CN109416358A

CN109416358A - 非人哺乳动物tk1蛋白水平的确定

Info

Publication number: CN109416358A
Application number: CN201780039279.6A
Authority: CN
Inventors: S·埃里克松; H·罗恩伯格; K·K·贾加拉穆迪
Original assignee: Alberti Veterinary Diagnostics Co
Current assignee: Alberti Veterinary Diagnostics Co
Priority date: 2016-08-10
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2019-03-01
Also published as: AU2017310218B2; US20190185582A1; AU2017310218A1; WO2018030946A1; CA3031645A1; JP2019532260A; JP7015294B2; EP3497449A4; EP3497449A1; EP3497449B1; EP3497449C0

Abstract

本发明公开了一种用于确定样品中非人哺乳动物TK1的试剂盒。所述试剂盒包含固定到载体上或意图固定到载体上的第一抗体。所述试剂盒还包含第二抗体。所述抗体中的一种对由来自非人哺乳动物TK1的C‑末端区域的第一氨基酸序列组成的肽具有特异性，且另一种抗体对由来自TK1活性位点的氨基酸序列组成的肽或对由来自所述C‑末端区域的第二氨基酸序列组成的肽具有特异性。

Description

非人哺乳动物TK1蛋白水平的确定

技术领域

本发明实施方案通常涉及TK1蛋白水平的确定，且尤其涉及包括使用抗-TK1抗体来确定非人哺乳动物TK1蛋白水平的试剂盒和方法。

背景技术

狗经常受到各种肿瘤疾病如淋巴瘤、白血病和乳腺肿瘤的影响。淋巴瘤是最常见的血液肿瘤形式，并且占所有狗癌症的5％。据估计，每10万只狗的年发病率为13至40例。就导致疾病进展的遗传和环境因素而言，犬淋巴瘤与人非霍奇金淋巴瘤相似。早期诊断与有效化学疗法相结合可以控制恶性肿瘤。已经研究了几种增殖标志物，包括嗜银核仁组织区(AgNOR)、增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki-67作为犬淋巴瘤的预后标志物，但它们的用途仅限于免疫组织化学。还研究了血清乳酸脱氢酶(LDH)作为用于监测犬淋巴瘤的标志物，但是LDH在除恶性肿瘤之外的疾病中上调，因此具有有限的临床价值(von Euler等人，2006)。

其他非人哺乳动物也患有各种赘生性疾病，诸如猫和马。

肿瘤进展依赖于细胞增殖，并且增殖标志物对于检测处于早期阶段的肿瘤疾病是有价值的。胸苷激酶1(TK1)是在不受控制的细胞生长期间释放到血液中的生物标志物之一。TK1将脱氧胸苷(dT)转化为脱氧胸苷单磷酸(dTMP)，最终将其掺入增殖细胞中的DNA中。TK1活性与细胞周期紧密相关，并且在S-期达到峰值，在G2期迅速下降，并在M期由特定机制退化。

血清TK1活性测量是用于诊断和监测人医学中淋巴瘤和白血病的既定工具。血清TK1活性通过使用几种酶测定法测量，例如TK放射性酶测定法(TK-RIA)如或TK化学发光免疫测定法(TK-CLIA)如TK，其中胸苷底物类似物如¹²⁵I-碘脱氧尿苷或叠氮胸苷(AZT)被磷酸化成相应的单磷酸酯。研究表明，TK-REA测定法和TK-CLIA测定法都为犬血液肿瘤的预后和治疗监测提供了有价值的信息。最近的一项研究，使用天然底物[3H]-dThd(脱氧胸苷)代替底物类似物，表明该测定法与TK-REA和TK-CLIA测定法同样灵敏，并且可以用于监测犬淋巴瘤(Sharif等人，2012a)。

针对人TK1蛋白的不同区域的抗体的开发进一步扩展了TK1确定的临床效用。基于抗体检测方法的几项临床研究展示，来自患有各种肿瘤疾病的患者的血清中的TK1蛋白水平增加。此外，发现TK1蛋白测定法对实体肿瘤的预后和治疗监测比TK1活性测定法更灵敏。已经进行了若干尝试来开发用于检测人医学中的乳腺癌、血液恶性肿瘤和肺癌的TK酶联免疫吸附测定(TK-ELISA)方法(Carlsson等人，2009；Alegre等人，2014)。

目前，还没有可用于非人哺乳动物肿瘤学研究的免疫化学方法。然而，最近已经使用基于针对狗TK1C-末端的抗体的免疫亲和测定法执行了研究(Kiran Kumar等人，2013；Jagarlamudi等人，2014)。这允许确定患有各种恶性肿瘤的犬受试者中的血清TK1蛋白水平，并得出结论，TK1蛋白测定法对来自健康狗的犬实体肿瘤的分化比TK1活性测定法更灵敏。Kiran Kumar 2010公开了用于检测血清TK1的抗狗TK1抗体的产生。通过用对应于狗TK1中氨基酸196至223的28个氨基酸长的肽免疫兔来产生抗体。

然而，仍然需要临床上可接受的技术来测量非人哺乳动物受试者中的TK1蛋白水平。

发明内容

一般目的是提供用于测量非人哺乳动物中TK1蛋白水平的试剂盒和方法。

通过本文定义的实施方案满足该目的和其他目的。

这些实施方案的一个方面涉及一种用于确定样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平的试剂盒。该试剂盒包含固定到载体上或意图固定到载体上的第一抗体以及第二抗体。第一抗体和第二抗体之一对由来自非人哺乳动物TK1的C-末端区域的氨基酸序列组成的肽具有特异性。第一抗体和第二抗体中的另一种对i)由来自TK1的活性位点的第一氨基酸序列组成的肽或ii)由来自该C-末端区域的第二氨基酸序列组成的肽具有特异性。来自C-末端区域的第二氨基酸序列与来自C-末端区域的第一氨基酸序列不同。

这些实施方案的另一方面涉及一种用于确定样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平的方法。该方法包括使样品与如上定义的试剂盒的第一抗体和第二抗体接触。该方法还包括检测结合的第二抗体的量。

这些实施方案的另一方面涉及一种用于估计非人哺乳动物受试者中肿瘤疾病复发的可能性的方法。该方法包括使用根据上述的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括比较身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平与代表健康非人哺乳动物受试者群体的非人哺乳动物TK1蛋白的水平或先前在非人哺乳动物受试者中确定的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括基于该比较估计非人哺乳动物受试者中肿瘤疾病复发的可能性。

这些实施方案的又一方面涉及一种用于确定非人哺乳动物受试者中的细胞增殖的方法。该方法包括使用根据上述的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括基于该身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平确定细胞增殖。

这些实施方案的另一方面涉及一种用于确定患有恶性肿瘤疾病的非人哺乳动物受试者中的增殖过程响应的方法。该方法包括使用根据上述的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括基于身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平确定增殖过程响应。

这些实施方案的又一方面涉及一种用于确定非人哺乳动物受试者中的炎症、感染或肿瘤细胞增殖的水平的方法。该方法包括使用根据上述的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括基于身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平确定炎症、感染或肿瘤细胞增殖的水平。

这些实施方案的另一方面涉及一种用于评价治疗非人哺乳动物受试者中的恶性肿瘤疾病的效率的方法。该方法包括在恶性肿瘤疾病治疗开始之前或结合恶性肿瘤疾病治疗的开始使用根据这些实施方案的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括在治疗恶性肿瘤疾病期间或之后使用根据这些实施方案的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括基于在恶性肿瘤疾病治疗开始之前或结合恶性肿瘤疾病治疗的开始在身体样品中确定的非人哺乳动物TK1蛋白的水平与在治疗恶性肿瘤疾病期间或之后在身体样品中确定的非人哺乳动物TK1蛋白的水平的比较评价治疗恶性肿瘤疾病的效率。

这些实施方案能够确定非人哺乳动物受试者中的TK1蛋白水平。这些实施方案的试剂盒和方法易于执行，快速且与现有TK1活性测定法一样灵敏且特异。另外，这些试剂盒和方法在区分健康非人哺乳动物与患有实体肿瘤的非人哺乳动物方面比TK1活性测定法更灵敏。

附图说明

可以通过参考以下结合附图的描述来最佳地理解实施方案以及它的其他目的和优点，在附图中：

图1示出人TK1(GenBank登录号KO_2582；SEQ ID NO:4)、狗TK1(本文中也称为犬TK1，GenBank登录号XM_540461；SEQ ID NO:3)、猫TK1(本文中也称为猫科动物TK1，GenBank登录号XP_3997286.2；SEQ ID NO:9)和马TK1(本文中也称为马科TK1，GenBank登录号XP_1491131.2；SEQ ID NO:17)推导的氨基酸序列的氨基酸序列比对。在马TK1中，进行编码保守N-末端肽的寡核苷酸序列(人、狗和猫TK1中TK1中的氨基酸1-27)MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGP(SEQ ID NO:18)的添加以制得GenBank推导的cDNA，从而产生与狗TK1和猫TK1蛋白具有相似总长度的重组马TK1蛋白，参见SEQ ID NO:10。抗体针对狗TK1的活性位点区域(CTK1p-161，狗TK1中的氨基酸161-183，AYTKRLGSEKEVEVIGGADKYHS(SEQ ID NO:7))、针对狗TK1的C-末端区域(CTK1p-211，狗TK1中的氨基酸211-225，VLVPGKPGEGKEATG(SEQ ID NO:11)；CTK1p-215，狗TK1中的氨基酸215-230，GKPGEGKEATGVRKLF(SEQ ID NO:1))和针对猫TK1的C-末端区域(FTK1p-213，猫TK1中的氨基酸213-227，GKPGEASGARKLFAP(SEQ ID NO:13))产生。该图还显示针对人TK1的活性位点区域(Ar-4，人TK1中的氨基酸161-183，AYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHS(SEQ ID NO:2))产生的小鼠单克隆抗-TK1抗体和针对狗TK1的C-末端区域(PAb-Arv1，狗TK1中的氨基酸215-230，GKPGEGKEATGVRKLF(SEQ ID NO:1))产生的兔多克隆抗体。

