JPH06222062A - ウイルス感染価および中和抗体価の測定法 - Google Patents
ウイルス感染価および中和抗体価の測定法Info
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- JPH06222062A JPH06222062A JP2603493A JP2603493A JPH06222062A JP H06222062 A JPH06222062 A JP H06222062A JP 2603493 A JP2603493 A JP 2603493A JP 2603493 A JP2603493 A JP 2603493A JP H06222062 A JPH06222062 A JP H06222062A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ウイルス感染価および中和抗体価の迅速、簡
便かつ定量的測定法を提供すること 【構成】 ９６穴プレートに培養された細胞に、ＨＣＭ
Ｖなどのウイルス検体を接種することによって出現した
ウイルス感染細胞を、該ウイルスの前初期抗原（ＩＥ
Ａ）または初期抗原（ＥＡ）を認識する抗体と可溶性基
質を用いる酵素抗体法により染色し、その発色の強さを
ＥＬＩＳＡリーダーなどの装置で測定することによりウ
イルス感染価を測定する。また、ウイルス検体の代わり
に、検体とウイルスの混合液を接種して同様に行い中和
抗体価を算出する。
便かつ定量的測定法を提供すること 【構成】 ９６穴プレートに培養された細胞に、ＨＣＭ
Ｖなどのウイルス検体を接種することによって出現した
ウイルス感染細胞を、該ウイルスの前初期抗原（ＩＥ
Ａ）または初期抗原（ＥＡ）を認識する抗体と可溶性基
質を用いる酵素抗体法により染色し、その発色の強さを
ＥＬＩＳＡリーダーなどの装置で測定することによりウ
イルス感染価を測定する。また、ウイルス検体の代わり
に、検体とウイルスの混合液を接種して同様に行い中和
抗体価を算出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウイルスの感染価およ
びウイルスに対する中和抗体価を測定する方法に関し、
さらに詳しくは、ウイルスに特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を用いて、ウイルスの感染価および中和抗体
価を迅速、簡便に、かつ定量的に測定する方法に関す
る。
びウイルスに対する中和抗体価を測定する方法に関し、
さらに詳しくは、ウイルスに特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を用いて、ウイルスの感染価および中和抗体
価を迅速、簡便に、かつ定量的に測定する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ウイルス感染症患者のウイルス量、また
は血中の中和抗体価などの患者の免疫状態の診断、ある
いはウイルス感染症に有効なモノクローナル抗体、また
は抗ウイルス剤などの薬物のスクリーニングなどに際
し、ウイルス感染価または中和抗体価を測定することが
行われている。
は血中の中和抗体価などの患者の免疫状態の診断、ある
いはウイルス感染症に有効なモノクローナル抗体、また
は抗ウイルス剤などの薬物のスクリーニングなどに際
し、ウイルス感染価または中和抗体価を測定することが
行われている。
【０００３】従来、ウイルス感染価、または中和抗体価
の測定法としては、プラーク法と呼ばれる方法が広く行
われてきた。この方法は、ウイルス液をシャーレや６穴
プレート上で培養されたウイルス感受性細胞の単層に接
種して、１〜２週間培養後、細胞を固定染色し、出現し
たウイルスプラークを顕微鏡下でカウントしてウイルス
感染価を測定する方法である。中和抗体価を測定する場
合は、まず、例えば患者血清やハイブリドーマの培養上
清などの検体とウイルス液を試験管内で混合し、一定時
間反応させた後、この液をシャーレや６穴プレート上に
培養したウイルス感受性細胞の単層に接種して、１〜２
週間培養後、細胞を固定染色し、出現したウイルスプラ
ークを顕微鏡下でカウントして、プラークの減少率から
検体中の中和抗体価を求める。
の測定法としては、プラーク法と呼ばれる方法が広く行
われてきた。この方法は、ウイルス液をシャーレや６穴
プレート上で培養されたウイルス感受性細胞の単層に接
種して、１〜２週間培養後、細胞を固定染色し、出現し
たウイルスプラークを顕微鏡下でカウントしてウイルス
