CN116867893A - 杂合α病毒-SARS-CoV-2粒子及其制备和使用方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
疫苗和抗病毒药物的及时开发对于控制新冠肺炎疫情至关重要。目前用于定量疫苗诱导的中和抗体的方法包括使用假病毒，如SARS‑CoV‑2刺突蛋白假型慢病毒。然而，这些假病毒含有与SARS‑CoV‑2不同的结构蛋白，需要数天才能感染和表达报告基因。因此，本申请公开了一种制备和使用新型杂合α病毒‑SARS‑CoV‑2(Ha‑CoV‑2)粒子的组合物和方法，所述粒子可用于中和抗体和病毒变异体的快速和准确定量。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求获得2020年10月20日提交的美国临时申请第63/094,029号、2020年11月27日提交的美国临时申请第63/118,787号和2021年5月3日提交的美国临时申请第63/183,189号的优先权；每项申请的全部内容在此作为参考并纳入。
背景技术
严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2，或新型冠状病毒)是一种快速传播的新型β-冠状病毒,其导致了2019年冠状病毒病(COVID-19)的全球大流行17-21。截至2021年4月，SARS-CoV-2已造成全球超过1.4亿人感染，300万人死亡。抗病毒药物和中和抗体可有效对抗疫情传播。尤其，由疫苗或病毒诱导的中和抗体在控制和预防感染方面可发挥关键作用。目前，仅有remdesivir一种药物获美国食品及药物管理局(FDA)批准，可用于减少住院时间1。近期，多种疫苗在三期临床试验中显示出显著效果2-6，并获批在紧急情况下使用，其中一种疫苗于2021年8月获得了FDA的完全批准。然而，疫苗的有效性仍需持续监测，以诱导出针对不断演变的病毒变异体的中和抗体。
当前，抗病毒药物筛选和中和抗体的定量依赖于SARS-CoV-2假病毒的使用7-14。使用活病毒需要满足生物安全等级(biosafety level，BSL)3级的设施和操作，从而限制了活病毒在普通实验室中的大规模测试和分析。慢病毒和以SARS-CoV-2蛋白为假型的水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)均用于基于细胞的中和试验和抗病毒药物筛选8-11。SARS-CoV-2含有四种结构蛋白：刺突蛋白(S蛋白)，膜蛋白(M蛋白)，包膜蛋白(E蛋白)，核衣壳蛋白(N蛋白)22,23。S蛋白是负责病毒附着和进入靶细胞的主要病毒蛋白24-26，因而通常用于病毒假型。然而，基于水泡口炎病毒和慢病毒的假病毒颗粒都只含有S蛋白，并且主要的病毒结构组分与SARS-CoV-2不同，从而可能影响受体结合中的病毒特性以及对抗体中和的反应15。此外，水泡口炎病毒假病毒的一个重要问题是残留的水泡口炎病毒可能导致假阳性结果高发27。而且，使用慢病毒-假病毒进行中和试验耗费时间，需要2-3天来感染并产生报告信号7-11。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种杂合粒子，包括：a)一种来源于α病毒的RNA基因组；以及b)至少一种SARS-CoV-2结构蛋白，其中所述结构蛋白为刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。
一个实施例中，所述杂合粒子为非复制型粒子。
另一个实施例中，来自α病毒的RNA基因组包括报告基因或目标基因。在进一步的实施例中，报告基因包括绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)基因或荧光素酶基因。
另一个实施例中，所述RNA基因组包括：a)5’非翻译区，b)编码非结构蛋白(nsp)1-4的开放阅读框，c)报告基因或目标基因，d)3’非翻译区，和e)聚(A)尾。在进一步的实施例中，所述RNA基因组包括SARS-CoV-2包装信号，其中SARS-CoV-2包装信号位于报道基因的下游。
另一个实施例中，所述杂合粒子为SARS-CoV-2病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)。
在另一个实施例中，所述杂合粒子靶向表达血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)的细胞。
在另一个实施例中，所述杂合粒子包括两种SARS-CoV-2结构蛋白，其中所述结构蛋白包括S蛋白和E蛋白。
在另一个实施例中，所述杂合粒子包括四种SARS-CoV-2结构蛋白，其中所述结构蛋白包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。在进一步的实施例中，所述杂合粒子在IC50值上与SARS-CoV-2具有直接相关性。
本发明的另一方面提供一种方法，包括(a)共转染编码至少一种SARS-CoV-2结构蛋白的第一载体和包含衍生于α病毒RNA基因组的第二载体，其中所述α病毒RNA基因组包括：(i)在5’末端的DNA启动子，(ii)第一非翻译区，(iii)编码来自α病毒的非结构蛋白的开放阅读框，(iv)报告基因，(v)SARS-CoV-2包装信号序列，(vi)病毒亚基因组RNA启动子，(vii)目标基因(viii)第二非翻译区和(ix)聚(A)尾；以及(b)生成杂合粒子，其中所述杂合粒子包括α病毒RNA基因组和至少一种SARS-CoV-2结构蛋白。
在一个实施例中，一种方法还包括用所述杂合粒子感染靶细胞，其中所述靶细胞表达ACE2。
在另一个实施例中，报告基因的表达能够产生有助于检测和定量感染的信号。在另一个实施例中，在杂合粒子感染后约2至72小时后读取信号。
本发明的另一方面提供一种用于检测受试者对一种或多种SARS-CoV-2变异体的抗体应答的方法，包括：a)将来自所述受试者的血清样品与所述杂合粒子一起孵育；b)将孵育的杂合粒子引入含有ACE2的细胞中；以及c)检测所述细胞中的报告基因表达，其中报告基因的表达表明受试者不具有阻断细胞病毒感染的中和抗体，而没有报告基因表达说明受试者具有阻断细胞病毒感染的抗体。
在一个实施例中，所述方法还包括向所述受试者施用不具有针对一种或多种SARS-CoV-2变异体的中和抗体的抗体、疫苗或治疗。
本发明的另一个实施例提供一种组合物，包括含有至少一种SARS-CoV-2结构蛋白的杂合粒子，其中所述结构蛋白为刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。在另一个实施例中，所述组合物为能够引发免疫应答的疫苗或颗粒。
本发明的另一个实施例提供一种组合物，包括由四种SARS-CoV-2结构蛋白组成的杂合粒子，其中所述结构蛋白包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。在另一个实施例中，所述组合物为能够引发免疫应答的疫苗或颗粒。
