CN104995310B

CN104995310B - 快速、低样品体积胆固醇和甘油三酯测定

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Publication number: CN104995310B
Application number: CN201380072538.7A
Authority: CN
Inventors: D·迈特杰; I·吉本斯; P·帕特尔; E·A·霍姆斯
Original assignee: Theranos Inc
Current assignee: Serranos intellectual property limited liability company
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: AU2013359422A1; US9546394B2; ES2729794T3; EP2929046A4; JP2019054811A; IL239229A; KR20150094710A; MX2015007131A; MX364956B; HK1216763A1; JP2023015207A; US11268130B2; US20140170688A1; IL239229A0; JP2021006060A; US10392650B2; SG11201504455PA; EP2929046A1; CN104995310A; CA2891944A1

Abstract

提供了用于从血液样品快速测量胆固醇和胆固醇亚部分的试剂、测定、方法、试剂盒、装置和系统。可以在胆固醇亚种以不同速率转化为可检测产物的条件下，使用动力学测量在单一测定中测量总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇。所述可检测产物在测定开始后的不同时间进行测量。脂肪酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶可以一起使用，以便以与转化的胆固醇的量成正比的量产生有色产物。披露了通过进一步包含甘油三酯测量而计算极低密度脂蛋白胆固醇水平的方法。测定可以在单一反应混合物中进行，与通过在不同反应混合物中进行若干不同的测定所预期的相比，其以更低的花费允许更准确和精确的胆固醇测定，包括胆固醇亚部分与总胆固醇之比。

Description

快速、低样品体积胆固醇和甘油三酯测定

背景技术

脂质，特别是胆固醇，在人类健康和疾病中发挥着关键作用。胆固醇是必需的养分和形成围绕细胞和细胞器的边界的脂膜的关键组分。

然而，过量的胆固醇是非常危险的，因为它可在血管中积累成“斑块”并可在人类中引起血栓形成、中风和其他潜在致死性后果。为了减小这些风险，将脂质，特别是胆固醇，包装进脂蛋白中以供在血液中通过身体转运。

已知多种不均一形式的含有胆固醇(C)和甘油三酯(TG)的脂蛋白，包括，例如乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。这些脂蛋白的胆固醇内容物分别被称为VLDL-胆固醇(VLDL-C)、LDL-胆固醇(LDL-C)和HDL-胆固醇(HDL-C)。

常规地进行血浆或血清的VLDL、LDL、HDL的胆固醇含量和总胆固醇(TC)含量的测量或衍生值，以评估动脉粥样硬化的风险和“降胆固醇”药物如“他汀类药物”的有益效果。

在现有技术方法中，血液样品的离心提供了在血清或血浆中的可区别的VLDL、LDL和HDL部分(fractions)；这些部分形成了因其不同密度而在离心力下以不同速度移动的不同的带。通过利用使用诸如硫酸葡聚糖、环糊精硫酸酯和阳离子等试剂的示差沉淀，脂蛋白还可以通过沉淀来分离。例如，VLDL和LDL可以完全沉淀而所有HDL留在溶液中。一旦通过离心或过滤去除了VLDL和LDL，则剩余的胆固醇只与HDL部分相关联。其他现有技术方法可以用于估算HDL-C和LDL-C，其利用例如通过共价连接聚乙二醇(PEG)链而修饰的酶。PEG被认为将酶活性限制于特定的脂蛋白部分。这些现有技术方法还可使用特定的试剂，所述试剂选择性地增溶或屏蔽特定脂蛋白部分，使得只有单一脂蛋白部分发生沉淀或在测定中可与测定化学发生反应。

为了使这些胆固醇含量测量成为有效的，它们必须是非常准确和精确的(误差小于5％)，因为小差异是临床上显著的。用于胆固醇亚部分(sub-fractions)测量的常规手段涉及若干独立的测定(一般至少三种：TC、LDL-C和HDL-C)和/或三种分析物(TC、TG、HDL-C)的测量加上使用Friedewald公式对LDL-C计算的值：

HDL-C≈TC–LDL-C–k x TG

其中“TG”是甘油三酯水平，“x”表示乘以，而“k”对于以mg/dl测量的量是0.2(如果该量以mmol/l测量，则k约为0.45)。

Friedewald公式对于LDL-C而言可以等同地表示如下：

LDL-C≈TC–HDL-C–k x TG

其中“TG”仍是甘油三酯水平，“x”表示乘以，而“k”对于以mg/dl测量的量是0.2(如果该量以mmol/l测量，则k约为0.45)。

脂蛋白胆固醇的亚形式(sub-forms)的相对水平，例如HDL-C与TC之比(HDL-C/TC)、LDL-C与TC之比(LDL-C/TC)或VLDL-C与TC之比(VLDL-C/TC)，是至关重要的。脂蛋白胆固醇的亚形式的水平通常分开测量，或者通过昂贵且繁琐的物理分离方法如离心或电泳来测量。由于这些水平常规地在若干独立测定中进行测量，每一个测定具有其自身的误差来源，所以胆固醇亚部分的计算比值中的累积误差将会大于对于有效诊断和疗法监测所期望的误差。此外，脂蛋白胆固醇亚部分的分析费用由于需要若干测定而增加。

援引并入

本文提到的所有专利、专利申请和出版物均通过引用在此全文并入本文。

发明内容

申请人已发现，在不需要脂蛋白沉淀且没有分离步骤的情况下，可在针对脂蛋白胆固醇的单一测定中使用动态测量获得T-C、LDL-C和HDL-C的非常准确且精确的值。本文公开的测定使用脂肪酶(例如胆固醇酯酶)、氧化酶(例如胆固醇氧化酶)和过氧化物酶来形成有色产物。本文公开的测定可以使用脂肪酶(例如胆固醇酯酶)、脱氢酶(例如胆固醇脱氢酶)和烟碱腺嘌呤二核苷酸来形成吸收光的产物(例如NADH)或其他可检测的产物。这样的产物可以通过分光光度法测量。在本文公开的测定中，由所有含胆固醇的脂蛋白种类形成的产物的量与转化的胆固醇的量成正比。本文公开的测定、方法、试剂和试剂盒可用于脂蛋白胆固醇和脂蛋白胆固醇亚部分的快速、高效且廉价的测定，且有利地提供了在单一测定中对脂蛋白胆固醇和脂蛋白胆固醇亚部分的测量。本文公开的测定在不需要脂蛋白沉淀的情况下有利地提供了脂蛋白胆固醇和脂蛋白胆固醇亚部分的测量。本文公开的测定在不需要离心或电泳的情况下有利地提供了脂蛋白胆固醇和脂蛋白胆固醇亚部分的测量。

申请人已发现，提供测定条件(例如试剂、方案和温度)以使得将HDL-C、LDL-C和VLDL-C转化为有色产物的反应的动力学以显著不同的速率进行，而仍允许所有脂蛋白种类(例如HDL、LDL和VLDL)的反应到测定结束时基本完成是可能的。例如，在本文公开的测定中，HDL-C的时程具有估计少于一分钟的半衰期(half-time)，而LDL-C转化具有滞后期和集中在大约三分钟上的总体S形形状。在本文公开的测定中，其余的脂蛋白胆固醇(乳糜微粒和VLDL-C)甚至更慢地反应(半衰期约为五分钟或更长)。不同胆固醇种类之间在半衰期和反应动力学上的这些差异使得能够使用简单的算法将测定信号去卷积成可归因于每个种类的信号，即使例如信号是在测定过程中的某些时间段内由多于一个种类产生的。因此，设计用于在本文公开的测定和方法中使用的试剂配方，以在单一测定中实现脂蛋白种类HDL、LDL和VLDL的动力学差示(kinetic differentiation)。

本文公开的新方法和测定利用了申请人的意外发现，即在这些测定中，胆固醇亚种以不同速率转化为所测量的产物。相应地，HDL-C非常快速地转化为产物，而LDL-C转化为产物慢于HDL-C转化为产物，且VLDL-C和乳糜微粒胆固醇转化得甚至更为缓慢。总胆固醇完全转化为产物甚至慢于HDL-C或LDL-C转化为产物。这种在转化为产物的速率上的差异允许在单一溶液中在不同时间进行来自不同脂蛋白种类的胆固醇的测量，从而减少了这类测量所需的步骤数目、减少了可能的误差并简化了程序。

因此，申请人在此公开了在血液的单一样品或样品的一部分中测定HDL-C、LDL-C和TC的方法。这些方法允许在测定过程中没有脂蛋白的显著沉淀的情况下，例如在血液的样品或样品的一部分中没有HDL或LDL的显著沉淀的情况下，在血液的单一样品或样品的一部分中测定HDL-C、LDL-C和TC。如本文所公开的，可以通过比色测定在将有效允许从样品中的脂蛋白释放的胆固醇发生氧化的试剂进行组合之后第一时间段内形成的过氧化物的量，而在没有显著脂蛋白沉淀的情况下测量血液样品中的HDL-C的量。例如，所述第一时间段可以是少于约3分钟的时间段，且在一些实施方案中，可以是约2分钟的时间段。如本文所公开的，可以通过比色测定在将有效允许从样品中的脂蛋白释放的胆固醇发生氧化的试剂进行组合之后第二时间段内形成的过氧化物的量，而在没有显著脂蛋白沉淀的情况下测量血液样品中的LDL-C的量。在实施方案中，可以根据在所述第二时间段开始时进行的比色测定与在所述第二时间段结束时进行的比色测定之间的差来测量血液样品中LDL-C的量。例如，所述第二时间段可以是在将有效允许从样品中的脂蛋白释放的胆固醇发生氧化的试剂进行组合之后约2分钟至约6分钟的时间段。如本文所公开的，可以通过比色测定在将有效允许从样品中的脂蛋白释放的胆固醇发生氧化的试剂进行组合之后形成的过氧化物的量，而在没有显著脂蛋白沉淀的情况下测量血液样品中的TC的量。这种TC测定(例如比色测定)可以在第三时间段开始时的时间或第三时间段过程中的任何特定时间进行。所述第三时间段包含所述第二时间段之后的时间段，例如可以是在将有效允许从样品中的脂蛋白释放的胆固醇发生氧化的试剂进行组合之后约6分钟开始的时间段。当不同样品在不同测定中测量时，为了不同样品之间测量的一致性，针对每个不同样品的比色测定可在每个样品的所述第三时间段开始之后的相同时间进行。

因此，HDL-C、LDL-C和TC测量可以在受试者血液的单一样品或样品的单一部分中进行。在实施方案中，如本文所公开的，HDL-C、LDL-C和TC测量可以在受试者血液的单一样品或样品的单一部分中顺序地进行。例如，基于这些测量值，受试者血液的单一样品或样品的单一部分中的VLDL-C水平可通过关系式VLDL-C＝TC–(HDL-C+LDL-C)或通过其他关系式来计算。在实施方案中，受试者血液的单一样品或样品的单一部分中的VLDL-C水平可从这些测量值，例如通过关系式VLDL-C＝αTC+βHDL-C+γLDL-C+λ来计算，其中α、β和γ分别是乘以TC、HDL-C和LDL-C的常数；且其中λ分别是将要与所有其他因数之和相加的加常数。在又进一步的实施方案中，受试者血液的单一样品或样品的单一部分中的VLDL-C水平可从其他关系式使用TC、HDL-C和LDL-C的部分或全部测量值以及与以上提供的关系式在形式上相似的乘常数和加常数来计算。

因此，申请人在此公开了新的且有用的HDL-C、LDL-C和TC的测量以及VLDL-C的计算，其可以对单一血液样品或血液样品的一部分进行，从而减少了这类测量所需的血液量，降低了测量血液中这些不同脂蛋白部分所需方法的复杂度，并提供了准确且快速的血液脂蛋白测量。可以在样品中的脂蛋白不发生显著沉淀的情况下进行这些测量。

申请人在此还公开了用于测定血液样品中的甘油三酯水平的方法，其中甘油三酯(TG)的水平(等同地：量)可通过以下方法测定，其中使血液样品与脂肪酶、激酶和氧化酶接触以从血液样品中的TG释放甘油，以使甘油发生磷酸化且随后提供过氧化氢。过氧化氢在过氧化物酶的存在下形成着色剂，着色剂的测量提供了血液样品中的TG水平的测定。

申请人在此公开了新的且有用的HDL-C、LDL-C、TC和TG的测量，其提供了准确且快速的血液脂蛋白测量。HDL-C、LDL-C和TC的测量可以对一个血液样品或血液样品的一部分进行，而TG测量可以对不同的血液样品或血液样品的不同部分进行。可以在样品中的脂蛋白不发生显著沉淀的情况下进行这些测量。四种血脂组分的这些测量对来自受试者血液的仅两个样品或一个或多个样品的两部分一起进行。申请人在此进一步公开了使用HDL-C、TC和TG测量值或使用HDL-C、LDL-C、TC和TG测量值计算受试者血液中的VLDL-C的改进方法。在实施方案中，VLDL-C可从HDL-C、TC和TG测量值或从HDL-C、LDL-C、TC和TG测量值计算，其中这些测量是根据本文公开的方法进行的。在实施方案中，受试者血液的单一样品或样品的单一部分中的VLDL-C水平可从这些测量值，例如通过关系式VLDL-C＝αTC+βHDL-C+γLDL-C+δTG+a₁(TG+ε)(TC+κ)+λ来计算，其中α、β、γ、δ和a₁分别是乘以TC、HDL-C、LDL-C、TG和(TG+ε)(TC+κ)的常数；且其中ε、κ和λ分别是与TG、TC和所有其他因数之和相加的加常数。在进一步的实施方案中，受试者血液的单一样品或样品的单一部分中的VLDL-C水平可从这些测量值，例如通过关系式VLDL-C＝αTC+βHDL-C+δTG+a₁(TG+ε)(TC+κ)+λ来计算，其中α、β、δ和a₁分别是乘以TC、HDL-C、TG和(TG+ε)(TC+κ)的常数；且其中ε、κ和λ分别是与TG、TC和所有其他因数之和相加的加常数。在又进一步的实施方案中，受试者血液的单一样品或样品的单一部分中的VLDL-C水平可从其他关系式使用TC、TG、HDL-C和LDL-C的部分或全部测量值以及与以上提供的关系式在形式上相似的乘常数和加常数来计算。

在实施方案中，设计用于在本文公开的测定和方法中使用的试剂配方，以在没有脂蛋白沉淀的情况下实现上述动力学差示。在本文公开的试剂和测定中，在没有发生脂蛋白沉淀的情况下实现了脂蛋白与阳离子(任选二价阳离子如镁、钙、锰、钴、镉或其他阳离子)和带负电荷的多糖(例如，葡聚糖酯如硫酸葡聚糖，环糊精酯如α-环糊精硫酸酯，肝素，或其他带负电荷的多糖)的复合物的形成。例如，在实施方案中，在不发生或几乎不发生脂蛋白沉淀的情况下实现了脂蛋白与镁离子和硫酸葡聚糖的复合物形成。两亲性化合物，如表面活性剂，可包括在本文公开的试剂和测定中。例如，多种表面活性剂适用于保持脂蛋白可溶。在实施方案中，所述试剂提供了以使得限制而非阻止接近(例如，通过胆固醇酯酶和/或氧化酶)LDL和VLDL胆固醇及胆固醇酯的方式有效修饰LDL和VLDL脂蛋白颗粒表面的成分。与不使用相互作用物和表面活性剂或者以与本文所公开的测定和试剂中所发现的不同浓度和相对比例使用这些试剂进行的相似测定中有色产物的形成速率相比，适用于LDL和VLDL颗粒表面的这种修饰的试剂和方法的使用对于减缓从这些脂蛋白种类形成有色产物是有效的。为了提供反应动力学的分离，以有效支持在不需要不同脂蛋白部分的物理分离(例如，不需要离心或电泳)的情况下在不同时间测量不同脂蛋白部分的胆固醇含量，减缓从脂蛋白种类形成有色产物可以是有用的。

因此，申请人在此公开了用于在测定中使用的第一试剂，该测定用于同时、快速测量来自受试者的血液样品中总胆固醇(TC)、LDL-胆固醇(LDL-C)和HDL-胆固醇(HDL-C)中的至少两种，而没有所述血液脂蛋白的显著沉淀，所述第一试剂包含脂蛋白增溶剂和脂蛋白相互作用物。在实施方案中，第一试剂可以包含缓冲液。在实施方案中，用于在本文公开的第一试剂中使用的脂蛋白增溶剂可以包含表面活性剂。脂蛋白相互作用物可以包含例如环糊精、葡聚糖或两者。在实施方案中，用于在这种第一试剂中使用的脂蛋白相互作用物可以包含低分子量葡聚糖。在实施方案中，用于在这种第一试剂中使用的脂蛋白相互作用物可以包含α-环糊精。在实施方案中，第一试剂可以包含着色剂。在实施方案中，第一试剂可以包括含苯胺化合物和氨基安替比林(aminoantipyrene)化合物中的一种或两种，这两种化合物在过氧化物和过氧化物酶的存在下有效反应而形成可检测的产物。在本文公开的试剂、测定、方法和试剂盒的实施方案中，这种第一试剂可包含α-环糊精硫酸酯、硫酸葡聚糖、氯化镁、4-氨基安替比林和缓冲液如磷酸盐缓冲液。在本文公开的试剂、测定、方法和试剂盒的实施方案中，这种第一试剂可以包含α-环糊精硫酸酯(1mM)、硫酸葡聚糖(20μM)、氯化镁(4mM)、4-氨基安替比林(2.25mM)和Na_xPO₄(100mM)(其中Na_xPO₄是磷酸钠盐；例如，可以是NaH₂PO₄、Na₂HPO₄或Na₃PO₄)。在实施方案中，这种第一试剂的pH可以为约pH 5至约pH 9，或约pH 6至约pH 8，任选地约pH 6.8至约pH 7.8，例如约pH 7.4。

申请人还公开了用于在测定中使用的第二试剂，该测定用于同时、快速测量来自受试者的血液样品中总胆固醇(TC)、LDL-胆固醇(LDL-C)和HDL-胆固醇(HDL-C)中的至少两种，而没有所述血液脂蛋白的显著沉淀，所述第二试剂包含脂肪酶、氧化酶和着色剂。在实施方案中，第二试剂可以包含缓冲液。在所述第二试剂的实施方案中，脂肪酶可以包含胆固醇酯酶，氧化酶可以包含胆固醇氧化酶，且着色剂可以包含过氧化物酶、过氧化物酶的底物或两者。在实施方案中，过氧化物酶和过氧化物酶的底物都存在于所述第二试剂中。