感染価を測定する方法である。中和抗体価を測定する場
合は、まず、例えば患者血清やハイブリドーマの培養上
清などの検体とウイルス液を試験管内で混合し、一定時
間反応させた後、この液をシャーレや６穴プレート上に
培養したウイルス感受性細胞の単層に接種して、１〜２
週間培養後、細胞を固定染色し、出現したウイルスプラ
ークを顕微鏡下でカウントして、プラークの減少率から
検体中の中和抗体価を求める。
【０００３】この方法は、信頼性が高く、定量的である
が、迅速性、簡便性にかけ、また顕微鏡下でのウイルス
プラークの判定には時間と熟練が必要とされるため、大
量の検体を扱ったり、結果を急ぐ病院や大学、企業の研
究室で用いるには不適であった。
が、迅速性、簡便性にかけ、また顕微鏡下でのウイルス
プラークの判定には時間と熟練が必要とされるため、大
量の検体を扱ったり、結果を急ぐ病院や大学、企業の研
究室で用いるには不適であった。
【０００４】この点を克服するために、最近、いくつか
の研究室から、モノクローナル抗体を用いた迅速な測定
法が提案されている。この方法は、感染後の早い時期に
細胞に出現するウイルス前初期抗原または初期抗原を認
識するモノクローナル抗体を使ってウイルス感染細胞を
染めるもので、接種から細胞固定までの時間が１〜２日
間と著しく短縮されている。また、細胞培養に９６穴プ
レートを用いて、一度に大量の検体を処理できる。
の研究室から、モノクローナル抗体を用いた迅速な測定
法が提案されている。この方法は、感染後の早い時期に
細胞に出現するウイルス前初期抗原または初期抗原を認
識するモノクローナル抗体を使ってウイルス感染細胞を
染めるもので、接種から細胞固定までの時間が１〜２日
間と著しく短縮されている。また、細胞培養に９６穴プ
レートを用いて、一度に大量の検体を処理できる。
【０００５】染色の手順としては、細胞固定後、モノク
ローナル抗体を加え、一定時間反応させた後、未反応の
抗体を洗浄除去し、次に酵素標識した２次抗体を加えて
同様に反応させ、洗浄後、酵素と反応した後は不溶性と
なる不溶性基質を加えてウイルス感染細胞を染色する。
直接法の場合には、酵素標識したモノクローナル抗体を
用いて同様の方法で染色する。酵素の代わりに蛍光色素
を標識したモノクローナル抗体、または２次抗体を用い
て染色することもできる。
ローナル抗体を加え、一定時間反応させた後、未反応の
抗体を洗浄除去し、次に酵素標識した２次抗体を加えて
同様に反応させ、洗浄後、酵素と反応した後は不溶性と
なる不溶性基質を加えてウイルス感染細胞を染色する。
直接法の場合には、酵素標識したモノクローナル抗体を
用いて同様の方法で染色する。酵素の代わりに蛍光色素
を標識したモノクローナル抗体、または２次抗体を用い
て染色することもできる。
【０００６】しかし、この方法で定量的な結果を得るた
めには、染色後、ウイルス感染細胞を顕微鏡下でカウン
トする必要が依然としてあり、この段階で時間と労力が
かかってしまうという欠点があった。モノクローナル抗
体を用いたウイルス感染価および中和抗体測定法の迅速
性、簡便性、検体処理能力を生かすには、最後の段階の
ウイルス感染の算出を定量性を失わずに簡略化すること
が必要であった。
めには、染色後、ウイルス感染細胞を顕微鏡下でカウン
トする必要が依然としてあり、この段階で時間と労力が
かかってしまうという欠点があった。モノクローナル抗
体を用いたウイルス感染価および中和抗体測定法の迅速
性、簡便性、検体処理能力を生かすには、最後の段階の
ウイルス感染の算出を定量性を失わずに簡略化すること
が必要であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、迅速、簡便
なウイルス感染価測定法および中和抗体価測定法を提供
することを目的とする。
なウイルス感染価測定法および中和抗体価測定法を提供
することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、９６穴プレー
ト上で培養された細胞にウイルス検体を接種することに
よって出現したウイルス感染細胞を、該ウイルスの前初
期抗原もしくは初期抗原を認識する抗体および可溶性基
質を用いる酵素抗体法により染色し、その発色の強さを
測定装置により読み取ることを特徴とする検体中のウイ
ルス感染価の測定法である。
ト上で培養された細胞にウイルス検体を接種することに
よって出現したウイルス感染細胞を、該ウイルスの前初
期抗原もしくは初期抗原を認識する抗体および可溶性基
質を用いる酵素抗体法により染色し、その発色の強さを
測定装置により読み取ることを特徴とする検体中のウイ
