JP2023546299A - ハイブリッドアルファウイルス－ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２粒子ならびにその作製方法および使用方法 - Google Patents

ハイブリッドアルファウイルス－ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２粒子ならびにその作製方法および使用方法 Download PDF

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Abstract

ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックを制御するためには、ワクチンおよび抗ウイルス薬のタイムリーな開発が重要である。ワクチン誘導性中和抗体を定量化するための現在の方法には、シュードウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓ）シュードタイプ化レンチウイルスの使用が含まれる。しかしながら、これらのシュードウイルスには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にとって外来の構造タンパク質が含まれており、感染してレポーター遺伝子を発現するのに数日が必要となる。ここで、本願は、中和抗体およびウイルスバリアントを迅速かつ正確に定量化するための新しいハイブリッドアルファウイルス－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｈａ－ＣｏＶ－２）粒子を作製および使用するための組成物および方法論を開示している。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１０月２０日に出願された米国仮出願第６３／０９４，０２９号、２０２０年１１月２７日に出願された米国仮出願第６３／１１８，７８７号、および２０２１年５月３日に出願された米国仮出願第６３／１８３，１８９号の優先的利益を主張し、各出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
導入部
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、急速に蔓延している新型のベータコロナウイルスで、現在進行中のコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の世界的規模のパンデミックを引き起こしている（文献１７－２１）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０２１年４月現在、世界で１億４，０００万人を超える感染者および３００万人を超える死者を発生させている。パンデミックと闘うためには、抗ウイルス薬および中和抗体が有効である。特に、ワクチンまたはウイルスによって誘導される中和抗体は、感染の制御および予防に重要な役割を果たす可能性がある。現在、ＦＤＡが承認した薬物は、入院期間を短縮できるレムデシビル１つだけである（文献１）。最近、幾つかのワクチンが、第ＩＩＩ相臨床試験で有意な結果を示し（文献２－６）、緊急使用のために承認されており、１つのワクチンは２０２１年８月の時点でＦＤＡの完全承認を取得している。とはいえ、ワクチンの有効性については、進化するウイルスバリアントに対する中和抗体の誘導を継続的に監視する必要がある。
現在の抗ウイルス薬のスクリーニングおよび中和抗体の定量化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルスの使用に依存している（文献７－１４）。生きたウイルスを使用するには、バイオセーフティレベル（ＢＳＬ）３の施設および実践が必要であり、一般的な研究室での大規模な試験および解析には限界がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルスと水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）とのいずれも、細胞ベースの中和アッセイおよび抗ウイルス薬のスクリーニングに使用されている８－１１。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２には、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）の４種の構造タンパク質が含まれている（文献２２、２３）。Ｓは、ウイルスの付着および標的細胞への侵入を担う主要なウイルスタンパク質であり（文献２４、２６）、ひいてはシュードタイプのウイルスによく使用される。とはいえ、ＶＳＶベースのシュードウイルス粒子とレンチウイルスベースのシュードウイルス粒子とのいずれにもＳタンパク質のみが含まれており、主要なウイルスの構造成分はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とは異なっているため、受容体結合および抗体中和に対する応答におけるビリオンの性質に影響を及ぼす可能性がある（文献１５）。加えて、ＶＳＶベースのシュードウイルスの重要な問題は、残留ＶＳＶウイルスの存在であり、これにより、高い割合で偽陽性の結果が生じる可能性がある（文献２７）。さらに、中和アッセイにレンチシュードタイプウイルスを使用するには時間がかかり、感染してレポーターシグナルを生成するのに２～３日を要する（文献７－１１）。
概要
一態様では、ａ）アルファウイルスに由来するＲＮＡゲノムと、ｂ）少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質とを含むハイブリッド粒子であって、前記構造タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）を含む、ハイブリッド粒子が存在する。
一実施形態では、ハイブリッド粒子は、非複製型の粒子である。
別の実施形態では、アルファウイルスに由来するＲＮＡゲノムは、レポーター遺伝子または目的遺伝子を含む。更なる実施形態では、レポーター遺伝子は、ＧＦＰ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子を含む。
別の実施形態では、ＲＮＡゲノムは、ａ）５’非翻訳領域と、ｂ）非構造タンパク質（ｎｓｐ）１～４をコードするオープンリーディングフレームと、ｃ）レポーター遺伝子または目的遺伝子と、ｄ）３’非翻訳領域と、ｅ）ポリ（Ａ）テールとを含む。更なる実施形態では、ＲＮＡゲノムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナルを含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナルは、レポーター遺伝子の下流にある。
別の実施形態では、ハイブリッド粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。
別の実施形態では、ハイブリッド粒子は、ＡＣＥ２を発現する細胞を標的とする。
別の実施形態では、ハイブリッド粒子は、２種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質を含み、前記構造タンパク質は、ＳおよびＥを含む。
別の実施形態では、ハイブリッド粒子は、４種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質を含み、前記構造タンパク質は、Ｓ、Ｅ、ＭおよびＮを含む。更なる実施形態では、ハイブリッド粒子は、ＩＣ５０値とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とで直接的な相関関係を有する。
別の態様では、（ａ）少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質をコードする第１のベクターと、アルファウイルスに由来するＲＮＡゲノムを含む第２のベクターとをコトランスフェクションすることであって、アルファウイルスＲＮＡゲノムは、（ｉ）５’末端のＤＮＡプロモーターと、（ｉｉ）第１の非翻訳領域と、（ｉｉｉ）アルファウイルスからの非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、（ｉｖ）レポーター遺伝子と、（ｖ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナル配列と、（ｖｉ）ウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターと、（ｖｉｉ）目的遺伝子と、（ｖｉｉｉ）第２の非翻訳領域と、（ｉｘ）ポリＡテールとを含む、コトランスフェクションすることと、（ｂ）ハイブリッド粒子を生成することであって、ハイブリッド粒子は、アルファウイルスＲＮＡゲノムと、少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質とを含む、生成することとを含む、方法が存在する。
一実施形態では、本方法は、ハイブリッド粒子を標的細胞に感染させることであって、前記標的細胞はＡＣＥ２を発現する、感染させることをさらに含む。
別の実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、感染の検出および定量化を容易にするシグナルを生成することができる。更なる実施形態では、シグナルは、ハイブリッド粒子による感染後、約２時間～約７２時間後に読み取られる。
別の態様では、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する対象の抗体応答を検出するための方法であって、ａ）前記対象からの血清試料をハイブリッド粒子とインキュベートすることと、ｂ）インキュベートしたハイブリッド粒子を、ＡＣＥ２を含む細胞に導入することと、ｃ）前記細胞内でのレポーター遺伝子の発現を検出することであって、レポーター遺伝子の発現は、対象が、細胞のウイルス感染を阻止する中和抗体を持たないことを示し、レポーター遺伝子の無発現は、対象が、細胞のウイルス感染を阻止する抗体を持つことを示す、検出することとを含む、方法が存在する。
一実施形態では、本方法は、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する中和抗体を有しない対象に、抗体、ワクチン、または処置を投与することをさらに含む。
別の実施形態では、組成物は、少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質を有するハイブリッド粒子を含み、前記構造タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）である。更なる実施形態では、本組成物は、免疫応答を開始することができるワクチンまたは粒子である。
別の実施形態では、組成物は、４種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質を含むハイブリッド粒子を含み、前記構造タンパク質は、Ｓ、Ｅ、ＭおよびＮを含む。更なる実施形態では、組成物は、免疫応答を開始させることができるワクチンまたは粒子である。
別の実施形態では、組成物は、ハイブリッド粒子を含み、前記組成物は、免疫応答を開始させることができるワクチンまたは粒子である。
別の態様では、ハイブリッドベクターは、（ｉ）５’末端のＤＮＡプロモーターと、（ｉｉ）５’末端の第１の非翻訳領域と、（ｉｉｉ）アルファウイルスからの非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、（ｉｖ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナル配列と、（ｖ）ウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターと、（ｖｉ）目的遺伝子と、（ｖｉｉ）３’末端の第２の非翻訳領域と、（ｖｉｉｉ）３’末端のポリＡテールとを含む。幾つかの実施形態では、ハイブリッドベクターは、レポーター遺伝子をさらに含む。幾つかの実施形態では、非構造タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼと関連因子とを含む。幾つかの実施形態では、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルスを含む。幾つかの実施形態では、ハイブリッドベクターは、細胞内で導入遺伝子を発現するように構成される。幾つかの実施形態では、ハイブリッドベクターは、抗ウイルス薬、抗体および／または抗ウイルスタンパク質のスクリーニングを容易にするように構成される。