在实施方案中，所述第二试剂可以包含缓冲液、两亲剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和着色剂。在实施方案中，用于在这种第二试剂中使用的两亲剂可以包含表面活性剂。在实施方案中，用于在这种第二试剂中使用的着色剂可以包含过氧化物酶和过氧化物酶的底物。在实施方案中，用于在这种第二试剂中使用的着色剂可以包含辣根过氧化物酶。在实施方案中，用于在这种第二试剂中使用的着色剂可以包含含苯胺化合物如N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)，可以包含氨基安替比林化合物如4-氨基安替比林，或其他化合物，以及与诸如过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)等酶反应的化合物的组合。在实施方案中，第二试剂可以包含含苯胺化合物和氨基安替比林化合物两者，两种化合物在过氧化物和过氧化物酶的存在下有效反应而形成可检测的产物。在实施方案中，脂肪酶可以包含胆固醇酯酶。在实施方案中，用于在这种第二试剂中使用的胆固醇酯酶可以包含细菌胆固醇酯酶，例如，来自假单胞菌属(Pseudomonas)细菌的胆固醇酯酶。在实施方案中，氧化酶可以包含胆固醇氧化酶。在实施方案中，用于在如本文公开的第二试剂中使用的胆固醇氧化酶可以包含细菌胆固醇氧化酶，如来自假单胞菌属细菌的胆固醇氧化酶。在本文公开的试剂、测定、方法和试剂盒的实施方案中，这种第二试剂可包含缓冲液如磷酸盐缓冲液(例如，Na_xPO₄(其中Na_xPO₄是磷酸钠盐；例如，可以是NaH₂PO₄、Na₂HPO₄或Na₃PO₄))、Trtion X-100、普朗尼克(pluronic)L64、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)、假单胞菌胆固醇酯酶和假单胞菌胆固醇氧化酶。例如，这种第二试剂可包含Na_xPO₄(50mM)、Trtion X-100(0.06％)、普朗尼克L64(3g/L)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)(3mM)、来自假单胞菌属的种的胆固醇酯酶(750U/L)和来自假单胞菌属的种的胆固醇氧化酶(1.5kU/L)。在实施方案中，这种第二试剂的pH可以为约pH5至约pH 9，或约pH 6至约pH 8，任选地约pH 6.8至约pH 7.8，例如约pH 7.4。

申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的方法和试剂，包括包含脂肪酶、氧化酶和着色剂的第二试剂，所述第二试剂包含一定浓度水平的脂蛋白相互作用物，当在本文公开的方法中使用时，该浓度水平以显著不同于LDL-C向可测量有色产物(或例如在光谱的近紫外线范围内可测量的产物)转化的速率提供HDL-C向可测量有色产物(或例如在光谱的近紫外线范围内可测量的产物)的转化。申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的方法和试剂，其包含脂肪酶、氧化酶和着色剂，包括包含一定浓度水平的脂蛋白相互作用物的第二试剂，当在本文公开的方法中使用时，该浓度水平以显著不同于VLDL-C向可测量有色产物转化的速率提供HDL-C向可测量有色产物的转化。申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的方法和试剂，其包含脂肪酶、氧化酶和着色剂，包括包含一定浓度水平的脂蛋白相互作用物的第二试剂，当在本文公开的方法中使用时，该浓度水平以显著不同于VLDL-C向可测量有色产物转化的速率提供LDL-C向可测量有色产物的转化。申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的方法和试剂，其包含脂肪酶、氧化酶和着色剂，包括包含一定浓度水平的脂蛋白相互作用物的第二试剂，当在本文公开的方法中使用时，该浓度水平以显著不同于LDL-C和/或VLDL-C向可测量有色产物转化的速率提供HDL-C向可测量有色产物的转化。申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的方法和试剂，其包含脂肪酶、氧化酶和着色剂，包括包含一定浓度水平的脂蛋白相互作用物的第二试剂，当在本文公开的方法中使用时，该浓度水平以显著不同于HDL-C和VLDL-C向可测量有色产物转化的速率提供LDL-C向可测量有色产物的转化。

在实施方案中，着色剂可以包含过氧化物酶和过氧化物酶的底物。例如，在实施方案中，着色剂可以包含过氧化物酶、含苯胺化合物和氨基安替比林化合物。

申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的试剂，包括包含一定浓度水平的脂蛋白相互作用物的试剂，该浓度水平以显著不同于LDL-C和VLDL-C向可测量有色产物转化的速率提供HDL-C向可测量有色产物的转化，并以显著不同于LDL-C和VLDL-C向可测量有色产物转化的速率提供HDL-C向可测量有色产物的转化。

申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的试剂，包括包含一定浓度的带负电荷的多糖衍生物和二价阳离子的试剂，所述浓度有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述试剂接触时，没有LDL的显著沉淀或没有显著的VLDL沉淀或两者均没有。申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的试剂，所述试剂包含比值为约0.002至约0.02、在一些实施方案中约0.005的带负电荷多糖与二价阳离子，有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述试剂接触时，没有HDL的显著沉淀或没有LDL的显著沉淀或没有VLDL的显著沉淀。在实施方案中，所述试剂包含如本文公开的第一试剂。

申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的试剂，所述试剂包含一定浓度的带负电荷的多糖、二价阳离子和表面活性剂，所述浓度有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述试剂接触时，没有HDL的显著沉淀或没有LDL的显著沉淀或没有VLDL的显著沉淀。在实施方案中，所述试剂包含如本文公开的第一试剂。

申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的试剂，所述试剂包含一定浓度的硫酸葡聚糖(或其他带负电荷的多糖)和镁(或其他二价阳离子)，所述浓度有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述试剂接触时，没有HDL的显著沉淀或没有LDL的显著沉淀或没有VLDL的显著沉淀。申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的试剂，所述试剂包含比值为约0.002至约0.02、在一些实施方案中约0.005的硫酸葡聚糖(或其他带负电荷的多糖)与镁离子(或其他二价阳离子)，有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述试剂或组合物接触时，没有HDL的显著沉淀或没有LDL的显著沉淀或没有VLDL的显著沉淀。申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的试剂，所述试剂包含一定浓度的硫酸葡聚糖、镁和表面活性剂，所述浓度有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述试剂或组合物接触时，没有LDL的显著沉淀或没有VLDL的显著沉淀或两者均没有。在实施方案中，所述试剂包含如本文公开的第一试剂。

申请人进一步在此公开了用于在测定中使用的组合物，该测定用于同时、快速测量来自受试者的血液样品中总胆固醇(TC)、LDL-胆固醇(LDL-C)和HDL-胆固醇(HDL-C)中的至少两种，而没有所述血液脂蛋白的显著沉淀，所述组合物包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物、脂肪酶和着色剂。在实施方案中，这种组合物可以包含缓冲液。在实施方案中，所述着色剂包含过氧化物酶、含苯胺化合物和氨基安替比林化合物。在实施方案中，所述组合物包含来自本文公开的第一试剂和第二试剂的成分。例如，这种组合物可以通过本文公开的所述第一试剂和所述第二试剂的组合来提供。在实施方案中，这种组合物可以包含带负电荷的多糖和含二价阳离子的盐(例如镁盐和硫酸葡聚糖)，其中带负电荷的多糖与二价阳离子(例如，硫酸葡聚糖与镁离子)之比为约0.002至约0.02，且在实施方案中该比值约为0.005，有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述组合物接触时，没有HDL的显著沉淀或没有LDL的显著沉淀或没有VLDL的显著沉淀。在实施方案中，这种组合物包含所述第一试剂和所述第二试剂，或所述第一试剂的整分试样和所述第二试剂的整分试样。在进一步的实施方案中，这种组合物包含所述第一试剂、所述第二试剂和血液样品，或所述第一试剂、所述第二试剂和所述血液样品中的一种或多种的一个或多个整分试样。

在实施方案中，在这种组合物中的脂蛋白增溶剂可以包含表面活性剂。在实施方案中，在这种组合物中的脂蛋白相互作用物可以包含二价阳离子(例如镁离子)和带负电荷的多糖衍生物。带负电荷的多糖衍生物可以包含环糊精-酯、葡聚糖-酯或环糊精-酯和葡聚糖-酯两者。例如，葡聚糖-酯可以包含低分子量葡聚糖-酯，例如低分子量硫酸葡聚糖，而环糊精-酯可以包含α-环糊精-酯，例如α-环糊精-硫酸酯。在实施方案中，脂肪酶可以包含胆固醇酯酶。在实施方案中，氧化酶可以包含胆固醇氧化酶。在实施方案中，着色剂可以包含过氧化物酶。

因此，在实施方案中，用于在本文公开的胆固醇测定中使用的组合物可包含胆固醇酯酶；胆固醇氧化酶；过氧化物酶；过氧化物酶的底物；表面活性剂；含二价阳离子的盐；和带负电荷的多糖(例如，葡聚糖衍生物，如硫酸葡聚糖)。在实施方案中，在这种组合物中的过氧化物酶的底物包含含苯胺化合物和氨基安替比林化合物两者，其有效使得两种化合物在过氧化物和过氧化物酶的存在下反应以形成可检测的产物。在实施方案中，过氧化物酶的底物可以包含与过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)反应的其他化合物及化合物的组合。例如，含苯胺化合物可以是N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)。氨基安替比林化合物可以是4-氨基安替比林。

在实施方案中，用于在本文中公开的胆固醇测定中使用的组合物可包含一定浓度的硫酸葡聚糖(或其他带负电荷的多糖)和镁，所述浓度有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述组合物接触时，没有HDL的显著沉淀或没有LDL的显著沉淀或没有VLDL的显著沉淀。申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的组合物，其包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，所述组合物包含比值为约0.002至约0.02、在一些实施方案中约0.005的硫酸葡聚糖与镁离子，有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述试剂接触时，没有HDL的显著沉淀或没有LDL的显著沉淀或没有VLDL的显著沉淀。申请人在此公开了用于在胆固醇测定中使用的组合物，其包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，所述组合物包含一定浓度的硫酸葡聚糖、镁和表面活性剂，所述浓度有效使得当血液样品或血液样品的一部分与所述组合物接触时，没有LDL的显著沉淀或没有显著VLDL沉淀或两者均没有。

在实施方案中，用于在测定(其用于同时、快速测量来自受试者的血液样品中总胆固醇(TC)、LDL-胆固醇(LDL-C)和HDL-胆固醇(HDL-C)中的至少两种，而没有所述血液脂蛋白的显著沉淀)中使用的组合物可包含胆固醇酯酶、胆固醇氧化物、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶)、4-氨基安替比林、ALPS、α-环糊精硫酸酯、硫酸葡聚糖、氯化镁、表面活性剂(例如Trition X-100和/或普朗尼克L64)和缓冲液。合适的缓冲液可以是，例如，磷酸盐缓冲液，而合适的pH可以为约pH 5至约pH 9，或约pH 6至约8，任选地约pH 6.8至约pH 7.8，例如约pH 7.4。用于在这种组合物中使用的合适的胆固醇酯酶可以包含细菌胆固醇酯酶，例如来自假单胞菌属细菌的胆固醇酯酶，且合适的胆固醇氧化酶可包含细菌胆固醇氧化酶，如来自假单胞菌属细菌的胆固醇氧化酶。

在实施方案中，申请人公开了用于在测定中使用的试剂，该测定用于同时、快速测量来自受试者的血液样品的脂蛋白中总胆固醇、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇中的至少两种，而没有所述脂蛋白的显著沉淀，所述试剂包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液，其中所述脂蛋白相互作用物以一定浓度水平存在，该浓度水平以显著不同于LDL-胆固醇向可测量有色产物转化的速率以及显著不同于VLDL-胆固醇向可测量有色产物转化的速率提供HDL-胆固醇向可测量有色产物的转化。

在实施方案中，申请人公开了用于在测定中使用的试剂，该测定用于同时、快速测量来自受试者的血液样品的脂蛋白中的总胆固醇、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇中的至少两种，而没有所述脂蛋白的显著沉淀，所述试剂包含α-环糊精硫酸酯、硫酸葡聚糖、氯化镁、4-氨基安替比林和磷酸钠缓冲液，其中硫酸葡聚糖与镁离子之比为约0.002至约0.02。

在实施方案中，申请人公开了用于在测定中使用的试剂，该测定用于测量来自受试者的血液样品的脂蛋白中总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇和高密度脂蛋白(HDL)-胆固醇中的至少两种，而没有所述脂蛋白的显著沉淀，所述试剂包含缓冲液、两亲剂、脂肪酶、氧化酶和着色剂。在实施方案中，所述试剂包含胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶。在所述试剂的实施方案中，所述两亲剂包含表面活性剂，该表面活性剂选自非离子表面活性剂；阴离子表面活性剂；阳离子表面活性剂；两性离子表面活性剂；及其衍生物、类似物和组合。在所述试剂的实施方案中，所述着色剂包含过氧化物酶、过氧化物酶底物、氨基安替比林化合物和含苯胺化合物中的一种或多种。在实施方案中，所述试剂包含磷酸钠缓冲液、Trition X-100、普朗尼克L64、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)、来自假单胞菌属的种的胆固醇酯酶和来自假单胞菌属的种的胆固醇氧化酶。

在实施方案中，申请人公开了用于在测定中使用的试剂，该测定用于同时、快速测量来自受试者的血液样品的脂蛋白中总胆固醇、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇中的至少两种，而没有所述脂蛋白的显著沉淀，所述试剂包含缓冲液、两亲剂、脂肪酶、氧化酶和着色剂。在实施方案中，申请人公开了用于在测定中使用的试剂，该测定用于同时、快速测量来自受试者的血液样品的脂蛋白中总胆固醇、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇中的至少两种，而没有所述脂蛋白的显著沉淀，所述试剂包含缓冲液、两亲剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶。

在实施方案中，试剂可以在试剂盒中提供；试剂盒可进一步包含说明书，该说明书是关于例如在胆固醇测定中，或在用于同时、快速测量来自受试者的血液样品的脂蛋白中总胆固醇、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇中的至少两种而没有所述脂蛋白的显著沉淀的测定中，或在另外一种测定或多种测定中，一种试剂(例如本文公开的组合物)的使用或多种试剂的使用。试剂盒中的试剂可以包含在容器中，且多种试剂可包含在多种容器中。

申请人在此公开了用于在测定中使用的包含试剂的试剂盒，所述测定用于同时、快速测量来自受试者的血液样品中TC、LDL-C和HDL-C中的至少两种，而没有所述脂蛋白的显著沉淀。在本文中公开的试剂盒的实施方案可包含第一容器和第二容器，第一容器含有包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液的第一试剂；第二容器含有包含缓冲液、两亲剂、脂肪酶、氧化酶和着色剂的第二试剂。在本文中公开的试剂盒的实施方案可包含第一容器和第二容器，第一容器含有包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液的第一试剂；第二容器含有包含缓冲液、两亲剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和着色剂的第二试剂。在实施方案中，着色剂可包含过氧化物酶、过氧化物酶的底物或两者。

在本文中公开的试剂盒的实施方案可包含第一容器、第二容器及其使用说明书，第一容器含有包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液的第一试剂；第二容器含有包含缓冲液、两亲剂、脂肪酶、氧化酶和着色剂的第二试剂。在实施方案中，这样的试剂盒包含第一容器、第二容器及其使用说明书，第一容器含有包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液的第一试剂；第二容器含有包含缓冲液、两亲剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和着色剂的第二试剂。在实施方案中，着色剂可包含过氧化物酶和过氧化物酶的底物。

在实施方案中，申请人公开了一种试剂盒，其包含试剂和关于所述试剂在胆固醇测定中的使用的说明书，所述试剂包含如本文公开的试剂。在实施方案中，申请人公开了试剂和关于所述试剂在胆固醇测定中的使用的说明书，所述试剂包含α-环糊精硫酸酯、硫酸葡聚糖、氯化镁、4-氨基安替比林和磷酸钠缓冲液，其中硫酸葡聚糖与镁离子之比为约0.002至约0.02。在实施方案中，申请人公开了一种试剂盒，其包含试剂和关于所述试剂在胆固醇测定中的使用的说明书，所述试剂包含磷酸钠缓冲液、Trition X-100、普朗尼克L64、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)、来自假单胞菌属的种的胆固醇酯酶和来自假单胞菌属的种的胆固醇氧化酶。

在实施方案中，申请人公开了一种试剂盒，其包含至少第一试剂和第二试剂，以及关于所述试剂在胆固醇测定中的使用的说明书，其中所述第一试剂包含如本文公开的试剂(例如，包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液的试剂)，而所述第二试剂包含如本文公开的试剂(例如，包含缓冲液、两亲剂、脂肪酶、氧化剂和着色剂的试剂)。在实施方案中，申请人公开了一种试剂盒，其包含至少第一试剂和第二试剂，以及关于所述试剂在胆固醇测定中的使用的说明书，其中所述第一试剂包含选自表面活性剂和带负电荷的α-环糊精衍生物的脂蛋白增溶剂；包含带负电荷的低分子量葡聚糖衍生物的脂蛋白相互作用物，和缓冲液；而所述第二试剂包含磷酸钠缓冲液、Trition X-100、普朗尼克L64、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)、来自假单胞菌属的种的胆固醇酯酶及来自假单胞菌属的种的胆固醇氧化酶。

在实施方案中，申请人公开了一种试剂盒，其包含至少第一试剂和第二试剂，以及关于所述试剂在胆固醇测定中的使用的说明书，其中所述第一试剂包含i)脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液，其中所述脂蛋白相互作用物以一定的浓度水平存在，该浓度水平以显著不同于LDL-胆固醇向可测量有色产物转化的速率和以显著不同于VLDL-胆固醇向可测量有色产物转化的速率提供HDL-胆固醇向可测有色产物的转化，或ii)α-环糊精硫酸酯、硫酸葡聚糖、氯化镁、4-氨基安替比林和磷酸钠缓冲液，其中硫酸葡聚糖与镁离子之比为约0.002至约0.02；而所述第二试剂a)包含缓冲液、两亲剂、脂肪酶、氧化酶和着色剂，或b)缓冲液、两亲剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶。

本文还公开了用于同时、快速测量来自受试者的血液样品中TC、LDL-C和HDL-C中的至少两种而没有所述脂蛋白的显著沉淀的方法。用于同时、快速测量来自受试者的血液样品中的TC、LDL-C和HDL-C而没有所述脂蛋白的显著沉淀的方法的实施方案包括以下步骤：在初始时间将所述血液样品的至少一部分与包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液的第一试剂组合以提供组合溶液；向所述组合溶液中添加包含缓冲液、两亲剂、脂肪酶、氧化酶和着色剂的第二试剂以提供有色溶液；以及在添加所述第二试剂之后的第一时间段内、第二时间段内及第三时间段内测量所述有色溶液的吸光度。

在这类方法的实施方案中，所述第一时间段包含所述初始时间之后少于约3分钟的时间段，且所述第三时间段包含所述初始时间之后大于约5分钟的时间段，其中所述初始时间包含将所述第二试剂添加至所述组合溶液时的时间。

在实施方案中，所述用于同时、快速测量来自受试者的血液样品中的TC、LDL-C和HDL-C而没有所述脂蛋白的显著沉淀的方法包括以下步骤：在初始时间将所述血液样品的至少一部分与包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液的第一试剂相组合以提供组合溶液；向所述组合溶液添加包含缓冲液、两亲剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和着色剂的第二试剂以提供有色溶液；以及在第一时间段内、第二时间段内和第三时间段内测量所述有色溶液的吸光度。

在这类方法的实施方案中，所述第一时间段包含所述初始时间之后少于约3分钟的时间段，且所述第三时间段包含所述初始时间之后大于约5分钟的时间段，其中所述初始时间包含将所述第二试剂添加至所述组合溶液的时间。

在本文公开的方法的实施方案中，所述第一时间段可包含所述初始时间之后约0分钟至约2分钟的时间段，所述第二时间段可包含所述初始时间之后约2分钟至约6分钟的时间段，且所述第三时间段可包含约6分钟至约10分钟或更长的时间段。在实施方案中，所述第三时间段包含开放式时间段，所述开放式时间段包含所述初始时间之后约5分钟或约6分钟之后的任何时间。在实施方案中，所述初始时间是将所述第二试剂添加至所述溶液时的时间。

