ES2261049B1 - Dioagnostico de carcinoma hepatocelular mediante la deteccion de formas oxidadas de apolipoproteina a1. - Google Patents

Dioagnostico de carcinoma hepatocelular mediante la deteccion de formas oxidadas de apolipoproteina a1. Download PDF

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Abstract

Diagnóstico de carcinoma hepatocelular mediante la detección de formas oxidadas de apolipoproteína A1. Diagnóstico del carcinoma hepatocelular, mediante la detección del incremento de una isoforma acídica de la apolipoproteína A1 en muestras biológicas aisladas de los pacientes. Caracterizándose dicha isoforma por estar oxidada en los residuos W50 y W108.

Description

Diagnóstico de carcinoma hepatocelular mediante la detección de formas oxidadas de apolipoproteína A1.
Campo técnico de la invención
La presente invención se engloba dentro del campo del diagnóstico del carcinoma hepatocelular.
Estado de la técnica anterior a la invención
El carcinoma hepatocelular (HCC) es la quinta enfermedad neoplásica de mayor incidencia y la tercera causa de muerte por cáncer con más de 500.000 nuevos casos diagnosticados anualmente. A pesar de que las principales causas de HCC son conocidas, entre ellas, infección por virus de hepatitis B (HBV), o C (HVC), el consumo de alimentos contaminados con aflatoxina, o el consumo abusivo de alcohol, el pronóstico de los pacientes con HCC es malo debido a la agresividad de la lesión en el momento de la diagnosis y a la falta de terapias eficaces. La identificación de biomarcadores que permitan describir con efectividad el estadía de esta enfermedad es, por lo tanto, de gran
interés.
Existen evidencias de que muchos procesos patológicos se asocian con cambios cuantitativos y funcionales en los constituyentes moleculares de los fluidos corporales. Excluyendo los componentes celulares, el análisis comparativo de muestras de fluidos corporales de donantes sanos y enfermos sólo resulta posible a nivel proteómico y no a nivel transcripcional. A pesar de que el liquido cefalorraquídeo y la orina se utilizan en medicina diagnóstica, existe un creciente interés en el proteoma del suero humano debido a que el suero perfunde constantemente los tejidos y, por lo tanto, el comienzo o la presencia de una enfermedad podría determinarse midiendo y caracterizando las miles de proteínas y péptidos circulantes individuales. Además, las técnicas de determinación en suero son técnicas incruentas, no invasivas, con buena disponibilidad de muestra, fáciles de realizar, rápidas y baratas.
Las técnicas tradicionales que permiten diagnosticar el HCC, como el incremento de los niveles de alfa fetoproteína (AFP), no son eficaces en todos los casos y resultan positivas cuando el estadío de la enfermedad es demasiado avanzado. Se han realizado estudios para identificar marcadores de HCC utilizando técnicas de proteómica de alto rendimiento, tanto en hígado (Zeindl-Eberhart E. et al. Hepatology (2004) 39:540-549), lo que supondría la utilización de técnicas invasivas para realizar el diagnóstico, como en suero (Steel F.L. et al. Proteomics (2003) 3:601-609; Quina Yu He et al. Proteomics (2003) 3:666-674). Sin embargo, si bien esta tecnología ha demostrado su eficacia en la detección de dianas moleculares relacionadas con el desarrollo de diversas enfermedades, su complejidad metodológica hace impensable su utilización en la práctica clínica. Ninguno de los estudios mencionados presenta información que sirva como base para el desarrollo de metodologías diagnósticas aplicables en clínica. Por otra parte, diversos estudios, incluyendo los arriba mencionados, han relacionado una disminución en los niveles de Apo A1 con el desarrollo de enfermedades hepáticas. Sin embargo, la isoforma de Apo A1, y su aumento en suero de pacientes con carcinoma hepatocelular, objeto de esta invención no ha sido descrita previamente.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es el diagnóstico de carcinoma hepatocelular, mediante la detección en una muestra biológica, preferentemente suero, de un incremento de una isoforma acídica de la apolipoproteína A1. Concretamente, una isoforma de apolipoproteína A1 oxidada en los residuos W50 y W108.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular, caracterizado porque comprende detectar el incremento de isoformas de apolipoproteína A1 oxidadas en al menos un residuo triptófano o metionina, o fragmentos de las mismas que contengan dichos residuos oxidados. En una realización preferente de la invención, comprende la detección del incremento de al menos una isoforma de apolipoproteína A1 oxidada en al menos un residuo seleccionado entre W50, W108, y M112 o fragmentos de la misma que contengan dichos residuos. Los residuos W50 y W108 pueden estar oxidados a kinurenina, formilkinurenina, hidroxitriptófano, o 3-OH-kinurenina. Por otra parte, el residuo M112 puede estar oxidado a M112 sulfóxido, o metionina sul-
fona.