幾つかの実施形態では、方法は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造成分をコードする第１のベクターと、プラス鎖ＲＮＡウイルスからのレプリコンベクターまたはアルファウイルスレプリコンベクターまたはハイブリッドベクターを含む第２のベクターとをコトランスフェクションすることを含む。ハイブリッドベクターは、（ｉ）５’末端のＤＮＡプロモーターと、（ｉｉ）第１の非翻訳領域と、（ｉｉｉ）アルファウイルスからの非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、（ｉｖ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナル配列と、（ｖ）ウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターと、（ｖｉ）目的遺伝子と、（ｖｉｉ）第２の非翻訳領域と、（ｖｉｉｉ）ポリＡテールとを含む。本方法はまた、ハイブリッドアルファウイルス－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＨＡＶＳ）粒子を生成し、ＨＡＶＳ粒子は、アルファウイルスＲＮＡゲノムとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの構造成分とを含む。幾つかの実施形態では、構造成分は、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）およびエンベロープタンパク質（Ｅ）から選択される少なくとも１つを含む。幾つかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンベクターおよびハイブリッドベクターおよびプラス鎖ＲＮＡからのレプリコンベクターは、レポーター遺伝子をさらに含む。幾つかの実施形態では、非構造タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼと関連因子とを含む。幾つかの実施形態では、ＨＡＶＳ粒子は、標的細胞に感染させるように構成され、標的細胞は、ＡＣＥ２を発現する。幾つかの実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、感染の検出および定量化を容易にするシグナルを生成するように構成される。
幾つかの実施形態では、シグナルは、ＨＡＶＳ粒子による感染の２～７２時間後に読み取られる。幾つかの実施形態では、本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス侵入阻害剤および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和抗体および／または抗ウイルス薬に対するスクリーニングおよび／または抗ウイルスタンパク質に対するスクリーニングを試験するように構成される。幾つかの実施形態では、ウイルス侵入阻害剤は、アルビドールを含む。
幾つかの実施形態では、アルファウイルスＲＮＡゲノムとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの構造成分とを含むハイブリッドアルファウイルス－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＨＡＶＳ）粒子を含む生成物が存在する。幾つかの実施形態では、ＨＡＶＳ粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造成分をコードする第１のベクターと、プラス鎖ＲＮＡウイルスからのレプリコンベクターまたはアルファウイルスレプリコンベクターまたはハイブリッドベクターを含む第２のベクターとのコトランスフェクションによって形成され、ハイブリッドベクターは、：（ｉ）５’末端のＤＮＡプロモーターと、（ｉｉ）５’末端の第１の非翻訳領域と、（ｉｉｉ）アルファウイルスからの非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、（ｉｖ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナル配列と、（ｖ）ウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターと、（ｖｉ）目的遺伝子と、（ｖｉｉ）３’末端の第２の非翻訳領域と、（ｖｉｉｉ）３’末端のポリＡテールとを含み、ＨＡＶＳ粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス侵入阻害剤および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和抗体を識別するように構成される。幾つかの実施形態では、ハイブリッドベクターおよびアルファウイルスレプリコンベクターおよびプラス鎖ＲＮＡからのレプリコンベクターは、レポーター遺伝子をさらに含む。幾つかの実施形態では、レポーター遺伝子は、ＨＡＶＳ粒子によって引き起こされる感染の検出および定量化を容易にするシグナルを生成するように構成される。幾つかの実施形態では、構造成分は、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）およびエンベロープタンパク質（Ｅ）から選択される少なくとも１つを含む。
当該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶＬＰパッケージレプリコンは、ウイルス様粒子およびナノ粒子ベースの技術分野における大幅な進歩である。これらのハイブリッドＶＬＰは、新薬およびワクチン開発のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染をモデル化する上で特に有用である。これは、コロナウイルスの感染経路をモデル化する上で大きな進歩であり、他のウイルスファミリーにも容易に適用できる可能性がある。これはまた、輸送されたレプリコンが自然免疫応答を刺激し、目的遺伝子が標的抗原を産生することができるため、免疫療法およびワクチン開発における進歩でもある。
ハイブリッドアルファウイルスレプリコンＶＬＰは、新規な創薬および抗体中和アッセイに最適なモデルである。この粒子は安価に製造することができ、ウイルス侵入阻害剤の迅速な評価に使用することができる。ＶＬＰは、創薬に取り組んでいる研究室に直接販売することができる。
Ｈａ－ＣｏＶ－２ベクターの設計を示す図である。 ＨＡ－ＣｏＶ－２粒子をウェスタンブロットで解析した図である。 ＨＡ－ＣｏＶ－２粒子をウェスタンブロットで解析した図である。 ＨＡ－ＣｏＶ－２粒子をウェスタンブロットで解析した図である。 ＨＡ－ＣｏＶ－２粒子をウェスタンブロットで解析した図である。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質およびＨａ－ＣｏＶ－２による標的細胞のＡＣＥ２依存性感染を示す図である。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）による標的細胞のＡＣＥ２依存性感染を示す図である。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）による標的細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質依存性感染を示す図である。 ルシフェラーゼ発現を定量化した図を示す。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）感染におけるレポーター遺伝子発現の迅速な経時変化を示す図である。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓシュードタイプ化レンチウイルスとＨａ－ＣｏＶ－２粒子との比較を示す図である。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓシュードタイプ化レンチウイルスとＨａ－ＣｏＶ－２粒子との比較を示す図である。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓシュードタイプ化レンチウイルスとＨａ－ＣｏＶ－２粒子との比較を示す図である。 感染経時変化におけるシュードレンチウイルスとＨａ－ＣｏＶ－２との比較を示す図である。 Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子による中和抗体の定量化を示す図である。 抗血清１Ｆの定量化を示す図である。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で定量化された血清中和活性の相関関係を示す図である。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で定量化された血清中和活性の相関関係を示す図である。 アルビドールの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性の迅速定量化を示す図である。 アルビドールのＭＴＴ細胞毒性アッセイを示す図である。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）粒子を集合させ、ビリオンへのＳおよびＮの取り込みについて解析した図を示す。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）粒子を集合させ、ビリオンへのＳおよびＮの取り込みについて解析した図を示す。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）（Ｇ６１４）またはＨａ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４）を用いて標的細胞を感染させ、５時間後にＬｕｃ発現を定量化した図である。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）バリアントの相対的な感染力を示す図である。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）およびそのバリアントに対する抗血清の定量化を示す図である。 Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）およびそのバリアントに対する抗血清の定量化を示す図である。 第１世代および第２世代レプリコンを示す図である。
図１：Ｈａ－Ｃｏｖ－２粒子の設計および集合。（Ａ）Ｈａ－ＣｏＶ－２ベクターの設計を示す図である。ベクターには、Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子にパッケージされる全長ウイルスＲＮＡゲノムを転写するＲＳＶプロモーターが含まれている。５’非翻訳領域に続いて、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）からの非構造タンパク質（ｎｓｐ）１～４をコードするオープンリーディングフレーム、ＬｕｃおよびＧＦＰレポーター発現用のウイルスサブゲノムプロモーター、３’非翻訳領域および肝炎デルタウイルスリボザイム（ＲＺ）によって自己切断されるポリ（Ａ）テールが示されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパッケージングシグナルは、３’非翻訳領域の前に挿入されている。ウイルス粒子を集合させるために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｈａ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の４種の構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＥおよびＮ）を発現するベクターとをコトランスフェクションさせた。上清中のＨＡ－ＣｏＶ２粒子を４８時間で採取し、精製、溶解し、次いでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質に対する抗体を用いてウェスタンブロットで解析した（Ｂ）。対照は、Ｈａ－ＣｏＶ－２ベクター単独でトランスフェクションした細胞からの上清である。（ＣおよびＤ）ＦＡＬＧタグ付きＭおよびＮを用いて粒子も集合させた。粒子は、ＦＬＡＧに対する抗体を用いたウェスタンブロットで解析した。（Ｅ）抗Ｓ抗体を結合させた磁気ビーズで上清中の粒子も捕捉し、次いで粒子中のＦＬＡＧタグ付きＭタンパク質について再度ＦＬＡＧに対する抗体を用いてウェスタンブロットで解析した。