图2是夹心ELISA的示意图。这五个步骤是：(1)用第一抗-TK1抗体(捕获或包被抗体)包被微板孔，(2)将血清中的TK1与捕获抗体结合，(3)连接生物素化的抗-TK1抗体(检测抗体)到血清中的TK1，(4)通过链霉亲和素-HRP检测生物素，和(5)通过添加3,3-,5,5-四甲基二氨基联苯胺(TMB)显色底物监测酶活性。

图3示出标准曲线，其中相对于5次不同运行在450nM下的吸光度，其具有0.6ng/mL至10ng/mL的重组狗TK1的不同浓度。

图4A示出来自健康狗(●)和患有血液肿瘤的狗(■)的血清中的log STK1活性水平(pmol/min/mL)。直线表示中值。

图4B示出来自患有血液肿瘤的狗(n＝36)和来自健康狗(n＝30)的STK1活性测定结果的受者操作特征(ROC)曲线。

图4C示出来自健康狗(●)和患有血液肿瘤的狗(■)的血清中的log STK1蛋白水平。直线表示中值。

图4D示出与患有血液肿瘤的狗相比，健康狗的STK1蛋白水平(ng/mL)的ROC曲线分析。

图5A示出来自健康狗(●)和患有实体肿瘤的狗(■)的血清中的log STK1活性水平(pmol/min/mL)。直线表示中值。

图5B示出来自患有实体肿瘤的狗(n＝40)和来自健康狗(n＝30)的STK1活性测定结果的ROC曲线。

图5C示出来自健康狗(●)和患有实体肿瘤的狗(■)的血清中的log STK1蛋白水平。直线表示中值。

图5D示出与患有实体肿瘤的狗相比，健康狗的STK1蛋白水平(ng/mL)的ROC曲线分析。

图6示出狗肿瘤的不同亚组中的log STK1分布。(A)来自健康狗、患有淋巴瘤的狗、患有白血病的狗的血清中的Log STK1活性水平。(B)健康狗、患有乳腺肿瘤的狗、患有恶性黑素瘤的狗、患有肥大细胞瘤的狗和患有其他肿瘤的狗的Log STK1活性水平。(C)健康狗、患有淋巴瘤的狗、患有白血病的狗的血清中的STK1蛋白分布。(D)健康狗、患有乳腺肿瘤的狗、患有恶性黑素瘤的狗、患有肥大细胞瘤的狗和患有其他肿瘤的狗的STK1蛋白分布

图7A示出在患有淋巴瘤的狗的化学疗法期间来自狗的血清中的STK1活性水平。

图7B示出在患有淋巴瘤的狗的化学疗法期间来自狗的血清中的STK1蛋白水平。

图8示出用狗、猫和马重组TK1进行斑点印迹免疫测定的结果，其中(A)CTK1p-215抗血清，(B)CTK1p-161抗血清，(C)CTK1p-211抗血清和(D)FTK1p-213抗血清。

图9示出具有不同浓度的具有不同抗血清的(A)狗重组TK1、(B)猫重组TK1和(C)马重组TK1的任意单位(A.U.)的点强度。

图10示出标准曲线，在用CTK1p-215包被和CTK1p-161作为检测抗体的五个不同实验中，其具有在0.6ng/mL至10ng/mL的重组狗TK1范围内的不同浓度。

图11A示出来自健康狗(●)和患有血液恶性肿瘤的狗(■)的血清中的log STK1ELISA蛋白水平(ng/mL)。误差条表示中值。

图11B示出用于区分血液肿瘤狗(n＝15)与健康狗(n＝10)的STK1 ELISA测定法的ROC曲线。

图11C示出来自健康狗(●)和患有实体肿瘤的狗(■)的血清中的log STK1蛋白水平。误差条表示中值。

图11D示出与患有实体肿瘤的狗(n＝10)相比，健康狗的STK1蛋白水平(ng/mL)的ROC曲线分析。

图12示出标准曲线，在用CTK1p-211包被和CTK1p-215检测抗体的五次不同运行中，相对于450nM下的吸光度，其具有在0.6ng/mL至10ng/mL的重组狗TK1范围内的不同浓度。

图13A示出来自健康狗(●)和患有血液肿瘤的狗(■)的血清中的log STK1蛋白分布(ng/mL)。误差条表示中值。

图13B示出用于区分血液肿瘤(n＝15)与健康(n＝7)的STK1ELISA测定法的ROC曲线。

具体实施方式

本发明实施方案整体涉及非人哺乳动物TK1蛋白水平的确定，且尤其涉及包括使用抗-TK1抗体来确定非人哺乳动物TK1蛋白水平的试剂盒和方法。

人TK1的晶体结构已得到解析，并且除了少数残基外，该酶的主要部分，包括N-末端区域，在人、狗、猫和马中都是保守的，参见图1并且SEQ ID NO:3代表狗TK1(犬TK1)，SEQID NO:4代表人TK1，SEQ ID NO:9代表猫TK1(猫科TK1)，且SEQ ID NO:10代表马TK1(马科TK1)。例如，人TK1序列与狗TK1显示88.5％的相似性，但在C-末端区域发现显著的序列多样性(9.1％)。

这些实施方案的一个方面涉及一种用于确定样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平的试剂盒。该试剂盒包含固定到载体上或意图固定到载体上的第一抗体以及第二抗体。根据实施方案，第一抗体和第二抗体之一对由来自非人哺乳动物TK1的C-末端区域的氨基酸序列组成的肽具有特异性。第一抗体和第二抗体中的另一种对i)由来自TK1的活性位点的第一氨基酸序列组成的肽或ii)由来自该C-末端区域的第二氨基酸序列组成的肽具有特异性。来自C-末端区域的第二氨基酸序列与来自C-末端区域的第一氨基酸序列不同。

该试剂盒特别适合确定样品中非人哺乳动物血清TK1(STK1)蛋白的水平，该样品优选为来自非人哺乳动物受试者的身体样品。

由来自C-末端区域的第一氨基酸序列或第二氨基酸序列组成的肽优选是选自非人哺乳动物TK1的一部分的肽，其范围为从非人哺乳动物TK1的氨基酸位置200到末端(狗的氨基酸位置242、猫的氨基酸位置237和马的氨基酸位置237)。在一个具体的实施方案中，该肽选自TK1蛋白的一部分，其范围为从氨基酸位置205，优选210且更优选211到氨基酸位置240，优选235且更优选230。

该肽优选为N-聚体，其中N为在10至25范围内，优选在10至20范围内且更优选15、16或17的整数。

肽优选由非人哺乳动物TK1蛋白的C-末端区域中的N个连续氨基酸组成。

可以将至少一个另外的氨基酸如半胱氨酸残基添加到肽的N-末端或C-末端，优选N-末端，用作与其他分子如载体蛋白的偶联。

在一个实施方案中，由来自C-末端区域的第一氨基酸序列或第二氨基酸序列组成的肽具有对应于犬TK1中氨基酸位置215至230的氨基酸序列，参见图1，即具有氨基酸序列GKPGEGKEATGVRKLF(SEQ ID NO:1)。具有添加的N-末端半胱氨酸残基的相应氨基酸序列是CGKPGEGKEATGVRKLF(SEQ ID NO:5)。

在另一个实施方案中，由来自C-末端区域的第一氨基酸序列或第二氨基酸序列组成的肽具有对应于犬TK1中氨基酸位置211至225的氨基酸序列，参见图1，即具有氨基酸序列VLVPGKPGEGKEATG(SEQ ID NO:11)。具有添加的N-末端半胱氨酸残基的相应氨基酸序列是CVLVPGKPGEGKEATG(SEQ ID NO:12)。

在另一个实施方案中，由来自C-末端区域的第一氨基酸序列或第二氨基酸序列组成的肽具有对应于猫科TK1中氨基酸位置213至227的氨基酸序列，参见图1，即具有氨基酸序列GKPGEASGARKLFAP(SEQ ID NO:13)。具有添加的N-末端半胱氨酸残基的相应氨基酸序列是CGKPGEASGARKLFAP(SEQ ID NO:14)。

由来自TK1活性位点的氨基酸序列组成的肽优选是选自TK1的一部分的肽，其范围为从氨基酸位置150至氨基酸位置190。在一个具体的实施方案中，该肽选自TK1的一部分，其范围为从氨基酸位置155，优选160且更优选161到氨基酸位置185，优选183。

该肽优选为M-聚体，其中M为在10至40范围内，优选在20至30范围内且更优选23或24的整数。

肽优选由TK1蛋白活性位点中的M个连续氨基酸组成。

代表TK1活性位点的该部分在不同物种之间，诸如在人、犬、猫科和马科TK1之间显示出非常高的同源性水平，如图1所示。例如，在人TK1与犬TK1及猫科TK1之间在从氨基酸位置150延伸到氨基酸位置190的部分内仅在单个氨基酸位置存在差异。在人TK1和马科TK1之间的该区域中没有氨基酸差异。

因此，该肽可以由来自人TK1的活性位点、来自犬TK1、来自猫科TK1、来自马科TK1或来自另一种非人哺乳动物TK1的氨基酸序列组成。如本文呈现的实验数据显示，对来自人TK1活性位点的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体也特异性结合犬TK1。