本发明的另一个实施例提供一种组合物，包括所述杂合粒子，其中所述组合物为能够引发免疫应答的疫苗或颗粒。
本发明的另一方面提供一种杂合载体，包括：(i)5’端的DNA启动子，(ii)5’端的第一非翻译区，(iii)编码来自α病毒的非结构蛋白的开放阅读框，(iv)SARS-CoV-2包装信号序列，(v)病毒亚基因组RNA启动子，(vi)目标基因，(vii)3’端的第二非翻译区，以及(viii)3’端的聚A尾。在一些实施例中，所述杂合载体还包括报告基因。在一些实施例中，所述非结构蛋白包括RNA聚合酶和相关因子。在一些实施例中，所述α病毒包括塞姆利基森林病毒。在一些实施例中，所述杂合载体经配置以在细胞中表达转基因。在一些实施例中，所述杂合载体经配置以促进抗病毒药物、抗体和/或抗病毒蛋白的筛选。
在一些实施例中，一种方法包括：(a)共转染编码SARS-CoV-2结构组分的第一载体和含有来自正义RNA病毒或α病毒复制子载体或杂合载体的复制子载体的第二载体；所述杂合载体包括：(i)5’端的DNA启动子，(ii)第一非翻译区，(iii)编码来自α病毒的非结构蛋白的开放阅读框，(iv)SARS-CoV-2包装信号序列，(v)病毒亚基因组RNA启动子，(vi)目标基因，(vii)第二非翻译区，以及(viii)聚A尾；该方法还包括生成一种杂合α病毒-SARS-CoV-2(hybrid alphavirus-SARS-CoV-2，HAVS)粒子，其中所述HAVS粒子包括α病毒RNA基因组和来自SARS-CoV-2的结构组分。在一些实施例中，所述结构组分包括选自刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、核衣壳蛋白(N蛋白)和包膜蛋白(E蛋白)中的至少一种。在一些实施例中，来自正义RNA的α病毒复制子载体和杂合载体以及复制子载体还包括报告基因。在一些实施例中，非结构蛋白包括RNA聚合酶和相关因子。在一些实施例中，所述HAVS粒子经配置以感染靶细胞，其中所述靶细胞表达ACE2。在一些实施例中，报告基因的表达经配置以产生有助于检测和定量感染的信号。
在一些实施例中，HAVS粒子感染2至72小时后读取信号。在一些实施例中，所述方法经配置以测试SARS-CoV-2进入抑制剂和/或SARS-CoV-2中和抗体和/或筛选抗病毒药物和/或筛选抗病毒蛋白。在一些实施例中，病毒进入抑制剂包括阿比多尔(Arbidol)。
本发明的一些实施例提供一种由杂合α病毒-SARS-CoV-2(HAVS)粒子组成的产品，该粒子包括α病毒RNA基因组和来自SARS-CoV-2的结构组分。在一些实施例中，HAVS粒子由共转染编码SARS-CoV-2结构组分的第一载体和包括来自正义RNA病毒的复制子载体或α病毒复制子载体的第二载体而形成，或杂合载体包括：(i)5’端的DNA启动子，(ii)5’端的第一非翻译区，(iii)编码来自α病毒的非结构蛋白的开放阅读框，(iv)SARS-CoV-2包装信号序列，(v)病毒亚基因组RNA启动子，(vi)目标基因，(vii)3’端的第二非翻译区，和(viii)3’端的聚A尾，其中所述HAVS粒子经配置以鉴定SARS-CoV-2进入抑制剂和/或SARS-CoV-2的中和抗体。在一些实施例中，所述杂合载体和来自所述正义RNA的α病毒复制子载体和复制子载体还包括报告基因。在一些实施例中，所述报告基因经配置以产生有助于检测和定量由所述HAVS粒子引起的感染的信号。
在一些实施例中，所述结构组分包括选自刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、核衣壳蛋白(N蛋白)和包膜蛋白(E蛋白)中的至少一种。
即时SARS-CoV-2病毒样颗粒包装复制子是病毒样颗粒和以纳米颗粒为基础的技术领域的实质性进展。这些混合病毒样颗粒在模拟SARS-CoV-2感染中非常有效，可用于开发新药和疫苗。这是冠状病毒感染途径建模的一大进步，也可便捷适用于其他属的病毒。这也是免疫治疗和疫苗开发方面的一个进步，所转运的复制子可以刺激先天免疫应答，并且目标基因可以产生靶抗原。
杂合α病毒复制子病毒样颗粒是新型药物发现和抗体中和试验的一个重要模型，该颗粒生产成本低，并可用于快速评估病毒进入抑制剂。病毒样颗粒可以直接出售给从事药物研发的实验室。
附图说明
图1：Ha-Cov-2粒子的设计和组装。(图A)Ha-CoV-2载体设计示意图。该载体含有一个劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，该启动子可转录待包装成Ha-Cov-2粒子的全长病毒RNA基因组。图中所示为5’非翻译区，随后是编码来自塞姆利基森林病毒(Semliki ForestVirus，SFV)的非结构蛋白(nsp)1-4的开放阅读框、用于荧光素酶(Luc)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达的病毒亚基因组启动子、3’非翻译区和由肝炎δ病毒核酶(RZ)自切割的聚(A)尾。SARS-CoV-2包装信号插入到3’非翻译区的前面。为了组装病毒粒子，人胚胎肾细胞(HEK293T)与Ha-CoV-2和表达SARS-CoV-2的4种结构蛋白(S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白蛋白)的载体进行共转染。在第48小时收获上清液中的Ha-Cov-2粒子，经纯化、裂解，然后使用SARS-CoV-2的S蛋白抗体通过蛋白质印迹法(western blot)进行分析(图B)。以Ha-CoV-2载体单独转染的细胞的上清液为对照。(图C和图D)使用FALG标记的M蛋白和N蛋白组装粒子，并使用针对FLAG的抗体通过蛋白质印迹法分析粒子。(图E)用与抗S蛋白抗体缀合的磁珠捕获上清液中的粒子，然后再次使用针对FLAG的抗体通过蛋白质印迹法分析粒子中FLAG标记的M蛋白。
图2：Ha-CoV-2对靶细胞的SARS-CoV-2的S蛋白和ACE2依赖性感染。
(图A)Ha-CoV-2(GFP)粒子感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞。感染后48小时观察到GFP表达。(图B)Ha-CoV-2(Luc)对靶细胞的ACE2依赖性感染。用Ha-CoV-2(Luc)粒子感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)和HEK293T细胞。感染后24小时定量荧光素酶表达。(图C)Ha-CoV-2(Luc)对靶细胞的SARS-CoV-2的S蛋白依赖性感染。在有S，或没有S或M+E+N的情况下组装粒子。在感染后4小时定量荧光素酶的表达。(图D)M蛋白、E蛋白和N蛋白对Ha-CoV(Luc)最佳传染性的要求。在存在S蛋白和有包括M蛋白、E蛋白和N蛋白的单个蛋白组成的组合的情况下组装粒子，并对荧光素酶的表达进行定量。图B至图D的检测以三组的方式进行。