図２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質およびＨａ－ＣｏＶ－２による標的細胞のＡＣＥ２依存性感染。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）細胞にＨａ－ＣｏＶ－２（ＧＦＰ）粒子を感染させた。感染後４８時間でＧＦＰの発現が観察された。（Ｂ）Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）による標的細胞のＡＣＥ２依存性感染。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）粒子を感染させた。ルシフェラーゼ発現を、感染してから２４時間後に定量化した。（Ｃ）Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）による標的細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質依存性感染。ＳまたはＭ＋Ｅ＋Ｎの存在下または非存在下で粒子を集合させた。ルシフェラーゼ発現を、感染してから４時間後に定量化した。（Ｄ）Ｈａ－ＣｏＶ（Ｌｕｃ）の最適な感染力のためのＭ、ＥおよびＮの要件。Ｓと、Ｍ、ＥおよびＮの個々のタンパク質の組み合わせとの存在下で粒子を集合させ、ルシフェラーゼ発現を定量化した。（Ｂ）～（Ｄ）のアッセイを３連で行った。
図３：Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）感染におけるレポーター遺伝子発現の迅速な経時変化。Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）粒子によるＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）細胞の感染後のルシフェラーゼ発現の６時間の経時変化。細胞にＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）を２時間感染させ、洗浄し、新鮮な培地で培養し、次いで溶解して異なる時点でのＬｕｃ発現を解析した。細胞へのウイルスの添加を時間「０」と定義した。感染アッセイは３連で行った。
図４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓシュードタイプ化レンチウイルスとＨａ－ＣｏＶ－２粒子との比較。（Ａ～Ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）およびＣａｌｕ－３細胞に、等量のウイルス粒子、レンチ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）またはＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）を感染させた。感染してから７２時間後にルシフェラーゼアッセイによって相対的な感染を定量化した。初代サル腎臓細胞も比較のためにＨａ－ＣｏＶ－２で感染させた。（Ｄ）感染経時変化におけるシュードレンチウイルスとＨａ－ＣｏＶ－２との比較。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）に、等量のウイルス粒子、レンチ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）またはＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）を感染させた。相対的なＬｕｃレポーター発現を、感染してから２時間～２４時間後にルシフェラーゼアッセイによって定量化した。すべての感染アッセイを３連で行った。
図５：中和抗体の迅速なスクリーニングおよび定量化のためのＨａ－ＣｏＶ－２粒子の検証。（Ａ）Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子による中和抗体の定量化。抗血清１ＦによるＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）の濃度依存的阻害と１Ｆ阻害曲線とが示されている。１Ｆを連続希釈し、Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）粒子と３７℃で１時間インキュベートした。Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）－抗体複合体を用いてＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）細胞を感染させた。中和活性は、細胞にウイルスを添加してから５時間後にルシフェラーゼアッセイによって定量化した。対照血清は、健康で、感染していないドナーからのものであった。ＩＣ５０は、血清濃度に対する感染の相対的割合を用いて算出した。（Ｂ）比較のため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質シュードタイプ化レンチウイルス、レンチ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）を用いて、抗血清１Ｆも同様に定量化した。中和活性は、感染してから７２時間後にルシフェラーゼアッセイによって定量化した。（ＣおよびＤ）Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で定量化された血清中和活性の相関関係。１９人のドナーからの回復期血漿を、感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびプラークアッセイ、またはＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）を用いて定量化した。中和活性をプロットし、ＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０における相関関係をプロットした。（ＥおよびＦ）アルビドールの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性の迅速定量化。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）細胞をアルビドールで１時間前処理した。アルビドールの存在下でＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）を細胞に感染させた。ウイルス侵入阻害は、５時間後にルシフェラーゼアッセイによって定量化した。アルビドールのＭＴＴ細胞毒性アッセイも細胞に対して行った（Ｆ）。
図６：Ｈａ－ＣｏＶ－２バリアントの相対的な感染力の定量化および中和抗体に対するそれらの応答。（ＡおよびＢ）Ｇ６１４突然変異Ｓまたは親Ｄ６１４Ｓを有するＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）粒子を集合させ、ビリオンへのＳおよびＮの取り込みについて解析した。（Ｃ）Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）（Ｇ６１４）またはＨａ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４）を用いて標的細胞を感染させ、５時間後にＬｕｃ発現を定量化した。感染には同レベルのウイルス粒子を使用した。感染アッセイを３連で行った。（Ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントからの９種のＳタンパク質変異体のパネルを用いてＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）粒子を集合させ、次いで標的細胞への感染に使用した。相対的な感染力を定量化し、個々のＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）バリアントのゲノムＲＮＡコピーで正規化した。ＷＴは、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に由来するＨａ－ＣｏＶ－２を指す。感染アッセイを３連で行った。（ＥおよびＦ）Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）およびそのバリアントに対する抗血清の定量化。感染した血液ドナーからの回復期血漿を、１用量ワクチン接種の前後に、Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）感染の阻害について定量化した。中和活性は、感染してから１２時間後にルシフェラーゼアッセイによって定量化した。ＩＣ５０は、血清濃度（Ｅ）に対する感染の相対的割合を用いて算出した。ワクチン接種後の抗血清も同様に、Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）バリアントの阻害について定量化した（Ｆ）。
図７：第１世代および第２世代レプリコン。（Ａ）複数の目的遺伝子を有する第１世代のＳＦＶレプリコン。セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）に由来する単一サイクルアルファウイルスレプリコンの第１世代を示す。（Ｂ）ＶＬＰのパフォーマンスを高めるためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のパッケージングシグナルを有する第２世代。生成された第２世代のＳＦＶレプリコンには、ＶＬＰを強化し、空粒子の量を減らすためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナルが含まれる。
詳細な説明
ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックを制御するためには、ワクチンおよび抗ウイルス薬のタイムリーな開発が重要である１－６。ワクチン誘導性中和抗体を定量化するための現在の方法には、シュードウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓ）シュードタイプ化レンチウイルスの使用が含まれる７－１４。しかしながら、これらのシュードウイルスには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にとって外来の構造タンパク質が含まれており、感染してレポーター遺伝子を発現するのに数日が必要となる１５。
以下に説明するように、本願は、中和抗体および抗ウイルス薬を迅速に定量化するための新しいハイブリッドアルファウイルス－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子（Ｈａ－ＣｏＶ－２）を作製および使用するための方法論を開示している。Ｈａ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの１つ以上の本物のウイルス構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＮおよびＥ）を含む非複製型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子である。Ｈａ－ＣｏＶ－２にはまた、アルファウイルスベースのベクターに由来するゲノムが含まれており１６，２８、ウイルス侵入後数時間以内に迅速かつ強固にレポーター遺伝子を発現することができる２８。さらに、以下に詳述するように、Ｈａ－ＣｏＶ－２は、中和抗体、ウイルスバリアントおよび抗ウイルス薬の迅速な定量化のための堅牢なプラットフォームとして使用することができる。
