KR101507313B1 - 광열 바이오센서를 이용한 시알산 정량측정 장치 및 방법 - Google Patents

광열 바이오센서를 이용한 시알산 정량측정 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 측온저항체(RTD)를 포함하는 하부층, 상기 하부층 위의 절연층을 포함하는 중간층 및 상기 중간층 위에 위치하며 적혈구 막 표면의 시알산과 화학결합하는 상부층을 포함하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서 및 이를 포함하는 시알산 정량측정 장치를 제공한다. 상기 시알산 정량측정 장치는 상기 상부층의 페닐붕소산(PBA)층과 적혈구 막 표면의 시알산의 직접적으로 화학결합하여 적혈구를 포획한 후 빛 조사에 의한 적혈구의 온도 변화로부터 간단하게 시알산의 양을 측정할 수 있는 작용효과가 있다.

Description

광열 바이오센서를 이용한 시알산 정량측정 장치 및 방법{Apparatus and method of quantitative Analysis of Sialic Acid using a Photothermal Biosensor}
본 발명은 적혈구 막의 시알산을 정량적으로 측정하는 장치 및 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 적혈구 헤모글로빈의 광열 효과를 이용하여 시알산을 정량적으로 측정하는 장치 및 방법에 관한 것이다.
인슐린 의존성 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM)은 전세계적으로 3,000만 명의 환자가 있는 것으로 추정되고 있다. 인슐린 의존성 당뇨병은 주로 사춘기에 가까운 청소년들에게서 흔하나, 다른 나이 대에서도 발병할 수 있으며, 제1형 당뇨병이라고도 불리운다. 이 병이 발병하는 이유는 랑게르한스섬 베타세포에 대한 자가면역반응에 의해 베타세포가 대량으로 괴사하기 때문이다. 제1형 당뇨병은 인슐린을 생산하는 베타세포의 기능이 상실되므로 췌장은 글루코스에 반응하지 못하고, 전형적인 인슐린 부족 증상(다뇨, 다식, 다갈, 체중감소)이 나타난다. 따라서 제1형 당뇨병은 고혈당과 생명을 위협하는 케토산혈증의 특징이 있는 대사상태를 피하기 위하여 외부로부터의 인슐린 투여가 필요하다.
상기 인슐린은 혈액 속의 포도당의 양을 일정하게 유지시키는 호르몬으로서, 인슐린의 세포 수용체에는 만노스, 갈락토스, 푸코스, N-아세틸글루코사민, 시알산을 함유하는 올리고당 측쇄가 존재한다.
이 중 시알산(Sialic Acid(SA), N-acetylneuraminic acid)은 뉴라민산(neuraminic acid)의 유도체로서, 음으로 하전된 단당류이다. 또한 시알산은 보통 적혈구 막에 있는 글리칸 체인(glycan chain)의 말단에 제시된다(Schauer, 2000). 이러한 시알산은 악성 암(Raz 등, 1980; Dobrossy 등, 1981; Passaniti와 Hart, 1988) 및 당뇨병(Vahalkar와 Haldankar, 2008; Mazzanti 등, 1997; Moretti 등, 2002)의 중요한 임상적 파라미터가 될 수 있다
먼저, 적혈구 막의 표면에서 과도하게 제시된 시알산은 여러 가지 암들 중 악성이고 전이성인 유전자형으로 임상적으로 인지되고 있다.
또한, 시알산은 면역 시스템이 “자기” 및 “비자기”를 구분하는데 도움을 주는 역할을 할 수 있는데, 이 시스템이 무너지면 면역 시스템이 “자기”를 공격하는 이른바 자가면역 현상이 나타나게 된다. 따라서 적혈구 막의 표면에서 적게 제시된 시알산은 자가면역질환의 일종인 제1형 당뇨병의 지표로서 인식될 수 있다. 최근 분석에서는, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM) 환자는 건강한 사람보다 시알산이 38% 저감되었다고 보고된 바 있다(Vahalkar와 Haldankar, 2008).
이와 같이 시알산 양을 측정함으로써 암 또는 당뇨병인지 여부를 진단할 수 있으므로, 시알산 양을 정량적으로 측정하는 장치 및 방법이 개발되어 왔다.
그 중에서도 상업화된 시알산 정량화 시약들을 사용하는 방법은, 다양한 효소들이 필요하여 분석비용이 매우 비싸며, 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다.
최근에는 전기장 효과 트랜지스터(field effect transistor; FET)계 시알산 측정방법이 개발되었으나, 마찬가지로 분석시간이 길고, 시알산과 FET 센서 표면이 매우 가까이 위치해야 하므로 조작이 어려운 단점이 있다.
따라서 현재 사용되고 있는 시알산 측정법들은 전문적인 훈련과 측정장비들을 필요로 하며 가격이 비싸고, 측정시간이 오래 걸리는 문제점이 있다.
기존의 시알산 정량분석법의 한계를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 광열효과를 이용한 간편한 시알산 정량 측정 장치 및 측정 방법을 제시한다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 효소반응 과정의 필요 없이 광열효과를 통하여 직접적으로 시알산의 양을 측정하는 시알산 정량측정 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 전문적인 인력이 필요 없이 간단하게 시알산의 양을 측정하는 시알산 정량측정 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 빠른 시간 내에 정확하게 시알산의 양을 측정하는 시알산 정량측정 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 당뇨병 진단장치로 적용할 수 있는 시알산 정량측정 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 시알산 정량측정 장치 및 방법에 사용될 수 있는 마이크로 열센서 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 측온저항체(RTD)를 포함하는 하부층, 상기 하부층 위의 절연층을 포함하는 중간층 및 상기 중간층 위에 위치하며 적혈구 막 표면의 시알산과 화학결합하는 상부층을 포함하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서를 제공한다.
상기 상부층은, 상기 중간층 위에 위치하는 금(Au) 박막층, 상기 금(Au) 박막층 위에 위치하는 자가조립 단분자층(SAM) 및 상기 자가조립 단분자층(SAM) 위에 위치하는 페닐붕소산(PBA)층을 포함할 수 있다.
상기 자가조립 단분자층(SAM)은 상기 금 박막층의 금(Au)과 결합을 형성할 수 있는 화합물을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 자가조립 단분자층은 아미노알칸싸이올, Fmoc-알칸싸이올, 카르복시알칸싸이올, 카르복시알칸설파이드, 숙신이미딜 알칸다이설파이드, 킬레이트 알칸싸이올, 페로세닐 알칸싸이올,하이드록시알칸싸이올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 하나의 물질로 형성될 수 있으며, 이 중 카르복시알칸싸이올 화합물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 카르복시알칸싸이올의 싸이올 기가 상기 금(Au) 박막층의 금 원자와 결합할 수 있으며, 상기 카르복시알칸싸이올 화합물은 10-카르복시-1-데칸싸이올(10-carboxy-1-decanethiol)인 것이 바람직하다.
