KR20200095575A - 항-사이토메갈로바이러스 중화 항체를 탐지하기 위한 방법 - Google Patents

항-사이토메갈로바이러스 중화 항체를 탐지하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 숙주 세포내의 HCMV 감염 레벨을 결정하고, 나아가, 샘플 내 존재하는 중화 항체 레벨을 결정하는데 유용한 방법들을 제공한다. 본 발명은 형광 모이어티를 갖는 HCMV 바이러스가 바이러스성 감염의 탐지(예를 들어서, 숙주 세포를 상기 바이러스와 접촉시킨 후 세포내의 형광을 산정함으로써)를 가능케 한다는 인식을 망라한다. 몇몇 구체예들에 있어서, HCMV 감염 레벨이 대상으로부터의 테스트 샘플(예를 들어서, 혈청 샘플)이 상기 바이러스와 선-배양되는 형광 탐지에 의해 결정된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 대상은 HCMV 백신 후보로 접종된다.

Description

항-사이토메갈로바이러스 중화 항체를 탐지하기 위한 방법{METHODS FOR DETECTION OF ANTI-CYTOMEGALOVIRUS NEUTRALIZING ANTIBODIES}
본 출원은, 본 명세서의 참고 문헌을 이루는, 2012년 3월 27일자로 출원된 미국출원 제 61/616,204 호에 대한 우선권 및 이의 이득을 주장한다.
인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)는, 베타-헤르페스바이러스군의 1종으로서 보편적으로 발생하는 병원균이다. 면역능력이 있는 인간에게, HCMV 감염은 매우 경미하고 특별한 증상들이 없어 보통 인지되지 않는다.
대조적으로, 특정 위험 그룹들, 예를 들어 AIDS환자, 장기이식 받은 자들, 그리고 출산 전 태내 감염된 자들과 같은 면역이 억제된 환자들에 있어서, HCMV 감염은 심각한 징후들을 보인다. (Staras SA et al., 2006 Clin Infect Dis 43(9): 1143-51; Hebart H et al, 2004 Hum Immunol 65(5):432-6; Rowshani AT et al, 2005 Transplantation 79(4):381-6). 현존하는 치료들은 면역글로불린항체 및 항바이러스제와 같은 간사이클로비르(ganciclovir) 및 그 유도체들의 사용을 포함하며, 감염된 개체군에 굉장히 이른 시기에 사용되거나 예방의 목적으로 사용될 경우 가장 효과적이다. 그러나, 현존하는 치료들은 특히 노년-발생의 질병에 대하여 상당한 독성 및 제한된 효험을 특징으로 하고(Boeckh M., 2004 Pediatr Transplant 8(Suppl. 5):19-27; Limaye AP., 2004 Transplantation 78(9): 1390-6), 선천적인 HCMV 질병에 대하여 임팩트가 없다. HCMV 질병에 대한 효과적인 백신의 개발은 공중 위생의 중요한 우선 순위로 여겨진다(Arvin AM et al, 2004 Clin Infect Dis 39(2):233-9).
생체외(in vitro) 어쎄이는 백신 후보에 있어서 HCMV 감염을 방해하는 능력을 평가하는 중요한 수단이다. 예를 들어서, 중화 어쎄이는 임상적 및 선임상적 실험에 있어서, 감염된 개체내의 면역 반응의 연구뿐만 아니라 백신 면역원 후보의 산정을 위해서 개발되어 왔다. HCMV의 경우, 항원 결합 ELISA들로 HCMV 항원에 특유한 항체를 판단할 수 있다; 그러나, 세포내 바이러스성 진입의 중화가 판단되는 어쎄이만이 항원-특유 항체의 생물학적 활성을 밝히고 수량화할 수 있었다(Abai et al., 2007 J Immunol Methods 332(1-2):82-93). 보통, 그러한 HCMV에 대한 중화 어쎄이에서, 세포의 HCMV 감염을 중화 항체가 어느 정도까지 감소시킬 수 있는지는 세포 내의 하나 이상의 바이러스성 단백질 발현에 기초하여, 감염된 세포의 핵의 수량화에 의해서 결정된다. 그러한 분석은 시간이 걸리고 고 스룻풋의 적용이 쉽지 않을 수 있다. 해당 분야에서 중화 항체 유도를 위한 잠재적인 HCMV 백신 후보를 스크리닝하는 개선된 방법에 대한 요구가 있다.
무엇보다도, 본 발명은 숙주 세포내의 HCMV 감염 레벨을 결정하고, 나아가, 샘플 내 존재하는 중화 항체 레벨을 결정하는데 유용한 방법들을 제공한다. 본 발명은 형광 모이어티를 갖는 HCMV 바이러스가 바이러스성 감염의 탐지(예를 들어서, 숙주 세포를 상기 바이러스와 접촉시킨 후 세포내의 형광을 산정함으로써)를 가능케 한다는 인식을 망라한다. 몇몇 구체예들에 있어서, HCMV 감염 레벨이 대상으로부터의 테스트 샘플(예를 들어서, 혈청 샘플)이 상기 바이러스와 선-배양되는 형광 탐지에 의해 결정된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 대상은 HCMV 백신 후보로 접종된다.
본 발명의 다른 특징들, 목적들, 및 장점들은 뒤따르는 발명의 상세한 설명에서 더 명백하다. 그러나, 본 발명의 구체적인 예시들은 발명을 제한하기 위한 것이 아니라 설명을 돕기 위한 것이다. 본 발명의 범위 내에서의 다양한 변형들 내지 변경들은 상세한 설명으로부터 해당 분야 통상의 기술자에 의해 명백하다.
첨부 도면들은 본 발명을 예시할 목적으로만 제시되는 것이지, 제한하기 위한 것이 아니다.
도 1은 2가의 gB 바이러스-유사 입자들(VLPs)(gB/pp65 및 gB/pp65 + gH-G/pp65)로 면역화한 후의 예시적인 ELISA 항-gB 항체 역가를 도시한 것이다. 토끼에서 2가의(bivalent) gB VLPs로 단일의 면역화 후에 강력하고 지속적인 면역이 유도된다.
도 2는 토끼에서 gB/pp65 CMV VLPs로 유도된 중화 항체 반응을 나타내는, 섬유아세포 내 GFP 발현의 대표적인 FACS 분석을 도시한 것이다. 토끼들(n = 6/그룹)을 0주차 및 8주차에 2회 면역화(IM)하였고, 2 주 후에 채혈하였다. 혈청들을 풀링하였고, 비교 Cytogam(상표명)내 표시 희석액(indicated dilutions)에서 HFF 섬유아세포내 GFP-발현 CMV 바이러스(TB40)에 대한 유사 희석액에서 테스트하였다. 감염된(GFP+) 세포의 플로우 사이토메트리 분석 동안 100,000개의 세포들을 모았다.
도 3은 토끼에서 2가의 gB + gH CMV VLPs로 유도된 중화 항체 반응을 나타내는, 섬유아세포 내 GFP 발현의 대표적인 FACS 분석을 도시한 것이다. 토끼들(n = 6/그룹)을 0주차 및 8주차에 2회 면역화(IM)하였고, 각 2 주 후에 채혈하였다. 혈청들을 풀링하였고, 비교 Cytogam(상표명)내 표시 희석액(indicated dilutions)에서 HFF 섬유아세포내 GFP-발현 CMV 바이러스(TB40)에 대한 유사 희석액에서 테스트하였다. 감염된(GFP+) 세포의 플로우 사이토메트리 분석 동안 100,000개의 세포들을 모았다.
도 4는 HFF-1 세포내의 대표적인 중화율을 도시한 것이다. 도시된 것은 PlVdl4, PlVd28, PlVd42, PlVd55, 및 P2Vdl4에서 풀링된 샘플 15RA09 그룹 7 {명반(alum)으로 보조된(adjuvanted) 1가 gB-G/1가 gH-G}; 및 P2Vdl4에서 15RA05 그룹 8 [빈 MLV Gag(empty MLV Gag)]에 대한 HFF-1 세포내 1:6 CMV-GFP-TB40-010512에 대한 10% 기니 피그 보체의 존재하에 중화들이다.
도 5는 ARPE-19 세포내의 대표적 중화율을 도시한 것이다. 도시된 것은 PlVdl4, PlVd28, PI Vd42, PlVd55, 및 P2Vdl4에서 풀링된 샘플 15RA09 그룹 7 (명반으로 보조된 1가 gB-G/1가 gH-G); 및 P2Vdl4에서 15RA05 그룹 8 [빈 MLV Gag(empty MLV Gag)]에 대한 ARPE-19 세포내 1:3 CMV-GFP-Towne-150612에 대한 2.5% 토끼 보체의 존재하에 중화들이다.
본 발명을 보다 용이하게 이해되도록 하기 위해, 특정 용어들이 아래와 같이 정의된다. 다음 용어들 및 다른 용어들에 대한 추가적인 정의는 본 명세서를 통해 제시된다.
아미노산: 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로 폴리펩타이드 사슬 내에 포함되어 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 몇몇 구체예에서, 아미노산은 H2N-C(H)(R)-COOH의 일반 구조를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 아미노산은 자연발생 아미노산이다. 몇몇 구체예에서, 아미노산은 합성 아미노산이고; 몇몇 구체예에서, 아미노산은 d-아미노산이고; 몇몇 구체예에서, 아미노산은 1-아미노산이다. "표준 아미노산(Standard amino acid)"은 자연발생 펩타이드들에서 보편적으로 발견되는 20개의 표준 l-아미노산들 중 임의의 것을 의미한다. "비표준 아미노산(Nonstandard amino acid)"은 합성으로 제조된 것 또는 자연에서 얻어진 것과 관계없이, 표준 아미노산이 아닌 아미노산들 중 임의의 것을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는, "합성 아미노산"은 화학적으로 변형된(chemically modified) 아미노산들을 망라하는 것으로, 그 비한정적인 예로 염, 아미노산 유도체(예를 들어, 아마이드), 및/또는 치환물을 포함한다. 펩타이드내 카르복시- 및/또는 아미노-말단의 아미노산을 포함하는, 아미노산은 메틸화에 의해, 아마이드화에 의해, 아세틸화에 의해, 기를 보호하는 것(protecting)에 의해, 및/또는 활성에 악영향을 미침이 없이 펩타이드의 순환 반감기(circulating half-life)를 변화시킬 수 있는 다른 화학 기로 치환하는 것에 의해, 변형될 수 있다. 아미노산들은 이황화 결합에 참여할 수 있다. 아미노산들은 예를 들어 하나 이상의 화학 물질들 (chemical entities) (예를 들어, 메틸기들, 아세테이트기들, 아세틸기들, 인산기들, 포르밀 모이어티들, 이소프레노이드 기들, 설페이트기들, 폴리에틸렌 글라이콜 모이어티들, 지질 모이어티들, 탄수화물 모이어티들, 비오틴 모이어티들 등)과의 연합(association)과 같은, 하나 이상의 번역후 변형들(posttranslational modifications)을 포함하여 구성될 수 있다. 용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 호환하여 사용될 수 있고, 유리 아미노산 및/또는 펩타이드의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 상기한 문맥으로부터 명백한 것은, 상기 용어는 유리 아미노산이든 펩타이드의 잔기이든 간에 사용될 수 있다는 것이다.
항원: 본 명세서에서 사용되는, 용어 "항원"은 하나 이상의 에피토프 (선형이든, 입체형이든, 또는 양자이든)를 포함하는, 항체들에 의해 인식되는 물질을 의미한다. 특정 구체예들에 있어서, 항원은 바이러스 또는 바이러스성 폴리펩타이드 이거나 바이러스 또는 바이러스성 폴리펩타이드를 포함하여 구성된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 용어 "항원"은 서브유닛(subunit) 항원[즉, 자연에서 연합된 항원을 갖는 전체 바이러스에서 분리되고 분비되는 항원, 예를 들어 바이러스-유사(virus-like) 입자에 결합된 항원]을 지칭한다. 이 대신에 또는 이에 더하여, 몇몇 구체예들에 있어서, 용어 "항원"은 사멸된(killed), 독성이 약화된(attenuated) 또는 불활성화된(inactivated) 바이러스들을 지칭한다. 특정 구체예들에 있어서, 항원은 "면역원(immunogen)" 이다.
대략 또는 약: 본 명세서에서, 대상의 하나 이상의 값에 적용된 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 참조 값들의 근사치를 지칭한다. 특정 구체예들에 있어서, 달리 언급하지 않는 한, 또는 문맥상 달리 명시하지 않는 한, 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 참조 값의 어느 한 쪽(작은 쪽 또는 큰 쪽)에서 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만에 속하는 값들의 범위를 지칭한다 (이러한 수는 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 배제함).
아멜리오레이션(Amelio비율n): 본 명세서에서 사용되는, 용어 "아멜리오레이션"은 상태(condition)의 예방, 감소 또는 경감(palliation), 또는 대상 현상의 호전(improvement)을 의미한다. 아멜리오레이션은 질병, 이상(disorder) 또는 상태 (예를 들어, HCMV 감염)의 완전한 회복 또는 완전한 예방을 포함하지만, 반드시 완전한 것을 요하는 것은 아니다. 용어 "예방"은 질병, 이상 또는 컨디션의 발병의 지연을 지칭한다. 예방은 질병, 이상 또는 컨디션의 발병이 미리 정해진(predefined) 기간 동안 지연되는 경우 완전한 것으로 간주될 수 있다.
투여형태(Dosage form): 본 명세서에서 사용되는, 용어 "투여형태(Dosage form)" 및 "단위 투여형태(unit dosage form)" 는 치료되어질 환자에 대한 치료제의 물리적인 개별 단위(discrete unit)를 의미한다. 각각의 단위(unit)는 희망하는 치료 효과를 발생시키기 위해 측정되는 활성 물질(active material)의 미리 결정된 분량을 함유한다. 그러나, 조성물의 총 투여량(total dosage)은 철저한(sound) 의학적 판단의 범위 내에서 의사에 의해 결정된다.
투여법(Dosing regimen): "투여법" (또는 "치료법")은 대상에게 개별적으로 투여되고, 그리고 보통 시간의 기간으로 분할되는 단위 투여량의 세트(보통 1회 이상)이다. 몇몇 구체예들에 있어서, 주어진 치료제는 1회 이상의 투여를 포함할 수 있는 권장 투여법으로 이루어진다. 몇몇 구체예들에 있어서, 투여법은 동일한 시간 간격으로 나누어지는 복수 회의 투여로 이루어진다. 몇몇 구체예들에 있어서, 투여법은 적어도 두 번의 시간 간격으로 나누어지는 복수의 투여로 이루어진다.
발현(Expression): 본 명세서에서 사용되는, 핵산 서열의 "발현"은 다음과 같은 현상들(events)의 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생성 [예를 들어, 전사(transcription)에 의해서]; (2) RNA 전사물(transcript)의 프로세싱 [예를 들어, 이어맞추기(splicing), 편집(editing), 5' 캡 형성, 및/또는 3' 말단 형성에 의해서]; (3) 폴리펩타이드 또는 단백질로 RNA의 번역(translation); 및/또는 (4) 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역후 변형(post-translational).
형광: 본 명세서에서 사용되는, 용어 "형광"은 발광하는 모이어티를 지칭한다. 보통 형광 모이어티들은 제1파장에서 전자기 에너지를 흡수하고 제2파장에서 전자기 에너지를 방출할 수 있는 전자들을 함유한다. 세포 내 몇몇의 단백질 또는 소분자(small molecule)는 자연적으로 형광[예를 들어서, NADH, 트립토판, 내생 엽록소, 피코에리트린(피코에리스린) 또는 녹색형광단백질(GFP)]이다. 형광 단백질의 다양한 변이체는 특히 EGFP, 황색형광단백질 (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal), 청록색형광단백질 (ECFP, Cerulean, CyPet), 황색형광단백질 (YFP, Citrine, Venus, YPet), 산화환원 민감성 녹색형광단백질 (roGFP), 및 모노머의 GFP 와 같이 본 발명에 따라 처리되고 사용되어질 수 있다. GFP 및 다른 형광 단백질들은 세포에서 단독으로 외생으로(exogenously) 또는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이 접근법은 형광 단백질이 세포내 위치예측(localization) 및 발현 패턴들과 같은 다수의 생물학적 이벤트들에 대한 리포터(reporter)로서 사용되는 것을 가능케 한다.
