였다.

(측정 시약의 제조)

측정 시약 키트인 LDH 카이노스 (카이노스사 제조)를 이용하여 측정 시약을 제작하였다.

즉, LDH 카이노스에서 발색 색소인 NTB를 제외한 것에 2,2'-디벤조티아졸릴-5,5'-비스[4-디(2-술포에틸)카르바모일페닐]-3,3'-(3,3'-디메톡시-4,4'-비스페닐렌)디테트라졸륨 이나트륨염 (주식회사 도진 가가꾸 겡뀨쇼 제조, WST-5)을 첨가하였다. 보다 구체적으로는 NTB를 제외한 LDH 카이노스 (기질 완충액) 16 ㎖에 0.5 mM의 WST-5를 용해한 후 반응 시약을 용해하여 측정 시약으로 하였다.

(검체: 표준 혈청의 조제)

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사) 5 ㎖로 용해하여 LDH 활성이 계산치로 700 WU가 되도록 조제하여 스톡 용액으로 하였다. 다음으로 스톡 용액을 정제수로 희석하여, 계산치로 400 WU 및 100 WU의 LDH 활성을 포함하는 용액을 조제하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

(LDH 활성의 검출)

실시예 5와 동일한 방법에 의해, LDH 활성의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<실시예 8>

(TP의 측정)

측정 시약에는 카이노스 오토 시리즈 TP 시약 (카이노스 주식회사)을 설명서에 따라 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하여 TP 농도가 계산치로 9.75 g/㎗, 7.5 g/㎗, 및 5.0 g/㎗이 되도록 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 상기 검체와 상기 측정 시약과의 혼합, 반응을 상기 측정 시약의 설명서에 따라서 행하였다. 그 후, 측정 시료를 50 ㎛의 깊이를 갖는 평판 유리로 제조된 큐베트 (GL Sciences 사 제조 Quartz Cell Type AB20-SQ-0.05)에 옮겨 이 큐베트를 도립 현미경의 스테이지 상에 설치하였다. 대물 렌즈의 촛점 맞춤은 록인앰프의출력치를 보면서 최고치를 나타내는 위치를 지표로 하여 행하였다. 이 최고치를 상술된 소프트웨어 Lab VIEW에 의해 처리하여, TP 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<실시예 9>

(요소 질소의 측정)

측정 시약에는 자동 분석용 시약 "세이켄(生硏)" UN-I (덴카 세이켄 주식회사)를 설명서에 따라서 사용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하여 요소 질소 농도가 계산치로 99.4 mg/㎗, 24.9 mg/㎗, 및 6.2 mg/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 요소 질소 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<실시예 10>

(총 빌리루빈의 측정)

측정 시약에는 총 빌리루빈 측정용 HA 테스트 와꼬-총 빌리루빈 II-HA 테스트 와꼬 (와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하고, 총 빌리루빈 농도가 계산치로 1.68 mg/㎗, 0.4 mg/㎗ 및 0.1 mg/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 총 빌리루빈 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<실시예 11>

(γ-GTP 활성의 측정)

측정 시약에는 γ-GTP 카이노스 (카이노스 주식회사) 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하여, γ-GTP 활성이 계산치로 121 IU/ℓ, 80 IU/ℓ 및 40 IU/ℓ가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 γ-GTP 활성의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<실시예 12>

(알부민의 측정)

측정 시약에는 알부민 시약·A (고쿠사이 시야꾸 주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하고, 알부민 농도가 계산치로 7.0 g/㎗, 4.71 g/㎗, 및 2.35 g/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 알부민 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

이하의 참고예 2 내지 9에 여러가지 물질의 측정예를 참고로 나타낸다.