本発明者らは、中和抗体およびウイルスバリアントを迅速かつ正確に定量化するための新しいハイブリッドアルファウイルス－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｈａ－ＣｏＶ－２）粒子を提供する。Ｈａ－ＣｏＶ－２は、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＮおよびＥ）と、高速発現アルファウイルスベクターに由来するＲＮＡゲノムとを含む非複製型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子である１６。Ｈａ－ＣｏＶ－２は、レポーター遺伝子、例えばＧＦＰまたはルシフェラーゼをコードする遺伝子を３～６時間以内に標的細胞で迅速かつ強固に発現することができる。さらに、Ｈａ－ＣｏＶ－２は、中和抗体、ウイルスバリアントおよび抗ウイルス薬の迅速な定量化のためのプラットフォームを提供する。加えて、概念実証として、本発明者らは、１０種のＨａ－ＣｏＶ－２バリアント分離株のパネル（Ｄ６１４Ｇ、Ｐ．１、Ｂ．１．１．２０７、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．４２９、Ｂ．１．２５８、Ｂ．１．４９４、Ｂ．１．２、Ｂ．１．１２９８）の相対的な感染力を集めて比較し、これらのバリアントが概して２～１０倍高い感染性を持つことを実証した。さらに、感染しワクチン接種を受けた個体からの抗血清を定量化することによって、モデルナｍＲＮＡ－１２７３の１回ワクチン接種で抗血清力価が約６倍と大幅に増加した。また、ワクチン接種後の血清は、試験した９種のバリアントすべてに対してさまざまな中和活性を示した。
これらの結果は、Ｈａ－ＣｏＶ－２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびそのバリアントに対する中和抗体の迅速な定量化のための堅牢なプラットフォームとして使用できることを実証した。
本組成物および方法論は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、別段の指示がない限り、本明細書を通じて引用および議論されるさまざまな一般的およびより具体的な文献に記載されているように行われる。本明細書の実施形態、および本明細書に記載される他の関連分野に関連して使用される名称、手順および技術は、当該技術分野において周知であり、よく使用されるものである。
本明細書で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２）」という用語は、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの原因となる呼吸器疾患であるコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こすコロナウイルスの株を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトに感染するプラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。
本明細書で使用される「アルファウイルス」は、トガウイルス科の３０種を超えるウイルスの属を指し、節足動物、特に蚊によって伝播される、脂質エンベロープ型のプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、これには、マヤロウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアおよびウマ脳炎の原因物質が含まれる。本願は、本ハイブリッドＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベクターの骨格としてアルファウイルスレプリコンを開示しているが、３種の門（キトリノウイルス門（Ｋｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｃｏｔａ，）、レナルウイルス門（Ｌｅｎａｒｖｉｒｉｃｏｔａ）、ピスウイルス門（Ｐｉｓｕｖｉｒｉｃｏｔａ））の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスからのレプリコンを使用することができる。
本明細書で使用される「ワクチン」は、投与すると活性免疫を生じ、それらのウイルスもしくは細菌または関連するウイルスもしくは細菌に対する保護を提供する、ウイルスまたは細菌に由来する抗原の懸濁液を指す。
本明細書で使用される「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、ウイルスによく似ているが、ウイルス遺伝物質を含まないため非感染性である分子を指す。ＶＬＰは、天然に存在するものであっても、ウイルス構造タンパク質を個別に発現することにより合成したものであってもよく、次いで自己集合してウイルス様構造になることができる。異なるウイルスの構造カプシドタンパク質を組み合わせて、組み換えＶＬＰを作り出すことができる。
本明細書で使用される場合、「ハイブリッド粒子」は、野生型ウイルスによく似ている少なくとも１つの構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＮおよびＥ）を有するハイブリッドアルファウイルス－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスベクター（Ｈａ－ＣｏＶ－２）を指す。本願を通じて使用されるように、ハイブリッド粒子は、ハイブリッドアルファウイルス－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベクター（ＨＡＶＳ）またはＨａ－ＣｏＶ－２と互換的に使用され、３つの用語は同義であり、同じハイブリッド粒子を意味する。一実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１種の構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＥおよびＮ）のみを含み得る。他の実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２種以上の構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＥおよびＮ）を含み得る。さらに他の実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３種以上の構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＥおよびＮ）を含み得る。ハイブリッド粒子はまた、数時間以内にレポーター遺伝子を迅速に発現することができるアルファウイルスに由来するレポーター（ＧＦＰまたはＬｕｃ）レプリコンを含み得る。幾つかの実施形態では、ハイブリッド粒子は、感染した標的細胞内で高レベルの導入遺伝子を発現することができ、それによって、感染力を追跡するための新規なプラットフォームを提供し、抗ウイルス薬および中和抗体の迅速なスクリーニングを容易にし、さらにはワクチンなどの新しい組成物を提供する。
「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質」は、成熟して集合したウイルス粒子の構成要素であるウイルスタンパク質を指す。それらには、ヌクレオカプシドのコアタンパク質（ｇａｇタンパク質）、ウイルス粒子内にパッケージされた酵素（ｐｏｌタンパク質）および膜成分（ｅｎｖタンパク質）などが含まれ得る。これに関連して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は４種類の構造タンパク質、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）タンパク質およびヌクレオカプシド（Ｎ）を有している。
本明細書で使用される「レンチウイルス」という用語は、ヒトおよび他の哺乳類種において、長い潜伏期間を特徴とする慢性および致命的な疾患を引き起こすレトロウイルスの属として定義される。最もよく知られているレンチウイルスは、エイズを引き起こすヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。レンチウイルスはまた、類人猿、ウシ、ヤギ、ウマ、ネコ、ヒツジにも宿主としてある。最近では、サル、キツネザル、マレーヒヨケザル（真のキツネザルでも霊長類でもない）、ウサギおよびフェレットでもレンチウイルスが見つけられている。レンチウイルスおよびその宿主は世界中に分布している。レンチウイルスは、相当量のウイルスｃＤＮＡを宿主細胞のＤＮＡに組み込むことができ、非分裂細胞に効率よく感染することができるため、遺伝子導入の最も効率的な方法の１つである。
本明細書で使用される「ＡＣＥ２受容体」は、アンジオテンシン変換酵素２を指し、大きめのタンパク質であるアンジオテンシノーゲンを切断して小さなタンパク質を生成し、次いで細胞内で機能を制御し続ける酵素である。ＡＣＥ２は、肺、心臓、血管、腎臓、肝臓および消化管を含む、多くの細胞型および組織に存在する。これは、特定の組織の内側を覆い、保護バリアを作り出す上皮細胞に存在する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、表面のスパイク状タンパク質を使用して、細胞に侵入して感染する前に鍵穴に差し込まれる鍵のようにＡＣＥ２に結合する。したがって、ＡＣＥ２は細胞の出入口として、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスの受容体として機能する。
本明細書で使用される「ＴＭＰＲＳＳ２」は、膜貫通型プロテアーゼ、セリン２を指し、ヒトではＴＭＰＲＳＳ２遺伝子によってコードされる酵素である。幾つかのコロナウイルス、例えば、２００３年のＳＡＲＳコロナウイルスとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とのいずれも、ＴＭＰＲＳＳ２によって活性化され、ひいてはＴＭＰＲＳＳ２阻害剤によって阻害されることができる。「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、侵入にＳＡＲＳ－ＣｏＶ受容体ＡＣＥ２を用い、Ｓタンパク質のプライミングにセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２を用いる。
Ａ．ハイブリッドアルファウイルス－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子
本発明者らは、中和抗体および抗ウイルス薬のスクリーニング評価のための迅速な細胞ベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染システムを確立するために、標的細胞でレポーター遺伝子を迅速に発現するためのアルファウイルスベースのＲＮＡゲノムを封入した新しいハイブリッドアルファウイルス－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子（図１Ａ）を開発した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の創薬およびワクチン開発には、シュードウイルスおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）が広く使用されている。シュードウイルス、例えばレンチウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスに由来するものなどは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入プロセスを模倣することができる。しかしながら、構造的にはＳＡＲＡ－ＣｏＶ－２とは大きく異なり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ、ＥおよびＮによって提供される構造要素が欠如している。ＶＬＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子によく似ているが、ＶＬＰには、標的細胞内でのレポーター発現のためのゲノムは含まれていない（文献３５）。
以下、本発明者らは、構造的にはＶＬＰであるが、標的細胞に侵入してレポーター遺伝子を発現するシュードウイルスの能力を有する新規なハイブリッドシステム、Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子の開発および検証について説明する。Ｈａ－ＣｏＶ－２のゲノムはアルファウイルスに由来しており、ウイルス侵入後数時間以内にレポーター発現を迅速かつ強固に定量化することが可能である。以下に説明するように、Ｈａ－ＣｏＶ－２は、中和抗体、ウイルスバリアントおよび抗ウイルス薬の迅速なスクリーニングおよび定量化に使用できることが実証された。