이 대신에 또는 이에 더하여, 일반적인 또는 특정한 단백질, 핵산, 지질 또는 소분자는 소분자, 단백질 또는 퀀텀 닷(quantum dot)일 수 있는 형광 염료인 외인성 형광물질(extrinsic fluorophore)로 라벨링될 수 있다. 대표적인 형광물질은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다; 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸움벨리페론; 5-카복시-2,7-디클로로플루오레세인; 5-카복시플루오레세인 (5-FAM); 5-카복시나프토플루오레세인; 5-카복시테트라메틸로드아민 (5-TAMRA); 5-히드록시 트립트아민 (5 -HAT); 5-ROX (카복시-X-로드아민); 6-카복시로드아민 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD); 7-히드록시-4- I 메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘 (ACMA); ABQ; 산성 푸크신(Acid Fuchsin); 아크리딘 오렌지; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로우; 아크리플라빈; 아크리플라빈 포일겐 SITSA; 에쿼린 (광단백질); AFPs 자가형광 단백질~(Quantum Biotechnologies) (참조: sgGFP, sgBFP); 알렉사 플루오(Alexa fluor) 350(상표명: .TM.); 알렉사 플루오 430.TM.; 알렉사 플루오 488.TM.; 알렉사 플루오 532.TM.; 알렉사 플루오 546.TM.; 알렉사 플루오 568.TM.; 알렉사 플루오 594.TM.; 알렉사 플루오 633.TM.; 알렉사 플루오 647.TM.; 알렉사 플루오 660.TM.; 알렉사 플루오 680.TM.; 알리자린 콤플렉손 (Alizarin Complexon); 알리자린 레드(Alizarin Red); 알로피코시아닌 (APC); AMC, AMCA-S; 아미노메틸쿠마린 (AMC A); AMCA-X; 아미노악티노마이신 D; 아미노쿠마린; 아닐린 블루; 안트로실 스테아르산염 (Anthrocyl stearate); APC-Cy7; APTRA-BTC; APTS; 아스트라존 브릴리언트 레트(Astrazon Brilliant Red) 4G; 아스트라존 오렌지(Astrazon Orange) R; 아스트라존 레드 6B; 아스트라존 Yellow 7 GLL; 아타브린(Atabrine); ATTO-TAG.TM. CBQCA; ATTO-TAG.TM. FQ; Auramine; Auro포스핀 G; Auro포스핀; BAO 9(Bisaminophenyloxadia졸); BCECF (높은 pH); BCECF (낮은 pH); Berberine 술페이트; 베타 락타마아제; BFP 블루 시프트된(shifted) GFP (Y66H); BFP; BFP/GFP FRET; Bimane; 비스벤제미드(Bisbenzemide); 비스벤지미드(Bisbenzimide) (Hoechst); bis- BTC; 블랑코포르(Blancophor) FFG; 블랑코포르 SV; BOBO.TM.-l; BOBO.TM.-3; 보디피(Bodipy) 492/515; 보디피 493/503; 보디피 500/510; 보디피 ;505/515; 보디피 530/550; 보디피 542/563; 보디피 558/568; 보디피 564/570; 보디피 576/589; 보디피 581/591; 보디피 630/650-X; 보디피 650/665-X; 보디피 665/676; 보디피 Fl; 보디피 FL ATP; 보디피 Fl-세르아미드(Fl-Ceramide); 보디피 R6G SE; 보디피 TMR; 보디피 TMR-X 컨쥬게이트; 보디피 TMR-X, SE; 보디피 TR; 보디피 TR ATP; 보디피 TR-X SE; BO-PRO.TM.-l; BO-PRO.TM.-3; 브릴리언트 술포플라빈 FF; BTC; BTC-5N; 칼세인; 칼세인 블루; 칼슘 크림슨--; 칼슘 그린; 칼슘 그린-1 Ca2+ Dye; 칼슘 그린-2 Ca2+; 칼슘 그린-5N Ca2+; 칼슘 그린-C18 Ca2+; 칼슘 오렌지; 칼코플루오르(Calcofluor) 화이트; 카복시-X-로다민 (5-ROX); 케스케이드(Cascade) 블루.TM.; 케스케이드 옐로우; 카테콜아민; CCF2 (진블레이저); CFDA; CFP (CFP); CFP/YFP FRET; 클로로필(Chlorophyll); 크로모mycin A; 크로모마이신 A; CL-NERF; CMFDA; 코엘렌테라진(Coelenterazine); 코엘렌테라진 cp; 코엘렌테라진 f; 코엘렌테라진 fcp; 코엘렌테라진 h; 코엘렌테라진 hep; 코엘렌테라진 ip; 코엘렌테라진 n; 코엘렌테라진 O; 쿠마린 팔로이딘; C-피코사이아닌; CPM I 메틸쿠마린; CTC; CTC Formazan; Cy2.TM.; Cy3.1 8; Cy3.5.TM.; Cy3.TM.; Cy5.1 8; Cy5.5.TM.; Cy5.TM.; Cy7.TM.; Cyan GFP; 사이클릭 AMP 플루오로센서(fluorosensor) (FiCRhR); 답실(Dabcyl); 단실(Dansyl); 단실 아민; 단실 카다베린(Cadaverine); 단실 클로라이드; 단실 DHPE; 단실 플루오라이드; DAPI; 다폭실(Dapoxyl); 다폭실 2; 다폭실 3'DCFDA; DCFH (디클로로디하이드로플루로레셈 디아세테이트); DDAO; DHR (디하이도로다민 123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS (비-ratio); DiA (4-Di 16-ASP); 디클로로디하이드로플루로레셈 디아세테이트 (DCFH); DiD- 친유성 트레이서(Lipophilic Tracer); DiD (DilC18(5)); DIDS; 디하이도로다민 123 (DHR); Dil (DilC18(3)); I 디니트로페놀; DiO (DiOC18(3)); DiR; DiR (Dil CI 8(7)); DM-NERF (높은 pH); DNP; 도파민; DsRed; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; 에오진(Eosin); 에리스로진; 에리스로진 ITC; 에티듐 브로마이드; 에티듐 호모다이머-1 (EthD-1); 유크리진(Euchrysin); 유코라이트(EukoLight); 유로퓸 (111) 클로라이드; EYFP; 패스트 블루; FDA; 포일겐 (파라로스아닐린); FIF (포름알데하이드 유도된 형광); FITC; 플라조 오렌지; 플루오-3; 플루오-4; 플루오레세인 (FITC); 플루오레세인 디아세트산; 플루오로-에메랄드; 플루오로-골드 (하이드록시스틸바미딘); 플루오로-루비; 플루오X; FM 1-43.TM.; FM4-46; 퓨라(Fura) Red.TM. (높은 pH); 퓨라 레드.TM./플루오-3; 퓨라-2; 퓨라-2/BCECF; 젠아크릴 브릴리언트 레드 B; 젠아크릴 브릴리언트 옐로우 10GF; 젠아크릴 Pink 3G; 젠아크릴 옐로우 5GF; 진블레이저; (CCF2); GFP (S65T); GFP 레드 시프트된 (rsGFP); GFP 와일드 타입* 비-UV 여기 (wtGFP); GFP 와일드 타입, UV 여기 (wtGFP); GFPuv; 글록살산; 그래뉼라(Granular) 블루; 하에마토포피린(Haematoporphyrin); Hoechst 33258; Hoechst 33342; Hoechst 34580; HPTS; 하이드록시쿠마린; 하이드록시스틸바미딘 (플루오로골드); 하이드록시스틸아민 ; Indo-1, 고칼슘; Indo-1 저칼슘; 인도디카르보시아닌 (DiD); 인도트리카르보시아닌 (DiR); 인트라화이트 Cf; JC-1; JO JO-1; JO-PRO- 1; LaserPro; Laurodan; LDS 751 (DNA); LDS 751 (RNA); 루코포르(Leucophor) PAF; 루코포르 SF; 루코포르 WS; 리싸민(Lissamine) 로다민; 리싸민 로다민 B; 칼세인/에티듐 호모다이머; LOLO-1; LO-PRO-1; 루시퍼(Lucifer) 옐로우; 리소 트래커(Lyso Tracker) 블루; 리소 트래커 블루-화이트; 리소 트래커 그린; 리소 트래커 레드; 리소 트래커 옐로우; 리소센서(LysoSensor) 블루; 리소센서 그린; 리소센서 옐로우/블루; 마그 그린; 막달라 레드 (플록신 B); 마그-퓨라 레드; 마그-퓨라-2; 마그-퓨라-5; 마그-lndo-1; 마그네슘 그린; 마그네슘 오렌지; 말라카이트(Malachite) 그린; 마리나 블루; I 맥실론 브릴리언트 플라빈(Flavin) 10 GFF; 맥실론 브릴리언트 플라빈 8 GFF; 메로시아닌; 메톡시쿠마린; 미토트랙커(Mitotracker) 그린 FM; 미토트랙커 오렌지; 미토트랙커 레드; 미트라마이신; 모노브로모비만(Monobromobimane); 모노브로모비만 (mBBr-GSH); 모노클로로비만; MPS (메틸 그린 피로닌 스틸벤); NBD; NBD 아민; 나일(Nile) 레드; 니트로벤조세디돌(Nitrobenzoxedidole); 노르아드레날린(Noradrenaline); 뉴클리어 패스트 레드; i 뉴클리어 옐로우; 닐로산 브릴리언트 lavin E8G; 오레곤 그린.TM.; 오레곤 그린.TM. 488; 오레곤 그린.TM. 500; 오레곤 그린.TM. 514; 퍼시픽 블루; 파라로스아닐린 (포일겐); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-텍사스레드 (레드 613); 플록신 B (막달라 레드); 포르위트(Phorwite) AR; 포르위트 BKL; 포르위트 Rev; 포르위트 RPA; 포스핀 3R; 포토리시스트(PhotoResist); 피코에리스린 B [PE]; 피코에리스린 R [PE]; PKH26 (Sigma); PKH67; PMIA; 폰토크롬 블루 블랙; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-1 PRO-3; 프리물린(Primuline); 프로시온 옐로우; 프로피듐 요다이드 (PI); PyMPO; 파이렌; 피로닌; 피로닌 B; 파이로잘 브릴리언트 플라빈 7GF; QSY 7; 퀴나크린(Quinacrine) 머스터드; 레조루핀; RH 414; Rhod-2; 로다민; 로다민 110; 로다민 123; 로다민 5 GLD; 로다민 6G; 로다민 B; 로다민 B 200; 로다민 B 추출물; 로다민 BB; 로다민 BG; 로다민 그린; 로다민 팔리시딘(Phallicidine); 로다민: 팔로이딘; 로다민 레드; 로다민 WT; Rose Bengal; R-피코사이아닌; R-피코에리스린 (PE); rsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; Sapphire GFP; SBFI; 세로토닌; 세브론(Sevron) 브릴리언트 레드 2B; 세브론 브릴리언트 레드 4G; 세브론 I 브릴리언트 레드 B; 세브론 오렌지; 세브론 옐로우 L; sgBFP.TM. (super glow BFP); sgGFP.TM. (super glow GFP); SITS (프리물린; 스틸벤 이소티오술폰산); SNAFL 칼세인; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARF 칼세인; SNARF1; 소듐 그린; 스펙트럼아쿠아; 스펙트럼그린; 스펙트럼오렌지; 스펙트럼 레드; SPQ (6-메톡시-N-(3sulfopropyl)quinolinium); 스틸벤; 술포로다민 B 및 C; 술포로다민 추출물; SYTO 11; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOX 블루; SYTOX 그린; SYTOX 오렌지; 테트라사이클린; 테트라메틸로다민 (TRITC); 텍사스 레드.TM.; 텍사스 레드-X.TM. 컨쥬게이트; 티아디카르보시아닌 (DiSC3); 티아진(Thiazine) 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TON; 티올라이트; 티오졸 오렌지; 티노폴 CBS (Calcofiuor white); TIER; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; TriColor (PE-Cy5); TRITC 테트라메틸로다민이소티오시아네이트; True 블루; Tru 레드; 울트라라이트; 우라닌 B; Uvitex SFC; wt GFP; WW 781; X-로다민; XRITC; 자일렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; 옐로우 GFP; YFP; YO-PRO-1; YO- PRO 3; YOYO-l;YOYO-3; Sybr 그린; 티아졸 오렌지 (인터킬레이트 염료); 퀀텀 닷과 같은 반도체 나노입자들; 또는 케이징된 형광물질 (빛 또는 다른 전자기 에너지원으로 활성화될 수 있는), 또는 이들의 조합.
융합 단백질: 본 명세서에서 사용되는, 용어 "융합 단백질"은 (1) 자연에서 발생하는, 그리고/또는 (2) 폴리펩타이드의 관능 도메인(funtional domain)을 나타내는, 펩타이드 모이어티에 대하여 고도의 아미노산 아이덴티티를 보이는, 일반적으로 적어도 두 개의 세그먼트들을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 보통, 이러한 세그먼트들을 적어도 두 개 포함하는 폴리펩타이드는 그 두 개의 세그먼트들이 (1) 동일한 펩타이드에 자연에서 포함되지 않은, 그리고/또는 (2) 단일 폴리펩타이드 내에서 서로 연결된 적이 없는, 그리고/또는 (3) 인위적으로 서로 연결된, 모이어티들이라면 융합 단백질이라 간주된다.
유전자: 본 명세서에서 사용되는, 용어 "유전자"는 당 분야에서 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 당 분야 통상의 기술자들에게 용어 "유전자"는 유전자 조절 서열들(regulatory sequences) [예를 들어, 프로모터들, 증폭자들(enhancers), 등] 및/또는 인트론(intron) 서열들을 포함할 수 있다고 이해된다. 나아가, 유전자의 정의는 단백질들을 인코딩하는 것이 아니라 예를 들어 tRNA들, RNAi-유도제들(inducing agents), 등의 기능적 RNA 분자들을 인코딩하는 핵산들을 언급한 것을 포함하는 것으로 이해된다. 명확히 하기 위하여, 본 출원에 사용되는 것과 같이 용어 "유전자"는 일반적으로 단백질을 인코딩하는 핵산의 부분을 의미함을 주의해야 한다; 용어 "유전자"는 당 분야 통상의 기술자에게 명확하듯이 선택적으로 조절 서열들을 포함할 수 있다. 상기 정의는 용어 "유전자"의 적용에서 비단백질-인코딩하는 발현 단위들을 배제하기 위함이 아니라, 대부분의 경우에 있어 본 출원에서 사용되는 상기 용어가 단백질-인코딩 핵산을 지칭하는 것을 명확하게 하기 위함이다.
유전자 산물(gene product) 또는 발현 산물(expression product): 본 명세서에서 사용되는, 용어 "유전자 산물(gene product)" 또는 "발현 산물(expression product)"은 일반적으로 유전자(사전- 및/또는 사후-프로세싱)로부터의 RNA 전사물 또는 유전자로부터의 RNA 전사물이 인코딩된 (사전- 및/또는 사후-변형) 폴리펩타이드를 의미한다.
고-스룻풋(High-throughput): 본 명세서에서 사용되는, 용어 "고-스룻풋" 은 광범위하게 수 많은 어쎄이를 거친 연구에 관한 것이고, 각 개체 샘플을 포맷팅하고(formatting), 준비 단계(pre파라tion steps) 및 문제(complications)를 줄이고, 그리고 어쎄이 결과들을 측정하는 것을 병렬로 또는 빠르게(파라llel or rapid) 연속(succession)으로 하는 것이 중요하다. 고-스룻풋 테스트는 보통 제조, 실행, 측정, 및 데이터 수집 등 어느 하나라도 다음 작용제에 대한 어쎄이를 행하기 전에 완료되어지는 단일 개체에 의한 것과 같은 수동의, 1회의 어쎄이를 포함하지 않는다. 고-스룻풋 보통 예를 들어서, 샘플들의 집단(batch)이 조제되고 측정되는(예를 들어서, 24, 96, 384 또는 그 이상의 테스트 샘플) 어쎄이는 어느 것이든 포함한다. 그러한 테스트 샘플 내의 테스트를 포맷팅하는 것은, 자동화의 도움과 같은 것에 의하여 병렬로 또는 빠르게(파라llel or rapid) 연속(succession)으로 측정하는 것을 가능케 함으로써, 어쎄이 프로세스를 가속화하기 위함이다. .
면역원성(immunogenic): 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원성"은 숙주 동물에서 비-숙주 엔터티(비-host entity) (예를 들어, HCMV 항원) 에 대항하여 면역 반응을 할 수 있음을 의미한다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 면역 반응은 특정 감염성 유기체(예를 들어, HCMV)에 대항하여 백신에 의해 이끌어내지는 방어면역의 기초를 형성한다.
면역 반응: 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 동물에서 야기되는 반응을 의미한다. 면역 반응은 세포성 면역, 체액성 면역을 의미하거나 둘 다를 포함할 수 있다. 면역 반응은 또한 면역 시스템의 일부분으로 제한될 수도 있다. 예를 들어, 특정 구체예들에 있어서, 면역원성 조성물은 증가된 IFNy 반응을 유발할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 면역원성 조성물은 점막(mucosal) IgA 반응[예를 들어, 비강 및/또는 직장 세척액(washes)에서 계측된]을 유발할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 면역원성 조성물은 전신의(systemic) IgG 반응 [예를 들어, 혈청(serum)에서 계측된]을 유발할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 면역원성 조성물은 바이러스-중화 항체들 또는 중화 항체 반응을 유발할 수 있다.
개선하다(Improve), 증가하다(increase), 또는 감소하다(reduce): 본 명세서에서 사용되는 용어 "개선하다", "증가하다", 또는 "감소하다", 또는 그 문법적 등가 표현은, 기준선 측정치(baseline measurement)에 대한 상대적인 값들을 표시한다, 예를 들어 여기에서 설명되는 치료가 행해지기에 앞선 동일한 개체에서의 측정치, 또는 여기에서 설명되는 치료가 행하여 지지 않는 대조 개체(control individual) (또는 다수의 대조 개체들)에서의 측정치에 대한 상대적인 값들을 표시한다.
개체(individual), 대상(subject), 환자(patient): 본 명세서에서 사용되는, 용어 "대상", "개체" 또는 "환자"는 인간의 또는 비인간의 포유동물 대상을 의미한다. 몇몇 구체예들에 있어서, 치료가 행하여지는 개체("환자" 또는 "대상"이라 칭하기도 함)는 질병, 예를 들어서 HCMV 감염을 앓는 개체 (태아, 유아, 아동, 청소년, 또는 성인)을 의미한다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 대상은 HCMV 감염의 위험에 처해질 수 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 대상은 면역억제된(immunosuppressed) 대상이다. 예를 들어, 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 면역억제된 대상은 HIV-감염된 대상, AIDS 환자, 장기이식 받는 인간, 소아, 그리고 임산부로 구성되는 집단에서 선택된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 대상은 HCMV 감염에 노출되어있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 대상은 인간이다.