图3：Ha-CoV-2(Luc)感染中报告基因表达的快速时间过程。Ha-CoV-2(Luc)粒子感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞后的6小时荧光素酶表达时程。用Ha-CoV-2(Luc)感染细胞2小时，洗涤，在新鲜培养基中培养，然后裂解并分析不同时间点的Luc表达。将病毒添加到细胞中定义为时刻“0”。感染试验以三组的方式进行。
图4：SARS-CoV-2S伪型慢病毒与Ha-Cov-2粒子的比较。(图A-图C)HEK293T(ACE2/TMPRSS2)和Calu-3细胞感染等体积的病毒粒子，即慢病毒-CoV-2(Luc)或Ha-CoV-2(Luc)。在感染后72小时，通过荧光素酶分析对相对感染进行定量，并用Ha-CoV-2感染原代猴肾细胞进行比较。(图D)慢病毒假病毒和Ha-CoV-2在一个感染时间过程中的比较。HEK293T(ACE2/TMPRSS2)感染等体积的病毒粒子，即慢病毒-CoV-2(Luc)或Ha-CoV-2(Luc)。在感染后2至24小时，通过荧光素酶分析法对Luc报告基因的相对表达量进行了定量分析。所有感染试验均以三组的方式进行。
图5：用于快速筛选和定量中和抗体的Ha-Cov-2粒子的验证。(图A)使用Ha-Cov-2粒子定量中和抗体。图中显示了抗血清1F对Ha-CoV-2(Luc)的浓度依赖性抑制作用和1F抑制曲线。将1F连续稀释，并与Ha-CoV-2(Luc)粒子在37℃孵育1小时。Ha-CoV-2(Luc)-抗体复合物用于感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞。病毒加入细胞后5小时，通过荧光素酶测定来定量中和活性。对照血清来自健康、未感染的供体。采用感染相对于血清浓度的相对百分比计算IC50。(图B)作为比较，使用SARS-CoV-2的S蛋白假型慢病毒Lenti-CoV-2(Luc)类似地定量抗血清1F。感染后72小时，用荧光素酶分析法对中和活性进行定量。(图C和图D)用Ha-CoV-2(Luc)和SARS-CoV-2定量的血清中和活性的相关性。使用传染性SARS-CoV-2和斑块检测或Ha-CoV-2(Luc)对19名捐赠者的康复期血浆进行量化，绘制中和活性图并计算IC50值，并绘制IC50的相关性图谱。(图E和图F)阿比朵尔抗SARS-CoV-2活性的快速定量分析。用阿比朵尔预处理HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞1小时，在存在阿比朵尔的情况下，用Ha-CoV-2(Luc)感染细胞，在第5小时通过荧光素酶分析对病毒进入抑制作用进行定量。对细胞进行了阿比朵尔的MTT细胞毒性试验(图F)。
图6：定量Ha-CoV-2变异体的相对传染性及其对中和抗体的应答。(图A和图B)组装带有G614突变S或亲代D614 S的Ha-CoV-2(Luc)粒子，并分析病毒体中S和N的掺入。(图C)用Ha-CoV-2(Luc)(G614)或Ha-CoV-2(D614)感染靶细胞，5h时进行Luc表达定量。使用同等水平的病毒粒子进行感染，且感染试验分三组进行。(图D)用一组来自SARS-CoV-2变异体的9个S蛋白突变异体组装Ha-CoV-2(Luc)粒子，之后用于感染靶细胞。使用单个Ha-CoV-2(Luc)变异体的基因组RNA拷贝数对相对传染性进行量化和标准化，其中WT指来源于原始SARS-CoV-2毒株的Ha-CoV-2。感染试验分三组进行。(图E和图F)针对Ha-CoV-2(Luc)及其变异体的抗血清定量。对一名受感染献血者在一剂疫苗接种前后的恢复期血浆进行了Ha-CoV-2(Luc)感染抑制定量分析。感染后12小时，通过荧光素酶分析定量中和活性。使用感染的相对百分比与血清浓度的关系来计算IC50(图E)。(图F)疫苗接种后的抗血清同样定量用于Ha-CoV-2(Luc)变异体的抑制。
图7：第一代和第二代复制子。(图A)具有多个目标基因的第一代SFV复制子。图中所示为来自塞姆利基森林病毒(SFV)的第一代单周期α病毒复制子。(图B)带有SARS-CoV-2包装信号的第二代复制子，以提高VLP性能。生成第二代SFV复制子将包括SARS-CoV-2包装信号以增强VLPs并减少空粒子的数量。
具体实施方式
疫苗和抗病毒药物的及时开发对控制新冠肺炎疫情至关重要1-6。目前量化疫苗诱导的中和抗体的方法包括使用假病毒，例如SARS-CoV-2刺突蛋白假型慢病毒7-14。然而，假病毒中含有与SARS-CoV-2不同的结构蛋白，并且需要数天来感染和表达报告基因15。
如下所述，本申请公开了一种用于制备和使用新型杂合α病毒-SARS-CoV-2粒子(Ha-CoV-2)以快速定量中和抗体和抗病毒药物的方法。Ha-CoV-2是一种非复制型SARS-CoV-2病毒样颗粒，包括一种或多种来自SARS-CoV-2的真实病毒结构蛋白(S蛋白、M蛋白、N蛋白和E蛋白)。Ha-CoV-2还包括源自基于α病毒的载体的基因组16,28，可在病毒进入后数小时内快速且稳健地表达报告基因28。此外，如下文详述，Ha-CoV-2可用作稳健平台来快速定量中和抗体、病毒变异体和抗病毒药物。
本发明人提供了一种新型杂合α病毒-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2)粒子，用于快速和准确地定量中和抗体和病毒变异体。Ha-CoV-2是一种非复制型SARS-CoV-2病毒样颗粒，包括一种或多种SARS-CoV-2结构蛋白(S蛋白、M蛋白、N蛋白和E蛋白)和来自于快速表达α病毒的载体的RNA基因组16。Ha-CoV-2可在3-6小时内快速、稳健地在靶细胞中表达报告基因，包括编码GFP或荧光素酶的基因。进一步的，Ha-CoV-2为中和抗体、病毒变异体和抗病毒药物的快速定量提供了平台。此外，作为概念证明，本发明人汇集并比较了一组10个Ha-CoV-2变异体分离毒株(D614G，P.1，B.1.1.207，B.1.351，B.1.1.7，B.1.429，B.1.258，B.1.494，B.1.2，B.1.1298)的相对传染性，并证明了这些变异体的传染性一般要高2-10倍。更进一步的，此外，通过对来自感染和接种个体的抗血清的定量，单剂量接种Moderna mRNA-1273后，抗血清滴度大大增加，增加量约为6倍，疫苗接种后的血清也表现出对所有9个测试变种的各种中和活性。
这些结果表明，Ha-CoV-2可作为稳健平台来快速量化针对SARS-CoV-2及其变异体的中和抗体。
除非另有说明，本发明的组合物和方法通常根据本领域熟知的常规方法进行，并在本说明书全文中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中进行描述。结合本说明书所述的实施例以及本文所述的其他相关领域使用的术语、过程和技术是本领域中众所周知和普遍使用的术语