一実施形態では、ゲノムＲＮＡは、５’非翻訳領域と、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）に由来する非構造タンパク質（ｎｓｐ）１～４（ｎｓｐ１～４）をコードするオープンリーディングフレームとからなり（文献１６、２９）、ｎｓｐｌ－４を含めることで、細胞におけるＲＮＡゲノムの自己増幅が可能となる。ＲＮＡゲノムには、レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ）の発現のためのウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターも含まれている。ゲノムの３’末端には、ＳＦＶの３’非翻訳領域とＲＮＡの安定化に用いられるポリ（Ａ）テールとが含まれている。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質ＮによるＲＮＡパッケージングを促進するために、レポーター遺伝子の下流に推定ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナルが挿入された。
ウイルス粒子を集合させるために、ＤＮＡベクターであるＨａ－ＣｏＶ－２を使用してゲノムＲＮＡを発現した。Ｈａ－ＣｏＶ－２ベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＥおよびＮ）を発現するベクターとＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でコトランスフェクションした（図１Ａ）。コトランスフェクションから４８時間後にウイルス粒子を採取し、ビリオンの感染力と標的細胞内でのレポーター遺伝子の発現能力とを試験した。
まず、Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質の存在を確認するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に対する抗体を用いて、精製粒子のウェスタンブロットを行ったところ、Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子にＳの存在が検出された（図１Ｂ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の他の構造タンパク質の存在をさらに調べるために、ＦＬＡＧタグ付きＭおよびＮタンパク質を用いてＨａ－ＣｏＶ－２粒子を集合させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子において、ＭとＮとのいずれの存在も検出された（図１Ｃおよび１Ｄ）。
さらに、これらの構造タンパク質が同じビリオン粒子に存在するかどうかを調べるために、抗Ｓ抗体が結合した磁気ビーズを用いてＨａ－ＣｏＶ－２粒子をプルダウンした。磁気的に分離された粒子をさらに抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットでプローブし、ＦＬＡＧタグ付きＭタンパク質の存在について調べた。図１Ｅに示すように、抗Ｓ抗体プルダウン粒子にはＭの存在が検出され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質とＨａ－ＣｏＶ－２ベクターとのコトランスフェクションによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生につながることが確認された。
Ｂ．Ｈａ－ＣｏＶ－２（ＧＦＰ）レポーターウイルス
Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子が標的細胞に感染してレポーター遺伝子を発現する能力をさらに実証するために、Ｈａ－ＣｏＶ－２（ＧＦＰ）レポーターウイルスを集合させ、ＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２とのいずれも過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ／ＴＥＭＰＲＳＳ２）細胞の感染に使用した。
感染後の細胞内でＧＦＰの発現が確認され（図２Ａ）、このことから、アルファウイルスベースのＲＮＡゲノムは、出芽中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＶＬＰによってパッケージングされ、標的細胞内でＧＦＰレポーター遺伝子を発現できることが実証された。
Ｈａ－ＣｏＶ－２による標的細胞の感染がＳとＡＣＥ２受容体との相互作用に依存しているかどうかを調べるために１８，３０、Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）レポーターウイルスを集合させ、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ／ＴＥＭＰＲＳＳ２）細胞および親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時に感染させるのに使用した。図２Ｂに示すように、Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）はＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ／ＴＥＭＰＲＳＳ２）細胞内で高レベルのＬｕｃを発現したが、ＨＥＫ２９３Ｔでは最小レベルのＬｕｃを発現し、Ｈａ－ＣｏＶ－２感染にＡＣＥ２が必要であることが実証された。
Ｓ－ＡＣＥ２相互作用の要件をさらに確認するために、Ｓタンパク質を用いずに粒子を生成した。図２Ｃに示すように、Ｓの非存在下では、Ｌｕｃ発現は非常に低下し、Ｈａ－ＣｏＶ－２感染にＳが必要であることが実証された。他の構造タンパク質であるＭ、ＮおよびＥについても、Ｈａ－ＣｏＶ－２感染にＭ、ＮおよびＥが必要であるかを試験した。これらのタンパク質は必須ではないことが判明したが、Ｍ、ＮおよびＥを除去すると、Ｈａ－ＣｏＶ－２の感染が減少した（図２Ｃ）。Ｈａ－ＣｏＶ－２感染におけるＭ、ＮおよびＥの寄与を調べたところ、一般に、これらの構造タンパク質が２つまたは３つ集合した粒子は、タンパク質を１つだけ含む粒子よりも高いレベルの感染を引き起こすように思われた。しかしながら、Ｈａ－ＣｏＶ－２の完全な感染力には、ＳとＥとが存在すれば十分であるように思われる（図２Ｄ）。
アルファウイルスベースのＲＮＡゲノムをＨａ－ＣｏＶ－２に使用する大きな利点は、アルファウイルスの極めて高速かつ高レベルな遺伝子発現にある。サブゲノムＲＮＡプロモーターからの遺伝子発現は、感染してから数時間以内に起こり、ウイルスのプラスＲＮＡのレベルは単一細胞内で２００，０００コピーにも達し得る（文献１６、２８）。Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）感染の経時変化に従って、Ｌｕｃレポーター発現は、細胞への粒子の添加から６時間以内に急速に増加することが確認された（図３）。この迅速なレポーターの発現動態により、Ｈａ－ＣｏＶ－２を用いて中和抗体および抗ウイルス薬の迅速なスクリーニングおよび定量化が可能になる。
Ｃ．Ｈａ－ＣｏＶ－２とシュードレンチウイルスとの比較
レンチベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプウイルスは、抗ウイルス薬のスクリーニングおよび中和抗体のアッセイによく使用されている（文献１０、１４）。ＡＣＥ２過剰発現細胞とネイティブレベルのＡＣＥ２を発現する細胞との両方の感染について、Ｈａ－ＣｏＶ－２とシュードレンチウイルスとの比較を行った。シュードレンチウイルスとＨａ－ＣｏＶ－２粒子とを、同様の細胞培養条件で集合させ、等量の粒子を感染に使用した。シュードレンチウイルスとＨａ－ＣｏＶ－２とのいずれも、ＡＣＥ２過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＥＳＳ２）細胞に感染することができる（図４Ａ）。しかしながら、ネイティブレベルのＡＣＥ２を発現するヒト肺癌細胞であるＣａｌｕ－３の感染はシュードレンチウイルスでは最小であったが（文献３１）、一方で、Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子はＣａｌｕ－３細胞の感染に対してはるかに高いシグナルを生じた（図４Ｂ）。Ｈａ－ＣｏＶ－２による初代ヒトＡＣＥ２－ヌルサル腎臓細胞の感染は、非感染細胞バックグラウンドを超えるシグナルを生成しなかった（図４Ｃ）。これらの結果は、Ｈａ－ＣｏＶ－２が低ＡＣＥ２発現細胞の感染に対してより感受性が高い可能性があることを実証している。
さらに、Ｈａ－ＣｏＶ－２の感染経時変化を追跡し、シュードレンチウイルスの感染変化と比較した。図４Ｄに示すように、Ｈａ－ＣｏＶ－２感染では、Ｌｕｃレポーター発現が早ければ２～４時間で検出可能になり、一方で、シュードレンチウイルス感染では、２４時間後に初めてＬｕｃレポーター発現が検出可能になった。加えて、Ｈａ－ＣｏＶ－２感染でのレポーター発現はより強固で、２４時間までに、シュードレンチウイルス感染から生成されたものより約１５０倍高いレベルに達した。
Ｈａ－ＣｏＶ－２とシュードレンチウイルスとの直接比較は、抗体中和アッセイでも行われた。どちらのシステムも中和抗体の定量化に有効であるが、２つのシステムの感度は異なっている。シュードレンチウイルスにはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のみが含まれるが、幾つかの実施形態では、Ｈａ－ＣｏＶ－２にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の４種の構造タンパク質すべて（Ｓ、Ｍ、ＥおよびＮ）を含み、他のウイルスからの構造タンパク質（例えば、レンチウイルスのｇａｇおよびｐｏｌ）は有しない。もちろん、他の実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１種の構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＥおよびＮ）のみを含んでいてもよいことが理解される。他の実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２種以上の構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＥおよびＮ）を含んでいてもよい。さらに他の実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３種以上の構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、ＥおよびＮ）を含んでいてもよい。例えば、決して限定するものではないが、一実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、Ｓを含んでいてもよい。別の実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、ＳおよびＥを含んでいてもよい。他の実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、Ｓ、ＥおよびＭタンパク質を含んでいてもよいか、またはＳ、ＥおよびＮタンパク質を含んでいてもよい。他の実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２は、Ｓ、Ｅ、ＭおよびＮを含んでいてもよい。
Ｓはウイルス侵入の主要な要件であるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の他の構造タンパク質の存在も、ビリオン感染力およびビリオン粒子ならびに細胞膜および抗体との相互作用に影響を与える可能性がある。本システムでは、ビリオン粒子上のＭおよびＥの欠如は、ウイルス感染に影響を与えると思われる（図２Ｄ）。
ウイルス構造タンパク質に加えて、ビリオン粒子は、ビリオンの出芽と放出中に複数の細胞性タンパク質も取り込む。ＰＳＧＬ－１などのこれらの細胞因子の多くは、ビリオン感染力（文献１５、３６－３８）および細胞膜への抗体結合（文献３９）に影響を与える可能性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の出芽は、主にＥＲ－ゴルジ体中間コンパートメントの膜で起こり（文献４０）、一方で、レンチシュードウイルスは細胞膜から出芽する（文献４１）。この違いにより、レンチシュードウイルスとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とには、異なる細胞内タンパク質のセットが組み込まれ得る可能性がある。この点から、Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によく似ていることは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および病原におけるビリオンの宿主タンパク質の影響を研究するためのユニークなツールを提供することができる（文献１５）。
