CN104321444A - 用于检测抗巨细胞病毒中和抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于确定宿主细胞中HCMV感染水平的方法，并且引申至确定样品中存在的中和抗体的水平。本公开内容涵盖这一认识：即，具有荧光部分的HCMV病毒允许对病毒感染进行检测(例如通过使宿主细胞与所述病毒接触后评估细胞中的荧光)。在一些实施方案中，HCMV感染的水平通过荧光检测确定，其中病毒已经与来自对象的测试样品(例如血清样品)预孵育。在一些实施方案中，所述对象已经被施用了候选HCMV疫苗。

Description

用于检测抗巨细胞病毒中和抗体的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年3月27日提交的美国临时申请序列No.61/616,204的权益，其内容通过引用整体并入本文。
背景技术
人巨细胞病毒(HCMV)(一种β疱疹病毒)是一种普遍存在的病原体。在具有免疫能力的人中，HCMV感染通常被忽视，其具有最温和的且非特异性的症状。相比之下，某些风险人群，例如在免疫抑制患者(例如AIDS患者或移植接受者)中，以及产前感染之后，HCMV感染具有严重的表现(Staras SA等，2006Clin Infect Dis 43(9)：1143-51；Hebart H等，2004Hum Immunol 65(5)：432-6；Rowshani AT等，2005Transplantation79(4)：381-6)。现有的治疗方法包括使用免疫球蛋白和抗病毒制剂(例如更昔洛韦及其衍生物)，其在高危人群中预防性使用时或在非常早期的感染过程中使用时是最有效的。然而，现有疗法的特征为显著的毒性和有限的疗效，尤其是对晚发性疾病(Boeckh M.，2004Pediatr Transplant 8(增刊5)：19-27；Limaye AP.，2004Transplantation 78(9)：1390-6)，而且这些疗法对先天性HCMV疾病尚无作用。开发有效的疫苗来防止HCMV疾病被认为是重要的公共卫生优先事项(Arvin AM等，2004Clin Infect Dis 39(2)：233-9)。
体外测定是评估候选疫苗干扰HCMV感染之能力的重要工具。例如，已经开发了中和测定来研究受感染个体中的免疫应答，以及在临床和临床前试验二者中评估疫苗免疫原候选物。在HCMV的情况下，抗原结合ELISA可测量对HCMV抗原的特异的抗体；然而，只有在其中测量进入细胞之病毒的中和反应的测定可建立并量化HCMV抗原特异性抗体的生物学活性(Abai等，2007J Immunol Methods 332(1-2)：82-93)。通常，在对HCMV的此种中和测定中，通过基于一种或更多种病毒蛋白在细胞中的表达定量受感染细胞的细胞核来在测定中确定中和抗体降低细胞HCMV感染的程度。此种分析可能耗时并难以用在高通量应用中。本领域仍需要筛选用于诱导中和抗体的潜在HCMV疫苗候选物的改进方法。
发明内容
除了其他方面以外，本公开内容提供了用于确定宿主细胞中HCMV感染水平的方法，并引申至确定样品中存在的中和抗体的水平。本公开内容涵盖这一认识：即，具有荧光部分的HCMV病毒允许对病毒感染进行检测(例如，通过使宿主细胞与病毒接触后评估细胞中的荧光)。在一些实施方案中，HCMV感染的水平通过荧光检测确定，其中所述病毒已经与来自对象的测试样品(例如血清样品)预孵育。在一些实施方案中，所述对象已经被施用了候选HCMV疫苗。
本公开内容的其他特点、目的和优势在以下的详细描述中将变得明显。然而，应当理解，尽管所述详细描述显示了本公开内容的一些实施方案，其仅通过举例说明的方式给出，而非限制。从该详细描述，本公开内容范围内的多种改变和修改对本领域技术人员将变得明显。
附图说明
附图仅用于举例说明目的，而非限制。
图1描述了用二价gB病毒样颗粒(VLP)(gB/pp65和gB/pp65+gH-G/pp65)免疫后的示例性ELISA抗gB抗体效价。单次免疫后，通过二价gB VLP在兔中诱导了强力且持久的免疫力。
图2描述了示例性的成纤维细胞中GFP表达的FACS分析，其指示了用gB/pp65CMV VLP在兔中诱导的中和抗体应答。在第0周和第8周免疫(IM)兔(n＝6只/组)两次并在2周后取血。合并血清并在指定的稀释度测试，与在相似稀释度的CytogamTM比较HFF成纤维细胞中抗表达GFP的CMV病毒(TB40)。在受感染(GFP+)细胞的流式细胞术分析期间收集100,000个细胞。
图3描述了示例性的成纤维细胞中GFP表达的FACS分析，其指示了用二价gB+gH CMV VLP在兔中诱导的中和抗体应答。在第0周和第8周免疫(IM)兔(n＝6只/组)两次并在2周后取血。合并血清并在指定的稀释度测试，与在相似稀释度的CytogamTM比较HFF成纤维细胞中抗表达GFP的CMV病毒(TB40)。在受感染(GFP+)细胞的流式细胞术分析期间收集100,000个细胞。
图4描述了HFF-1细胞中的示例性中和百分比。描述了在HFF-1细胞中，在10％豚鼠补体抗1∶6CMV-GFP-TB40-010512的存在下，15RA09组7(用铝佐剂的单价gB-G/单价gH-G)合并样品在P1Vd14、P1Vd28、P1Vd42、P1Vd55和P2Vd14下；以及15RA05组8(空MLV Gag)在P2Vd14下的中和。
图5描述了ARPE-19细胞中的示例性中和百分比。描述了在ARPE-19细胞中，在2.5％兔补体抗1∶3CMV-GFP-Towne-150612的存在下，15RA09组7(用铝佐剂的单价gB-G/单价gH-G)合并样品在P1Vd14、P1Vd28、P1Vd42、P1Vd55和P2Vd14下；以及15RA05组8(空MLV Gag)在P2Vd14下的中和。
定义
为了使本公开内容变得更易于理解，下文中首先对某些术语进行定义。以下术语和其他术语的另外定义列在整个说明书中。
氨基酸：本文所用的术语“氨基酸”以其最广泛的含义，指可被并入多肽链的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通式结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成的氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”指在天然存在之肽中普遍发现的20种标准l-氨基酸的任一种。“非标准氨基酸”指除了标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。本文所用的“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代。氨基酸(包括肽中羧基端和/或氨基端氨基酸)可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或用其他化学基团取代进行修饰，这可改变肽的循环半衰期且不负面影响其活性。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可以包含一种或更多种翻译后修饰，例如与一种或更多种化学实体(例如甲基基团、乙酸盐/酯基团、乙酰基团、磷酸盐/酯基团、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸盐/酯基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)结合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以指游离的氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用该术语的上下文中，该术语指游离氨基酸还是指肽的残基将会是明显的。
抗原：本文所使用的术语“抗原”是指含有一种或更多种被抗体识别的表位(线性表位、构象表位或两者)的物质。在某些实施方案中，抗原是病毒或病毒多肽或者包含病毒或病毒多肽。在一些实施方案中，术语“抗原”指亚单位抗原(即与完整病毒分开或由其分离的抗原，所述抗原与所述完整病毒本质上相关；例如与病毒样颗粒相关的抗原)。替选地或另外地，在一些实施方案中，术语“抗原”指杀死的、减毒或灭活的病毒。在某些实施方案中，抗原是“免疫原”。
大约或约：本文所用的应用至一个或更多个目的值的术语“大约”或“约”，指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，除非另外提到货另外从上下文是明显的，术语“大约”或“约”指落入所述参考值之任意方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小之内(除了这样的数字将超过可能值的100％的情况)的一系列值。
改善：本文所用的术语“改善(amelioration)”意味着预防、减少或减轻状态，或改进对象的状态。改善包括但不需要完全恢复或完全预防疾病、病症或病状(例如HCMV感染)。术语“预防”指延缓疾病、病症或病状的发作。当疾病、病症或病状的发作已经被延迟了预定的时间段时，可以视为完成了预防。
剂型：本文所用的术语“剂型”和“单位剂型”指用于待治疗之患者的治疗剂的物理离散单位。各个单位含有预定量的活性物质，其经计算以产生期望的治疗效果。然而，应当理解，组合物的总剂量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
给药方案：本文所用的术语“给药方案”(或“治疗方案”)是单独施用至对象的通常隔开一段时间的一组单位剂量(通常多于一个)。在一些实施方案中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，其可涉及一次或更多次给药。在一些实施方案中，给药方案包括多次给药，各次给药被相同长度的时间段相互隔开；在一些实施方案中，给药方案包括多次给药以及将各次给药分开的至少两种不同的时间段。
表达：本文使用的核酸序列的“表达”指一个或更多个以下事件：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)加工RNA转录本(例如通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’末端形成)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
荧光：本文所用的术语荧光指发光的部分。通常荧光部分包含电子，其可吸收一个波长的电磁能量并发射第二波长的电磁能量。在细胞中一些蛋白质或小分子是天然的荧光物(例如，NADH、色氨酸、内源性叶绿素、藻红蛋白或绿色荧光蛋白(GFP))。应理解，荧光蛋白的各种突变体已被工程化，并且可以根据本公开内容使用，例如EGFP、蓝色荧光蛋白(EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal)、青色荧光蛋白(ECFP、Cerulean、CyPet)，黄色荧光蛋白(YFP、Citrine、Venus、YPet)，氧化还原敏感性GFP(roGFP)，以及单体GFP等等。GFP和其他荧光蛋白可以单独或作为融合蛋白在细胞中外源性表达。这种方式允许荧光蛋白用作任意数量的生物学事件(例如亚细胞定位和表达模式)的报告分子。
替选地或另外地，特定的或一般的蛋白质、核酸、脂质或小分子可以用外来荧光团、荧光染料标记，其可以是小分子，蛋白质或量子点。示例性的荧光团包括但不限于，1，5IAEDANS；1，8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2，7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘酚荧光素(Carboxynapthofluorescein)；5-羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine)(5-TAMRA)；5-羟色胺(5-HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-I-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)；ABQ；酸性品红；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；锥虫黄(Acriflavin)；锥虫黄孚尔根SITSA(Acriflavin Feulgen SITSA)；水母发光蛋白(发光蛋白)；AFP(自荧光蛋白(AutoFluorescent Protein)，Quantum Biotechnologies)(参见sgGFP、sgBFP)；Alexa Fluor350.TM.；Alexa Fluor 430.TM.；Alexa Fluor 488.TM.；Alexa Fluor 532.TM.；AlexaFluor 546.TM.；Alexa Fluor 568.TM.；Alexa Fluor 594.TM.；Alexa Fluor633.TM.；Alexa Fluor 647.TM.；Alexa Fluor 660.TM.；Alexa Fluor 680.TM.