可以理解，还可以使用其他的时间或时间段，例如当脂肪酶或氧化酶或两者的量降低时可以使用更长的时间和时间段。还可以理解，例如当脂肪酶或氧化酶或两者的量升高时可以使用更短的时间和时间段。类似地，当脂蛋白增溶剂和/或脂蛋白相互作用物的量改变时还可使用其他的时间和时间段。因此，在本文公开的方法的进一步实施方案中，所述时间段可比以上讨论的时间段更长；例如，试剂和方法可这样配置，其中所述第一时间段可包含所述初试时间之后约0分钟至约10分钟的时间段，所述第二时间段可包含所述初始时间之后约10分钟至约20分钟或约30分钟的时间段，而所述第三时间段可包含约20分钟至约40分钟或约30分钟至约60分钟或更长的时间段。在本文公开的方法的又进一步的实施方案中，所述时间段可以比上述讨论的时间段更短；例如，试剂和方法可以这样配置，其中所述第一时间段可包含所述初始时间之后约0分钟至约1分钟的时间段，所述第二时间段可包含所述初始时间之后约1分钟至约4分钟或至约5分钟的时间段，而所述第三时间段可包含约4分钟至约8分钟或约5分钟至约9分钟的时间段。

在实施方案中，测量吸光度的步骤可包括使用分光光度计测量吸光度。测量吸光度的步骤通常会包括使用分光光度计在或接近特定频率处测量吸光度。在实施方案中，测量吸光度的步骤可包括在或接近约560纳米(nm)波长处测量吸光度。在实施方案中，测量吸光度的步骤可进一步包括使用分光光度计测量在或接近第一波长处的吸光度与在或接近第二波长处的吸光度的差；这种在两个波长处测得的吸光度的差可称作“ΔA”。例如，这两个波长可以是约560nm和约700nm。在实施方案中，测量吸光度的步骤可进一步包括使用分光光度计在约560nm波长处和约700nm波长处测量吸光度，以有效获得约560nm和约700nm之间吸光度的差。可以理解，对于某些着色剂，可能使用其他的波长和其他的波长间隔；例如，具有在约400nm和约700nm之间的波长处可检测到的发色过氧化物酶底物。

这样的吸光度测量可在特定的时间或在两个特定时间或在三个或更多个特定时间进行，其中特定时间相对于初始时间来定义。在特定时间的测量可包括在一系列时间过程中，例如初始时间之后0至约2分钟或初始时间之后约2分钟至约6分钟或初始时间之后约6分钟至约10分钟或在其他时间和/或其他时间段进行的测量。

在实施方案中，测量吸光度的步骤可包括使用分光光度计在两个时间测量吸光度，并记录或计算在所述两个时间进行的测量之间的差。在实施方案中，吸光度可以是作为在两个波长处测得的吸光度的差而测量的ΔA，且可记录和计算在第一时间测得的ΔA和在第二时间测得的ΔA的差；这种在两个时间测得的ΔA之间的差被称作“ΔA_t”。例如，ΔA_t可以通过测量作为在560nm处和在700nm处测得的吸光度之间的差的ΔA来测量，其中ΔA的测量是在初始时间之后约2分钟时和初始时间之后约6分钟时进行的，其中ΔA_t是两个ΔA测量值之间的差。在进一步的实施方案中，ΔA_t可以通过测量作为在560nm处和在700nm处测得的吸光度之间的差的ΔA来测量，其中ΔA测量是在初始时间和在初始时间之后约2分钟时进行的，其中ΔA_t是两个ΔA测量值之间的差。在进一步的实施方案中，ΔA_t可以通过测量作为在560nm处和在700nm处测得的吸光度的差的ΔA来测量，其中ΔA的测量是在初始时间之后约6分钟时和初始时间之后约10分钟时进行的，其中ΔA_t是两个ΔA测量值之间的差。在进一步的实施方案中，其中ΔA测量是在特定时间之后进行的，可以理解诸如“约5分钟之后”、“约10分钟之后”、“在大于约5分钟的时间段”、“在大于约10分钟的时间段”等词语可在规定时间之后的任何时间和其后的合理时间之间被测量。在实施方案中，这种用于测量的时间段可以不在时间上延长超过初始时间之后约30分钟或超过约20分钟。

在实施方案中，第一试剂可包含脂蛋白增溶剂、脂蛋白相互作用物和缓冲液。在实施方案中，脂蛋白增溶剂可包含表面活性剂。在实施方案中，脂蛋白相互作用物可包含葡聚糖(如葡聚糖衍生物，诸如磺化或磷酸化的葡聚糖)、环糊精(如环糊精衍生物，诸如磺化或甲基化的环糊精)、带负电荷的天然产物如肝素或其组合。在实施方案中，脂蛋白相互作用物可包含带负电荷的低分子量葡聚糖酯，例如低分子量硫酸葡聚糖。在实施方案中，脂蛋白相互作用物可包含α-环糊精衍生物，如α-环糊精硫酸酯。在实施方案中，第一试剂可包含过氧化物酶底物。在实施方案中，过氧化物酶底物可包含氨基安替比林化合物，如4-氨基安替比林，和含苯胺化合物，如ALPS。在进一步的实施方案中，第一试剂可包含α-环糊精硫酸酯、硫酸葡聚糖、氯化镁、4-氨基安替比林、ALPS和缓冲液，例如磷酸盐缓冲液(例如Na_xPO₄，其中Na_xPO₄是磷酸钠盐；例如可以是NaH₂PO₄、Na₂HPO₄或Na₃PO₄)，用来缓冲pH至约pH 6至约pH 8。例如，在实施方案中，第一试剂可包含α-环糊精硫酸酯(1mM)、硫酸葡聚糖(20μM)、氯化镁(4mM)、4-氨基安替比林(2.25mM)、3mM ALPS和Na_xPO₄(100mM)，pH约7。

在实施方案中，过氧化物酶底物的组分可以分离为不同的试剂。过氧化物酶底物组分分离为不同的试剂对于所述试剂中的一种或两种的稳定性可能是期望的，或者对于降低或防止所述试剂中的一种或两种的降解可能是有用的。因此，在实施方案中，第一试剂可包括安替比林化合物，而第二试剂可包括含苯胺化合物。在进一步的实施方案中，第一试剂可包含4-氨基安替比林，而第二试剂可包含N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)。在进一步的实施方案中，第一试剂可包含约1mM至约5mM的4-氨基安替比林，而第二试剂可包含约0.5mM至约20mM的ALPS。例如，第一试剂可包含2.25mM 4-氨基安替比林而第二试剂可包含3mM APLS。

在实施方案中，过氧化物酶底物的组分可以包含在单一的试剂中。在单一试剂中包含多种组分对于简化生产或易于使用或其他原因可能是期望的。例如，含有过氧化物酶底物的所有组分的试剂可包含氨基安替比林化合物和含苯胺化合物。在进一步的实施方案中，含有过氧化物酶底物的所有组分的试剂可包含4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)。在进一步的实施方案中，含有过氧化物酶底物的所有组分的试剂可包含约1mM至约5mM的4-氨基安替比林和约0.5mM至约20mM的ALPS。例如，含有过氧化物酶底物的所有组分的试剂可包含2.25mM 4-氨基安替比林和3mM ALPS。在其他实施方案中，可将试剂干燥以便增加稳定性。可将试剂冻干或作为玻璃状膜，例如可粘附至容器壁的膜而提供。当这类试剂干燥时，可对其进行配制以便在加入水或另一种水性溶剂如缓冲溶液时迅速溶解(例如，在数秒至数分钟内)。

在本文公开的方法的实施方案中，第二试剂可包含脂肪酶、氧化酶和着色剂。在所述第二试剂的实施方案中，脂肪酶可包含胆固醇酯酶，氧化酶可包含胆固醇氧化酶，而着色剂可包含过氧化物酶。在本文公开的方法的实施方案中，第二试剂可包含缓冲液、两亲剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和着色剂。在本文公开的方法的实施方案中，两亲剂可包含表面活性剂。在实施方案中，着色剂可包含过氧化物酶、过氧化物酶底物且可包含过氧化物酶和过氧化物酶底物两者。例如，过氧化物酶可包含来自辣根(Armoracia rusticana)的过氧化物酶(HRP)。过氧化物酶底物可包含含苯胺化合物、氨基安替比林化合物或两者。在实施方案中，着色剂可包含氨基安替比林化合物，如4-氨基安替比林。在实施方案中，着色剂可包含N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)。在本文公开的方法的实施方案中，第二试剂可包含细菌胆固醇酯酶，如来自假单胞菌属细菌的胆固醇酯酶，且在实施方案中可包含细菌胆固醇氧化酶，如来自假单胞菌属细菌的细菌胆固醇氧化酶。在本文公开的方法的实施方案中，第二试剂可包含缓冲液，如磷酸盐缓冲液(例如Na_xPO₄(50mM))、Trition X-100(0.06％)、普朗尼克L64(3g/L)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)(3mM)、来自假单胞菌属的种的胆固醇酯酶(750U/L)和来自假单胞菌属的种的胆固醇氧化酶(1.5kU/L)。

在实施方案中，如在本文中公开的组合物可包含α-环糊精硫酸酯、硫酸葡聚糖、氯化镁、过氧化物酶底物(例如二氨基联苯胺或4-氨基安替比林和ALPS)、胆固醇酯酶(例如来自假单胞菌属的种的胆固醇酯酶)、胆固醇氧化酶(例如来自假单胞菌属的种的胆固醇氧化酶)、表面活性剂和缓冲液。在实施方案中，如在本文中公开的组合物可包含第一试剂和第二试剂。在实施方案中，如在本文中公开的组合物可包含第一试剂、第二试剂和来自受试者的血液样品的至少一部分。

例如，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液(例如Na_xPO₄，其中Na_xPO₄是磷酸钠盐；例如可以是NaH₂PO₄、Na₂HPO₄或Na₃PO₄)，其用于缓冲pH至约pH 5至约pH 9或约pH 6至约pH 8，任选地约pH 6.8至约pH 7.8，例如pH 7.4。在实施方案中，如在本文中公开的组合物可包含约100U/L至约2000U/L的来自假单胞菌属的种的胆固醇酯酶(例如约750U/L)，且可包含约100U/L至约3000U/L的来自假单胞菌属的种的胆固氧化酶(例如约1.5kU/L)。

在实施方案中，例如，过氧化物酶底物可包含约1mM至约5mM的4-氨基安替比林和约0.5mM至约20mM的ALPS，例如约2.25mM 4-氨基安替比林和约3mM ALPS。在实施方案中，表面活性剂可以是例如Triton X-100和/或普朗尼克L64，例如，所述组合物可包含约0.01％至约1％Triton X-100且可包含约1g/L至约10g/L普朗尼克L64；在特定的实施方案中，所述组合物可包含约0.06％Triton X-100和约3g/L普朗尼克L64。

在本文公开的方法的实施方案中，在第一时间段内的测量可用于测定所述样品中的HDL-胆固醇。在本文公开的方法的实施方案中，在第二时间段内的测量可用于测定所述样品中的LDL-胆固醇。在本文公开的方法的实施方案中，在第三时间段内的测量可用于测定所述样品中的总胆固醇。在本文公开的方法的实施方案中，测量可包括使用分光光度计测量吸光度。在本文公开的方法的实施方案中，测量可包括使用分光光度计测量ΔA(其中ΔA是在第一波长处和第二波长处测得的吸光度之间的差)。在本文公开的方法的实施方案中，测量可包括使用分光光度计测量ΔA_t(其中ΔA_t是在第一时间测得的吸光度与在第二时间测得的吸光度之间的差)。用于测量ΔA_t的吸光度测量可以是ΔA测量。

在本文公开的方法的实施方案中，分析从受试者血液样品中获得的胆固醇测量数据的方法可包括以下步骤：在第一时间段内、在第二时间段内和在第三时间段内测量来自胆固醇亚部分与包含脂肪酶和氧化酶的试剂混合物之间反应的产物形成，以提供胆固醇测量数据；其中从在所述第二时间段内获得的所述胆固醇测量数据获得低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)测量值；其中从在所述第三时间段内获得的所述胆固醇测量数据获得总胆固醇(TC)测量值；且其中由在所述第二时间段内获得的所述胆固醇测量数据加上在所述第一时间段内测得的产物形成速率获得高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)测量值；由此，分析从受试者血液样品获得的所述胆固醇测量数据。

在分析从本文公开的受试者血液样品中获得的胆固醇测量数据的方法的特定实施方案中，所述脂肪酶可包含胆固醇酯酶，而所述氧化酶可包含胆固醇氧化酶。例如，在本文公开的方法的实施方案中，分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的方法可包括以下步骤：在第一时间段内、第二时间段内和第三时间段内测量来自胆固醇亚部分与包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的试剂混合物之间反应的产物形成，以提供胆固醇测量数据；其中从在所述第二时间段内获得的所述胆固醇测量数据获得LDL-C测量值；其中从在所述第三时间段内获得的所述胆固醇测量数据获得TC测量值；且其中从在所述第二时间段内获得的所述胆固醇测量数据加上在所述第一时间段内测得的产物形成速率获得HDL-C测量值；由此，分析了从受试者血液样品获得的所述胆固醇测量数据。

分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的方法的实施方案可包括以下步骤，其中所述第一时间段可包含初始时间之后少于约3分钟，其中所述初始时间包含将第二试剂添加至组合溶液的时间，且其中组合溶液可包含第一试剂和血液样品的至少一部分。在实施方案中，分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的方法可包括以下步骤，其中第三时间段包含初始时间之后大于约5分钟的时间段，其中所述初始时间包含将第二试剂添加至组合溶液的时间。在实施方案中，所述第一时间段包含所述初始时间之后约0分钟至约2分钟的时间段，所述第二时间段包含所述初始时间之后约2分钟至约6分钟的时间段，而所述第三时间段包含约6分钟至约10分钟或更长的时间段。在实施方案中，所述第三时间段可包含开放式的时间段，其有效包括所述初始时间之后大于约5分钟或所述初始时间之后大于约6分钟的任何时间。

在实施方案中，测量产物形成的步骤包括测量吸光度。在实施方案中，测量吸光度的步骤包括使用分光光度计测量ΔA。在进一步的实施方案中，使用分光光度计测量吸光度的步骤包括在第一波长处测量吸光度和在第二波长处测量吸光度以获得ΔA测量值，其中ΔA是在第一波长处和在第二波长处测得的吸光度之间的差。在实施方案中，使用分光光度计测量ΔA的步骤包括在约300nm和约700nm之间的波长处和在约600nm和约900nm之间的波长处测量ΔA。在更特定的实施方案中，使用分光光度计测量ΔA的步骤包括在约560nm的波长处和在约700nm的波长处测量ΔA。

在至少一些实施方案中，本文公开的方法包括分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法，其中HDL-C测量值是根据下式由在第二时间段内获得的所述胆固醇测量数据加上在第一时间段内测得的产物形成速率获得的：

K₁-K₂x(LDL-C)+K₃x R₁

其中K₁是常数，它的值可以为约0至约250；

其中K₂是常数，它的值可以为约0至约100；

其中LDL-C的量可以由在所述第二时间段开始和所述第二时间段结束之间测得的吸光度的差来确定；

其中K₃是常数，它的值可以为约1至约20,000；且其中R₁可以由在所述第一时间段开始和所述第一时间段结束之间测得的吸光度的差来确定，且其中所述时间段可相对于初始时间确定，其中所述初始时间段包含将第二试剂添加至包含第一试剂及所述血液样品至少一部分的组合溶液的时间。

在实施方案中，K₁的值可以为约0至约100或约0至约50。在实施方案中，K₂的值可以为约0至约50或约0至约25。在实施方案中，K₃的值可以为约0至约10,000或约0至约5,000。在进一步的实施方案中，K₁的值可以为约0至约25或约0至约10。在进一步的实施方案中，K₂的值可以为约0至约5或约0至约2。

在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，第一时间段可包含初始时间之后约0分钟至约2分钟的时间段。在实施方案中，第二时间段可包含初始时间之后约2分钟至约6分钟的时间段。在实施方案中，第三时间段可包含初始时间之后约6分钟至约10分钟或更长的时间段。在实施方案中，所述第三时间段可包含开放式的时间段，其有效包括所述初始时间之后大于约5分钟或所述初始时间之后大于约6分钟的任何时间。

在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，K₁可具有约0至约3的值。在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，K₂可具有约0至约1的值。在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，K₃可具有约800至约1,800的值。在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，K₁可具有约1.30的值。在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，K₂可具有约0.446的值。在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，K₃可具有约1255的值。

在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，胆固醇测量数据可包含来自吸光度测量的数据。在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，吸光度测量可包含使用分光光度计进行的吸光度测量。在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，使用分光光度计的吸光度测量可包含ΔA测量，其中ΔA测量包含在第一波长处进行的吸光度测量和在第二波长处进行的吸光度测量，其有效获得在所述第一波长处与在所述第二波长处的吸光度的差。在分析从受试者血液样品获得的胆固醇测量数据的进一步方法的实施方案中，使用分光光度计的ΔA测量可包含在约560nm的波长处与在约700nm的波长处的吸光度测量。

申请人在此进一步公开了用于测量在来自受试者的血液样品至少一部分中的总胆固醇或胆固醇亚部分的装置。在实施方案中，用于测量在来自受试者的血液样品至少一部分中的总胆固醇或胆固醇亚部分的装置可包含：用于组合第一试剂与来自受试者的血液样品的至少一部分以有效提供组合溶液的器件(means)；用于组合第二试剂与所述组合溶液以提供有色溶液的器件；用于测量所述有色溶液的光学性质的器件；和用于显示或报告所述有色溶液的所述光学性质的所述测量的结果的器件。在进一步的实施方案中，用于测量在来自受试者的血液样品至少一部分中的总胆固醇或胆固醇亚部分的装置可包含：用于组合第一试剂与来自受试者的血液样品的至少一部分以有效提供组合溶液的室；用于组合第二试剂与所述组合溶液以提供有色溶液的管；用于测量所述有色溶液的光学性质的光学检测器；和用于报告所述有色溶液的所述光学性质的所述测量的结果的显示元件或通信链路。在实施方案中，显示元件和/或通信链路可以是适合双向通信的。

申请人在此公开了用于测量来自受试者的血液样品至少一部分中的总胆固醇或胆固醇亚部分的系统。在实施方案中，用于测量来自受试者的血液样品至少一部分中的总胆固醇或胆固醇亚部分的系统包含如在本文中公开的装置和用于将信息从所述装置通信至计算机、计算机网络、电话、电话网络或配置为显示从所述装置通信的信息的器件。可以理解，用于通信信息的器件可包括用于单向通信的器件且可包括用于双向通信的器件，并且可包括用于与多个地点或实体通信的器件。在实施方案中，用于测量来自受试者的血液样品至少一部分中的总胆固醇或胆固醇亚部分的系统包含如在本文中公开的装置及用于将信息从所述装置通信至计算机的信道，其中所述信道选自计算机网络、电话网络、金属通信链路、光学通信链路和无线通信链路。可以理解，用于通信信息的信道可以是单向通信信道且可以是双向通信信道，并且可以包括用于与多个地点或实体通信的信道。

在实施方案中，甘油三酯水平可通过其中使血液样品与脂肪酶接触以提供来自血液样品中TG的脂肪酸和甘油的方法来确定。这种甘油可与激酶如甘油激酶接触，以提供磷酸甘油，磷酸甘油可与氧化酶如甘油3-磷酸氧化酶接触，以提供二羟基丙酮磷酸和过氧化氢。在过氧化氢的存在下，着色剂如4-氨基安替比林和N-乙基-(磺丙基苯胺)可与辣根过氧化物酶接触以有效形成染料如醌亚胺染料，醌亚胺染料的测量提供了对血液样品中TG水平的测量。这样的染料可通过分光光度法测量；例如，这样的染料和TG水平可通过测量在一定波长(例如560纳米(nm))处或在波长范围内(例如555nm至565nm)的吸光度来测量。

