CN105164537B - 用于早期检测潜在炎症特别是与移植物的排斥、神经变性病症或抑郁症有关的潜在炎症的体外方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种用于早期检测潜在炎症，特别是移植物排斥的体外方法，其中测定唾液中的犬尿氨酸水平。该检验方法可以容易地实施且允许早期检测潜在的问题。

Description

用于早期检测潜在炎症特别是与移植物的排斥、神经变性病 症或抑郁症有关的潜在炎症的体外方法

本发明涉及诊断领域。由于医药在疾病的治疗中实现了重大的进步，特别是通过将身体或器官的一部分用源自外部来源的部分取代来替换，现代医学治疗影响着越来越多的人。当身体特别是器官的一部分不能适宜发挥功能时，可以移植器官或通过人工元件替换身体的部分例如植入的牙。这类治疗经常引起身体的应答，其经常以炎症开始且可能最终导致移植物排斥。

EP 2 284 540A1披露了一种诊断器官衰竭的方法。该衰竭可能是炎症相关的(败血症)。所述方法描述了利用定量代谢组学概况(metabolomics profile)并将结果与一定量的内源代谢物的定量参照代谢组学概况比较。这背后的想法似乎是检测由于感染/败血症所致的器官衰竭。在该申请中，没有提到关于移植、排斥及其在唾液中的模式。

然而，本发明公开了一种检测和诊断早期炎症的方法。该方法描述了利用定量代谢组学概况并将结果与定量参照比较。这背后的想法似乎是从检测先天免疫应答的激活的意义上来检测早期炎性应答。该激活独特地见于几种疾病中，特别是在早期。这是在病原体或称为报警物(alarmin)的分子上的反应且导致炎性体(inflammasome)的激活。下一步是在至少6至7天后激活适应性免疫应答。

当植入物并非源自同一身体时，人体识别身体内植入的元件为不相容的。因此，必须仔细检查外来植入物和受体的相容性并小心监测可能的排斥作用。当移植实体器官如心脏、肝、肺、胰或肾时，通常可通过用药物适宜处理来下调受体身体的排斥作用。然而，不想要的副作用是，身体对移植物的应答下调经常同时导致免疫应答的下调。

因此，必须非常小心地监测接受移植物的患者的潜在的感染(例如细菌性或病毒性)，因为这类感染对于已接受移植物的患者可能是致命的。然而，对已接受移植物的人的复杂医学治疗具有的不想要的副作用是，患者未意识到感染和/或炎症的早期迹象。对移植物的排斥可能产生炎症，而患者由于移植后的医学治疗通常未识别早期阶段。患者仅会在更后期的阶段意识到他或她患有炎症，然而产生的不期望的后果是对患者开始进行适宜治疗以避免移植物排斥可能已太迟。因此，需要简单和可靠的体外方法来早期检测潜在的炎症，特别是检测对移植器官的潜在排斥。

本发明涉及犬尿氨酸(kynurenine)途径。色素是可经由不同路径代谢的基本氨基酸，其中一种主要路径是犬尿氨酸途径。该途径例示于图1。该途径的第一个酶，吲哚胺-2,3-双加氧酶，受炎性分子特别是干扰素-γ强烈刺激。如此，当免疫应答激活时，犬尿氨酸途径经常系统性上调。其生物学意义是在一方面，色氨酸的消耗和犬尿氨酸的生成在免疫应答中起着关键的调控作用。在另一方面，令人惊讶地发现在唾液中测量的犬尿氨酸水平可用于早期检测潜在的移植物排斥反应，其以其他方式是不能容易检出的。

色氨酸分解代谢中牵涉的主要酶吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO I)的活化生成免疫抑制性代谢物，其反向调节免疫活化。在显示IDO活性对于小鼠模型中半同种异源胎儿(semiallogeneic foetus)的免疫接受具有重要意见后，移植免疫学家对该控制环路的兴趣急剧增加。实验数据产生以下假说，即调节性T细胞通过启动IDO活性发挥其免疫抑制功能。这一基础性发现使得色氨酸代谢对于临床移植和不同疾病也具有意义(Chen等,Int.J.of Tryptophan Research 2009；2,1-19)。

用于早期测量和预测炎性形成的可靠的监测方法对于患者治疗有益。

目前已知曾经认为相对惰性的内皮牵涉多种功能，如纤维蛋白溶解、凝固作用、血管紧张度、生长和免疫应答。人体中最常见的反应可在由先天免疫介导的炎性应答中看到。

吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)，一种IFN-γ可诱导的胞内酶，催化犬尿氨酸途径中基本氨基酸色氨酸的降解中的第一且限速步骤。IDO的免疫调控效果由阻止T细胞增殖、促进T细胞凋亡、诱导T细胞忽略、无反应性、和T调节细胞的生成代表。虽然IDO显现为免疫调节物，但是其在控制同种异体应答(allo-response)中的作用正在展开中。