<참고예 2>

(AST 활성의 측정)

측정 시약에는 TA-LN 카이노스 (카이노스주식회사)를 설명서에 따라 이용하였다. 단, 이 측정 시약은 TA-LN 카이노스에 통상 포함되는 TOOS를 대신해서 DAOS (주식회사 도진 가가꾸 겡뀨쇼)를 함유하고 있다. 그 농도는 통상 TOOS가 포함되는 농도와 동일하다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하고, AST 활성이 계산치로 238 KU, 33.6 KU 및 1.7 KU가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 4와 동일하게 하여 AST 활성의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<참고예 3>

(요산의 측정)

측정 시약에는 이아트로 LQ UA(야트론 주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하고 요산 농도가 계산치로 9.79 mg/㎗, 6.53 mg/㎗, 및 3.25 mg/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 요산 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 24에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<참고예 4>

(글루코스의 측정)

측정 시약에는 델타미나 GL·E (교와 메덱스주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하고, 글루코스 농도가 계산치로 305 mg/㎗, 101.7 mg/㎗, 및 50.9 mg/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 글루코스 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 25에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<참고예 5>

(총 콜레스테롤의 측정)

측정 시약에는 총 콜레스테롤 측정용 HA 테스트 와꼬-콜레스테롤 E-HA 테스트 와꼬-(와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하여 총 콜레스테롤 농도가 계산치로 800 mg/㎗, 400 mg/㎗, 및 200 mg/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 총 콜레스테롤 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<참고예 6>

(HDL-콜레스테롤의 측정)

측정 시약에는 콜레스테스트 HDL (다이이찌 가가꾸 세이야꾸 주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하고, HDL-콜레스테롤 농도가 계산치로 76.8 mg/㎗, 48 mg/㎗, 및 24 mg/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 HDL-콜레스테롤 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<참고예 7>

(LDL-콜레스테롤의 측정)

측정 시약에는 콜레스테스트 LDL (다이이찌 가가꾸 세이야꾸 주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하고, LDL-콜레스테롤 농도가 계산치로 270 mg/㎗에서 135 mg/㎗, 및 62.5 mg/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 LDL-콜레스테롤 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 28에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<참고예 8>

(중성 지방의 측정)

측정 시약에는 자동 분석 장치용 시약-HR 트리글리세라이드-HR (와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하고, 중성 지방 농도가 계산치로 208 mg/㎗, 104 mg/㎗, 및 34.7 mg/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 중성 지방 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

<참고예 9>

(크레아티닌의 측정)

측정 시약에는 크레아티닌 측정용 L 타입 크레아티닌 F (와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하고 크레아티닌 농도가 계산치로 1.58 mg/㎗, 0.79 mg/㎗, 및 0.39 mg/㎗가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액과 정제수 그 자체를 검체로 하였다.

광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과 동일하게 하여 크레아티닌 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 30에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다.

다음에, 유미화를 나타내는 혈액 시료의 측정 결과에 관해서 설명한다.

<실시예 13>

측정 시약에는 HA 테스트 와꼬-콜레스테롤 E-HA 테스트 와꼬 (와꼬 쥰야꾸 고교 주식회사)를 설명서에 따라서 이용하였다.

검체로는 조제법을 일부 변형한 스이트롤 A (닛스이 세이야꾸 주식회사)를 이용하였다. 구체적으로는 1 바이알의 동결 건조품을 정제수 (교에이 세이야꾸 주식회사)로 용해하여 총 콜레스테롤이 계산치로 800 mg/㎗, 400 mg/㎗, 200 mg/㎗, 및 0 mg/㎗ (정제수 그 자체)가 되게 제조하였다. 그리고, 이러한 용액을 간섭 체크·A플러스 (고꾸사이 시야꾸 주식회사)의 유미 및 유미 블랭크로 1/10로 희석한 것을 검체로 하였다. 또, 간섭 체크·A플러스의 유미로 희석한 것이 유미화를 나타내는 검체이고, 간섭 체크·A플러스의 유미 블랭크로 희석한 것이 유미화를 나타내지 않는 검체이다.

희석 후의 유미화를 나타내는 검체의 포르마진도는 2100도이었다. 광열 변환 검출 장치는 실시예 4와 동일한 구성인 것을 이용하였다. 그리고, 실시예 8과동일하게 하여 총 콜레스테롤 농도의 측정을 행하였다. 그 결과, 도 31에 나타낸 바와 같은 검량선이 얻어졌다. 도 31의 그래프에서 알 수 있는 바와 같이 유미화를 나타내는 검체의 검량선과, 유미화를 나타내지 않는 검체의 검량선은 거의 일치하고 있다. 이 결과에서 광열 변환 검출법에 있어서는 유미의 영향이 거의 없는 것을 알 수 있다.