상기 페닐붕소산(PBA)층은 시료의 적혈구와 직접적으로 접촉하는 층으로 상기 페닐붕소산(PBA)층의 말단이 적혈구 막 표면의 시알산과 결합하여 적혈구를 포획하는 역할을 수행한다.
상기 페닐붕소산(PBA)층은 상기 자가조립 단분자층(SAM)과 결합을 형성할 수 있는 화합물로 형성될 수 있다. 상기 페닐붕소산 층은 페닐붕소산계 화합물이 형성된 것으로 아미노페닐붕소산 화합물을 사용하여 형성될 수 있으며, 바람직하게는 상기 아미노페닐붕소산 화합물은 3-아미노페닐붕소산(3-aminoophenylboronic acid)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 페닐붕소산(PBA)층이 상기 아미노페닐붕소산 화합물을 사용하여 형성되면, 상기 아미노페닐붕소산 화합물은 자가조립 단분자층(SAM) 말단의 카르복시기와 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
상기 측온저항체(RTD)는 금속 화합물을 포함하며, 바람직하게는 백금(Pt)을 사용하여 형성될 수 있다.
상기 절연층은 산화물을 포함하며, 바람직하게는 SiO2 를 사용하여 형성될 수 있다.
본 발명은, 측온저항체(RTD)를 포함하는 하부층 위에 절연층을 포함하는 중간층을 형성하는 단계, 상기 중간층 위에 금(Au) 박막층을 증착하는 단계, 상기 금(Au) 박막층 위에 자가조립 단분자층(SAM)을 형성하는 단계 및 상기 자가조립 단분자층(SAM) 위에 페닐붕소산(PBA) 층을 형성하는 단계를 포함하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 제조방법을 제공한다.
상기 절연층을 포함하는 중간층을 형성 단계는 실리콘 산화막을 형성하는 단계이며, 예를 들면, 상기 실리콘 산화막은 플라스마-강화 화학기상 증착법(PECVD)을 사용하여 증착될 수 있다.
상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 이전에는 증착된 금(Au) 박막층 표면을 세척할 수 있다.
상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 단계는 상기 금(Au) 박막층의 금과 결합을 형성할 수 있는 화합물과 알코올의 혼합 용액에 금(Au) 박막층이 증착된 마이크로 열센서를 침지시켜 형성될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 자가조립 단분자층(SAM)은 카르복시알칸싸이올 및 알코올 혼합용액에 금(Au) 박막층이 증착된 마이크로 열센서를 침지시킴으로써 형성될 수 있으며, 상기 카르복시알칸싸이올은 10-카르복시-1-데칸싸이올(10-carboxy-1-decanethiol)이 바람직하다.
또한, 상기 혼합용액에서 상기 카르복시알칸싸이올 농도는 5 ~ 15 mM 인 것이 바람직하다.
상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 후, 상기 금(Au) 박막층의 금과 결합하지 못한 화합물을 세척할 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 상기 금(Au) 박막층의 금과 결합하지 못한 카르복시알칸싸이올 화합물을 초순수로 세척한 후 순수한 알코올에서 초음파 처리할 수 있다.
또한, 상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 후, 자가조립 단분자층(SAM)의 표면에 위치하는 말단기를 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 자가조립 단분자층(SAM)이 카르복시알칸싸이올을 사용하여 형성되는 경우, 상기 자가조립 단분자층의 표면에 노출된 말단 카르복시기를 활성화시킬 수 있다. 상기 카르복실기 활성화는 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride을 용질로, DMF를 용매로 하여 80 내지 120mM(mmol/L)농도의 혼합용액을 만들고, 마이크로 열센서를 30분 내지 1시간 30분 동안 상기 혼합용액에 침지시켜 수행될 수 있다.
상기 페닐붕소산(PBA)층 형성 단계는 자가조립 단분자층(SAM)이 형성된 마이크로 열센서를 페닐붕소산(PBA)계 화합물을 포함하는 용액에 침지시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 페닐붕소산(PBA)층은 DMF와 페닐붕소산계 화합물이 포함된 NaOH 용액의 부피비가 1:0.5 내지 1:2인 혼합 용액에 상기 자가조립 단분자층(SAM)이 형성된 마이크로 열센서를 15 내지 30시간 동안 침지시켜 형성될 수 있다. 상기 용액은 약 15 내지 25℃일 수 있으며, 상기 페닐붕소산계 화합물이 포함된 NaOH 용액에서 페닐붕소산 화합물의 농도는 15 ~ 25 mM인 것이 바람직하다. 또한, 상기 페닐붕소산계 화합물은 3-아미노페닐붕소산(3-aminophenylboronic acid)일 수 있다.
본 발명은, 적혈구를 포함하는 전혈시료에 빛을 조사하는 레이저 모듈, 상기 조사되는 빛에 대응하여 변화하는 적혈구의 온도를 검출하는 검출부 및 검출된 온도를 이용하여 적혈구 막 표면의 시알산의 양을 측정하는 측정부를 포함하는 시알산 정량측정 장치를 제공한다.
상기 레이저 모듈은 500 ~ 1,000 nm의 빛을 조사할 수 있으며, 532 nm의 빛을 조사하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 레이저 모듈은 CWDPSS(Continous Wave Diode Pumped Solid State)인 것이 바람직하다.
상기 검출부는 전혈시료가 안착되는 본 발명에서 제공되는 마이크로 열센서 및 상기 마이크로 열센서에 연결되어 측온저항체(RTD)의 저항의 변화에 따라 가열된 적혈구로부터 발생한 열변화 신호를 검출하는 전류-전압계(I-V meter)를 포함할 수 있다.
상기 시알산 정량측정 장치는, 상기 레이저 모듈로부터 공급되는 전원을 제어하는 파워 컨트롤러, 상기 레이저 모듈로부터 조사되는 빛을 규칙적인 시간 간격으로 단속하는 광학 초퍼 및 상기 레이저 모듈로부터 조사되는 빛의 세기를 측정하는 광학 파워미터를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명에서 제공되는 마이크로 열센서에 안착된 전혈시료에 레이저 모듈로부터 빛을 조사하는 단계, 빛이 조사된 적혈구의 온도 변화를 측정하는 단계 및 측정된 적혈구의 온도 변화로부터 시알산 양을 계산하는 단계를 포함하는 시알산 정량측정 방법을 제공한다.