本文中公开的方法可用作方便的监测工具来测量炎症或激活的先天免疫应答。尽管对IDO的分子T细胞调节机制的认知逐渐增多，但其在同种异型免疫(alloimmunity)和临床移植中的生理作用仍是争议性的。可获的实验数据表明通过将IDO基因引入同种异体移植物的遗传操作与延长的存活有关，且抗原呈递细胞(APC)如树突细胞能增加IDO的表达，如此调节免疫应答。此外，IDO充当树突细胞和调节性T细胞(Treg)之间的桥梁以获得完全效应器功能。这些发现显示IDO对于移植中的免疫调控和抗原特异性耐受诱导具有相当大的潜力。这同样适用于犬尿氨酸。犬尿氨酸是在N-甲酰犬尿氨酸之后色氨酸的头一个降解产物。犬尿氨酸相当早地显示炎性应答的激活且可以用于早期检测排斥发作(episode)。

本发明提供了用于早期检测潜在炎症(其特别是与移植物排斥有关)的体外方法。在所述方法中测定唾液中犬尿氨酸的水平。虽然在本发明的方法中优选测定L-犬尿氨酸的水平，但也可以测定N-甲酰犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸和犬尿烯酸(kynureninic acid)的水平。根据检测的方法，可以在不同中间体之间测定。然而，还可以利用与不同中间体反应的测定检验。对唾液中犬尿氨酸的测定优选定量或半定量进行，因为检测在常规值外的犬尿氨酸水平的变化是重要的。尤其有利的是所述体外方法可在没有医生或医学受训人员的情况下进行。

本发明的方法优选用于尽早地检测可能与对移植器官的排斥有关的任何并发症。在本发明的优选实施方案中，移植的器官选自那些经常移植的器官，如肾、肝、胰、心脏或肺。

然而，在另一个实施方案中，本发明的方法可在移植身体的一部分时使用。这类部分可以是眼的部分如角膜或视网膜。还能移植其他身体部分，如软骨、骨、骨髓或皮肤。

在一个进一步的实施方案中，移植物并非源自另一个人或源自动物。在这类实施方案中，从并非源自另一人或动物身体的材料制备移植物。这类材料可以是骨替换物、关节替换物、用于牙齿的植入物、乳房植入物或阴茎植入物等等。通常选择这类材料以将身体的潜在排斥活性保持在最低可能水平。

然而，监测对移植物的接受且用于早期检测可能导致移植物的最终排斥的潜在并发症的方法可能是有帮助的。本发明的体外方法优选可用于容易和可靠地监测患者在接受移植物后的恢复。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，本文中描述的检验方法可用于治疗控制。可以在非常早的阶段检测炎症的早期迹象而不需要侵入性手段。患者能通过用其唾液容易地实施检验，且本文中提供的检验试剂盒允许早期指示治疗中的潜在风险。

在另一个实施方案中，本发明提供用于实施依照本发明方法的适宜的试剂盒。这类试剂盒包含用于测定唾液中犬尿氨酸的手段。这类手段可基于不同的原理工作。可以使用特定的显色试剂，其检测犬尿氨酸和/或犬尿氨酸衍生物的存在。或者，试剂盒可包含至少一种或优选两种特异性结合犬尿氨酸的抗体。优选地，当使用两种抗体时，这类抗体不结合相同表位，从而允许形成由第一抗体、犬尿氨酸或其衍生物和第二抗体形成的夹心。

在本发明的一个实施方案中，通过显色反应来实施对犬尿氨酸或其衍生物的测定。测定检验中的样品是唾液。在可以测定犬尿氨酸或其衍生物的含量之前，必须除去可能不利地影响正确和准确检验结果的组分。在一个优选的实施方案中，优选通过将扰乱测量结果的组分沉淀来除去可能扰乱正确检验结果的不想要的唾液组分。这类沉淀优选可通过使用三氯酸(trichloric acid)进行。然而，除了使用三氯酸以外，可以使用其他用于唾液去蛋白作用的方法。在已通过沉淀除去唾液的扰乱组分之后，可能必需通过离心分离相。然后，优选使上清液与显色试剂反应，所述显色试剂优选可以是Ehrlich氏试剂。在显色后通过测量在适宜波长处的吸光度来测量样品。优选地，所述检验以定量或半定量方式进行。在检验方法中，可以使用校正曲线或在检验试剂盒中固定某个阈值以避免假阳性结果。