ルス感染価の測定法である。
【０００９】本発明において、ウイルスとしては、公知
のウイルスを用いることができるが、ヒトサイトメガロ
ウイルス（Human Cytomegalo Virus、以下ＨＣＭＶと略
す）水痘帯状疱疹ウイルス（Varicella Zoster Virus、
以下ＶＺＶと略す）、単純疱疹ウイルス（Herpes Simpl
ex Virus、以下ＨＳＶと略す）などが好適である。
のウイルスを用いることができるが、ヒトサイトメガロ
ウイルス（Human Cytomegalo Virus、以下ＨＣＭＶと略
す）水痘帯状疱疹ウイルス（Varicella Zoster Virus、
以下ＶＺＶと略す）、単純疱疹ウイルス（Herpes Simpl
ex Virus、以下ＨＳＶと略す）などが好適である。
【００１０】ウイルスの前初期抗原（Immediate early
antigen 、以下ＩＥＡと称することがある）または初期
抗原（Early antigen 、以下ＥＡと称することがある）
とは、ウイルス感染の早い時期に感染細胞に出現する前
初期または初期タンパク質であり、例えばＨＣＭＶにお
いては、ＩＥ1 またはＩＥ2 または６４〜６６キロダル
トンの前初期タンパク質を挙げることができる。
antigen 、以下ＩＥＡと称することがある）または初期
抗原（Early antigen 、以下ＥＡと称することがある）
とは、ウイルス感染の早い時期に感染細胞に出現する前
初期または初期タンパク質であり、例えばＨＣＭＶにお
いては、ＩＥ1 またはＩＥ2 または６４〜６６キロダル
トンの前初期タンパク質を挙げることができる。
【００１２】本発明において用いられる抗体は、ウイル
ス特異的な前記タンパク質に反応する抗体であれば、動
物血清であっても、モノクローナル抗体であってもよ
い。前記ＨＣＭＶに対する抗体としては、ＨＣＭＶの６
４〜６６キロダルトンの前初期タンパクに対するヒトモ
ノクローナル抗体、Ｃ７を挙げることができる。
ス特異的な前記タンパク質に反応する抗体であれば、動
物血清であっても、モノクローナル抗体であってもよ
い。前記ＨＣＭＶに対する抗体としては、ＨＣＭＶの６
４〜６６キロダルトンの前初期タンパクに対するヒトモ
ノクローナル抗体、Ｃ７を挙げることができる。
【００１３】酵素抗体法とは、酵素を予め結合させて標
識した抗体（以下、酵素標識抗体ということがある）と
検体との間で抗原抗体反応を起こさせ、該酵素と反応す
ると特定の発色をする基質を加えて、目的とする抗原を
検出する免疫学的測定法である。この酵素抗体法には、
酵素標識抗体を抗原（本発明においてはＩＥＡまたはＥ
Ａ）と反応させる直接酵素抗体法と、酵素標識抗体を２
次抗体として抗原と結合した抗体と反応させる間接酵素
抗体法が知られている。
識した抗体（以下、酵素標識抗体ということがある）と
検体との間で抗原抗体反応を起こさせ、該酵素と反応す
ると特定の発色をする基質を加えて、目的とする抗原を
検出する免疫学的測定法である。この酵素抗体法には、
酵素標識抗体を抗原（本発明においてはＩＥＡまたはＥ
Ａ）と反応させる直接酵素抗体法と、酵素標識抗体を２
次抗体として抗原と結合した抗体と反応させる間接酵素
抗体法が知られている。
【００１４】本発明においては、いずれの方法も採用す
ることができ、間接酵素抗体法においては、ＩＥＡまた
はＥＡを認識する抗体に対する抗体に酵素標識したも
の、例えば、抗ＨＣＭＶ−ＩＥＡマウス抗体の場合、抗
マウス抗体に酵素標識したものを２次抗体として用い
る。
ることができ、間接酵素抗体法においては、ＩＥＡまた
はＥＡを認識する抗体に対する抗体に酵素標識したも
の、例えば、抗ＨＣＭＶ−ＩＥＡマウス抗体の場合、抗
マウス抗体に酵素標識したものを２次抗体として用い
る。
【００１５】酵素抗体法において用いることのできる酵
素としては、公知のものを挙げることができ、例えば、
西洋ワサビパーオキシダーゼ（Horse Radish Peroxydas
e 、以下ＨＲＰと略す）などのペルオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、ベータガラクトシダーゼなどを
挙げることができる。
素としては、公知のものを挙げることができ、例えば、
西洋ワサビパーオキシダーゼ（Horse Radish Peroxydas
e 、以下ＨＲＰと略す）などのペルオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、ベータガラクトシダーゼなどを
挙げることができる。