상기 레이저 모듈은 532nm의 빛을 조사하는 것이 바람직하고, 적혈구의 온도 변화는 측온저항체(RTD)를 통하여 측정될 수 있다.
본 발명의 시알산 정량 측정 방법 및 장치를 통하여 효소반응 과정의 필요 없이 광열효과를 통하여 직접적으로 시알산의 양을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 시알산 정량 측정 방법 및 장치를 통하여 전문적인 인력이 필요 없이 간단하게 시알산의 양을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 시알산 정량 측정 방법 및 장치를 통하여 빠른 시간 내에 정확하게 시알산의 양을 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 마이크로 열센서의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 마이크로 열센서의 제조공정을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 시알산 정량적 측정장치를 설명하기 위하여 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 일예 및 이를 포함하는 시알산 정량측정 장치의 일예를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 광열효과를 이용한 시알산 정량측정 방법을 설명하기 위한 설명도이다.
도 6은 본 발명의 마이크로 열센서 금(Au) 박막층 표면 처리의 각 단계 이후 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 광열효과에 따른 각 실험결과를 나타낸 도면이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예들에 따른 장치 및 상기 장치의 제조 방법에 대하여 상세하게 설명하지만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면에 있어서, 유사한 구성 요소에 대해서는 유사한 참조 부호를 사용한다. 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로 사용된다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다", "구비하다" 또는 "구성되다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
첨부된 도면에 있어서, 기판, 층(막) 또는 패턴들 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다. 본 발명에 있어서, 각 층(막), 패턴 또는 구조물들이 기판, 각 층(막) 또는 패턴들의 "상에", "상부에" 또는 "하부"에 형성되는 것으로 언급되는 경우에는 각 층(막), 패턴 또는 구조물들이 직접 기판, 각 층(막) 또는 패턴들 위에 형성되거나 아래에 위치하는 것을 의미하거나, 다른 층(막), 다른 패턴 또는 다른 구조물들이 기판 상에 추가적으로 형성될 수 있다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들에 따른 장치 및 장치 제조방법을 상세하게 설명한다.
광열효과
색소포(Chromophore)는 특정 파장의 광자를 흡수하고 이를 열에너지로 전환할 수 있는데(Anderson과 Parrish, 1983), 적혈구 내의 헤모글로빈 분자 역시 전형적인 색소포에 해당한다.
단일 적혈구 내에는 2억 7천만 헤모글로빈 분자가 있으며, 각각의 헤모글로빈 분자는 4개의 헴(heme) 그룹을 가진다. 각각의 헴 그룹은 헤테로고리인 포르피린 고리 중앙에 철(Fe) 원자를 포함하고 있다.
이러한 철(Fe) 이온들은 418nm, 530-545nm, 및 577-595nm에서 광자(photon)를 흡수하고 이를 열에너지로 전환할 수 있다. 특히, 532nm 파장의 빛을 잘 흡수하며, 이 파장에서 적혈구의 상기 광열효과에 의한 파라미터는 잘 확립되어 있다(Lapotko 등, 2002; Lapotko와 Lukianova, 2005; Lapotko, 2006; Almond와 Patel, 1996).
본 발명에서는 이러한 상기 적혈구에 대한 광열효과를 이용하여 시알산의 양을 정량적으로 측정할 수 있는 하기와 같은 마이크로 열센서를 제시한다.
마이크로 열센서
본 발명의 발명자는 적혈구의 광열효과를 이용한 헤모글로빈의 정량적 측정장치를 개발한 바 있으며, 상기 발명은 국내공개특허 제10-2011-0057341호로 공개되었다.
상기 공개특허에 개시된 마이크로 열센서는 측온저항체(Resistance Temperature Detector; RTD) 및 상기 측온저항체와 연결된 도선부를 포함하는 센서로서 이에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 마이크로 열센서는 상기 공개특허의 마이크로 열센서를 표면처리한 것으로서, 기판(substrate) 위에 측온저항체(RTD)를 포함하는 하부층, 상기 하부층 위의 절연층을 포함하는 중간층 및 상기 중간층 위에 위치하며 적혈구 막 표면의 시알산과 화학결합하는 상부층을 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 구조의 일예를 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 실시예들에 따른 마이크로 열센서(22)의 구조는 기판(210) 위에 하부층인 백금 측온저항체(RTD)(215)가 위치하고, 그 위에 절연층(220)을 포함하는 중간층이 위치한다. 상기 절연층(220) 상에는 금(Au) 박막층(230)이 위치하며, 상기 금(Au) 박막층(230) 위에 자가조립 단분자층(SAM)(240)이 위치한다. 자가조립 단분자층(SAM)(240) 위의 최외각에는 페닐붕소산(PBA)층(250)이 위치한다.
상기 기판(210)으로는 내열충격성이 있고, 실리콘(148 W/m*K)보다 낮은 열전도성(1.005 W/m*K) 및 낮은 열팽창계수(32.5 x 10-7 ℃-1)를 가지는 유리 기판을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 파이렉스 유리 웨이퍼를 사용할 수 있다.
상기 하부층은 측온저항체(RTD, 215)를 포함한다. 상기 측온저항체(RTD, 215)는 온도변화에 의한 저항변화 값으로부터 온도를 측정할 수 있는 온도계이다. 상기 측온저항체(RTD)는 도선부와 연결되며, 금속을 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 측온저항체(RTD)는 백금(Pt)을 사용하여 형성될 수 있다.
상기 중간층은 하부층 위에 위치하며, 상부층(260)과 하부층 사이의 전기 절연을 할 수 있는 절연층(220)을 포함한다. 상기 절연층(220)은 SiO2 막일 수 있다.
상기 상부층(260)은 적혈구 막 표면의 시알산과 화학결합할 수 있는 화합물이 최외각에 도포됨으로써 시알산-매개 가교에 의한 적혈구를 직접적으로 포획하는 층이다.
상기 시알산과 결합을 형성할 수 있는 화합물로는 페닐붕소산 (Phenylboronic acid, PBA)계 화합물이 사용될 수 있다. 상기 페닐붕소산계 화합물은 시알산의 양 또는 농도에 따라 결합하여 포획되는 적혈구의 개수가 달라지게 된다. 페닐붕소산계 화합물로 포획된 적혈구의 개수는 광열효과를 통하여 측정될 수 있으며, 이를 통하여 시알산의 양 또는 농도를 측정할 수 있다.