本说明书所用的术语"SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒-2)"是指引起2019年冠状病毒疾病(新冠肺炎)的冠状病毒毒株，即造成2019冠状病毒病(COVID-19)大流行的呼吸系统疾病。SARS-CoV-2是一种在人类中具有传染性的正义单链RNA病毒。
本说明书所用的“α病毒”是指披膜病毒科包含30多种病毒的一个属，是由节肢动物(特别是蚊子)传播的脂质包膜正义RNA病毒，包括马雅罗病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒以及基孔肯雅脑炎和马脑炎的病原体。尽管本申请公开了α病毒复制子作为本发明即时杂合SARS-CoV-2载体的骨架，但来自其他三个门(黄病毒门、光滑裸露病毒门和小核糖病毒门)的单链正义RNA病毒的复制子也可以使用。
本文所用的“疫苗”是指来源于病毒或细菌的抗原悬液，施用后可产生主动免疫并提供针对这些病毒或细菌或相关病毒或细菌的保护。
本文所用的“病毒样颗粒(VLPs)”是指与病毒非常相似的分子，因其不含病毒遗传物质，所以不具传染性。它们可以是天然存在的，也可以通过病毒结构蛋白的个体表达来合成，然后可以自我组装成病毒样结构。来自不同病毒的结构衣壳蛋白的组合可用于产生重组病毒样颗粒。
本文所用“杂合粒子”是指杂合α病毒-SARS-CoV-2载体(Ha-CoV-2)，其具有与野生型病毒非常相似的至少一种结构蛋白(S蛋白、M蛋白、N蛋白和E蛋白)。如本申请全文所用，杂合粒子可与杂合α病毒-SARS-CoV-2载体(HAVS)或Ha-CoV-2互换使用，这三个术语是同义词，指相同的杂合粒子。在一个实施例中，本发明的Ha-CoV-2可以仅包括一种SARS-CoV-2结构蛋白(S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白)。在其他实施例中，本发明的Ha-CoV-2可以包括两种或多种SARS-CoV-2结构蛋白(S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白)。在其他实施例中，本发明的Ha-CoV-2可以包括三种或多种SARS-CoV-2结构蛋白(S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白)。杂合粒子还可包括来源于α病毒的报告基因(GFP或Luc)复制子，其可在数小时内快速表达报告基因。在一些实施例中，杂合粒子能够在感染的靶细胞中高水平表达转基因，从而提供用于追踪传染性、促进抗病毒药物和中和抗体的快速筛选平台以及提供新型组合物如疫苗的新平台。
“SARS-CoV-2结构蛋白”是指作为成熟组装的病毒粒子的组成部分的病毒蛋白，包括核衣壳核心蛋白(gag蛋白)、包装在病毒粒子内的酶(pol蛋白)和膜组分(env蛋白)。与此相关的是，SARS-CoV-2有四种类型的结构蛋白：刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。
本文所用的术语"慢病毒"是指在人类和其他哺乳动物中引起慢性和致命疾病的逆转录病毒属，其特点是潜伏期长。最著名的慢病毒为导致艾滋病的人类免疫缺陷病毒(HIV)。慢病毒也存在于猿、牛、山羊、马、猫和绵羊中。最近，人们在猴子、狐猴、马来飞行狐猴(既不是真正的狐猴也不是灵长类)、兔和雪貂中发现了慢病毒。慢病毒及其宿主分布全球。慢病毒能把大量的病毒cDNA整合到宿主细胞的DNA中，并高效地感染非分裂细胞，是基因传递最有效的方法之一。
本文所用的“ACE2受体”是指血管紧张素转换酶2，是一种通过切割较大的蛋白血管紧张素原而产生小蛋白的酶，所述较大的蛋白血管紧张素原随后继续调节细胞中的功能。ACE2存在于多种类型的细胞和组织中，包括肺、心脏、血管、肾脏、肝脏和胃肠道。ACE2存在于上皮细胞中，衬于某些组织并形成保护屏障。利用其表面的穗状蛋白，SARS-CoV-2与ACE2结合，就像在细胞进入和感染之前插入锁的钥匙一样。因此，ACE2起着细胞门道的作用，是导致新冠肺炎病的病毒的受体。
本文所用的“TMPRSS2”是指跨膜蛋白酶，丝氨酸2是一种在人体内由TMPRSS2基因编码的酶。TMPRSS2可激活某些冠状病毒，例如2003年非典型肺炎冠状病毒和SARS-CoV-2，因而受TMPRSS2抑制剂抑制。SARS-CoV-2使用SARS-CoV受体ACE2作为进入途径，使用丝氨酸蛋白酶TMPRSS2作为S蛋白启动途径。
A.杂合α病毒-SARS-CoV-2粒子
为了建立用于筛选和评价中和抗体和抗病毒药物的基于细胞的快速SARS-CoV-2感染系统，本发明人提供了一种新型杂合α病毒-SARS-CoV-2粒子，其中封闭了一个基于α病毒的RNA基因组，用于在靶细胞中快速表达报告基因(图1A)。
假病毒和病毒样颗粒(VLPs)已广泛用于SARS-CoV-2的药物研发和疫苗开发。慢病毒、水泡性口炎病毒等来源的假病毒可以模拟SARS-CoV-2的进入过程，但在结构上与SARS-CoV-2有很大不同，缺少SARS-CoV-2的M蛋白、E蛋白和N蛋白所提供的结构组分。病毒样颗粒与SARS-CoV-2粒子非常相似，但不含用于在靶细胞中表达报告基因的基因组35。
下面，本发明人描述了新型杂合系统Ha-Cov-2粒子的开发和验证，该粒子在结构上是病毒样颗粒，但具有假病毒进入靶细胞并在其中表达报告基因的能力。
Ha-CoV-2的基因组来源于α病毒，从而允许在病毒进入的数小时内快速和稳健地定量报告基因的表达。如下文所述，已证明Ha-CoV-2可用于中和抗体、病毒变异体和抗病毒药物的快速筛选和定量。
在一个实施例中，基因组RNA由编码来自塞姆利基森林病毒(SFV)的非结构蛋白(nsp)1-4(nsp1-4)的5’非翻译区和开放阅读框组成16,29；nsp1-4允许细胞中RNA基因组的自扩增。RNA基因组还包括用于表达报告基因(如荧光素酶)的病毒亚基因组RNA启动子。基因组的3’末端包括SFV的3’非翻译区和一条用于稳定RNA的聚(A)尾。此外，在报告基因的下游插入一个推定的SARS-CoV-2包装信号，以促进SARS-CoV-2结构蛋白N蛋白的RNA包装。
为了组装病毒粒子，使用DNA载体Ha-CoV-2表达基因组RNA。将Ha-CoV-2载体与表达SARS-CoV-2结构蛋白(S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白)的载体共转染入HEK293T细胞(图1A)。在共转染后48小时收获病毒粒子，并检测病毒粒子的传染性和在靶细胞中表达报告基因的能力。
首先，为了确认Ha-Cov-2粒子中是否存在SARS-CoV-2结构蛋白，使用针对SARS-CoV-2的S蛋白的抗体对纯化粒子进行了蛋白质印迹检测，结果显示在Ha-Cov-2粒子中检测到S的存在(图1B)。
进一步确定SARS-CoV-2其他结构蛋白的存在，使用FLAG标记的M和N蛋白组装Ha-Cov-2粒子，并使用抗FLAG抗体进行蛋白质印迹检测，结果显示在Ha-Cov-2粒子中检测到M蛋白和N蛋白的存在(图1C和1D)。