분리된(isolated): 본 명세서에서 사용되는 용어 "분리된"은 (1) 처음에 (자연에서 및/또는 실험 세팅에서) 생산되었을 때 연합되어 있던 구성요소들의 적어도 일부로부터 분리된; 및/또는 (2) 인위적으로 생산된, 조제된, 및/또는 제조된; 물질 및/또는 엔터티를 의미한다. 분리된 물질들 및/또는 엔터티들은 그들이 처음에 연합되어있었던 다른 구성요소들의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 이상으로 분리될 수 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 분리된 작용제들(agents)은 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99%보다 높은 순도의 것이다. 본 명세서에서 사용되는, 물질에 실질적으로 다른 조성물들이 없는 경우 물질이 "순수하다(pure)" 라고 한다. 본 명세서에서 사용되는, 분리된 물질들 및/또는 엔터티들의 순도 퍼센트(percent purity) 계산은 부형제 (예를 들어, 버퍼, 용매, 물, 등)을 포함해서는 안된다.
연결자(Linker): 본 명세서에서 사용되는, 용어 "연결자"는 예를 들어, 융합 단백질에서, 적절한 길이의 아미노산 서열을 지칭하고, 그것 외에는 자연 단백질의 특정 위치(position)에서 나타나고 신축성있게 및/또는 예를 들어 a-나선(helix)과 같은 구조를 두 단백질 모이어티들 사이에 넣기 위하여 일반적으로 디자인된다, 일반적으로, 연결자는 융합 단백질의 두 또는 그보다 많은 도메인들이 각 도메인들의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 생물학적 활성을 유지하도록 하는 것을 가능하게 한다. 연결자는 또한 스페이서를 지칭하기도 한다.
핵산: 본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산"은 가장 넓은 의미로 올리고뉴클레오타이드 사슬 내에 포함되어 있는 임의의 화합물(compound) 및/또는 물질을 지칭한다. 몇몇 구체예들에 있어서, 핵산은 인산디에스테르 결합(phosphodiester linkage)을 통해 올리고뉴클레오타이드 사슬내에 포함되거나 포함되어 질 수 있는 화합물(compound) 및/또는 물질이다. 몇몇 구체예들에 있어서, "핵산"은 개별의(individual) 핵산 잔기들(residues) (예를 들어, 뉴클레오타이드들(nucleotides) 및/또는 뉴클레오사이드들(nucleosides))을 지칭한다. 몇몇 구체예들에 있어서, "핵산"은 개별 핵산 잔기들을 포함하여 구성되는 올리고뉴클레오타이드 사슬을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "올리고뉴클레오타이드"와 "폴리뉴클레오타이드"는 동일한 의미이다. 몇몇 구체예들에 있어서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중-가닥의 DNA 및/또는 cDNA를 망라한다. 게다가, "핵산," "DNA," "RNA"라는 용어들 및/또는 비슷한 용어들은 핵산 유사물들(analogs)을 포함하며, 다시 말해 포스포디에스테르(phosphodiester) 골격(backbone) 이외의 것을 갖는 유사물들(analogs)을 포함한다. 예를 들어, 골격에서 인산디에스테르 결합들 대신에 펩타이드 결합들을 갖고 당 분야에서 알려진 소위 "펩타이드 핵산들,"은 본 발명의 범위 내에서 생각되어진다. "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열" 이라는 말은 서로 축중한 형태(degeneracy version)의 것 및/또는 동일 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열들을 포함한다. 단백질들 및/또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열들 인트론들(introns)을 포함할 수 있다. 핵산들은 천연물유래로부터 정제되어지고, 재조합 발현 시스템들과 선택적으로 정제되어질 수 있고 화학적으로 합성, 등을 이용하여 생산될 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어 화학적으로 변형된 분자들(molecules)의 경우에 있어서 핵산들은 예를 들어 화학적으로 변형된 염기들 또는 당들, 골격변형들, 등의 뉴클레오사이드(nucleoside) 유사물들을 포함하여 구성될 수 있다. 핵산 서열은 그 외에 다르게 지시되지 않는 한, 5'에서 3'로의 방향으로 존재한다. 용어 "핵산 세그먼트"은 본 명세서에서 더 긴 핵산 서열의 부분인 핵산 서열을 지칭하기 위하여 사용되어 진다. 다수의 구체예들에 있어서, 핵산 세그먼트는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 잔기들을 포함하여 구성된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 핵산은 천연의 뉴클레오사이드들 (예를 들어, 아데노신(adenosine), 티미딘(thymidine), 구아노신(guanosine), 시티딘(cytidine), 우리딘(uridine), 디옥시아데노신(deoxyadenosine), 디옥시티미딘(deoxythymidine), 디옥시구아노신(deoxyguanosine), 그리고 디옥시시티딘(deoxycytidine)); 뉴클로오사이드(nucleoside) 유사물들 (예를 들어, 2-아미노아데노신(aminoadenosine), 2-싸이오티미딘(티오thymidine), 이노신(inosine), 파이롤피리미딘(pyrrolo-pyrimidine), 3-메틸아데노신(메틸adenosine), 5-메틸시티딘(메틸cytidine), C-5 프로피닐시티딘(propynyl-cytidine), C-5 프로피닐우리딘(propynyl-uridine), 2-아미노아데노신(aminoadenosine), C5-브로모우리딘(bromouridine), C5-플루오로우리딘(플루오ouridine), C5-아이오도우리딘(iodouridine), C5-프로피닐우리딘(propynyl-uridine), C5-프로피닐시티딘(propynyl-cytidine), C5-메틸시티딘(메틸-cytidine), 2-아미노아데노신(aminoadenosine), 7-데아자아데노신(deazaadenosine), 7-데아자구아노신(deazaguanosine), 8-옥소아데노신(oxoadenosine), 8-옥소구아노신(oxoguanosine), 0(6)-메틸구아닌(메틸guanine), 그리고 2-싸이오시티딘(티오cytidine); 화학적으로 변형된 염기들; 생물학적으로 변형된 염기들 (예를 들어, 메틸화된 염기들); 인터켈레이티드(intercalated) 염기들; 변형된 당들 [예를 들어, 2'-플루오로리보오스(fluororibose), 리보오스(ribose), 2'-디옥시리보오스(deoxyribose), 아라비노오스(arabinose), 그리고 헥소오스(hexose)]; 및/또는 변형된 인산기 그룹들 [예를 들어, 포스포로티오에이트들(phosphoro티오ates) 그리고 5'-N-포스포아미다이트(phosphoramidite) 연결들] 이거나 또는 상기의 것들을 포함하여 구성된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 본원 발명은 구체적으로 "변형되지 않은(unmodified) 핵산들" 에 관련되어지며, 이는 공급을 하거나 이를 원활히 하기 위하여 화학적으로 변형되지 않은 핵산들 (예를 들어, 뉴클레오타이드들 및/또는 뉴클레오사이드들을 포함하는 폴리뉴클레오타이드들과 잔기들)을 의미한다.
약학적 허용가능(pharmaceutically acceptable): 본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 허용가능"은 철저한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증, 상응하는 합리적인 이익/위험 비율(benefit/risk ratio) 없이 인간과 동물들 세포들과의 접촉에 있어 사용에 적합한 물질들을 지칭한다.
폴리펩타이드: 본 명세서에서 사용되는 "폴리펩타이드"는 일반적으로 적어도 두 개의 아미노산들이 상호 펩타이드 융합 결합된 일련의 스트링이다. 몇몇 구체예들에 있어서, 폴리펩타이드는 적어도 3-5 개의 아미노산들을 포함할 수 있으며, 그 각각은 적어도 하나의 펩타이드 결합의 방식으로 상호 결합되어 있다. 당 분야 통상의 기술자들은 폴리펩타이드들이 때때로 폴리펩타이드 사슬로 통합되어질 수 있는 "인공(비-natural)" 아미노산들 또는 다른 엔터티들을 선택적으로 포함한다고 이해할 수 있다.
해당 분야에서 잘 알려져 있듯이, 아미노산 또는 핵산 서열들은 상업적 컴퓨터 프로그램들에서 사용가능한 예를 들어 뉴클레오타이드 서열들에 사용되는 BLASTN, 그리고 아미노산 서열들에 사용되는 BLASTP, 갭드 BLAST, 및 PSI-BLAST 등을 포함하여 다양한 알고리즘들을 사용하여 대조되어 질 수 있다. 대표적인 그러한 프로그램들은 다음에 설명된다; Altschul, et al, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996); Altschul, et al, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: 단백질 데이터베이스 검색 프로그램의 새로운 시대", nucleic acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the analysis of genes and proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al, (eds.), Bioinformatics Methods and protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. 상동성 있는 서열들을 확인하는 것에 더불어, 상기 언급된 그러한 프로그램들은 보통 상동성 정도의 인디케이션을 제공한다. 몇몇 구체예들에 있어서, 두 개의 서열들은 만일 적어도 그들의 대응되는 잔기들의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 관련있는 스트레치에서 상동성이 있다면 실질적인 상동성이 있다고 여겨진다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 관련있는 스트레치는 완전한 서열이다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 관련있는 스트레치는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 또는 그 이상의 잔기들이다.
실질적인 아이덴티티(substantial identity): 어구 "실질적인 아이덴티티" 는 본 명세서에서 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 대조를 지칭하기 위해 사용된다. 당 분야 통상의 기술자에 의해 이해되겠지만, 아미노산 또는 핵산 서열들은 상업적 컴퓨터 프로그램들에서 사용가능한 예를 들어 뉴클레오타이드 서열들에 사용되는 BLASTN, 그리고 아미노산 서열들에 사용되는 BLASTP, 갭드 BLAST, 및 PSI-BLAST 등을 포함하여 다양한 알고리즘들을 사용하여 대조되어 질 수 있다. 대표적인 그러한 프로그램들은 다음에 설명되어져 있다. Altschul, et al, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996); Altschul, et al, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: 단백질 데이터베이스 검색 프로그램의 새로운 시대", nucleic acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the analysis of genes and proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. 동일한 서열들을 확인할 뿐만 아니라, 상기 언급된 프로그램들은 아이덴티티 정도의 지표를 제공한다. 몇몇 구체예들에 있어서, 두 개의 서열들은 만일 적어도 그들의 대응되는 잔기들의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 관련있는 스트레치에서 동일하다면 실질적으로 동일하다고 여겨진다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 관련있는 스트레치는 완전한 서열이다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 관련있는 스트레치는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 또는 그 이상의 잔기들 이다.
앓는(Suffering from): 질병, 이상, 또는 상태(예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스 감염)를 "앓는" 개체는 상기 질병, 이상, 또는 상태 중 하나 이상의 증상이 나타나거나 또는 진단된다.
걸리기 쉬운(Susceptible to): 질병, 이상, 또는 상태 (예를 들어, HCMV 감염) 에 "걸리기 쉬운" 개체는 상기 질병, 이상, 또는 상태가 생길 위험이 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 질병, 이상, 또는 상태에 걸리기 쉬운 개체는 질병, 이상, 또는 상태의 어떠한 증상도 나타내지 않는다. 몇몇 구체예들에 있어서, 질병, 이상, 또는 상태에 걸리기 쉬운 개체는 상기 질병, 이상, 및/또는 상태로 진단받은 적이 없다, 몇몇 구체예들에 있어서, 질병, 이상, 또는 상태에 걸리기 쉬운 개체는 상기 질병, 이상, 또는 상태의 발병에 관련된 상태들에 노출된 적이 있는 개체를 의미한다 (예를 들어, HCMV에 노출된 적이 있는 개체).
줄어들다(reduced): 본원 발명에 따를 때, 하나 이상의 특정 질병, 이상 또는 상태의 증상들이 규모 (예를 들어, 강도, 극렬함 등) 또는 빈도가 감소될 때, "줄어든다" 고 말한다. 명확히 하기 위하여, 특정 증상의 발병 지체는 당해 증상의 빈도 감소의 한 형태로 여겨진다. 상기 증상들이 없어지는 경우들로만 본원 발명이 한정되는 것으로 의도하는 것은 아니다. 본원 발명은 비록 완전하게 없어지지 않을지라도, 구체적으로 하나 이상의 증상이 줄어드는 경우 (그리고 대상의 상태가 그로 인해 "개선되는") 치료를 고려한다.
치료상 유효한(Therapeutically effective): 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료상 유효한"은 치료되는 대상에 치료 효과를 부여하기 위한 의학적인 치료방법에 적용되는 합리적인 이익/위험 비율의 충분한 양을 지칭한다, 상기 치료 효과는 객관적이거나 (즉, 몇몇 테스트 또는 마커에 의해 측정되어 질 수 있는) 또는 주관적일 수 있다. (즉, 대상은 효과를 느끼거나 효과에 대한 조짐을 나타낼 수 있다). 특히, "치료상 유효한"은 치료하거나, 아멜리오레이션되거나, 또는 바라는 질병 또는 상태를 예방하는, 또는 감지할 수 있는 약학적 또는 예방적 효과, 예를 들어 상기 질병과 관련된 증상들을 개선하면서, 상기 질병의 발병을 예방하면서 또는 늦추면서, 및/또는 또한 상기 질병의 극렬함 또는 빈도를 줄이면서, 를 나타내기에 효과적인 약학적 단백질 또는 조성물을 지칭한다, 치료상 유효한 양은 흔히 복수의 단위 투여들을 포함하여 구성되는 투여법으로 투여된다. 특정 면역원성 조성물에 있어서, 치료상 유효한 (및/또는 효과적인 투여법을 갖는 적절한 투여 단위)는, 예를 들어 투여의 루트 또는 다른 약학적 물질들과의 조합에 따라서 다양할 수 있다, 또한, 개별적인 환자에 대한 특이적 치료상 유효한 (및/또는) 단위 투여는 치료되는 해당 이상과 해당 이상의 극렬함을 포함하는 다양한 요인들에 따른다 ; 이용된 구체적인 약학적 물질의 활성 ; 이용된 구체적인 조성물은; 환자의 나이, 체중, 일반건강, 성별 그리고 식생활 ; 투여시간, 투여루트, 및/또는 이용된 상기 구체적인 면역원성 조성물의 분비 또는 대사작용 비율; 상기 치료의 지속성; 의학 분야에서 잘 알려진 것과 같은 요인들.
치료(treatment): 본 명세서에서 사용되는, 용어 "치료(treatment)" (또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 면역성 조성물의 투여가 상기 질병에 대한 소인(predisposition)의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생 정도(incidence)를 부분적으로 또는 완전하게 완화하거나, 아멜리오레이션되거나, 덜어주거나, 막거나, 발병을 지연시키거나, 극렬함(severity)을 감소시키거나(reduces) 그리고/또는 특정 질병, 이상, 및/또는 상태 (예를 들어, HCMV 감염) 또는 상기 질병에 대한 소인(predisposition)의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생 정도(incidence)를 감소시키는(reduces) 것이라면 어떠한 것이든 이를 의미한다. 그러한 치료(treatment)의 대상은 관련있는(relevant) 질병, 이상의 신호들(signs) 및/또는 상태를 나타내지 않는 대상들일 수 있고 그리고/또는 오로지 상기 질병, 이상, 및/또는 상태의 이른 신호들(signs)을 나타내는 대상일 수 있다. 이 대신에 또는 이에 더하여, 그러한 치료(treatment)는 관련있는(relevant) 질병, 이상 및/또는 상태의 하나 이상의 규명된(established) 신호(sign)를 나타내는 대상일 수 있다, 특정 구체예들에 있어서, 용어 "치료하는"은 환자의 백신접종을 의미한다.
친화성(Tropiosm): 본 명세서에서 사용되는, 바이러스 및 다른 병원균의 상황에 있어서의 용어들 "친화성" 또는 "숙주 친화성" 또는 "세포 친화성" 은 보통 특정한 세포 타입을 감염시키는 바이러스 또는 병원균의 능력에 관한 것이다. 친화성은 상기 바이러스 또는 병원균이 진화하여 종들 내에서 특정 숙주 종들 또는 특정 세포 타입들을 우선적으로 타겟팅하는 방식에 관한 것이다. 예를 들어서, HCMV는 보통 숙주에서 대부분의 기관의 실질 세포(parenchymal cells), 결합 조직 세포(connective tissue cells), 및 다양한 조혈 세포 타입을 포함한 굉장히 광범위한 범위의 세포를 감염시킬 수 있다. 그러나, 다양한 세포들에 대한 친화성은 예를 들어서, UL128-131 유전자 로커스의 변형과 같은, 다양한 HCMV 균주들에 따라 다르다. 몇몇 구체예들에 있어서, HCMV 균주는 섬유아세포를 감염시킬 수 있지만, 상피 및/또는 내피 세포를 감염시키지 못한다. 몇몇 구체예들에 있어서, HCMV 균주는 섬유아세포, 상피 세포 및 내피 세포를 감염시킬 수 있다.