Ｄ．中和抗体の迅速なスクリーニングおよび定量化のためのＨａ－ＣｏＶ－２
中和抗体の迅速なスクリーニングおよび定量化のためのＨａ－ＣｏＶ－２を検証するために、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗血清（１Ｆ）を試験し、これを連続希釈してＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）とプリインキュベートした。抗体－ウイルス複合体を用いて細胞を５時間感染させ、Ｌｕｃ発現を行った。図５Ａに示すように、Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）の１Ｆ濃度依存的な阻害が観察され、ＩＣ５０は１：４３３希釈で調べた（図５Ａ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードレンチウイルスが中和アッセイで広く使用されていることから４，８，１４、１Ｆとシュードレンチウイルスであるレンチ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）とを用いて同様のアッセイを行った１５。感染した細胞を、感染してから７２時間後に解析した。シュードレンチウイルスについても同様の１Ｆ濃度依存性阻害を観察し、ＩＣ５０は１：１８６希釈であることが判明した（図５Ｂ）。これらの結果から、Ｈａ－ＣｏＶ－２は中和抗体の定量化においてシュードレンチウイルスと同等の効果があるが、その速度がはるかに速い（５～１２時間対４８～７２時間）ことが実証された。
上記の１Ｆの結果に基づき、Ｈａ－ＣｏＶ－２ベースの中和アッセイの追加検証を、１９人のドナーの回復期血漿を用いて行った。各血清の阻害曲線およびＩＣ５０は、図５Ｃに提示されている。比較のために、感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて独立した定量化を行って、これらの抗血清を検証した。Ｈａ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とから得られたＩＣ５０値には、直接的な相関関係（ｒ２＝０．８７）が観察された（図５Ｄ）。これらの結果から、Ｈａ－ＣｏＶ－２が中和抗体の迅速な定量化に使用できることが実証された。
シュードウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入阻害剤のハイスループットスクリーニングにもよく用いられている（文献７、１０）。そのため、広域スペクトルのウイルス侵入阻害剤であるアルビドール（ウミフェノビル）（文献３２）を、Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）感染を阻止するその能力のために使用した。図５Ｅに示すように、Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）の用量依存性阻害が５時間で観察され、ＩＣ５０は１６ｐＭと決定された。これらの結果から、Ｈａ－ＣｏＶ－２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入阻害剤の迅速なスクリーニングに使用できることが示された。
Ｅ．Ｈａ－ＣｏＶ－２によるウイルスバリアントの相対的な感染力の迅速な評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が循環し進化し続ける中、英国におけるＢ．１．１．７系統の最近の出現で記録されているように、ウイルスバリアントはＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの制御にとって特に難しい課題となっている（文献４２）。ウイルス突然変異は、ウイルスの伝播および適応の増加につながる可能性があり、ひいてはウイルスの感染力の変化および中和抗体への応答に変化について、新興バリアントの迅速な同定および特性評価が急務となっている。本Ｈａ－ＣｏＶ－２システムは、ウイルスバリアントを迅速に定量化し、中和抗体およびワクチンの有効性に影響を与える可能性のある強固なプラットフォームを提供することができる。
本Ｈａ－ＣｏＶ－２システムを、ウイルスバリアントの相対的な感染力を迅速に評価するために試験した。Ｄ６１４Ｇスパイク突然変異は、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの初期に出現し、最近、より大きな感染力を付与することが報告され、そのためＤ６１４Ｇ変異体の循環が世界的に優勢になった（文献３３、３４）。Ｈａ－ＣｏＶ－２システムでウイルス感染力の増加を再現および定量化できるかどうかを調べるために、Ｇ６１４変異体Ｓタンパク質（Ｇ６１４）または親Ｓタンパク質（Ｄ６１４）を用いてＨａ－ＣｏＶ－２粒子を集合させた。Ｄ６１４Ｇ突然変異はビリオン放出またはＳタンパク質のビリオン取り込みレベルを増加させないことが判明した（図６Ａおよび６Ｂ）。しかしながら、Ｇ６１４スパイクを持つＨａ－ＣｏＶ－２粒子は、Ｄ６１４スパイクを持つ粒子よりも感染力がほぼ３倍高いことが判明した（図６Ｃ）。
ブラジルバリアント（Ｐ．１）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）、英国バリアント（Ｂ．１．１．７）、カリフォルニアバリアント（Ｂ．１．４２９）、その他幾つかの新興バリアント（Ｂ．１．２、Ｂ．１．４９４、Ｂ．１．１．２０７、Ｂ．１．２５８、およびＢ．１．１．２９８）を含む、循環しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント（ＧＩＳＡＩＤグローバルリファレンスデータベースから選択、表１）に由来する９種のＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）分離株を寄せ集めた。Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）および関連するＳタンパク質バリアントを用いて標的細胞を感染させ、相対的な感染力を定量化した。
Figure 2023546299000002
 ＊ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の系統識別およびバリアントの命名はＧＩＳＡＩＤ（https://www.gisaid.org）から得た；スパイクタンパク質における突然変異および各分離株の配列アクセッション番号が一覧にされている。
図６Ｄに示すように、ゲノムＲＮＡコピーで正規化すると、これらのバリアントは、一般に、元の親Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）よりも感染力が２～１０倍高い。これらの結果は、Ｈａ－ＣｏＶ－２がウイルスバリアントの迅速なモニタリングおよび定量化のための便利なツールを提供できることを実証した。概念実証として、ウイルスバリアントを中和する抗血清の能力を定量化した。感染したドナーから回復期血漿を取得し、次いでモデルナｍＲＮＡ－１２７３を１回ワクチン接種した。この１回ワクチン接種により、抗血清力価が約６倍と大幅に増加した（図６Ｅ）。さらに、Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）バリアントを試験すると、ワクチン接種後の血清は、試験したすべてのバリアントに対して中和活性を有することが判明した（図６Ｆ）。とはいえ、中和活性はバリアント間で大きく異なり、抗血清はＢ．１．４９４に対する中和活性が最も高く（ＩＣ５０、１：６８７２）、Ｂ．１．１．４２９バリアントに対する活性が最も低い（ＩＣ５０、１：１１０６）。
これらの結果は、Ｈａ－ＣｏＶ－２がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの迅速な定量化に使用でき、中和抗体およびワクチン効果に影響を与える可能性があることを実証している。
Ｆ．Ｈａ－ＣｏＶ－２の方法論
本Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子は、（１）ＣＯＶＩＤ侵入に対する薬物スクリーニング；（２）アルファウイルスレプリカーゼ侵入に対する薬物スクリーニング；（３）抗体の測定用；および（４）免疫応答の刺激を必要とする対象における免疫応答の刺激を含むが、これらに限定されない、さまざまな用途に使用することができる。
例えば、本Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子を使用して、対象のための個別化された医療処置を決定し提供するための手段として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのパネルに対する対象の抗体を測定することができる。例えば、所定の対象者は、ブラジルバリアント（Ｐ．１）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）および英国バリアント（Ｂ．１．１．７）などの一部のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する抗体を有している可能性はあっても、対象は、例えば、カリフォルニアバリアント（Ｂ．１．４２９）および幾つかの他の新興バリアント（Ｂ．１．２、Ｂ．１．４９４、Ｂ．１．１．２０７、Ｂ．１．２５８およびＢ．１．１．２９８）に対する抗体は有していない可能性がある。
別の例では、対象は、英国バリアント（Ｂ．１．１．７）が優勢なバリアントであるイギリスなどの特定の国に旅行する前に抗体を検査することを望むかもしれない。もちろん、場所および優勢なバリアントは時間とともに変化する可能性があるので、当業者であれば、特定の場所または地理において、関連する時間に優勢なバリアントを検査することを知っているだろう。このようにして、本Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子を使用して、旅行前に対象のための個別化された医療処置を決定し提供するための手段として、所定の地理で知られているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する対象の抗体を測定することができる。この点から、また、対象が特定のバリアントに対する中和抗体を有していない場合、対象は、特定の場所、国、または地理に旅行する前に、抗体、ワクチンまたは処置を受けることができる。
別の実施形態では、本Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子は、ウイルス侵入を阻害する薬物および他の小分子のスクリーニングに使用することができる。例えば、化合物がウイルス侵入を阻止するかどうかは、
ａ）ウイルス侵入阻害剤、中和抗体、または抗ウイルスタンパク質もしくは薬物からなる群から選択される化合物を取得することと、
ｂ）化合物を本ハイブリッド粒子とインキュベートすることと、
ｃ）インキュベートしたハイブリッド粒子を、ＡＣＥ２を含む細胞に導入することと、
ｄ）前記細胞内でレポーター遺伝子発現を検出することであって、レポーター遺伝子の発現は細胞の感染を示す、検出することと
によって決定することができる。
以下の実施例は、例示であり、本開示を限定するものではない。実際、本明細書に示され、説明されたものに加えて、さまざまな改変が、前述の説明から当業者に明らかになり、本開示の範囲内に入るであろう。
実施例１：ウイルスおよびウイルス粒子の集合
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の研究では、一般的な臨床・研究室での感染性ウイルスの使用を制限する高レベルの封じ込めが必要である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の創薬およびワクチン開発には、シュードウイルスおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）が広く使用されている。シュードウイルス、例えばレンチウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスに由来するものなどは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入プロセスを模倣することができる。しかしながら、構造的にはＳＡＲＡ－ＣｏＶ－２とは大きく異なり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ、ＥおよびＮによって提供される構造要素が欠如している。ＶＬＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子によく似ているが、ＶＬＰには、標的細胞内でのレポーター発現のためのゲノムは含まれていない（文献３５）。