Además, el procedimiento objeto de la presente invención se caracteriza porque dicha detección se realiza en muestras biológicas aisladas. Estando dichas muestras seleccionadas entre: suero, plasma, sangre, orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, lágrima, líquido amniótico, lavado tisular, homogeneizado tisular, y lisado celular. En una realización preferente de la invención dicha muestra biológica es suero.
En una realización concreta de la presente invención, el diagnóstico de carcinoma hepatocelular se lleva a cabo en individuos con hepatitis, y preferentemente en individuos con hepatitis B (HBV).
Tal y como se utiliza en la invención, el término "individuo" se refiere a cualquier animal, preferentemente un mamífero. En una realización preferida de la invención, el individuo es un hombre o una mujer.
En el procedimiento objeto de la presente invención la detección de dicho incremento puede realizarse por comparación con estándares de Apo A1 purificada en cantidades conocidas, o mediante comparación con las cantidades de dicha isoforma presente en el mismo tipo de muestra biológica obtenida de individuos control sanos.
En una realización preferente, el incremento observado mediante dicho procedimiento, en la forma oxidada en el suero con respecto al nivel control es de al menos 1,5 veces, y preferentemente de al menos 2,5 veces.
Adicionalmente, dicho procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular, se caracteriza porque comprende el uso de métodos para detectar y cuantificar la presencia de isoformas oxidadas de Apo A1 seleccionados entre: espectrometría de masas, inmunoensayos, ensayos químicos, cromatografía líquida, métodos fotométricos directos e indirectos, y combinaciones de los anteriores. En una realización preferente los métodos de espectrometría de masas están seleccionados entre: espectrometría de masas en tandem asociada con cromatografía líquida (LC-MS) y MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry time-of flight MS). Además, en una realización preferente de la invención los inmunoensayos están seleccionados entre: ensayos homogéneos, ensayos heterogéneos, enzima-inmunoensayos (EIA, ELISA), ensayos de competición, ensayos inmunométricos (sandwich), ensayos turbidimétricos, ensayos nefelométricos y combinaciones de los anteriores; los cuales están extensamente descritos en "The immunoassay handbook" editado por David Wild, 2ª Edición 2001, Nature Publishing Group, el cual se incluye como referencia. En una realización preferida, los métodos de detección y cuantificación de formas oxidadas de Apo A1 comprenden la utilización de anticuerpos, aptámeros y/o lecitinas que reconocen específicamente dichas isoformas de Apo A1 y fragmentos de las mismas.
El objeto de la presente invención, se refiere además, al diagnóstico precoz del carcinoma hepatocelular, por el procedimiento descrito anteriormente en el texto.
Además, la presente invención se refiere a un kit para determinar el incremento de isoformas de la apolipoproteína anteriormente descritas, caracterizado porque comprende reactivos para realizar los métodos de la presente invención. En una realización preferente, dichos reactivos están seleccionados entre ligandos específicos de isoformas de Apo A1, componentes marcadores para detectar isoformas de Apo A1, tampones, diluyentes, estándares y controles. En una realización preferida, dicho kit comprende además, botellas, viales, tubos agujas, sustratos sólidos e instruccio-
nes.