백신접종: 본 명세서에서 사용되는, 용어 "백신접종"은 예를 들어서 질병-유발 작용제 (예를 들어, HCMV) 에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 의도된 조성물의 투여를 의미한다, 본원 발명의 목적으로서, 백신접종은 질병-유발 물질에 노출되기 전, 그리고/또는 노출되는 동안, 그리고/또는 노출된 후에 투여될 수 있고, 특정 구체예들에 있어서, 상기 물질에 노출되기 전, 노출되는 동안 그리고/또는 상기 물질에 노출된 후에 투여될 수 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 백신접종은 예방접종하는 조성물이 적절하게(appropriately) 시간적 간격을 두어진 복수의 투여들을 포함한다.
벡터(Vector): 본 명세서에서 사용되는, "벡터"는 핵산 분자인데, 다른 핵산을 그것이 결합되어 있는 곳으로 수송(transporting)을 가능케 한다. 몇몇 구체예들에 있어서, 벡터들(vectors)은 예를 들어 진핵의 그리고/또는 원핵의 세포와 같은 숙주 세포내에서 그들이 연결되는 핵산들의 염색체 외의(추출물-크로모somal) 복제 및/또는 발현을 할 수 있다. 오퍼레이트하게(operatively) 연결된 유전자들(genes)의 발현 지시를 가능케 하는 벡터들(vectors)은 본원 명세서에서 "발현 벡터들(expression vectors)" 로 나타낸다.
특정 구체예들의 설명
무엇보다도, 본 발명은 숙주 세포내의 HCMV 감염 레벨을 결정하고, 나아가, 샘플 내 존재하는 중화 항체 레벨을 결정하는데 유용한 방법들을 제공한다. 본 발명은 형광 모이어티를 갖는 HCMV 바이러스가 바이러스성 감염의 탐지(예를 들어서, 숙주 세포를 상기 바이러스와 접촉시킨 후 세포내의 형광을 산정함으로써)를 가능케 한다는 인식을 망라한다. 몇몇 구체예들에 있어서, HCMV 감염 레벨이 대상으로부터의 테스트 샘플(예를 들어서, 혈청 샘플)이 상기 바이러스와 미리-배양되는 형광 탐지에 의해 결정된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 대상은 HCMV 백신 후보로 접종된다.
I. HCMV 감염 및 백신
인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)는, 베타-헤르페스바이러스구의 1종으로서 보편적으로 발생하는 병원균이다. 일반적으로, 세포내 헤르페스바이러스의 진입은 흡착(adsorption) 및 수용체 결합에 의해 시작되고 바이러스 피막과 세포막의 융합이 뒤따르는 복잡한 과정이다. 융합은 보통 원형질 막 또는 엔도솜 막에서 일어난다. HCMV는 상피 세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 포함한 인 비보(in vivo)의 다양한 타입들의 세포를 감염시킨다(Plachter B et al., 1996 Adv Virus Res 46: 195-261). HCMV는 섬유아세포의 원형질 막과 융합하지만(Compton T et al., 1992 Virology 191 :387-395), 엔도시토시스를 통해 망막 색소 상피 세포 및 제대 혈관 내피 세포로 들어간다(Bodaghi B et al., 1999 J Immunol 162:957-964; Ryckman BJ et al, 2006 J Virol 80:710-722). 헤르페스바이러스가 그 진입 루트를 선택하는 메커니즘은 불확실하다. 보통 진입 경로는 숙주 세포에 의해 주로 결정된다고 추정되나, 비리온 당단백질의 트로픽 역할(tropic roles)에 대한 증거가 있다(Wang X et al, 1998 J Virol 72:5552-5558). HCMV는 두 개의 당단백질 H/당단백질 L (gH/gL) 복합체, 즉 트리머 복합체(trimeric complex)인 gH/gL/gO (이하, 'gO-함유 복합체'라 함) 및 펜타머 복합체(pentameric complex)인 gH/gL/pUL128/UL130/UL131 (이하, 'pUL128/UL130/UL131-함유 복합체'라 함)를 인코딩한다. 상기 pUL128/UL130/UL131-함유 복합체는 내피 및 상피 세포의 HCMV 감염에 중요한 반면, 상기 gO-함유 복합체는 섬유아세포 감염에 충분하다. 본 명세서에서 사용되는, 바이러스 및 다른 병원균의 문맥에서의 용어들 "친화성" 또는 "숙주 친화성" 또는 "세포 친화성" 은 보통 특정한 타입의 세포를 감염시키는 바이러스 또는 병원균의 능력을 의미한다. 친화성은 바이러스 또는 병원균이 진화하여 종들 내에서 우선적으로 특정 숙주 종들 또는 특정 세포 타입들을 타겟팅하는 방식을 의미한다. 몇몇 구체예들에 있어서, HCMV 균주는 섬유아세포를 감염시킬 수 있지만, 상피 및/또는 내피 세포들을 감염시키지는 못한다. 몇몇 구체예들에 있어서, HCMV 균주는 섬유아세포, 상피 세포 및 내피 세포를 감염시킬 수 있다.
HCMV는 나이 40세 성인들의 50-85%를 감염시킨다(Gershon AA et al, 1997 in Viral Infections of Humans, 4th edition, New York; Plenum Press:229-251). 출생 후에 HCMV를 얻은 대부분의 건강한 개체들에는 증상이 있다면, 적게 발생한다. 그러나, HCMV 질병은 조혈 세포 장기이식(HCT) 및 고형-기관 장기이식(SOT) 받은 자들과 같은 면역력이 약화된 개체에서 상당한 질병률(morbidity) 및 사망률(mortality)의 원인이다(Pass RF 2001 Cytomegalovirus. In Fields Virology. 4th edition, Philadelphia; Lippincott Williams & Wilkens:2675-2705). SOT 또는 HCT 개체군들에서, HCMV 질병은 공여 기관 또는 HCT로부터 옮겨진 새로운 감염으로부터 발생하거나, 또는 이식 받은자들 내에서 잠복해 있는 바이러스의 재활성화(reactivation)의 결과로서 재발한다. HIV-감염된 개체 내에서, 항레트로바이러스성 치료의 효용에도 불구하고, HCMV 감염은 AIDS 및 사망으로의 진행을 가속화한다. (Deayton JR et al, 2004 Lancet 363:2116-2121). 게다가 미국에서, HCMV는 가장 흔한 자궁 내(intrauterine) 감염이고, 매년 대략 8,000 명의 유아에 선천적인 이상(congenital abnormalities)을 유발하여 사망 또는 귀먹음 및 정신 지체를 포함하는 심각한 선천적 기형에 이르게 한다(Stagon S et al, 1986 JAMA 256:1904-1908).
HCMV를 컨트롤하는 면역 반응들은 불완전하게 이해되어 있다. 다른 인간 헤르페스바이러스로 유추해 볼 때, 세포성 및 체액성 면역 반응들 모두 중요한 역할을 한다고 추정된다 (Kohl S 1992 Current topics in Microbiology and Immunology 179:75-88). 쥐과의(murine) CMV에 있어서, 세포독성 T 세포 반응 또는 중화 항체의 수동 전달(passive transfer)이 치명적인 공격에 대항하여 보호하기에 충분하다고 보여진다(Rapp M et al, 1993 Multidisciplinary Approach to Understanding Cytomegalovirus Disease 327-332; Reddehase MJ et al, 198 J Virology 61 :3102-3108).
면역력이 약화된 인간내에서의 HCMV의 컨트롤은 주로 세포성 면역 반응꽈 연관이 있다; CD8+ 및 CD4+ T 림프구 둘 다 CMV 질병에 대항한 보호에 중요하다고 보여진다(Gamadia LE et al, 2003 Blood 101 :2686-2692; Cobbold M et al, 2005 J Exp Med 202:379-386). CMV에 대한 세포성 면역 반응은 바이러스성 입자의 피막(envelope) 및 캡시드 사이의 영역인, 바이러스성 테구멘트(tegument)에서 발견되는 다수의 항원에 대한 CD4+ 헬퍼 T-림프구 및 CD8+ 세포독성 T-림프구 반응들을 포함한다. 건강한 공여자로부터의 CMV-특정 CD4 및 CD8 T 세포들에 대한 최근의 연구는 CMV 감염 후에 인식되는 항원들을 확인하기 위하여, 일련의 CMV 오픈 리딩 프레임(open reading frames)으로부터의 오버래핑 펩타이드(overlapping peptides)를 사용한다(Sylwester AW et al, 2005 J Exp Med 202:673-685). 상기 CMV 테구멘트 포스포단백질 65 (pp65) 및 표면 당단백질 gB 는 CD4+ T 세포에 의해 가장 빈번히 인식되는 항원들이고, pp65는 또한 CD8+ T 세포에 의해 가장 빈번히 인식되는 항원들 중 하나이다.
장기이식 셋팅(transplant setting)에 대조적으로, 바이러스에 대항한 모계의 체액성 면역 반응은 신생아에서 HCMV 질병을 예방하는 데에 중요하다고 보여진다. 표면 당단백질, 특히 gB에 대한 항체는 HCMV의 모체-태아 이동에 대항한 보호에 결정적이라고 보여진다(Fowler KB et al, 2003 JAMA 289: 1008-1011). 게다가, 초기의 백신접종 연구에서 재-감염으로부터의 보호는 중화 항체와 상호 관련이 있다고 보여졌다(Adler SP et al., 1995 J Infectious Diseases 171 :26-32). HCMV에 대한 체액성 면역 반응은 바이러스 입자의 외피막에 존재하는 바이러스성 피막 당단백질(예를 들어서, gB 및 gH) 에 대한 반응에 의한 지배를 받는다.
HCMV의 경우, 바이러스가 엄격히 종-특이적이고 어떠한 동물 모델 시스템도 이용가능하지 않기 때문에 면역의 효과기 기능(immunological effector funtions)의 직접적인 평가는 어렵다. 그러나, 쥐과의 CMV 및 기니 피그 CMV를 이들 숙주 종들에서의 백신 전략을 평가하는 데에 사용해왔다.
방어적 T 세포 및 중화 항체 반응들 모두를 유도하는 CMV 백신은 감염을 예방하거나 또는 선천적인 감염 또는 장기이식에 의한 CMV 질병을 아멜리오레이션하는 포텐셜을 갖는다.
인간에서 테스트된 첫 번째의 살아 있는, 독성이 약화된(attenuated) HCMV 백신 후보는 실험실-순응된 AD 169 균주에 기초한다. 또 다른 실험실-순응된 임상적 분리집단, Towne 균주로 한 차후의 임상실험들은 살아 있는, 독성이 약화된 백신이 CD4+ 및 CD8+ T 림프구 반응들뿐만 아니라 중화 항체를 이끌어 낼 수 있음을 확인해 주었다. Towne 백신의 효험은 일련의 연구들에서 신장 장기이식 받은 자들을 통해 산정되었다. Towne 백신이 HCMV 질병에 방어적인 임팩트를 제공하였지만, 장기이식 후의 HCMV 감염을 예방하는 데에는 실패하였다 (Plotkin SA et al., 1984 Lancet 1 :528-530). Towne 백신은 또한 HCMV-감염된 자신들의 아동들로부터 감염되는 것을 예방하지 못하는, 탁아소에 맡겨지는 아이들을 자녀로 두는 혈청 검사 음성 어머니들의 위약대조그룹 연구에서 평가되어졌다. (Adler SP et al, 1995 J Infecious Diseases 171 :26-32). 이러한 연구들에서는 Towne 백신이 과다하게 독성이 약화되었다고 해석된다. 이러한 가능성을 분석하기 위하여, CMV의 독성이 약화되지 않은 "Toledo" 균주 부분이 Towne 유전체의 상응하는 부분으로 치환된 일련의 유전적으로 재조합 물질들이 제조되어지고, 그 결과 Towne 백신의 독성 약화에 기여하는 변이체들의 전부는 아니지만 몇몇을 포함하는 Towne/Toledo "키메라"의 제조가 가능하다. (Heineman TC et al. 2006 J Infect Disease 193: 1350-1360). 네 개의 Towne/Toledo "chimeras" 의 안정성 및 내약성은 임상실험 1 단계에서 실험되어진다. 장기간 안정성은 잠복하는 HCMV 감염이 생백신들의 추가적인 발생을 저해하는 잠재적인 위험에 관한 것이다.
자연 감염(natural infection) 동안의 바이러스-중화 항체 반응들 및 높은-역가를 이끌어 낼 수 있는 당해 단백질의 능력 덕택에, 리딩 서브유닛(subunit) CMV 백신 후보는 피막 당단백질, gB, (정제된 재조합 물질 gB 백신은 Sanofi-Pasteur 백신들에 의해 제조된다) 에 기초한다. 재조합 물질 gB 백신은 중화 항체 반응들을 이끌어 내고 탁월한 안정성을 갖는다. 그러나, 상기 백신 후보는 중화 항체 반응의 다른 당단백질 타겟들(targets) 및 그 이상으로 중요한 T 림프구 타겟들(targets)을 배제한다. 백신은 면역원성을 최적화하기 위하여 MF59 보조인자를 요한다. 가장 최근의 임상실험에서, 2 단계 임상실험에서는, 젊은 여성들에게 있어 상기 백신은 CMV 감염의 예방에 전반적으로 50%의 효험이 있다. (Pass RF et al, 2009 N Engl J Med 360: 1191-1199). 서브유닛(subunit) 백신 후보로 평가되어지는 다른 바이러스성 단백질들은 T-세포 반응들을 이끌어 내는 pp65 및 IE1 포함한다.
DNA 백신들은 동물들에서 활발한 세포성 및 체액성 면역 반응들을 이끌어 내고 백신 디자인에 있어서 특정성(specificity) 및 정확성(정확성)에 상당히 적합하다. DNA 백신들은 CMV에 대항해 개발되고 있으며 gB, IE1 및 pp65 단백질들을 타겟팅 면역원(target immunogens)의 후보로 주목하고 있다. pp65 및 gB를 인코딩하는 플라스미드 DNA를 사용하는 2가의 CMV DNA 백신 후보 (Wloch MK 2008 J Infectious Diseases 297: 1634-1642) 및/또한 IE1 유전자 산물을 인코딩하는 세번째 플라스미드를 포함하는 3가의 백신 후보 (Jacobson MA 2009 Vaccine 27:1540-1548) 는 Vical 백신들 (미국 특허 7,410,795호) 에 의해 개발되어졌다. 3가의 DNA 백신은 투여 루트에 관계없이 단독으로 최소의 면역원성을 갖는다. 그러나, 상기 CMV DNA 백신은 살아있는, 독성이 약화된 CMV (Towne) 의 투여 이후에 관찰된 CMV 항원들에 대한 기억 반응(memory response) 의 틀림없는 주된 요소라 보여진다.
벡터화된(vectored) 백신 접근법에서, 관심 있는 유전자 산물(gene product)은 비복제의 (보통은 바이러스성) 운반체를 통하여 발현된다. 이들 중 하나의 실시예는 ALVAC 라 불리는, Virogenetics 및 Sanofi-Pasteur 백신들에 의해 개발된 카나리폭스(canarypox) 벡터(vector)이고, 이것은 포유류 세포들에서 불임적으로(abortively) 복제되는 독성이 약화된 폭스바이러스(poxvirus) 이다. CMV gB를 발현하는 ALVAC 및 pp65 (미국 특허 6,267,965호)를 발현하는 ALVAC 는 임상 실험들에서 테스트되어진다. 차후의 gB 서브유닛/MF59 백신으로의 면역화 후에, 중화 항체 역가들을 신장시키는 것으로 보이지 않을지라도 (Bernstein DI et al. 2002 J Infectious Diseases 185:686-690), ALVAC-CMV(gB) 는 Towne 균주 CMV 의 차후 감염 이후, 중화 항체들을 유도하지는 않지만 중화 항체의 높은 역가들에 중요한 역할을 한다 (Adler SP et al. 1999 J Infectious Diseases 180:843-846). pp65, ALVAC-CMV(pp64)를 발현하는 카나리폭스 벡터는 자연적으로 혈청반응양성인 개인들에 비하여, 본래 혈청 검사 음성의 지원자들 모두에서 장기간-지속되는 CTL 반응들을 유도한다. (Berencsi K et al. 2001 J Infectious) Disease 183: 1171-1179). gB를 벡터화된(vectored) 백신으로서 발현하기 위해 사용되는 다른 접근법은 AlphaVax Inc (US 7,419,674) 에 의한 알파바이러스 리플리콘(replicon) 시스템을 사용하는 것이다. 상기 접근법은 pp65, IE1 또는 gB 단백질을 발현하는 바이러스-유사 리플리콘 입자들 (VRPs)을 생산하기 위해서, 알파바이러스, 즉 Venezuelan Equine Encephalitis (VEE) 바이러스의 독성이 약화된 균주로부터 유래된 전파(propagation)-결여의 단일-주기의 RNA 리플리콘(replicon) 벡터(vector) 시스템을 포함한다. (Berstein et al., 2010 Vaccine 28:484-493). CMV gB (Towne 균주) 및 pp65/IEl 융합 단백질의 수용성형태가 안전하고, 높은 수준의 중화 항체 및 다관능성의 CD4+ 및 CD8+ 항원-특유의 T 세포 반응들 유도한다고 알려졌기에, 두 구성요소 알파바이러스 리플리콘(replicon) 백신은 세 개의 CMV 단백질들을 발현하기 위해 사용되어졌다. (Reap EA et al. 2007 Vaccine 25:7441-7449). 테스트 결과에서 높은 복용량 그룹의 기하 평균 역가 (GMT) 는 자연적으로 감염된 CMV 혈청반응양성의 12명 개체들의 GMT의 약 절반이었다.
현재 전임상(preclinical) 개발에서의, HCMV에 대항한 백신접종의 신규한 후보는 "조밀체(dense body)" 백신 이다. 조밀체들(DBs) 은 피막를 보유하고, 세포 배양시, CMVs 의 복제(replication) 동안 형성되는 복제-불능(replication-defective)인 입자들이다. 조밀체들은 막 당단백질들 및 다량의 pp65 단백질을 함유한다. 조밀체들(DBs)은 비감염성이고, 면역원성(immunogenic) 이지만, 백신 접종자들에게 잠복해 있는 HCMV 감염을 시킬 수 없다. 조밀체들은 쥐들에서 바이러스성 유전자 발현이 없는 경우에 바이러스 중화 항체들 및 T-세포 반응들 유도할 수 있다고 보여진다(Pepperl S et al., 2000 J Virol 74:6132-6146 국제 공개공보 00/53729호 및 미국 특허 6,713,070호).