以下、本発明者らは、構造的にはＶＬＰであるが、標的細胞に侵入してレポーター遺伝子を発現するシュードウイルスの能力を有する新規なハイブリッドシステム、Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子の開発および検証について説明する。Ｈａ－ＣｏＶ－２のゲノムは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）などのアルファウイルスに由来しており、ウイルス侵入後数時間でレポーター発現を迅速かつ強固に定量化することが可能である。以下に説明するように、Ｈａ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびアルファウイルスに対する中和抗体、ウイルスバリアントおよび抗ウイルス薬の迅速なスクリーニングおよび定量化、ならびに免疫応答の刺激に使用できることが実証された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ、Ｓ（Ｄ６１４Ｇ）、Ｍ、ＥまたはＮ発現ベクターは、Sinobiological社から購入した。Ｈａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）およびＨａ－ＣｏＶ－２（ＧＦＰ）ベクター、ならびにＳタンパク質バリアントは、ＧＩＳＡＩＤグローバルデータベース（第１表）で識別された分離株から選択し、Twist Bioscience社によって合成した。Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子は、１０ｃｍディッシュに入れたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、各２．５μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質発現ベクター（Ｓ、Ｎ、Ｅ、Ｍ）と１０μｇのＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）またはＨａ－ＣｏＶ－２（ＧＦＰ）とコトランスフェクションすることによって集合させた。コトランスフェクションから４８時間後に粒子を採取し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、次いで勾配遠心分離によって濃縮した。
レンチシュードウイルスは、以前に記載されたように１５、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ発現ベクター（０．５μｇ）、ｐＣＭＶΔＲ８．２（７．５μｇ）およびｐＬＴＲ－Ｔａｔ－ＩＲＥＳ－Ｌｕｃ（１０μｇ）とコトランスフェクションすることによって集合させた。
実施例２：構造タンパク質のＨａ－ＣｏＶ－２ビリオン取り込みの検出
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ－ＦＬＡＧおよびＮ－ＦＬＡＧベクターは、Zhang et al. A systemic and molecular study of subcellular localization of SARS-CoV-2 proteins. Signal Transduct Target Ther5, 269, doi:10.1038/s41392-020-00372-8 (2020)に開示されているように使用した（文献４３）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０μｇのＨａ－ＣｏＶ－２（Ｌｕｃ）、２．５μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ発現ベクターおよび各２．５μｇのＭフラグ、ＮフラグおよびＥフラグのベクターとコトランスフェクションした。粒子を採取し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、次いで勾配遠心分離によって精製した。ビリオンライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析し、スパイクタンパク質Ｓ２モノクローナル抗体（１Ａ９）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（１：１０００希釈）またはＤＹＫＤＤＤＤＫタグモノクローナル抗体（ＦＧ４Ｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（１：１０００希釈）を用いてウェスタンブロットを行った。次いで、膜を抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）（１：２０００希釈）とともに室温で６０分間インキュベートした。化学発光シグナルは、Ｗｅｓｔ ＰｉｃｏまたはＷｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ化学発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して検出した。画像はＣＣＤカメラ（ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ９９００イメージングシステム）（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ社）を用いて取り込んだ。粒子はまた、解析のために磁気ビーズで取り込んだ。簡単に言うと、磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐａｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（２ｘｌ０７個のビーズ／５０μｌ）に、スパイクタンパク質Ｓ２モノクローナル抗体（１Ａ９）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（２μｌ抗体）を室温で３０分間コンジュゲートした。コンジュゲーション後、ビリオンを抗Ｓ２－ビーズと４℃で３０分間インキュベートし、磁石で引き下げた。冷ＰＢＳで５回洗浄した後、ビリオンをＬＤＳライセートバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で溶解した。ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析し、ＤＹＫＤＤＤＤＫタグモノクローナル抗体（ＦＧ４Ｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（１：１０００希釈）を用いてウェスタンブロットを行い、ＦＬＡＧタグ付きＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｍタンパク質を検出した。
実施例３：ウイルス感染力アッセイ
Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）細胞（Virongy LLC社（バージニア州マナッサス在）からの寄贈）、Ｃａｌｕ－３細胞（ＡＴＣＣ）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）およびＸｕｅｆｅｎｇ Ｌｉｕ博士によって提供された初代サル腎臓細胞に感染させた。簡単に言うと、細胞を１２ウェルプレートに播種した（１ウェル当たり２×ｌ０５細胞）。細胞を３７℃で１～２時間感染させ、洗浄し、新鮮な培地で３～４８時間培養し、次いでルシフェラーゼアッセイ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、ＧｌｏＭａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼ活性を調べた。レンチシュードタイプウイルス粒子を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）細胞およびＣａｌｕ－３細胞（ＡＴＣＣ）に感染させた。細胞を２時間感染させ、３日間培養した後、ルシフェラーゼアッセイバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、ＧｌｏＭａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いたルシフェラーゼアッセイを行った。
実施例４：中和抗体アッセイ
Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子をＣＯＶＩＤ１９患者の血清で連続希釈したものと１時間プレインキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）細胞に２時間添加した。次いで、細胞を洗浄し、新鮮な培地でさらに３～２４時間培養した。細胞を、ルシフェラーゼアッセイ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、ＧｌｏＭａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いたルシフェラーゼアッセイを行った。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを用いた中和アッセイでは、抗血清を連続希釈し（１：１０希釈から始まる１２点の２倍希釈系列）、１００ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３７℃で１時間プレインキュベートした。インキュベーション後、ウイルス力価を定量化するためにウイルスプラークアッセイを実施した。簡単に言うと、１２ウェルプレート（１ウェル当たり２×ｌ０５細胞）のＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ）を、３７℃で１時間、ウイルスに感染させた。感染後、０．６％アガロースと、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したフェノールレッド（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）なしの２Ｘ ＥＭＥＭとからなる１：１オーバーレイを、各ウェルに添加した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。細胞を１０％ホルムアルデヒドで室温にて１時間固定し、次いでアガロースオーバーレイを除去した。細胞はクリスタルバイオレット（２０％エタノール溶液中の１％ＣＶ（ｗ／ｖ））で染色した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス力価は、プラークの数を数えることによって決定した。
実施例５：抗ウイルス薬アッセイ
アルビドール－塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社）をジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ社）に再懸濁した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２）細胞を、連続希釈されたアルビドールで１時間前処理した。Ｈａ－ＣｏＶ－２粒子を細胞に添加し、それに続けて、薬物濃度を維持するためにアルビドールを添加した。細胞をアルビドールの存在下で２時間感染させ、洗浄し、次いで新鮮な培地で計５時間培養した。細胞を、ルシフェラーゼアッセイ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、ＧｌｏＭａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いたルシフェラーゼアッセイを行った。
実施例６．中和抗体の迅速な検出および定量化のためのハイブリッド粒子