；茜素络合剂；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC；AMCA-S；氨甲基香豆素(AMCA)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；苯胺蓝(AnilinBlue)；硬脂酸蒽(Anthrocyl)；APC-Cy7；APTRA-BTC；APTS；阿斯屈拉崇(Astrazon)亮红4G；阿斯屈拉崇橙R；阿斯屈拉崇红6B；阿斯屈拉崇黄7GLL；阿的平；ATTO-TAG.TM.CBQCA；ATTO-TAG.TM.FQ；金胺；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(双氨基苯二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸黄连素；β内酰胺酶；BFP蓝移GFP(Y66H)；蓝色荧光蛋白；BFP/GFP FRET；Bimane；Bisbenzemide；双苯酰亚胺(Hoechst)；双BTC；布兰科福尔(Blancophor)FFG；布兰科福尔SV；BOBO.TM.-1；BOBO.TM.-3；Bodipy492/515；Bodipy493/503；Bodipy500/510；Bodipy 505/515；Bodipy 530/550；Bodipy 542/563；Bodipy558/568；Bodipy 564/570；Bodipy 576/589；Bodipy 581/591；Bodipy630/650-X；Bodipy 650/665-X；Bodipy 665/676；Bodipy F1；Bodipy FL ATP；Bodipy F1-神经酰胺；Bodipy R6G SE；Bodipy TMR；Bodipy TMR-X缀合物；Bodipy TMR-X、SE；Bodipy TR；Bodipy TR ATP；Bodipy TR-X SE；BO-PRO.TM.-1；BO-PRO.TM.-3；Brilliant Sulphoflavin FF；BTC；BTC-5N；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；Calcium Crimson；Calcium Green；Calcium Green-1Ca.sup.2+染料；Calcium Green-2Ca.sup.2+；CalciumGreen-5N Ca.sup.2+；Calcium Green-C18Ca.sup.2+；Calcium Orange；Calcofluor White；羧基-X-罗丹明(5-ROX)；Cascade Blue.TM.；CascadeYellow；儿荼酚胺；CCF2(GeneBlazer)；CFDA；CFP(青色荧光蛋白)；CFP/YF P FRET；叶绿素；色霉素A(Chromomycin A)；色霉素A；CL-NERF；CMFDA；腔肠素(Coelenterazine)；腔肠素cp；腔肠素f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素hcp；腔肠素ip；腔肠素n；腔肠素O；香豆素鬼笔环肽；C-藻蓝蛋白(phycocyanine)；CPM I甲基香豆素；CTC；CTC甲臜；Cy2.TM.；Cy3.18；Cy3.5.TM.；Cy3.TM.；Cy5.18；Cy5.5.TM.；Cy5.TM.；Cy7.TM.；青色GFP(Cyan GFP)；环腺苷酸荧光传感器(cyclicAMP Fluorosensor，FiCRhR)；Dabcyl；丹酰；丹酰胺；丹酰尸胺；丹酰氯；丹酰DHPE；丹酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3’DCFDA；DCFH(二氯二氢荧光素二乙酸酯(Dichlorodihydrofluorescein Diacetate))；DDAO；DHR(二氢罗丹明(Dihydorhodamine)123)；二-4-ANEPPS；二-8-ANEPPS(非定比)；DiA(4-Di 16-ASP)；二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH)；DiD-亲脂示踪物；DiD(DilC18(5))；DIDS；二氢罗丹明(Dihydorhodamine)123(DHR)；Dil(DilC18(3))；I二硝基苯酚；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(Di1C18(7))；DM-NERF(高pH值)；DNP；多巴胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF97；伊红；藻红；藻红ITC；溴化乙锭；乙啡啶同型二聚物-1(EthD-1)；Euchrysin；EukoLight；氯化铕(111)；EYFP；速蓝；FDA；孚尔根(副品红)；FIF(甲醛(Formaldehyd)诱导的荧光)；FITC；FlazoOrange；Fluo-3；Fluo-4；荧光素(FITC)；荧光素二乙酸酯；荧光祖母绿；荧光金(Fluoro-Gold)(羟芪巴脒)；Fluor-Ruby；FluorX；FM 1-43.TM.；FM 4-46；Fura Red.TM.(高pH)；Fura红.TM./Fluo-3；Fura-2；Fura-2/BCECF；Genacryl亮红B；Genacryl亮黄10GF；Genacryl粉红3G；Genacryl黄5GF；GeneBlazer；(CCF2)；GFP(S65T)；GFP红移(rsGFP)；非UV激发的野生型GFP(wtGFP)；UV激发的野生型GFP(wtGFP)；GFPuv；Gloxalic Acid；粒状蓝(Granular blue)；血卟啉；Hoechst 33258；Hoechst 33342；Hoechst 34580；HPTS；羟基香豆素；羟芪巴脒(荧光金)；羟色胺；Indo-1(高钙)；Indo-1(低钙)；Indo二碳菁(DiD)；Indo三碳菁(DiR)；Intrawhite Cf；JC-1；JO JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；Laurodan；LDS 751(DNA)；LDS751(RNA)；Leucophor PAF；Leucophor SF；Leucophor WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；钙黄绿素/乙啡啶同型二聚物；LOLO-1；LO-PRO-1；荧光(Lucifer)黄；溶酶体蓝色探针(LysoTracker Blue)；溶酶体蓝白探针；溶酶体绿色探针；溶酶体红色探针；溶酶体黄色探针；LysoSensor蓝；LysoSensor绿；LysoSensor黄/蓝；Mag绿；苏丹红(Magdala Red)(根皮红B)；Mag-Fura红；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-靛蓝-1；镁绿；镁橙；Malachite绿；Marina蓝；I MaxilonBrilliant Flavin 10GFF；Maxilon Brilliant Flavin 8GFF；Merocyanin；甲氧基香豆素；绿线粒体绿色荧光探针(Mitotracker Greeu)FM；绿线粒体橙色荧光探针；绿线粒体红色荧光探针；普卡霉素；Monobromobimane；Monobromobimane(mBBr-GSH)；Monochlorobimane；MPS(甲基绿派洛宁二苯乙烯)；NBD；NBD Amine；尼罗红(Nile Red)；Nitrobenzoxedidole；去甲肾上腺素；核固红(Nuclear Fast Red)；i核黄；Nylosan Brilliant lavinE8G；Oregon绿.TM.；Oregon绿.TM.488；Oregon绿.TM.500；Oregon绿.TM.514太平洋蓝；副品红(Feulgen)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP Cy5.5；PE-TexasRed(红613)；根皮红B(苏丹红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；PhorwiteRPA；磷化氢3R；光致抗蚀剂；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26(Sigma)；PKH67；PMIA；Pontochrome蓝黑；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-1PRO-3；樱草灵；普施安黄(Procion Yellow)；Propidium lodid(P1)；PyMPO；芘；派洛宁；派洛宁B；Pyrozal Brilliant Flavin 7GF；QSY 7；芥奎吖因(QuinacrineMustard)；试卤灵；RH 414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B；罗丹明B 200；碱性玫瑰精(RhodamineB extra)；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明毒伞素(Phallicidine)；罗丹明：鬼笔环肽；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红(Rose Bengal)；R-phycocyanine；R-藻红蛋白(PE)；rsGFP；S65A；S65C；S65L；S65T；蓝宝石GFP；SBFI；血清素；Sevron亮红2B；Sevron亮红4G；Sevron I亮红B；Sevron；Sevron黄L；sgBFP.TM.(超级发光BFP)；sgGFP.TM.(超级发光GFP)；SITS(樱草灵；二苯乙烯异硫代磺酸)；SNAFL钙黄绿素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF钙黄绿素；SNARF1；钠绿(SodiumGreen)；SpectrumAqua；SpectrumGreen；SpectrumOrange；SpectrumRed；SPQ(6-甲氧基-N-(3磺丙基)喹啉铵)；二苯乙烯；磺基罗丹明B和C；超磺基罗丹明；SYTO 11；SYTO 12；SYTO 13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO16；SYTO 17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO 21；SYTO 22；SYTO 23；SYTO24；SYTO 25；SYTO 40；SYTO 41；SYTO 42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO 62；SYTO 63；SYTO 64；SYTO80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO 84；SYTO 85；SYTOX蓝；SYTOX绿；SYTOX橙；四环素；四甲基罗丹明(TRITC)；Texas红.TM.；Texas红-X.TM.缀合物；硫代二羰花青(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫黄素5；硫黄素S；硫黄素TON；Thiolyte；Thiozole橙；Tinopol CBS(Calcofiuor白)；TIER；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC四甲基罗丹明异硫代氰酸(TetramethylRodaminelsoThioCyanate)；True蓝；Tru红；Ultralite；荧光素钠B；Uvitex SFC；wt GFP；WW 781；X罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO3；YOYO-1；YOYO-3；Sybr绿；噻唑橙(内螯合染料(interchelating dye))；半导体纳米颗粒例如量子点；或封闭(caged)的荧光团(其可以用光或其他电磁能量源激活)；或者其组合。
融合蛋白：本文所用的术语“融合蛋白”一般指包含至少两个片段的多肽，每个所述片段都显示出与(1)天然存在的和/或(2)代表多肽的功能结构域的肽部分高度的氨基酸同一性。通常，含有至少两个这样的片段的多肽被认为是融合蛋白，如果所述两个片段是这样的部分：(1)不天然地包括在同一肽中，和/或(2)之前在单个多肽中尚未相互连接，和/或(3)已经通过人工作用相互连接。
基因：本文使用的术语“基因”具有如其在本领域中所理解的含义。本领域的普通技术人员应当理解，术语“基因”可以包括基因调控序列(例如启动子、增强子等)和/或内含子序列。还应当理解，基因的定义包括涉及不编码蛋白质而编码功能RNA分子(例如tRNA、RNAi-诱导剂等)的核酸。出于澄清的目的，我们注释本申请中使用的术语“基因”一般指编码蛋白质的核酸部分；如本领域的普通技术人员将从上下文中明白的，该术语可任选地涵盖调控序列。这一定义不旨在排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码性表达单位，而是为了澄清在大多数情况下，在本文本中使用的该术语指编码蛋白质的核酸。
基因产物或表达产物：本文所用的术语“基因产物”或“表达产物”一般指从基因(加工前和/或加工后)转录的RNA或者由从该基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。
高通量：本文所用的术语“高通量”宽泛地指利用大量测定的研究，其使得格式化每个单独样本、最小化制备步骤和复杂度，以及以平行或快速连续方式测量测定结果变得重要。高通量测试通常不包括手工的、一次一个的测定，例如单个独立的测定，其中一个测定的准备、执行、测量和数据收集全部在下一个试剂的测定完成前完成了。高通量通常包括例如，任何其中准备并测量一批样品(例如24、96、384或更多测试样品)的测定。在这样的测试样品中格式化所述测试意指例如在自动化的协助下使测量以平行或快速连续的方式进行来加速测定过程。