HCMV에 대항하여 추가적인 백신접종 후보들로 고려된 것은 바이러스 유사 입자들이다. 레트로바이러스는 레트로비리대(retroviridae) 과에 속하는 피막을 갖는 RNA 바이러스이다. 레트로바이러스에 의한 숙주 세포의 감염 이후, RNA는 역전사 효소에 의해 DNA로 전사된다. 상기 DNA는 이후 인테그라아제 효소에 의해 숙주 세포의 게놈에 합쳐지고, 이후 숙주 세포 DNA의 일부로서 복제된다. 상기 레트로비리대 과는 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 입실론레트로바이러스, 렌티바이러스 및 스푸마바이러스 속들을 포함한다. 상기 레트로바이러스 과의 숙주들은 보통 척추동물이다. 레트로바이러스는 숙주 세포막에서 유래된 지질 이중층으로 둘러싸인 구형의 뉴클레오캡시드(바이러스성 구조 단백질과 복합체를 이루는 바이러스성 게놈)를 포함하는 감염성 비리온을 생산한다.
레트로바이러스성 벡터는 감염성이고 복제-가능하거나 복제-불능인, 피막을 갖는 비리온을 발생시키는 데에 사용될 수 있다. 복제-가능한 감염성 레트로바이러스성 벡터는 비리온 합성 및 번식 숙주 세포의 감염이 발생하면 그들 자신을 계속해서 번식시키는 데에 필요한 모든 유전자들을 포함한다.
복제-불능인 감염성 레트로바이러스성 벡터는 최초의 감염 이후 전파되지 않는다. 이는 레트로바이러스의 인코딩 영역의 대부분을 이동될 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열로 대체함으로써 이루어지며; 상기 벡터가 복제의 추가적인 라운드들에 필요한 단백질들을 만들지 못하게 한다.
이 대신에 또는 이에 더하여, 레트로바이러스성 벡터는 레트로바이러스-유래 게놈이 없고, 비-감염성이고 비-복제성인 바이러스-유사 입자들을 발생시키는데에 사용될 수 있다. VLPs의 유리한 특성로 인하여, VLPs는 항원 딜리버리 시스템으로서 활용될 수 있다. 게다가, VLPs가 비-감염성이기에, 면역원성 조성물(예를 들어서, 백신)로서 안전하게 접종될 수 있다. VLPs는 보통 구조적으로 위에 설명된 피막을 갖는 비리온과 유사하나, 레트로바이러스-유래 게놈이 결여되어 있어 바이러스성 복제가 발생하지 않게 한다. 몇몇 바이러스[예를 들어서, 몰로니 쥐과의 백혈병 바이러스 (MMLV)와 같은, 쥐과의 백혈병 바이러스]의 캡시드 단백질(예를 들어서, Gag)의 발현은 바이러스성 유전 물질이 없는 입자들인, 상응하는 자가 바이러스(native virus)에 유사한 입자들로의 자가-조립으로 이어진다.
다양한 VLPs 조제하였다. 예를 들어서, 피막 단백질 및/또는 표면 당단백질이 있거나 없는, 단일 또는 다수의 캡시드 단백질을 포함한 VLPs가 조제되어졌다. 몇몇의 경우에 있어서, 헤파드나바이러스(예를 들어서, Engerix, GSK 및 Recombivax HB, Merck), 파필로마바이러스(예를 들어서, Cervarix , GSK 및 Gardasil, Merck), 파로바이러스, 또는 폴리오마바이러스로부터 조제된 VLPs에서 보여지는 것과 같이, VLPs는 피막을 갖지 않고 오로지 한 개의 주요한 캡시드 단백질의 발현에 의해서 조립된다. 몇몇 구체예들에 있어서, VLPs는 피막을 갖고 상응하는 자가 바이러스에서 발견되는 다수의 항원 단백질을 포함하여 구성될 수 있다. VLPs는 보통 그들의 상응하는 자가 바이러스를 닮고, 다가의(multivalent) 미립자 구조(particulate structures)일 수 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 항원 단백질은 VLP 구조의 구성요소로서 VLP 내부, 및/또는 VLP의 표면에 존재할 수 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, VLP의 상황에 있어서 내부 항원의 존재는 예를 들어서, VLP와 결합되지 않은 가용성 항원과 같은 다른 형태로의 항원 존재와 대비하여 중화 항체의 유도에 유리하다. 중화 항체는 3차 또는 4차 구조들을 가장 빈번히 인식한다; 이는 대게 피막 당단백질과 같은 항원 단백질이 그들의 자가 바이러스성 형태로 존재할 것을 필요로 한다. 이 대신에 또는 이에 더하여, 세포성 면역(예를 들어서, T 세포 반응)을 유도하는 상황에 있어서 VLPs는 항원을 존재시키는 데에 유용하다. 몇몇 구체예들에 있어서, VLP 시스템 내에서 항원 조합의 사용은 개선된 면역 반응을 발생시킨다.
II. 탐지 가능한 HCMV
위에 설명된 것과 같이, 무엇보다도, 본 발명은 숙주 세포내의 HCMV 감염 레벨을 결정하고, 나아가, 샘플 내 존재하는 중화 항체 레벨을 결정하는데 유용한 방법들을 제공한다. 본 발명은 형광 모이어티를 갖는 HCMV 바이러스가 바이러스성 감염의 탐지(예를 들어서, 숙주 세포를 상기 바이러스와 접촉시킨 후 세포내의 형광을 산정함으로써)를 가능케 한다는 인식을 망라한다. 몇몇 구체예들에 있어서, HCMV 감염 레벨이 대상으로부터의 테스트 샘플(예를 들어서, 혈청 샘플)이 상기 바이러스와 미리-배양되는 형광 탐지에 의해 결정된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 대상은 HCMV 백신 후보로 접종된다.
제공되는 방법들은 형광 모이어티를 함유하는 HCMV 바이러스를 활용한다. 여기에서 설명된 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 어떠한 HCMV 바이러스라도 형광 모이어티를 함유하도록 처리될 수 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 섬유아세포를 감염시키기 위하여, gH/gL/gO 복합체의 전부 또는 일부를 함유하는 HCMV 바이러스는 형광 모이어티를 함유하도록 처리될 수 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 내피 세포 및/또는 상피 세포를 감염시키기 위하여, gH/gL/UL128/UL130/UL131 복합체의 전부 또는 일부를 함유하는 HCMV 바이러스는 형광 모이어티를 함유하도록 처리될 수 있다. 형광 탐지가 잘 되는 변형된 HCMV 균주는 해당 분야에 잘 알려져 있고 및 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어서, UL32-EGFP-HCMV-TB40은 GFP와 융합된 TB40 UL32 유전자를 보유하는 플라스미드(ATCC; VR-1578)와 HCMV 균주 TB40의 생체외(in vitro) 재조합이다. 상기 UL32-EGFP-HCMV-TB40 재조합형 균주는 UL32 유전자의 산물인, 테구멘트 포스포단백질 pp150의 C 말단에 융합된 GFP가 있는 재조합 HCMV 바이러스를 발생시킨다(Sampaio et al, 2005 Journal of Virology 79(5):2754). GFP가 바이러스성 구조 단백질과 결합되기 때문에, 바이러스 입자들은 적절한 조명 하에 초록색의 형광을 낸다. 상기 UL32-EGFP-HCMV-TB40 균주는 섬유아세포에 대한 친화성을 갖는다고 보여졌다 (Sampaio et al., 2005 Journal of Virology 79(5):2754). 형광 탐지가 잘되는 추가적인 HCMV 균주는 CMV 균주 AD 169 게놈 및 GFP 리포터 카세트(reporter cassette)를 함유하는 HB15-t178b 이다(Saccoccio et al, 2011 Vaccine 29(15):2705).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "형광"은 발광하는 모이어티를 지칭한다. 보통 형광 모이어티들은 제1파장에서 전자기 에너지를 흡수하고 제2파장에서 전자기 에너지를 방출할 수 있는 전자들을 함유한다. 세포 내 몇몇의 단백질 또는 소분자(small molecule)는 자연적으로 형광[예를 들어서, NADH, 트립토판, 내생 엽록소, 피코에리트린(피코에리스린) 또는 녹색형광단백질(GFP)]이다. 형광 단백질의 다양한 변이체는 특히 EGFP, 황색형광단백질 (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal), 청록색형광단백질 (ECFP, Cerulean, CyPet), 황색형광단백질 (YFP, Citrine, Venus, YPet), 산화환원 민감성 녹색형광단백질 (roGFP), 및 모노머의 GFP 와 같이 본 발명에 따라 처리되고 사용되어질 수 있다. GFP 및 다른 형광 단백질들은 세포에서 단독으로 외생으로(exogenously) 또는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이 접근법은 형광 단백질이 세포내 위치예측(localization) 및 발현 패턴들과 같은 다수의 생물학적 이벤트들에 대한 리포터(reporter)로서 사용되는 것을 가능케 한다.
이 대신에 또는 이에 더하여, 일반적인 또는 특정한 단백질, 핵산, 지질 또는 소분자는 소분자, 단백질 또는 퀀텀 닷(quantum dot)일 수 있는 형광 염료인 외인성 형광물질(extrinsic fluorophore)로 라벨링될 수 있다. 대표적인 형광물질은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다; 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸움벨리페론; 5-카복시-2,7-디클로로플루오레세인; 5-카복시플루오레세인 (5-FAM); 5-카복시나프토플루오레세인; 5-카복시테트라메틸로드아민 (5-TAMRA); 5-히드록시 트립트아민 (5 -HAT); 5-ROX (카복시-X-로드아민); 6-카복시로드아민 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD); 7-히드록시-4- I 메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘 (ACMA); ABQ; 산성 푸크신(Acid Fuchsin); 아크리딘 오렌지; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로우; 아크리플라빈; 아크리플라빈 포일겐 SITSA; 에쿼린 (광단백질); AFPs 자가형광 단백질~(Quantum Biotechnologies) see sgGFP, sgBFP; 알렉사 플루오 350(상표명: .TM.); 알렉사 플루오 430.TM.; 알렉사 플루오 488.TM.; 알렉사 플루오 532.TM.; 알렉사 플루오 546.TM.; 알렉사 플루오 568.TM.; 알렉사 플루오 594.TM.; 알렉사 플루오 633.TM.; 알렉사 플루오 647.TM.; 알렉사 플루오 660.TM.; 알렉사 플루오 680.TM.; 알리자린 콤플렉손 (Alizarin Complexon); 알리자린 레드(Alizarin Red); 알로피코시아닌 (APC); AMC, AMCA-S; 아미노메틸쿠마린 (AMC A); AMCA-X; 아미노악티노마이신 D; 아미노쿠마린; 아닐린 블루; 안트로실 스테아르산염 (Anthrocyl stearate); APC-Cy7; APTRA-BTC; APTS; 아스트라존 브릴리언트 레트(아스트라존 브릴리언트 Red) 4G; 아스트라존 오렌지(아스트라존 오렌지) R; 아스트라존 Red 6B; 아스트라존 옐로우 7 GLL; 아타브린; ATTO-TAG.TM. CBQCA; ATTO-TAG.TM. FQ; 아우라민(Auramine); 아우로포스핀(Auro포스핀) G; 아우로포스핀; BAO 9(Bisaminophenyloxadia졸); BCECF (높은 pH); BCECF (낮은 pH); 베르베린(Berberine) 술페이트; 베타 락타마아제; BFP 블루 시프트된 GFP (Y66H); BFP; BFP/GFP FRET; Bimane; 비스벤제미드; 비스벤지미드 (Hoechst); bis- BTC; 블랑코포르 FFG; 블랑코포르 SV; BOBO.TM.-l; BOBO.TM.-3; 보디피 492/515; 보디피 493/503; 보디피 500/510; 보디피 ;505/515; 보디피 530/550; 보디피 542/563; 보디피 558/568; 보디피 564/570; 보디피 576/589; 보디피 581/591; 보디피 630/650-X; 보디피 650/665-X; 보디피 665/676; 보디피 Fl; 보디피 FL ATP; 보디피 Fl-세르아미드; 보디피 R6G SE; 보디피 TMR; 보디피 TMR-X 컨쥬게이트; 보디피 TMR-X, SE; 보디피 TR; 보디피 TR ATP; 보디피 TR-X SE; BO-PRO.TM.-l; BO-PRO.TM.-3; 브릴리언트 술포플라빈 FF; BTC; BTC-5N; 칼세인; 칼세인 블루; 칼슘 크림슨--; 칼슘 그린; 칼슘 그린-1 Ca2+ Dye; 칼슘 그린-2 Ca2+; 칼슘 그린-5N Ca2+; 칼슘 그린-C18 Ca2+; 칼슘 오렌지; 칼코플루오르 화이트; 카복시-X-로다민 (5-ROX); 케스케이드 블루.TM.; 케스케이드 옐로우; 카테콜아민; CCF2 (진블레이저); CFDA; CFP (CFP); CFP/YFP FRET; 클로로필; 크로모mycin A; 크로모마이신 A; CL-NERF; CMFDA; 코엘렌테라진; 코엘렌테라진 cp; 코엘렌테라진 f; 코엘렌테라진 fcp; 코엘렌테라진 h; 코엘렌테라진 hep; 코엘렌테라진 ip; 코엘렌테라진 n; 코엘렌테라진 O; 쿠마린 팔로이딘; C-피코사이아닌; CPM I 메틸쿠마린; CTC; CTC Formazan; Cy2.TM.; Cy3.1 8; Cy3.5.TM.; Cy3.TM.; Cy5.1 8; Cy5.5.TM.; Cy5.TM.; Cy7.TM.; Cyan GFP; 사이클릭 AMP 플루오로센서 (FiCRhR); 답실; 단실; 단실 아민; 단실 카다베린; 단실 클로라이드; 단실 DHPE; 단실 플루오라이드; DAPI; 다폭실; 다폭실 2; 다폭실 3'DCFDA; DCFH (디클로로디하이드로플루로레셈 디아세테이트); DDAO; DHR (디하이도로다민 123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS (비-ratio); DiA (4-Di 16-ASP); 디클로로디하이드로플루로레셈 디아세테이트 (DCFH); DiD- 친유성 트레이서; DiD (DilC18(5)); DIDS; 디하이도로다민 123 (DHR); Dil (DilC18(3)); I 디니트로페놀; DiO (DiOC18(3)); DiR; DiR (Dil CI 8(7)); DM-NERF (높은 pH); DNP; 도파민; DsRed; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; 에오진; 에리스로진; 에리스로진 ITC; 에티듐 브로마이드; 에티듐 호모다이머-1 (EthD-1); 유크리진; 유코라이트; 유로퓸 (111) 클로라이드; EYFP; 패스트 블루; FDA; 포일겐 (파라ros아닐린); FIF (Formaldehyd Induced fluorescence); FITC; 플라조 오렌지; 플루오-3; 플루오-4; 플루오레세인 (FITC); 플루오레세인 Di아세트산; 플루오로-에메랄드; 플루오로-골드 (하이드록시스틸바미딘); 플루오로-루비; 플루오X; FM 1-43.TM.; FM4-46; 퓨라 레드.TM. (높은 pH); 퓨라 레드TM./플루오-3; 퓨라-2; 퓨라-2/BCECF; 젠아크릴(Genacryl) 브릴리언트 레드 B; 젠아크릴 브릴리언트 옐로우 10GF; 젠아크릴 Pink 3G; 젠아크릴 옐로우 5GF; 진블레이저(GeneBlazer); (CCF2); GFP (S65T); GFP 레드 시프트된 (rsGFP); GFP 와일드 타입(wild type)* 비-UV 여기(Non-UV excitation) (wtGFP); GFP 와일드 타입, UV 여기 (wtGFP); GFPuv; 글록살산(Gloxalic Acid); 그래뉼라 블루; 하에마토포피린; Hoechst 33258; Hoechst 33342; Hoechst 34580; HPTS; 하이드록시쿠마린; 하이드록시스틸바미딘 (플루오로골드); 하이드록시스틸아민 ; Indo-1, high 칼슘; Indo-1 low 칼슘; 인도디카르보시아닌 (DiD); 인도트리카르보시아닌 (DiR); 인트라화이트 Cf; JC-1; JO JO-1; JO-PRO- 1; LaserPro; Laurodan; LDS 751 (DNA); LDS 751 (RNA); 루코포르 PAF; 루코포르 SF; 루코포르 WS; 리싸민 로다민; 리싸민 로다민 B; 칼세인/에티듐 호모다이머; LOLO-1; LO-PRO-1; 루시퍼 옐로우; 리소 트래커 블루; 리소 트래커 블루-화이트; 리소 트래커 그린; 리소 트래커 레드; 리소 트래커 옐로우; 리소센서 블루; 리소센서 그린; 리소센서 옐로우/블루; 마그 그린; 막달라 레드 (플록신 B); 마그-퓨라 Red; 마그-퓨라-2; 마그-퓨라-5; 마그-lndo-1; 마그네슘 그린; 마그네슘 오렌지; 말라카이트 그린; 마리나 블루; I 맥실론 브릴리언트 플라빈 10 GFF; 맥실론 브릴리언트 플라빈 8 GFF; 메로시아닌; 메톡시쿠마린; 미토트랙커 그린 FM; 미토트랙커 오렌지; 미토트랙커 Red; 미트라마이신; 모노브로모비만; 모노브로모비만 (mBBr-GSH); 모노클로로비만; MPS (메틸 그린 피로닌 스틸벤); NBD; NBD 아민; 나일 레드; 니트로벤조세디돌; 노르아드레날린; 뉴클리어 패스트 레드; i 뉴클리어 옐로우; 닐로산 브릴리언트 lavin E8G; 오레곤 그린.TM.; 오레곤 그린.TM. 488; 오레곤 그린.TM. 500; 오레곤 그린.TM. 514; 퍼시픽 블루; 파라로스아닐린 (포일겐); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-텍사스레드 (Red 613); 플록신 B (막달라 레드); 포르위트 AR; 포르위트 BKL; 포르위트 Rev; 포르위트 RPA; 포스핀 3R; 포토리시스트; 피코에리스린 B [PE]; 피코에리스린 R [PE]; PKH26 (Sigma); PKH67; PMIA; 폰토크롬 블루 블랙; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-1 PRO-3; 프리물린; 프로시온 옐로우; 프로피듐 요다이드 (PI); PyMPO; 파이렌; 피로닌; 피로닌 B; 파이로잘 브릴리언트 플라빈 7GF; QSY 7; 퀴나크린 머스터드; 레조루핀; RH 414; Rhod-2; 로다민; 로다민 110; 로다민 123; 로다민 5 GLD; 로다민 6G; 로다민 B; 로다민 B 200; 로다민 B 추출물; 로다민 BB; 로다민 BG; 로다민 그린; 로다민 팔리시딘; 로다민: 팔로이딘; 로다민 Red; 로다민 WT; Rose Bengal; R-피코사이아닌; R-피코에리스린 (PE); rsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; Sapphire GFP; SBFI; 세로토닌; 세브론 브릴리언트 Red 2B; 세브론 브릴리언트 Red 4G; 세브론 I 브릴리언트 Red B; 세브론 오렌지; 세브론 옐로우 L; sgBFP.TM. (super glow BFP); sgGFP.TM. (super glow GFP); SITS (프리물린; 스틸벤 이소티오술폰산); SNAFL 칼세인; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARF 칼세인; SNARF1; 소듐 그린; 스펙트럼아쿠아; 스펙트럼그린; 스펙트럼오렌지; 스펙트럼 Red; SPQ (6-메톡시-N-(3sulfopropyl)quinolinium); 스틸벤; 술포로다민 B 및 C; 술포로다민 추출물; SYTO 11; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOX 블루; SYTOX 그린; SYTOX 오렌지; 테트라사이클린; 테트라메틸로다민 (TRITC); 텍사스 레드.TM.; 텍사스 레드-X.TM. 컨쥬게이트; 티아디카르보시아닌 (DiSC3); 티아진 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TON; 티올라이트; 티오졸 오렌지; 티노폴 CBS (Calcofiuor 화이트); TIER; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; TriColor (PE-Cy5); TRITC 테트라메틸로다민이소티오시아네이트; True 블루; Tru Red; 울트라라이트; 우라닌 B; Uvitex SFC; wt GFP; WW 781; X-로다민; XRITC; 자일렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; 옐로우 GFP; YFP; YO-PRO-1; YO- PRO 3; YOYO-l;YOYO-3; Sybr 그린; 티아졸 오렌지 (인터킬레이트 염료); 퀀텀 닷과 같은 반도체 나노입자들; 또는 케이징된 형광물질 (빛 또는 다른 전자기 에너지원으로 활성화될 수 있는), 또는 이들의 조합.