患者血清サンプルを、遠心分離によりドナー血液から採取した。ＨＡＶＳ（Ｌｕｃ）粒子（Ｈａ－ＣｏＶ－２とも呼ばれる）を抗血清（１：６０希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートし、次いでＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２＋ＴＭＰＲＳＳ２）細胞を５時間感染させるために用いた。中和活性はルシフェラーゼアッセイで測定した。感染していない健康なドナーの血清を対照として用いた。抗血清１Ｆの用量依存性阻害は、ＨＡＶＳ（Ｌｕｃ）粒子を用いて定量化した。阻害治癒は、血清を連続希釈（一連の１：２希釈）し、ＨＡＶＳ（Ｌｕｃ）粒子と３７℃で１時間インキュベーションすることで生成した。ＨＡＶＳ（Ｌｕｃ）－抗体複合体を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２＋ＴＭＰＲＳＳ２）細胞を５時間感染させた。中和活性はルシフェラーゼアッセイで測定した。ＩＣ５０は、感染の相対的な割合と血清濃度の相対的な対数とを用いて算出した。比較のために、抗血清１Ｆの用量依存性阻害を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓシュードタイプ化レンチウイルス（ＬＴＲ－Ｔａｔ－Ｌｕｃ）を用いて定量化した。阻害治癒は、血清を連続希釈（１：２希釈の連続）し、ＬＴＲ－Ｔａｔ－Ｌｕｃシュードウイルスと３７℃で１時間インキュベートすることで生成した。シュードウイルス－抗体複合体を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＣＥ２＋ＴＭＰＲＳＳ２）細胞を７２時間感染させた。中和活性はルシフェラーゼアッセイで測定した。ＩＣ５０は、感染の相対的な割合と血清濃度の相対的な対数とを用いて算出した（図５Ａ～Ｄに示されるように）。
実施例７：第１世代および第２世代のＳＦＶレプリコン
図７に示すように、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）からの第１世代の単サイクルアルファウイルスレプリコンは、ウイルスＲＮＡを、５’非翻訳領域と、非構造タンパク質（ｎｓｐ）１～４と、ウイルスサブゲノムプロモーターによって駆動される導入遺伝子とともに生成する真核生物プロモーターをコードするプラスミドから生成される。ウイルスレプリカーゼによる効率的なＲＮＡ複製を確実にするため、プラスミドから直接ポリＡテールがコードされ、肝炎デルタウイルスリボザイムによって切断される。レプリコンに２つ目のサブゲノムプロモーターを追加することで、複数の導入遺伝子の生成が可能となる。ＳＦＶレプリコンとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造成分とのコトランスフェクションにより、ハイブリッドＶＬＰが生成されることになる。ＳＦＶレプリコンは、出芽中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＶＬＰを乗っ取ることができる豊富なレプリコンＲＮＡを産生する。
第２世代のＳＦＶレプリコンは、ＶＬＰを強化し、空粒子の量を減らすために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパッケージングシグナルを含むように生成される。これにより、感染シグナルが大幅に強化され、感染アッセイに必要なインキュベーション時間がさらに短縮されるはずである。完全なゲノムレプリコンを確実にパッケージングするために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナルはコドン最適化されたＮＳＰ４タンパク質（部分的にｃｏ－ＮＳＰ４）の直後に挿入されている。コドン最適化により、元のサブゲノムプロモーターは破壊され、次いでパッケージングシグナルの下流で置き換えられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパッケージングシグナルは、Ｈａ－ＣｏＶ－２ゲノムの５’末端、内部、または３’末端のいずれかに挿入することもできる。
実施例８：大規模な生産
現在のパンデミックの需要を満たすためには、この技術を大規模生産に移行する必要がある。これまでの研究で、ＶＬＰを産生する安定した細胞株は、ウイルス構造タンパク質の過剰生産による細胞毒性の影響により一般的に生産が困難になり得ることが示されている。この課題を克服するために、機能するレプリコンが存在する場合にのみＶＬＰの構造成分を産生する細胞株を産生することができる。これまでの研究で、アルファウイルスのレプリコン依存性ゲノムを用いて、安定した細胞株から効率的にＶＬＰを産生できることが実証されている。これらの欠陥レプリコンは、パッケージングを行わず、別の機能的レプリコンが存在する場合にのみ、サブゲノムプロモーターから遺伝子を産生する。
図２に示すように、本願では、この細胞株により、これらのハイブリッドＶＬＰを大量に生産し、商業および臨床用途でより多く使用することができるようになる。
ハイブリッドＶＬＰの機能を実証するために、許容される細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２を感染させ、蛍光顕微鏡を用いて緑色蛍光タンパク質の産生をモニタリングした。ハイブリッドＶＬＰは、標的細胞内で目的遺伝子を産生することができた。以下は、レプリコンを有するハイブリッドＶＬＰによってＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を感染させたことを示す顕微鏡画像である。ハイブリッドＶＬＰによる２回目の感染は、許容されるＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２＋ＴＭＰＲＳＳ２細胞株で行った。レプリコンはルシフェラーゼ遺伝子をコードし、ルシフェラーゼ活性は感染してから３日目に測定した。ハイブリッドＶＬＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入をモデル化するための改良された方法であり、抗ウイルスおよびワクチン探索のための新しいプラットフォームである。
ハイブリッドＶＬＰの機能を実証するために、許容される細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２を感染させ、蛍光顕微鏡を用いて緑色蛍光タンパク質の産生をモニタリングした。ハイブリッドＶＬＰは、標的細胞内で目的遺伝子を産生することができた。図２は、レプリコンを有するハイブリッドＶＬＰによってＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を感染させたことを示す顕微鏡画像である。
ハイブリッドＶＬＰによる２回目の感染は、許容されるＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２＋ＴＭＰＲＳＳ２細胞株で行った。レプリコンはルシフェラーゼ遺伝子をコードし、ルシフェラーゼ活性は図２Ｂ－Ｃに示すように、感染してから３日目に測定した。ハイブリッドＶＬＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入をモデル化するための改良された方法であり、抗ウイルスおよびワクチン探索のための新しいプラットフォームである。

Claims (20)

  1. ａ）アルファウイルスに由来するＲＮＡゲノムと、
    ｂ）少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質と
    を含むハイブリッド粒子であって、
    前記構造タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）である、ハイブリッド粒子。
  2. 前記粒子が、非複製型の粒子である、請求項１記載のハイブリッド粒子。
  3. 前記アルファウイルスに由来する前記ＲＮＡゲノムが、レポーター遺伝子または目的遺伝子を含む、請求項１記載のハイブリッド粒子。
  4. 前記ＲＮＡゲノムが、
    ａ）５’非翻訳領域と、
    ｂ）非構造タンパク質（ｎｓｐ）１～４をコードするオープンリーディングフレームと、
    ｃ）レポーター遺伝子または目的遺伝子と、
    ｄ）３’非翻訳領域と、
    ｅ）ポリ（Ａ）テールと
    を含む、請求項１記載のハイブリッド粒子。
  5. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナルをさらに含み、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナルが、前記レポーター遺伝子の下流にある、請求項４記載のハイブリッド粒子。
  6. 前記ハイブリッド粒子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、請求項１記載のハイブリッド粒子。
  7. 前記レポーター遺伝子が、ＧＦＰ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子を含む、請求項３記載のハイブリッド粒子。
  8. 前記ハイブリッド粒子が、ＡＣＥ２を発現する細胞を標的とする、請求項１記載のハイブリッド粒子。
  9. ２種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質を含み、前記構造タンパク質が、ＳおよびＥを含む、請求項１記載のハイブリッド粒子。
  10. ４種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質を含み、前記構造タンパク質が、Ｓ、Ｅ、ＭおよびＮを含む、請求項１記載のハイブリッド粒子。
  11. 前記ハイブリッド粒子が、ＩＣ５０値とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とで直接的な相関関係を有する、請求項１０記載のハイブリッド粒子。
  12. （ａ）少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質をコードする第１のベクターと、アルファウイルスに由来するＲＮＡゲノムを含む第２のベクターとをコトランスフェクションすることであって、前記アルファウイルスＲＮＡゲノムは、（ｉ）５’末端のＤＮＡプロモーターと、（ｉｉ）第１の非翻訳領域と、（ｉｉｉ）アルファウイルスからの非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、（ｉｖ）レポーター遺伝子と、（ｖ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージングシグナル配列と、（ｖｉ）ウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターと、（ｖｉｉ）目的遺伝子と、（ｖｉｉｉ）第２の非翻訳領域と、（ｉｘ）ポリＡテールとを含む、コトランスフェクションすることと、
    （ｂ）ハイブリッド粒子を生成することであって、前記ハイブリッド粒子は、アルファウイルスＲＮＡゲノムと、少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質とを含む、生成することと
    を含む、方法。
  13. 前記ハイブリッド粒子を標的細胞に感染させることであって、前記標的細胞は、ＡＣＥ２を発現する、感染させることをさらに含む、請求項１２記載の方法。
  14. 前記レポーター遺伝子の発現が、感染の検出および定量化を容易にするシグナルを生成することができる、請求項１２記載の方法。
  15. 前記シグナルが、前記ハイブリッド粒子による感染後、約２時間～約７２時間後に読み取られる、請求項１４記載の方法。
  16. １つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する対象の抗体応答を検出するための方法であって、
    ａ）前記対象からの血清試料を請求項１０記載のハイブリッド粒子とインキュベートすることと、
    ｂ）インキュベートした前記ハイブリッド粒子を、ＡＣＥ２を含む細胞に導入することと、
    ｃ）前記細胞内でのレポーター遺伝子の発現を検出することであって、レポーター遺伝子の発現は、前記対象が、前記細胞のウイルス感染を阻止する中和抗体を持たないことを示し、レポーター遺伝子の無発現は、前記対象が、前記細胞のウイルス感染を阻止する抗体を持つことを示す、検出することと
    を含む、方法。
  17. 請求項１記載のハイブリッド粒子を含む組成物。
  18. 前記組成物が、免疫応答を開始することができるワクチンまたは粒子である、請求項１７記載の組成物。
  19. 請求項１０記載のハイブリッド粒子を含む組成物。
  20. 前記組成物が、免疫応答を開始することができるワクチンまたは粒子である、請求項１９記載の、ハイブリッド粒子を含む組成物。
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