免疫原性：本文所用的术语“免疫原性”意味着能够在宿主动物中针对非宿主实体(例如HCMV抗原)产生免疫应答。在某些实施方案中，这种免疫应答形成了通过针对特定感染性生物体(例如HCMV)的疫苗引起之保护性免疫的基础。
免疫应答：本文所用的术语“免疫应答”指在动物中引发的应答。免疫应答可以指细胞免疫、体液免疫或者可以涉及二者。还可将免疫应答限制在免疫系统的一部分。例如，在某些实施方案中，免疫原性组合物可以诱导增加的IFNγ应答。在某些实施方案中，免疫原性组合物可以诱导粘膜IgA应答(例如，在鼻和/或直肠清洗液中测量的)。在某些实施方案中，免疫原性组合物可以诱导全身IgG应答(例如，在血清中测量的)。在某些实施方案中，免疫原性组合物可以诱导病毒中和抗体或中和抗体应答。
改进、增加或减少：本文所用的术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等同语，指示相对于基线测量的值，所述基线测量例如在本文所述的处理开始之前在相同的个体中的测量或在不存在本文所述之处理的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量。
个体、对象、患者：本文所用的术语“对象”、“个体”或“患者”指人或非人哺乳动物对象。待治疗的个体(也称为“患者”或“对象”)是患有疾病(例如HCMV感染)的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人)。在一些实施方案中，对象处于HCMV感染的风险中。在一些实施方案中，所述对象是免疫抑制的对象。例如，在一些实施方案中，免疫抑制的对象选自HIV感染的对象、AIDS患者、移植接受者、儿童对象以及妊娠对象。在一些实施方案中，所述对象已经暴露于HCMV感染。在一些实施方案中，所述对象是人。
分离的：本文所用的术语“分离的”指如下的物质和/或实体，其已经(1)与其被初始产生(无论在自然和/或在实验环境中)时所关联的组分的至少一些分离，和/或(2)通过人工产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与其初始所关联的其他组分的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％分离。在一些实施方案中，分离的物质为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或者大于约99％纯的。如本文所使用的，如果物质基本上没有其他组分，那么所述物质是“纯的”。如本文所使用的，分离的物质和/或实体之百分比纯度的计算不应当包括赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)。
接头：本文所用的术语“接头”指(例如在融合蛋白中)不在天然蛋白质的特定位置出现的适当长度的氨基酸序列，并且一般被设计为柔性和/或插入一结构(例如两个蛋白部分之间的α-螺旋)。一般而言，接头允许融合蛋白的两个或更多个结构域保留各自结构域之50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的生物活性。接头还可以指间隔子。
核酸：本文所用的术语“核酸”，以其最广泛的含义，指被并入或可并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是通过磷酸二酯键被并入或可并入寡核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”指单个核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。本文所用的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似的术语包括核酸类似物，即，具有非磷酸二酯骨架的类似物。例如，在本领域已知并且在骨架中具有肽键而非磷酸二酯键的所谓的“肽核酸”被视为在本公开内容的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括各自的简并版本(degenerate version)和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可以包含内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学地合成等。其中，例如在化学合成分子的情况下，合适的核酸可包括核苷类似物，例如具有经化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，核酸序列以5’至3’方向给出。本文所用的术语“核酸片段”是指较长核酸序列之一部分的核酸序列。在许多实施方案中，核酸片段包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮杂腺苷、7-脱氮杂鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如甲基化的碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸盐/酯基团(例如硫代磷酸盐/酯和5’-N-亚磷酰胺键)。在一些实施方案中，本公开内容具体地涉及“未经修饰的核酸”，意指核酸(例如多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)尚未被化学修饰以利于或实现递送。
可药用：本文所用的术语“可药用”指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相当的物质。
多肽：本文所用的“多肽”一般而言是至少两个氨基酸通过肽键彼此连接的串(string)。在一些实施方案中，多肽可以包含至少3至5个氨基酸，每一个氨基酸通过至少一个肽键与其他相连接。本领域的普通技术人员应当理解，任选地，多肽有时包括“非天然”氨基酸或者仍能够并入多肽链的其他实体。
基本同源性(Substantial homology)：本文所用的短语“基本同源性”指氨基酸或核酸序列之间的比较。本领域的普通技术人员应当理解，如果两个序列在对应的位置含有同源残基，那么它们一般被认为是“基本同源的”。同源残基可以为相同残基。或者，同源残基可以为结构和/或功能特征大致相似的非相同残基。例如，本领域的普通技术人员公知，某些氨基酸通常分类为“疏水的”或“亲水的”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。相同类型的一个氨基酸对另一个的替代经常可以认为是“同源”替代。
如本领域所公知的，可以使用多种算法的任意种进行氨基酸或核酸序列的比较，包括那些市售可得的计算机程序，例如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、缺口的BLAST和PSI-BLAST。示例性的这样的程序描述于Altschul，等，Basic local alignment search tool，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；Altschul，等，Methods in Enzymology；Altschul，等，“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein databasesearch programs”，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Baxevanis，等，Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins，Wiley，1998；以及Misener，等，(编辑)，Bioinformatics Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology，132卷)，Humana Press，1999。除了鉴别同源序列，上述程序通常提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果在一段相关的残基上其对应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是同源的，则两个序列被认为是基本同源的。在一些实施方案中，相关段是整个序列。在一些实施方案中，相关段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个残基。
基本同一性：本文所用的短语“基本同一性”指氨基酸或核酸序列之间的比较。本领域的普通技术人员应当理解，如果两个序列在对应位置含有相同的残基，那么它们一般被认为是“基本同一的”。本领域公知，可以使用多种算法中的任意种进行氨基酸或核酸序列的比较，包括那些市售可得的计算机程序，例如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、缺口的BLAST和PSI-BLAST。示例性的这样的程序描述于Altschul，等，Basic local alignment search tool，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；Altschul，等，Methods in Enzymology；Altschul，等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Baxevanis，等，Bioinformatics：A Practical Guide to theAnalysis of Genes and Proteins，Wiley，1998；以及Misener，等，(编辑)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，132卷)，Humana Press，1999。除了鉴别相同序列，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果一段相关残基上其对应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多为同一的，则两个序列被认为是基本同一的。在一些实施方案中，相关段是整个序列。在一些实施方案中，相关段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个残基。
患有：“患有”疾病、病症或病况(例如HCMV感染)的个体已经被诊断为具有和/或表现出该疾病、病症或病况的一种或更多种症状。
易感：“易感”疾病、病症或病况(例如HCMV感染)的个体处于发生所述疾病、病症或病况的风险中。在一些实施方案中，易感疾病、病症或病况的个体不表现出所述疾病、病症或病况的任何症状。在一些实施方案中，易感疾病、病症或病况的个体已经被诊断为具有所述疾病、病症和/或病况。在一些实施方案中，易感疾病、病症或病况的个体是已经暴露于与所述疾病、病症或病况的发生相关之条件的个体(例如个体已经暴露于HCMV)。
症状减轻：根据本公开内容，当特定疾病、病症或病况的一种或更多种症状的程度(例如强度、严重程度等)或频率降低时，则“症状减轻”。出于澄清的目的，特定症状之发作的延迟被认为是减少所述症状之频率的一种形式。不旨在将本公开内容仅限制为症状消除的情况。本公开内容特别地构想使得虽然未完全消除，但一种或更多种症状减轻(并且对象的病症由此“改进”)的治疗。
治疗有效量：本文所用的术语“治疗有效量”指以可应用于任何医疗治疗的合理的收益/风险比，足以对所治疗的对象产生治疗效果的量。治疗效果可为客观的(即，可通过某种测试或标志物测量)或主观的(即，对象给出效果的指示或感觉到效果)。特别地，“治疗有效量”指有效地治疗、改善或预防期望的疾病或病症或者表现出可检测的治疗或预防效果(例如通过改善与疾病相关的症状、预防或延迟疾病的发作、和/或还减轻疾病症状之严重程度或频率)的治疗性蛋白质或组合物的量。治疗有效量通常以可以包含多种单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的免疫原性组合物，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可以例如根据施用途径、与其他药剂的组合而变化。此外，针对任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可以取决于多种因素，包括：被治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体药剂的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径、和/或所采用的具体免疫原性组合物的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医药领域中公知的类似因素。
治疗：本文所用的术语“治疗”指对于特定疾病、病症和/或病况(例如HCMV感染)的一种或更多种症状或特点或者对该疾病的易感性予以部分或完全地减轻、改善、缓解、抑制、延迟其发作、减轻其严重程度、和/或减轻其发生率的免疫原性组合物的任何施用。这样的治疗可以对不表现出相关疾病、病症和/或病况之病征的对象进行，和/或仅表现出该疾病、病症和/或病况之早期病征的对象进行。替选地或另外地，这样的治疗可以对表现出相关疾病、病症和/或病况之一种或更多种已确定病征的对象进行。在某些实施方案中，术语“治疗”指对患者接种疫苗。