III. 감염 어쎄이
* HCMV의 감염성 역가의 결정은 보통 어떠한 테스트 물질 없이도 세포 감염이 되는 조건 하에서, HCMV에 의해 감염이 되기 쉬운 숙주 세포를 바이러스(예를 들어서, 형광 모이어티를 함유하는 HCMV)의 일련의 희석물들과 접촉시키는 것을 포함한다. 리포터 유전자 구성(예를 들어서, 형광 모이어티, 예를 들어, GFP)을 발현하는 타겟팅 세포의 수는 결정하여(예를 들어서, 플로우 사이토메트리에 의해서) 바이러스 조제의 감염성 역가를 계산한다.
백신 후보가 접종되는 대상의 혈청 내 중화 항체의 존재 및/또는 활성을 산정하기 위하여, 상기 혈청은 중화 항체가 HCMV의 감염성을 감소시키기에 충분한 시간 동안(예를 들어서, 적어도 15 분, 적어도 30 분, 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 또는 그 이상) HCMV(예를 들어서, 형광 모이어티, 예를 들어서, GFP를 함유하는 HCMV)와 선-배양되어져야 한다. 상기 혈청과 HCMV(예를 들어서, 형광 모이어티를 함유하는 HCMV)의 선-배양된 혼합물의 일련의 희석물들은, 이후 감염이 되는 조건 하에서 HCMV에 의해 감염되기 쉬운 숙주 세포와 접촉시키기 위해 사용될 수 있다. 해당 분야 통상의 기술자는 감염 어쎄이를 위한 혈청의 적절한 희석들을 결정할 수 있다. 예를 들어서, 몇몇 구체예들에 있어서, 테스트된 희석들은 1:6, 1:12, 1:24, 1:48, 1:96, 1:192, 또는 이들의 조합이다.
감염이 되는 조건은 그 중에서도 바이러스성 균주, 숙주 세포 타입, 온도, 세포 컨플루언스(confluence), 바이러스 농도를 포함하는 다양한 요인들 에 따라 바뀐다고 이해된다. 해당 분야 통상의 기술자는 감염 조건을 적절히 변형시킬 수 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 감염 조건은 숙주 세포를 바이러스와 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 3 시간, 적어도 4 시간, 적어도 5 시간, 적어도 6 시간, 적어도 7 시간, 적어도 8 시간, 또는 그 이상 배양하는 것을 포함한다. 세포 감염의 관찰은 가시 세포성 형태 산정(예를 들어서, 세포성 팽윤 및 라운딩) 및/또는 가시 형광 산정(예를 들어서, 형광 현미경과 같은 디바이스로 형광을 탐지)을 포함할 수 있다고 이해된다. 감염 이후, 숙주 세포는 모아지고(예를 들어서, 세척 및 트립신화 및/또는 스크래핑에 의해서) 해당 분야에서 이용 가능하고 여기서 설명된 형광 탐지 방법들에 의해 분석된다.
HCMV에 의해 감염되기 쉬운 숙주 세포는 모두 여기서 설명된 방법으로 사용될 수 있다. 대표적인 숙주 세포는 인간 포피 섬유아세포(HFF)와 같은 인간 섬유아세포 및 망막 색소 상피 세포(ARPE-19)와 같은 인간 상피 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 감염 어쎄이 동안 숙주 세포가 자라는 배지는 세포 타입에 따라 바뀐다. 예를 들어서, 몇몇 구체예들에 있어서, HFF 감염 배지는 MEM + 5% FBS + 1% PenStrep을 포함한다. 몇몇 구체예들에 있어서, APRE 감염 배지는 DMEM:F-12 + 1% FBS를 포함한다.
IV. 형광 탐지 및 중화 항체 산정
예를 들어서, 플로우 사이토메트리 분석, 형광 활성 새포 분류장치(fluorescence Activated Cell Sorting), 또는 유동 미형광측정법(flow micro fluor cyometry)를 포함하는 적절한 방법이면 어느 것이든 사용하여 형광을 탐지할 수 있다. 형광 탐지의 민감도는 보통 탐지 시스템 내의 형광 엔터티 카피의 수, 탐지 기구의 효능, 및 샘플 내의 내생 생물학적 형광 엔터티 및 샘플과 형광 엔터티의 비-특정 결합으로부터 발생하는 백그라운드 형광에 대한 형광 엔터티의 형광 밝기에 좌우된다고 이해된다. 형광 엔터티의 밝기는 결국, 형광 신호를 만드는 형광 엔터티의 양자 효능 및 형광 엔터티의 빛 흡수 능력 (흡광 계수에 의해 수량화되는)에 의해 좌우된다.
세포는 GFP와 같은 리포터 분자를 사용하는 표면 및/또는 세포내의 형광 레벨에 기초하여 확인되거나 그리고/또는 분리될 수 있어야 한다고 이해되어야 한다. 보통, 형광 강도와 단백질 생산(예를 들어서, 바이러스성 감염 및 생산)과의 상관관계가 관찰된다. 예를 들어서, 몇몇 구체예들에 있어서, 숙주 세포내 형광 강도의 높은 레벨은 숙주 세포의 바이러스성 감염의 높은 레벨과 상관이 있다.
몇몇 구체예들에 있어서, 세포는 전반적인 형광 레벨(예를 들어서, 형광의 세포내 위치에 상관없이)이 산정된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 세포는 세포의 세포내 특정 위치(예를 들어서, 핵)에서의 형광 레벨이 산정된다. 일반적으로, 플로우 사이토메트리는 다수의 세포의 정량적 표현형 분석을 가능케 하지만, 그러나, 다수의 플로우 사이토메트리 어플리케이션은 세포들을 정량된 대로 이미지화 할 수 있는 능력을 포함하지 않는다. 몇몇 구체예들에 있어서, 세포 형광의 탐지 및 정량은 감염을 산정하기에 충분하다. 몇몇 경우에 있어서 세포 내 형광의 위치를 결정하는 것이 필요하다고 이해되어진다. 몇몇 구체예들에 있어서, 세포의 플로우 사이토메트리 분석은 형광의 가시 산정과 병행될 수 있다. 형광 레벨 및 위치의 이원 분석(dual analysis)은 다수의 디바이스(예를 들어서, 플로우 사이토메트리 및 형광 현미경)또는 단일 디바이스를 사용하여 행해질 수 있다. 위치 분석과 함께 형광 분석 및/또는 정량 분석을 할 수 있는 그러한 디바이스들은 해당 분야에서 이용 가능하다. 예를 들어서, ImageStreamx (Amnis)는 형광의 강도 및 위치를 모두 수량화하고, 분 당 50,000 세포 이상을 이미지화 할 수 있다.
세포 형광 레벨은 해당 분야에 알려진 적절한 방법이면 어떤 것에 의해서라도 정량될 수 있다. 세포 형광 레벨은 레퍼런스 레벨과 비교될 수 있다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 레퍼런스 레벨은 미리 결정되어 있거나 이력 레퍼런스 레벨이다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 레퍼런스 레벨은 레퍼런스 샘플과의 사이드-바이-사이드 비교로 얻어진다(예를 들어서, 양성 및/또는 음성 컨트롤).
플로우 사이토메트리 및 세포 분류를 사용하는 스크리닝 및 선택 방법의 등장은 스크리닝될 수 있는 세포의 수를 상당히 증가시켰다. 예를 들어서, 수백만의 세포는 단시간에 스크리닝될 수 있고, 부분개체군(subpopulations) 및 단일 세포는 혼합된-세포 개체군내로부터 그 개체군내에 10-6만큼 낮은 빈도로 존재하여도 분리될 수 있다. 제공된 방법들의 이점들 중 하나는 샘플 산정이 고-스룻풋 방법으로 이루어질 수 있다고 이해된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 제공된 방법들은 공지의 감염 및/또는 중화 항체 탐지 방법들(예를 들어서, 바이러스성 단백질의 스테이닝, 형광 현미경, ELISPOT, 등)과 비교시에 스룻풋을 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 그 이상으로 증가시킨다. 제공된 방법들은 멀티-웰 플레이트(multi-well plate) 포맷에서 수행되고 따라서 중-내지-고(mid-to-high) 스릇풋 스크리닝의 사용에 특히 적합하다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 멀티-웰 플레이트들은 96개의 웰을 갖는다. 몇몇 구체예들에 있어서, 상기 멀티-웰 플레이트들은 6, 12, 24, 384, 864 또는 1536 웰을 갖는 플레이트를 포함하지만 이에 한정되지 않는 또 다른 수의 웰을 갖는다. 용어들 "멀티-웰 플레이트" 및 "미역가 플레이트(microtiter plate)" 는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
몇몇 구체예들에 있어서, 살아있는 세포들은 분석된다. 몇몇 구체예들에 있어서, 세포들은 분석에 앞서 고정된다.
몇몇 구체예들에 있어서, 본 발명은 형광 탐지 및/또는 숙주 세포의 바이러스성 감염을 상관시켜 항-HCMV 중화 항체를 측정하는 방법들을 제공한다. 예를 들어서, 형광 모이어티(예를 들어서, GFP)를 함유하는 HCMV는 HCMV 백신 후보로 면역화된 대상으로부터의 혈청과 선-배양될 수 있다. 혈청 내 존재하는 중화 항체는 HCMV(예를 들어서, 형광 모이어티를 함유하는 HCMV)가 보통 HCMV에 의해 감염되기 쉬운 숙주 세포를 감염시키는 것을 감소시킨다. 상기 HCMV(예를 들어서, 형광 모이어티를 함유하는 HCMV) 및 혈청을 포함하는 선-배양된 혼합물은 이후 숙주 세포에 접촉시키는 데에 사용될 수 있고 숙주 세포의 형광 레벨은 산정될 수 있다. 숙주 세포 내의 형광 레벨에 기초하여, 숙주 세포의 감염 레벨이 결정될 수 있다. 숙주 세포의 감염 레벨은 보통 혈청 내 중화 항체의 존재 및 양과 반비례 관계에 있고, 이는 결과적으로, 치료적 반응(예를 들어서, 방어적 면역 반응)을 이끌어 내는 백신 후보의 효험과 상관이 있다. 예를 들어서, 백신 후보가 대상 내의 중화 항체를 유도하는데 효험이 있을수록, 혈청 내 중화 항체가 더 많이 존재하고, 결과적으로 청과의 선-배양 이후형광 모이어티를 함유하는 HCMV가 숙주 세포를 감염시키는 능력을 감소시키는 것에 상응하고, 나아가 형광 모이어티를 함유하는 HCMV와 숙주 세포를 접촉시킨 후 숙주 세포 내의 탐지되는 형광이 감소하는 것과 상응한다. 몇몇 구체예들에 있어서, 본 명세서의 방법들은 여기서 설명된 상관관계에 기초하여, 중화 항체를 유도하는 백신으로서의 백신 후보(예를 들어서, HCMV 백신 후보)를 선택하고 그리고/또는 확인하는 것을 더 포함한다.
실시예들
하기의 실시예는 본원 명세서에 기재된 특정 조성물 및 방법을 구성하고 실시하는 몇몇 대표적인 양태를 기재한다. 당해 실시예들은 단지 설명을 목적으로 하는 것이지 본원 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1: 바이러스-유사 입자들을 이용한 토끼의 면역화
본 실시예는 다양한 재조합 물질 HCMV 항원을 함유하는 바이러스-유사 입자들을 이용한 토끼의 대표적인 면역화를 설명한다.
HEK 293T 세포(ATCC, CRL-11268)를 다양한 재조합 HCMV 항원을 인코딩하는 발현 플라스미드와 함께 칼슘 포스페이트 방법(칼슘 phosphate method)을 이용하여 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 상기 HEK 293 세포에 의한 다양한 HCMV 항원의 발현을 플로우 사이토메트리로 확인하였다. 48 내지 72 시간의 트랜스펙션 이후, VLPs를 함유하는 상청액을 채취하고 0.45㎛ 공극 크기의 멤브레인을 통해 여과하고 나아가 SW32 Beckman 회전자(25,000 rpm, 2 시간, 4℃)에서 20% 수크로오스 쿠션(sucrose cushion)을 거치는 초원심분리로 농축하고 정제하였다. 알갱이(Pellets)를 살균된 내독소-없는(endotoxin-free) PBS(GIBCO)에서 재현탁시켜 500배 농축된 VLP 스탁(stocks)을 얻었다. 총 단백질은 브레드포드 어쎄이 수량화 키트(BioRad)를 사용하여 엘리??(aliquot)으로 결정하였다. 정제된 VLPs 는 사용 전까지 -80℃ 에 저장하였다.
토끼를 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 t = 0 및 t = 8 주차에 근육 내에VLPs 로 면역화시켰다. 혈청을 t = 4, 6, 8, 10, 13 및 16 주차에 모았다.
테스트 물질 번호
(Test Article #)
(n = 6/group)		 투여
(Dose)		 테스트 대상 설명
(Test Article Description)
1 100㎍ gB/pp65 2가의 VLPs
6 100㎍/각각 gB/pp65 2가의 VLPs +
gH-G/pp65 2가의 VLPs
엘리사(ELISA)를 행하여 토끼 혈청 HCMV IgG 함량을 결정하였다. 도 1은 gB/pp65 2가의 VLPs(상부) 및 gB/pp65 2가의 VLPs + gH-G/pp65 2가의 VLPs(하부)로 면역화된 토끼에서의 강력하고 지속적인 면역을 나타낸다.
실시예 2: 플로우 사이토메트리-기초 중화 활성
본 실시예는 면역화된 동물로부터의 혈청 내 HCMV에 대한 중화 항체 반응의 산정을 설명한다. 본 실시예의 목적은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 1) 다른 동물 연구들로부터 선택된 CMV 임상적 후보 구성요소의 면역원성의 확인; 2) 투여 루트들(예를 들어서, IM vs. IP 투여)에 따른 투여량 및 포텐셜 시너지(potential synergy) 및/또는 길항 작용(antagonism)의 산정; 및 3) 면역 부스팅(immunological boosting) 및 면역 지속성의 산정.
실시예 1로부터의 테스트 물질 번호(test article #) 6 으로 면역화된 토끼로부터의 혈청 샘플을 t = 0 (P0V) 및 t = 2 주 (P2Vd14) 차에 모았다. 이 그룹으로부터 풀링된(pooled), 열 비활성화된(HI) 샘플을 하기 설명된 바와 같이 중화 항체 활성을 위해 테스트하였다.
혈청 샘플을 1/6 내지 1/96로 희석하였다. HFF 세포[P=9, post 시딩(seeded)된지 24 시간 후에 사용] 및 새로이 채취된 바이러스인 TB40-230212을 사용하였다. TB40-230212 바이러스는 TB40-010212의 자손이다. TB40-010212 은 ATCC(ATCC VR-1578; 인간 헤르페스바이러스 5; UL32-EGFP-HCMV-TB40)으로부터 얻었다. 바이러스 감염 지속은 T150 감염 플라스크에서 15 일이었다(표 2). 현미경에 의한 관찰은 바이러스가 감염성임을 나타내 주었다. 감염 배지는 TB40-HFF-1 감염 배지 (MEM+5%FBS+l%Pen/Strep) 또는 VR1814-A선-19 감염 배지 (DMEM:F-12+1%FBS)이었다.
바이러스 Lot # 바이러스 감염
조상 지속기간 감염 플라스크 현미경
관찰
TB40 230212 TB40-010212
(새로운 ATCC)		 15일 T150 감염성
HFF 시딩된 T150 플라스크를 CMV TB40-010212 [5개의 약병들(vials)] + 20 ml 의 감염성 배지 (MEM-Sigma Cat.No. M4655 + 5% FBS + 1% P/S 로부터의 Minimum Essential Medium Eagle)로 감염시켰다. 37℃의 C02 인큐베이터에서 15 일간의 배양 후, 상기 플라스크는 잘-감염되었다. 상기 플라스크로부터의 상청액 거의 전부를 제거하고 50 mL 팔콘 튜브(Falcon tube)에서 살균을 유지하여 바이러스를 채취하였다. 약 5-7 mL의 잔여 상청액은 세포 스크레이퍼(NUNC, Cat# 179707)로 세포를 스크래핑하는 것을 돕는 데에 쓰였다. 스크래핑 이후, 아래 위로의 강력한 피펫팅(10X 까지)은 세포로부터의 바이러스 방출을 용이하게 하였다. 팔콘 튜브로부터의 최초 상청액 부피의 반(cca. 8 mL)이 더 강력한 바이러스를 얻기 위해 추가되었다.액체 질소로부터의 다섯 개 유리병의 TB40-010212(조상)을 하나의 T150 플라스크에서 감염시켰고, 37℃, 5% C02에서 1 시간 동안 배양하였다. 12 mL의 감염 배지를 배양 후에 추가하였다. 바이러스는 15 mL의 상청액에서 농축되었다.
Cytogam™ (CMV-IGIV - 사이토메갈로바이러스 면역 글로불린 정맥의 - Human; CSL Behring; 상업적 농도 2.5g/50ml 또는 50mg/ml)을 양성 컨트롤로 사용하였다. 1/20 희석을 기초 농도(1/20 희석: 100의 Cytogam™ 50 mg/mL + 1900의 감염성 배지)로 제조하였고, 이후 토끼 혈청들에 사용되는 것과 희석물과 동일한 희석물을 만드는 데에 사용하였다. Cytogam™ 은 토끼 혈청들(하기 표 3-5에 설명된 것과 같이)과 같은 동일 조건 하에서 열 불활성화되었다.
표 3. 감염 어쎄이