发现早在实体器官移植后第1天，与在移植物手术后具有非并发性过程的患者相比，血清犬尿氨酸在随后患有急性排斥发作的患者中显著升高。将色氨酸代谢中的这些变化用于开发针对实体器官同种异体移植的急性排斥的新的预后检验。在移植后立即分析犬尿氨酸含量能协助定义最可能经历急性排斥的患者亚组，并对立即执行挽救移植治疗(graft-saving therapy)具有另外的意义。

本发明的方法展现出在超过15,000次探查(probe)中炎性活性与炎症，如败血症、感染和排斥的相关性。

数据表明激活的先天免疫是急性和慢性移植衰竭的关键因素之一。氧化性应激诱导的细胞因子信号传导途径可以为新的免疫抑制剂提供更特定的靶物。

在本发明的另一个实施方案中，提供一种用于检测和/或监测神经变性病症的体外方法，其中测定唾液中或血浆中犬尿氨酸的水平。通过比较测量的值和从未受影响个体获得的平均值，可以进行诊断预测。

在优选的实施方案中，所述神经变性病症选自下组：阿耳茨海默氏病(Alzheimer's disease)、血管性痴呆(vascular dementia)、帕金森氏病(Parkinson's disease)和术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction)。将血浆和/或唾液中的犬尿氨酸水平与在未患有这类神经变性疾病的可比个体中测量的犬尿氨酸的平均水平比较。

慢性进行性神经变性疾病，如阿耳茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)和血管性痴呆(VD)随着人群的持续老龄化展现出增加的流行性，且因此产生了相当大的近来的研究兴趣。尽管已对神经变性过程的背景进行了大量研究，但确切的分子基础仍需弄清。越来越多的证据表明，脑中的先天免疫应答主要受炎性过程影响。

尽管这些破坏性疾病对于患者的生活质量具有严重影响，但其管理经常是具有挑战性的。目前的疗法大多仅提供症状性减轻且没有神经保护性治疗。不同的神经变性病症的病理机制共享一些共有的特征。兴奋性中毒(excitotoxicity)、神经炎症、线粒体紊乱和氧化性应激均牵涉于急性和慢性神经病症中。

神经变性过程具有一些共有的特征，其不是疾病特异的。虽然还有许多细节等待阐明，但有一些被广泛接受的普遍机制；线粒体紊乱、兴奋性中毒、神经炎症、和氧化性应激的作用似乎是明显的。

谷氨酸盐兴奋性中毒牵涉到缺血性发作、创伤性脑损伤(traumatic braininjury)和多种神经变性病症的病理机制中。

之前认为AD涉及独特的病理学，其可与血管性痴呆(VD)清楚地区分。然而，最近数年已将脑血管功能障碍的作用与AD的神经变性过程关联起来，且血管风险因子关于AD形成和进展已吸引了越来越多的注意力。

VD和AD之间的重叠长期以来是公认的，但在最近数年开始了完全的范式转移(paradigm shift)，已提出AD主要是血管疾病。仅小部分的AD病例具有遗传起源；大多数是偶发的。形成AD的最重要的风险因子是老龄，流行性和发病率数据显示随着年龄增长的增加的趋势。再次地，犬尿氨酸在血管调节过程中起着主要作用。

类似地，在AD的动物模型中已观察到受损的脑血液流动和自身调节能力，该损伤证明为与氧化性应激有关。这些发现将Aβ的存在与氧化性应激和神经炎症关联。目前在新的先天免疫应答的观点下，可以假定存在对先天炎性应答的激活。另一主题是犬尿氨酸在血管调节过程中起着主要作用。

将在下文更详细地解释犬尿氨酸途径(KP)在AD和其他神经疾病中的作用，和将对其调控作为潜在的治疗策略。

犬尿氨酸途径(KP)是哺乳动物中色氨酸(TRP)降解的主要代谢路径，其负责人脑中超过95％的TRP分解代谢。该代谢级联中产生的代谢物，称为犬尿氨酸，涉及许多生理学过程，包括神经传递和免疫应答。KP还涉及神经毒性和神经保护性代谢物，且已在多种病理学过程中展现了其精细平衡中的改变。KP的中心中间体是L-犬尿氨酸(L-KYN)，此处代谢途径分成两个不同的分支。L-KYN被转化成神经保护性犬尿烯酸(KYNA)或3-羟基-L-犬尿氨酸(3-OH-KYN)，其在一系列酶促步骤中进一步代谢得到最终NAD。相关的细节显示于图8。