在一个实施方案中，由来自TK1活性位点的氨基酸序列组成的肽具有对应于人TK1(和马科TK1)中氨基酸位置161至183的氨基酸序列，参见图1，即具有氨基酸序列AYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHS(SEQ ID NO:2)。具有添加的N-末端半胱氨酸残基的相应氨基酸序列是CAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHS(SEQ ID NO:6)。

在另一个实施方案中，由来自TK1活性位点的氨基酸序列组成的肽具有对应于犬科TK1中氨基酸位置161至183的氨基酸序列，参见图1，即具有氨基酸序列AYTKRLGSEKEVEVIGGADKYHS(SEQ ID NO:7)。具有添加的N-末端半胱氨酸残基的相应氨基酸序列是CAYTKRLGSEKEVEVIGGADKYHS(SEQ ID NO:8)。

在另一个实施方案中，由来自TK1活性位点的氨基酸序列组成的肽具有对应于猫科TK1中氨基酸位置161至183的氨基酸序列，参见图1，即具有氨基酸序列AYTKRLGAEKEVEVIGGADKYHS(SEQ ID NO:15)。具有添加的N-末端半胱氨酸残基的相应氨基酸序列是CAYTKRLGAEKEVEVIGGADKYHS(SEQ ID NO:16)。

在一个实施方案中，用于确定样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平的试剂盒包含固定到载体上或意图固定到载体上的第一抗体以及第二抗体。在该实施方案中，第一抗体和第二抗体之一对由来自TK1活性位点的氨基酸序列组成的肽具有特异性，且第一抗体和第二抗体中的另一种对由来自TK1的C-末端区域的氨基酸序列组成的肽具有特异性。

在一个具体的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一对由选自由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性，且第一抗体和第二抗体中的另一种对由选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性。因此，根据该实施方案的第一抗体和第二抗体的特定组合包括对由由SEQ ID NO:11组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ IDNO:2组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:11组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:6组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:11组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:7组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:11组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:8组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:12组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:2组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:12组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:6组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:12组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:7组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，和对由由SEQID NO:12组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:8组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体。

在一个优选的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一是CTK1p-211抗体，且第一抗体和第二抗体中的另一种是CTK1p-161抗体。在另一个优选的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一是CTK1p-211抗体，且第一抗体和第二抗体中的另一种是Arv4抗体。

在另一个具体的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一对由选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性，且第一抗体和第二抗体中的另一种对由选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性。因此，根据该实施方案的第一抗体和第二抗体的特定组合包括对由由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ IDNO:2组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:6组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQID NO:7组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:8组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:5组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:2组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:5组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:6组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:5组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:7组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，和对由由SEQ ID NO:5组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:8组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体。

在一个优选的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一是CTK1p-215抗体，且第一抗体和第二抗体中的另一种是CTK1p-161抗体。在另一个优选的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一是CTK1p-215抗体，且第一抗体和第二抗体中的另一种是Arv4抗体。在另一个优选的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一是PAb-Arv1抗体，且第一抗体和第二抗体中的另一种是CTK1p-161抗体。在又一个优选的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一是PAb-Arv1抗体，且第一抗体和第二抗体中的另一种是Arv4抗体。

在一个实施方案中，用于确定样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平的试剂盒包含固定到载体上或意图固定到载体上的第一抗体以及第二抗体。在该实施方案中，第一抗体和第二抗体之一对由来自TK1的C-末端区域的第一氨基酸序列组成的肽具有特异性，且第一抗体和第二抗体中的另一种对由来自TK1的C-末端区域的第二氨基酸序列组成的肽具有特异性。

第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是来自TK1的C-末端区域的不同氨基酸序列。然而，当比较例如CTK1p-211的氨基酸序列与CTK1p-215的氨基酸序列时，两个氨基酸序列可以如图1所示部分地重叠。

例如，如果第一氨基酸序列由N₁氨基酸组成且第二氨基酸序列由N₂氨基酸组成，则这两个氨基酸序列可以与P个氨基酸重叠。P等于或大于0，但小于N₁和N₂中最大者，即，0≤P<max(N₁，N₂)。

非常令人惊讶的是，对TK1的C-末端区域中可能至少部分地重叠的不同表位具有特异性的两种抗体可以用于确定非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该令人惊讶的发现的可能原因可能是TK1是多价的并且在重组TK1和血清TK1上都具有若干抗体结合位点。然而，尽管在重组和血清TK1复合物中具有多个潜在的抗体结合位点，但通常优选使用对不同表位具有特异性的两种不同抗体以降低交叉反应性并增加特异性。

在一个具体的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一对由选自由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性，且第一抗体和第二抗体中的另一种对由选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性。因此，根据该实施方案的第一抗体和第二抗体的特定组合包括对由由SEQ ID NO:11组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:11组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:5组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，对由由SEQ ID NO:12组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体，和对由由SEQ ID NO:12组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体和对由由SEQ ID NO:5组成的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体。

在一个优选的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一是CTK1p-211抗体，且第一抗体和第二抗体中的另一种是CTK1p-215抗体。在另一个优选的实施方案中，第一抗体和第二抗体之一是CTK1p-211抗体，且第一抗体和第二抗体中的另一种是PAb-Arv1抗体。

这些抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体，或者它们中的一种可以是多克隆抗体，另一种是单克隆抗体。

在一个具体的实施方案中，对由来自非人哺乳动物TK1的C-末端区域的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体是多克隆抗体，并且对由来自TK1的活性位点的氨基酸序列组成的肽具有特异性的抗体是单克隆抗体。

这些抗体中的一种或两种可以是对相关肽具有特异性的抗体片段。在这种情况下，该片段可以选自由单链抗体、Fv片段、scFv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fd片段、单结构域抗体(sdAb)、scFv-Fc片段、di-scFv片段和CDR区组成的组。

可以基于亲和力和/或亲合力确定抗体的特异性。由抗体解离抗原的平衡常数(K_d)表示的亲和力是在抗原决定子与抗体上抗原结合位点之间的结合强度的量度。K_d值越小，抗原决定子和抗体之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和常数(K_a)，其是1/K_d。如本领域技术人员所清楚的，亲和力可以以本身已知的方式确定，这取决于关注的特定抗原。

亲合力是抗体与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与抗原决定子与抗体上的其抗原结合位点之间的亲和力和单克隆抗体上存在的相关结合位点的数量有关。

通常，抗体将以10^-5至10^-12摩尔/升(M)或更低且优选10^-7至10^-12M或更低且更优选10^-8至10^-12M的解离常数(K_d)与其抗原结合，即以10⁵至10¹²M^-1或更高且更优选10⁷至10¹²M^-1或更高且更优选10⁸至10¹²M^-1的缔合常数(K_a)与其抗原结合。

通常，通常认为任何大于10^-4M的K_d值(或低于10⁴M^-1的任何K_a值)指示非特异性结合。

优选地，实施方案的抗体或片段将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，诸如小于5nM的亲和力与血清形式和/或重组形式的非人哺乳动物TK1结合。

在一个具体的实施方案中，该试剂盒是夹心测定试剂盒。这意味着该试剂盒使用结合非人哺乳动物TK1蛋白的不同表位的抗体，使得第一抗体和第二抗体可以同时结合相同的非人哺乳动物TK1分子或复合物。

在一个具体的实施方案中，该试剂盒是酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，且优选夹心ELISA。

夹心ELISA可以用于通过制备载体如固体载体的表面来检测样品中的细胞和/或血清TK1蛋白，第一抗体与所述载体结合为所谓的捕获抗体。在一个优选的实施方案中，已知量的第一抗体与载体的表面结合。表面上的任何非特异性结合位点任选地但优选地被阻断。然后将样品施用到表面上，使得其中存在的任何非人哺乳动物TK1蛋白将被固定的第一抗体捕获。优选通过一个或多个洗涤步骤除去未结合的物质。然后添加通常表示为检测抗体的第二抗体，并使其与被第一抗体捕获的任何非人哺乳动物TK1蛋白结合。

然后通过直接或间接检测方法确定结合的第二抗体的量。例如，标记或酶可以直接连接到第二抗体或通过连接如生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素连接间接连接。或者，可以使用标记或连接到酶并与第二抗体特异性结合的二次抗体。

因此，在一个实施方案中，第二抗体具有共价连接的生物素。或者，第二抗体具有共价连接的链霉亲和素或亲和素。

该试剂盒优选还包含辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素或HRP标记的亲和素。或者，该试剂盒还包含HRP标记的生物素。该试剂盒还包含HRP底物，诸如3,3',5,5'-四甲基二氨基联苯胺(TMB)底物、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)底物或2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)底物。在这种情况下，样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平可以通过分光光度法测定，该分光光度法检测HRP将发色底物转化为可检测的有色产物。

在一个实施方案中，该试剂盒还包括微量滴定板(MCP)作为固定或意图固定第一抗体的载体。图2是使用根据一个实施方案的第一抗体和第二抗体的夹心ELISA的概念的示意图。

该试剂盒不一定必须是ELISA试剂盒。在另一个实施方案中，该试剂盒使用亲和色谱法，其中第一抗体与固定相结合，例如与柱中的凝胶基质或珠粒结合。例如，凝胶基质或珠粒可以由琼脂糖如制成。

在这种情况下，样品中存在的非人哺乳动物TK1蛋白将通过与固定的第一抗体结合而包埋在柱中。洗涤后，可以使用第二抗体洗脱并检测结合的非人哺乳动物TK1蛋白。例如，洗脱的非人哺乳动物TK1蛋白的量可以使用Western印迹确定，并且使用直接或间接检测方法使用第二抗体用于TK1检测。