상기 상부층(260)은 상기 절연층(220) 위에 위치하는 금(Au) 박막층(230), 상기 금(Au) 박막층(230) 위에 위치하는 자가조립 단분자층(SAM)(240) 및 상기 자가조립 단분자층(SAM)(240) 위에 위치하는 페닐붕소산(PBA)층(250)를 포함한다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 금(Au) 박막층(230) 상에 상기 자가조립 단분자층(SAM)(240)이 화학결합을 통해 부착되며, 상기 자가조립 단분자층(SAM)(240) 상에 화합결합을 통해 페닐붕소산층(250)이 부착될 수 있다.
상기 자가조립 단분자층(SAM, 240)은 상기 금 박막층(230)의 금(Au)과 결합을 형성할 수 있는 화합물을 사용하여 형성될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 자가조립 단분자층(240)은 아미노알칸싸이올, Fmoc-알칸싸이올, 카르복시알칸싸이올, 카르복시알칸설파이드, 숙신이미딜 알칸다이설파이드, 킬레이트 알칸싸이올, 페로세닐 알칸싸이올, 하이드록시알칸싸이올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 물질을 사용하여 형성될 수 있다.
예를 들면, 상기 자가조립 단분자층(SAM)은 카르복시알칸싸이올 화합물을 사용하여 형성될 수 있다. 상기 카르복시알칸싸이올 화합물의 싸이올 기는 상기 금(Au) 박막층의 금 원자와 결합함으로써 단단하게 연결될 수 있다. 상기 카르복시알칸싸이올 화합물로는 15-Carboxyl-1-pentadecanethiol, 10-carboxy-1-decanethiol, 7-Carboxy-1-heptanethiol, 5-Carboxy-1-pentanethiol 또는 Carboxy-EG6-undecanethiol 등을 포함할 수 있으며, 10-carboxy-1-decanethiol을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 페닐붕소산(PBA)층(250)은 페닐붕소산계 화합물을 사용하여 형성된 층이다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 페닐붕소산(PBA)층(250)과 상기 자가조립 단분자층(SAM)(240)과의 결합을 강화하기 위하여 아미노페닐붕소산 화합물을 사용하여 형성시킬 수 있으며, 이때 아미노페닐붕소산의 아미노기와 자가조립 단분자층(SAM)의 카르복실기의 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 예를 들면, 상기 페닐붕소산층(250)은 3-아미노페닐붕소산을 사용하여 형성될 있다.
상기 상부층(260)의 최외각에 형성된 상기 페닐붕소산(PBA)층(250)은 적혈구 막 표면의 시알산과 직접 화학결합할 수 있으며, 이 결합을 통하여 시알산과 연결되어 있는 적혈구를 포획할 수 있다.
마이크로 열센서의 제조방법
본 발명의 상기 마이크로 열센서는 마이크로 열센서의 패턴을 형성한 후, 형성된 패턴 위에 페닐붕소산(PBA) 처리를 함으로써 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 상기 마이크로 열센서의 제조방법은 측온저항체(RTD)(215)를 포함하는 하부층 위에 절연층(220)을 포함하는 중간층을 형성하는 단계, 상기 중간층 위에 금(Au) 박막층(230)을 증착하는 단계, 상기 금(Au) 박막층(230) 위에 자가조립 단분자층(SAM)(240)을 형성하는 단계, 및 상기 자가조립 단분자층(SAM)(240) 위에 페닐붕소산(PBA)층(250)을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
도 2는 본 발명의 시알산 정량측정에 사용되는 마이크로 열센서의 패턴 형성과정을 설명하는 도면으로서, 상기 증착된 금 박막층(230)을 자가조립 단분자층(SAM)(240) 및 페닐붕소산(PBA)으로 표면처리하기 이전의 단계는 도 2를 참조하여 설명하기로 한다.
도 2를 참조하면, 상기 마이크로 열센서 상의 절연층(220) 및 금(Au) 박막층(230)은 포토리소그라피(photolithography) 방식을 이용하여 형성될 수 있으며, 리프트-오프(lift-off) 공정을 사용하여 형성될 수 있다.
먼저, 열 특성이 우수한 파이렉스 7740 유리 웨이퍼 (열전도도: 1.005W/m*K, 열팽창계수: 32.5 X 10-7/℃)에 AZ1512 포토레지스트 조성물을 도포하여 포토레지스트 막을 형성한 후 포토레지스트 막을 노광하고 현상하여 포토레지스트 패턴을 형성할 수 있다.
상기 포토레지스트 막은 상기 포토레지스트 조성물을 스핀 코팅하여 형성될 수 있으며, 약 3000rpm으로 스핀 코팅하여 형성될 수 있다.
상기 웨이퍼 상에 포토레지스트 막을 형성하기 전 상기 포토레지스트 막과 웨이퍼의 접착을 강화하기 위하여 hexamethyldisilazane(HMDS, [(CH3)3Si]2NH])을 약 4000rpm으로 스핀 코팅하는 단계를 더 수행할 수 있다.
상기 포토레지스트 막 형성 후 얼라이너를 이용하여 UV로 상기 포토레지스트 막을 노광한다. 상기 얼라이너는 Karl Suss MA6 Mask Aligner를 사용할 수 있으며, 상기 노광 공정은 14 mJ/cm2으로 365nm 파장의 UV를 이용하여 약 10 초 내지 15초, 바람직하게는 약 13초 동안 수행할 수 있다.
노광 공정 후 상기 포토레지스트 막에 대해 현상 공정을 수행하여 포토레지스트 패턴을 형성한다. 상기 현상 공정은 4차 암모늄 수산화 용액을 사용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 AZ300 (Clariant Industries, Ltd.)을 사용하여 25초 동안 수행할 수 있다.
상기 포토레지스트 패턴 상에 크롬(Cr) 층과 백금(Pt) 층을 형성한다. 상기 크롬(Cr) 층은 상기 백금(Pt) 층과 상기 웨이퍼 기판의 접착성을 향상시키기 위하여 형성될 수 있으며, 약 200Å의 두께로 형성될 수 있다. 상기 백금(Pt) 층은 측온저항체(RTD)로 사용되며, 약 1000Å의 두께로 형성될 수 있다.
상기 백금(Pt) 층과 크롬(Cr) 층을 형성한 후에, 상기 포토레지스트 패턴과 함께 E-beam 증발장치를 사용하여 패턴을 형성할 수 있다.
이 후 아세톤을 이용하여 상기 포토레지스트 패턴을 제거하여 측온저항체(RTD)를 형성하는 백금(Pt) 막 패턴을 형성할 수 있다.
다시 도 2를 참조하면, 상기 측온저항체(RTD)로 기능하는 백금(Pt) 막 패턴 상에 절연층을 형성한다. 상기 절연층은 장치 제조 및 실험에 사용되는 용액들로 인한 저항 변화를 차단하는 역할을 수행한다.