许多神经病症如亨廷顿病中显示KP的改变。不仅在AD中而且还在存在认知衰退的其他病症中显示KP中的不平衡，且影响该精细平衡可能具有治疗价值。

另外，提出犬尿氨酸代谢物中的变化与梗死体积、中风患者的死亡率和中风后认知受损相关。在另一项研究中，测量进行心脏手术的患者中的血清犬尿氨酸水平和炎性标志物；结果指示几种犬尿氨酸代谢物水平与手术后认知表现的关联。

结果显示增加的色氨酸水平和降低的与分流(bypass)有关的犬尿氨酸、邻氨基苯甲酸和3-羟基邻氨基苯甲酸水平，和犬尿烯酸中的后期增加。新喋呤(neopterine)和脂质过氧化反应产物的水平在非分流(non-bypass)患者中手术后升高，而TNF-α和S100B水平在分流后增加。新喋呤水平的变化在非分流手术后更大。认知检验显示色氨酸、犬尿氨酸、犬尿烯酸的水平和犬尿氨酸/色氨酸比与术后认知功能方面相关，且在对额叶执行功能和记忆敏感的任务中是认知表现的重要预测物。如此，麻醉和重大手术与炎性变化(根据自由基的生成激活先天免疫应答)和色氨酸氧化机制中的改变(其预测术后认知功能且可能在术后认知功能中起作用)有关。

KP代谢物还牵涉到血管认知受损。关于AD，大量证据显示改变的色氨酸代谢。

从周围犬尿氨酸代谢的方面看，在AD患者的血清、红细胞和CSF中测量到降低的KYNA水平。另外，AD患者的血清中显示增强的IDO活性，如由增高的KYN/TRP比反映的，这一升高显示与认知衰退速率的反相关。IDO活化也与血液中的几种免疫标志物相关，由此指示免疫激活，这进一步支持了神经炎性在AD的病理机制中的作用。增加的IDO活性也由在AD患者的海马中的免疫组化连同增强的QUIN免疫反应性确认。

本发明的一个特别优选的实施方案是诊断和监测术后认知功能障碍。术后认知功能障碍(POCD)定义为在外科手术规程后新形成的认知功能病症。症状是微妙的且显示多种模式。导致这一本质(entity)的机制仍未完全解决。实验结果显示对导致神经炎性的先天免疫系统的免疫应答。炎性应答的激活和TNF-α和NF-kB信号级联在经由不同的细胞因子的分泌破坏血脑屏障的完整性。

这实现巨噬细胞到海马中的迁移并允许脑记忆应答的失能。抗炎性应答能抑制该促炎性作用且功能异常将被阻止。

已经显示QUIN刺激脂质过氧化反应，产生反应性氧种类(reactive oxygenspecies)，和线粒体功能异常。在大鼠皮质纹状体系统的器官型培养中实施的研究表明，甚至仅稍比生理学浓度高的QUIN浓度就能在暴露数周后导致神经变性。发现脊髓神经元对QUIN变化尤其敏感，仅纳摩浓度的该代谢物就导致细胞死亡。

犬尿氨酸途径(KP)代谢必需氨基酸色氨酸且生成多种神经活性代谢物，称为犬尿氨酸。分开到至少两个不同的分支中(经常称为KP的“神经毒性”和“神经保护性”臂)，它们分别受两种酶犬尿氨酸3-单加氧酶和犬尿氨酸氨基转移酶调节。有意思的是，该途径中的几种酶在炎性介质的紧密调控下且甚至少量改变就能导致重大损伤。数年来，我们对CNS病中的神经炎性的理解有巨大的增长。有证据表明神经炎性与先天免疫系统和NAPLP3炎性体(inflammasome)的作用关联。这可能是在这些病症种类中保护性治疗办法的一个选项。

免疫系统激活涉及某些精神病病症的病理生理学得到充分证明。炎性分子如促炎性细胞因子能增强吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的活性，该酶是色氨酸降解途径(犬尿氨酸途径)的第一个限速酶。