或者，载体可以是磁珠，诸如磁珠。

根据实施方案确定的非人哺乳动物TK1蛋白可以是非人哺乳动物细胞和/或血清TK1蛋白，优选非人哺乳动物血清TK1(STK1)蛋白或分子。

在一个实施方案中，非人哺乳动物TK1蛋白选自由犬TK1蛋白、猫科TK1蛋白和马科TK1蛋白组成的组。因此，在这些实施方案中，TK1蛋白可以来自狗、猫或马。在一个具体的实施方案中，非人哺乳动物TK1蛋白是犬TK1蛋白。

本发明实施方案的试剂盒可以用于确定样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平的方法中。

这些实施方案的另一方面涉及一种用于确定样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平的方法。该方法包括使样品与根据实施方案的试剂盒的第一抗体和第二抗体接触。该方法还包括检测结合的第二抗体的量。

然后基于检测到的结合的第二抗体的量确定样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平。

检测结合的抗体量的任何现有技术均可以用于本发明方法中。例如，该检测可以是直接的或间接的，并且可以产生荧光或显色信号。直接检测通常包括使用与标记缀合的抗体。间接检测利用针对抗体的宿主物种产生的标记的二次抗体。

用于可视化抗体与表位的结合的常用标记包括将可溶性底物转化为显色终产物的荧光团和酶。

样品优选为身体样品，且更优选选自由细胞样品、组织样品、血液样品、血清样品、脑脊液样品、胸膜液样品、滑液样品和腹膜腔液样品组成的组。在一个优选的实施方案中，该身体样品是体液样品，并且优选选自由血液样品、血清样品、脑脊液样品、胸膜液样品、滑液样品和腹膜腔液样品组成的组。在一个具体的实施方案中，身体(液体)样品是血液样品或血清样品。

因此，实施方案的抗体可以用于确定样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平，即量。据信，实施方案的抗体能够结合并因此能够确定用包括可能与其他蛋白、辅因子或分子结合的以其各种形式的非人哺乳动物细胞或血清TK1如二聚体、四聚体和寡聚体的水平。因此，非人哺乳动物细胞和/或血清TK1蛋白因此包括以其各种形式的非人哺乳动物细胞和/或血清TK1。

在一个具体的实施方案中，该方法是一种用于确定身体样品中非人哺乳动物STK1蛋白的水平的方法。

在另一个实施方案中，该方法是一种用于确定身体样品中非人哺乳动物细胞TK1蛋白的水平的方法。

在另一个实施方案中，该方法是一种用于确定身体样品中非人哺乳动物细胞TK1蛋白和非人哺乳动物STK1蛋白的水平的方法。

这些实施方案的另一方面涉及一种用于估计非人哺乳动物受试者如狗、猫或马中肿瘤疾病复发的可能性的方法。该方法包括使用根据实施方案的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。然后将身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平与代表健康非人哺乳动物受试者群体的非人哺乳动物TK1蛋白的水平或先前在非人哺乳动物受试者中确定的非人哺乳动物TK1蛋白的水平进行比较。该方法还包括基于该比较估计非人哺乳动物受试者中肿瘤疾病复发的可能性。

高于与健康的非人哺乳动物群体相关的水平的确定水平指示非人哺乳动物受试者中肿瘤疾病复发的可能性增加。类似地，高于与先前治疗之后非人哺乳动物受试者相关的水平的确定水平指示非人哺乳动物受试者中肿瘤疾病复发的可能性增加。

这些实施方案的又一方面涉及一种用于确定非人哺乳动物受试者中的细胞增殖的方法。该方法包括使用根据实施方案的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括基于身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平确定细胞增殖。

在一个具体的实施方案中，确定正常或肿瘤细胞增殖的水平，并将其与非人哺乳动物TK1蛋白的确定水平进行比较，以确定非人哺乳动物受试者是否具有正常或基线细胞增殖或升高的细胞增殖。

本发明方法可以用作监测应用到非人哺乳动物受试者的各种疗法的工具。例如，该方法可以用以监测非人哺乳动物受试者中的抗增殖或抗肿瘤疗法。在这种情况下，该方法可以用于验证选择的抗增殖或抗肿瘤疗法是否具有减少非人哺乳动物受试者中的细胞增殖的所需效果。如果该疗法不具有所需效果，即，没有检测到细胞增殖的显著降低，则可以对非人哺乳动物受试者应用另一种或修饰的抗增殖或抗肿瘤疗法。

这些实施方案的另一方面涉及一种用于确定患有恶性肿瘤疾病的非人哺乳动物受试者中的增殖过程响应的方法。该方法包括使用根据实施方案的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括基于身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平确定增殖过程响应。这种增殖过程响应的实例可以是免疫反应或免疫反应响应。

在一个实施方案中，用于增殖过程响应的至少一种其他生物标志物也可以用于该确定中。

这些实施方案的又一方面涉及一种用于确定非人哺乳动物受试者中的炎症、感染或肿瘤细胞增殖水平的方法。该方法包括使用根据实施方案的方法或试剂盒确定来自非人哺乳动物受试者的身体样品中的非人哺乳动物TK1蛋白的水平。该方法还包括基于身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平确定炎症、感染或肿瘤细胞增殖的水平。在一个实施方案中，用于炎症、感染或肿瘤细胞增殖的至少一种其他生物标志物也可以用于该确定中。

这些实施方案的方法和试剂盒可以用于评价或确定治疗例如狗、猫或马中的恶性肿瘤疾病的效率。因此，通过比较在治疗期间或之后确定的TK1蛋白水平与先前在治疗开始之前或结合治疗的开始确定的相应TK1蛋白水平，可以确定所选治疗在降低非人哺乳动物中TK1蛋白水平方面是否具有任何医疗效果。因此，确定经治疗的非人哺乳动物中TK1蛋白水平的降低与对恶性肿瘤疾病有效的治疗，即高效治疗相关。然而，如果在经治疗的非人哺乳动物中未检测到TK1蛋白水平的显著降低，则特定治疗无效并且对恶性肿瘤疾病没有所需效果。

该肿瘤优选为血液肿瘤，诸如淋巴瘤或白血病，或实体肿瘤，诸如乳腺肿瘤、组织细胞肉瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、血管肉瘤或腺癌。

Kiran Kumar 2010公开了通过用对应于狗TK1中氨基酸196至223的28个氨基酸长的肽免疫兔而产生的抗狗TK1抗体的产生。然而，当用于ELISA测定法并且具有高背景时，抗狗TK1抗体显示出差的性能。针对长(28个氨基酸)肽的多克隆抗体的产生显示出大的批次间差异。这与本文提出的实施方案和实验数据形成鲜明对比。本发明实施方案的抗体可以成功地用于具有高特异性并且能够区分健康受试者和患有血液或实体肿瘤的受试者的ELISA测定法中。

实施例

实施例1

开发了用于确定在患有血液和实体肿瘤的狗中血清TK1(STK1)蛋白水平的新TK1-ELISA。测量在来自健康狗、患有白血病和淋巴瘤以及实体肿瘤的狗的血清中的STK1活性和STK1蛋白水平两者。此外，在治疗期间跟踪来自六只患有淋巴瘤的狗的血清样品以测试这两种TK1测定法的监测效率。

材料和方法

血清样品

从瑞典乌普萨拉的瑞典农业科学大学动物医院(University Animal Hospitalat the Swedish University of Agricultural Sciences,Uppsala,Sweden)收集来自健康狗、患有血液肿瘤和实体肿瘤的狗的血清样品，并将其储存在-20℃下，直至分析。该项目得到了瑞典动物伦理委员会(Swedish Animal Ethics Committee)的批准。该研究包括来自健康狗(n＝30)、患有血液肿瘤的狗(n＝36：淋巴瘤，n＝31，白血病，n＝5)和患有实体肿瘤的狗(n＝40)的样品。健康组的平均且中值年龄为6岁(范围为3岁至10岁)、血液肿瘤组为8.5岁和8岁(范围为3岁至13岁)，且患有实体肿瘤的狗为9岁和8岁(范围3岁至14岁)。

肿瘤诊断程序如前所述(von Euler等人，2008)。本研究共纳入35个品种。最常见的品种包括拉布拉多犬(Labrador Retriever)(13/105)、金毛猎犬(Golden Retriever)(12/105)、罗威纳犬(Rottweiler)(11/105)、混合品种(11/105)、里森雪纳瑞犬(RiesenSchnauzer)(11/105)、德国牧羊犬(German Shepherd)(7/106)、平涂猎犬(Flat coatedRetriever)(5/105)、新斯科舍省猎犬和拳狮犬(Nova Scotia Retriever and Boxer)(每种3/105)，其次是诺威奇梗(Norwich Terrier)、猎狐犬(Fox Terrier)、斗牛犬(BullTerrier)、伯尔尼山犬(Bernese Mountain dog)、罗得西亚脊背犬(Rhodesian ridgeback)、英国史宾格犬(English Springer Spaniel)和混合犬种(每种2/105)、克伦伯猎犬(Clumber Spaniel)、苏格兰梗犬(Clumber Spaniel)、杜宾犬(Doberman)、霍夫瓦尔特犬(Hovawart)、诺威奇梗犬(Norwich Terrier)、西部高地梗犬(West highland Terrier)、设得兰群岛牧羊犬(Shetland Sheep Dog)、瑞典麋鹿猎犬(Swedish Elk Hound)、野战犬(Field Spaniel)、莱昂伯杰犬(Leon Berger)、博德牧羊犬(Brooder Coolie)、灰色猎犬(Grey Hound)、可卡犬(Cocker Spaniel)、法国斗牛犬(French Bull dog)、威玛猎犬(Weimaraner)、帕格(Pug)和澳大利亚牧羊犬(Australian Shepherd)(1/105)。