此外，为了确定这些结构蛋白是否存在于相同的病毒粒子中，使用了抗-S抗体结合磁珠来下拉Ha-Cov-2粒子。使用抗FLAG抗体进一步用蛋白质印迹探测磁性分离的粒子，以确定FLAG标记的M蛋白的存在。如图1E所示，在抗-S抗体下拉粒子中检测到M蛋白的存在，证实SARS-CoV-2结构蛋白与Ha-CoV-2载体的共转染导致了SARS-CoV-2病毒样颗粒的产生。
B.Ha-CoV-2(GFP)报告病毒
组装Ha-CoV-2(GFP)报告病毒，从而进一步证明Ha-Cov-2粒子感染靶细胞并在靶细胞中表达报告基因的能力，并用于感染过表达ACE2和TMPRSS2的HEK293T(ACE/TEMPRSS2)细胞。
在感染后的细胞中观察到GFP表达(图2A)，证明出芽的SARS-CoV-2病毒样颗粒可以包装基于α病毒的RNA基因组，且基于α病毒的RNA基因组能够在靶细胞中表达GFP报告基因。
组装Ha-CoV-2(Luc)报告病毒以确定Ha-CoV-2对靶细胞的感染是否依赖于S与ACE2受体的相互作用18,30，并将其用于同时感染HEK293T(ACE/TEMPRSS2)细胞和亲代HEK293T细胞。如图2B所示，Ha-CoV-2(Luc)在HEK293T(ACE/TEMPRSS2)细胞中高水平表达Luc，但在HEK293T中以最低水平表达了Luc，证明了ACE2对Ha-CoV-2感染的必要性。
为了进一步确认S-ACE2相互作用的要求，生成了不含S蛋白的粒子。如图2C所示，在没有S的情况下，Luc表达大量减少，说明Ha-CoV-2感染需要S。还检测了Ha-CoV-2感染对其他结构蛋白如M蛋白、N蛋白和E蛋白的要求。结果显示这些蛋白是非必需的，但去除M蛋白、N蛋白和E蛋白导致Ha-CoV-2感染减少(图2C)。在调查M蛋白、N蛋白和E蛋白对Ha-CoV-2感染的贡献时，一般来说，用这些结构蛋白中的两种或三种组装起来的粒子似乎比只含一种蛋白的粒子产生更高的感染水平。然而，S蛋白加E蛋白似乎足以使Ha-CoV-2具有完全感染性(图2D)。
对于Ha-CoV-2，使用基于α病毒的RNA基因组的一个主要优势是α病毒的极快速度和高水平基因表达；来自亚基因组RNA启动子的基因表达在感染后数小时内发生，病毒RNA的水平在单个细胞中的拷贝数可达20000016,28。在Ha-CoV-2(Luc)感染的时间过程之后，从向细胞中添加粒子起6小时内，Luc报告基因表达迅速增加(图3)。这种快速报告的表达动力学允许使用Ha-CoV-2来快速筛选和量化中和抗体和抗病毒药物。
C.Ha-CoV-2与慢病毒假病毒的比较
基于慢病毒的SARS-CoV-2假病毒通常用于抗病毒药物筛选和中和抗体测定10,14。针对ACE2过表达细胞和表达天然水平的ACE2细胞的感染，对Ha-CoV-2与慢病毒假病毒进行了比较。在相似的细胞培养条件下组装慢病毒假病毒和Ha-Cov-2粒子，并使用等体积的粒子进行感染。慢病毒和Ha-CoV-2均可感染ACE2过表达的HEK293T(ACE2/TMPRESS2)细胞(图4A)。然而，使用慢病毒-假病毒感染Calu-3(一种表达天然水平的ACE2的人肺癌细胞)的可能性极小31，而Ha-Cov-2粒子对Calu-3细胞的感染产生更高水平的信号(图4B)。用Ha-CoV-2感染原代人ACE2-空猴肾细胞未产生高于未感染细胞背景的信号(图4C)。这些结果表明，Ha-CoV-2对于感染低ACE2表达的细胞可能更加敏感。
此外，还跟踪了Ha-CoV-2的感染时间进程，并与慢病毒-假病毒的感染进程进行了比较。如图4D所示，在Ha-CoV-2感染中，Luc报告基因表达早在2至4小时就可检测到，而在慢病毒-假病毒感染中，Luc报告基因表达需在24小时后才可检测到。此外，Ha-CoV-2感染中的报告基因表达更为稳健，在24小时后，所达水平比慢病毒-假病毒感染产生的水平高大约150倍。
在抗体中和试验中还对Ha-CoV-2和慢病毒假病毒进行了直接比较。虽然两种系统都能有效定量中和抗体，但两种系统的灵敏度不同。慢病毒假病毒仅含有SARS-CoV-2的S蛋白，而在一些实施例中，Ha-CoV-2含有SARS-CoV-2的所有四种结构蛋白(S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白)，并且没有来自其他病毒的结构蛋白(例如慢病毒的gag和pol)。当然，可以理解的是，在其他实施例中，本发明的Ha-CoV-2可以仅包括一种SARS-CoV-2结构蛋白(S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白)。在其他实施例中，本发明的Ha-CoV-2可以包括两种或多种SARS-CoV-2结构蛋白(S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白)。在其他实施例中，本发明的Ha-CoV-2可以包括三种或多种SARS-CoV-2结构蛋白(S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白)。例如，在一个实施方案中，在不限制的情况下，即时Ha-CoV-2可以包括S蛋白。在另一个实施例中，即时Ha-CoV-2可以包括S蛋白和E蛋白。在其他实施例中，即时Ha-CoV-2可以包括S蛋白、E蛋白和M蛋白，或者可以包括S蛋白、E蛋白和N蛋白蛋白。在其他实施例中，即时Ha-CoV-2可以包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。
虽然S蛋白是病毒进入的主要条件，但SARS-CoV-2的其他结构蛋白的存在也可能影响病毒体的传染性以及粒子与细胞膜和抗体的相互作用。在本系统中，病毒粒子上缺少M蛋白和E蛋白似乎确实影响病毒感染(图2D)。
除病毒结构蛋白外，病毒粒在病毒粒出芽和释放过程中还整合了多种细胞蛋白，其中许多细胞因子如PSGL-1可以影响病毒的感染性15,36-38和抗体与质膜的结合39。SARS-CoV-2出芽主要发生在ER-Golgi中间隔室的膜上40，而慢病毒-假病毒从质膜萌发41。由于这种差异，不同组的细胞蛋白可能被整合到慢病毒和SARS-CoV-2中。鉴于此，Ha-Cov-2粒子与SARS-CoV-2的相似性可能为研究病毒体宿主蛋白在SARS-CoV-2感染和发病机制中的作用提供一个独特的工具15。
D.Ha-CoV-2用于快速筛选和定量中和抗体
检测抗SARS-CoV-2抗血清，从而验证Ha-CoV-2是否可用于中和抗体的快速筛选和定量。将抗SARS-CoV-2抗血清(1F)连续稀释并与Ha-CoV-2(Luc)预培养。抗体-病毒复合物感染细胞5小时以进行Luc表达。如图5A所示，观察到Ha-CoV-2(Luc)的1F浓度依赖性抑制，测定IC50为1：433稀释度(图5A)。鉴于SARS-CoV-2慢病毒-假病毒已广泛用于中和分析4,8,14，使用1F和慢-假病毒，慢-SARS-CoV-2(Luc)进行了类似的分析15。感染后72小时分析感染细胞，观察到慢病毒-假病毒的类似1F浓度依赖性抑制，发现IC50为1：186稀释度(图5B)。这些结果表明，Ha-CoV-2在定量中和抗体方面与慢病毒假病毒一样有效，但速度更快(5-12小时相对于48-72小时)。