向性：本文所用的术语“向性”或“宿主向性”或“细胞向性”在病毒或其他病原体的语境中一般指病毒或病原体感染特定细胞类型的能力。向性可以指其中病毒或病原体已经进化成优先靶向特定宿主物种或这些物种内的特定细胞类型的方式。例如，HCMV通常可感染其宿主内的非常广阔的细胞范围，包括几乎任何器官的实质细胞、结缔组织细胞和各种造血细胞类型。上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞是病毒复制的主要靶标。然而，在不同的HCMV毒株之间对各种细胞的向性变化很大，例如来自UL128-131基因座内的改变。在一些实施方案中，HCMV毒株能够感染成纤维细胞，但不能感染上皮和/或内皮细胞。在一些实施方案中，HCMV毒株能够感染成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞。
接种疫苗：本文所用的术语“接种疫苗”指施用旨在对例如致病剂(例如，HCMV)产生免疫应答的组合物。出于本公开内容的目的，接种疫苗可以在暴露于致病剂之前、期间和/或之后施用，并且在某些实施方案中，在暴露于致病剂之前、期间和/或之后不久施用。在一些实施方案中，接种疫苗包括疫苗组合物以适当间隔时间多次施用。
载体：本文所用的“载体”指能够转运其与之缔合的另一个核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体能够染色体外复制和/或在宿主细胞(例如真核和/或原核细胞)中表达其与之相连接的核酸。能够引导有效连接的基因之表达的载体在本文中称作“表达载体”。
某些实施方案的详细描述
除了其他方面以外，本公开内容提供了用于确定宿主细胞中HCMV感染水平的方法，并引申至确定样品中存在的中和抗体的水平。本公开内容涵盖这一认识：即，具有荧光部分的HCMV病毒允许对病毒感染进行检测(例如，通过将宿主细胞与病毒接触后评估细胞中的荧光)。在一些实施方案中，通过荧光检测确定HCMV感染水平，其中所述病毒已经与来自对象的测试样品(例如血清样品)预孵育。在一些实施方案中，对象已经被施用了候选HCMV疫苗。
I.HCMV感染和疫苗
人巨细胞病毒(HCMV)(一种β疱疹病毒)是一种普遍存在的病原体。一般而言，疱疹病毒进入细胞是复杂的过程，其通过吸收和受体结合起始，接着通过病毒包膜与细胞膜融合。融合通常发生在质膜或内体膜处。HCMV在体内感染多种细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞(PlachterB等，1996Adv Virus Res 46：195-261)。它与成纤维细胞的质膜融合(Compton T等，1992Virology 191：387-395)，但是通过内吞作用进入视网膜色素上皮细胞和脐静脉内皮细胞(Bodaghi B等，1999J Immunol162：957-964；Ryckman BJ等，2006J Virol 80：710-722)。疱疹病毒选择其进入途径的机制仍然不清楚。通常假定进入途径主要由宿主细胞确定，但有证据表明由病毒体糖蛋白的向性作用确定(Wang X等，1998J Virol72：5552-5558)。HCMV编码两种gH/gL复合物，gH/gL/gO和gH/gL/UL128/UL130/UL131。含gO的复合物对于成纤维细胞感染是足够的，而含pUL128/UL130/UL131的复合物对于HCMV感染内皮细胞和上皮细胞是重要的。如本文所用的术语“向性”或“宿主向性”或“细胞向性”在病毒和其他病原体的语境中一般指病毒或病原体感染特定细胞类型的能力。向性可以指其中病毒或病原体已经进化成优先靶向特定宿主物种或这些物种内的特定细胞类型的方式。在一些实施方案中，HCMV毒株能够感染成纤维细胞，但不能感染上皮和/或内皮细胞。在一些实施方案中，HCMV毒株能够感染成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞。
HCMV感染50％至85％的40岁以下的成年人(Gershon AA等，1997在Viral Infections of Humans中，第四版，New York；PlenumPress：229-251)。出生后获得HCMV的大多数健康个体很少发生症状(如果有的话)。然而，HCMV疾病在免疫功能低下的个体(例如造血细胞移植(HCT)和实质器官移植(SOT)的接受者)中导致显著的发病率和死亡率(Pass RF 2001Cytomegalovirus.在Fields Virology.第四版中，Philadelphia；Lippincott Williams&Wilkens：2675-2705)。在SOT或HCT人群中，HCMV疾病可由于由供体器官或HCT传输的新感染而发生，或者可由于接受者中潜伏病毒的再激活而复发。在被HIV感染的个体中，尽管可获得抗逆转录病毒治疗，但HCMV感染仍加速AIDS和死亡的进程(Deayton JR等，2004Lancet 363：2116-2121)。另外在美国，HCMV是最常见的子宫内感染并且每年在大约8,000例婴儿中导致引起死亡或严重出生缺陷的先天性畸形，包括耳聋和智力迟钝(mental retardation)，(StagonS等，1986JAMA 256：1904-1908)。
控制HCMV的免疫应答未被完全理解。通过与其他人疱疹病毒的类比，可以推测细胞和体液免疫应答都发挥了重要作用(Kohl S 1992Currenttopics in Microbiology and Immunology 179：75-88)。对于鼠CMV，显示无论细胞毒性T细胞应答还是中和抗体的被动转运均足以防止致命攻击(challenge)(Rapp M等，1993Multidisciplinary Approach toUnderstanding Cytomegalovirus Disease：327-332；Reddehase MJ等，198JVirology 61：3102-3108)。
在免疫功能低下的人中，对HCMV的控制主要与细胞免疫应答相关；CD8+和CD4+T淋巴细胞二者似乎对防止CMV疾病均是重要的(GamadiaLE等，2003Blood 101：2686-2692；Cobbold M等，2005J Exp Med202：379-386)。对CMV的细胞免疫应答包括针对在病毒被膜(包膜与衣壳之间的病毒颗粒区域)中发现的多种抗原的CD4+辅助T淋巴细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答。最近对来自健康供体的CMV特异性CD4+和CD8+T细胞的研究使用了来自一系列CMV开放阅读框的重叠肽(overlapping peptide)来鉴定CMV感染后被识别的抗原(Sylwester AW等，2005J Exp Med 202：673-685)。CMV被膜磷蛋白65(pp65)和表面糖蛋白gB是最经常被CD4+T细胞识别的抗原，并且pp65也是最经常被CD8+T细胞识别的抗原之一。
与移植情况(transplant setting)相反，母体针对病毒的体液免疫应答对于在新生儿中预防HCMV疾病似乎是重要的。针对表面糖蛋白(特别是gB)的抗体似乎对于防止HCMV的母体-胎儿转移至关重要(Fowler KB等，2003JAMA 289：1008-1011)。此外，在更早的接种疫苗研究中，显示出对再感染的预防与中和抗体相关(Adler SP等，1995J Infectious Diseases171：26-32)。对HCMV的体液免疫应答以针对存在于病毒颗粒之外部包膜中的病毒包膜糖蛋白(例如gB和gH)的应答为主。
在HCMV的情况下，难以直接评估免疫学效应功能，因为病毒是严格物种特异性的并且没有可用的动物模型系统。然而，鼠CMV和豚鼠CMV已经被用于评价这些宿主物种中的疫苗策略。
诱导保护性T细胞和中和抗体应答二者的CMV疫苗具有预防感染或改善由先天性感染或移植导致的CMV疾病的潜力。
在人中测试的第一个活的减毒HCMV疫苗候选物是基于实验室改造的AD169毒株。用另一个实验室改造的临床分离株(isolate)Towne毒株进行的随后试验证实了活的减毒疫苗可引发中和抗体以及CD4+和CD8+T淋巴细胞应答。在肾移植接受者中的一系列研究中评估了Towne疫苗的效力。尽管Towne疫苗的确提供了对HCMV疾病的保护性作用，但它无法防止移植后的HCMV感染(Plotkin SA等，1984Lancet 1：528-530)。还在血清反应阴性之母亲的安慰剂对照研究中评价了Towne疫苗，这些母亲的孩子参加幼儿园(group daycare)，这种情况下无法防止这些妇女从其被HCMV感染的儿童获得感染(Adler SP等，1995J Infectious Diseases171：26-32)。对这些研究的解释为Towne疫苗被过度减毒(overattenuate)了。为了探究这种可能性，一系列的遗传重组体，(其中用CMV未减毒的“Toledo”毒株的区域替代Towne基因组的对应区域)，产生了Towne/Toledo“嵌合体”的构造，其含有一些而不是所有使得Towne疫苗减毒的突变(Heineman TC等2006J Infect Disease 193：1350-1360)。正在I期试验中测试4种Towne/Toledo“嵌合体”的安全性和耐受性。关于建立潜伏HCMV感染之潜在风险的长期安全性关注已经阻碍了活的、减毒疫苗的进一步开发。
主要的亚单位CMV疫苗候选物基于包膜糖蛋白gB(纯化的重组gB疫苗由Sanofi-Pasteur Vaccines制造)，因为这种蛋白质能够在自然感染期间引发高效价的病毒中和抗体应答。重组gB疫苗引发中和抗体应答并且具有优异的安全性质，然而它排除了中和抗体应答的其他糖蛋白靶标并更重要地排除了T淋巴细胞靶标。该疫苗需要MF59佐剂以优化免疫原性。在最近的试验中，这种疫苗在年轻妇女中的2期临床试验中对预防CMV感染提供了总共50％的效力(Pass RF等，2009N Engl J Med 360：1191-1199)。正作为亚单位疫苗候选物被评价的其他病毒蛋白质包括pp65和IE1，这二者都引发T细胞应答。
DNA疫苗在动物中引发强力的(robust)细胞和体液免疫应答并且很好地匹配疫苗设计中的特异性和精确度(precision)。已经开发了用于CMV的DNA疫苗，并且已经聚焦于gB、IE1和pp65蛋白作为候选的靶免疫原。使用编码pp65和gB之质粒DNA的二价CMV DNA疫苗候选物(WlochMK，2008J Infectious Diseases 297：1634-1642)，和还包含编码IE1基因产物之第三质粒的三价疫苗候选物(Jacobson MA，2009Vaccine27：1540-1548)，已经由Vical Vaccines开发(美国专利No.US 7,410,795)。无论施用途径如何，单独的三价DNA疫苗的免疫原性最小。然而，在施用活的减毒CMV(Towne)后，CMV DNA疫苗确实看起来安全地引发了所观察到的针对CMV抗原的记忆应答。
在载体疫苗的方法中，目的基因产物在非复制(通常为病毒)载体的环境中表达。这种的一个实例是由Virogenetics and Sanofi-Pasteur Vaccines开发的称作ALVAC的金丝雀痘载体(canarypox vector)，其是减毒的无法在哺乳动物细胞中复制的痘病毒。已经在临床试验中测试了表达CMV gB的ALVAC和表达pp65的ALVAC(美国专利No.6,267,965)。ALVAC-CMV(gB)不诱导中和抗体，但在用Towne毒株CMV进行后续感染后确实引发了更高的中和抗体效价(Adler SP等1999J Infectious Diseases180：843-846)，尽管在用gB亚单位/MF59疫苗进行后续免疫后，它似乎没有加强中和抗体效价(Bernstein DI等，2002J Infectious Diseases185：686-690)。表达pp65、ALVAC-CMV(pp64)的金丝雀痘载体在所有初始血清反应阴性的志愿者中诱导了持久的CTL应答，其频率与天然血清反应阳性的个体相当(Berencsi K等2001J Infectious Diseases 183：1171-1179)。用于作为载体疫苗来表达gB的另一种方法是使用Alpha VaxInc的甲病毒复制子系统(美国专利No.7,419,674)。这一方法涉及源自甲病毒的减毒株(委内瑞拉马脑炎(Venezuelan Equine Encephalitis，VEE)病毒)的繁殖缺陷的单周期(single-cycle)RNA复制子载体系统，以产生表达pp65、IE1或gB蛋白的病毒样复制子颗粒(VRP)(Berstein等，2010Vaccine 28：484-493)。使用了两组分甲病毒复制子疫苗以可溶形式的CMVgB(Towne毒株)来表达三种CMV蛋白，并且发现pp65/IE1融合蛋白(ReapEA等，2007Vaccine 25：7441-7449)是安全的并且诱导了高水平的中和抗体和多功能的CD4+和CD8+抗原特异性T细胞应答。高剂量组的几何平均滴度(GMT，Geometric Mean Titre)为在测定中所测试的12例自然感染的CMV血清反应阳性个体中之GMT的一半左右。
目前在临床前开发中用于针对HCMV接种疫苗的候选物为“密体”疫苗。密体(dense body，DB)是细胞培养物中在CMV的复制期间形成的包膜的、复制缺陷颗粒。它们含有包膜糖蛋白和大量的pp65蛋白。DB是非感染性的且是免疫原性的，但不能在疫苗接受者中发生潜在的HCMV感染。DB已经示出能够在小鼠中，在没有病毒基因表达的情况下诱导病毒中和抗体和T细胞应答(Pepperl S等，2000J Virol 74：6132-6146PCT公开No.WO 00/53729和美国专利No.6,713,070)。