VLDL-C可通过将样品中TG的浓度除以5由TG测量值来估算：VLDL-C＝TG/5

以便提供血液样品中VLDL-C水平的值，该血液样品中TG已经测量。以这种方式估算的VLDL-C水平可通过增加HDL-C、LDL-C和VLDL-C的水平(如根据公式VLDL-C＝TG/5估算的)进一步用于计算血液样品中的TC。

然而，代替这种估算，申请人在此公开了基于本文公开的新颖且有用的HDL-C、LDL-C、TC和TG测量计算VLDL-C的进一步方法。这些进一步的方法被认为提供了比现有方法更高的准确度。在实施方案中，VLDL-C可由HDL-C、TC和TG测量值来计算，其中这些测量根据本文公开的方法进行。在实施方案中，VLDL-C可由HDL-C、LDL-C、TC和TG测量值来计算，其中这些测量根据本文公开的方法进行。

在实施方案中，例如，受试者血液的单一样品或样品的单一部分中的VLDL-C水平可通过下列关系式由HDL-C、TC和TG测量值计算：

VLDL-C＝αTC+βHDL-C+δTG+a₁(TG+ε)(TC+κ)+λ

其中α、β、δ和a₁分别是乘以TC、HDL-C、TG和(TG+ε)(TC+κ)的常数；且其中ε、κ和λ分别是与TG、TC和所有其他因数之和相加的加常数。项“(TG+ε)(TC+κ)”可被称为“交叉项”，其中一个括号内的项乘以另一括号内的项。乘常数α、β、δ和a₁与加常数ε、κ和λ可以取任意值，无论是正、负或零。

在实施方案中，例如，受试者血液的单一样品或样品的单一部分中的VLDC-C水平可通过下列关系式由HDL-C、LDL-C、TC和TG测量值计算：

VLDL-C＝αTC+βHDL-C+γLDL-C+δTG+a₁(TG+ε)(TC+κ)+λ

其中α、β、γ、δ和a₁分别是乘以TC、HDL-C、LDL-C、TG和(TG+ε)(TC+κ)的常数；且其中ε、κ和λ分别是与TG、TC和所有其他因数之和相加的加常数。乘常数α、β、γ、δ和a₁与加常数ε、κ和λ可以取任意值，无论是正、负或零。如上所述并如本文别处所用，项“(TG+ε)(TC+κ)”和类似项可被称为“交叉项”，其中一个括号内的项乘以另一括号内的项。

可以理解，在实施方案中，所有可能的交叉项和所有可能的交叉项的组合可包含在用于计算VLDL-C的关系式中。因此，例如，除了和/或代替交叉项(TG+ε)(TC+κ)，任何或所有以下交叉项可包含在用于计算VLDL-C的关系式中：(TG+ε)(HDL-C+μ)；(TG+ε)(LDL-C+ν)；(TC+κ)(HDL-C+μ)；(TC+κ)(LDL-C+ν)和(LDL-C+ν)(HDL-C+μ)，其中加常数λ、ε、κ、μ和ν可取任意值，无论是正、负或零。

因此，在实施方案中，VLDL-C可以由测量的量如下计算：

VLDL-C＝αTC+βHDL-C+γLDL-C+δTG+λ+a₁(TG+ε)(TC+κ)+a₂(TG+ε)(HDL-C+μ)+a₃(TG+ε)(LDL-C+ν)+a₄(TC+κ)(HDL-C+μ)+a₅(TC+κ)(LDL-C+ν)+a₆(LDL-C+ν)(HDL-C+μ)

其中乘系数α、β、γ、δ、a₁、a₂、a₃、a₄、a₅和a₆可取任意值，无论是正、负或零；且

其中加常数λ、ε、κ、μ和ν可取任意值，无论是正、负或零。

在进一步的实施方案中，在受试者血液的单一样品或样品的单一部分中的VLDL-C水平可使用部分或全部的TC、TG、HDL-C和LDL-C测量值以及在形式上与以上提供的关系式类似的乘常数和加常数由其他关系式来计算。

申请人在此进一步公开了用于在一个装置中测量样品的至少两种生物学相关属性的方法、装置和系统。在实施方案中，样品的生物学相关属性非限制性地包括：脂蛋白水平，包括TC、HDL-C、LDL-C和VLDL-C；血液甘油三酯(TG)水平；血液血细胞比容；血液铁含量；红细胞沉降率(ESR)；细胞计数测量(例如存在和/或量的测定，包括一个细胞类型或多个细胞类型的分数量或绝对量)，包括样品中的细胞、细胞数目、细胞类型和细胞性质的基于抗体、基于染料、流式细胞计数、成像和其他的测量；化学测量，包括pH，盐浓度(例如构成盐的阳离子和/或阴离子的)，维生素、蛋白质、蛋白质或小分子的代谢物的存在和/或浓度，医学状况的指示性标记的测量，和血液、尿、组织或其他生物样品的其他测量。样品的至少两种生物学相关属性的测量可同时进行或可连续进行，或者，在进行样品的生物学相关属性的至少三个测量时，一些测量可以同时进行而样品的生物学相关属性的其他测量可在同时进行的测量之前或之后进行。

在实施方案中，一个或多个这样的测量可以是快速测量，其中快速测量是这样的测量，其可以在约一小时的时间段内进行；或可在约半小时的时间段内进行；或可在约十五分钟的时间段内进行；或可在约十分钟的时间段内进行；或可在约5分钟的时间段内进行；或可在约4分钟的时间段内进行；或可在约3分钟的时间段内进行；或可在约2分钟的时间段内进行；或可在约1分钟的时间段内进行；或可在约30秒的时间段内进行；或可在约15秒的时间段内进行；或可在约10秒的时间段内进行；或可在约5秒的时间段内进行；或可在约1秒的时间段内进行。

在实施方案中，一个或多个这样的测量可使用小体积血液样品或仅仅用血液样品的小体积部分来进行，其中小体积血液样品和血液样品的小体积部分包含不超过约5mL；或包含不超过约3mL；或包含不超过约1mL；或包含不超过约250μL；或包含不超过约100μL；或包含不超过约50μL；或包含不超过约25μL；或包含不超过约20μL；或包含不超过约15μL；或包含不超过约10μL；或包含不超过约5μL；或包含不超过约1μL；或包含其他小体积，例如，如本文所述。

本文公开的测定和方法可在用于处理样品的装置上或系统上进行。本文公开的测定和方法可容易地并入并用在自动化测定装置和自动化测定系统中。例如，如本文公开的系统可包含用于传输或接收基于待检测分析物(例如总胆固醇(TC)、胆固醇亚部分(例如LDL、HDL、VLDL等)、甘油三酯(TG)或其他分析物)或基于其他待通过所述装置或系统检测的分析物的方案的通信组件。在实施方案中，测定方案可根据由装置实施的多个测定的最优时序安排而改变，或者可根据先前从来自受试者的样品获得的结果或可根据先前从来自受试者的不同样品获得的结果而改变。在实施方案中，通信组件可包含用于将信息从所述装置通信至计算机的信道，其中所述信道选自计算机网络、电话网络、金属通信链路、光学通信链路和无线通信链路。在实施方案中，本文公开的系统可将信号传输至中央位置或至最终用户，且可包含用于传输这类信号的通信组件。如本文公开的系统可配置用于按照需要或定期更新方案。

因此，申请人公开了配置为按照本文公开的方法测量血液样品中的TC或胆固醇亚部分、TG及其组合的装置。配置为按照本文公开的方法测量血液样品中的TC、胆固醇亚部分、TG和其他脂质部分以及分析物的装置可配置为测定来自血液样品的TC、胆固醇亚部分、TG和其他脂质部分以及分析物，该血液样品包含不超过约1000μL的血液，或不超过约500μL的血液，或不超过约250μL的血液，或不超过约150μL的血液，或不超过约100μL的血液，或不超过约50μL的血液，或者，在一些实施方案中，其中所述血液样品包含不超过约25μL的血液，或其中所述血液样品包含不超过约10μL的血液，或其中所述血液样品包含少于约10μL的血液。这类装置可配置为，在少于约一个小时内，或者，在一些实施方案中，在少于约40分钟内，或在少于约30分钟内，测量血液样品中的TC、胆固醇亚部分、TG和其他脂质部分及分析物。

在本文中公开的装置可配置为实施用于测量TC、胆固醇亚部分、TG和其他脂质部分及分析物的测定且还实施用于测量血液样品中的其他分析物的测定。在本文中公开的装置可配置为实施用于测量TC、胆固醇亚部分、TG和其他脂质部分及分析物的测定且还实施包含测量血液样品中的血细胞形态特征的测定。在本文中公开的装置可配置为实施用于测量TC、胆固醇亚部分、TG和其他脂质部分及分析物的测定且还实施包含测量其他血液分析物(例如维生素、激素、药物或药物代谢物或其他分析物)的测定。这类装置可以这样配置，其中由所述装置实施的测定或测定的实施顺序可通过与另外的装置之间通信而改变。

申请人还公开了包含本文公开的装置的系统。在实施方案中，该系统包含配置为实施用于测量TC、胆固醇亚部分、TG和其他脂质部分及分析物的测定且还实施用于测量血液样品中的其他分析物的测定的装置。在实施方案中，该系统包含配置为实施用于测量TC、胆固醇亚部分、TG和其他脂质部分及分析物的测定且还实施用于测量血液样品中血细胞的形态特征的测定的装置。在这种系统的实施方案中，由所述装置实施的测定或测定的实施顺序可通过与另外的装置之间通信而改变。

在本文公开的装置和系统的实施方案中，装置可包含用于测量a)来自受试者的血液样品的至少一部分中的TC或胆固醇亚部分，和b)来自受试者的所述血液样品的其他分析物或属性的装置。在实施方案中，所述其他的分析物或属性可包括TG并可包括TG和血液的进一步的分析物或属性。在实施方案中，所述其他分析物或属性可对来自受试者的血液样品的部分进行测量，该部分不同于用于测量TC或胆固醇亚部分的部分。在实施方案中，所述其他分析物或属性可对来自受试者的血液样品的部分进行测量，该部分与用于测量TC或胆固醇亚部分的部分相同。在实施方案中，用于测量a)来自受试者的血液样品至少一部分中的TC或胆固醇亚部分和b)来自受试者的所述血液样品的其他分析物或属性的装置可包含：用于组合第一试剂与来自受试者的血液样品的至少一部分以有效提供组合溶液的器件；用于组合第二试剂与所述组合溶液以提供有色溶液的器件；用于测量所述有色溶液的光学性质的器件；用于显示或报告所述有色溶液的所述光学性质的所述测量的结果的器件；和用于测量来自受试者的所述血液样品的其他属性的器件。在实施方案中，所述其他属性可包括TG且可包括TG和血液的其他属性。在实施方案中，用于测量a)来自受试者的血液样品至少一部分中的TC或胆固醇亚部分和b)来自受试者的所述血液样品的其他属性两者的装置可配置为且能够对样品如血液样品进行任何两种或更多种多个测量。在用于测量a)来自受试者的血液样品至少一部分中的TC或胆固醇亚部分和b)来自受试者的所述血液样品的其他属性两者的装置的实施方案中，所述测量可以是可选择的，有效使得部分或全部多个测量被选择用于第一样品的测量，且部分或全部所述多个测量的不同选择可被选择以用于将对第二样品进行的测量。在实施方案中，所述其他属性可包括TG且可包括TG和血液的其他属性。

在进一步的实施方案中，用于测量a)来自受试者的血液样品至少一部分中的TC或胆固醇亚部分和b)来自受试者的所述血液样品的其他属性的装置可包含：用于组合第一试剂与来自受试者的血液样品的至少一部分以有效提供组合溶液的室；用于组合第二试剂与所述组合溶液以提供有色溶液的管；用于测量所述有色溶液的光学性质的光学检测器；离心机；和用于报告所述有色溶液的所述光学性质的所述测量的结果的显示元件或通信链路。在实施方案中，所述其他分析物或属性可包括TG且可包括TG和血液的其他分析物或属性。在这种装置的实施方案中，所述装置可配置用于且能够对样品进行任何两种或更多种多个测量。在这种装置的实施方案中，所述测量可以是可选择的，有效使得部分或全部多个测量被选择用于第一样品的测量，且部分或全部所述多个测量的不同选择可以被选择以用于将对第二样品进行的测量。

用于测量在血液样品的至少一部分中的总胆固醇或胆固醇亚部分和来自受试者的所述血液样品的其他生物学相关属性的系统可包含装置，该装置用于测量a)在来自受试者的血液样品至少一部分中的TC或胆固醇亚部分和b)来自受试者的所述血液样品的其他分析物或属性。在实施方案中，所述其他分析物或属性可包括TG，且可包括TG和血液的其他分析物或属性。在实施方案中，这种系统包含用于测量如在本文中公开的a)和b)的装置以及用于将信息从所述装置通信至计算机、计算机网络、电话、电话网络或配置为显示从所述装置通信的信息的装置的器件。在实施方案中，用于测量a)在来自受试者的血液样品至少一部分中的TC或胆固醇亚部分和b)来自所述受试者的所述血液样品的其他分析物或属性的系统包含如在本文中公开的装置和用于将信息从所述装置通信至计算机的信道，其中所述信道选自计算机网络、电话网络、金属通信链路、光学通信链路和无线通信链路。如在本文中公开的系统可包含配置用于且能够对所述样品进行任何两种或更多种多个测量的装置。在包含这种装置的系统的实施方案中，所述测量可以是可选择的，其有效使得部分或全部多个测量被选择用于第一样品的测量，且部分或全部所述多个测量的不同选择可被选择用于将对第二样品进行的测量。

用于测量在血液样品至少一部分中的总胆固醇或胆固醇亚部分和来自受试者的所述血液样品的其他生物学相关分析物或属性的系统的实施方案可包括在美国专利8,088,593或在2011年9月26日提交的美国申请No.13/244,947(均通过引用为所有目的完全并入本文)中公开的装置，且可包括如本文中公开的系统。例如，在本文中公开的系统可包括用于传输或接收基于待检测分析物或基于其他待通过所述装置或系统检测的分析物的方案的通信组件。例如，在实施方案中，测定方案可根据由装置实施的多个测定的最优时序安排而改变，或者可根据先前从来自受试者的样品获得的结果或可根据先前从来自受试者的不同样品获得的结果而改变。在实施方案中，通信组件可包含用于将信息从所述装置通信至计算机的信道，其中所述信道选自计算机网络、电话网络、金属通信链路、光学通信链路和无线通信链路。在实施方案中，在本文中公开的系统可将信号传输至中央单元或至最终用户，且可包括用于传输这类信号的通信组件。在本文中公开的系统可配置用于按照需要或定期更新方案。

在本文中公开的测定、方法、试剂、试剂盒、装置和系统通过允许在单一测定中进行快速且廉价的胆固醇和胆固醇亚部分测量提供了相对于先前测定、方法、试剂、试剂盒和系统的优势。在本文中公开的方法和测定允许对同一血液样品或对血液样品的同一部分进行多种脂蛋白部分的测量；例如，可对同一血液样品或对血液样品的同一部分测量HDL-C、LDL-C和TC。这些测量在样品或样品部分中没有显著脂蛋白沉淀的情况下进行。在单一测定中提供所需测量简化了程序、降低了误差的可能性、降低了结果的可变性，且允许更快速和更廉价的程序。所公开的测定、方法、试剂、试剂盒和系统有效降低测定TC、HDL-C、LDL-C和其他胆固醇亚部分及血液脂蛋白组分(例如VLDL-C和TG)所需测定的数目。因此，在本文中公开的测定、方法、试剂、试剂盒、装置和系统提供了对所述技术的改进。

在本文中公开的方法和组合物提供了仅需要少量样品(例如仅少量血液)的快速测定。在本文中公开的装置和系统被配置为进行这类仅需要少量样品(例如仅少量血液)的快速测定。因此，所述方法、组合物、装置和系统提供了快速测定，其仅需要少量生物样品，并因此提供了相对于其他方法、组合物、测定、装置和系统在仅需少量生物样品和提供快速测定方面的进一步优势。

提供本发明内容以便以简化形式介绍概念的选择，其在以下具体实施方式中进行了进一步的描述。本发明内容并非旨在确定所要求保护的主题的关键特征或重要特征，也并非用于限制所要求保护的主题的范围。

附图说明

图1A显示了示例性的反应方案，其中胆固醇酯(例如，如在血液样品的脂蛋白中发现的)可与胆固醇酯酶反应形成胆固醇，该胆固醇可以与胆固醇氧化酶和氧反应形成过氧化氢。过氧化氢在辣根过氧化物酶和着色剂如氨基-安替比林(例如4-氨基安替比林)以及含苯胺化合物(例如N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)的存在下可反应形成有色产物(例如，如图所示的Trinder(例如醌亚胺)染料)。

图1B显示了示例性的反应方案，其中甘油三酯(例如，如在血液样品中发现的)可与脂肪酶反应形成甘油和脂肪酸。该甘油可以在三磷酸腺苷(ATP)的存在下被甘油激酶磷酸化，并且所得的磷酸甘油可被甘油-3-磷酸氧化酶氧化以提供二羟基丙酮磷酸和过氧化氢。过氧化氢在辣根过氧化物酶和着色剂如氨基-安替比林(例如4-氨基安替比林)以及含苯胺化合物(例如N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)的存在下形成有色产物(例如，如在图中所示的醌亚胺染料或Trinder染料)。

图2标绘出了在脂蛋白中发现的样品脂质，显示了沿垂直轴以毫克每分升(mg/dL)为单位的脂质值以及沿水平轴的总胆固醇(mg/dL)，其中脂质值和总胆固醇使用

Chemistry Systems试剂和方法(Siemens Healthcare Diagnostics,Inc.,Tarrytown,NY)来测量。

图3标绘出了示例性实验的测定动力学，其中含样品、试剂A和试剂B的溶液在560纳米(nm)波长处和在700nm波长处吸光度的差(“吸光度(A560-A700mm)”)通过分光光度计来测量。560nm波长处的吸光度通过测量550nm和570nm之间的吸光度来确定；700nm波长处的吸光度通过测量690nm和710nm之间的吸光度来确定。显示在水平轴上的时间是添加试剂B(试剂B的组成描述在表2中)之后的以分钟为单位的时间。

图4显示了使用来自在本文中公开的单一、示例性测定的动力学数据进行的LDL-C(4A)、HDL-C(4B)和TC(4C)测量，并标绘出了通过在本文中公开的测定(其中试剂A如表1中所述且试剂B如表2中所述)而确定的沿垂直轴(以mg/dL为单位)的报告的LDL-C、HDL-C和TC值以及通过使用Siemens Direct测定的硫酸葡聚糖测定而确定的LDL-C、HDL-C和TC值(单位mg/dL)。图4A和4C中接近(0,0)的初始点不代表实验数据，但是为了清楚起见并为拟合线提供定位点而被包含在分析和图中。图4A：LDL-C结果(显示在6分钟时测得的吸光度减去在2分钟时测得的吸光度的差)；图4B：HDL-C结果；图4C：TC结果，在10分钟时测得的吸光度。