基于上述1F结果，使用来自19名供体的恢复期血浆对基于Ha-CoV-2的中和试验进行了额外验证。图5C所示为每种血清的抑制曲线和IC50。使用传染性SARS-CoV-2进行独立定量作为对比以验证这些抗-血清。从Ha-CoV-2和SARS-CoV-2获得的IC50值中观察到了直接相关性(r2＝0.87)(图5D)。这些结果表明，Ha-CoV-2可用于中和抗体的快速定量。
假病毒也常用于高通量筛选SARS-CoV-2进入抑制剂7,10。正因如此，一种广谱病毒进入抑制剂，阿比朵尔(Umifenovir)32，由于其阻断Ha-CoV-2(Luc)感染的能力而受应用。如图5E所示，在5h内观察到Ha-CoV-2(Luc)呈剂量依赖性抑制，测定IC50为16M。这些结果表明Ha-CoV-2可用于SARS-CoV-2进入抑制剂的快速筛选。
E.Ha-CoV-2用于快速评估病毒变异体相对传染性
随着SARS-CoV-2继续流行和进化，病毒变异体对控制COVID-19大流行构成了严峻的挑战，最近在英国出现的B.1.1.7系就证明了这一点42。病毒突变可能导致病毒传播和适应性增加，因此迫切需要快速鉴定和表征新出现的变异体，以了解病毒传染性和对中和抗体应答的变化。即时Ha-CoV-2系统可提供一个稳健的平台，用于快速定量病毒变异体以及对中和抗体和疫苗有效性的潜在影响。
对即时Ha-CoV-2系统进行测试，以快速评估病毒变异体的相对传染性。D614G刺突蛋白突变出现在新冠肺炎疫情早期，最近有报道称其具有更强的传染性，导致D614G突变在全球流行中占主导地位。为确定Ha-CoV-2系统是否能概括和定量病毒感染性的增加，使用G614突变S蛋白(G614)或亲本S蛋白(D614)组装Ha-Cov-2粒子。结果发现，D614G突变并未增加病毒粒释放或S蛋白病毒粒掺入水平(图6A和6B)，而带有G614刺突的Ha-Cov-2粒子的传染性是带有D614刺突的粒子的近3倍(图6C)。
从正在流行的SARS-CoV-2变异株(选自GISAID全球参考数据库，表1)中分离出9株Ha-CoV-2(Luc)，包括巴西变异株(P.1)、南非变异株(B.1.351)、英国变异株(B.1.1.7)、加利福尼亚变异株(B.1.429)和其他几种新出现的变异株(B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258和B.1.1.298)。使用Ha-CoV-2(Luc)及相关S蛋白变异体感染靶细胞，并对相对传染性进行定量。
表1：SARS-CoV-2分离株S蛋白突变表
*SARS-CoV-2谱系鉴定和变异体命名来自于GISAID(https：//www.GISAID.org)；刺突蛋白的突变和每种分离物的序列登录号已列出。
如图6D所示，使用基因组RNA拷贝数标准化时，这些变异体通常比原始亲本Ha-CoV-2(Luc)的传染性高2-10倍。这些结果表明，Ha-CoV-2可作为一种方便工具快速监测和定量病毒变异体。作为概念证明，对抗血清中和病毒变异体的能力进行了量化。从感染的供体获得恢复期血浆，然后接种一剂Moderna-1273。这一单剂量疫苗接种大大增加了抗血清滴度，增加了约6倍(图6E)。此外，当检测Ha-CoV-2(Luc)变异体时，发现接种后血清对所有检测的变异体具有中和活性(图6F)。然而，不同变异体之间的中和活性有很大差异；抗血清对B.1.494的中和活性最高(IC50，1：6872)，对B.1.1.429变异体的活性最低(IC50，1：1106)。
上述结果表明，Ha-CoV-2可用于快速定量SARS-CoV-2变异体，以了解对中和抗体和疫苗效力的潜在影响。
F.Ha-CoV-2方法论
即时Ha-Cov-2粒子可用于多种应用，包括但不限于：(1)针对COVID进入的药物筛选；(2)针对α病毒复制酶进入的药物筛选；(3)用于测量抗体；以及(4)在有需求的受试者中刺激免疫应答。
例如，即时Ha-Cov-2粒子可用于测量受试者针对一组SARS-CoV-2变异体的抗体，从而作为确定和提供受试者个性化药物治疗的方法。例如，给定受试者可能具有针对某些SARS-CoV-2变异体的抗体，如巴西变异体(P.1)、南非变异体(B.1.351)和英国变异体(B.1.1.7)，但受试者可能不具有抗体，例如针对加利福尼亚变异体(B.1.429)和其他几种新出现的变异体(B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258和B.1.1.298)。
在另一个例子中，受试者可能希望在前往特定国家(如英国)之前检测抗体，在英国，英国变异体(B.1.1.7)是主要变异体。当然，位置和主要变量可能随时间变化，因此本领域普通技术人员需知道于相关时间内在特定位置或地理位置测试主要变量。由此，即时Ha-Cov-2粒子可以用于测量受试者针对给定地理区域中已知的SARS-CoV-2变异体的抗体，从而作为用于在旅行之前确定并为受试者提供个性化药物治疗的手段。有鉴于此，如果受试者没有针对特定变异体的中和抗体，则受试者可以在前往特定地点、国家或地理位置之前接受抗体、疫苗或治疗。
在另一个实施例中，即时Ha-Cov-2粒子可用于筛选抑制病毒进入的药物和其它小分子。例如，可以通过以下方式确定化合物是否阻断病毒进入：
a)获得选自病毒进入抑制剂、中和抗体或抗病毒蛋白或药物的化合物；
b)将化合物与即时杂合粒子进行孵育；
c)将孵育的杂合粒子引入包含ACE2的细胞中；
d)检测所述细胞中的报告基因表达，其中报告基因表达表示感染所述细胞。
**************
以下说明性实施例并不限制本公开。实际上，除本发明所揭示和描述之外，显而易见的，本领域技术人员基于前述可做各种修改，且本领域技术人员基于前述所作修改均落入本公开的保护范围内。
实施例1：病毒和病毒粒子组装
对SARS-CoV-2的研究需要高水平的控制以限制传染性病毒在普通临床和研究实验室中的使用。假病毒和病毒样颗粒(VLPs)已广泛应用于SARS-CoV-2药物发现和疫苗开发。慢病毒、水泡性口炎病毒等来源的假病毒可以模拟SARS-CoV-2的进入过程，但因缺少SARS-CoV-2的M蛋白、E蛋白和N蛋白提供的结构组分，在结构上与SARA-CoV-2有很大不同。病毒样颗粒与SARS-CoV-2粒子非常相似，但病毒样颗粒不含用于在靶细胞中表达报告基因的基因组35。
下面，本发明人描述了一种新型杂合系统，即Ha-Cov-2粒子的开发和验证，该粒子在结构上是病毒样颗粒，但具有假病毒进入靶细胞并在靶细胞中表达报告基因的能力。Ha-CoV-2的基因组来源于α病毒，如塞姆利基森林病毒(SFV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)或委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)，可在病毒进入后数小时内对报告基因表达进行快速、稳健的定量分析。如下文所述，已证明Ha-CoV-2可用于针对SARS-CoV-2和α病毒的中和抗体、病毒变异体和抗病毒药物的快速筛选和定量，以及刺激免疫应答。