【００１６】また、本発明においては、酵素抗体法にお
いて、基質として、標識された酵素と反応したのちも可
溶性のままの可溶性基質を用いる。従って可溶性基質
は、標識に用いられた酵素との組合せによって適切な可
溶性発色基質または化学発光基質が選ばれる。例えば、
ＨＲＰを標識酵素とする場合過酸化水素と３，３′，
５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）の混合
液を、アルカリフォスファターゼの場合にはｐ−ニトロ
フェニルリン酸２ナトリウムを、ベータガラクトシダー
ゼの場合にはｐ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside、ｐＮＰ
Ｇ）を用いることが好ましい。このような可溶性基質を
用いることにより、その発色の強さを測定装置を用いて
読み取ることができるため、ウイルス感染価を定量性を
失うことなく、簡便に測定することができる。
いて、基質として、標識された酵素と反応したのちも可
溶性のままの可溶性基質を用いる。従って可溶性基質
は、標識に用いられた酵素との組合せによって適切な可
溶性発色基質または化学発光基質が選ばれる。例えば、
ＨＲＰを標識酵素とする場合過酸化水素と３，３′，
５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）の混合
液を、アルカリフォスファターゼの場合にはｐ−ニトロ
フェニルリン酸２ナトリウムを、ベータガラクトシダー
ゼの場合にはｐ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside、ｐＮＰ
Ｇ）を用いることが好ましい。このような可溶性基質を
用いることにより、その発色の強さを測定装置を用いて
読み取ることができるため、ウイルス感染価を定量性を
失うことなく、簡便に測定することができる。
【００１７】本発明において、測定装置としては、化学
発光の強さ、蛍光の強さなどを、例えば、吸光度として
測定する装置を挙げることができ、一般にＥＬＩＳＡリ
ーダーとして知られている装置などを挙げることができ
る。
発光の強さ、蛍光の強さなどを、例えば、吸光度として
測定する装置を挙げることができ、一般にＥＬＩＳＡリ
ーダーとして知られている装置などを挙げることができ
る。
【００１８】本発明の操作手順は下記のように行われ
る。 ９６穴プレートに培養された細胞に、ウイルス検体液
を接種後、一定時間培養し、固定したのち、直接酵素抗
体法においては、 該ウイルスのＩＥＡまたはＥＡを認識する酵素標識さ
れた抗体を加えて反応させ、 未反応の抗体を洗浄除去したのち、可溶性基質を加え
てウイルス感染細胞を染色し、 その発色の強さをＥＬＩＳＡリーダーなどの装置で測
定する。
る。 ９６穴プレートに培養された細胞に、ウイルス検体液
を接種後、一定時間培養し、固定したのち、直接酵素抗
体法においては、 該ウイルスのＩＥＡまたはＥＡを認識する酵素標識さ
れた抗体を加えて反応させ、 未反応の抗体を洗浄除去したのち、可溶性基質を加え
てウイルス感染細胞を染色し、 その発色の強さをＥＬＩＳＡリーダーなどの装置で測
定する。
【００１９】間接酵素抗体法の場合は、前記におい
て、標識されていない抗体をまず反応させた後、未反
応の抗体を洗浄除去し、次に酵素標識された２次抗体を
加えた後、同様に可溶性基質を加えて染色し、その発
色の強さを測定する。
て、標識されていない抗体をまず反応させた後、未反
応の抗体を洗浄除去し、次に酵素標識された２次抗体を
加えた後、同様に可溶性基質を加えて染色し、その発
色の強さを測定する。
【００２０】この手順において、用いられる細胞とし
ては、測定しようとするウイルスが増殖可能な細胞が望
ましく、例えば、ウイルスがＨＣＭＶの場合、ヒト胎児
肺線維芽細胞（Human Enbryonic Lung Fibroblast Cel
l、以下ＨＥＬ細胞と略す）を、単純疱疹ウイルスの場
合Vero細胞を挙げることができる。
ては、測定しようとするウイルスが増殖可能な細胞が望
ましく、例えば、ウイルスがＨＣＭＶの場合、ヒト胎児
肺線維芽細胞（Human Enbryonic Lung Fibroblast Cel
l、以下ＨＥＬ細胞と略す）を、単純疱疹ウイルスの場
合Vero細胞を挙げることができる。
【００２１】ウイルスを増殖可能な細胞に接種したの
ち、適切な培養液を加え、１〜７日間培養したのち、培
養液を吸引除去し、洗浄して細胞固定液を加え、５〜１
０分間固定する。細胞固定液としては、５０〜２００μ