图5显示使用试剂AT和试剂BT的示例性甘油三酯测定(如实施例3所述)的结果。使用本发明新方法获得的甘油三酯水平显示为图中每个菱形的Y轴值，并相对于使用现有技术方法进行的甘油三酯测量(每个菱形的X轴值)而作图。所述数据已用直线进行拟合，该直线具有接近1(0.9536)的斜率；最小二乘法拟合的R²值为0.9537。

图6显示了VLDL-C值的比较，其中从现有技术(超速离心)方法获得的VLDL-C值沿垂直轴标绘，且从基于如本文公开的HDL-C、TC和TG测量的计算获得VLDL-C值。R平方(R²)和其他指示拟合优度的值显示在图中。至于显示在图6中的测量结果，通过以下关系式最优地计算VLDL-C：

VLDL-C＝0.152x TC+0.15x TG-0.549x HDL-C+0.0015x(TG-192)x(TC-188)-2.62

(其中“x”表示乘以)。如图6所示，对于显示在图中的20个数据点，根据在本文中公开的方法，即通过以上方程式计算的VLDL-C值，与通过超速离心法获得的VLDL-C值非常好地符合(R平方为0.959)。

具体实施方式

申请人已经发现，可以使用动力学测量在胆固醇的单次测定中获得TC、LDL-C和HDL-C的非常准确和精确的值。本文公开的测定可使用脂肪酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶来形成可用分光光度法测量的有色产物。在本文公开的测定中，从所有含胆固醇的种类形成的颜色与转化的胆固醇的量成正比。

可以如本文所公开的那样使用的试剂、测定、方法、试剂盒、装置和系统实例的描述和公开可见于以下文献，例如，美国专利8,088,593；美国专利申请系列号13/244,947；美国申请系列号61/673,037；美国申请系列号61/673,245；美国申请系列号61/675,758；美国申请系列号61/675,811；美国申请系列号61/676,178；美国申请系列号61/697,797；美国申请系列号61/705,552；美国申请系列号61/706,753；和美国申请系列号61/735,424，所述专利和专利申请的公开内容在此通过引用而全文并入本文。

定义

在公开和描述本发明的制剂和使用方法之前，应当理解，本文使用的术语只以描述特定的实施方案为目的，并非意在限制。也应当理解，本公开内容提供解释性的和示例性的描述和实例，因此，除非另外表明，本文公开的测定、试剂、方法、装置和系统不限于本文描述的特定实施方案。

必须指出，如说明书和附加的权利要求书中使用的，除非上下文中明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示物。因此，例如，提及“一种表面活性剂”是指单种表面活性剂或不同表面活性剂的混合物，等等。

在该说明书和后面的权利要求书中，将会提到许多术语，这些术语将被定义为具有以下含义：

如本文使用的，术语“显著的”意为超过最低的或不显著的量；“显著地”意为超过最低地或不显著地。因此，例如，如本文使用的短语“显著不同”表示两个数值间的充分高的差异程度，以至于本领域技术人员将认为这两个值之间的差异在通过所述值测量的特性的背景中是统计学显著的。因此，彼此之间显著不同的两个值间的差，作为参考值或比较值的函数，通常大于约10％，且可以大于约20％，任选地大于约30％，任选地大于约40％，任选地大于约50％。

如本文使用的，术语“两性离子的”和“两极性的”各自是指具有相反极性的带电荷基团的分子。

如本文使用的，术语“两亲性的”是指同时具有疏水性和亲水性性质的一种化合物或多种化合物；通常，两亲性分子具有疏水性部分也具有亲水性部分。分子的疏水性部分可以是非极性部分，相对不溶于水的部分，如烃链部分。分子的亲水性部分可以是极性的，相对可溶于水的部分，并可包括能在水溶液中得到或失去电荷的酸或碱部分。表面活性剂通常是两亲性化合物。示例性的可商购的两亲性化合物包括Triton^TM表面活性剂、聚乙烯失水山梨醇如

化合物和泊洛沙姆(例如环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物)如

化合物。

如本文使用的，“表面活性剂”是有效降低液体如水的表面张力的化合物。表面活性剂通常是两亲性化合物，同时具有亲水和疏水的性质，并可有效帮助其他化合物的溶解。表面活性剂可以是，例如，亲水性表面活性剂、亲脂性表面活性剂或其他化合物，或其混合物。一些表面活性剂包含长链脂肪族碱或酸的盐，或亲水部分如糖。表面活性剂包括阴离子、阳离子、两性离子和非离子型化合物(其中术语“非离子型”是指在溶液中不电离的分子，即，是“电离”惰性的)。例如，在本文公开的试剂、测定、方法、试剂盒中有用的以及在装置和系统中使用的表面活性剂包括，例如，Tergitol^TM非离子型表面活性剂和Dowfax^TM阴离子型表面活性剂(DOW Chemical Company,Midland,Michigan 48642)；聚山梨醇酯(聚氧乙烯失水山梨醇)，例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，例如，作为

表面活性剂(ICI Americas,New Jersey,08807)销售的；泊洛沙姆(例如，环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物)如

化合物(BASF,Florham Park,N.J)；聚乙二醇及其衍生物，包括Triton^TM表面活性剂(例如Triton^TMX-100；Dow Chemical Company,Midland,Michigan 48642)和其他聚乙二醇，包括PEG-10月桂酸酯、PEG-12月桂酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32月桂酸酯、PEG-32二月桂酸酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG-15硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-25甘油三油酸酯、PEG-32二油酸酯、PEG-20甘油月桂酸酯、PEG-30甘油月桂酸酯、PEG-20甘油硬脂酸酯、PEG-20甘油油酸酯、PEG-30甘油油酸酯、PEG-30甘油月桂酸酯、PEG-40甘油月桂酸酯、PEG-40棕榈仁油、PEG-50氢化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸酯/辛酸甘油酯、PEG-8癸酸酯/辛酸甘油酯、聚甘油基-10-月桂酸酯、PEG-30胆固醇、PEG-25植物甾醇、PEG-30大豆甾醇、PEG-20三油酸酯、PEG-40失水山梨醇油酸酯、PEG-80失水山梨醇月桂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、POE-9月桂基醚、POE-23月桂基醚、POE-10油基醚、POE-20油基醚、POE-20硬脂基醚、生育酚PEG-100琥珀酸酯、PEG-24胆固醇、聚甘油-10油酸酯、蔗糖单硬脂酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、PEG10-100壬基酚系列、PEG15-100辛基酚系列和泊洛沙姆；聚氧化烯烷基醚如聚乙二醇烷基醚；聚氧化烯烷基酚如聚乙二醇烷基酚；聚氧化烯烷基酚脂肪酸酯如聚乙二醇脂肪酸单酯和聚乙二醇脂肪酸双酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧化烯失水山梨醇脂肪酸酯如聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯；磷酸胆碱如n-十二烷基磷酸胆碱(DDPC)；十二烷基硫酸钠(SDS)；n-月桂基肌氨酸；n-十二烷基-N,N-二甲胺-N-氧化物(LADO)；n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)；癸基麦芽糖苷(DM)、n-十二烷基-N,N-二甲胺-N-氧化物(LADO)；n-癸基-N,N-二甲胺-N-氧化物、1,2-二庚酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)；1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)；2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(MPC)；1-油酰-2-羟基-sn-甘油-3-[二氧磷基-RAC-(1-甘油)](LOPC)；1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-[磷酰-RAC-(1-甘油)](LLPG)；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)；n-辛基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐；n-癸基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐；n-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐；n-十六烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐；十四烷酰胺基丙基-二甲基铵基-丙磺酸盐；十六烷酰胺基丙基-二甲基铵基-丙磺酸盐；4-n-辛基苯甲酰胺基-丙基-二甲基铵基磺基甜菜碱；聚(马来酸酐-alt-1-十四烯),3-(二甲基氨基)-1-丙胺衍生物；壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP40)表面活性剂；烷基铵盐；夫西地酸盐；氨基酸、寡肽和多肽的脂肪酸衍生物；氨基酸、寡肽和多肽的甘油酯衍生物；卵磷脂类和氢化卵磷脂类，包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷酯酰丝氨酸；溶血卵磷脂和氢化溶血卵磷脂；磷脂及其衍生物；溶血磷脂及其衍生物，包括溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、PVP-磷脂酰乙醇胺；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸酯的盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸酯；单甘油酯和二甘油酯的单乙酰化和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化的单甘油酯和二甘油酯；单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯；脂肪酸的乳酸酯、硬脂酰-2-乳酸酯、硬脂酰乳酸酯、琥珀酰化单甘油酯、单/二甘油酯的单/二乙酰化酒石酸酯、单/二甘油酯的柠檬酸酯、胆酰肌氨酸(cholylsarcosine)、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、油酸酯、蓖麻酸酯、亚油酸酯、亚麻酸酯、硬脂酸酯、月桂基硫酸酯、十四烷基硫酸酯(teracecyl sulfate)、多库酯、月桂酰肉碱、棕榈酰肉碱、豆蔻酰肉碱及其盐和混合物；烷基麦芽糖苷、烷基硫代葡糖苷、月桂基聚乙二醇甘油酯；多元醇与由甘油脂类、植物油类、氢化植物油类、脂肪酸类和甾醇类组成的组中的至少一个成员的亲水性酯交换产物；聚氧化乙烯甾醇类、衍生物及其类似物；聚氧乙烯化维生素类及其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；及其混合物；脂肪醇类；甘油脂肪酸酯；乙酰化甘油脂肪酸酯；低级醇脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；失水山梨醇脂肪酸酯；聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯；甾醇类和甾醇衍生物；聚氧乙烯化甾醇类和甾醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；单甘油酯和二甘油酯的乳酸衍生物；多元醇与由甘油脂类、植物油类、氢化植物油类、脂肪酸类和甾醇类组成的组中的至少一个成员的疏水性酯交换产物；油溶性维生素类/维生素衍生物；及其组合。

如本文使用的，术语“增溶”是指使分子在溶液中溶解。

本文使用的术语“脂蛋白增溶剂”是指帮助将脂蛋白颗粒保持在溶液中的试剂。两亲性化合物如表面活性剂可适合在本文公开的试剂、测定、方法和试剂盒中以及在用于实施这类方法的装置和系统中用作脂蛋白增溶剂。

如本文使用的，“着色剂”是可用于改变溶液的光学性质或为溶液提供新的光学性质的化合物(其可单独或与其他化合物一起作用)。例如，着色剂可以是染料、发色团、发色化合物、化学发光化合物、荧光化合物、发荧光化合物(如Amplex red)、纳米颗粒如量子点，或其他改变溶液的光学性质的成分或化合物。例如，着色剂可作用，或可参与反应，以改变其所加入的溶液的光学性质，或在溶液中提供或产生发光、荧光或其他光学活性产物。溶液的光学性质可以是，例如，溶液的颜色；溶液对特定波长、波长范围或波长组合的光的吸光度；溶液的发光或荧光的量或峰值波长；溶液的浊度；或影响溶液对光的反射或吸收的溶液的任何其他性质。如本文使用的，术语“着色剂”还指可改变溶液的浊度或溶液的澄清度的化合物或反应结果。着色剂可作用，或可参与反应，以改变光通过着色剂所加入的溶液的吸光度。应当理解，“着色剂”可指一个分子或一类分子，或可指可一起作用来改变溶液的光学性质的一对分子或多类分子，或可指可一起作用来改变溶液的光学性质的多个分子或多类分子。

参与与其底物的反应以形成有色产物的过氧化物酶是着色剂，该过氧化物酶的底物同样是着色剂。例如，着色剂辣根过氧化物酶(HRP)参与与若干种分子中的任一种或多种的反应，该分子有效改变HRP所加入的溶液的光学性质(例如，通过改变溶液的颜色，光通过HRP所加入的溶液的吸光度，和/或溶液的其他光学性质)。例如，HRP可与含苯胺的化合物如N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)反应，或与氨基安替比林化合物如4-氨基安替比林或与酚类化合物反应。因此，例如，过氧化物酶(例如HRP、髓过氧化物酶或其他过氧化物酶)、含苯胺的化合物和氨基安替比林均可被称为“着色剂”。在进一步的实例中，HRP可与含联苯胺的化合物(如，与二氨基联苯胺(DAB)；四甲基联苯胺(TMB)；2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(DABS)；3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)；氢醌；邻联甲苯胺；邻苯二胺；邻氯苯酚；对羟基苯磺酸酯；对甲氧基苯胺；Trinder试剂(如4-氨基安替比林、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)或其他产生Trinder染料的化合物)；以及衍生物和相关化合物)反应以形成有色产物。HRP或其他过氧化物酶也可与其他化合物反应以形成化学发光产物；例如，HRP或其他过氧化物酶可与鲁米诺(luminol)反应以形成化学发光产物(其他分子可以存在，且可增强这类反应；例如，在4-碘苯酚的存在下，HRP介导的从鲁米诺产生发光产物增加)。其他着色剂包括，例如，碱性磷酸酶；刃天青(7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮-10-氧化物)；10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(Amplex Red)和相似的化合物(例如Amplex UltraRed(A36006，来自Life Technologies,Carlsbad,CA 92008)；试卤灵(resorufin)化合物(例如7-乙氧基试卤灵)；染料，例如荧光素、钙黄绿素、罗丹明和乙啡啶染料；N-甲基-4-肼基-7-硝基苯并呋咱；吖啶(吖啶-9-甲酸)酯和与这些化合物反应以改变溶液的光学性质的化合物；酚类和酚衍生物(例如对碘苯酚和对苯基苯酚)；发光胺类，包括胺加合物(例如，可源自氰化铜)，和其他分子。应当理解，其他酶和反应物可用于形成有色产物，或用于检测血液样品中的胆固醇。

如本文使用的，术语“产物形成”、“有色产物”、“有色产物形成”等用来指代将着色剂加入溶液中的动作以及导致的产物。例如，着色剂向溶液中的加入可导致有效改变溶液的光学性质的反应。这样的反应可导致溶液中原来不存在的分子的形成，或可导致溶液中以前的分子或化合物的聚集，或可导致溶液中以前的分子或化合物的降解或其他改变，其有效改变着色剂所加入的溶液的颜色、吸光度和/或其他光学性质。

如本文使用的，样品是从受试者获得的生物标本，并且可以非限制性地是血液样品、尿液样品、咽喉或脸颊拭子、组织样品、脑脊髓液样品或其他可取自受试者的样品。如本文使用的，术语“样品”包括完整的生物标本，并包括生物标本的一部分或整分试样，如从受试者抽取的血液。样品的获得通常是用于分析，例如用于测定一种或多种生物相关属性，例如，总胆固醇和/或其他脂蛋白测量；血液甘油三酯(TG)水平；血细胞比容；pH，葡萄糖水平；尿酸水平；盐浓度(例如，组成盐的阳离子和/或阴离子的)；血液铁水平；红细胞沉降率(ESR)；细胞计数测量(例如，细胞大小、细胞密度、细胞形态、细胞类型、细胞表面和/或细胞内标记和属性的检测，等等)；化学测量，包括维生素、蛋白质、蛋白质或小分子的代谢物的存在和/或浓度的测量，以及血液、尿、组织或其他生物样品的其他测量。

样品，例如血液样品，或血液样品的一部分，可以具有任何合适的尺寸或体积，并且任选地具有小尺寸或体积。在本文公开的测定和方法的一些实施方案中，可用小体积血液样品，或仅用血液样品的小体积部分进行测量，其中小体积包含不超过约5mL；或包含不超过约3mL；或包含不超过约2mL；或包含不超过约1mL；或包含不超过约500μL；或包含不超过约250μL；或包含不超过约100μL；或包含不超过约75μL；或包含不超过约50μL；或包含不超过约35μL；或包含不超过约25μL；或包含不超过约20μL；或包含不超过约15μL；或包含不超过约10μL；或包含不超过约8μL；或包含不超过约6μL；或包含不超过约5μL；或包含不超过约4μL；或包含不超过约3μL；或包含不超过约2μL；或包含不超过约1μL；或包含不超过约0.8μL；或包含不超过约0.5μL；或包含不超过约0.3μL；或包含不超过约0.2μL；或包含不超过约0.1μL；或包含不超过约0.05μL；或包含不超过约0.01μL。

如本文使用的，“脂蛋白”和“脂蛋白颗粒”包括但不限于乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。在它们的多种成分中，脂蛋白包含甘油三脂(TG)和胆固醇，包括胆固醇酯和胆固醇的其他形式。在脂蛋白中或附着于其上的胆固醇(以其所有形式)分别被称为VLDL-C、LDL-C和HDL-C。血液样品中的总胆固醇(TC)包括胆固醇亚部分VLDL-C、LDL-C和HDL-C。

如本文使用的，“脂蛋白沉淀”、“脂蛋白的沉淀”和类似的术语是指脂蛋白的聚集(例如，通过在有带负电荷的聚合物如带负电荷的多糖如硫酸葡聚糖的存在下，暴露于二价阳离子如镁离子)，也可指用以进一步从其他血液成分中分离脂蛋白的离心或其他动作。当血液样品中的大部分，如大于约75％、或大于约80％、或大于约85％、或大于约90％、或大于约95％、或大于约99％的脂蛋白聚集或沉淀时，可发生脂蛋白的显著沉淀。

如本文使用的，所述术语“脂蛋白相互作用物”是指一种化合物，或一对或一组化合物，其可作用以从溶液中聚集和/或沉淀脂蛋白。然而，应当理解，术语“脂蛋白相互作用物”在此用作标识物，这类化合物的使用或包含不需要要求在溶液中或在可存在脂蛋白相互作用物的测定中有脂蛋白的沉淀。与脂蛋白的相互作用的一个示例性形式通过阳离子如镁和其他二价阳离子来介导，其中带负电荷的聚合物如带负电荷的多糖(例如硫酸葡聚糖)与脂蛋白通过带电荷的阳离子而缔合。因此，这类阳离子，例如镁(通常为MgCl₂的形式)，可被称为“脂蛋白相互作用物”。其他脂蛋白相互作用物包括但不限于葡聚糖、环糊精、磷钨酸、磷钨酸盐(例如磷钨酸钠，包括磷钨酸钠联合氯化镁)、聚乙烯硫酸酯、肝素、肝素联合氯化镁、聚乙二醇(如聚乙二醇(PEG)6000)和抗体(例如，抗-载脂蛋白-B-特异性单克隆抗体)。抗体在脂蛋白测定中通常和离心方法一起使用。

本文所述的方法和试剂中使用的葡聚糖，例如，可作为硫酸葡聚糖获得。如本文所述的方法和试剂中使用的环糊精，例如，α-环糊精，例如可作为环糊精硫酸酯获得。在一些现有技术方法中，脂蛋白可被相对低浓度的硫酸葡聚糖和相对高浓度的氯化镁(例如，Kimberly等人(Clinical Chemistry 45(10):18803-1812(1999))描述的0.182μM硫酸葡聚糖和32mM MgCl₂)从血液样品中沉淀出来。

如本文使用的，术语“葡聚糖”是指任何形式的、由不同长度的多糖链构成的复杂的支链葡聚糖(即，由多个葡萄糖分子组成的多糖)。沿着多糖链的直线长度的葡萄糖分子间(例如，在分支之间)的键通常是α-1,6糖苷键，而在葡萄糖分子间的分支键通常是α-1,3糖苷键。葡聚糖的大小和分子量广泛不同；例如，葡聚糖多糖链可具有广泛不同的长度，且葡聚糖在分子量上表现出极大的变化(例如，从约3千道尔顿(kD)到约2000kD或更多)。如本文使用的，术语“葡聚糖”包括葡聚糖脂和盐，例如葡聚糖硫酸盐、葡聚糖乙酸盐、葡聚糖丙酸盐、葡聚糖琥珀酸盐和其他葡聚糖盐。