상기 절연층은 실리콘 산화물을 사용하여 플라스마-강화 화학기상 증착법(PECVD)법으로 형성될 수 있으며 약 700Å 내지 1200Å, 바람직하게는 1000Å의 두께로 증착될 수 있다.
상기 절연층이 형성된 후에는 상기 절연층 상에 크롬(Cr) 층과 금(Au) 박막층을 증착한다. 상기 크롬 층은 약 200 Å의 두께로 증착될 수 있으며, 상기 금(Au) 박막층은 약 1000 Å의 두께로 증착될 수 있다.
상기 크롬(Cr) 층과 금(Au) 박막층은 포토리소그라피 공정을 사용하여 습식 식각 공정을 수행함으로써 패턴을 형성할 수 있다.
상기 크롬 층과 금 박막층 패턴에 의해 노출된 절연층을 콘택트 패드(contact pad) 형성을 위해 습식 식각 공정을 수행할 수 있다.
제작한 마이크로 열센서의 성능을 검증하기 위하여 J-type 열전쌍과 전열기, 펠티에 소자를 이용하여 보정실험을 수행한 결과는 도 2의(i)와 같다.
이하에서는 상기 패턴이 형성된 마이크로 열센서의 표면처리 단계를 설명하기로 한다.
먼저, 상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 이전에는 증착된 금(Au) 박막층 표면을 세척할 수 있다.
상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 단계는 상기 금(Au) 박막층의 금과 결합을 형성할 수 있는 화합물과 알코올의 혼합 용액에 금(Au) 박막층이 증착된 마이크로 열센서를 침지시켜 형성될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 자가조립 단분자층(SAM)은 카르복시알칸싸이올 및 알코올 혼합용액에 금(Au) 박막층이 증착된 마이크로 열센서를 침지시킴으로써 형성될 수 있으며, 상기 카르복시알칸싸이올은 10-카르복시-1-데칸싸이올(10-carboxy-1-decanethiol)이 바람직하다.
또한, 상기 혼합용액에서 상기 카르복시알칸싸이올 농도는 5 ~ 15 mM 인 것이 바람직하다.
상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 후, 상기 금(Au) 박막층의 금과 결합하지 못한 화합물을 세척할 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 상기 금(Au) 박막층의 금과 결합하지 못한 카르복시알칸싸이올 화합물을 초순수로 세척한 후 순수한 알코올에서 초음파 처리할 수 있다.
또한, 상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 후, 자가조립 단분자층(SAM)의 표면에 위치하는 말단기를 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 자가조립 단분자층(SAM)이 카로복시알칸싸이올을 사용하여 형성되는 경우, 상기 자가조립 단분자층의 표면에 노출된 말단 카르복시기를 활성화시킬 수 있다. 상기 카르복실기 활성화는 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride을 용질로, DMF를 용매로 하여 80 내지 120 mM(mmol/L)농도의 혼합용액을 만들고, 마이크로 열센서를 30분 내지 1시간 30분 동안 상기 혼합용액에 침지시켜 수행될 수 있다.
상기 페닐붕소산(PBA)층 형성 단계는 자가조립 단분자층(SAM)이 형성된 마이크로 열센서를 페닐붕소산(PBA)계 화합물을 포함하는 용액에 침지시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 페닐붕소산(PBA)층은 DMF와, 페닐붕소산계 화합물이 포함된 NaOH 용액의 부피비가 1:0.5 내지 1:2인 혼합 용액에 상기 자가조립 단분자층(SAM)이 형성된 마이크로 열센서를 15 내지 30시간 동안 침지시켜 형성될 수 있다. 상기 용액은 약 15 내지 25℃일 수 있으며, 상기 페닐붕소산계 화합물이 포함된 NaOH 용액에서 페닐붕소산계 화합물의 농도는 15 ~ 25 mM인 것이 바람직하다. 또한, 상기 페닐붕소산계 화합물은 3-아미노페닐붕소산(3-aminophenylboronic acid)일 수 있다.
시알산 정량측정 장치
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 시알산 정량적 측정장치를 설명하기 위하여 도시한 도면이다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 시알산 정량적 측정장치는 적혈구를 포함하는 전혈시료에 빛을 조사하는 레이저 모듈(10), 레이저 모듈(10)로부터 조사되는 빛에 대응하여 변화하는 적혈구의 온도를 검출하는 검출부(20) 및 검출된 온도를 이용하여 시알산의 양을 측정하는 측정부(30)를 포함한다.
상기 레이저 모듈(10)은 시알산 정량측정 장치의 상부에 설치할 수 있으며, 상기 검출부(20)에 수직으로 설치되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 상기 레이저 모듈(10)은 0.03W/cm2의 에너지 밀도에서 9.6W/cm2까지 가변적으로 변화시킬 수 있으며, CWDPSS(Continuous wave Diode Pumped Solid State) 모듈을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 레이저 모듈(10)은 500 내지 1,000 nm 범위의 파장의 빛을 조사할 수 있으며, 바람직하게는 500 내지 700 nm 범위의 파장, 더욱 바람직하게는 532 nm 파장의 빛을 조사한다.
또한, 상기 레이저 모듈(10)의 레이저 빔 반경은 약 2.0 mm인 것이 바람직하며, 레이저 모듈(10)의 파워 안정성은 3% 이내로 4시간 이상 지속되는 것이 바람직하다.
상기 검출부(20)는 전혈시료가 안착되는 마이크로 열센서(22) 및 상기 마이크로 열센서(22)에 연결되어 측온저항체(RTD)의 저항의 변화에 따라 가열된 적혈구로부터 발생한 열변화 신호를 검출하는 전류-전압계(I-V meter)(24)를 포함한다. 상기 마이크로 열센서(22)는 본 발명의 표면처리된 마이크로 열센서를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 시알산 정량측정 장치는 상기 레이저 모듈(10)로부터 공급되는 전원을 제어하는 파워 컨트롤러(40), 상기 레이저 모듈(10)로부터 조사되는 빛을 규칙적인 시간 간격으로 단속하는 광학 초퍼(50) 및 상기 레이저 모듈(10)로부터 조사되는 빛의 세기를 측정하는 광학 파워미터(60)를 더 포함할 수 있다.
한편, 도 4는 본 발명의 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 일예 및 이를 포함하는 시알산 정량측정 장치의 일예를 나타낸다. 구체적으로, 도 4의 (a)는 시알산 정량 측정 마이크로 열센서의 일예이고, 도 4의 (b)는 도 4의 (a)의 마이크로 열센서의 특성을 나타내며, 도 4의 (c)는 시알산 정량측정 장치의 시스템을 설명하는 설명도이며, 도 4의 (d)는 항온시스템을 나타내는 도면이다.