关于犬尿氨酸代谢物及其涉及神经-生理学过程的知识在近年来快速增多。特别地，内源性KYNA似乎紧密调控中脑多巴胺神经元的发炎(firing)且似乎涉及认知功能。如此，已经发现降低的大鼠脑KYNA的内源性水平降低这些神经元的发炎，且具有犬尿氨酸氨基转移酶II的靶向缺失的小鼠展示低内源性脑KYNA水平伴随着在认知检验中提高的表现。还提出犬尿氨酸参与精神病病症的病理生理学。如此，已经在患有精神分裂症的患者的CSF中以及死后脑中发现升高水平的KYNA。调节色氨酸代谢的犬尿氨酸途径的遗传和激素因素的现有技术提出该途径介导抑郁的遗传和环境机制两者。犬尿氨酸形成的限速酶，色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)由应激激素(TDO)和/或促炎性细胞因子(IDO)激活。促炎性细胞因子基因(例如干扰素-gamma和肿瘤坏死因子-alpha)的高生产等位基因的同时存在决定经由IDO的上调对抑郁的遗传素因(predisposition)，而经由TDO的激素激活介导环境应激的影响。色氨酸-犬尿氨酸途径代表抑郁中基因-环境相互作用的主要交汇点和用于药理学干预的新靶物。因此本文中公开的方法也可用于诊断抑郁。

本文中公开的方法应与临床参数一起使用。犬尿氨酸的相对值优选可与其他临床参数一起解译。本发明实质性地有助于诊断的预后价值。经常地，可通过将要诊断的患者中测量的犬尿氨酸值与获自不患有该病的人的可比分组的平均值比较来改进本发明的方法。

用于实施如本文中公开的体外方法的试剂盒可基于不同原理。优选的原理之一称为横向流动免疫层析测定(Lateral Flow Immunochromatographic Assay)。这类横向流动免疫层析测定可由患者容易地实施，无需医生或其他医学受训人员的帮助。

横向流动检验，也称为横向流动免疫层析测定，是意图检测靶分析物样品的存在(或不存在)而无需专门和昂贵设备的简单装置，尽管存在许多得到阅读设备支持的基于实验室的应用。这些检验典型用于医学诊断，用于家庭检验、医护点检验(point of caretesting)或实验室使用。广泛使用且公知的一种应用是家庭妊娠检验。

该技术基于一系列毛细管床，如多孔纸或烧结聚合物的片。这些元件的每一个都具有自发转运液体(例如唾液)的能力。头一个元件(样品床)充当海绵且存置过量的样品液体。一旦浸透，流体就迁移到第二元件(缀合垫)，其中制造商已储存了所谓的缀合物，在盐-糖基质中的生物活性颗粒的干燥形式(见下文)，其含有固定化于颗粒表面上的保证靶分子(例如犬尿氨酸)及其化学配偶体(例如抗体)之间优化的化学反应的一切。当样品流体溶解盐-糖基质时，它在流过多孔结构时还溶解颗粒且在一个组合的输运行为中样品和缀合物混合。通过这种方式，分析物结合颗粒，同时更远地迁移到第三毛细管床。该材料具有一个或多个区域(常称为条(stripes))，其中制造商已固定化有第三分子。当样品-缀合物混合物到达这些条时，分析物已结合在颗粒上且该第三“捕捉”分子结合该复合物。不久后，当越来越多的液体通过了该条时，颗粒积累且条区域改变颜色。通常有至少两种条：一种捕捉任何颗粒且由此显示反应条件和技术正常工作的条(对照)，第二种含有特异性捕捉分子且仅捕捉那些上面已经固定化有分析物分子的颗粒。在穿过这些反应区后，流体进入最终多孔材料，纱布条(wick)，其简单充当废物容器。横向流动检验可作为竞争性或夹心测定法运行。

从原理上讲，可以使用任何颜色的颗粒，然而，最普遍使用的是乳胶(蓝色)或纳米大小的金颗粒(红色)。由于局部化的表面等离振子共振，金颗粒颜色是红的。还可以使用荧光或磁性标记的颗粒，然而这些需要使用电子读数器来评估检验结果。

样品首先遇到带色颗粒，其用针对靶分析物生成的抗体标记。检验线(line)还将含有针对相同靶物的抗体，尽管它能结合分析物上的不同表位。检验线将在阳性样品中显示为带色条带。夹心测定法的一个例子是夹心ELISA。

尽管不是严格必需的，但大多数检验试剂盒优选纳入第二线，其含有挑取游离胶乳/金的抗体以确认检验正确运行。

在一个优选的实施方案中，以下述方式改编横向流动测定的单一构件使得仅当样品中存在超过一定阈值的犬尿氨酸时指示犬尿氨酸的存在。

优选的检验试剂盒由以下构件组成：

1.样品垫–对其上施加检验样品(唾液)的吸收垫

2.缀合物或试剂垫–其含有特异于缀合至带色颗粒(通常是胶体金颗粒或胶乳微球)的靶(犬尿氨酸)分析物的抗体

3.反应膜–典型为疏水性硝酸纤维素或醋酸纤维素膜，其上在跨越膜的线内固定化有抗靶分析物抗体作为捕捉带或检验线(对照带也可以存在，其含有特异于缀合物抗体的抗体)