应当理解，葡聚糖分子可见于或可提供于含有不同葡聚糖分子的不均一混合物中，每个葡聚糖分子可具有与在葡聚糖组合物如葡聚糖本体组合物中的其他葡聚糖分子相比不同的结构和/或不同的分子量。如本文使用的，术语“葡聚糖分子量”、“葡聚糖的分子量”和类似术语是指在葡聚糖的本体组合物中的葡聚糖分子的平均分子量，并非提示葡聚糖本体组合物中的所有或甚至大多数葡聚糖分子具有被确定为该“葡聚糖分子量”的特定分子量。因此应当理解，葡聚糖的分子量是指归因于包含葡聚糖分子的不均一混合物的本体组合物的平均值，这些葡聚糖分子在它们的分子量和结构上可以不同。

如本文使用的，术语“低分子量葡聚糖”是指葡聚糖分子量小于约100千道尔顿(kD)，并且通常小于约75kD的葡聚糖；在实施方案中，低分子量葡聚糖可具有约25kD至约75kD，或约40kD至约60kD的分子量。在实施方案中，低分子量葡聚糖可具有约50kD的分子量。

如本文使用的，术语“环糊精”是指任何环状的多糖，例如，由糖分子组成的环状化合物。环糊精的环上的糖分子数目可以不同；例如，在环上具有6个糖的环糊精被称为α-环糊精；具有七元环的环糊精被称为β-环糊精；而在环上具有8个糖分子的环糊精被称为γ-环糊精。

如本文使用的，带负电荷的聚合物是包含重复单元并在接近中性的pH(例如，约pH5至约pH 9的pH，任选地约pH 6至约pH 8)下在水溶液中具有负电荷的任何有机分子。例如，聚乙烯硫酸酯是带负电荷的聚合物。其他带负电荷的聚合包括带负电荷的多糖，包括肝素和葡聚糖脂。

胆固醇可在受试者如人类受试者的血液中测量。在血液样品中测量的胆固醇可被认为包含一种或多种胆固醇亚部分的胆固醇。如本文使用的，术语“总胆固醇”及其首字母缩写“TC”用于表示样品中胆固醇的总量。当讨论血液样品中胆固醇的量时，在没有另外指明的情况下，术语“胆固醇”是指“总胆固醇”。在受试者(例如人类受试者)的血液中，胆固醇可以以多种形式存在；例如，在血液中可发现乳糜微粒、VLDL、LDL和/或HDL形式的胆固醇。乳糜微粒、VLDL、LDL和HDL中的每一种都可被称为胆固醇亚部分。以乳糜微粒、VLDL、LDL和/或HDL亚部分存在的胆固醇量的总和构成从受试者获得的血液样品中的总胆固醇。

胆固醇的总量，以及在单独的和每个胆固醇亚部分中的胆固醇的量，可通过本领域已知的多种手段以及通过本文公开的新型方法和手段来测量。如本文使用的，术语“胆固醇测量数据”是指由样品中胆固醇的测量所得的数据，且可以非限制性地指TC、VLDL-C、LDL-C、HDL-C、乳糜微粒胆固醇及其组合的测量值。例如，如本文所公开的，胆固醇可通过任何合适的手段来测量，包括电流分析法、伏安法或其他手段，包括测量血液样品如根据本文所公开的方法和测定加入一种试剂或多种试剂后的血液样品的光学性质。例如，如本文所公开的，胆固醇可通过测量在血液样品中，例如在根据本文所公开的方法和测定加入一种试剂或多种试剂后的血液样品中的吸光度来测量。在实施方案中，胆固醇测量数据包含通过用分光光度计测量吸光度而获得的数据。在实施方案中，胆固醇测量数据包含通过用分光光度计测量ΔA而获得的数据，其中ΔA是在两个波长处，例如，在约560nm和约700nm之间测量的吸光度之差。因此，例如，胆固醇测量数据可通过用分光光度计测量ΔA，通过测量在约560nm的波长处和在约700nm的波长处的吸光度，并计算或以其他方式获得这些吸光度测量值之间的差而获得。

术语“吸光度”在本文中根据它在本领域中的通常和惯常含义而使用，是指溶液(例如样品)的光学性质，其与落在溶液上的光学(例如电磁)辐射量与通过溶液(例如样品)传播的光学辐射量之比相关。

吸光度可通过测量在穿过介质的过程中吸收的光量，通过测量穿过介质的光量，或通过其他本领域已知的方法来测量。透过率(T)通常被定义为穿过样品的光量与穿过对照(例如，空白)的光量之比，其中光量通常通过光强度来测量。没有穿过介质的光量因此是1–T。吸光度A通常被定义为负log₁₀T。因此，吸光度和透过率是一起测量的，因为这两个值中的一个的确定允许了对另一个值的确定。因此，如本文使用的，“吸光度”还表示并且指“透过率”，因为吸光度的确定也允许透过率的确定。

如本文使用的，吸光度(和透过率)可在特定波长范围内，或在特定波长处，或在多个特定波长处测量。在特定波长处测量的吸光度可通过在以该特定波长为中心的波长范围内的测量而获得。例如，在560nm处的吸光度可通过测量在约530nm至约590nm波长之间的吸光度；通过测量在约540nm至约580nm波长之间的吸光度；任选地通过测量在约550nm至约570nm波长之间的吸光度；或在大于和小于560nm的其他波长之间测量而获得。类似地，在700nm处的吸光度可通过测量在约670nm至约730nm波长之间的吸光度；通过测量在约680nm至约720nm波长之间的吸光度；通过测量在约690nm至约710nm波长之间的吸光度；或在大于和小于700nm的其他波长之间测量而获得。在本文公开的实施例中，使用分光光度计来测量吸光度。

如本文使用的，术语“ΔA”是指在第一波长处测量的吸光度与在第二波长处测量的吸光度之差；例如，第一波长可以是约560nm而第二波长可以是约700nm。例如，ΔA可通过确定在约560nm波长处和在约700nm波长处测量的吸光度之差，以及计算或以其他方式得到这些吸光度测量值之间的差值而测量。因此，例如，这种在560nm和700nm处测量的ΔA可被称为“ΔA(560-700nm)”。

如本文使用的，术语“分光光度计”是指被配置用于且有效地测量在特定波长范围内，或在特定波长处，或在多个特定波长处的光强度的装置。分光光度计可有效地测量样品中的吸光度。分光光度计可有效地测量样品发出的光(例如，荧光和/或发光)。分光光度计可有效地测量样品中的吸光度并测量样品发出的光。

如本文使用的，术语“分光光度法”是指用分光光度计进行测量；例如，在特定波长范围内，或在特定波长处，或在多个特定波长处进行光学测量。

如本文使用的，术语“光学检测器”和用于测量光学性质(例如，有色溶液的光学性质)的器件是指任何适合的光学器件、光学装置、光电检测器和用来检测电磁辐射(例如，任何波长的光)的光学装置元件。例如，光学检测器和光学检测器件可用于检测吸光度、透过率、浊度、发光(包括化学发光)、荧光和/或其他光信号。光学检测器包括但不限于成像装置。光学器件、光学装置、光电检测器和光学装置元件包括但不限于电子检测器如数码相机、电荷耦合器件(CCD，包括过冷CCD)、光电二极管(包括，例如，pin二极管和雪崩光电二极管)、光电倍增管、光电管、光子计数检测器、光电二极管阵列(包括，例如pin二极管阵列和雪崩光电二极管阵列)、电荷耦合器件阵列(包括过冷CCD阵列)、光电二极管阵列、光电倍增管阵列、光电管阵列、光子计数检测器阵列和其他检测装置和检测元件。在一些实施方式中，pin二极管或其他元件可与放大器耦合。

在一些实施方案中，光学检测器可包括相机(例如，数码相机)。相机可包含镜头，或者可在没有镜头的情况下运行。在某些情况下，相机可包含CCD，可使用互补金属氧化物半导体(CMOS)元件，可以是无镜头相机、微镜头阵列相机、开源相机(包括，例如，如Levoy,“Experimental Platforms for Computational Photography,”IEEE Computer Graphicsand Applications,Vol.30,No.5,2010年9月/10月,第81-87页所述的Frankencamera)，并且可使用任何本领域已知的或以后开发的视觉检测技术。相机可获取常规的和/或非常规的图像，例如全息图像、层析图像、干涉图像、傅里叶变换光谱，上述任一种或全部可借助于或不借助于计算方法来解读。相机可包含一个或多个特征，该特征可使相机在使用过程中聚焦，或者可捕捉能后来聚焦的图像。在一些实施方案中，成像设备可使用二维(2-D)成像、三维(3-D)成像和/或四维(4-D)成像(并入随时间的变化)。成像设备可捕捉静态图像。用于实现3-D和4-D成像的光学方案可以是本领域技术人员已知的几种方案中的一种或多种，例如结构化照明显微术(SLM)、数字全息显微术(DHM)、共聚焦显微术、光场显微术等。静态图像可在一个或多个时间点捕捉。成像设备可捕捉视频和/或动态图像。视频图像可在单一时段内连续捕捉，或者可在一个或多个时间段上捕捉。成像设备可从光学系统收集信号，该光学系统按照任意扫描模式(例如，光栅扫描)对目标(例如，用于阵列的样品)进行扫描。

光学检测器和光学检测器件包括但不限于显微镜，且用于光学检测的手段可包括显微术、目视检查、通过感光胶片，或者可包括诸如数码相机、电荷耦合器件(CCD)、过冷CCD阵列、光电管、光学检测器和本领域已知并且如本文公开的其他检测装置等电子检测器的使用。光学检测器和光学检测器件可包括光纤或多根光纤(例如，光纤电缆)，例如，该光纤可功能性地连接到CCD检测器或PMT阵列上。光纤束可包含离散的纤维和/或许多融合在一起形成实体束的小纤维。

光学检测器可包括光源，如电灯泡、白炽灯泡、电致发光灯、激光器、激光二极管、发光二极管(LED)、气体放电灯、高强度放电灯、化学发光光源、生物发光光源、磷光光源、荧光光源和自然阳光。在实施方案中，例如，当将要检测化学发光时，光可以通过测定化学而产生。在实施方案中，为了辅助检测结果，光源能照亮组分。例如，光源能照亮测定中的溶液以便检测该测定的结果。例如，测定可以是荧光测定或吸光度测定，通常与核酸测定一起使用。检测器可包含能有效地将光从光源传送到测定或测定室的光学元件。这样的光学元件可包括但不限于，例如，透镜，镜子(例如，扫描或检流镜(galvano-mirror)、棱镜、光纤或纤维束、光导(例如，液体光导)和/或其他光学元件。光学检测器可包括这样的光学元件，其中这样的光学元件被布置成有效地将光传送到检测器上。例如，光学检测器可配置为用来检测选定的电磁辐射的波长或波长范围。光学检测器可配置为用来在样品上移动或者观察样品的部分。光学检测器可包括镜子、马达、压电元件、或其他能有效允许检测在不同时间从目标位置的不同部分发出的光的元件，例如，用来扫描样品。

光学检测器可用于检测一种或多种光学信号。例如，检测器可用于检测产生发光的反应的存在或进程。检测器可用于检测产生荧光、化学发光、光致发光、电致发光、声致发光、吸光度、浊度、旋光色散(ORD)、圆二色性(CD)或偏振的反应。检测器可以能够检测与颜色强度及其相或空间或时间梯度相关的光学信号。

如本文使用的，用于将信息从所述装置通信到计算机或其他外部设备的手段和用于将信息通信到计算机或其他外部设备的信道非限制性地是指计算机网络、电话、电话网络和配置为用来显示从所述设备通信的信息的设备。在实施方案中，用于信息通信的手段和用于信息通信的信道包括用线缆(包括双绞线、同轴电缆、带状电缆和其他电缆)的直接链路、无线手段和无线技术(例如蓝牙技术或RTM(重传模式)技术)。通信手段和用于通信的信道包括任意适合的通信方法，包括使用调制解调器的拨号有线连接、使用线缆的直接链路、无线连接，包括红外线、蜂窝电话、wimax、wifi、卫星、寻呼机、通用分组无线业务(GPRS)、本地数据传输系统(例如，以太网或基于局域网(LAN)的令牌环网或其他网络)。

将要与之通信的外部设备可以是任何能够接受这类通信的设备。例如，外部设备可以是联网设备，包括服务器、个人计算机、膝上型计算机、平板计算机、移动设备、“非智能”蜂窝电话、卫星电话、智能手机(例如

Android^TM、

Palm、Symbian、

)、个人数字助理(PDA)、寻呼机或其他任何设备。在实施方案中，外部设备可以是诊断装置。在外部设备包括诊断装置的实施方案中，设备和本文公开的系统和外部设备之间的关系可包括主从式关系、对等关系或分布式关系(distributedrelationship)。

如本文使用的，术语“脂肪酶”是指催化与作为反应底物一部分的脂质的反应的一类酶。脂肪酶可催化诸如水解等反应或其他反应。例如，脂肪酶可催化胆固醇酯被代谢为胆固醇和脂肪酸的反应。

如本文使用的，术语“胆固醇酯酶”是指有效催化如下反应的酶，该反应去除或改变胆固醇分子或含胆固醇的分子上胆固醇部分的酯键，如羧酸酯。胆固醇酯酶(又名“甾醇酯酶”和“胆汁脂肪酶”)通常催化甾醇脂与水组合生成甾醇和脂肪酸的反应。胆固醇酯酶很常见，可见于单细胞和多细胞生物体中；许多商业上有用的胆固醇酯酶是细菌胆固醇酯酶，但是来自其他来源的胆固醇酯酶也是已知的并且有用的。例如，有用的胆固醇酯酶可以是细菌胆固醇酯酶，例如从革兰氏阴性细菌获得的胆固醇酯酶，包括来自假单胞菌属的种的胆固醇酯酶。

如本文使用的，术语“胆固醇氧化酶”是指有效催化以下反应的酶，在该反应中胆固醇分子或含胆固醇的分子上的胆固醇部分与氧组合生成氧化的胆固醇部分如胆甾-4-烯-3-酮(还生成过氧化氢)。许多胆固醇氧化酶是细菌胆固醇氧化酶。例如，有用的胆固醇氧化酶可以是例如可以从革兰氏阴性细菌获得的胆固醇氧化酶，包括来自假单胞菌属的种的胆固醇氧化酶。

如本文使用的，“缓冲液”是一种化合物或一组化合物，其在溶液中倾向于将溶液的pH维持在等于或接近特定的值。例如，磷酸盐可用作缓冲液。磷酸盐包括NaH₂PO₄、Na₂HPO₄和Na₃PO₄。其他缓冲液也适合在本文公开的试剂、测定和方法中使用，包括但不限于柠檬酸盐、铵盐、乙酸盐、碳酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰胺基)-亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、氯化胆胺、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸(TES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙酰胺基甘氨酸(acetamidoglycine)、tricine(N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)、甘氨酰胺、bicine(2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)和其他缓冲液。任意缓冲液都可以使用，只要它能使水溶液缓冲在所需pH，并且另外还要与本文公开的测定和方法相匹配。在实施方案中，可以使用缓冲液将溶液的pH缓冲在接近中性pH到微酸性pH的pH范围中，例如，从约pH 5到约pH9，或者在约pH 6到约pH 8之间，或者在约pH 6.8到约pH 7.8之间，并且在一些实施方案中，缓冲到约pH 7或约pH 7.4的pH。

装置和系统

本文公开的测定和方法可在用于处理样品的装置或系统上进行。本文公开的测定和方法可以容易地并入并用在用于处理样品的装置中，或用于处理样品的系统中，该装置和系统可以是自动化的测定装置，或者可以是自动化的测定系统。这样的装置和这样的系统可用于实施本文中公开的方法。例如，装置可用于接收样品。装置可用于制备或处理样品。装置可用于对样品进行测定。装置可用于从样品获得数据。装置可用于传输从样品获得的数据。装置可用于在样品的处理或测定后处置样品。

装置可以是系统的一部分，该系统的组件可以是样品处理装置。装置可以是样品处理装置。样品处理装置可配置用于促进样品的采集、制备样品以供临床检测，或实现与一种或多种试剂的化学反应或其他化学或物理处理，如本文所公开的。样品处理装置可配置用于从样品获得数据。样品处理装置可配置用于传输从样品获得的数据。样品处理装置可配置用于分析从样品获得的数据。样品处理装置可配置用于与另一台装置、实验室或附属于实验室的个体进行通信，来分析从样品获得的数据。

样品处理装置可配置用于放置在受试者之内或之上。样品处理装置可配置用于直接或间接地从受试者接收样品。样品可以是，例如、血液样品(例如，从手指针刺获得的样品，或来自于静脉穿刺，或动脉血液样品)、尿液样品、活检样品、组织切片、粪便样品或其他生物样品；水样品、土壤样品、食物样品、气体样品；或其他样品。血液样品可包括，例如，全血、血浆或血清。样品处理装置可通过该装置的外壳接收来自受试者的样品。样品收集可发生在样品收集场所或其他地方。样品可在样品收集场所提供给该装置。

在一些实施方案中，样品处理装置可配置用于接收或容纳筒匣(cartridge)。在一些实施方案中，样品处理装置可包括筒匣。筒匣可以是可从样品处理装置上移除的。在一些实施方案中，可将样品提供给样品处理装置的筒匣。或者，可将样品提供给样品处理装置的另一部分。筒匣和/或装置可包含样品收集单元，该样品收集单元可被配置用于接收样品。

筒匣可包含样品，并且可包含用于处理或检测样品的试剂，用于处理或检测样品的一次性用品，或其他材料。在将筒匣置于样品处理装置上或插入样品处理装置中后，筒匣的一个或多个组件可与样品处理装置的其他组件流体连通。例如，如果在筒匣处收集样品，则可将样品转移到样品处理装置的其他部分。类似地，如果在筒匣上提供一种或多种试剂，则可将该试剂转移到样品处理装置的其他部分，或样品处理装置的其他组件可被带到试剂处。在一些实施方案中，筒匣的试剂或组分可留在筒匣上。在一些实施方案中，不包含需要管路或需要维护(例如，手动或自动维护)的流体部件(fluidics)。

样品或试剂可转移到装置如样品处理装置。样品或试剂可转移到装置内。可以在不提供从筒匣到装置的连续流体路径的情况下实现这样的样品或试剂的转移。可以在不提供装置内的连续流体路径的情况下实现这样的样品或试剂的转移。在实施方案中，这样的样品或试剂的转移可通过样品处理系统(例如，移液器)来完成；例如，样品、试剂或其整分试样可被吸入尖端开放的转移组件如移液器端头中，该组件可以可操作地连接到样品处理系统，该系统将端头连同端头内的样品，试剂或其整分试样转移到样品处理装置之上或之内的位置。样品、试剂或其整分试样可以存放在样品处理装置之上或之内的位置。样品和试剂，或多种试剂，可用样品操作装置以类似的方式混合。筒匣的一种或多种组分可以以自动化的方式转移到样品处理装置的其他部分，反之亦然。