Breve descripción de las figuras Figura 1
Identificación del incremento de niveles de Apo A1 y Apo AIV en el suero de ratones MAT1A-/-. Muestras de suero de ratones control y MAT1A-/- de 1, 3, 5, 12, y 18 meses de edad, fueron analizadas mediante electroforesis bidimensional. El panel A muestra geles representativos de tres análisis independientes. Las bandas diferenciales están identificadas en las áreas 1 y 2. El panel B muestra el espectro típico obtenido mediante MALDI TOF MS a partir de digestiones trípticas de las bandas 1 y 2. Los péptidos cuya secuencia coincide con la secuencia de Apo AIV (1) y Apo A1 (2) están indicados.
Figura 2
Identificación de residuos específicos de metionina, sulfóxido en la isoforma 1 de Apo A1 mediante ESI-MS/MS. Los péptidos trípticos de las especies de Apo A1 fueron resueltos mediante cromatografía líquida nanoflujo de fase reversa. La columna se conectó mediante una fuente de electroespray a un espectrómetro de masas en tándem. Se muestran los espectros de fragmentación de los péptidos procedentes de la isoforma 1, que contenían derivados de la metionina sulfóxido en las posiciones 85 y 116. Las modificaciones fueron confirmadas en tres experimentos independientes. En todos los ensayos, las isoformas 2 y 3 mostraron los residuos M85 y M116 sin oxidar.
Figura 3
Análisis de isoformas de Apo A1 en enfermedades de hígado humano mediante electroforesis bidimensional. Las isoformas de Apo A1 fueron analizadas en suero de pacientes con las patologías hepáticas indicadas. En todos los grupos, las muestras de suero de 6 pacientes fueron analizadas con la única excepción de EHNA (esteatohepatitis no alcohólica) en la que se incluyeron 15 pacientes en el estudio. El panel A muestra secciones de geles 2D representativos que contienen cuatro especies de Apo A1. Las bandas de proteína fueron identificadas mediante espectrometría de masas MALDI TOF y secuenciación de péptidos de novo. La densitometría de las bandas de Apo A1 de grupos que mostraban una distribución distinta de las isoformas que los individuos control se muestra en el panel B. * y ** indican p<0,05 frente a individuos control de acuerdo con el análisis mediante la t de Student.
Figura 4
Identificación de derivados específicos de metionina sulfóxido y formilkinurenina en la isoforma 1 de Apo A1 humana. Digestiones trípticas de isoformas de Apo A1 a partir de pacientes control y pacientes con HBV+HCC se resolvieron mediante cromatografía nano-LC. Los péptidos eluidos fueron caracterizados mediante espectrometría de masas en tandem (ESI/MS/MS). Se muestran los espectros de los péptidos con los iones específicos metionina sulfóxido (M112) y formilkinurenina (W50 y W108). Las modificaciones fueron confirmadas en tres experimentos independientes y sólo fueron detectadas en la isoforma 1. Las isoformas 2, 3, y 4 mostraban residuos de metionina y triptófano no oxidados.
Ejemplo 1
En este estudio se utilizaron ratones MAT1A-/-, caracterizados por una reducción crónica de la enzima AdoMet hepática, lo que induce el desarrollo espontáneo de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA/NASH) y hepatocarcinoma celular a los 18 meses de edad.
Se tomaron muestras de suero de ratones control y MAT1A-/-, de 3, 5, 12 y 18 meses de edad, y a continuación se analizaron mediante electroforesis bidimensional (2DE) seguida de espectrometría de masas. De este modo, se obtuvo una resolución promedio de 500 proteínas, y se realizó una comparación diferencial mediante PDQUEST, en la que se aceptaban como diferencias, los incrementos o disminuciones de un mínimo de dos veces. Con este criterio se obtuvieron sólo dos bandas proteicas pertenecientes a los sueros de ratones MAT1A-/-, cuyo incremento resultaba consistente en todos los ensayos. Además, estas diferencias se observaban a partir de 3 meses de edad de los
ratones.