4.纱布条或废液储器(Wick or waste reservoir)–设计为通过毛细管作用吸引样品跨越反应膜并收集它的一个另外的吸附垫。

条的各构件通常固定至惰性基底材料(backing marterial)，并且可以以简单的浸渍片形式或者在具有样品口和显示捕捉和对照带的反应窗的塑料铸件内呈现。

在本发明的方法中使用两种优选的检验试剂盒的实施方案(横向流动免疫测定)：

a.双抗体夹心测定法

在该形式中，样品从样品垫迁移到缀合物垫，在该处任何存在的靶分析物将结合缀合物。然后样品继续迁移过膜，直至其达到捕捉带，在该处靶物/缀合物复合物将结合固定化的抗体，从而在膜上产生可见的线。接着，样品进一步沿条迁移直至其达到对照带，在该处过量的缀合物将结合且在膜上产生第二条可见的线。该对照线指示样品已经如意图的那样迁移通过膜。膜上两条清楚的线显示阳性结果。在对照带中的单个线是阴性结果。双抗体夹心测定法是最适宜于较大分析物如细菌病原体和病毒(具有多个抗原性位点)的。对于本发明，必须选择一对适宜的抗体，其结合犬尿氨酸上的不同表位。

当适用于实施这类方法的检验方法或试剂盒使用特异性结合犬尿氨酸的抗体时，术语“抗体”不仅意指人工产生例如通过免疫实验室动物如家兔、绵羊或山羊产生的抗体。在一个优选的实施方案中，它还包含根据杂交瘤技术产生的单克隆抗体。而且，术语“抗体”还包括抗体的抗原结合片段如重组产生的抗原结合片段。这类构建体可通过噬菌体展示及自其衍生的技术产生。

b.竞争测定法

竞争性测定法主要用于检验小分子且与双抗体夹心形式的不同之处在于，缀合物垫含有已经结合于靶分析物或其类似物的抗体。如果靶分析物存在于样品中，其因而将不与缀合物结合而是保持未标记。当样品沿膜迁移且到达捕捉带时，过量的未标记的分析物将结合固定化的抗体并阻断缀合物的捕捉，从而不产生可见线。未结合的缀合物然后将结合对照带中的抗体，从而产生可见的对照线。膜上的单个对照线是阳性结果。在捕捉和对照带中的两条可见线是阴性结果。然而，如果不存在过量的未标记的靶分析物，就可能在捕捉带中产生微弱的线，从而指示不确定结果。竞争测定法最适用于检验小分子，如真菌毒素，其不能同时结合超过一种抗体。横向流动技术有许多改变形式。根据靶分析物，膜上的捕捉带可以含有固定化的抗原或酶而不是抗体。还可以应用多个捕捉带以创造多重检验。

横向流动免疫测定可简单地由未受训练的操作者使用且一般在15分钟内产生结果。它们非常稳定和稳健(robust)，具有较长保质期且通常不需要冷冻存放。它们的生产也相对便宜。这些特征使其对于医护点使用和实地检验样品以及在实验室中使用为理想的。然而，它们的灵敏性有限，没有另外的浓缩或培养规程。已存在可用的定量检验，但我们的目标是对唾液在一定范围进行定性检验。因此，优选的试剂盒被调整为仅在超过一定浓度存在时测量犬尿氨酸。低于这类浓度，检验试剂盒将显示阴性结果。

本发明的方法优选使用唾液进行。唾液是一种临床上提供信息的生物学流体，其可用于预后、实验室或临床诊断、和监测及管理患者的新办法。唾液含有多种生物标志物，且对唾液腺分泌的原理的概论、收集方法和一般用途论述可见于在Annals of the NewYork Academy of Sciences Malamud D,Niedbala RS Oral-based diagnostics NY AcadSci 2007；Boston Mass上发表的会议报告中。

最近，由于逐渐出现的生物技术和唾液诊断学的组合，也逐渐显示出唾液中的大量医学有价值的分析物且其中一些代表不同疾病(癌症、病毒疾病、HIV)的生物标志物。

这些进展拓展了基于唾液的诊断学的范围，将其简单口腔拓展到全生理学系统。

通过本发明的方法，满足了提供无痛、便宜、比基于具有分子诊断学的影响的血清或尿的办法容易和安全的检验的目的。在一个实施方案中，通过使用干燥方法(冻干)和随后稀释使灵敏性降至0.2μM来修改所述方法。所述方法与HPLC技术比较，发现了可比的结果。