装置，如样品处理装置，可具有流体处理系统。流体处理系统可执行或可帮助执行流体如样品的运送、稀释、提取、整分、混合和其他动作。在一些实施方案中，流体处理系统装可包含在装置外壳内。流体处理系统可允许收集、递送、处理和/或运送流体，溶解干试剂，将液体和/或干试剂与液体混合，以及收集、递送、处理和/或运送非流体组分、样品或材料。该流体可以是样品、试剂、稀释剂、洗液、染料或其他任何可被所述装置使用的流体，并且可包括但不限于均匀流体、不同液体、乳液、悬浮液和其他流体。流体处理系统，包括但不限于移液器，也可用于在所述装置附近运送器皿(内含或不含流体)。所述流体处理系统可分配或抽吸流体。样品可包含漂浮在流体内的一种或多种微粒或固体物质。

在实施方案中，流体处理系统可包含移液器、移液器端头、注射器、毛细管或其他组件。该流体处理系统可具有包含内表面和外表面的部分和开口端。该流体处理系统可包含由移液器，移液器可包括移液器主体和移液器管口，并且可包含移液器端头。移液器端头可以是或者可以不是可从移液器管口移除的。在实施方案中，流体处理系统可使用与移液器端头配合的移液器；移液器端头可以是一次性的。端头在与移液器配合时可形成流体密封。移液器端头可被使用一次、两次或更多次。在实施方案中，流体处理系统可使用具有或没有移液器端头的移液器或类似装置来抽吸、分配、混合、运送或以其他方式操作处理流体。需要时，流体可从流体处理系统分配出去。流体在从例如移液器端头上的孔口分配之前可容纳在移液器端头内。在实施方案或使用期间的实例中，所有流体均可被分配；在其他实施方案或使用过程中的实例中，端头内的流体的一部分可被分配。移液器可以选择性地抽吸流体。移液器可以抽吸选定量的流体。移液器可以能够致动搅拌机构来混合端头或容器内的流体。移液器可结合端头或容器，从而生成连续的流动环路以用于混合，包括混合非液体形式的材料或试剂。移液器端头也可通过同时或顺序地按计量递送多种液体来促进混合，如两部分底物反应。

流体处理系统可包含一个或多个流体隔离或液压独立的单元。例如，该流体处理系统可包含一个、两个或更多个移液器端头。该移液器端头可被配置用于接收和限制流体。该端头可彼此为流体隔离或液压独立的。容纳在每一个端头内的流体可与其他端头内的流体和该装置内的其他流体为流体隔离或液压独立的。该流体隔离或液压独立的单元相对于该装置的其他部分和/或相对于彼此可以是可移动的。该流体隔离或液压独立的单元可以是可单独移动的。流体处理系统可包含一个或多个底座或支撑物。底座或支撑物可支撑一个或多个移液器或移液器单元。底座或支撑物可将流体处理系统的一个或多个移液器彼此相连。

样品处理装置可被配置用于对从受试者获得的样品执行处理步骤或动作。样品处理可包括样品制备，包括例如样品稀释、样品整分、提取、与试剂接触、过滤、分离、离心或其他预处理或处理的动作或步骤。样品处理装置可被配置用于对样品执行一个或多个样品制备动作或步骤。任选地，可以为化学反应和/或物理处理步骤准备样品。样品制备动作或步骤可包括以下一个或多个：离心、分离、过滤、稀释、富集、纯化、沉淀、孵育、移液、运送、光谱分析、细胞裂解、细胞计数、粉碎、研磨、活化、超声处理、微柱处理、磁珠处理、纳米颗粒处理或其他样品制备动作或步骤。例如，样品处理可包括一个或多个步骤来将血液分离成血清和/或微粒部分，或将任何其他样品分离成不同组分。样品制备可包括一个或多个步骤来稀释和/或浓缩样品，如血液样品或其他生物样品。样品制备可包括向样品中添加抗凝剂或其他成分。样品制备还可包括样品的纯化。在实施方案中，所有样品处理、制备或测定动作或步骤均由单一装置执行。在实施方案中，所有样品处理、制备或测定动作或步骤均在单一装置的外壳内执行。在实施方案中，大部分样品处理、制备或测定动作或步骤由单一装置执行，而且可在单一装置的外壳内执行。在实施方案中，许多样品处理、制备或测定动作或步骤由单一装置执行，而且可在单一装置的外壳内执行。在实施方案中，样品处理、制备或测定动作或步骤可以由多于一台的装置执行。

样品处理装置可被配置用于对样品运行一个或多个测定，并且从样品获得数据。测定可包括一个或多个物理或化学处理，并且可包括运行一个或多个化学或物理反应。样品处理装置可被配置用于对小的体液样品执行一个、两个或更多个测定。一个或多个化学反应可在具有如本文其他地方描述的体积的样品上发生。例如，一个或多个化学反应可在体积小于飞升的丸粒中发生。在一个实例中，样品收集单元被配置用于接收体积相当于一滴或更少的血液或组织液的体液样品。在实施方案中，样品的体积可以是小体积，其中小体积可以是小于约1000μL、或小于约500μL、或小于约250μL、或小于约150μL、或小于约100μL、或小于约75μL、或小于约50μL、或小于约40μL、或小于约20μL、或小于约10μL的体积或其他小体积。在实施方案中，所有样品测定动作或步骤均在单一样品上执行。在实施方案中，所有样品测定动作或步骤均由单一装置执行。在实施方案中，所有样品测定动作或步骤均在单一装置的外壳内执行。在实施方案中，大部分样品测定动作或步骤由单一装置执行，而且可在单一装置的外壳内执行。在实施方案中，许多样品处测定动作或步骤由单一装置执行，而且可在单一装置的外壳内执行。在实施方案中，样品处理、制备或测定动作或步骤可由多于一台的装置执行。

样品处理装置可被配置用于对样品执行多个测定。在实施方案中，样品处理装置可被配置用于对单一样品执行多个测定。在实施方案中，样品处理装置可被配置用于对单一样品执行多个测定，其中该样品是小样品。例如，小样品可具有为小于约1000μL、或小于约500μL、或小于约250μL、或小于约150μL、或小于约100μL、或小于约75μL、或小于约50μL、或小于约40μL、或小于约20μL、或小于约10μL的小体积或其他小体积的样品体积。样品处理装置可以能够对单一样品执行多重测定。多个测定可同时运行；可顺序运行；或者一些测定可同时运行而其他测定顺序运行。一个或多个对照测定和/或校准物(例如，包括具有用于该测定/试验的校准物对照的配置)也可引入该装置内；对照测定和对校准物的测定可与对样品进行的测定同时进行，或者可在对样品进行的测定之前或之后进行，或其任意组合。在实施方案中，所有样品测定动作或步骤均由单一装置执行。在实施方案中，所有多个样品测定动作或步骤均在单一装置的外壳内执行。在实施方案中，多个测定的大部分样品测定动作或步骤由单一装置执行，而且可在单一装置的外壳内执行。在实施方案中，多个测定的许多样品测定动作或步骤由单一装置执行，而且可在单一装置的外壳内执行。在实施方案中，样品处理、制备或测定动作或步骤可由多于一台的装置执行。

在实施方案中，所有多个测定可在短时间段内执行。在实施方案中，这种短时间段包含小于约3小时、或小于约2小时、或小于约1小时、或小于约40分钟、或小于约30分钟、或小于约25分钟、或小于约20分钟、或小于约15分钟、或小于约10分钟、或小于约5分钟、或小于约4分钟、或小于约3分钟、或小于约2分钟、或小于约1分钟、或其他短时间段。

样品处理装置可被配置用于检测一个或多个与样品相关的信号。样品处理装置可被配置用于鉴别样品的一种或多种性质。例如，样品处理装置可被配置用于检测样品中(例如在体液、分泌物、组织或其他样品中或在其整体中)一种分析物或多种分析物的存在或浓度或疾病状况。或者，样品处理装置可被配置用于检测一个或多个信号，可分析该信号以检测样品中一种或多种分析物(其可指示疾病状况)的存在或浓度或疾病状况。该信号可在该装置上或在另一个位置处分析。运行临床检测可包括或者可不包括对所收集的数据的任何分析或比较。

化学反应或其他处理步骤可在使用或不使用样品的情况下进行。可由所述装置准备或运行的步骤、检测或测定的例子可包括但不限于免疫测定、核酸测定、基于受体的测定、细胞计数测定、比色测定、酶测定、电泳分析、电化学测定、光谱分析、色谱分析、微观测定、地形测定(topographic assay)、量热测定、浊度测定(turbidmetric assay)、凝集测定、放射性同位素测定、粘度测定、凝结测定、凝固时间测定、蛋白质合成测定、组织学测定、培养测定、摩尔渗透压浓度测定和/或其他类型的测定，离心、分离、过滤、稀释、富集、纯化、沉淀、粉碎、孵育、移液、运送、细胞裂解或其他样品制备动作或步骤，或其组合。可由所述装置准备或运行的步骤、检测或测定可包括成像，包括显微术、细胞计数和其他制作或使用图像的技术。可由所述装置准备或运行的步骤、检测或测定还可包括对样品的组织学、形态学、运动学、动力学和/或状态的评估，其可包括对细胞的这类评估。

装置可以能够在短时间长度内执行所有在装置上的步骤(例如，由单一装置执行的步骤或动作)。装置可以能够在短时间长度内对单一样品执行所有在装置上的步骤。例如，从由受试者收集样品到传输数据和/或到分析可用时约3小时或更少、2小时或更少、1小时或更少、50分钟或更少、45分钟或更少、40分钟或更少、30分钟或更少、20分钟或更少、15分钟或更少、10分钟或更少、5分钟或更少、4分钟或更少、3分钟或更少、2分钟或更少、或1分钟或更少。关于这种样品从在装置内接收样品到传输数据和/或到从该装置分析的时间量可取决于在该样品上执行的步骤、检测或测定的类型和数目。关于这种样品从在装置内接收样品到传输数据和/或到从该装置分析的时间量可用时约3小时或更少、2小时或更少、1小时或更少、50分钟或更少、45分钟或更少、40分钟或更少、30分钟或更少、20分钟或更少、15分钟或更少、10分钟或更少、5分钟或更少、4分钟或更少、3分钟或更少、2分钟或更少、或1分钟或更少。

装置可被配置用于在样品处理或测定后准备样品以供处置，或处置样品，如生物样品。

在实施方案中，样品处理装置可被配置用于传输从样品获得的数据。在实施方案中，样品处理装置可被配置用于经由网络而通信。样品处理装置可包含可与网络相连接的通信模块。样品处理装置可通过有线连接或无线地连接至网络。所述网络可以是局域网(LAN)或广域网(WAN)如因特网。在一些实施方案中，所述网络可以是个人局域网。所述网络可包括云。样品处理装置可无需中间装置而连接至网络，或者可能需要中间装置将样品处理装置连接至网络。样品处理装置可通过网络与另一设备通信，该设备可以是任意类型的网络设备，包括但不限于个人计算机、服务器计算机或膝上型计算机；个人数字助理(PDA)如Windows CE设备；电话如蜂窝电话、智能手机(例如，iPhone、Android、Blackberry等)或位置感知便携式电话(如GPS)；漫游设备，如联网的漫游设备；无线设备如无线电子邮件设备或其他能与计算机网络进行无线通信的设备；或其他任何类型的可以有可能通过网络而通信和处理电子事务的网络设备。这样的通信可包括将数据提供至云计算基础架构或其他任何类型的可被其他设备访问的数据存储基础架构。

样品处理装置可将关于样品的数据提供给，例如，医疗保健专业人员、医疗保健专业场所，如实验室，或其附属机构。实验室、医疗保健专业人员或受试者中的一个或多个可具有能够接收或访问由样品处理装置提供的数据的网络设备。样品处理装置可配置用于将关于样品的数据提供至数据库。样品处理装置可配置用于将关于样品的数据提供至电子病历系统、实验室信息系统、实验室自动化系统或其他系统或软件。样品处理装置可以以报告的形式提供数据。

实验室、装置或其他实体或软件可实时地对关于样品的数据进行分析。软件系统可执行化学分析和/或病理分析，或者这些可分布在实验室、临床和专门或专业人员的组合中。分析可包括对样品的定性和/或定量评估。数据分析可包括对样品的后续定性和/或定量评估。任选地，可基于原始数据、预处理的数据或分析后的数据生成报告。可以准备这样的报告以便保持从样品获得的数据的保密性，关于从中获得样品的受试者的身份和其他信息，数据的分析，和其他保密信息。所述报告和/或数据可传输至医疗保健专业人员。由样品处理装置获得的数据，或对这些数据的分析，或报告，可提供至数据库、电子病历系统、实验室信息系统、实验室自动化系统或其他系统或软件。

可以使用本文公开的复合物、组合物、抗体或其他试剂或与之一起使用的试剂、测定、方法、试剂盒、装置和系统示例的描述和公开内容可见于，例如，美国专利8,088,593；美国专利8,380,541；2013年2月18日提交的美国专利申请系列号13/769,798；2013年2月18日提交的美国专利申请系列号13/769,779；2011年9月26日提交的美国专利申请系列号13/244,947；2012年9月25日提交的PCT/US2012/57155；2011年9月26日提交的美国专利申请系列号13/244,946；2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,949；和2011年9月26日提交的美国申请系列号61/673,245，所述专利和专利申请的公开内容通过引用全文并入本文。

脂质和脂质部分方法和测定

本文公开的新型方法和测定利用了申请人的以下发现：胆固醇亚种以不同的速率转化成所测量的产物。相应地，HDL-C非常快速地转化为产物，而LDL-C转化为产物慢于HDL-C转化为产物，且VDL-C和乳糜微粒转化得甚至更为缓慢。总胆固醇完全转化为产物甚至慢于HDL-C或LDL-C转化为产物。这种在转化为产物的速率上的差异允许在单一溶液中在不同时间进行来自不同脂蛋白种类的胆固醇的测量，从而减少了这类测量所需的步骤数目、减少了可能的误差并简化了程序。在本文公开的实施方案中，“产物”可以是有色产物，例如，由过氧化物酶如辣根过氧化物酶形成的有色产物。通过在例如(1)非常早的时间(例如，0–2分钟)、在稍后的时间(例如，2–6分钟)和在后来的时间(例如，10分钟或更后)对有色产物进行测量，两种最重要的胆固醇亚部分(HDL-C和LDL-C)和总胆固醇(T-C)能在单一测定中测量。重要的是，因为测定在单一反应混合物中进行，胆固醇亚部分与总胆固醇之比的确定会比在不同反应混合物中进行数次不同测定所预期的更加准确和精确。另外，与需要运行3次或更多次测定来获得胆固醇亚部分和总胆固醇值的先前方法和测定的成本相比，在单一反应混合物中进行的本文公开的测定和方法能显著地减少胆固醇测量的成本。

本文公开的方法和测定利用了脂肪酶(例如，胆固醇酯酶)和氧化酶(例如，胆固醇氧化酶)作用于每个含胆固醇的脂蛋白部分的差别速率。脂蛋白在其所含脂质(例如，包括甘油三酯、胆固醇、胆固醇酯和磷脂质在内的脂质)的组成上和在帮助溶解脂质以供通过血液运输的载脂蛋白上不同。脂蛋白非常不均一，但被认为在为了临床诊断目的而对脂质的评估中非常实用的部分在其物理和化学性质上非常独特，并且已通过其在离心力下或经历电泳分离时移动的速率在现有技术方法中得到区分。

与现有技术方法相反，本文公开的测定和方法使用了，并且本文公开的试剂提供了这样的条件：在该条件下，HDL、LDL和VLDL脂蛋白与测定化学物在同一溶液中以充分不同的速率反应，而没有显著的沉淀，使得能在单一测定中在不同时间利用多次测量来测量每个部分。因此，在本文公开的方法的一个实例中，HDL-C到约2分钟时完全耗尽而LDL-C需要约6分钟才完全转化为所测量的产物。通过等待稍长的时间(例如，10分钟或更长)，样品中的所有胆固醇都得到转化。根据本文公开的方法，总胆固醇可在测定终点时通过测量有色产物的吸光度来估算。根据本文公开的方法，LDL-C可通过在一段时间范围内(例如2–6分钟)取有色产物产生的速率来测量。在反应的最早阶段(例如，0–2分钟)，HDL和LDL都被消耗；HDL的贡献可用该测定内测量的LDL浓度(例如，一旦从该测定内进行的测量得知LDL浓度)来估算。如本文所公开的，已经建立了用于进行计算的方法。本发明方法因此允许单独使用速率数据来计算HDL-C、LDL-C和总-C。LDL-C可由取自测定反应中段的动力学数据(例如，在测定开始后约2至6分钟采集的测量值)来计算，而HDL-C可由该反应的早期阶段(例如，在测定开始后约0至2分钟)考虑LDL的贡献来估算。

申请人发现，本文公开的测定的一方面涉及设定测定条件(例如，试剂、方案和温度)，使得在同一溶液中在没有脂蛋白的显著沉淀的情况下，HDL-C、LDL-C、乳糜微粒和VLDL-C转化为有色产物的反应的动力学以明显不同的速率进行，同时允许所有脂蛋白种类(例如HDL-C、LDL-C和VLDL)在该测定结束之前基本上完全反应。本文公开的试剂和方法提供了这样的条件，该条件允许不同脂蛋白部分在单一反应混合物中随时间的差异化，而无需显著的脂蛋白沉淀。

例如，在本文公开的条件下，HDL-C的时程具有估计少于1分钟的半衰期，而LDL-C转化具有滞后期和集中在大约三分钟上的总体S形形状。在本文公开的条件下，其余的脂蛋白胆固醇(乳糜微粒和VLDL-C)更加缓慢地反应(例如，半衰期大约为5分钟或更长)。不同胆固醇种类之间在半衰期和反应动力学上的这些差异使得能够使用简单的算法将测定信号去卷积成可归因于每个种类的信号，即使例如信号是在测定过程中的某些时间段内由多于一个种类产生的。因此，本文公开的方法允许对主要脂蛋白部分中的胆固醇的快速、方便和准确的测定。

在常规现有技术测定中，LDL和VLDL通过多种试剂中的一种来沉淀。例如，硫酸葡聚糖和镁离子能将带负电荷的脂蛋白颗粒桥接起来，因此它们聚集形成例如LDL：Mg²⁺：硫酸葡聚糖：Mg²⁺：LDL复合物。在这类常规测定中的沉淀物形成需要两种试剂的具体浓度处于正确的比例。在这类常规测定中的沉淀物随后可通过离心或过滤去除。其他LDL和VLDL沉淀试剂是已知的，如磷钨酸、聚乙烯硫酸酯、肝素与二氯化锰、聚乙二醇(PEG)6000、磷钨酸钠与氯化镁和抗-载脂蛋白-B-特异性单克隆抗体。

相反，设计用于在本文公开的测定和方法中使用的试剂配方，以实现上述动力学差示，而不需要任何脂蛋白的沉淀。在本文公开的试剂中，在基本不发生脂蛋白沉淀的条件下实现与镁和硫酸葡聚糖的络合物形成。多种表面活性剂和其他试剂如α-环糊精适用于使脂蛋白保持可溶性。LDL和VLDL颗粒表面以限制但不阻止对LDL和VLDL胆固醇和胆固醇酯的接近的方式改性。适合于LDL和VLDL颗粒表面的这种改性的试剂和方法的使用能有效减慢由这些脂蛋白种类形成有色产物。

与现有技术已知(predicate)方法相比，以下在表3中示出的一种示例性的试剂组成使用了更低分子量的硫酸葡聚糖和高得多的镁离子浓度和镁离子与硫酸葡聚糖之比。在该测定的第一步中，这些成分的浓度减半，因为在本发明方法和已知方法中均加入样品。