El análisis mediante PMF permitió identificar estas dos bandas proteicas incrementadas como la apolipoproteína AIV y la apolipoproteína A1 (Figura 1). Puesto que la Apo A1 ha sido implicada previamente en enfermedades hepáticas, se basó este análisis en la caracterización molecular de la forma incrementada específicamente. Así, mediante la digestión tríptica de las distintas isoformas de Apo A1, seguida de nanocromatografía líquida acoplada a un espectrómetro de masas Q TOF Micro mediante una fuente de ionización electroespray (ESI/MS/MS). Los péptidos secuenciados representan más del 40% de la secuencia de Apo A1 en las tres isoformas (Tabla 1). Se identificaron cuatro residuos de metionina oxidados a metionina sulfóxido. La oxidación de M169 y M218 era común a los tres isotipos de Apo A1, y por lo tanto, no se puede descartar un artefacto generado durante el análisis de las muestras. Sin embargo, los sulfóxidos de M85 y M216 sólo fueron identificados en la isoforma 1 (Figura 2). Esta especificidad confirmada en tres análisis independientes, sugiere la relevancia fisiológica de la oxidación selectiva de los residuos M85 y M216.
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TABLA 1 Análisis mediante LC/MS/MS de isoformas de Apo A1 de suero murino
Péptidos trípticos de las isoformas de Apo A-1 procedentes de suero MAT1A-/- fueron resueltos mediante cromatografía líquida nanoflujo de fase reversa conectada a un espectrómetro de masas ESI/MS/MS. Las secuencias de los péptidos de Apo A-1 se dedujeron mediante análisis de síntesis de novo. Los residuos de metionina oxidados se encuentran en negrita.
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Ejemplo 2
Se estudiaron los niveles y el estado postraduccional de Apo A1 en muestras de suero de pacientes afectados de distintas patologías hepáticas, incluyendo esteatohepatitis no alcohólica, cirrosis alcohólica, HBV, HCV, y HCC. Se identificaron cuatro bandas como Apo A1 mediante PMF (Peptide Mass Fingerprint) y secuenciación peptídica de novo en todas las muestras y análisis mediante Western blot 2D. Mediante este estudio se detectaron alteraciones patología-específicas de la cantidad relativa de las isoformas de Apo A1. De modo que todas las muestras de suero procedentes de pacientes con HBV y HCC mostraron un incremento de 2,5 veces de la isoforma 1, con respecto a los controles (cantidad relativa 41,93 \pm 3,00% frente a 18,23 \pm 1,08% en individuos control) (Figura 3).
A continuación, se quiso analizar si el incremento de la isoforma acídica de Apo A1 era el resultado de un incremento del estado de oxidación de la proteína. Los productos de la digestión tríptica de las isoformas de Apo A1 procedentes de tres pacientes diferentes con HBV+HCC fueron analizadas mediante nano cromatografía líquida (nano LC) acoplada a un espectrómetro de masas Q TOF Micro mediante una fuente de ionización electroespray (ESI/MS/MS). En la isoforma 1 se detectaron selectivamente tres oxidaciones específicas. La oxidación de la metionina 112 a metionina sulfóxido se evidenció mediante una desviación +16 Da de la masa molecular correspondiente al ión (Figura 4). Adicionalmente, los iones de los residuos de triptófano 50 y 108 mostraron la adición de 32 unidades de masa, consistente con la formación de formilkinurenina mediante dos pasos consecutivos de oxidación. La M112 sulfóxido y la formilkinurenina en las posiciones 50 y 108 sólo se identificaron en la isoforma 1 (Tabla 2), mientras que la secuencia de los péptidos análogos de las isoformas 2, 3 y 4 mostraron los residuos de metionina y triptófano no oxidados. Estos datos fueron consistentes en los tres análisis independientes, lo que apoya la relevancia fisiológica de estas modificaciones.
TABLA 2 Análisis de isoformas de Apo A1 procedentes de suero humano mediante LC/MS/MS
Los péptidos trípticos de las isoformas de Apo A1 procedentes de suero humano se resolvieron mediante una columna de fase reversa C18, nano-flujo, conectada con un espectrómetro de masas Q TOF Micro (ESI/MS/MS). Las secuencias de los péptidos de Apo A1 fueron deducidas a partir de sus espectros de fragmentación. Los residuos de metionina y triptófano oxidados se encuentran en negrita.