TK1抗体

针对狗TK1的C-末端区域中的肽产生多克隆抗体。使用具有添加到N-末端的半胱氨酸的16个氨基酸的合成肽(氨基酸215-230，GKPGEGKEATGVRKLF，SEQ ID NO:1；PAb-Arv1)(图1)产生16-聚体抗体。将该16-聚体肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联，并与弗氏完全佐剂混合作为抗原以使兔免疫(GenScript，Piscataway，NJ，USA)。在第三和第四免疫后收集抗血清并如先前所述(Wu等人，2003)在肽偶联的Sepharose 4B柱上纯化。24-聚体抗体如前所述(Gasparri等人，2009)针对人TK1活性位点中的具有添加到N-末端的长套索状环(氨基酸161-183，AYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHS，SEQ ID NO:2；Ar-4)产生。还将24-聚体肽与KLH偶联，使小鼠免疫并且如前所述(Gasparri等人，2009)制备单克隆抗体。Ar-4抗体由瑞典乌普萨拉的AroCell AB提供。

Ar-4的生物素化

根据制造商的说明，使用ChromaLink^TM生物素抗体标记试剂盒(Solulink，California，USA)将Ar-4抗体生物素化。使用链霉亲和素-HRP通过Western印迹分析生物素化的Ar-4抗体。

血清TK1活性测定法

使用优化的[³H]-dThd磷酸化测定法确定血清样品中的TK1活性，如先前所述(Sharif等人，2012a；Kiran Kumar等人，2013)。简而言之，将10μL血清与含有10mM Tris-HCl pH 7.6、2mM二硫苏糖醇(DTT)、5mM MgCl₂、5mM NaF、5mM ATP和5μM[³H]-脱氧胸苷的反应混合物在37℃下一起温育1小时并施用到DE-81滤纸盘上。然后将滤纸用1mM甲酸铵洗涤两次，每次5分钟，并将结合的产物在0.1M HCl和0.2M KCl中洗脱45分钟。如前所述(Sharif等人，2012a)，通过β-闪烁计数确定放射性。TK1活性表示为pmol/min/mL。

开发夹心ELISA以检测狗血清中的TK1

将Maxisorp型NUNC(丹麦)的ELISA板用100μL在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的PAb-Arv1抗-TK1多克隆抗体(4μg/mL)包被，并在4℃下温育过夜。使用Tecan Hydro挠性微板洗涤器洗涤板，用洗涤缓冲液(Tris 0.1M，pH 7.4，NaCl 0.3M，Tween 0.05％和BSA 1％)洗涤四次。此后，用在TBST中稀释的5％脱脂奶粉在室温下封闭所有孔1小时。将50μL的狗血清样品在50μL血清稀释缓冲液(AroCell AB，Uppsala)中稀释，并在室温下预温育1小时。再次洗涤孔并添加预温育的血清样品。然后将板在室温下在摇动平台上温育2小时。如上所述洗涤板并添加生物素化Ar-4抗体(在洗涤缓冲液中4μg/mL)。在室温下温育1小时后，如上洗涤板，添加在洗涤缓冲液中以1:32,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)，并温育1小时。最后一次洗涤后，添加TMB(Thermo Fisher Scientific)并使其显影15分钟，然后用2N H₂SO₄淬火。在Infinite M200微板读数器(Tecan,Germany)中在450nM下读板。

验证狗TK1 ELISA

如前所述(Sharif等人，2012b)纯化狗重组TK1，并用不同浓度的重组狗TK1(在样品稀释缓冲液中稀释的0.6ng/ml至10ng/ml)建立标准曲线。通过使用标准曲线，基于不同血清样品的平均吸光度，计算血清样品中TK1的浓度。检测限被估计为最小分析物浓度，给出与零校准器显著不同的值。还由所有血清样品的平均值和SD确定组间变化，这些血清样品在两个不同的实验中独立作为重复值测定。

统计分析

使用D'Agostino和Pearson综合正态性检验测试健康、血液肿瘤和实体肿瘤中的TK1活性和TK1蛋白分布的正常性。健康狗以及患有血液肿瘤和实体肿瘤的狗的STK1活性和蛋白水平显示非高斯分布。Spermann相关系数(rs)用于确定TK1活性与TK1蛋白水平之间的相关性。Mann Whitney t检验用于评价各组之间的差异。对于灵敏度和特异性分析以及对于测定法的比较，构建接受者操作特征(ROC)曲线。使用Graph Pad Prism 5.0(Graph Pad软件，La Jolla，CA，USA)执行统计学分析。将显著性水平设定为P<0.05。

结果

ELISA程序的描述

ELISA原理基于夹心免疫酶系统，如图2所示。第一步骤是用针对狗TK1的C-末端区域中的肽产生的纯化的多克隆抗狗TK1特异性抗体包被微量滴定板(PAb-Arv1，图1)。TK1的这部分是血液中形成的TK1蛋白复合物的暴露区域。在用奶粉(5％)封闭孔后，使来自健康狗和肿瘤狗的预温育血清样品与板上的抗体结合。通过洗涤程序除去未特异性结合的蛋白。使针对TK1的高度保守且暴露的活性位点区域制备的第二抗体Ar-4生物素化并允许与结合到孔的TK1反应。通过链霉亲和素-过氧化物酶(HRP)复合物检测抗原-抗体结合复合物，其通过添加显色底物(TMB)可视化。颜色反应的强度与血清样品中存在的TK1的量成比例。

ELISA的检测限和精密度

将狗重组TK1用作校准物以产生TK1-ELISA的剂量-响应曲线。来自5个不同运行的典型校准曲线如图3所示。在所有非零校准点CV处的测定内变化≤10％。该测定法的检测限(LOD)为0.46ng/mL，且在低至0.63ng/mL的浓度下，运行间不精确度(CV)<20％。在血清样品的情况下，组间变化范围为5％至15％，并且测定内变化为5％。来自健康狗、患有血液恶性肿瘤的狗和患有实体肿瘤的狗的中值血清TK1活性和TK1蛋白水平汇总在下表1中。

表1-来自健康狗、患有血液恶性肿瘤的狗和患有实体肿瘤的狗的血清中TK1活性和蛋白水平

低于LOD的TK1-ELISA值表示为小于0.46ng/mL

健康狗和患有血液肿瘤的狗的STK1活性水平

在健康狗组中，STK1活性在0.7pmol/min/mL至1.4pmol/min/mL的范围内(表1)，其中中值为1.02pmol/min/mL。来自患有血液肿瘤的狗的血清中的STK1活性水平范围在0.5pmol/min/mL至59pmol/min/mL范围内(表1)。在健康狗以及患有血液肿瘤的狗中，雄性和雌性之间的STK1活性水平没有显著差异。使用Mann-Whitney U检验的统计分析显示，与健康狗相比，血液肿瘤组中的STK1活性显著更高(P<0.0001，图4A)。STK1活性测定结果的ROC曲线分析显示曲线下面积(AUC)为0.83(P<0.0001，95％CI，0.72-0.94)(图4B)。在1.35pmol/min/mL的截止值下，灵敏度为75％(95％CI，0.578-0.878)，且特异性为96％(95％CI，0.82-0.99)。

在健康狗和患有血液恶性肿瘤的狗中的TK1 ELISA确定

通过使用不同浓度的重组狗TK1作为标准来确定临床样品中的TK1蛋白水平。在健康狗中，STK1蛋白水平小于0.46ng/mL，且30个血清中的1个具有0.47ng/mL的蛋白值。基于30只健康狗的正常参考的估计上限为0.46ng/mL。来自患有淋巴瘤或白血病的狗的血清通常具有较高的STK1蛋白水平，其范围为<0.46ng/mL至4.4ng/mL。健康狗和血液肿瘤之间的中位STK1蛋白水平存在显著差异(P<0.0001，图4C)。ROC曲线分析显示AUC为0.94(P<0.0001，95％CI，0.89-0.99)。使用0.46ng/mL的截止值，真阳性率为78％(95％CI，0.60-0.898)，且假阳性率为4％(95％CI，0.82-0.99)(图4D)。

来自患有实体肿瘤的狗的血清中的STK1活性和蛋白水平

来自患有实体肿瘤的狗的大多数血清样品具有低于截止值的STK1活性。STK1活性水平范围为0.5pmol/min/mL至2.5pmol/min/mL(中值＝1.02)。在实体肿瘤组和健康组之间没有显著差异(P＝0.193)(图5A)。ROC曲线分析显示AUC为0.56(P＝0.43，95％CI，0.41-0.69)。使用1.35pmol/min/mL的截止值，真阳性率为27％(95％CI，0.14-0.43)，且假阳性率为4％(95％CI，0.82-0.99)(图5B)。然而，与健康狗(P<0.0001，图5C)相比，在来自患有实体肿瘤的狗的血清中的TK1蛋白水平显著较高(范围为<0.46ng/mL至3.4ng/mL)。此外，ROC曲线分析的AUC为0.88(P<0.0001，95％CI，0.80-0.95)(图5D)。在0.46ng/mL的截止值下，灵敏度为62％(95％CI，0.458-0.772)，且特异性为96％(95％CI，0.82-0.99)。这些结果有力地指示TK1-ELISA可以区分患有实体肿瘤的狗和健康狗。