被构想用于针对HCMV的疫苗接种的另外的候选物是病毒样颗粒(VLP)。逆转录病毒是包膜的RNA病毒，其属于逆转录病毒科(Retroviridae)。宿主细胞被逆转录病毒感染后，RNA经酶逆转录酶转录为DNA。然后DNA通过整合酶并入宿主细胞的基因组并且之后作为宿主细胞DNA的一部分复制。逆转录病毒科包括以下属：α逆转录病毒属(Alpharetrovirus)、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)、γ逆转录病毒属(Gammearetrovirus)、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)、ε逆转录病毒属(Epsilonretrovirus)、慢病毒属(Lentivirus)和泡沫病毒属(Spumavirus)。这种逆转录病毒科的宿主一般为脊椎动物。逆转录病毒产生感染性病毒体，其含有被来自宿主细胞膜的脂质双层包围的球形核衣壳(与病毒结构蛋白复合的病毒基因组)。
逆转录病毒载体可用于产生包膜的病毒体，其是感染性的并且或者是有复制能力的或者是复制缺陷的。有复制能力的感染性逆转录病毒载体含有用于病毒体合成的所有必需基因并且一旦发生宿主细胞的感染后持续繁殖自身。复制缺陷的感染性逆转录病毒载体在初始感染后不扩散。这通过用待转移的基因或核苷酸序列替换逆转录病毒的大多数编码区实现；使得载体不能够制造另外的复制循环所需的蛋白质。
替选地或另外地，逆转录病毒载体可用于产生病毒样颗粒(VLP)，其缺乏来自逆转录病毒的基因组并且既是非感染性又是非复制性的。由于VLP有益的性质，VLP可以用作抗原递送系统。此外，因为VLP是非感染性的，它们可作为免疫原性组合物(例如，疫苗)安全地施用。VLP通常结构类似于上述的包膜的病毒体，但缺乏来自逆转录病毒的基因组，使得病毒复制将不太可能发生。一些病毒(例如鼠白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV))的衣壳蛋白(例如Gag)的表达导致自组装成类似于相应天然病毒的颗粒，该颗粒没有病毒的遗传物质。
已经制备了各种各样的VLP。例如，已经制备了包含单种或多种衣壳蛋白(有或者没有包膜蛋白和/或表面糖蛋白)的VLP。在一些情况下，VLP是非包膜的并且通过仅表达一种主要衣壳蛋白装配，如所示的从嗜肝DNA病毒(例如EngerixTM，GSK和Recombivax HBTM，Merck)、乳头状瘤病毒(例如CervarixTM，GSK和GardasilTM，Merck)、细小病毒(paroviruse)或多瘤病毒制备的VLP。在一些实施方案中，VLP是包膜的并且可包含存在于相应的天然病毒中的多个抗原蛋白。VLP通常类似于其对应的天然病毒并且可为多价的颗粒结构。在一些实施方案中，抗原蛋白可以存在于VLP内作为VLP结构的组分和/或在VLP的表面上。在一些实施方案中，与其他形式的抗原呈递(例如不与VLP缔合的可溶性抗原)相比，在VLP的情形中的抗原呈递有利于诱导针对该抗原的中和抗体。中和抗体大多数经常识别三级或四级结构，这经常需要以其天然病毒构象呈递抗原蛋白(如包膜糖蛋白)。替选地或另外地，VLP可用于在诱导细胞免疫(例如T细胞应答)的情形下呈递抗原。在一些实施方案中，在VLP系统中使用抗原组合可产生改进的免疫应答。
II.可检测的HCMV
如上所述，除了其他方面以外，本公开内容提供了确定宿主细胞中HCMV感染水平的方法，并引申至确定样品中存在的中和抗体的水平。本公开内容涵盖这一认识：即，具有荧光部分的HCMV病毒允许对病毒感染进行检测(例如，通过使宿主细胞与病毒接触后评估细胞中的荧光)。在一些实施方案中，通过荧光检测确定HCMV感染水平，其中所述病毒已经与来自对象的测试样品(例如血清样品)预孵育。在一些实施方案中，对象已经被施用了候选HCMV疫苗。
提供的方法利用包含荧光部分的HCMV病毒。本文所述的能够感染宿主细胞的任何HCMV病毒可被改造以包含荧光部分。在一些实施方案中，为感染成纤维细胞，包含gH/gL/gO复合物之全部或部分的HCMV病毒可被改造以包含荧光部分。在一些实施方案中，为感染内皮细胞和/或上皮细胞，包含gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物之全部或部分的HCMV病毒可被改造以包含荧光部分。负责荧光检测的经修饰HCMV毒株在本领域是已知的并且可以根据本公开内容使用。例如，UL32-EGFP-HCMV-TB40是HCMV毒株TB40与携带与GFP融合之TB40UL32基因的质粒的体外重组体(ATCC；VR-1578)。UL32-EGFP-HCMV-TB40重组毒株产生了具有GFP融合到被膜磷蛋白pp150(tegument phosphoprotein pp150)(UL32基因的产物)之C端重组HCMV病毒(Sampaio等，2005Journal ofVirology 79(5)：2754)。由于GFP与病毒结构蛋白相关，在恰当的光照下病毒颗粒发绿色荧光。已经证明UL32-EGFP-HCMV-TB40毒株具有成纤维细胞的向性(Sampaio等，2005Journal of Virology 79(5)：2754)。负责荧光检测的另一种HCMV毒株是HB15-t178b，其含有CMV毒株AD 169基因组和GFP报告基因盒(Saccoccio等，2011Vaccine 29(15)：2705)。
应当理解，本文所用的术语荧光指发光的部分。通常荧光部分包含电子，其可吸收一个波长的电磁能量并发射第二波长的电磁能量。在细胞中一些蛋白质或小分子是天然发荧光的(例如，NADH、色氨酸、内源性叶绿素、藻红蛋白或绿色荧光蛋白(GFP))。将理解，荧光蛋白的各种突变体已被工程化，并且可以根据本公开内容使用，例如EGFP、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet)，黄色荧光蛋白(例如YFP、Citrine、Venus、YPet)，氧化还原敏感的GFP(例如roGFP)，以及单体GFP等等。GFP和其他荧光蛋白可以单独或作为融合蛋白在细胞中外源性地表达。这种方式允许荧光蛋白用作任意数量的生物学事件(例如亚细胞定位和表达模式)的报告分子。
替选地或另外地，特定的或一般的蛋白质、核酸、脂质或小分子可以用外来荧光团、荧光染料标记，其可以是小分子，蛋白质或量子点。示例性的荧光团包括但不限于，l，5IAEDANS；1，8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2，7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘酚荧光素(Carboxynapthofluorescein)；5-羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine)(5-TAMRA)；5-羟色胺(5-HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-I-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)；ABQ；酸性品红；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；锥虫黄(Acriflavin)；锥虫黄孚尔根SITSA(Acriflavin Feulgen SITSA)；水母发光蛋白(发光蛋白)；AFP(自荧光蛋白(AutoFluorescent Protein)，Quantum Biotechnologies)(参见sgGFP、sgBFP)；Alexa350；Alexa430；Alexa488；Alexa532；Alexa546；Alexa568；Alexa594；Alexa633；Alexa647；Alexa660；Alexa680；茜素络合剂；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC；AMCA-S；氨甲基香豆素(AMCA)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；苯胺蓝(Anilin Blue)；硬脂酸蒽(Anthrocyl)；APC-Cy7；APTRA-BTC；APTS；阿斯屈拉崇(Astrazon)亮红4G；阿斯屈拉崇橙R；阿斯屈拉崇红6B；阿斯屈拉崇黄7GLL；阿的平；ATTO-TAGTM CBQCA；ATTO-TAGTM FQ；金胺；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(双氨基苯二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸黄连素；β内酰胺酶；BFP蓝移GFP(Y66H)；蓝色荧光蛋白；BFP/GFP FRET；Bimane；Bisbenzemide；双苯酰亚胺(Hoechst)；双BTC；布兰科福尔(Blancophor)FFG；布兰科福尔SV；BOBOTM-1；BOBOTM-3；Bodipy492/515；Bodipy493/503；Bodipy500/510；Bodipy 505/515；Bodipy 530/550；Bodipy542/563；Bodipy 558/568；Bodipy 564/570；Bodipy 576/589；Bodipy 581/591；Bodipy 630/650-X；Bodipy 650/665-X；Bodipy 665/676；Bodipy F1；BodipyFL ATP；Bodipy F1-神经酰胺；Bodipy R6G SE；Bodipy TMR；BodipyTMR-X缀合物；Bodipy TMR-X、SE；Bodipy TR；Bodipy TR ATP；BodipyTR-X SE；BO-PROTM-1；BO-PROTM-3；Brilliant Sulphoflavin FF；BTC；BTC-5N；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；Calcium CrimsonTM；Calcium GreenTM；Calcium GreenTM-1Ca2+染料；Calcium GreenTM-2Ca2+；CalciumGreenTM-5N Ca2+；Calcium GreenTM-C18Ca2+；Calcium OrangeTM；Calcofluor White；羧基-X-罗丹明(5-ROX)；Cascade CascadeYellowTM；儿荼酚胺；CCF2(GeneBlazer)；CFDA；CFP(青色荧光蛋白)；CFP/YF P FRET；叶绿素；色霉素A(Chromomycin A)；色霉素A；CL-NERF；CMFDA；腔肠素(Coelenterazine)；腔肠素cp；腔肠素f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素hcp；腔肠素ip；腔肠素n；腔肠素O；香豆素鬼笔环肽；C-藻蓝蛋白(phycocyanine)；CPM I甲基香豆素；CTC；CTC甲臜；Cy2TM；Cy3.18；Cy3.5TM；Cy3TM；Cy5.18；Cy5.5TM；Cy5TM；Cy7TM；青色GFP(Cyan GFP)；环腺苷酸荧光传感器(cyclic AMPFluorosensor，FiCRhR)；Dabcyl；丹酰；丹酰胺；丹酰尸胺；丹酰氯；丹酰DHPE；丹酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3’DCFDA；DCFH(二氯二氢荧光素二乙酸酯(Dichlorodihydrofluorescein Diacetate))；DDAO；DHR(二氢罗丹明(Dihydorhodamine)123)；二-4-ANEPPS；二-8-ANEPPS(非定比)；DiA(4-Di 16-ASP)；二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH)；DiD-亲脂示踪物；DiD(DilC18(5))；DIDS；二氢罗丹明(Dihydorhodamine)123(DHR)；Dil(DilC18(3))；I二硝基苯酚；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(Di1C18(7))；DM-NERF(高pH值)；DNP；多巴胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF97；伊红；藻红；藻红ITC；溴化乙锭；乙啡啶同型二聚物-1(EthD-1)；Euchrysin；EukoLight；氯化铕(111)；EYFP；速蓝；FDA；孚尔根(副品红)；FIF(甲醛(Formaldehyd)诱导的荧光)；FITC；FlazoOrange；Fluo-3；Fluo-4；荧光素(FITC)；荧光素二乙酸酯；荧光祖母绿；荧光金(Fluoro-Gold)(羟芪巴脒)；Fluor-Ruby；FluorX；1-43；4-64；Fura RedTM(高pH)；Fura红TM/Fluo-3；Fura-2；Fura-2/BCECF；Genacryl亮红B；Genacryl亮黄10GF；Genacryl粉红3G；Genacryl黄5GF；GeneBlazer；(CCF2)；GFP(S65T)；GFP红移(rsGFP)；非UV激发的野生型GFP(wtGFP)；UV激发的野生型GFP(wtGFP)；GFPuV；Gloxalic Acid；粒状蓝(Granular blue)；血卟啉；Hoechst 33258；Hoechst33342；Hoechst 34580；HPTS；羟基香豆素；羟芪巴脒(荧光金)；羟色胺；Indo-1(高钙)；Indo-1(低钙)；Indo二碳菁(DiD)；Indo三碳菁(DiR)；Intrawhite