应当理解，特定成分及其量在实施本文公开的方法时使用的试剂中可能不同。表3所示的试剂组成提供了适合在这些方法中使用的多种可能试剂的一个例子。通常，所述试剂将包括阳离子，而且适合在这些方法中使用的试剂中的阳离子将任选地是二价阳离子，如镁、锰、钙、钡和其他二价阳离子。在用于在本文公开的方法中使用的试剂的实施方案中，二价阳离子浓度将在约0.1mM至约20mM的范围内，任选地为约1mM至约10mM，或任选地约2mM至约8mM。通常，所述试剂将包括带负电荷的多糖，而且适合在这些方法中使用的试剂中的带负电荷的多糖将任选地是葡聚糖酯，如硫酸葡聚糖。在用于在本文公开的方法中使用的试剂的实施方案中，带负电荷的多糖(例如硫酸葡聚糖)的量将会在约0.1g/L至约20g/L的范围内，任选地为约0.3g/L至约10g/L，或任选地为约0.5g/L至约5g/L。在适合在本文公开的方法中使用的试剂的特定实施方案中，带负电荷的多糖(例如硫酸葡聚糖)将具有在约10,000至约1,000,000的范围内、任选地在约20,000至约500,000的范围内、任选地在约25,000至约100,000的范围内、或任选地在约30,000至约80,000的范围内的分子量。在适合在本文公开的方法中使用的试剂的特定实施方案中，带负电荷的多糖(例如硫酸葡聚糖)与二价阳离子之比将在约0.001至约0.1的范围内，任选地在约0.001至约0.05的范围内，任选地在约0.002至约0.02的范围内，或任选地在约0.003至约0.007的范围内。

在本文公开的实例中，胆固醇和胆固醇亚部分的对照(“已知(predicate)”)测量，按照制造者和供应商提供的

产品的建议说明书，使用

1800仪器，采用

化学和方法来进行(Siemens Healthcare Diagnostics(Tarrytown,NY10591USA))。

因此，如上所述，在如上所述的初始时间之后的测定过程中，给组合试剂中带负电荷的多糖(如葡聚糖酯，例如硫酸葡聚糖)、任选地带负电荷的环糊精(如α-环糊精硫酸酯)和阳离子(例如，二价阳离子如镁)提供血液样品的试剂、检测和方法，有效提供胆固醇从不同脂蛋白部分上的不同速率的降解，使得在不同时间点和/或在不同时间段中对反应进程的测量，如上所述，能有效地测量和确定HDL-C、LDL-C、VLDL-C和/或TC。

在本文公开的试剂、测定和方法的备选实施方案中，脂肪酶(例如胆固醇脂肪酶)、脱氢酶(例如胆固醇脱氢酶)和烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD)可在测定过程中组合，例如，可将血液样品加到试剂或试剂混合物中，使得血液样品、脂肪酶、脱氢酶和NAD(例如，以其氧化形式NAD⁺)均存在于溶液中，其有效地使脂肪酶可起作用，以从样品内脂蛋白中的胆固醇酯上释放胆固醇，并且脱氢酶和烟碱腺嘌呤二核苷酸有效反应以提供还原形式的烟碱腺嘌呤二核苷酸(NADH)和胆甾-4-烯-3-酮或其他形式的胆固醇，有效提供有色产物(例如NADH)或其他可检测的产物。在这样的备选实施方案中，在如上所述的初始时间之后的测定过程中，类似量的带负电荷的多糖(例如葡聚糖脂质，例如硫酸葡聚糖)、任选地带负电荷的环糊精(例如α-环糊精)和阳离子(例如，二价阳离子如镁)存在于试剂中和组合试剂中，其有效提供胆固醇从不同脂蛋白部分上的不同速率的降解，因此在不同时间点和/或在不同时间段中对反应进程的测量，如上所述，能有效地测量和确定HDL-C、LDL-C、VLDL-C和/或TC。

因此，在这样的备选实施方案中，烟碱腺嘌呤二核苷酸是着色剂。如上所述，NADH可通过分光光度法或其他手段检测，其有效使得可以检测和测量胆固醇水平。例如，可以通过在340nm处或在以约340nm为中心的波长范围内的吸光度测量来检测NADH并确定其水平。NADH可被波长约为340nm的光激发，而发射波长约为440nm的光；因此，NADH可通过在约340nm处的激发和测量约440nm处的发射而检测。其他检测和测量NADH水平(例如，用以确定血液样品中的胆固醇水平)的方法包括在氧化还原介体如黄递酶的存在下用氧化还原反应敏感分子如四唑鎓盐测量NADH形成；安培法；和消耗NADH的发光法(luminogenic method)(例如，使用萤光素酶介导的光生成，如通过使用细菌萤光素酶)。

应当理解，虽然上述公开内容已经结合其特定实施方案进行了描述，但上述描述以及随后的实施例旨在说明而非限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面、优势和改变对本发明所属领域的技术人员是显而易见的。

实施例

实施例1化学法和试剂

胆固醇测定化学法：

本文公开的测定可用于从与血液样品中发现的胆固醇和胆固醇衍生物(例如胆固醇酯)的反应形成有色产物。如图1所示，胆固醇酯可与胆固醇酯酶反应以生成游离的胆固醇。游离的胆固醇可与胆固醇氧化酶和氧反应以形成过氧化氢。在这种反应中形成的过氧化氢可用于对样品中的胆固醇量进行定量。过氧化氢可与过氧化物酶反应以形成有色产物，例如在着色剂的存在下，或者通过使用着色剂，并且可以对这样的反应进行检测和定量。例如，过氧化氢在辣根过氧化物酶和着色剂如氨基安替比林化合物(例如4-氨基安替比林)和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺的存在下反应以形成有色产物(例如，如图1所示的Trinder(醌亚胺)染料)。

胆固醇测定试剂：

以下表1和表2列出了两种示例性试剂AC和BC的组成。试剂AC提供了如本文公开的第一试剂的实例，BC提供了如本文公开的第二试剂的实例。试剂AC和BC可具有如表1A和1B所公开的组成：

表1A:试剂AC的组成

表1B:试剂BC的组成

其中“ALPS”是N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺，而Na_xPO₄是一定比例的NaH₂PO₄、Na₂HPO₄和Na₃PO₄，该比例能有效提供约pH 6至约pH 8.5的pH；例如，约pH7.4。

例如，在特定的实施方案中，试剂AC和BC可具有如以下表2A和2B中列出的以下组成：

表2A:试剂AC的组成

表2B:试剂B的组成

其中“ALPS”是N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺，而Na_xPO₄是一定比例的NaH₂PO₄、Na₂HPO₄和Na₃PO₄，该比例能有效提供约pH 6至约pH 8.5的pH，例如约pH7.4。

表3提供了在本文公开的新型试剂和测定中使用的硫酸葡聚糖和氯化镁的量，与在现有技术方法中使用的硫酸葡聚糖和氯化镁的量之间的比较。在一些现有技术测定中，硫酸葡聚糖和氯化镁可用于使脂蛋白在胆固醇和胆固醇酯的测定过程中沉淀。如表3所示，本发明测定包括不同浓度的硫酸葡聚糖和氯化镁，使得在本发明测定中基本上没有脂蛋白的沉淀。

表3:一些试剂的比较——组分浓度.

已知方法：Kimberly等人的dextran sulfate-magnesium chloride method,Clinical Chemistry 45(10):1803-1812(1999)。

实施例2–胆固醇测定

1)在37℃下，将30μL样品(净血浆或用水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以1:30稀释的血清)与20μL试剂AC在384-孔酶标仪(MTP)的孔内组合。

2)将板在1800rpm下振摇2秒。

3)将板在37℃下孵育5分钟。

4)加入20μL试剂BC。将板在1800转每分钟(rpm)下振摇2秒。

5)将板在能够以给定时间间隔读取吸光度的分光光度计中在37℃下孵育12分钟。

6)每隔30秒记录560nm和700nm处的吸光度(A)(用M5分光光度计(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)进行测量)。注意，其他间隔，包括更长的间隔，也是适合的。

样品:

图2显示了在用于实施例中所示研究的临床血清样品中测得的脂蛋白的脂质含量(包含甘油三酯的结果)。可以看出，各种脂蛋白亚形式中的胆固醇之间具有较差的相关性至没有相关性。另外，胆固醇水平跨越在正常受试者和患有脂血症的受试者中所见的范围，因此为本发明的方法提供了良好的检测组。在下面的数据中，还使用

化学系统(Siemens Healthcare Diagnostics,Inc.,Tarrytown,NY)通过参考方法对样品进行了分析。

胆固醇测定反应的时程

颜色形成在本发明胆固醇测定方法的几个阶段中发生。这样的分阶段颜色形成的实例在如图3所呈现的示例性实验中测量样品所获得的结果来说明，(时间是指加入试剂BC后的时间)。所述阶段包括：

1.快速阶段(0到约2分钟)，此时HDL-C和LDL-C被消耗。

2.S形过程，其对应于略微的“滞后”，随后是颜色形成的快速上升(约2–约6分钟)，此时其余LDL-C被消耗。

3.第三阶段中相对缓慢的VLDL-胆固醇消耗(约6–10分钟或更长)。

通过本发明方法对脂蛋白种类的测量以及与参考方法的结果的关联

在一些情况下还对可商购的对照材料进行了测量。TC在10分钟时使用ΔA(560-700nm)来测量。LDL-C根据在2到6分钟之间出现的ΔA(560-700nm)的差来测量。HDL-C根据ΔA_t测量，ΔA_t是在0到2分钟之间出现的ΔA(560-700nm)的变化。(ΔA是在560nm处测量的吸光度与在700nm处测量的吸光度之差。)在本实施例的实验中，用M5分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量ΔA。

标以“参考测定”的测量采用Siemens

化学和方法(Siemens HealthcareDiagnostics,Inc.)来进行。

获得了下列满足临床测定要求的相关性：

LDL-胆固醇：对于15个样品和对照：y＝0.989*x；R²＝0.978；x范围：7.7–230mg/dL；x平均值＝118.1；估计值/平均值的标准差＝6.8％

HDL-胆固醇：对于10个样品：y＝0.98*x+1.35；R²＝0.98；x范围40.3–103.4mg/dL；x平均值67.2mg/dL；估计值/平均值的标准差＝4.0％

总胆固醇：对于14个样品和对照：y＝0.977*x；R²＝0.980；x范围15–304mg/dL；x平均值＝195.6mg/dL；估计值/平均值的标准差＝4.3％(其中*代表乘以)。

本发明方法和参考方法的这些结果以图形的形式在图4中显示。本发明方法和参考方法的LDL-C结果以图形的形式在图4A中显示。本发明方法和参考方法的HDL-C结果以图形的形式在图4B中显示。本发明方法和参考方法的TC结果以图形的形式在图4C中显示。

用于计算HDL-C的公式通过用来自相同测定的LDL-C的估计值加上在0到2分钟之间测量的速率而得出(其中*代表乘以)：

HDL-胆固醇＝1.30-0.446*LDL-C+1255.5*(ΔA(560-700nm),2min-(ΔA(560-700nm),0min)

用于计算HDL-C的公式通过用来自相同测定的LDL-C的估计值加上在0到2分钟之间测量的速率而得出(其中*代表乘以)。

两个因子(LDL-C和(ΔA(560-700nm),2min-(ΔA(560-700nm),0min)都高度地显著性相关(p<0.0001)。

使用测得的吸光度、TC和从吸光度数据计算的LDL-C的试验和误差组合，通过在此呈现的测定结果的多重回归分析，得出上述等式。

结论：特定试剂配方和反应产物的动力学测量的使用允许同时测量总、LDL和HDL胆固醇。

实施例3甘油三酯测定

甘油三酯(TG)水平可通过以下测定来测量：在该测定中，如图1B所示，样品中的甘油三酯分解成其构成成分脂肪酸和甘油，而甘油水平通过光度法来测量。在三磷酸腺苷(ATP)的存在下，甘油可以被甘油激酶磷酸化，而产生的磷酸甘油被甘油3-磷酸氧化酶氧化以产生二羟基丙酮磷酸和过氧化氢。过氧化氢和辣根过氧化物酶(或其他过氧化物酶)可与着色剂反应以产生染料，该染料可用分光光度计测量，以确定样品的甘油三酯含量。用于该TG测定的示例性试剂试剂AT和试剂BT在表4中示出。如本实施例所示，4-氨基安替比林和N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺会在过氧化氢的存在下与辣根过氧化物酶反应以形成紫色的醌亚胺(quinoneimine)染料；形成的染料的量可通过测量560nm处的吸光度来确定，如下面的程序所示，并且如图5中报告的实验结果所示。

甘油三酯测定试剂

该测定使用一种酶反应级联，该级联导致过氧化氢(H₂O₂)的产生，过氧化氢被辣根过氧化物酶(HRP)使用，生成紫色的有色产物。这类测定中使用的试剂包括试剂AT和试剂BT。适合于这类试剂的组成的实例在表4A中示出，并且特定的具体示例性试剂AT和BT的组成在表4B中示出。

表4A–甘油三酯测定试剂

特定的示例性试剂AT和BT可根据如表4B中所示的成分和量来制备。

表4B–甘油三酯测定试剂

用于EDTA抗凝血浆的血清中甘油三酯的示例性测定程序

1.样品(和/或校准物)用水按1:30比例稀释。

2.在测定前，使试剂和稀释后的样品达到37℃。

3.稀释后的样品、如表4B中描述的试剂AT和试剂BT各20μL在384-孔微量滴定板中的孔内混合。

4.稀释后的样品、如表4B中描述的试剂AT和试剂BT的混合物在37℃下孵育10分钟。

5.第4步后，采用微量滴定板读取仪(Molecular Devices M5)读取560nm处的吸光度。

根据上述方法进行的TG测量在图5中示出(该测量提供数据点沿垂直轴的位置)；将数据点相对于根据现有技术方法(由Teco Diagnostics提出的方法，使用可商购的TecoKit试剂盒(Teco Diagnostics,Anaheim,CA 92807)的试剂)获得的TG测量值作图。用本发明方法测量的TG与现有技术TG测量值非常紧密地一致。如果现有技术方法与本发明方法之间存在完美的一致性，则经过这些点画出的线的斜率应该是1。如图5所示，通过经过这些点的线性回归而画出的线的斜率非常接近于1(斜率＝0.9536)。因此，此实施例中所述的TG测定方法与其他被广泛接受的方法有非常好的相关性。

实施例4血液胆固醇和甘油三酯组合测量

可对同一血液样品的整分试样或对取自同一患者的不同血液样品进行胆固醇(C)和甘油三酯(TG)的测量，以便与单独测量C或单独测量D所能达到的相比提供更完整的临床信息。另外，TG测量可用于提供血液样品中VLDL的测量。因此，LDL-C、HDL-C、TC、VLDL-C和TG的测量可以通过实施例1、2和3的方法获得，并通过以下公式估算VLDL-C：

VLDL-C＝TG/5。

TC可根据本文公开的方法和测定直接测量；类似地，HDL-C和LDL-C可根据本文公开的方法和测定直接测量。由于TC是样品中的总胆固醇的量度，所以TC是样品中脂蛋白部分中的胆固醇的总和，并因此可通过关系式TC＝HDL-C+LDL-C+VLDL-C来估算。因此，通过重排，VLDL-C的更好的测定可以如下所示由HDL-C、LDL-C和TC的测得量获得：

VLDL-C＝TC-HDL-C-LDL-C

并且可根据本文描述的方法和公式来确定。

如上所述，本文公开了由HDL-C、LDL-C和TC的测量值以及由TG、HDL-C、LDL-C和TC的测量值确定VLDL-C的进一步方法。例如，在实施方案中，在受试者血液的单一样品或样品的单一部分中VLDL-C的水平可通过下面的关系式计算：

VLDL-C＝αTC+βHDL-C+γLDL-C+δTG+a₁(TG+ε)(TC+κ)+λ

其中α、β、γ、δ和a₁分别是乘以TC、HDL-C、LDL-C、TG和交叉项(TG+ε)(TC+κ)的常数(在交叉项中，一个括号内的项与另一个括号内的项相乘)；且其中ε、κ和λ分别是与TG、TC和所有其他因子之和相加的加常数。在特定的实施方案中，当γ＝0时，受试者血液的单一样品或样品的单一部分中VLDL-C的水平可由这些测量值来计算，例如，通过关系式：

VLDL-C＝αTC+βHDL-C+δTG+a₁(TG+ε)(TC+κ)+λ

其中α、β、δ和a₁分别是乘以TC、HDL-C、LDL-C、TG和(TG+ε)(TC+κ)的常数；且其中ε、κ和λ是分别与TG、TC和所有其他因子之和相加的加常数。

VLDL-C的这种计算的一个实例在图6中示出，其中基于本文公开的测量由上述等式确定的VLDL-C的20个值(沿Y轴绘制)相对于通过现有技术超速离心法测得的相应VLDL-C测量值(沿X轴绘制)作图。如图6所示，根据上述公式计算的VLDL-C值非常准确地追循通过现有技术方法获得的值。在图6所示的图中，λ(“截距”)的值为-2.62；α的值为0.15；β的值为-0.55；δ的值为0.15；a₁的值为0.0015；ε的值为-192；κ的值为-188。由上述等式计算的VLDL-C值与通过超速离心法获得的VLDL-C值非常一致(R平方为0.959)。图中示出的最优拟合线使用JMP软件(SAS institute,Inc.,Cary NC,27513)计算，并且对该模型和这些参数的方差分析得到93.4的F比，表明这样的良好拟合只是偶然发现的，概率小于0.001，这是非常有意义的结果。

虽然以上是对在此描述的实施方案的描述，但使用不同的替代方案、修改和等同方案是可能的。应当理解，除非上下文中明确规定，否则在此处的说明书和随后的整个权利要求书中使用的“一个”“一种”和“该”的含义包括复数的指示物。同样，除非上下文中明确规定，否则在此处的说明书和随后的整个权利要求书中使用的“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。最后，除非上下文中特别规定，否则在此处的说明书和随后的整个权利要求书中使用的“和”和“或”的含义包括连接的和分隔的含义，而且可以可互换地使用。因此，除非上下文中特别规定，否则在使用术语“和”或“或”的语境中，这类连词的使用不排除“和/或”的含义。

Claims

1.一种用于在胆固醇测定中使用的试剂，所述试剂由以下所述构成：0.1mM–10mM的环糊精、0.1g/L–20g/L的硫酸葡聚糖、1mM–10mM的氯化镁、1mM至5mM的4-氨基安替比林和pH6-8的磷酸钠缓冲液，硫酸葡聚糖与镁离子之比为0.002至0.02，其中的葡聚糖分子量小于100千道尔顿。

2.一种用于试验的试剂，所述试验用于测量受试者血液样品中脂蛋白中总胆固醇、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇中至少两者，且没有所述脂蛋白的显著沉淀，其由以下所述构成：pH 6至pH 8的磷酸钠缓冲液，0.01％-1％的Triton X-100、0.5g/L–20g/L普朗尼克L64、0.5mM至20mM的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(ALPS)、0.5kU/L–20kU/L辣根过氧化物酶、100U/L–5000U/L来自假单胞菌属的种的胆固醇酯酶和0.25kU/L–10kU/L来自假单胞菌属的种的胆固醇氧化酶。

3.一种包含试剂和关于所述试剂在胆固醇测定中的使用的说明书的试剂盒，该试剂包含权利要求1或2所述的试剂。

4.一种包含至少第一试剂和第二试剂及关于所述试剂在胆固醇测定中的使用的说明书的试剂盒，其中所述第一试剂包含权利要求1的试剂，且所述第二试剂包含权利要求2的试剂。