总之，健康狗、患有血液肿瘤的狗和患有实体肿瘤的狗中的STK1活性测定值使用线性回归分析显示与STK1 ELISA(ng/mL)值显著相关，即，r＝0.64(P<0.0001)。来自患有血液肿瘤的狗和患有实体肿瘤的狗的血清进一步细分为淋巴瘤、白血病和乳腺肿瘤、肥大细胞瘤和黑素瘤。图6A和图6B示出不同亚类中的log STK1活性分布，而图6C和图6D示出不同亚类中的log STK1蛋白水平。

在患有淋巴瘤的狗的化学治疗期间追踪血清TK1活性和蛋白水平

患有淋巴瘤的狗通常使用基于多柔比星的多药剂方案(ADRIA-Plus)进行治疗。在每剂量的ADRIA-plus之前和之后从六只狗中收集血清样品。最初，在5只狗中发现了高STK1活性和STK1蛋白值，并且在第一治疗后，6只狗中的4只显示STK1活性和STK1蛋白水平显著下降，导致水平相似于或低于截止值(图7A，图7B)。在两名患者(第8号、第9号)中，在第三治疗期间STK1活性和STK1蛋白有所增加，但第四治疗后水平下降。在2名患者(第5号、第17号患者)中，在第一治疗后，STK1活性和STK1蛋白水平增加，并且在第二治疗后，STK1活性和STK1蛋白水平增加降低，但在第三治疗和第四治疗后再次增加，接着，在第五治疗后下降。一名患者(第19号患者)在第二治疗后显然完全缓解。患有完全缓解的淋巴瘤的狗的平均STK1活性和STK1蛋白与健康对照组中的STK1没有显著差异。然而，两名患者(第11号、第37号患者)显示出对化学疗法的不同响应模式。第11号患者在第一治疗后STK1活性和STK1蛋白水平显著降低。此后，STK1水平在第二治疗和第三治疗后增加，该患者肿瘤复发，对治疗没有进一步的响应。第37号患者在第一治疗后STK1活性和STK1蛋白水平显著增加。在进一步的治疗过程中，STK1水平在第二治疗和第三治疗后略有下降，与对照组相比，STK1活性和STK1蛋白水平均显著升高。此外，这只狗对治疗也没有响应，并且这两只狗后来都被安乐死了。本文显示的结果强烈指示STK1活性和STK1蛋白测定法都可以提供关于犬淋巴瘤的预后和治疗效率的信息。

讨论

先前的研究已经展示，血清TK1活性测量对于犬血液肿瘤的预后和治疗监测是有价值的。然而，这些活性测定法是复杂的，因为它们包括使用危险且昂贵的放射性同位素，因此限制了TK1活性测定法的临床应用。由于ELISA通常用于几乎所有的临床实验室，因此开发ELISA免疫测定法将显著增加TK1作为生物标志物的临床效用。在基于TK1抗体的免疫测定法的人医学研究中，显示它们是用于预测和监测不同肿瘤疾病的灵敏工具。已经有几种尝试以在人医学中建立基于抗体的TK1-ELISA，但是仅在最近才使用稳健的ELISA作为仅研究用途的产品(AroCell AB,Sweden)。这可能是由于难以获得对血清形式的TK1具有足够亲和力的抗体。在血清中发现的TK1寡聚体的复杂性很可能阻止与不同类型的抗TK1抗体的可重复的反应性。

在一项初步研究中，使用针对人TK1活性位点中的长套索环(氨基酸161-183)的抗体。该区域在狗TK1序列中高度保守(图1)，并且还用于生成Ar-4(von Euler和Eriksson，2011)。很明显，这些抗体在犬淋巴瘤组织中检测到细胞TK1。在另一项研究中，使用针对来自狗TK1重组的C-末端区域的肽产生的两种抗体，可以检测并表征细胞和血清形式的犬TK1(Sharif等人，2012b)。有几种相似之处，但也存在差异，特别是在人血清TK1和狗血清TK1的寡聚结构中。

最近的一项研究报道，使用狗抗-TK1抗体的免疫亲和测定法可以测量来自血液和实体肿瘤的血清中的TK1水平，并指示TK1蛋白检测法比TK1活性测定法更灵敏(KiranKumar等人，2013)。此外，研究表明，与健康狗相比，来自患有实体肿瘤的狗的血清具有低TK1活性，但具有相对高的TK1蛋白水平。

如本文所公开，开发了犬TK1-ELISA，其可以克服传统TK1放射性同位素测定法的局限性。血液肿瘤的ROC曲线分析展示，TK1-ELISA测定法和TK1活性测定法的灵敏度均为75％，并且假阳性率为4％。这指示两种测定法对于临床常规实践而言可能是准确且灵敏的。然而，TK1活性测定法无法区分健康患者与实体肿瘤患者，这由灵敏度低得多(27％)的ROC曲线展示。TK1-ELISA可以区分这些组，其灵敏度比TK1活性测定法高2倍(62％)。此外，化学治疗后TK1蛋白水平恢复正常(基线水平)，导致肿瘤缓解，复发患者中TK1蛋白水平增加至更高水平，类似于患有淋巴瘤的狗中的TK1活性水平。在治疗期间，在少数患者中发现TK1蛋白水平短暂增加，这可能是由于因药物毒性而死亡的细胞释放TK1。

此外，来自先前研究的尺寸排阻分析显示血清TK1以高分子量聚集体形式存在，其在狗淋巴瘤的情况下具有酶活性。有趣的是，来自乳腺肿瘤狗的血清具有一小部分的具有活性的TK1高分子量聚集体，但很大一部分的蛋白显然是无活性的(Jagarlamudi等人，2014)。发现结果与两种测定法之间仍然存在强烈的相关性(rs＝0.64)。这指示分子形式的TK1有助于这两种测定法之间观察到的总体相关性。新ELISA的可用性将增加TK1作为增殖生物标志物的临床效用，并且对于预测和监测兽医学中的血液肿瘤将是有价值的。

本研究描述了一种用于确定TK1蛋白水平的新TK1-ELISA，其可以作为诊断和监测犬血液肿瘤的潜在标志物。TK1-ELISA易于执行，快速且与现有TK1活性测定法一样灵敏且特异。

实施例2

以下实验展示对来自狗和猫TK1序列的不同区域的肽产生的狗TK1抗血清的反应性。除少数氨基酸差异外，TK1的大多数肽序列在人、狗、猫和马TK1序列中是保守的，参见图1。然而，TK1蛋白的C-末端的TK1序列之间存在相当大的趋异。

TK1抗血清

两种不同的多克隆兔抗血清使用来自狗TK1的C-末端区域的肽产生(CTK1p-211、CTK1p-215)，且一种抗血清由狗TK1的活性位点区域产生(CTK1p-161)。第一犬TK1肽序列(CTK1p-215)抗血清针对16个氨基酸的合成肽(狗TK1中的氨基酸215-230；图1)，其中添加了N-末端半胱氨酸(CGKPGEGKEATGVRKLF，SEQ ID NO:5)。第二抗血清(CTK1p-211)使用15个氨基酸的肽(狗TK1中的氨基酸211-225；图1)产生，其中添加了N-末端半胱氨酸(CVLVPGKPGEGKEATG，SEQ ID NO:12)。CTK1p-161抗血清使用狗TK1的高度保守的活性位点序列(狗TK1中的氨基酸161-183；图1)产生，其中添加了N-末端半胱氨酸(CAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHS，SEQ ID NO:8)。FTK1p-213抗血清针对猫TK1的C-末端区域(猫TK1中的氨基酸213-227；图1)产生，其中添加了N-末端半胱氨酸(CGKPGEASGARKLFAP，SEQ ID NO:14)。所有这些肽都在N-末端添加了半胱氨酸，用于与载体蛋白KLH偶联。肽载体复合物用作用以使兔免疫的抗原(GenScript,Piscataway,NJ,USA)。在第三免疫和第四免疫之后收集测试的抗血清。如对狗TK1蛋白所述进行猫和马重组TK1蛋白的克隆和表达(Jagarlamudi等人，2015)。

斑点印迹免疫测定法

通过斑点印迹测定法测试所有四种不同的TK1抗血清与重组狗、猫和马TK1的反应性。简而言之，将3μL的不同稀释度的重组TK1制剂应用到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。使膜干燥并用在TBST(Tris缓冲盐水(TBS)和聚山梨醇酯20(也称为吐温20)的混合物)中稀释的5％脱脂奶粉在室温下封闭1小时。将膜用TBST洗涤三次，然后与在TSBT中稀释(1:300)的不同TK1抗血清在室温下一起温育2小时。重复洗涤程序，且将膜与链霉亲和素辣根过氧化物酶(HRP)(在TBS中稀释：1:20,000)一起温育1小时。最后洗涤后，将膜与ECL化学发光(GEhealth care,Uppsala)一起温育1分钟。用Bio-Rad chemi doc触摸系统扫描膜。用图像仪3软件量化点的强度。

结果和讨论

图8A至图8D示出用具有四种不同TK1抗血清的狗、猫和马重组TK1的斑点印迹免疫测定法的结果。图9A至图9C示出用不同浓度的具有四种不同TK1抗血清的狗、猫和马重组TK1得到的任意单位的点强度。

如图8和9所示，各种C-末端肽(CTK1p-215、CTK1p-211和FTK1p-213)的能力存在很大差异，以诱导产生与重组狗、猫和马TK1反应的抗体。显然，CTK1p-211给出与所有测试的重组TK1蛋白具有高反应性的抗体，但明显优选狗TK1。CTK1p-215给出针对狗和马TK1的抗血清，而FTK1p-213仅产生与马TK1具有反应性的抗体。CTK1p-161产生与所有三种类型的TK1蛋白反应并且优选与猫TK1反应的抗体。