Cf；JC-1；JO JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；Laurodan；LDS 751(DNA)；LDS751(RNA)；Leucophor PAF；Leucophor SF；Leucophor WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；钙黄绿素/乙啡啶同型二聚物；LOLO-1；LO-PRO-1；荧光(Lucifer)黄；溶酶体蓝色探针(Lyso Tracker Blue)；溶酶体蓝白探针；溶酶体绿色探针；溶酶体红色探针；溶酶体黄色探针；LysoSensor蓝；LysoSensor绿；LysoSensor黄/蓝；Mag绿；苏丹红(MagdalaRed)(根皮红B)；Mag-Fura红；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-靛蓝-1；镁绿；镁橙；Malachite绿；Marina蓝；I Maxilon Brilliant Flavin 10GFF；Maxilon Brilliant Flavin 8GFF；Merocyanin；甲氧基香豆素；绿线粒体绿色荧光探针(Mitotracker Green)FM；绿线粒体橙色荧光探针；绿线粒体红色荧光探针；普卡霉素；Monobromobimane；Monobromobimane(mBBr-GSH)；Monochlorobimane；MPS(甲基绿派洛宁二苯乙烯)；NBD；NBD Amine；尼罗红(Nile Red)；Nitrobenzoxedidole；去甲肾上腺素；核固红(Nuclear Fast Red)；i核黄；Nylosan Brilliantlavin E8G；Oregon绿Oregon绿488；Oregon绿500；Oregon绿514太平洋蓝；副品红(Feulgen)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP Cy5.5；PE-TexasRed(红613)；根皮红B(苏丹红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；PhorwiteRPA；磷化氢3R；光致抗蚀剂；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26(Sigma)；PKH67；PMIA；Pontochrome蓝黑；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-1PRO-3；樱草灵；普施安黄(Procion Yellow)；Propidiumlodid(P1)；PyMPO；芘；派洛宁；派洛宁B；Pyrozal Brilliant Flavin 7GF；QSY 7；芥奎吖因(Quinacrine Mustard)；试卤灵；RH 414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B；罗丹明B 200；碱性玫瑰精(Rhodamine B extra)；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明毒伞素(Phallicidine)；罗丹明：鬼笔环肽；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红(Rose Bengal)；R-phycocyanine；R-藻红蛋白(PE)；rsGFP；S65A；S65C；S65L；S65T；蓝宝石GFP；SBFI；血清素；Sevron亮红2B；Sevron亮红4G；Sevron I亮红B；Sevron；Sevron黄L；sgBFPTM(超级发光BFP)；sgGFPTM(超级发光GFP)；SITS(樱草灵；二苯乙烯异硫代磺酸)；SNAFL钙黄绿素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF钙黄绿素；SNARF1；钠绿(Sodium Green)；SpectrumAqua；SpectrumGreen；SpectrumOrange；SpectrumRed；SPQ(6-甲氧基-N-(3磺丙基)喹啉铵)；二苯乙烯；磺基罗丹明B和C；超磺基罗丹明；SYTO 11；SYTO 12；SYTO13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO 16；SYTO 17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO21；SYTO 22；SYTO 23；SYTO 24；SYTO 25；SYTO 40；SYTO 41；SYTO42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO 45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO62；SYTO 63；SYTO 64；SYTO 80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO84；SYTO 85；SYTOX蓝；SYTOX绿；SYTOX橙；四环素；四甲基罗丹明(TRITC)；Texas红；Texas红-X缀合物；硫代二羰花青(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫黄素5；硫黄素S；硫黄素TON；Thiolyte；Thiozole橙；Tinopol CBS(Calcofiuor白)；TIER；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC四甲基罗丹明异硫代氰酸(TetramethylRodaminelsoThioCyanate)；True蓝；Tru红；Ultralite；荧光素钠B；Uvitex SFC；wt GFP；WW 781；X罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO3；YOYO-1；YOYO-3；Sybr绿；噻唑橙(内螯合染料(interchelatingdye))；半导体纳米颗粒例如量子点；或封闭(caged)的荧光团(其可以用光或其他电磁能量源激活)；或者其组合。
III.感染测定
HCMV感染效价的测定通常包括在没有任何测试物质的存在下允许细胞感染的情况下使易感于HCMV感染的宿主细胞与连续稀释的病毒(例如包含荧光部分的HCMV)接触。可以(例如通过流式细胞术)对表达报告基因构建体(例如荧光部分，例如GFP)的靶细胞数目的确定来计算病毒制剂的感染效价。
为评估已经施用候选疫苗的对象之血清中中和抗体的存在和/或活性，可以将血清与HCMV(例如，包含荧光部分例如GFP的HCMV)预孵育足以使中和抗体减少HCMV之感染性的一段时间(例如至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时或更久)。然后可以使用血清与HCMV(例如包含荧光部分的HCMV)之连续稀释的预孵育混合物在允许感染的情况下接触易感于HCMV感染的宿主细胞。本领域的普通技术人员将能够确定用于感染测定的血清的恰当稀释度。例如，在一些实施方案中，所测试的稀释度是1∶6、1∶12、1∶24、1∶48、1∶96、1∶192或其组合。
应当意识到允许感染的条件可以根据多种因素变化，包括病毒毒株、宿主细胞类型、温度、细胞汇合度(cell confluence)、病毒浓度等等。本领域的普通技术人员能够适当地修改感染条件。在一些实施方案中，感染条件包括宿主细胞与病毒孵育至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时或更久。还应意识到对于细胞感染的监测可以包括视觉细胞形态评估(例如对于细胞肿胀和变圆)和/或视觉荧光评估(例如在设备如荧光显微镜上检测荧光)。感染后，可收集(例如，通过洗涤和胰蛋白酶消化和/或刮)宿主细胞并通过本领域可得和本文所述的荧光检测方法分析。
任何易感于HCMV感染的宿主细胞可用于本文所述的方法。示例性的宿主细胞包括但不限于人成纤维细胞例如人包皮成纤维细胞(HFF)，和人上皮细胞例如视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)。感染测定期间宿主细胞在其中生长的培养基可以根据细胞类型变化。例如，在一些实施方案中，HFF感染培养基包含MEM+5％FBS+1％PenStrep。在一些实施方案中，APRE感染培养基包含DMEM：F-12+1％FBS。
IV.荧光检测和中和抗体评估
可以使用任何恰当的方法检测荧光，包括例如流式细胞术分析、荧光激活的细胞分选或流式微荧光术(flow microfluorometry)。应当意识到，荧光检测的敏感度通常依赖于检测系统中荧光实体的拷贝数目，检测仪器的效率，以及荧光实体相对于样品中从内源生物荧光实体出现的和从与样品非特异性相关之荧光实体出现的背景荧光的荧光亮度。荧光实体的亮度继而取决于产生荧光信号的荧光实体的量子效率和荧光实体的光吸收能力(通过消光系数量化)。
将理解可使用报告分子例如绿色荧光蛋白(GFP)基于表面和/或胞内荧光的水平鉴定和/或分离细胞。一般而言，将观察到荧光强度和蛋白产物(例如病毒感染和产生)之间的相关性。例如，在一些实施方案中，宿主细胞中高水平的荧光强度和宿主细胞中病毒高水平的感染相关。
在一些实施方案中，评估细胞的总体荧光水平(例如，无论荧光的亚细胞定位)。在一些实施方案中，在细胞的特定亚细胞位置(例如细胞核)评估细胞的荧光水平。一般而言，流式细胞术允许定量确定大量细胞的表型，然而许多流式细胞术应用由于是定量的，不包括成像细胞的能力。在一些实施方案中，细胞荧光的检测和定量足以评估感染。将意识到在一些情况下，期望确定荧光在细胞内的定位。在一些实施方案中，细胞的流式细胞术分析可以与荧光的视觉评估结合。荧光水平和定位的双重分析可以使用多个设备(例如流式细胞术和荧光显微术)或单个设备进行。允许荧光分析和/或定量，联合定位分析的这样的设备在本领域可以获得。例如，ImageStreamx 量化荧光的强度和位置二者，并且允许成像超过每分钟50,000个细胞。
可通过本领域已知的任何恰当方法定量细胞荧光水平。细胞荧光水平可以与参考水平比较。在一些实施方案中，参考水平是预定的参考水平或历史参考水平。在一些实施方案中，通过与参考样品(例如阳性和/或阴性对照)平行比较获得参考水平。
使用流式细胞术和细胞分选的筛选和选择方法的出现显著增加了可被筛选的细胞数目。例如，在短时间内筛选数百万个细胞，并且可以从混合的细胞群体中分离亚群和单个细胞，甚至当它们在群体中存在的频率低至10-6时。将意识到，所提供的方法的优势之一是可以以高通量的方式实现样品评估。在一些实施方案中，所提供的方法与已知的感染和/或中和抗体检测方法(例如病毒蛋白的染色、荧光显微术、ELISPOT等)相比，通量增加了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。所提供的方法可以以多孔板方式进行，并且因此特别适合用于中到高通量筛选。在一些实施方案中，多孔板具有96个孔。在一些实施方案中，多孔板具有另一个数目的孔，其包括但不限于具有6、12、24、384、864或1536个孔的板。术语“多孔板”和“微滴定板”可互换使用。
在一些实施方案中，活细胞被分析。在一些实施方案中，分析之前细胞被固定。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于通过相关的荧光检测和/或宿主细胞的病毒感染来测量抗HCMV中和抗体的方法。例如，包含荧光部分(例如GFP)的HCMV可以与来自用HCMV候选疫苗免疫之对象的血清预孵育。血清中存在的中和抗体将使通常易感于HCMV感染的宿主细胞减少对HCMV(例如包含荧光部分的HCMV)的感染。包含HCMV(例如包含荧光部分的HCMV)和血清的预孵育混合物可随后用于与这样的宿主细胞接触，并且可以评估宿主细胞的荧光水平。基于宿主细胞中的荧光水平，可确定宿主细胞的感染水平。宿主细胞的感染水平一般与血清中中和抗体的存在和量负相关，反之，与候选疫苗引发治疗性应答(例如保护性免疫应答)的效力相关。例如，候选疫苗在对象中诱导中和抗体越有效，血清中存在的中和抗体越多，继而对应于在与血清预孵育后包含荧光部分的HCMV感染宿主细胞的能力的降低，进一步对应于将其与包含荧光部分的HCMV接触后，宿主细胞中的荧光检测的降低。在一些实施方案中，本公开内容的方法还包括基于本文所述的相关性选择和/或鉴定作为诱导中和抗体之疫苗的候选疫苗(例如HCMV候选疫苗)。
实施例
以下实施例描述了制造和实践本文所述的某些组合物的一些示例性模式。应当理解这些实施例仅用于举例说明目的并且不意味着限制本文所述的组合物和方法的范围。
实施例1：用病毒样颗料免疫兔
该实施例描述了用含有多种重组HCMV抗原的病毒样颗粒对兔的示例性的免疫。
使用磷酸钙方法用编码多种重组HCMV抗原的表达质粒瞬时转染HEK 293T细胞(ATCC，CRL-11268)。通过流式细胞术确认由HEK 293细胞对多种HCMV抗原的表达。转染后48至72小时，收获含有VLP的上清液并通过0.45μm孔径的膜过滤，然后在SW32Beckman转子中通过20％蔗糖垫层(sucrose cushion)超速离心来浓缩和纯化(25,000rpm，2小时，4℃)。在无菌无内毒素的PBS(GIBCO)中重悬沉淀以获得500倍浓缩的VLP原液。通过Bradford测定定量试剂盒(BioRad)确定等份试样的总蛋白。将经纯化的VLP储藏在-80℃直至使用。
如下表1所示，用VLP在t＝0周和t＝8周肌内免疫兔。在t＝4周、6周、8周、10周、13周和16周收集血清。
表1.