도 4(a) 및 (b)를 참조하면, 상기 마이크로 열센서(22)의 페닐붕소산(PBA) 개질 영역의 지름은 약 1 mm일 수 있으며, 이때 이론적으로 20,000개 이상의 적혈구와 결합할 수 있다.
도 4(d)를 참조하면, 상기 항온시스템은 일정한 온도 분포를 보장하기 위하여 알루미늄 블록(237 W/m*K)이 사용될 수 있다.
또한, 상기 항온시스템의 한 면에는, 2개의 전열기 및 1개의 K-형 열전쌍이 설치될 수 있다. 상기 2개의 전열기는 상기 열전쌍에 의하여 측정되는 시스템 온도를 증가시키기 위하여 사용된다. 상기 열전쌍의 뚜껑은 빛의 침투를 허용할 수 있으며, 532 nm 파장의 빛을 조사하는 경우 약 20 mm 두께의 아크릴을 사용하는 것이 바람직하다.
도 4(c)를 참조하면, 상기 전열기 및 열전쌍은 PID 컨트롤러(proportional-integral-derivative controller)에 연결되어 일정한 온도(<±0.1℃)를 유지할 수 있다.
본 발명의 마이크로 열센서(22)는 일정한 센서 온도를 유지하기 위하여 상기 알루미늄 블록에 위치할 수 있고, Bayonet Neill-Concelman cables 등의 도선부를 통하여 측정부(30)에 연결될 수 있다.
시알산 정량측정 방법
본 발명에서는 상기 마이크로 열센서 및 이를 포함하는 시알산 정량측정 장치를 이용하여 시알산을 정량적으로 측정할 수 있다.
본 발명의 시알산 정량측정 방법은, 시알산의 농도가 마이크로 열센서(22)에 결합한 적혈구의 농도에 비례하고, 결합한 적혈구의 농도는 빛 조사시 결합한 적혈구 온도 변화에 비례하는 점을 이용하여 적혈구 온도 변화로부터 역으로 시알산의 양을 측정하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 정량측정 방법은, 본 발명에서 제공되는 마이크로 열센서(22)에 안착된 전혈시료에 레이저 모듈(10)로부터 빛을 조사하는 단계, 빛이 조사된 적혈구의 온도 변화를 측정하는 단계 및 측정된 적혈구의 온도 변화로부터 시알산 양을 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
도 5는 본 발명의 광열효과를 이용한 시알산 정량측정 방법을 설명하기 위한 설명도이다.
도 5를 참조하면, 먼저 본 발명의 표면처리된 마이크로 열센서(22)에 전혈시료가 안착된다. 상기 전혈시료와 마이크로 열센서(22)의 표면의 결합은 50 초 이상, 바람직하게는 60초 이상 진행하는 것이 바람직하다.
상기 안착된 전혈시료에 상기 시알산 정량측정 장치의 레이저 모듈(10)을 이용하여 빛을 조사한다. 상기 레이저 모듈(10)은 532 nm의 빛을 조사하는 것이 바람직하다.
상기 레이저 모듈(10)로부터 빛을 조사하게 되면 전혈시료 내의 적혈구에서 온도 변화가 발생하게 되며, 상기 적혈구의 온도변화는 마이크로 열센서(22)의 측온저항체(RTD)(215)를 통하여 측정할 수 있다.
상기 측정된 적혈구의 온도 변화로부터 상기 정량측정 장치의 검출부(30)를 통하여 적혈구 막 표면의 시알산의 양을 계산할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 1> 마이크로 열센서의 표면처리
1) 절연층이 도포된 마이크로 열센서의 표면 층을 깨끗하게 만들기 위하여, O2 플라스마 기기를 사용하여 1000W의 파워로 300초 동안 처리(세척)한다.
2) 10-카르복시-1-데칸싸이올(10-carboxy-1-decanethiol)을 알코올에 넣어서 10 mM(mmol/L)농도의 용액을 만든 후, 마이크로 열센서를 상기 용액 속에 침지시킨다.
3) 표면에 결합되지 않은 10-카르복시-1-데칸싸이올(10-carboxy-1-decanethiol)을 초순수(DI WATER)로 충분히 세척한 후, 순수한 알코올에서 초음파(sonication)로 5분 동안 진동시킨다. 이 과정을 2번 반복하여 실행한다.
4) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(용질), DMF(N,N-Dimethylformamide)(용매)에 넣어 100 mM(mmol/L)농도의 용액을 만든다. 상기 용액에 3)번 과정을 통하여 깨끗이 세척된 마이크로 열센서를 30분 내지 1시간 30분 동안 침지시켜 자가조립 단분자층 말단의 카르복시기를 활성화시킨다.
5) 1M(mol/L)농도의 NaOH 용액을 만들고, 상기 NaOH 용액에 3-아미노페닐붕소산(3-aminophenylboronic acid)(용질)을 넣어 20 mM (mmol/L)농도로 만든다. DMF 및 3-아미노페닐붕소산(3-aminophenylboronic acid)이 포함된 NaOH 용액을 1:1 부피비로 혼합시킨다. 마이크로 열센서를 상기 혼합 용액에 상온에서 24시간 동안 담근다.
6) 표면처리가 끝난 마이크로 열센서를 20 mM(mmol/L) 페닐붕소산 (pH 7.4), 155 mM농도의 NaCl의 용액에 담그어 보관한다.
도 6은 상기 제조예에서 마이크로 열센서 금 박막층 표면 처리의 각 단계 이후 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, 도 6의 (a) 내지 (c)는 마이크로 열센서 표면처리의 각 단계를 전자주사현미경(Scanning electron microscopy; SEM)으로 찍은 결과이며, 도 6의 (d) 내지 (f)는 각 단계에서 10ul의 초순수(DI Water)와 센서 표면의 접촉 각도를 나타낸다. 도 6의 (g)는 적혈구 표면의 시알산(SA)과 표면 처리된 마이크로 열센서의 페닐붕소산(PBA)계 화합물 사이의 가교결합으로 포획된 적혈구를 나타내는 전자주사현미경 이미지를 나타낸 것이다.
< 제조예 2> 전혈시료의 제조
1) 피신(Ficin) 효소가 시알산의 다양한 농도를 가진 적혈구를 생산하기 위하여 사용되었다. 상기 피신은 당단백질을 포함한 막단백질을 절단하고, 그 후 시알산과 같은 당류를 방출하는 시스테인 프로테아제이다.