풀링된
HI P0V

 1/6 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
첫번째 플레이트
1/12 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
1/24 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
1/48 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
두번째 플레이트
1/96 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
세포 2 6-웰 플레이트 웰들

풀링된
HI P2V

 1/6 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
세번째 플레이트
1/12 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
1/24 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
1/48 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
네번째 플레이트
1/96 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
세포 2 6-웰 플레이트 웰들

HI Cytogam™
(기초 농도
1/20)
 1/6 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
다섯번째 플레이트
1/12 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
1/24 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
1/48 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
여섯번째 플레이트
1/96 1/2 바이러스 2 6-웰 플레이트 웰들
TB40-23012 1/2로 희석됨 2 6-웰 플레이트 웰들
표 4. P0V, P2Vd14 및 Cytogam™ 의 용도로 풀링된 혈청 희석
사용된
혈청 희석		 사용된
혈청		 희석제조를 위한 FBS
없는 배지
(ul)		 총 량
(ul)		 어쎄이에
사용된
혈청
(ul)		 어쎄이에
사용된 순수
바이러스
(ul)		 최종 농도
혈청
vs.
바이러스
1/3 100 ul
순수 혈청		 200 300 130 ul 1/3 130 1/6
vs.
1/2
1/6 150 ul 1/3 150 300 130 ul 1/6 130 1/12
vs.
1/2
1/12 150 ul 1/6 150 300 130 ul 1/12 130 1/24
vs.
1/2
1/24 150 ul 1/12 150 300 130 ul 1/24 130 1/48
vs.
1/2
1/48 150 ul 1/24 150 300 130 ul 1/48 130 1/96
vs.
1/2
표 5. HFF-1 세포 성장 및 감염 배지
원료 제조사 Cat# Lot# Exp 각 성분 농도 부피
HFF-1 세포
성장 배지

(DMEM +
15% FBS +
1%
Pen/Strep)		 DMEM
(둘베코의
개질이글배지)		 Hyclone SH30243.01 AWH17628 08/
2012		 80% 420ml
FBS
(소태아혈청)		 Hyclone SH30396.03 AVC67186 03/
2015		 15% 75ml
Pen/Strep
(페니실린
스트렙토마이신 용액)		 Sigma P0781-
100ML		 031M0787 10/
2012		 1% 5ml
HFF 감염 배지 TB40

(MEM +
5% FBS +
1%
Pen/Strep)		 MEM
(최소필수
이글배지)		 Sigma M4655-
500ml		 RNC0312 09/
2012		 94% 470ml
FBS
(소태아혈청)		 Hyclone SH30396.03 AVC67186 03/
2015		 5% 25ml
Pen/Strep
(페니실린
스트렙토마이신
용액)		 Sigma P0781-
100ML		 031M0787 10/
2012		 1% 5ml
각각의 특정한 농도의 혈청들 또는 Cytogam과 1/2 최종 바이러스 희석물을 화합시 혼합물/웰 + 200 감염 배지가 4 시간 이상의 건조되는 것을 피하기 위하여, 바이러스-혈청 혼합물을 2중으로 도포하였다. 37℃/5% C02에서 4 시간 동안 배양하였다[진동(rocking)을 매 60분에 행하였다]. 4-시간의 배양 이후, 각각의 웰로부터의 내용물을 피펫으로 조심스럽게 빨아내고 3 ml 의 새로운 감염성 배지를 추가하였다. 플레이트들을 인큐베이터에서 37℃/5% C02로 10 일 동안 보관하였다. 세포내 바이러스 감염의 매일의 검사가 후-감염(post-infection)의 5일 후에 행하여졌다. 팽윤 및 라운딩된 세포들은 빛 현미경 또는 형광 현미경을 이용한 녹색 형광 탐지에 의해 보여졌다.샘플을 모으기 위하여, 배지를 각각의 웰로부터 빨아내었다. 각각의 웰을 PBS(HyClone DPBS/칼슘 및 마그네슘 없이 변형된; Cat#SH30028.02)로 2회 세척하였고 100㎕의 1X Trypsin-EDTA (Sigma; Cat#T4174-100 ml) 및 100 의 PBS를 첨가하였다. 샘플들을 세포의 트립신화가 잘 될 때까지 C02 인큐베이터에서 2-3분 보관하였다. 트립신화를 멈추기 위하여 1 mL/웰을 PBS+5% FBS를 첨가하였다. 샘플들을 투명 플로우 유도 튜브에 모았다(동일 샘플/튜프에 대하여 2 개의 웰들) (BD Falcon, 5 ml 폴리스티렌 둥근-바닥, REF 352054). 플레이트들을 빛 현미경으로 체크하여 모든 세포들을 모았는지 확인하였다(모두 모아지지 않았으면, 나머지를 모으기 위하여 추가적인 500㎕, PBS+5% FBS를 사용했다). 샘플들을 900 rpm에서 10 분 동안 스핀 다운하였다. 상청액을 폐기하였고, 알갱이는 보관하였다. 상기 튜브를 볼텍싱하여 상기 알갱이가 잔존하는 버퍼에 퍼지게 하였다. 잔여 단계들을 빛에 최소한 노출될 채로 행하였다. 200㎕ 고정액 (BD Biosciences, BD Cytofix, Fixation 버퍼 Cat#554655, 100 ml)을 첨가하였고, 얼음통 안에서(on ice) 15 분 동안 배양하였다. 사이토픽스(Cytofix)를 멈추기 위하여 1 mL/튜브의 혼합물 PBS+5% FBS 첨가하였다. 샘플들을 900 rpm에서 10 분 동안 스핀 다운 하였다. 상청액을 폐기하였고 알갱이는 보관하였다. 상기 알갱이를 500㎕ 의 PBS+5% FBS에 녹여 환원시켰고(reconstitute), 플로우 사이토메트리를 하기 전에 격렬히 볼텍싱하였다.
샘플들은 플로우 사이토메트리의 대상이고, Cellquest 소프트웨어를 사용하여 분석한다. FSC 및 SSC 파라미터들은 "선형"으로 설정하였고, 다른 모든 파라미터들은 "로그형"으로 설정하였다. 감염된 세포의 플로우 사이토메트리 분석 동안 100,000 개의 세포들을 모았다. HFF 세포 및 TB40 CMV를 사용하는 플로우를 위한 보통의 조건은 FSC E-1 및 4.83; SSC 325; FL1 427이고, 더 적절한 점 플롯(dot plot)을 얻기 위하여 파라미터들을 현존 조건들 근처로 미미하게 변경할 수 있다.
도 2는 토끼에서 gB/pp65 CMV VLPs로 유도된 중화 항체 반응을 나타내는, 섬유아세포 내 GFP 발현의 대표적인 FACS 분석을 도시한 것이다. 토끼들(n = 6/그룹)을 0주차 및 8주차에 2회 면역화(IM)하였고, 2 주 후에 채혈하였다. 혈청들을 풀링하였고, 비교 Cytogam(상표명)내 표시 희석액(indicated dilutions)에서 HFF 섬유아세포내 GFP-발현 CMV 바이러스(TB40)에 대한 유사 희석액에서 테스트하였다. 감염된(GFP+) 세포의 플로우 사이토메트리 분석 동안 100,000개의 세포들을 모았다.
도 3은 토끼에서 2가의 gB + gH CMV VLPs로 유도된 중화 항체 반응을 나타내는, 섬유아세포 내 GFP 발현의 대표적인 FACS 분석을 도시한 것이다. 토끼들(n = 6/그룹)을 0주차 및 8주차에 2회 면역화(IM)하였고, 각 2 주 후에 채혈하였다. 혈청들을 풀링하였고, 비교 Cytogam(상표명)내 표시 희석액(indicated dilutions)에서 HFF 섬유아세포내 GFP-발현 CMV 바이러스(TB40)에 대한 유사 희석액에서 테스트하였다. 감염된(GFP+) 세포의 플로우 사이토메트리 분석 동안 100,000개의 세포들을 모았다.
실시예 3: 플로우 사이토메트리를 사용한, 중화 항체의 탐지를 위한 대표적인 미-중화 어쎄이
본 실시예는 백신화된 동물로부터의 혈청 샘플들 내에서, 플로우 사이토메트리에 의한 관능 항-CMV 중화 항체의 탐지를 설명한다.
물질/장비
다음의 물질 및 장비가 본 어쎄이에서 사용된다: 인간 포피 섬유아세포(HFF-1)세포들 - ATCC# SCRC-1041; 인간 발생 망막 색소 상피세포 - (ARPE-19) - ATCC#CRL-2302; 인간 헤르페스바이러스 5 HCMV (UL32-EGFP-HCMV-TB40) - ATCC# VR-1578; 인간 CMV-GFP-Towne TS15-rR (Dr. M. McVoy, VCU-Virginia 로부터 얻음); 토끼 IgG에 대한 염소 항혈청 (GAR) - MP Cappel, Cat#: 55620; 토끼로부터의 보체 혈청 - Sigma-Aldrich Cat#S7764-5 ml; 표준 기니 피그 보체 - Cedarlane Cat#CL-5000; 살균한 증류 수 - Gibco, Cat#15230; Dulbecco's 변형된 Eagle 배지 (DMEM) - HyClone; Cat# SH30243.01 (성장 배지); Minimum Essential Badge Eagle (MEM) - Sigma; Cat# M4655-500 ml (감염성 배지); Fetal Bovine Serum (FBS) - HyClone; Cat# SH30396.03; Penicillin Streptomycin Solution (Pen/Strep) - Sigma; Cat# P0781-100 ml; IX 트립신화-EDTA - Sigma; Cat#T4174-100 ml; 변형된 포스페이트 버퍼ed saline (DPBS - 칼슘 및 마그네슘이 없는) - HyClone; Cat# SH30028.02; Fixation 버퍼 BD Biosciences; BD 사이토픽스 Cat#554655-100 ml; Cytogam (CMV-IGIV - Cytomegalovirus Immune Glonulin Intravenous/Human- CSL Behring; Commercial 농도 2.5 g/50 ml; 디메틸술폭사이드 (DMSO) - Sigma-Aldrich Cat# D1435-500 ml; Biosafety 캐비넷; 인큐베이터 5% C02, 37C; Centrifuge; 볼텍싱; 플로우 사이토메트리용 샘플 획득 튜브(BD Falcon, 5 ml 폴리스티렌 둥근-바닥, REF 352054); 6-웰 플레이트; Multichannel 마이크로피펫 저장소; 5 내지 10 ml의 눈금이 새겨진 피펫; 1회용 팁들과 함께 10 내지 1000 로 조절가능한 단일 채널 마이크로피펫; 세포 스크레이퍼 - NUNC; Cat# 179707; 50 ml의 Falcon 튜브 - BD 358206; 회전자 - 에펜도르프 튜브(eppendorf tubes)를 위한; 형광 현미경; FACSCAN 기계
바이러스의 획득 및 채취
HFF-1 세포(T 150 플라스크 내 시딩된 95% 융합성 단일층)를 1.5 ml의 UL32-EGFP-HCMV-TB40("TB40")을 이용하여 감염시켰다. ARPE-19 세포를 HCMV-GFP-Towne-TS15-rR("Towne")을 이용하여 상기 동일한 방법으로 감염시켰다. 이 바이러스들이 빛에 민감하기 때문에, 상기 세포를 빛이 없는 상태에서 감염시켜야 한다. 상기 플라스크들을 이후 C02 인큐베이터/37℃ 에서 30 분 동안 배양하여, 세포와 바이러스를 부착시켰다.
25 ml 의 감염성 배지를 이후 상기 세포들에 첨가하였다(표 6 및 7에 제시됨). 플라스크들을 세포들이 잘 감염될 때까지 C02 인큐베이터/37℃에서 보관하였다 (TB40의 경우, 세포의 팽윤 및 라운딩은 빛 현미경 또는 형광 현미경을 이용한 녹색 형광으로 볼 수 있었다; Towne의 경우, 감염은 녹색 형광으로 탐지된다). 질 좋은 감염에 필요한 시간은 조상 바이러스의 감염 능력에 좌우된다.
채취는 상기 플라스크로부터의 거의 모든 상청액을 제거하고 50 ml의 팔콘 튜브에 살균상태로 보관하는 것으로 시작된다. 약 5 ml의 잔여 상청액은 세포 스크레이퍼를 이용한 세포의 스크래핑을 용이하게 하였다. 훌륭한 스크래핑 및 아래 위로의 강력한 피펫팅(10X 까지)은 바이러스가 세포로부터 방출되게 하였다. 팔콘 튜브로부터의 10 ml 의 최초 상청액을 첨가하였고 900 rpm에서 10 분 동안 스핀 다운하였다. 알갱이를 제거하였고, 약 15 ml의 농축된 바이러스를 보관하였다. 바이러스 총 양에서 5%에 해당하는 동결방지제(DMSO)를 첨가하였다. 1 ml의 엘리??을 조제하였고, 라벨링하였고, -80℃에서 단시간 또는 액체 질소에서 장시간 보관하였다.
표 6. HFF-1 세포 성장 및 CMV-GFP-TB40를 위한 감염 배지
원료 제조사 Cat# 각 성분 농도 부피
HFF-1 성장
배지

(DMEM +
15% FBS +
1%
Pen/Strep)		 DMEM
(둘베코의
개질이글배지)		 Hyclone SH30243.01 80% 420ml
FBS
(소태아혈청)		 Hyclone SH30396.03 15% 75ml
Pen/Strep
(페니실린
스트렙토마이신
용액)		 Sigma P0781-
100ML		 1% 5ml
CMV-GFP-
TB40
바이러스용
HFF 감염
배지

(MEM +
5% FBS +
1%
Pen/Strep)		 MEM
(최소필수
이글배지)		 Sigma M4655-
500ml		 94% 470ml
FBS
(소태아혈청)		 Hyclone SH30396.03 5% 25ml
Pen/Strep
(페니실린
스트렙토마이신
용액)		 Sigma P0781-
100ML		 1% 5ml
표 7. ARPE-19 세포 성장 및 CMV-GFP-Towne를 위한 감염 배지
원료 제조사 Cat# 각 성분 농도 부피
ARPE-19
성장 배지

(DMEM : F-12
5% FBS + 1%
Pen/Strep)		 DMEM : F-12
(둘베코의
개질이글배지/영양분 혼합물 F-12 HAM)		 Hyclone SH30023.01 80% 420ml
FBS
(소태아혈청)		 Hyclone SH30396.03 15% 75ml
Pen/Strep
(페니실린
스트렙토마이신
용액)		 Sigma P0781-100ML 1% 5ml
Towne 성장용
ARPE-19
감염 배지

(DMEM : F-12
5% FBS + 1%
Pen/Strep)