检品#(n＝6/组) 剂量 检品描述
1 100μg gB/pp65二价VLP
6 100μg/每种 gB/pp65二价VLP+gH-G/pp65二价VLP(1∶1比率)
进行酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定兔血清HCMV IgG含量。图1示出用gB/pp65二价VLP(上)和gB/pp65二价VLP+gH-G/pp65二价VLP(下)免疫的兔中强力且持久的免疫力。
实施例2：基于流式细胞术的中和活性
该实施例描述了评估来自于经免疫动物之血清的针对HCMV的中和抗体应答。该实施例的目的包括但不限于：1)确认来自其他动物研究中的CMV临床候选组分的免疫原性；2)评估剂量和与施用途径(例如IM相对于IP施用)的潜在的协同作用和/或拮抗作用；以及3)评估免疫增强和免疫持久性。
在t＝0周(P0V)和t＝2周(P2Vdl4)时间点从用来自实施例1的检品#6免疫的兔收集血清样品。将来自该组的样品合并、热灭活(HI)，然后如下所述测试中和抗体活性。
将血清样品稀释1/6至1/96。使用HFF细胞(P＝9，使用接种后24小时的)和新鲜收获的TB40-230212病毒。TB40-230212病毒是TB40-010212的后代。TB40-010212获得自ATCC(ATCC VR-1578；人疱疹病毒5；UL32-EGFP-HCMV-TB40)。在T150感染瓶中病毒感染持续15天(表2)。显微镜观察指示病毒是感染性的。感染培养基是TB40-HFF-1感染培养基(MEM+5％FBS+l％Pen/Strep)或VR1814-APRE-19感染培养基(DMEM：F-12+1％FBS)。
表2.
用CMV TB40-010212(5小瓶)+20ml感染性培养基(MEM-来自Sigma的极限必需培养基Eagle货号M4655+5％FBS+1％P/S)感染接种HFF的T150瓶。在CO2培养箱/37℃中15天后，瓶被完全感染。通过从瓶移除几乎全部上清收获病毒并在50mL Falcon管中保持无菌。剩余的上清，约5至7mL用于帮助用细胞刮刀(NUNC，Cat#179707)刮下细胞。刮下后，强力上下吹吸(多达10X)促进从细胞释放病毒。添加来自Falcon管的原始上清体积的一半(cca.8mL)以获得更强力的病毒。
来自液氮的5小瓶TB40-010212(祖先)在一个T150瓶中感染，在37℃、5％CO2孵育1小时。孵育后添加12毫升的感染培养基。病毒浓缩在15mL的上清中。
CytogamTM(CMV-IGIV-巨细胞病毒免疫球蛋白静脉内注射-人；CSLBehring；市售浓度2.5g/50ml或50mg/ml)用作阳性对照。制作1/20稀释度作为基础浓度(1比20稀释：100μl的CytogamTM 50mg/mL+1900μL的感染培养基)，并随后用于进行稀释，对兔血清使用相同的稀释度。CytogamTM在相同条件下热灭活作为兔血清(如下表3-5中所述)。
表3.感染测定
表4.P0V、P2Vdl4和CytogamTM的合并血清稀释
表5.HFF-1细胞生长和感染培养基
将各个特定浓度的血清或CytogamTM和1/2最终病毒稀释组合并在37℃旋转1小时。用温PBS小心地漂洗待用的具有95％至100％汇合的HFF细胞的六孔板两次，然后一式两份地施加病毒血清混合物100μL混合物/孔+200μL感染培养基以避免4小时期间干燥。在37℃/5％CO2孵育4小时(每60分钟震荡)。4小时孵育后，用移液管从每个孔小心地吸出内容物并添加3mL新鲜感染培养基。将板在培养箱中于37℃/5％CO2保持10天。通常在感染后的5天后进行细胞中病毒感染的每天检查。通过光学显微镜或用荧光显微镜检测绿色荧来观察细胞的肿胀和变圆。
对于样品收集，从每个孔吸出培养基。用PBS漂洗每个孔两次(HyCloneDPBS/改良的没有钙和镁；Cat#SH30028.02)并添加100μL的1X胰蛋白酶-EDTA(Sigma；Cat#T4174-100ml)和100μL的PBS。将样品保持在CO2培养箱2至3分钟直到细胞被胰蛋白酶消化彻底。每孔添加1mL的PBS+5％FBS以终止胰蛋白酶。将样品收集到透明的流式目的管(flowintended tube)中(相同样品每管两个孔)(BD Falcon，5ml聚苯乙烯圆底，REF 352054)。在光学显微镜下检查板以确认收集了所有的细胞(如果没有，添加另外的500μL PBS+5％FBS以用来收集剩余物)。在900rpm 10分钟将样品离心下来。丢弃上清并保存沉淀。将管涡旋使得沉淀分散在剩下的缓冲液中。以最小的光暴露进行剩下的步骤。添加200μL固定剂(BDBiosciences，BD Cytofix，固定缓冲液Cat#554655，100ml)并在冰上孵育15分钟。每管混合物添加1mL PBS+5％FBS以终止Cytofix。在900rpm 10分钟将样品离心下来。弃掉上清并保留沉淀。将沉淀在500μL PBS+5％FBS中重构并在放到流式细胞仪之前剧烈涡旋。
样品经历流式细胞仪并使用Cellquest软件分析。将FSC和SSC参数设定成“线性”，而所有其他参数设定成“对数”。在受感染细胞的流式细胞术分析期间收集100,000个细胞。使用HFF细胞和TB40CMV的流式的一般条件为FSC E-l和4.83；SSC 325；FL1427，但参数可以围绕现有条件略微改变以得到更恰当的点图。
图2描述了示例性的成纤维细胞中表达GFP的FACS分析，其指示了用gB/pp65CMV VLP在兔中诱导的中和抗体应答。在第0周和第8周免疫(IM)兔(n＝6只/组)两次并在2周后取血。合并血清并在指定的稀释度测试与在相似稀释度的CytogamTM比较HFF成纤维细胞中抗表达GFP的CMV病毒(TB40)。在受感染(GFP+)细胞的流式细胞术分析期间收集100,000个细胞。
图3描述了示例性的成纤维细胞中表达GFP的FACS分析，其指示了用二价gB+gH CMV VLP在兔中诱导的中和抗体应答。在第0周和第8周免疫(IM)兔(n＝6只/组)两次并在2周后取血。合并血清并在指定的稀释度测试与在相似稀释度的CytogamTM比较HFF成纤维细胞中抗表达GFP的CMV病毒(TB40)。在受感染(GFP+)细胞的流式细胞术分析期间收集100,000个细胞。
实施例3.通过流式细胞术检测中和抗体的示例性微中和测定
该实施例描述了通过流式细胞术在来自接种疫苗之动物的血清样品中检测功能性抗CMV中和抗体。
材料/设备
在该测定中使用以下材料和设备：人包皮成纤维(HFF-1)细胞-ATCC#SCRC-1041；人类产生的视网膜色素上皮细胞(Human Arising RetinalPigment Epithelia)-(ARPE-19)-ATCC#CRL-2302；人疱疹病毒5HCMV(UL32-EGFP-HCMV-TB40)-ATCC#VR-1578；人CMV-GFP-TowneTS15-rR(从M.McVoy博士获得，VCU-Virginia)；山羊对兔IgG的抗血清(GAR)-MP Cappel，Cat#：55620；来自兔的补体血清-Sigma-AldrichCat#S7764-5ml；标准豚鼠补体-Cedarlane Cat#CL-5000；无菌蒸馏水-Gibco公司，Cat#15230；Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)-HyClone；Cat#SH30243.01(生长培养基)；极限必需培养基Eagle(MEM)-Sigma；Cat#M4655-500ml(感染培养基)；胎牛血清(FBS)-HyClone；Cat#SH30396.03；青霉素链霉素溶液(Pen/Strep)-Sigma；Cat#P0781-100ml；1X胰蛋白酶-EDTA-Sigma；Cat#T4174-100ml；改良的磷酸盐缓冲盐溶液(DPBS-不含钙和镁)-HyClone；Cat#SH30028.02；固定缓冲液-BDBiosciences；BD Cytofix Cat#554655-100ml；Cytogam(CMV-IGIV-巨细胞病毒免疫球蛋白静脉内/人-CSL Behring，市售浓度2.5g/50ml；二甲基亚砜(DMSO)-Sigma-Aldrich Cat#D1435-500ml；生物安全柜；培养箱5％CO2、37℃；离心机；漩涡；流式细胞仪的样品采集管(BD Falcon，5ml聚苯乙烯圆底，REF 352054)；6孔板；多通道微量移液管储蓄池(Multichannel micropipette reservoirs)，5ml和10ml刻度移液管；具有一次性尖头的10μl至1000μl可调节的单通道微量移液管；细胞刮刀-NUNC；Cat#179707；50ml Falcon管-BD358206；转子-用于eppendorf管；荧光显微镜；FACSCAN机器。
获得并收获病毒
用1.5ml的UL32-EGFP-HCMV-TB40(“TB40”)感染HFF-1细胞(接种在T150瓶中的95％汇合的单层)。以相同的方式用HCMV-GFP-Towne-TS15-rR(“Towne”)感染ARPE-19细胞。由于这些病毒是光敏感的，细胞在无光(light off)下被感染。该瓶在CO2培养箱/37℃孵育30分钟以允许细胞和病毒之间的接触。
然后向细胞添加25ml的感染培养基。(参见表6和7)。将瓶保持在CO2培养箱/37℃中直到细胞被完全感染(在TB40的情况中，通过光学显微镜或利用荧光显微镜的绿色荧光观察细胞的肿胀和变圆；对于Towne，感染通过绿色荧光检测)。良好感染所需的时间取决于祖先病毒的感染能力。
收获从自瓶移出几乎全部的上清开始并在50ml Falcon管中使其保持无菌。约5ml残余的上清液方便用细胞刮刀刮下细胞。完全刮下并强力上下吹吸(多达10X)使得病毒从细胞释放。添加10ml体积的来自Falcon管的原始上清并在900rpm离心10分钟。移出沉淀并保留约15ml的浓缩病毒。添加病毒总量之5％的冷冻保护剂(DMSO)。制备1ml的等份试样、标记并短时间保持在-80℃或长时间保持在液氮中。
表6.用于CMV-GFP-TB40的HFF-1细胞生长和感染培养基
表7.用于CMV-GFP-Towne的ARPE-19细胞生长和感染培养基
实验设置及方法
在使用前，将取血前和免疫后的血清样品在56℃保持30分钟热灭活。充当阳性对照的市售血清Cytogam也热灭活。由1/6开始直至期望的稀释度来进行血清稀释，一式两份。在可比较的稀释度下测试Cytogam，预先稀释原液试剂1∶20以调整人/兔血清的Ig含量(参见表8)。
表8.血清和病毒稀释(作为一个实例示出1比2的病毒稀释)
将特定浓度的血清(Cytogam)和病毒组合并在37℃旋转1小时。在一些测定中，补体被包括。对于利用补体和HFF细胞的测定，向各个特定血清(Cytogam)/病毒混合物添加10％标准豚鼠补体。以相同方式处理病毒对照。对于利用补体和ARPE-19细胞的测定，向各个混合添加2.5％兔补体，不论使用的种类(兔或血清)。将血清和病毒在37℃旋转1小时。