2) 또한, 혈액 샘플의 응고를 방지하기 위하여 EDTA 용액(Lavender BC Vacutainer®)을 사용하였다.
3) 1% w/v 저장 용액을 생산하기 위하여 1 g의 드라이 피신 파우더가 포스페이트 완충 염분(155 mM NaCl 용액을 포함하는 pH 7.4의 PBS 20 mM) 100ml에 투입되었다.
4) 상기 피신 용액을 세척된 적혈구 샘플에 동일 부피로 가해졌다.
5) 37 ℃에서 지정된 시간 동안, 적혈구와 피신의 혼합 및 배양 후에, 각각의 샘플은 4 ℃ 아래로 즉시 냉각되었고, 추가 효소 반응을 방지하기 위하여 많은 양의 PBS로 세 번 세척하였다.
6) 각각의 전혈시료 샘플에 대하여 30초, 60초, 90초, 및 120초 동안 피신 처리를 수행하였다.
< 실험예 >
도 7(a)는 상기 제조예에 의하여 제조된 전혈시료로부터 측정된 시알산의 함량의 결과를 나타낸다.
상기 시알산 측정 방법으로 종래의 효소반응을 이용한 시알산 정량분석 방법을 이용하였다. 상기 효소로서 N-acetylneuraminic acid aldolase 및 β-nicotinamide-adenine dinucleotide(β-NADH)가 사용되었다.
상기 N-acetylneuraminic acid aldolase는 α(2→3,6,8,9)를 포함한 모든 시알산 연결을 촉매반응시켜, 시알산을 피루브산으로 분리시킬 수 있으며, 상기 β-nicotinamide-adenine dinucleotide(β-NADH)은 상기 피루브산을 락틱산으로 환원시킨다. 상기 β-NADH 산화 정도는 분광광도계를 이용하여 측정되며, 이를 통하여 시알산의 양이 측정되었다.
구체적으로, 20 ㎕의 시알리다아제 버퍼 및 80 ㎕의 초순수가 각 샘플(9.8×107 cells/20㎕)에 가해졌다. 그 후, 세포들을 5분 동안 90℃로 가열하고, 이어서 실온으로 냉각함으로써 죽였다. 모든 시알산 연결들을 절단하기 위하여, 1 ㎕의 α(2→3,6,8,9)-neuraminidase가 상기 용액에 가해지고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 1 ~ 200 nmol 시알산 (R2=0.9213) 범위의 표준 시알산 용액을 사용하여 보정이 수행되었다.
피신 처리되지 않은 샘플의 시알산 농도와 30초, 60초, 90초 및 120초 동안 피신 처리된 4개 샘플의 시알산 농도는, 각각, 379.3±25.9, 363.7±4.0, 288.9±17.5, 271.6±30.9 및 183.6±9.5 pmol/106 cells이었으며, 그 결과는 도 7(a)에 도시된다.
또한, 피신 처리되지 않은 샘플의 시알산(SA) 농도에 대비하여 30초, 60초, 90초, 및 120초 피신 처리된 샘플들의 감소된 시알산(SA) 농도 퍼센트는 각각, 4.1%, 23.8%, 28.4%, 및 51.6%이다.
도 7(b)는 마이크로 열센서에 대한 본 발명의 마이크로 열센서와 전혈시료의 최적의 결합시간 결과를 나타낸다.
상기 결과는 결합시간에 따른 포획된 적혈구의 수에 의해 결정되었으며, 도 7(b)에서 시알산(SA)-페닐붕소산(PBA) 커플링은 약 50초 후에 포화됨이 확인된다.
도 7(c)는 시알산(SA) 농도에 따른 적혈구의 결합 친화도 결과를 나타낸다.
상기 결합 친화도 테스트를 위하여, 상기 표면처리된 마이크로 열센서 위에 세척된 전체 혈액 샘플 1 ㎕를 위치시키고, 60초 동안 적혈구 막 표면의 시알산과 마이크로 열센서 최외각의 페닐붕소산(PBA)층을 반응시켰다.
상기 전체 혈액 샘플 1 ㎕ 부피의 반경은 5.3 mm2이었고, 이는 상기 PBA로 표면처리된 마이크로 열센서 영역보다 6.8배 크다. 상기 반응 후에, 상기 마이크로 열센서는 결합하지 않은 적혈구를 제거시키기 위하여 페닐붕소산(PBS) 용액에 담근다.
상기 도 7(c)를 참조하면, 379.3±25.9 pmol/106 cells의 시알산(SA) 농도를 가지는, 상기 전체 혈액 샘플의 경우에, 상기 결합된 적혈구 농도는 58±17 cells/mm2 이다. 30초, 60초, 90초 및 120초 동안 피신 처리된 샘플은, 각각, 52±6, 45±11, 37±1 및 25±2 cells/mm2의 농도를 나타낸다. 따라서 포획된 적혈구의 농도는 시알산의 농도에 비례하며, 시알산의 농도가 높은 시료가 결합 친화도가 높음을 알 수 있다.
도 7(d)는 시알산 농도 및 레이저 세기에 따른 온도 적혈구의 온도 변화를 나타낸다. 상기 테스트를 위하여 사용되는 시료는 상기 결합 친화도 테스트를 위한 것과 같은 것이다.
본 실험에서는 시알산 농도에 따른 온도 변화(△T = TMesuered - TBare SA chip)를 보면, 시알산 농도에 따라 적혈구의 온도 변화가 비례함을 알 수 있다. 또한, 각각의 시알산 농도에서 레이저 세기에 따른 온도 변화 역시 비례함을 알 수 있다.