已有的结果是令人惊讶的。在移植的患者和健康志愿者之间在血清和唾液中有显著差异。此外，在比使用其他参数如CRP或甚至临床症状更早(多至5天)的阶段检测到炎性应答。

本发明由下图例示：

图1显示色氨酸降解的途径和由此形成的犬尿氨酸及其它中间体的结构。色氨酸到丙氨酸和乙酰乙酸的降解由色氨酸-2,3-双加氧酶启动。

图2是对健康对照的血清中正常犬尿氨酸值的估测。在不同性别之间没有观察到差异。健康人的血清中犬尿氨酸的平均值为2.5至3.0μM犬尿氨酸。

图3是血液供体的正常健康对照的两个独立分组的比较。在第一分组(老)中，检验了174份血清，而在第二分组(新)中，检查了117份血液供体血清。在两个组之间没有统计学差异。测量到几乎相同值。

图4显示在来自患有感染如例如UTI(泌尿道感染)、支气管肺炎或更大的伤口感染的未移植患者的血清中的犬尿氨酸浓度。没有性别差异且与稳定移植的患者有显著差异。犬尿氨酸值实质性高于在正常患者的血清中测量的值。平均值范围为约7至9μM犬尿氨酸。

图5是均获自正常健康对照人的血清和唾液中测量的犬尿氨酸水平的比较。健康人的唾液中的平均犬尿氨酸水平是约0.5-0.7μM/L犬尿氨酸，而血清中犬尿氨酸的浓度为约2.5-3.0μM/L犬尿氨酸。因此，当两份样品均获自正常对照人时，犬尿氨酸的浓度是唾液中约4-5倍高。

图6显示在从患者取样品后犬尿氨酸的稳定性。样品中犬尿氨酸的浓度在至少相当长一段时间(数小时)内保持相同是重要的。因此，取样品、存放并以1小时时间间隔测量犬尿氨酸的浓度。在测量的时间间期(长达4小时)内，没有观察到犬尿氨酸浓度的实质性变化。

图7显示唾液中的犬尿氨酸测定允许可靠地指示患者在接受移植物后的潜在问题。该图显示作为对照的没有指示潜在移植物排斥的炎症的患者。对照显示唾液中犬尿氨酸的浓度为平均约0.5μM/L犬尿氨酸。显示炎症早期迹象的患者的唾液中的犬尿氨酸值急剧增加至平均值为约7μM/L犬尿氨酸。令人惊讶地，在任何临床症状发生之前5天检测到炎性应答。这允许在早期阶段治疗这类患者，由此能避免对移植物的排斥。

图8是犬尿氨酸途径的示意图，该途径是高等真核生物中色氨酸降解的主要路径。酶以斜体显示。神经毒性代谢物QUIN和3-HK红色高亮且神经保护性代谢物KYNA为深灰色。

图9是4组中犬尿氨酸的比较(在血浆和唾液中测量)：对照n＝116；在心脏手术之前的患者n＝51；患有术后脑病症的患者n＝8和患有脑痴呆的患者(POCD)(在治疗前)n＝9。在对照、POCD和血管痴呆(Vasc.-Dem.)之间有显著差异(p<0.001)。在血浆和唾液两者中，发现在心脏手术和POCD和VD之间有类似的结果(p<0.05)。

本发明进一步由以下实施例示例，然而其不限定本发明的范围。

实施例

实施例1

尤其对移植中排斥发作诊断炎症的犬尿氨酸检验

1.1.比色测定法的通用技术

可以通过数十年以来已知的显色反应(例如Coppini等,Clinical Chemistry,Vol.5,No.5,1959,p.391-401)定量测定生物学流体中经由犬尿氨酸的色氨酸代谢物。一般地，可通过标准方法实施经由显色反应产物的形成的检测方法。

微板读数器是设计为检测微滴定板中样品的生物学、化学或物理事件的实验室仪器。它们在药物和生物技术工业及学术性组织的研究、药物发现、生物测定验证、质量控制以及制造过程中广泛使用。样品反应可在6-1536孔形式微滴定板中测定。在学术性研究实验室或临床诊断实验室中使用的最普遍的微板形式是96孔(8乘12矩阵)，具有典型反应体积为100至200μL每孔。更高密度的微板(384或1536孔微板)通常用于筛选应用，此时通量(处理的样品数/天)和测定成本/样品变成关键参数，典型测定体积为5至50μL每孔。