SARS-CoV-2的S蛋白、S(D614G)蛋白、M蛋白、E蛋白或N蛋白表达载体购自北京义翘神州(Sinobiological)。Ha-CoV-2(Luc)和Ha-CoV-2(GFP)载体以及S蛋白变异体均选自GISAID全球数据库(表1)中鉴定的分离病毒株，并由Twist Bioscience合成。Ha-Cov-2粒子通过HEK293T细胞在10cm培养皿中与各2.5g的SARS-CoV-2结构蛋白表达载体(S蛋白、N蛋白、E蛋白、M蛋白)和10μg的Ha-CoV-2(Luc)或Ha-CoV-2(GFP)共转染而组装得到。共转染后48小时收获粒子，通过0.45微米过滤器过滤，然后经梯度离心浓缩。
如前述，使用SARS-CoV-2S表达载体(0.5μg)、pCMVΔR8.2(7.5μg)和pLTR-Tat-IRES-Luc(10μg)共转染HEK293T细胞来组装慢病毒15
实施例2：检测结构蛋白的Ha-CoV-2病毒体掺入
采用M-FLAG和N-FLAG载体，其披露见Zhang等《SARS-CoV-2蛋白亚细胞定位的系统和分子研究》信号转导与靶向治疗5，269，doi：10.1038/s41392-020-00372-8(2020)43。HEK293T细胞与10μg Ha-CoV-2(Luc)、2.5μgSARS-CoV-2的S表达载体以及2.5μg M-FLAG、N-FLAG和E-FLAG载体共转染。收集粒子，0.45微米过滤器过滤，然后经梯度离心纯化。使用刺突(Spike)蛋白S2单克隆抗体(1A9)(Invitrogen)(1：1000稀释)或DYKDDDDK标记单克隆抗体(FG4R)(Invitrogen)(1：1000稀释)通过SDS-PAGE和蛋白质印记分析病毒裂解产物。然后将膜与抗小鼠IgG、HRP连接抗体(细胞信号)(1：2000稀释度)在室温下孵育60分钟。使用West Pico或West Femto化学发光试剂(Thermo Fisher Scientific)检测化学发光信号。图像由CCD摄像机(FluorChem 9900成像系统)(Alpha Innotech)拍摄。使用磁珠捕获颗粒以进行分析。简言之，磁珠Pan小鼠IgG(Invitrogen)(2x107磁珠/50μL)与Spike蛋白S2单克隆抗体(1A9)(Invitrogen)(2μL抗体)在室温下偶联30分钟。缀合后，将病毒粒子与抗S2珠在4℃孵育30分钟，并用磁铁吸下。用冷PBS洗涤5次后，在LDS裂解缓冲液(Invitrogen)中裂解病毒粒。使用DYKDDDDK标记单克隆抗体(FG4R)(Invitrogen)(1：1000稀释度)通过SDS-PAGE和蛋白质印记分析裂解产物，以检测FLAG标记的SARS-CoV-2的M蛋白。
实施例3：病毒传染性测定
Ha-Cov-2粒子用于感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞(由Virongy LLC，Manassas，VA提供)、Calu-3细胞(ATCC)、HEK293T细胞(ATCC)和刘学锋博士提供的原代猴肾细胞。简言之，将细胞接种于12孔板(每孔2×105个细胞)中，在37℃下将细胞感染1-2小时，洗涤，在新鲜培养基中培养3-48小时，然后在荧光素酶分析裂解缓冲液(Promega)中裂解，使用GLOMaxDiscover微孔板读数仪(Promega)测定荧光素酶活性。使用慢病毒-假病毒粒子感染HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞和Calu-3细胞(ATCC)，细胞感染2小时，培养3天，然后在荧光素酶分析裂解缓冲液(Promega)中裂解，用GloMax Discover微孔板读数仪(Promega)进行荧光素酶分析。
实施例4：中和抗体测定
Ha-Cov-2粒子与来自COVID-19患者的连续稀释血清预孵育1小时，然后加入HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞中2小时。然后洗涤细胞，并在新鲜培养基中再培养3-24小时。在荧光素酶分析裂解缓冲液(Promega)中裂解细胞，使用GloMax Discover微孔板读数仪(Promega)进行荧光素酶分析。对于使用野生型SARS-CoV-2的中和试验，连续稀释抗血清(以1：10稀释度开始的12点(twelve-points)、2倍稀释系列)，并与100pfu的SARS-CoV-2在37℃下预孵育1小时。孵育后，进行病毒斑块试验以定量病毒滴度。简言之，将12孔板(每孔2×105个细胞)中的Vero细胞(ATCC)在37℃下用病毒感染1小时。感染后，向每孔中加入由0.6％琼脂糖和2×EMEM(无酚红)(Quality Biological)组成的1：1覆盖层，并辅以10％胎牛血清(FBS)(Gibco)。将平板在37℃孵育48小时。室温下用10％甲醛固定细胞1小时，然后去除琼脂糖覆盖层。用结晶紫(20％乙醇溶液中含1％结晶紫，w/v)对细胞进行染色。通过计数斑块数测定SARS-CoV-2滴度。
实施例5：抗病毒药物测定
将阿比朵尔盐酸盐(Sigma)重悬于二甲基亚砜(Sigma)中。HEK293T(ACE2/TMPRSS2)细胞用连续稀释的阿比朵尔预处理1小时。向细胞中加入Ha-Cov-2粒子，加入阿比朵尔以保持药物浓度。在阿比朵尔存在下感染细胞2小时，洗涤，在新鲜培养基中培养共5小时。在荧光素酶分析裂解缓冲液(Promega)中裂解细胞，使用GloMax Discover微孔板读数仪(Promega)进行荧光素酶分析。
实施例6：杂合粒子用于快速检测和定量中和抗体
通过离心从供体血液中采集患者血清样本。HAVS(Luc)粒子(又称Ha-CoV-2)与抗血清(1：60稀释度)在37℃孵育1h，之后用于感染HEK293T(ACE2+TMPRSS2)细胞5小时。用荧光素酶法测定中和活性。以未感染的健康献血者的血清用作对照。使用HAVS(Luc)粒子定量了抗血清1F的剂量依赖性抑制作用。通过血清连续稀释(1：2连续稀释)并与HAVS(Luc)粒子在37℃下孵育1小时产生抑制治愈。使用HAVS(Luc)-抗体复合物感染HEK293T(ACE2+TMPRSS2)细胞5小时，用荧光素酶法测定中和活性。使用感染的相对百分比和血清浓度的相对对数计算IC50。作为对比，使用SARS-CoV-2的S假型慢病毒(LTR-Tat-Luc)定量了抗血清1F的剂量依赖性抑制。通过连续稀释(1：2连续稀释)血清并在37℃下与LTR-Tat-Luc假病毒孵育1小时产生抑制治愈。使用假病毒-抗体复合物感染HEK293T(ACE2+TMPRSS2)细胞72小时。用荧光素酶法测定中和活性。使用感染的相对百分比和血清浓度的相对对数计算IC50(如图5A-D所示)。