10: 레이저 모듈 20: 검출부
22: 마이크로 열센서 24: 전류-전압계
30: 측정부 40: 광학 컨트롤러
50: 광학 초퍼 60: 광학 파워미터
210: 기판 215: 측온저항체
220: 절연층 230: 금(Au) 박막층
240: 자가조립 단분자층(SAM) 250: 페닐붕소산(PBA)층
260: 상부층

Claims (35)

  1. 측온저항체(RTD)를 포함하는 하부층;
    상기 하부층 위에 위치하는 절연층을 포함하는 중간층; 및
    상기 중간층 위에 위치하며 적혈구 막 표면의 시알산과 화학결합하는 상부층;
    을 포함하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서에 있어서,
    상기 상부층은,
    상기 중간층 위에 위치하는 금(Au) 박막층;
    상기 금(Au) 박막층 위에 위치하는 자가조립 단분자층(SAM); 및
    상기 자가조립 단분자층(SAM) 위에 위치하는 페닐붕소산(PBA)층;
    을 포함하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 자가조립 단분자층(SAM)은 아미노알칸싸이올, Fmoc-알칸싸이올, 카르복시알칸싸이올, 카르복시알칸설파이드, 숙신이미딜 알칸다이설파이드, 킬레이트 알칸싸이올, 페로세닐 알칸싸이올, 하이드록시알칸싸이올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 하나의 물질로 형성되는 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  4. 제3항에 있어서, 상기 자가조립 단분자층(SAM)은 카르복시알칸싸이올 화합물로 형성되는 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  5. 제4항에 있어서, 상기 카르복시알칸싸이올의 싸이올 기는 상기 금(Au) 박막층의 금 원자와 결합하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  6. 제4항에 있어서, 상기 카르복시알칸싸이올 화합물은 10-카르복시-1-데칸싸이올(10-carboxy-1-decanethiol)인 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  7. 제1항에 있어서, 상기 페닐붕소산(PBA)층은 페닐붕소산계 화합물로 형성된 것인 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  8. 제7항에 있어서, 상기 페닐붕소산계 화합물로 아미노페닐붕소산 화합물을 사용하여 자가조립 단분자층(SAM) 말단의 카르복시기와 아마이드 결합을 형성하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아미노페닐붕소산 화합물은 3-아미노페닐붕소산인 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  10. 제1항에 있어서, 상기 페닐붕소산(PBA)층의 말단이 적혈구 막 표면의 시알산과 화학결합하여 적혈구를 포획하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  11. 제1항에 있어서, 상기 측온저항체는 백금(Pt)을 사용하여 형성되는 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  12. 제1항에 있어서, 상기 절연층은 SiO2를 사용하여 형성되는 시알산 정량측정 마이크로 열센서.
  13. 측온저항체(RTD)를 포함하는 하부층 위에 절연층을 포함하는 중간층을 형성하는 단계;
    상기 중간층 위에 금(Au) 박막층을 증착하는 단계;
    상기 금(Au) 박막층 위에 자가조립 단분자층(SAM)을 형성하는 단계; 및
    상기 자가조립 단분자층(SAM) 위에 페닐붕소산(PBA)층을 형성하는 단계;
    를 포함하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 중간층 형성 단계는 SiO2막을 형성하는 것인 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 SiO2막은 플라스마-강화 화학기상 증착법(PECVD)으로 증착되는 것인 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 단계 이전에 증착된 금(Au) 박막층 표면을 세척하는 단계를 더 포함하는 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 단계는 카르복시알칸싸이올 및 알코올 혼합용액에 금(Au) 박막층이 증착된 마이크로 열센서를 침지시키는 것인 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 카르복시알칸싸이올은 10-카르복시-1-데칸싸이올 (10-carboxy-1-decanethiol)인 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 혼합용액에서 10-카르복시-1-데칸싸이올(10-carboxy-1-decanethiol)의 농도는 5 ~ 15 mM인 시알산 정량측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 단계 후, 결합하지 않은 카르복시알칸싸이올 화합물을 초순수로 세척한 후 순수한 알코올에서 초음파 처리하는 단계를 더 포함하는 시알산 정량 측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 자가조립 단분자층(SAM) 형성 단계 후, 자가조립 단분자층(SAM)의 말단 카르복시기를 활성화시키는 단계를 더 포함하는 시알산 정량 측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 카르복실기 활성화는 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride을 용질로, DMF를 용매로 하여 80 내지 120mM(mmol/L) 농도의 혼합용액을 만들고, 마이크로 열센서를 30분 내지 1시간 30분 동안 상기 혼합용액에 침지시키는 것인 시알산 정량 측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  23. 제13항에 있어서, 상기 페닐붕소산(PBA)층 형성 단계는 자가조립 단분자층(SAM)이 형성된 마이크로 열센서를 DMF : 페닐붕소산계 화합물이 포함된 NaOH 용액의 부피비가 1:0.5 내지 1:2인 혼합용액에 15 내지 25℃에서 15 내지 30시간 동안 침지시키는 것인 시알산 정량 측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 페닐붕소산계 화합물이 포함된 NaOH 용액에서 페닐붕소산 화합물의 농도는 15 ~ 25 mM인 시알산 정량 측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 페닐붕소산계 화합물은 3-아미노페닐붕소산(3-aminophenylboronic acid)인 시알산 정량 측정 마이크로 열센서의 제조방법.
  26. 적혈구를 포함하는 전혈시료에 빛을 조사하는 레이저 모듈;
    상기 조사되는 빛에 대응하여 변화하는 적혈구의 온도를 검출하는 검출부; 및
    검출된 온도를 이용하여 적혈구 막 표면의 시알산의 양을 측정하는 측정부;를 포함하는 시알산 정량측정 장치에 있어서,
    상기 검출부는 전혈시료가 안착되는 제1항, 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항의 마이크로 열센서를 포함하는 시알산 정량측정 장치.
  27. 제26항에 있어서, 상기 레이저 모듈은 500 ~ 1,000nm의 빛을 조사하는 시알산 정량측정 장치.
  28. 제27항에 있어서, 상기 레이저 모듈은 532nm의 빛을 조사하는 시알산 정량측정 장치.
  29. 제26항에 있어서, 상기 레이저 모듈은 CWDPSS(Continous Wave Diode Pumped Solid State)인 시알산 정량측정 장치.
  30. 삭제
  31. 제26항에 있어서, 상기 검출부는 상기 마이크로 열센서에 연결되어 측온저항체(RTD)의 저항의 변화에 따라 가열된 적혈구로부터 발생한 열변화 신호를 검출하는 전류-전압계(I-V meter)를 더 포함하는 시알산 정량측정 장치.
  32. 제26항에 있어서,
    상기 레이저 모듈로부터 공급되는 전원을 제어하는 파워 컨트롤러;
    상기 레이저 모듈로부터 조사되는 빛을 규칙적인 시간 간격으로 단속하는 광학 초퍼; 및
    상기 레이저 모듈로부터 조사되는 빛의 세기를 측정하는 광학 파워미터;
    를 더 포함하는 시알산 정량측정 장치.
  33. 제1항, 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항의 마이크로 열센서에 안착된 전혈시료에 레이저 모듈로부터 빛을 조사하는 단계;
    빛이 조사된 적혈구의 온도 변화를 측정하는 단계; 및
    측정된 적혈구의 온도 변화로부터 시알산 양을 계산하는 단계;
    를 포함하는 시알산 정량측정 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 레이저 모듈은 532nm의 빛을 조사하는 것인 시알산 정량측정 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 적혈구의 온도 변화는 측온저항체(RTD)를 통하여 측정되는 것인 시알산 정량측정 방법.
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