用于微板测定的常见检测模式是吸光度、荧光强度、发光、时间分辨性荧光和荧光极化。

吸光度检测在微板读数器中可用达超过30年，且用于测定法如ELISA测定、蛋白和核酸定量或酶活性测定。光源使用特定波长(由光纤或单色仪选择)照射样品，而位于孔另一侧的光检测器测量有多少初始(100％)光传播过样品：传播的光量通常将与感兴趣的分子的浓度相关。

1.2.对检验的描述

该检验作为一种经修改的方法开发。

制备显色试剂且还制备犬尿氨酸标准溶液的稀释物。显色反应使用所谓的“Ehrlich-Reagenz”实施，其产生黄色。包含溶解于20％HCl的按重量计2％的二甲氨基苯甲醛的溶液称为“Ehrlich-Reagenz”。所述显色试剂也用于检测伯氨基团、吡咯以及吲哚衍生物。使用单色光进行对浓度的比色测定。犬尿氨酸的标准溶液通过使用L-犬尿氨酸硫酸盐制备。

将等量的样品与100μl三氯乙酸(30％)彻底混合。在离心后测量上清液。将每份样品在492nm的吸光度与同一样品在650nm或690nm的吸光度比较。然后，从每个孔的吸光度减去对照的吸光度(5个孔的平均)。通过制备标准曲线，能测定每份样品中的犬尿氨酸浓度。

实施例2

如下测定血清值：

在前导性研究中，在来自具有肾同种异体移植物和明确限定的术后过程的>400名受体的>15,000份血清中测定L-犬尿氨酸水平。犬尿氨酸水平反映IDO激活程度。所有受体显示肾移植前(pre renal transplant)显著升高的犬尿氨酸水平(16,5±5nmol/ml；健康的移植的稳定的人：5,3±1,2；器官供体：6,5±5,5和正常对照：2,4±0,3；组间差异p<.001)。使用血清测定犬尿氨酸值。在具有立即发挥功能的肾移植物的受体中，犬尿氨酸水平在3-5天内回复正常。每个延迟的移植物功能均与升高的犬尿氨酸水平有关，其在移植物功能开始后也回复正常(存在着透析期间的激活和更低的经尿排泄)。在具有主要无功能(functionless)移植物的受体中，术前升高的犬尿氨酸水平未改变。在具有主要发挥功能的移植物的受体中，移植物功能的破坏即时与显著升高的犬尿氨酸水平有关。这些发现提供了犬尿氨酸活性还在临床肾移植中的重要性的证据。一项招募248名受体的扩展的研究显示犬尿氨酸活性作为排斥以及长期功能的预测性参数的临床相关性。

实施例3

满足标准(26)的在心脏手术后具有术后脑病症的8名患者(瓣替换，均值年龄62±6,3岁)和患有脑痴呆的9名患者(均值年龄73±8,3岁，均值MMS-得分22)被招募到与正常对照(n＝116；均值年龄48,8岁，范围12-88岁)和心脏手术前患者(n＝51，均值年龄51,3，范围42-69岁)的比较性研究中。目的是通过估测血浆或唾液中的犬尿氨酸检测在此重大手术规程后的炎性应答。在术后第5天，犬尿氨酸在患有POCD的患者中显著更高。具有脑痴呆的患者在开始医学治疗之前显示在血浆以及在唾液中升高的犬尿氨酸水平。

总之，在该非常小的患者组中已经可以显示，犬尿氨酸测量是鉴定脑病症以及对其进行监测的工具。

Claims (8)

1.用于定量测定唾液中L-犬尿氨酸的水平的合适的试剂在制备用于早期检测由对移植物的排斥所致的潜在炎症的试剂盒中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中潜在炎症由对选自下组的移植器官的排斥所导致，该组包含肝、胰、心脏、肺和肾。

3.根据权利要求1的用途，其中所述潜在炎症由选自下组的移植物所导致，该组包含角膜移植物、视网膜移植物、软骨移植物和皮肤移植物。

4.根据权利要求1的用途，其中所述潜在炎症由对人工移植物的排斥所导致。

5.根据权利要求4的用途，其中所述人工移植物选自下组，该组包含骨替换物、关节替换物、牙植入物、软骨植入物、乳房植入物和阴茎植入物。

6.根据权利要求1至5中任一项的用途，其中所述试剂盒用于监测已接受移植物后患者的恢复。

7.根据权利要求1至5中任一项的用途，其中所述试剂盒用于治疗控制。

8.根据权利要求6的用途，其中所述试剂盒用于治疗控制。