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Claims (22)

1. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular caracterizado porque comprende detectar el incremento de isoformas de apolipoproteína A1 oxidadas en al menos un residuo triptófano o metionina, o fragmentos de las mismas que contengan al menos uno de dichos residuos oxidados.
2. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepático según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende la detección del incremento de al menos una isoforma de apolipoproteína A1 oxidada en al menos un residuo seleccionado entre W50, W108 y M112, o fragmentos de la misma que contengan al menos uno de dichos residuos oxidados.
3. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepático según la reivindicación 2 caracterizado porque comprende la detección del incremento de al menos una isoforma de apoliproteína A1 oxidada en una combinación cualquiera de los residuos W50, W108 y M112, bien sean dos de ellos o los tres.
4. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los residuos W50 y W108 están oxidados a kinurenina, formilkinurenina, hidroxitriptofano, o 3-OH-kinurenina.
5. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque M112 está oxidado a M112 sulfóxido, o metionina sulfona.
6. Procedimiento para él diagnóstico de carcinoma hepatocelular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha detección se realiza en una muestra biológica aislada.
7. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicha muestra biológica está seleccionada entre: suero, plasma, sangre, orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, lágrima, líquido amniótico, lavado tisular, homogeneizado tisular, y lisado celular.
8. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la muestra biológica es suero.
9. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende el diagnóstico en muestras biológicas procedentes de individuos con hepatitis.
10. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende el diagnóstico en muestras biológicas procedentes de individuos con HBV.
11. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dicha detección se realiza por comparación con estándares de Apo A1 purificada en cantidades conocidas, o por comparación con las cantidades de dicha isoforma presente en el mismo tipo de muestras biológicas aisladas de controles sanos.
12. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el incremento detectado de la isoforma oxidada de Apo A1 es de al menos 1,5 veces, con respecto al nivel control.
13. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el incremento observado en la isoforma oxidada con respecto al nivel control es de al menos 2,5 veces.
14. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado la presencia de isoformas oxidadas de Apo A1 se detecta y se cuantifica mediante un método seleccionado entre: espectrometría de masas, inmunoensayos, ensayos químicos, cromatografía líquida, métodos fotométricos directos e indirectos y combinaciones de los anteriores.
15. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según la reivindicación 14, caracterizado porque los métodos de espectrometría de masas están seleccionados entre: espectrometría de masas en tandem asociada con cromatografía líquida (LC-MS) y MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry time-of flight).
16. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según la reivindicación 14, caracterizado porque dichos inmunoensayos están seleccionados entre: ensayos homogéneos, ensayos heterogéneos, enzima-inmunoensayos (EIA, ELISA), ensayos de competición, ensayos inmunométricos (sandwich), ensayos turbidimétricos, ensayos nefelométricos y combinaciones de los anteriores.
\newpage
17. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según la reivindicación 14, caracterizado porque dichos ensayos comprenden la utilización de anticuerpos, aptámeros y/o lectinas, que reconocen específicamente dichas isoformas de Apo A1 o sus fragmentos.
18. Procedimiento para el diagnóstico de carcinoma hepatocelular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque dicho diagnóstico es precoz.
19. Kit para determinar el aumento de la isoforma de apolipoproteína A1 según el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque comprende medios para detectar y cuantificar la presencia de dicha isoforma, o fragmentos de la misma, en muestras biológicas.
20. Kit para determinar el aumento de la isoforma de apolipoproteína A1 según la reivindicación 19, caracterizado porque comprende reactivos para realizar el procedimiento de la presente invención.
21. Kit para determinar el aumento de la isoforma de apolipoproteína A1 según una cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, caracterizado porque dichos reactivos están seleccionados entre: ligandos específicos de isoformas de Apo A1, componentes marcadores para detectar isoformas de Apo A1, tampones, diluyentes, estándares y controles.
22. Kit para determinar el aumento de la isoforma de apolipoproteína A1 según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque comprende además, botellas, viales, tubos, agujas, sustratos sólidos, e instrucciones.
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