다음에, 동일하게 하여 조제한 측정 시료에 관해서 흡광도계 (시마즈 UV 2200)에 의해, 파장 635 nm에서 흡광도 측정을 행하였다. 그 결과를 도 32에 나타낸다.

이 결과에서 유미화를 나타내는 검체는 유미화를 나타내지 않는 검체와 비교하여 흡광도가 약 0.2 정도 높은 값을 나타내는 것을 알 수 있었다. 여기서 흡광도 측정에서는 백그라운드를 빼기 때문에 상이한 2가지 파장에서 측정을 행하는 것이 필요하다는 것을 알 수 있다.

<산업상의 이용가능성>

이상과 같이, 본 발명의 물질 측정 방법에 의하면 극미량의 생체 성분 유래시료 중의 헤모글로빈, ALP 등의 물질의 양을 광열 변환 검출법에 의해 간편하고 또한 단시간에 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 물질 측정 방법에 의하면 모세관 중에 침전 및 반응 생성물의 미세결정이 발생되지 않고 광열 변환 검출법에 의해 안정된 측정이 가능하다. 특히, 여기광으로서 장파장의 레이저를 사용하기 때문에 광열 변환 검출 장치를 염가로 제조할 수 있고 측정을 저비용으로 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 물질 측정 방법은 시료 조제 공정과 광열 변환 검출 공정을마이크로 칩 내부에서 행하기 때문에 측정에 필요한 생체 성분 유래 시료 및 측정 시약이 미량이다. 또한, 생체 성분 유래 시료와 측정 시약을 혼합하여 측정 시료를 조제하는 조작이 간편하고, 또한 폐기물도 적어진다.

특히, 본 발명의 헤모글로빈의 측정 방법에 의하면 헤모글로빈의 안정적인 측정이 가능하다. 그리고, 측정 시약이 독물인 시아니드를 함유하지 않기 때문에 측정 시약의 취급에 위험이 따르지 않고 또한 복잡한 폐액 처리도 불필요하다.

또한, 본 발명의 물질 측정 방법에 의하면 임상 검사상 문제가 되는 유미화를 나타내는 혈액 시료이더라도 상이한 2가지 파장에서 측정을 행할 필요가 없고 1회 측정만으로 정량적인 측정이 가능하다.

또한, 본 발명의 측정 시약을 사용하면 극미량의 생체 성분 유래 시료 중의 헤모글로빈, ALP 등의 물질의 양을 광열 변환 검출법에 의해 안정적으로 측정하는 것이 가능하다.

Claims (24)

1. 생체 성분 유래 시료 중의 물질을 검출하거나 또는 그 농도의 측정을 행하는 방법으로서,

   시료 조제 공정과 광열 변환 검출 공정을 구비하고,

   상기 시료 조제 공정은 상기 생체 성분 유래 시료와 측정 시약을 혼합 반응시켜, 과산화수소를 유도하지 않고 상기 물질과는 흡수 파장이 상이한 반응 생성물을 상기 물질의 양에 대응되는 양만 생성시켜 측정 시료를 조제하는 공정이고,