 DMEM : F-12
(둘베코의
개질이글배지/영양분 혼합물 F-12 HAM)		 Hyclone SH30023.01 99% 470ml
FBS
(소태아혈청)		 Hyclone SH30396.03 5% 25ml
Pen/Strep
(페니실린
스트렙토마이신
용액)		 Sigma P0781-100ML 1% 5ml
실험용 셋업(set-up) 및 방법
선-채혈되고 후-면역화된 혈청 샘플을 사용에 앞서 56℃에서 30 분 동안 열 불활성화하였다. 양성 컨트롤로서 역할을 하는 상업용 혈청들, Cytogam™ 도 열 불활성화하였다. 혈청 희석물들은 1/6로부터 원하는 희석들로 2개씩 만들었다. 인간/토끼 혈청의 Ig 함량에 맞추기 위하여 스탁 시약(stock reagent)을 1:20으로 희석하였고, 비교 희석물들에서 Cytogam을 테스트하였다(표 8에 제시됨).
표 8. 혈청 및 바이러스 희석 (2중의 1예로서 바이러스 희석을 나타낸다)
사용된
혈청 희석		 사용된
혈청		 희석제조를
위한 FBS
없는 배지
(ul)		 총 량
(㎕)		 어쎄이에
사용된
혈청 부피
(㎕)		 어쎄이에
사용된
순수
바이러스
(㎕)		 최종 농도
혈청
vs.
바이러스
1/3 100 ㎕
순수 혈청		 200 300 130 ㎕ 1/3 130 1/6
vs.
1/2
1/6 150 ㎕ 1/3 150 300 130 ㎕ 1/6 130 1/12
vs.
1/2
1/12 150 ㎕ 1/6 150 300 130 ㎕ 1/12 130 1/24
vs.
1/2
1/24 150 ㎕ 1/12 150 300 130 ㎕ 1/24 130 1/48
vs.
1/2
1/48 150 ㎕ 1/24 150 300 130 ㎕ 1/48 130 1/96
vs.
1/2
1/96 150 ㎕ 1/48 150 300 130 ㎕ 1/96 130 1/192
vs.
1/2
1/192(등.) 150 ㎕ 1/96 150 300 130 ㎕ 1/192 130 1/384
vs.
1/2(등.)
특정 농도의 혈청들(Cytogam) 및 바이러스를 화합하고 37℃에서 1 시간 동안 회전시켰다. 몇몇의 어쎄이에서, 보체를 포함시켰다. 보체 및 HFF 세포를 활용하는 어쎄이에서, 각각의 특정한 혈청들(Cytogam)/바이러스 혼합물에 10% 표준 기니 피그 보체를 추가하였다. 바이러스 컨트롤도 동일한 방식으로 처리하였다. 보체 및 ARPE-19 세포를 활용하는 어쎄이를 위해서, 어떠한 종들을 사용하는지에 관계없이(토끼 또는 혈청들) 2.5% 토끼 보체를 각각의 혼합물에 추가하였다. 상기 혈청 및 바이러스를 37℃에서 1 시간 동안 회전시켰다.95% 융합성 세포(6-웰 플레이트에 시딩된)를 바이러스-혈청들 혼합물의 2중(in duplicate)의 도포(application)에 앞서 온난한 PBS로 조심스럽게 2회 세척하였다. 4 시간 이상의 배양 동안 건조되는 것을 피하기 위하여, 100㎕ 의 혼합물/웰 + 200㎕ 감염 배지를 첨가하였다. 37℃/5% C02에서 4 시간 동안 배양하였다(진동을 매 60분에 행하였다). 4-시간의 배양 이후, 각각의 웰로부터의 내용물을 피펫으로 조심스럽게 빨아내고 3 ml 의 적절하고 새롭고, 온난한 감염성 배지를 추가하였다. 플레이트들을 제대로 감염될 때까지 37℃/5% C02에서 배양하였다. 5 일의 배양 이후, 세포를 바이러스 감염에 대하여 분석하였다. HFF-1 세포의 감염은 세포의 팽윤 및 라운딩으로 결정하고, 빛 현미경 또는 형광 현미경을 이용한 녹색 형광에 의해 보여졌다. ARPE-19 세포 감염은 형광 현미경을 이용한 녹색 형광으로 탐지하였다.
플로우 사이토메트리용 샘플 수집 및 조제
샘플을 모으기 전에, 제대로 된 감염의 존재를, 이용 가능하다면, 세포에 결합된 GFP를 형광 현미경으로 분석함에 의해서 빛 현미경으로 확인하였다. 배지를 각각의 웰로부터 빨아내거나 따랐다. 세포를 PBS (HyClone DPBS/칼슘 및 마그네슘이 없는 변형된 ; Cat#SH30028.02)로 2회 세척하였다. HFF-1 세포에 100㎕ 의 1X Trypsin-EDTA (Sigma; Cat#T4174-100 ml) 와 200㎕ 의 PBS를 추가하였다. ARPE-19 세포에 200㎕ 의 1X Trypsin-EDTA 와 100㎕ 의 PBS를 추가하였다. 세포가 제대로 트립신화될 때까지 C02 인큐베이터에서 2-3 분 동안 보관하였다. 트립신화를 멈추기 위해서, 1 ml/웰의 PBS+5% FBS을 추가하였다. 세포를 투명 플로우 유도 튜브(transparent flow intended tubes)에 모았다(동일 샘플/튜프에 대하여 2개의 ㅇ웰들)(BD Falcon, 5 ml 폴리스티렌 둥근-바닥, REF 352054). 웰을 빛 현미경 하에 보았고, 만약 세포가 남아있다면, 추가적인 세포를 모으기 위하여 추가적인 500㎕ PBS+5% FBS를 첨가하였다.
팔콘 튜브를 900 rpm으로 10 분 동안 스핀다운 하였다. 상청액을 폐기하였고 알갱이는 보관하였다. 상기 튜브를 볼텍싱하여 상기 알갱이가 잔존하는 버퍼에 퍼지게 하였다. 잔여 단계들을 어두운 곳에서 행하였다. 200 ul 사이토픽스(BD Biosciences, BD Cytofix, Fixation 버퍼 Cat#554655 100 ml)를 각각의 튜브에 첨가하였고 샘플들을 얼음통 안에서 15 분 동안 배양하였다. 사이토픽스를 멈추기 위하여 1 ml 의 혼합물 PBS+5% FBS 을 각각의 튜브에 첨가하였다. 튜브를 900 rpm으로 10 분 동안 스핀다운 하였다. 상기 상청액을 따라내었고 알갱이를 보관하였다. 상기 알갱이를 500 ul 의 PBS+5% FBS 에 녹여 환원하였고, 격렬히 볼텍싱하였고, 플로우 사이토메트리를 수행하였다.
실시예 4: 토끼 내 대표적인 VLPs의 중화 활성
CHO 세포를 1.5E06 내지 2.0E06 cells/mL 의 세포 밀도에서 1가의 gB-G 및 1가의 gH-G의 플라스미드들로(PCT/US2012/64556에서 설명된 것과 같이 조제됨) 트랜스펙션하였다. 스터퍼 DNA(Stuffer DNA)를 첨가하여 세포 배양물을 총 DNA의 농도를 1 g/mL 까지 만들었다. 상기 트랜스펙션에 사용된 플라스미드는 먼저 MaxiPrep 또는 GigaPrep 플라스미드 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 트랜스펙션에 있어 DNA를 세포에 전하기 위해 사용된 PEIMAX는 6:1의 비율 (PEL:DNA wt/wt)로 제공하였다. 상기 세포 배양물은 트랜스펙션의 72 시간 후에, Beckman Coulter사의 JS-4.2A 회전자를 이용하여 4000 rpm으로 20 분 동안 원심분리를하여 1 리터 병안에 채취하였다. 상청액은 0.8/0.45㎛ 의 필터(AcroPak 500 Capsule, Pall)를 통해 여과하였다. 상기 여과 상청액을 이후 Tangential Flow Filtration (VLPs의 농축을 위한 TFF)를 이용하여 농축하였고, 히스티딘-함유 버퍼를 철저여과하였다(diafilter). 70ml 의 Benzonase [250 Units/mL을 함유하는 Novogen 99% 순도(D00127703)] 를 MgCl2 가 공급된 400㎕ 의 PBS 에서 부유시켜서(suspended) 2 mM 의 최종농도를 얻었다. TFF 잔류물 부분(retentate portion)을 PBS 용액에서 희석된 Benzonase 와 혼합시켰고, 실온에서 회전자 쉐이커(rotary shaker) [헤드-투-토 회전(head-to-toe rotation)]에 1 시간 동안 보관하였고 이후 상기 튜브를 하룻 밤 동안 4℃ 에 놓았다. 상기 철저여과된 benzonase 처리된 물질은 이후, 통과액이 모아지는 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼 (DNA 및 숙주 단백질의 감소에 대한 AEX)에 로딩하였다. 이후 상기 통과액을 0.45㎛ 을 통해 살균 여과하였고 다른 부피들로 나누었다.
설명된 바와 같이 조제된 1가 gB-G 및 1가 gH-G VLP 조성물을 혼합하고 명반으로 보조하여, 생후 6-8 주의 New Zealand 화이트 암컷 토끼에서 (테스트 그룹 당 최소 5 마리의 동물들) 실시예 3에서 설명된 미중화 어쎄이를 이용하여 중화 활성을 테스트하였다. 토끼들을 근육 내에서 0.5 ml [근위 후단 뒤 넓적 다리 근육(proximal caudal hind thigh muscle)의 두 부분에 각 250 ㎕ 씩]의 VLP 조성물로 0일 차(Prime)에 1 회 번 및 57일 차(8주 차 부스트)에 1 회 및 162일 차(24주 차 부스트)에 1 회, 총 3 회 면역화 하였다. 토끼들은 50 ㎕ 의 1가 gB-G 및 1가 gH-G (1 : 1 비율로 혼합된) VLP 조성물로 처리하였다. 토끼들 내에서 체액성 면역 반응을 산정하기 위하여, 혈액을 모든 토끼들에서 첫번째 면역화 앞 서, 그리고 첫번째 면역화 후 28, 42 및 55 일에, 그리고 두번째 면역화 후 14일 차에 채취하였다.
섬유아세포 내의 HCMV에 대한 중화 항체 반응은 앞서 설명된 바와 같이, GFP-발현 CMV 바이러스(TB40)에 기초한 미중화 어쎄이 및 감염된(GFP+) HFF-1 세포의 플로우 사이토메트리 분석을 이용하여 결정하였다. 설명된 것과 같이 면역화의 이전 및 이후에 모아진 토끼 혈청들을 풀링하고 양성 컨트롤 CMV 하이퍼글로불린, Cytogam™ 및 빈 Gag VLP(empty Gag VLP)(항원 단백질 gB-G 및/또는 gH-G 이 결여된)을 포함하는 음성 컨트롤과 비교하여, 기니 피그 보체의 존재하에 HCMV 발현 GFP에 대한 섬유아세포 내의 중화 활성에 대해 테스트하였다..
도 4는 10% 기니 피그 보체 및 토끼 혈청이 존재하는 중에 CMV- GFP-TB40-010512 바이러스로 배양한 HFF-1 세포의 중화율을 나타낸 것이다(동물이 1가의 gB-G 및 1가의 gH-G VLPs 로 세 번 처리된, 15RA09로부터 그룹 7 풀링된 혈청은 양성 데이터 표본으로 사용하였고, 15RA05 연구(빈 Gag)로부터의 그룹 8 은 음성 컨트롤 표본으로 사용하였다). 도 4에 도시한 바와 같이, 상기 빈 Gag VLP가 어떠한 중화 항체 반응도 나타내지 못한 반면에, 1가 gB-G 및 1가 gH-G VLP 조성물의 조합은 섬유아세포 감염에 대항하여 토끼 내의 급속하고, 시너지적이고 지속적인 중화 항체 반응을 이끌어 내었다("GFP-TB40-010512" 은 2012년 5월 1일에 자란 인간 헤르페스바이러스 5 HCMV (UL32-EGFP-HCMV-TB40) - ATCC# VR-1578 (실시예 3에서 설명됨) 를 나타낸다).
전에 설명된 것과 같이 GFP-발현 HCMV 바이러스 (Towne TS15-rR) 및 감염된 (GFP+) ARPE-19 세포의 플로우 사이토메트리 분석에 기초하여, 미중화 어쎄이를 이용하여 풀링된 토끼 혈청으로 상피 세포 내의 HCMV에 대한 중화 항체 반응을 테스트하였다. 설명된 것과 같이 면역화의 이전 및 이후에 모아진 토끼 혈청들을 풀링하고 양성 컨트롤 CMV 하이퍼글로불린, Cytogam™ 및 빈 Gag VLP(항원 단백질 gB-G 및/또는 gH-G 이 결여된)을 포함하는 음성 컨트롤과 비교하여, 2.5% 토끼 보체의 존재하에 HCMV 발현 GFP에 대한 ARPE-19 상피 세포 내의 중화 활성에 대해 테스트하였다.
도 5는 2.5% 토끼 보체 및 토끼 혈청이 존재하는 중에 CMV- GFP-Towne-150612 바이러스로 배양한 ARPE-19 세포의 중화율을 나타낸 것이다(동물이 1가의 gB-G 및 1가의 gH-G VLPs 로 세 번 처리된, 15RA09로부터 그룹 7 풀링된 혈청은 양성 데이터 표본으로 사용하였고, 15RA05 연구(빈 Gag)로부터의 그룹 8 은 음성 컨트롤 표본으로 사용하였다). 도 5에 도시한 바와 같이, 상기 빈 Gag VLP가 어떠한 중화 항체 반응도 나타내지 못한 반면에, 1가 gB-G 및 1가 gH-G VLP 조성물의 조합은 상피세포 감염에 대항하여 토끼 내의 급속하고, 시너지적이고 지속적인 중화 항체 반응을 이끌어 내었다("GFP-Towne-150612" 은 2012년 6월 25일에 자란 인간 CMV-GFP-Towne TS15-rR (Dr. M. McVoy, VCU-Virginia 에 의해 획득되고, 실시예 3에서 설명되어 있음) 를 나타낸다).
다른 구체예들
본 명세서에 다른 구체예들은, 본 명세서에서 제시하는 상세한 설명 또는 구현으로부터 당 분야의 통상 기술자에 의해 자명할 것이다. 본 명세서의 상세한 설명 및 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 진정한 범위는 수반하는 청구항들에 의해 나타내어 지는 것이다. 본 명세서에서 언급한 모든 참조문헌들의 인용 내용들은 그 전체가 본 명세서에 통합되는 것이다.

Claims (32)

  1. (i) 인간사이토메갈로바이러스(HCMV) 백신 후보(candidate vaccine)로 면역화된 대상에서 유래한 열-불활성화(heat-inactivated) 혈청을, gH/gL/gO 복합체의 일부 또는 전부를 포함하며 형광 모이어티를 포함하는 HCMV와 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;
    (ii) 상기 단계(i)의 혼합물에 기니 피그 보체(guinea pig complement)를 추가하는 단계;
    (iii) 감염을 허용하는 조건하에, HCMV에 의해 감염될 수 있는, 인간 포피 섬유아세포 (human foreskin fibroblast cell)인 숙주 세포를 상기 단계(ii)의 기니 피그 보체 존재하의 상기 혼합물과 접촉시키는 단계;
    (iv) 상기 혼합물과 접촉된 상기 숙주 세포의 형광 레벨을 플로우 사이토메트리(flow cytometry)로 산정하는 단계; 및
    (v) 상기 산정된 형광 레벨에 기초하여 상기 숙주 세포의 감염 레벨을 결정하는 단계;를 포함하여 구성되는, HCMV 감염 레벨 결정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계(ii)가, 10% 기니 피그 보체를 추가하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인간 포피 섬유아세포가 HFF-1세포인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 면역화된 대상이 인간인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 혈청이 항-HCMV 중화 항체를 포함하여 구성되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 HCMV 백신 후보가 바이러스유사입자들(VLPs)을 포함하여 구성되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 VLPs가 HCMV로부터의 gB, gH, gH-G, gB-G 및 pp65 중 하나 이상을 포함하여 구성되는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 형광 모이어티가 형광 단백질인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형광 단백질이 녹색형광단백질(GFP), 청색형광단백질(BFP), 청록색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP), 및 이들의 조합들로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 형광 단백질이 녹색형광단백질인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 형광 모이어티 함유 HCMV가 TB40-GFP 균주 바이러스인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 형광 모이어티 함유 HCMV가 AD 169-GFP 균주 바이러스인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 형광 모이어티 함유 HCMV가 CMV-GFP-Towne 균주 바이러스인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 CMV-GFP-Towne 균주가 TS15-rR인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 단계(iii) 전에, 단계(ii)의 보체 존재하의 상기 혼합물을 적어도 15 분 동안 배양하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 단계(iii) 전에, 단계(ii)의 보체 존재하의 상기 혼합물을 적어도 1 시간 동안 선-배양하여 항체를 중화시키는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 단계(iv)가 고 스룻풋 방식(high throughput manner)으로 수행되는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 단계(iv)가 상기 숙주 세포의 형광 레벨을 레퍼런스(reference)와 비교하는 것을 포함하여 구성되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 레퍼런스가 미리 결정된 레퍼런스(predetermined reference)인, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 레퍼런스가 양성 또는 음성 콘트롤(positive or negative control)인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정 단계에 기초하여 상기 혈청내 항-HCMV 중화 항체 역가를 결정하는 것을 더 포함하여 구성되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 결정 단계에 기초하여 상기 HCMV 백신 후보의 효험을 평가하는 것을 더 포함하여 구성되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 혼합물과 접촉된 상기 숙주 세포의 형광 레벨이 레퍼런스 형광 레벨보다 낮을 때, 상기 후보 HCMV 백신을 중화 항체를 유도하는 백신으로 선정하는 단계를 더 포함하여 구성되는, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 단계(iii)가 적어도 1 시간의 배양을 포함하여 구성되는, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 단계(iii)가 적어도 4 시간의 배양을 포함하여 구성되는, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포가 가시 세포 형태 평가 또는 가시 형광 평가에 의해 감염이 더 모니터되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 가시 세포 형태 평가가 세포 팽윤 및 라운딩을 모니터하는 것을 포함하여 구성되는, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 가시 형광 평가가 형광을 탐지하는 것을 포함하여 구성되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 형광이 형광 현미경에서 탐지되는, 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포의 핵의 형광 레벨이 산정되는, 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포 전체의 형광 레벨이 산정되는, 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포의 형광 레벨을 정량하는 단계를 더 포함하여 구성되는, 방법.
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