实施例3

重复实施例1中的程序，但有以下不同之处。

夹心ELISA程序检测狗血清中TK1

将Maxisorp,NUNC(丹麦)微量滴定板用100μL在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的CTK1p-215抗-TK1兔多克隆抗体(4μg/mL)包被，并在4℃下温育过夜。使用Tecan Hydro挠性微板洗涤器洗涤板，用洗涤缓冲液(Tris 0.1M，pH 7.4，NaCl 0.3M，Tween 0.05％和BSA1％)洗涤四次。此后，用在TBST中稀释的5％脱脂奶粉在室温下封闭所有孔1小时。将50μL的狗血清样品在50μL样品稀释缓冲液中稀释，并在室温下预温育1小时。再次洗涤平板并添加预温育的血清样品。然后，将板在室温下在摇动平台上温育2小时。如上所述洗涤板并添加生物素化CTK1p-161抗体(在洗涤缓冲液中4μg/mL)。在室温下温育1小时后，如上所述洗涤板，并添加在洗涤缓冲液中以1:10,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)(Thermo FisherScientific)，并温育30分钟。最后一次洗涤后，添加TMB(Thermo Fisher Scientific)并使其显影15分钟，然后用2N H₂SO₄淬火。使用540nM作为参考波长，在Infinite M200微板读数器(Tecan,Germany)中在450nM下读板。

来自该实施例3的结果呈现在图10和图11A-11D中。更详细地讲，图10图示具有不同浓度的具有CTK1p-215包被和作为检测抗体的CTK1p-161的重组TK1的标准曲线。图11A示出来自健康狗和患有血液恶性肿瘤的狗的血清中的log STK1 ELISA蛋白水平。图11B示出用于区分血液肿瘤狗与健康狗的相应ROC曲线。图11C示出来自健康狗和患有实体肿瘤的狗的血清中的log STK1 ELISA蛋白水平。图11D示出用于区分实体肿瘤狗与健康狗的相应ROC曲线。

使用相同的程序，但改变了抗体。CTK1p-211抗-TK1多克隆抗体用于包被，且生物素化CTK1p-215用于检测。

这些抗体的结果呈现在图12和图13A-13B中。图12示出具有不同浓度的具有CTK1p-211包被和作为检测抗体的CTK1p-215的重组TK1的标准曲线。图13A示出来自健康狗和患有血液恶性肿瘤的狗的血清中的log STK1 ELISA蛋白水平。图13B示出用于区分血液肿瘤狗与健康狗的相应ROC曲线。

上述实施方案应被理解为是本发明的几个说明性实施例。本领域的技术人员应当理解，可以对实施方案做出各种修改、组合和变化，而不背离本发明的范围。具体地讲，在技术上可能的情况下，不同实施方案中的不同部分解决方案可以组合为其他配置。然而，本发明的范围由所附权利要求书限定。

参考文献

Alegre，M.M.，Weyant，M.J.，Bennett，D.T.，Yu，J.A.，Ramsden，M.K.，Elnaggar，A.，Robison，R.，O′Neill，K.L.，2014.Serum detection of thymidine kinase 1 as ameans of early detection of lung cancer.Anticancer Research 34，2145-2152.

Carlsson，L.，Larsson，A.，Lindman，H.，2009.Elevated levels ofthymidinekinase 1 peptide in serum from patients with breast cancer.Uppsala Joumal ofMedical Sciences 114，116-120.

Gasparri，F.，Wang，N.，Skog，S.，Galvani，A.，Eriksson，S.，2009.Thymidinekinase 1 expression defines an activated G1 state of the cell cycle asrevealed with site-specific antibodies and ArrayScan(TM)assays.Eur J CellBiol 88，779-785.

Jagarlamudi，KK.，Westberg，S.，H.，Eriksson，S.，2014.Properties ofcellular and serum forms of thymidine kinase 1(TK1)in dogs with acutelymphocytic leukemia(ALL)and canine manmary tumors(CMTs)：implications for TK1as a proliferation biomarker.BMC veterinary research，10：228.

Jagarlamudi，KK.，Hansson，LO.，Eriksson，S.，2015.Breast and prostatecancer patients differ significantly in their serum Thymidine kinase 1(TK1)specific activities compared with those hematological malignancies and blooddonors：implications of using serum TK1 as a biomarker.BMC Cancer，15：1073.

Kiran Kumar，J.，Sharif，H.，Westberg，S.，von Euler，H.，Eriksson，S.，2013.High levels of inactive thymidine kinase 1 polypeptide in sera from dogswith solid tumours by immunoaffinity methods：lmplications for in vitrodiagnostics.The Veterinary Joumal 197，854-860.

Kiran Kumar.J.，Immunoassays for detection of serum Thymidine kinase 1in Dog lymphomas and carcinomas，Master Thesis in Animal Sciences，Uppsala2010.

Sharif，H.，von Euler，H.，Westberg，S.，He，E.，Wang，L.，Eriksson，S.，2012 a.Asensitive and kinetically defined radiochemical assay for canine and humanserum thymidine kinase(TK1)to monitor canine lymphoma.The Veterinary Joumal194，40-47.

Sharif，H.，Jagarlamudi，K.K.，Wang，L.，He，E.，Eriksson，S.，2012b.Quaternary structures of recombinant，cellular，and serum forms of ThymidineKinase 1 from dogs and humans.BMC Biochemistry 13，12.

von Euler，H.，Ohrvik，A.B.，Eriksson，S.K.，2006.A non-radiometric methodfor measuring serum thymidine kinase activity in malignant lymphomas indogs.Research in Veterinary Science 80，17-24.

von Euler，H.，Rivera，P.，Aronsson，A.C.，Bengtsson，C.，Hansson，L.O.，Eriksson，S.K.，2008.Monitoring therapy in canine malignant lymphoma andleukemia with serum thymidine kinase 1 activity-Evaluation of a new，fullyautomated non-radiometric assay.International Journal Oncology 34，505-510.

von Euler，H.，Eriksson，S.，2011.Comparative aspects of thymidine kinase1 in human and canine tumor diseases.Vet Comp Oncol，9：1-15.

Wu，C.，Yang，R.，Zhou，J.，Bao，S.，Zou，L.，Zhang，P.，Mao，Y.，Wu，J.，He，Q.，2003.Production and characterization of a novel chicken IgY antibody raisedagainst C-terminal peptide from human thymidine kinase 1.Journal ofmmunological Methods 277，157-169.

序列表

<110> ALERTIX VETERINARY DIAGNOSTICS AB

<120> 非人哺乳动物TK1蛋白水平的确定

<130> P1264PC00

<150> US 62/373262

<151> 2016-08-10

<160> 18

<170> 专利3.5版

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 狼

<400> 1

Gly Lys Pro Gly Glu Gly Lys Glu Ala Thr Gly Val Arg Lys Leu Phe

1 5 10 15

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<300>

<302> 暴露的增殖相关肽、配体和采用其的方法

<310> WO 2008/142664

<311> 2008-05-23

<312> 2008-11-27

<313> (1)..(23)

<400> 2

Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly

1 5 10 15

Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser

20

<210> 3

<211> 242

<212> PRT

<213> 狼

<400> 3

Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys

1 5 10 15

Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys

20 25 30

Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr

35 40 45

Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Asn Ser

50 55 60

Phe Ser Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Leu

65 70 75 80

Leu Arg Asp Val Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile

85 90 95

Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Phe Ser Glu Thr Met

100 105 110

Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe

115 120 125

Gln Arg Lys Ala Phe Gly Thr Ile Leu Asn Leu Val Pro Leu Ala Glu

130 135 140

Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu Cys Phe Arg Glu Ala

145 150 155 160

Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Ser Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly

165 170 175

Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu Cys Tyr Phe Lys Lys

180 185 190

Ala Ser Gly Pro Pro Met Gly Leu Asp Ser Arg Glu Asn Lys Glu Asn

195 200 205

Val Leu Val Leu Val Pro Gly Lys Pro Gly Glu Gly Lys Glu Ala Thr

210 215 220

Gly Val Arg Lys Leu Phe Ala Pro Gln His Val Leu Gln Cys Ser Pro

225 230 235 240

Ala Asn

<210> 4

<211> 234

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys

1 5 10 15

Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys

20 25 30

Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr

35 40 45

Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Ser

50 55 60

Phe Cys Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Leu

65 70 75 80

Leu Arg Asp Val Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile

85 90 95

Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Phe Cys Glu Ala Met

100 105 110

Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe

115 120 125

Gln Arg Lys Pro Phe Gly Ala Ile Leu Asn Leu Val Pro Leu Ala Glu

130 135 140

Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu Cys Phe Arg Glu Ala

145 150 155 160

Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly

165 170 175

Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu Cys Tyr Phe Lys Lys

180 185 190

Ala Ser Gly Gln Pro Ala Gly Pro Asp Asn Lys Glu Asn Cys Pro Val

195 200 205

Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro

210 215 220

Gln Gln Ile Leu Gln Cys Ser Pro Ala Asn

225 230

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 狼

<400> 5

Cys Gly Lys Pro Gly Glu Gly Lys Glu Ala Thr Gly Val Arg Lys Leu

1 5 10 15

Phe

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Cys Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile

1 5 10 15

Gly Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser

20

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> 狼

<400> 7

Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Ser Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly

1 5 10 15

Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser

20

<210> 8

<211> 24

<212> PRT

<213> 狼

<400> 8

Cys Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Ser Glu Lys Glu Val Glu Val Ile