   상기 광열 변환 검출 공정은 상기 측정 시료에 여기광을 조사하여 그 결과 발생되는 부분적인 온도 변화에 의한 물리량 변화를 측정하는 공정이며,

   상기 반응 생성물은 수용성이고 또한 상기 여기광의 파장 영역에서 상기 반응 생성물의 흡광도는 상기 온도 변화를 발생시키는 데에 충분한 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 물리량 변화가 굴절률 변화이고, 상기 광열 변환 검출 공정에서는 상기 굴절률 변화에 의해 형성되는 열렌즈에 검출용 프로브광을 입사하여, 상기 열렌즈에 의해 발생되는 상기 프로브광의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 여기광의 파장이 600 nm 이상인 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 성분 유래 시료와 상기측정 시약을 모세관을 갖는 마이크로 칩에 장입하여, 상기 시료 조제 공정과 상기 광열 변환 검출 공정을 상기 마이크로 칩의 모세관 내부에서 행하는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 모세관은 한쌍의 평판상 부재를 접합시킴으로써 형성되는 것으로서, 상기 한쌍의 평판상 부재 중 적어도 한쪽은 그 판면에 홈을 구비하고 있고, 상기 한쌍의 평판상 부재는 상기 홈을 구비한 판면을 내측으로 하여 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 성분 유래 시료가 혈액시료이고, 상기 물질이 헤모글로빈으로서 상기 시료 조제 공정은 상기 혈액 시료와 상기 측정 시약을 혼합 용혈시켜 상기 측정 시료를 조제하는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 여기광의 파장 범위가 610 nm 내지 650 nm이고, 또한 상기 프로브광의 파장이 상기 여기광보다도 장파장인 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 여기광의 파장 범위가 620 nm 내지 640 nm이고, 또한 상기 프로브광의 파장이 상기 여기광보다도 장파장인 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정 시약이 적혈구를 용혈시키는 농도의 중성 계면 활성제와, 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 농도의 산화제와, pH의 범위를 5 내지 7로 유지시키는 농도의 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 측정 시약이 시아니드를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액 시료와 상기 측정 시약과의 혼합비의 범위가 1:1 내지 1:250인 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 포스파타아제이고, 상기 측정 시약은 상기 포스파타아제에 대한 기질을 함유하며, 상기 시료 조제 공정은 상기 생체 성분 유래 시료와 상기 측정 시약을 혼합하여 상기 생체 성분유래 시료 중의 포스파타아제와 상기 측정 시약 중의 상기 기질을 반응시켜 측정 시료를조제하는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 기질이 인산 에스테르 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 기질이 5-브로모-4-클로로-3-인독실포스페이트 및 그의 염 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스파타아제가 알칼리 포스파타아제인 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정 시료 중의 상기 기질의 농도 범위가 1 내지 15 mM인 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 성분 유래 시료와 상기 측정 시약을 혼합하고 나서 상기 물리량 변화를 측정하기까지의 시간이 3 내지 15분인 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
18. 유미화를 나타내는 혈액 시료 중의 물질을 검출하거나 또는 그 농도의 측정을 행하는 방법으로서, 상기 혈액 시료와 측정 시약을 혼합하여 측정 시료를 조제하는 시료 조제 공정과, 상기 측정 시료에 여기광을 조사하여 그 결과 발생하는 부분적인 온도 변화에 의한 물리량 변화를 측정하는 광열 변환 검출 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 물리량 변화가 굴절률 변화이고, 상기 광열 변환 검출 공정에서는 상기 굴절률 변화에 의해 형성되는 열렌즈에 검출용 프로브광을 입사하여, 상기 열렌즈에 의해 발생되는 상기 프로브광의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 혈액 시료와 상기 측정 시약을 모세관을 갖는 마이크로 칩에 장입하여, 상기 시료 조제 공정과 상기 광열 변환 검출 공정을 상기 마이크로 칩의 모세관 내부에서 행하는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 모세관은 한쌍의 평판상 부재를 접합시킴으로써 형성되는 것으로서, 상기 한쌍의 평판상 부재 중 적어도 한쪽은 그 판면에 홈을 구비하고 있고, 상기 한쌍의 평판상 부재는 상기 홈을 구비한 판면을 내측으로 하여 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 물질 측정 방법.
22. 제6항 내지 제11항의 물질 측정 방법에 사용되는 측정 시약으로서, 적혈구를 용혈시키는 농도의 중성 계면 활성제와, 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 농도의 산화제와, pH의 범위를 5 내지 7로 유지시키는 농도의 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 시약.
23. 제12항 내지 제17항의 물질 측정 방법에 사용되는 측정 시약으로서, 인산 에스테르 결합을 갖는 기질을 구비한 것을 특징으로 하는 측정 시약.
24. 제23항에 있어서, 상기 기질이 5-브로모-4-클로로-3-인독실포스페이트 및 그 염 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 측정 시약.