实施例7：第一代和第二代SFV复制子
如图7所示，第一代单循环α病毒复制子来自塞姆利基森林病毒(SFV)，由编码真核启动子的质粒产生，其中真核启动子产生具有5’非翻译区的病毒RNA、非结构蛋白(nsp)1-4和由病毒亚基因组启动子驱动的转基因。为确保病毒复制酶的RNA高效复制，聚A尾直接由质粒编码，并由δ型肝炎病毒核酶切割。向复制子中添加第二个亚基因组启动子，以产生多个转基因。SFV复制子和SARS-CoV-2结构成分进行共转染从而产生杂合病毒样颗粒。SFV复制子产生大量的复制子RNA，可以劫持萌芽的SARS-CoV-2病毒样颗粒。
产生第二代SFV复制子，这将包括SARS-CoV-2包装信号以增强VLP并减少空粒子的数量，从而大大增强感染信号，并进一步缩短感染检测所需的培养时间。
为了确保全基因组复制子的包装，在密码子优化的NSP4蛋白(部分共NSP4)之后插入SARS-CoV-2包装信号。密码子优化破坏了原始的亚基因组启动子，启动子在包装信号的下游被取代。SARS-CoV-2的包装信号也可以插入Ha-CoV-2基因组的5’端、内部或3’端。
实施例8：大规模生产
为满足当前疫情的需求，将该技术转向大规模生产。以往研究表明，由于病毒结构蛋白过度产生的细胞毒性效应，通常很难产生病毒样颗粒的稳定细胞系。为了克服这一问题，可以产生一种细胞系，当存在功能性复制子时，该细胞系将仅产生病毒样颗粒的结构组分。已有研究证明，可通过使用依赖于α病毒复制子的基因组从稳定的细胞系有效地产生病毒样颗粒。当存在单独的功能性复制子时，这些缺陷复制子不进行包装，仅从亚基因组启动子产生基因。
如图2所示，本申请的细胞系允许大量生产这些杂合病毒样颗粒，以用于商业和临床应用中的更大用途。
为了证明杂合病毒样颗粒的功能，感染允许的细胞系HEK293T-ACE2，使用荧光显微镜监测绿色荧光蛋白的产生。杂合病毒样颗粒能够在靶细胞中产生目标基因。下方为显微镜图像，如图所示，带有复制子的杂合病毒样颗粒感染了HEK293T-ACE2细胞。在允许的HEK293T-ACE2+TMPRSS2细胞系上进行了杂合病毒样颗粒的第二次感染。复制子编码荧光素酶基因，感染后三天测量荧光素酶活性。杂合病毒样颗粒是模拟SARS-CoV-2进入的改良方法，也是抗病毒和疫苗发现的新平台。
为了验证杂合病毒样颗粒的功能，允许的细胞系HEK293T-ACE2被感染，使用荧光显微镜监测绿色荧光蛋白的产生。杂合病毒样颗粒能够在靶细胞中产生目标基因。图2为具有复制子的杂合病毒样颗粒感染HEK293T-ACE2细胞的显微镜图像。
在允许的HEK293T-ACE2+TMPRSS2细胞系上进行了杂合病毒样颗粒的第二次感染。复制子编码荧光素酶基因，并在感染后三天测量荧光素酶活性，如图2B-C所示。杂合病毒样颗粒是模拟SARS-CoV-2进入的改良方法，也是研发抗病毒和疫苗的新平台。
Claims (20)
1.一种杂合粒子，包括：
a)来源于α病毒的RNA基因组；
b)至少一种SARS-CoV-2结构蛋白，其中所述结构蛋白包括刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。
2.根据权利要求1所述的杂合粒子，其中所述粒子为非复制型粒子。
3.根据权利要求1所述的杂合粒子，其中来源于α病毒的RNA基因组包括报告基因或目标基因。
4.根据权利要求1所述的杂合粒子，其中所述RNA基因组包括：
a)5’非翻译区；
b)编码非结构蛋白(nsp)1-4的开放阅读框；
c)报告基因或目标基因；
d)3’非翻译区；
e)聚(A)尾。
5.根据权利要求4所述的杂合粒子，进一步包括SARS-CoV-2包装信号，其中所述SARS-CoV-2包装信号位于所述报告基因的下游。
6.根据权利要求1所述的杂合粒子，其中所述杂合粒子是SARS-CoV-2病毒样颗粒(VLPs)。
7.根据权利要求3所述的杂合粒子，其中所述报告基因包括GFP基因或荧光素酶基因。
8.根据权利要求1所述的杂合粒子，其中所述杂合粒子靶向表达ACE2的细胞。
9.根据权利要求1所述的杂合粒子，包括两种SARS-CoV-2结构蛋白，其中所述结构蛋白包括S蛋白和E蛋白。
10.根据权利要求1所述的杂合粒子，包括四种SARS-CoV-2结构蛋白，其中所述结构蛋白包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。
11.根据权利要求10所述的杂合粒子，其中所述杂合粒子的IC50值与SARS-CoV-2具有直接相关性。
12.一种方法，包括：
(a)共转染编码至少一种SARS-CoV-2结构蛋白的第一载体和包括衍生于α病毒的RNA基因组的第二载体，其中所述α病毒RNA基因组包括(i)5’末端的DNA启动子，(ii)第一非翻译区，(iii)编码来自α病毒的非结构蛋白的开放阅读框，(iv)报告基因，(v)SARS-CoV-2包装信号序列，(vi)病毒亚基因组RNA启动子，(vii)目标基因，(viii)第二非翻译区，(ix)聚A尾；以及
(b)产生杂合粒子，其中所述杂合粒子包括α病毒RNA基因组和至少一种SARS-CoV-2结构蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，进一步包括用所述杂合粒子感染靶细胞，其中所述靶细胞表达ACE2。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述报告基因的表达能够产生促进感染的检测和定量的信号。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在所述杂合粒子感染后约2至72小时后读取所述信号。
16.一种检测受试者对一种或多种SARS-CoV-2变异体的抗体应答的方法，包括
a)将来自所述受试者的血清样品与如权利要求10所述的杂合粒子一起孵育；
b)将孵育的杂合粒子引入含有ACE2的细胞中；
c)检测所述细胞中的报告基因表达，其中
报告基因的表达表明受试者不具有阻断细胞病毒感染的中和抗体，而没有报告基因表达表明受试者具有阻断细胞病毒感染的抗体。
17.一种组合物，包括权利要求1所述的杂合粒子。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物为能够引发免疫应答的疫苗或颗粒。
19.一种组合物，包括权利要求10所述的杂合粒子。
20.一种组合物，包括权利要求19所述的杂合粒子，其中所述组合物为能够引发免疫应答的疫苗或颗粒。
Applications Claiming Priority (5)
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| US63/118,787 | 2020-11-27 | ||
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2021
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