1 5 10 15

Gly Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser

20

<210> 9

<211> 237

<212> PRT

<213> 猫

<400> 9

Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys

1 5 10 15

Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys

20 25 30

Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr

35 40 45

Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Ser

50 55 60

Phe Ser Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Leu

65 70 75 80

Leu Arg Asp Val Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile

85 90 95

Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Tyr Ser Glu Thr Met

100 105 110

Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe

115 120 125

Gln Arg Lys Ala Phe Gly Thr Ile Leu Asn Leu Val Pro Leu Ala Glu

130 135 140

Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu Cys Phe Arg Glu Ala

145 150 155 160

Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Ala Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly

165 170 175

Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu Cys Tyr Phe Lys Lys

180 185 190

Ala Ser Gly Leu Pro Ala Gly Pro Asp Gly Lys Glu Asn Lys Glu Asn

195 200 205

Cys Pro Leu Leu Gly Lys Pro Gly Glu Ala Ser Gly Ala Arg Lys Leu

210 215 220

Phe Ala Pro His Gln Ile Leu Gln Cys Ser Ser Ala Asn

225 230 235

<210> 10

<211> 237

<212> PRT

<213> 马

<400> 10

Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys

1 5 10 15

Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys

20 25 30

Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr

35 40 45

Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Asn

50 55 60

Phe Ser Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Gln

65 70 75 80

Leu Arg Asp Ala Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile

85 90 95

Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Phe Ser Glu Ala Met

100 105 110

Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe

115 120 125

Gln Arg Lys Ala Phe Gly Ala Ile Leu Asn Leu Val Pro Leu Ala Glu

130 135 140

Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu Cys Phe Arg Glu Ala

145 150 155 160

Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly

165 170 175

Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu Cys Tyr Phe Lys Lys

180 185 190

Pro Leu Gly Gln Pro Ala Gly Leu Asp Ser Thr Glu Asn Lys Glu Asn

195 200 205

Phe Pro Val Leu Gly Lys Pro Gly Glu Ala Thr Gly Ala Arg Lys Leu

210 215 220

Phe Ala Pro His Gln Ile Leu Gln Cys Ser Thr Ala Asn

225 230 235

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 狼

<400> 11

Val Leu Val Pro Gly Lys Pro Gly Glu Gly Lys Glu Ala Thr Gly

1 5 10 15

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 狼

<400> 12

Cys Val Leu Val Pro Gly Lys Pro Gly Glu Gly Lys Glu Ala Thr Gly

1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 猫

<400> 13

Gly Lys Pro Gly Glu Ala Ser Gly Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro

1 5 10 15

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 猫

<400> 14

Cys Gly Lys Pro Gly Glu Ala Ser Gly Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro

1 5 10 15

<210> 15

<211> 23

<212> PRT

<213> 猫

<400> 15

Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Ala Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly

1 5 10 15

Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser

20

<210> 16

<211> 24

<212> PRT

<213> 猫

<400> 16

Cys Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Ala Glu Lys Glu Val Glu Val Ile

1 5 10 15

Gly Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser

20

<210> 17

<211> 210

<212> PRT

<213> 马

<400> 17

Met Phe Ser Gly Lys Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe

1 5 10 15

Gln Ile Ala Gln Tyr Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr

20 25 30

Arg Tyr Ser Ser Asn Phe Ser Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala

35 40 45

Leu Pro Ala Cys Gln Leu Arg Asp Ala Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val

50 55 60

Ala Val Ile Gly Ile Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu

65 70 75 80

Phe Ser Glu Ala Met Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala

85 90 95

Leu Asp Gly Thr Phe Gln Arg Lys Ala Phe Gly Ala Ile Leu Asn Leu

100 105 110

Val Pro Leu Ala Glu Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu

115 120 125

Cys Phe Arg Glu Ala Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu

130 135 140

Val Glu Val Ile Gly Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu

145 150 155 160

Cys Tyr Phe Lys Lys Pro Leu Gly Gln Pro Ala Gly Leu Asp Ser Thr

165 170 175

Glu Asn Lys Glu Asn Phe Pro Val Leu Gly Lys Pro Gly Glu Ala Thr

180 185 190

Gly Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro His Gln Ile Leu Gln Cys Ser Thr

195 200 205

Ala Asn

210

<210> 18

<211> 27

<212> PRT

<213> 狼

<400> 18

Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys

1 5 10 15

Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro

20 25

Claims

1.一种用于确定样品中非人哺乳动物胸苷激酶1(TK1)蛋白的水平的试剂盒，其包含：

固定到载体上或意图固定到所述载体上的第一抗体；和

第二抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体之一对由非人哺乳动物TK1的C-末端区域的第一氨基酸序列组成的肽具有特异性，且所述第一抗体和所述第二抗体中的另一种对于i)由来自TK1的活性位点的氨基酸序列组成的肽或ii)由来自所述C-末端区域的第二氨基酸序列组成的肽具有特异性，来自所述C-末端区域的所述第二氨基酸序列与来自所述C-末端区域的所述第一氨基酸序列不同。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一抗体和所述第二抗体中的所述一种对由选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述第一抗体和所述第二抗体中的所述另一种对由选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQID NO:16组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其中所述第一抗体和所述第二抗体中的所述一种对由选自由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性，且所述第一抗体和所述第二抗体中的所述另一种对由选自由SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其中所述第一抗体和所述第二抗体中的所述一种对由选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性，且所述第一抗体和所述第二抗体中的所述另一种对由选自由SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其中所述第一抗体和所述第二抗体中的所述一种对由选自由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性，且所述第一抗体和所述第二抗体中的所述另一种对由选自由SEQ ID NO:1和SEQID NO:5组成的组的氨基酸序列组成的肽具有特异性。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是夹心测定试剂盒。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的试剂盒，其中所述第二抗体具有共价连接的生物素或共价连接的链霉亲和素或亲和素。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其还包含：

辣根过氧化物酶、HRP、标记的链霉亲和素或亲和素或HRP标记的生物素；和

HRP底物，其选自由3,3',5,5'-四甲基二氨基联苯胺TMB底物、3,3'-二氨基联苯胺DAB底物和2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸ABTS底物组成的组。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的试剂盒，还包括微量滴定板作为所述载体。

12.根据权利要求1至10所述的试剂盒，其还包含琼脂糖珠或磁珠作为所述载体。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的试剂盒，其中所述非人哺乳动物TK1蛋白选自由犬TK1蛋白、猫科TK1蛋白和马科TK1蛋白组成的组。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述非人哺乳动物TK1蛋白是犬TK1蛋白。

15.一种用于确定样品中非人哺乳动物胸苷激酶1(TK1)蛋白的水平的方法，其包括：

使所述样品与根据权利要求1至14中任一项所述的试剂盒的第一抗体和第二抗体接触；和

检测结合的第二抗体的量。

16.根据权利要求15所述的方法，其还包括基于所述检测到的结合的第二抗体的量确定所述样品中非人哺乳动物TK1蛋白的所述水平。

17.一种用于估计非人哺乳动物受试者中肿瘤疾病复发的可能性的方法，其包括：

使用根据权利要求1至14中任一项所述的试剂盒或根据权利要求15或16所述的方法确定来自所述非人哺乳动物受试者的身体样品中非人哺乳动物胸苷激酶1(TK1)蛋白的水平；

将所述身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的所述水平与代表健康非人哺乳动物受试者群体的非人哺乳动物TK1蛋白的水平或先前在所述非人哺乳动物受试者中确定的非人哺乳动物TK1蛋白的水平进行比较；和

基于所述比较估计所述非人哺乳动物受试者中所述肿瘤疾病复发的所述可能性。

18.一种用于确定非人哺乳动物受试者中的细胞增殖的方法，其包括：

使用根据权利要求1至14中任一项所述的试剂盒或根据权利要求15或16所述的方法确定来自所述非人哺乳动物受试者的身体样品中非人哺乳动物胸苷激酶1(TK1)蛋白的水平；和

基于所述身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的所述水平确定所述细胞增殖。

19.一种用于确定患有恶性肿瘤疾病的非人哺乳动物受试者中的增殖过程响应的方法，其包括：

基于所述身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的所述水平确定所述增殖过程响应。

20.一种用于确定非人哺乳动物受试者的炎症、感染或肿瘤细胞增殖的水平的方法，其包括：

使用根据权利要求1至14中任一项所述的试剂盒或根据权利要求15或16所述的方法确定来自所述非人哺乳动物受试者的身体样品中非人哺乳动物胸苷激酶(TK1)蛋白的水平；和

基于所述身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的所述水平确定所述炎症、感染或肿瘤细胞增殖的水平。

21.一种用于评价治疗非人哺乳动物受试者中的恶性肿瘤疾病的效率的方法，其包括：

在所述恶性肿瘤疾病的所述治疗开始之前或结合所述恶性肿瘤疾病的所述治疗的开始使用根据权利要求1至14中任一项所述的试剂盒或根据权利要求15或16所述的方法确定来自所述非人哺乳动物受试者的身体样品中非人哺乳动物胸苷激酶1(TK1)蛋白的水平；

在所述恶性肿瘤疾病的所述治疗期间或之后使用根据权利要求1至14中任一项所述的试剂盒或根据权利要求15或16所述的方法确定来自所述非人哺乳动物受试者的身体样品中非人哺乳动物TK1蛋白的水平；和

基于在所述恶性肿瘤疾病的所述治疗开始之前或结合所述恶性肿瘤疾病的所述治疗的开始在所述身体样品中确定的非人哺乳动物TK1蛋白的所述水平与在所述恶性肿瘤疾病的所述治疗期间或之后在所述身体样品中确定的非人哺乳动物TK1蛋白的所述水平的比较评价所述恶性肿瘤疾病的所述治疗的效率。