在应用病毒-血清混合物之前，将95％汇合的细胞(接种在6孔板中)用温PBS小心地漂洗两次，一式两份。添加100μl的混合物/孔+200μl感染培养基以避免在4小时的孵育过程中干燥。将细胞在37℃/5％CO2孵育4小时(每60分钟晃动)。4小时孵育后，将每孔的内容物小心地用移液管吸出或倒出，并且添加3ml合适的新鲜温的感染培养基。将板在37℃/5％CO2孵育直到完全感染。孵育5天后，分析细胞的病毒感染。通过光学显微镜或者利用荧光显微镜的绿色荧光观察细胞的肿胀和变圆来确定HFF-1细胞的感染。ARPE-19细胞感染为用荧光显微镜检测到的绿色荧光。
用于流式细胞术的样品收集和制备
样品收集前，良好感染的存在在光学显微镜下确认，并且如果可能的话，通过使用荧光显微镜分析并入细胞的GFP来确认。从各个孔吸出或倒出培养基。用PBS(HyClone DPBS/改良的，无钙和镁；Cat#SH30028.02)漂洗细胞2次。向HFF-1细胞添加100μl的1X胰蛋白酶-EDTA(Sigma；Cat#T4174-100ml)和200μl的PBS。向ARPE-19细胞添加200μl的1XTrypsin-EDTA和100μl的PBS。将细胞保持在CO2培养箱2至3分钟直到细胞完全被胰蛋白酶消化。每孔添加1ml的PBS+5％FBS来终止胰蛋白酶。将细胞收集到透明的流式目的管中(针对相同样品每管两个孔)(BDFalcon，5ml聚苯乙烯圆底，REF 352054)。在光学显微镜下观察孔，如果细胞残留，添加另外的500μlPBS+5％FBS以收集另外的细胞。
将Falcon管在900rpm离心10分钟。舍弃上清并保留沉淀。涡旋管使沉淀分散到残余的缓冲液中。在黑暗中进行剩下的步骤。向每个管添加200μl Cytofix(BD Biosciences，BD Cytofix，固定缓冲液Cat#554655100ml)并且将样品在冰上孵育15分钟。向每个管添加1ml的混合物PBS+5％FBS以终止Cytofix。将管在900rpm离心10分钟。倾倒上清并保留沉淀。将沉淀在500μl的PBS+5％FBS中重构，剧烈震荡并进行流式细胞术。
实施例4：示例性VLP在兔中的中和活性
在1.5E06至2.0E06细胞/mL的细胞密度下用单价gB-G和单价gH-G的质粒转染CHO细胞(如PCT/US2012/64556中所述制备)。添加填充(stuffer)DNA使得总DNA浓度多达每mL细胞培养物1μg。用于转染的质粒首先通过MaxiPrep或GigaPrep质粒纯化试剂盒(Qiagen)纯化。以6∶1的(PEI∶DNA wt/wt)比率提供用于转染以将DNA递送至细胞的PEIMAX。转染后72小时，在1升的瓶子中，通过使用Beckman Coulter的转子JS-4.2A在4000rpm离心20分钟收获细胞培养物。将上清通过0.8/0.45μm过滤器(AcroPak 500Capsule，Pall)过滤。然后将过滤的上清经过切向流过滤(用于浓缩VLP的TFF)浓缩，并且针对含有组氨酸的缓冲液渗滤。将70μL的Benzonase(Novogen 99％纯度(D00127703)，每μL含250单位)悬浮在补充以MgCl2的400ml PBS中以具有2mM的终浓度。TFF渗余物部分与在PBS溶液中稀释的Benzonase混合并在旋转振荡器(头对尾旋转)中于室温下保持1小时，然后将管放置在4℃过夜。然后将经渗滤的核酸酶(benzonase)处理过的物质加载到阴离子交换层析柱(用于减少DNA和宿主蛋白的AEX)，其中收集流过物(flowthrough)。然后将流过物通过0.45μm无菌过滤并分成不同体积。
将如所述制备的单价gB-G和单价gH-G VLP组合物混合在一起，用铝佐剂，然后在6至8周龄雌性新西兰白兔(每个测试组最少5只动物)中使用实施例3中描述的微中和测定测试中和活性。兔用0.5ml(尾椎后大腿肌肉近端的两个位点250μl)的VLP组合物肌内免疫3次，一次在0天(引发)并且一次在第57天(第8周强化)，一次在162天(第24周强化)。兔用50μg的单价gB-G和单价gH-G二者(以1∶1比例混合在一起)的VLP组合物处理。为评估在兔中的体液免疫应答，在第一次免疫前以及随后第一次免疫后第28天、第42天和第55天以及第二次免疫后在第14天从研究中的所有兔收集血液。
在成纤维细胞中基于表达GFP的CMV病毒(TB40)使用微中和测定以及如前所述的受感染(GFP+)HFF-1细胞的流式细胞术分析来确定对HCMV的中和抗体应答。合并并测试如所述在免疫前和免疫后收集之兔血清在豚鼠补体的存在下相对于阳性对照CMV超球蛋白(hyperglobulin)、CytogamTM和由空Gag VLP(缺乏抗原性蛋白gB-G和/或gH-G)组成的阴性对照在HFF成纤维细胞中抗表达GFP的HCMV的中和活性。
图4示出在10％豚鼠补体和兔血清的存在下，用CMV-GFP-TB40-010512病毒孵育的HFF-1细胞的百分比中和(来自15RA09的组7合并的血清用作阳性数据代表，其中动物用单价gB-G和单价gH-G VLP处理三次，另外来自15RA05研究(空Gag)的组8被用作阴性对照代表)。如在图4中所示，单价gB-G和单价gH-G VLP组合物的组合在兔中引发了针对成纤维细胞感染的快速、协同的持续中和抗体应答，而空Gag VLP示出无中和抗体应答。(“GFP-TB40-010512”代表人疱疹病毒5HCMV(UL32-EGFP-HCMV-TB40)-ATCC#VR-1578(实施例3中描述)生长于2012年5月1日。)
还在上皮细胞中基于表达GFP的HCMV病毒(Towne TS15-rR)使用微中和测定以及如前所述的受感染(GFP+)ARPE-19细胞的流式细胞术分析来测试经汇聚兔血清对HCMV的中和抗体应答。合并并测试如所述在免疫前和免疫后收集之兔血清在2.5％兔补体的存在下相对于阳性对照CMV超球蛋白、CytogamTM和由空Gag VLP(缺乏抗原性蛋白gB-G和/或gH-G)组成的阴性对照的抗ARPE-19上皮细胞中表达GFP的HCMV的中和活性。
图5示出在2.5％兔补体和兔血清的存在下，用CMV-GFP-Towne-150612病毒孵育的ARPE-19细胞的百分比中和(来自15RA09的组7的合并血清用作阳性数据代表，其中动物用单价gB-G和单价gH-GVLP组合物处理三次，另外来自15RA05研究(空Gag)的组8被用作阴性对照代表)。如在图5中所示，单价gB-G和单价gH-G VLP组合物的组合在兔中引发了针对上皮细胞感染的快速、协同的持续中和抗体应答，而空Gag VLP示出无中和抗体应答。(“GFP-Towne-150612”代表人CMV-GFP-Towne TS15-rR(获自M.McVoy博士，VCU-Virginia，并描述于实施例3)生长于2012年6月15日。)
其他实施方案
考虑到本文公开的公开内容的说明书或实践，本公开内容的另一些实施方案对本领域的技术人员将是显而易见的。旨在认为说明书和实施例仅是示例性的，本公开内容的真实范围由以下权利要求书指出。本文参考的任意参考文献的内容通过参考以其整体并入本文。

Claims (30)

1.一种方法，其包含以下步骤：
(i)将来自已经用HCMV候选疫苗免疫之对象的血清与包含荧光部分的HCMV混合以形成混合物；
(ii)将易感于HCMV感染的宿主细胞在允许感染的条件下与(i)的混合物接触；
(iii)通过流式细胞术评估已经与所述混合物接触的所述宿主细胞的荧光水平；以及
(iv)基于评估的荧光水平确定所述宿主细胞的感染水平。
2.权利要求1所述的方法，其中经免疫的对象是人。
3.权利要求1所述的方法，其中所述血清包含抗HCMV中和抗体。
4.权利要求1所述的方法，其中所述HCMV候选疫苗包含VLP。
5.权利要求4所述的方法，其中所述VLP包含来自HCMV的gB、gH、gH-G和pp65的一种或更多种。
6.权利要求1所述的方法，其中所述荧光部分是荧光蛋白。
7.权利要求6所述的方法，其中所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白及其组合。
8.权利要求6所述的方法，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
9.权利要求1所述的方法，其中所述包含荧光部分的HCMV是TB40-GFP病毒株。
10.权利要求1所述的方法，其中所述包含荧光部分的HCMV是AD169-GFP病毒株。
11.权利要求1所述的方法，其中所述(i)的混合物在步骤(ii)之前孵育至少15分钟、至少30分钟、至少1小时或至少2小时。
12.权利要求1所述的方法，其中所述易感于HCMV感染的宿主细胞是成纤维细胞。
13.权利要求12所述的方法，其中所述成纤维细胞是人包皮成纤维(HFF)细胞。
14.权利要求1所述的方法，其中所述易感于HCMV感染的宿主细胞是上皮细胞。
15.权利要求14所述的方法，其中所述上皮细胞是视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)。
16.权利要求1所述的方法，其中所述评估步骤(iii)以高通量的方式进行。
17.权利要求1所述的方法，其中所述评估步骤(iii)包括将所述荧光水平与参考比较。
18.权利要求17所述的方法，其中所述参考是历史参考。
19.权利要求17所述的方法，其中所述参考是平行参考。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其还包括基于所述确定步骤确定血清中抗HCMV中和抗体效价。
21.权利要求20所述的方法，其还包括基于所述确定步骤评估所述候选HCMV疫苗的效力。
22.权利要求21所述的方法，其还包括如果已经与所述混合物接触之所述宿主细胞的荧光水平低于参考荧光水平，则选择所述候选HCMV疫苗作为诱导中和抗体的疫苗。
23.权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤(ii)包括孵育至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时或至少8小时。
24.权利要求1所述的方法，其中还通过视觉细胞形态评估(例如针对细胞肿胀和变圆)或视觉荧光评估(例如在设备如荧光显微镜上检测荧光)来监测所述宿主细胞的感染。
25.权利要求24所述的方法，其中所述视觉细胞形态评估包括监测细胞的肿胀和变圆。
26.权利要求24所述的方法，其中所述视觉荧光评估包括检测荧光。
27.权利要求26所述的方法，其中在荧光显微镜上检测所述荧光。
28.权利要求1所述的方法，其中评估所述宿主细胞之细胞核的荧光水平。
29.权利要求1所述的方法，其中评估整个宿主细胞的荧光水平。
30.权利要求1所述的方法，其还包括定量所述宿主细胞之荧光水平的步骤。
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