ｌのアセトン−メタノール＝１：１混合液、１０％ホル
マリン溶液、０．１％グルタールアルデヒド溶液などを
用いることができる。このなかで、ＨＣＭＶを接種した
ＨＥＬ細胞においては、アセトン−メタノール＝１：１
混合液が最も感度が高く、従って、これを用いて固定す
るのが望ましい。
ち、適切な培養液を加え、１〜７日間培養したのち、培
養液を吸引除去し、洗浄して細胞固定液を加え、５〜１
０分間固定する。細胞固定液としては、５０〜２００μ
ｌのアセトン−メタノール＝１：１混合液、１０％ホル
マリン溶液、０．１％グルタールアルデヒド溶液などを
用いることができる。このなかで、ＨＣＭＶを接種した
ＨＥＬ細胞においては、アセトン−メタノール＝１：１
混合液が最も感度が高く、従って、これを用いて固定す
るのが望ましい。
【００２２】検体の感染価を測定するには、予め既知濃
度のウイルス溶液と検体を同時に段階希釈しておき、本
発明の方法によって吸光度を測定し、同一の吸光度を与
える検体の希釈倍率と、既知濃度のウイルス溶液の感染
価を比較することによって、検体の原液のウイルス感染
価を知ることができる。
度のウイルス溶液と検体を同時に段階希釈しておき、本
発明の方法によって吸光度を測定し、同一の吸光度を与
える検体の希釈倍率と、既知濃度のウイルス溶液の感染
価を比較することによって、検体の原液のウイルス感染
価を知ることができる。
【００２３】本発明は、また、検体とウイルスの混合液
を接種することにより出現したウイルス感染細胞を前記
抗体および可溶性基質を用いる酵素抗体法により染色
し、その発色の強さを測定装置を用いて読み取り、検体
中の中和抗体価を定量する方法を提供するものである。
を接種することにより出現したウイルス感染細胞を前記
抗体および可溶性基質を用いる酵素抗体法により染色
し、その発色の強さを測定装置を用いて読み取り、検体
中の中和抗体価を定量する方法を提供するものである。
【００２４】検体の中和抗体価は、検体のウイルス中和
価であり、前記ウイルス感染価の測定において、ウイル
ス検体に替えて検体とウイルスの混合液を接種するほか
は同様にして測定される。すなわち、検体とウイルスを
混合、反応させ、９６穴プレートに培養されたＨＥＬ細
胞などの細胞単層に接種し、培養、固定、ＥＬＩＳＡ染
色を行い、その発色の強さを測定装置を用いて読み取
り、この値から中和抗体価を算出する。用いられる細
胞、酵素、可溶性基質なども前記ウイルス感染価の測定
と同様のものを用いることができる。
価であり、前記ウイルス感染価の測定において、ウイル
ス検体に替えて検体とウイルスの混合液を接種するほか
は同様にして測定される。すなわち、検体とウイルスを
混合、反応させ、９６穴プレートに培養されたＨＥＬ細
胞などの細胞単層に接種し、培養、固定、ＥＬＩＳＡ染
色を行い、その発色の強さを測定装置を用いて読み取
り、この値から中和抗体価を算出する。用いられる細
胞、酵素、可溶性基質なども前記ウイルス感染価の測定
と同様のものを用いることができる。
【００２５】本発明の方法で得られる中和抗体価は、従
来法と高い相関性を有し、従って、本発明は、これまで
期間と労力を必要としていた中和抗体価の測定を迅速、
簡便にかつ定量的に行う方法を提供するものということ
ができる。
来法と高い相関性を有し、従って、本発明は、これまで
期間と労力を必要としていた中和抗体価の測定を迅速、
簡便にかつ定量的に行う方法を提供するものということ
ができる。
【００２６】また、本発明の方法では、ウイルスプラー
ク数のみならず、ウイルス感染細胞数をも数値化が可能
であるため、抗体、例えばＨＳＶの糖タンパクｇＨに対
するマウスモノクローナル抗体（Gampels U. and Minso
n A. , Virology 1986年、156 巻、230 ページ）、ＶＺ
Ｖの糖タンパクｇｐIII に対するモノクローナル抗体
（Keller P.M. et al.,Virology 1987年、 157巻、 526
ページ、およびSugano T. et al.,J. Gen. Virol. 1991
年、72巻、2065ページ) 、サイトメガロウイルスの糖タ
ンパクｇＨに対するモノクローナル抗体（Rasmussen L.
et al.,Transplantation Proc. 1991年、23巻、60ペー
ジ) などの有するウイルスの細胞間感染を抑制する効
果、すなわち細胞間感染拡大抑制活性を加味した値とし
て、従来法による中和抗体価より低い値（高感度な値）
として抗ウイルス活性を知ることができる。
ク数のみならず、ウイルス感染細胞数をも数値化が可能
であるため、抗体、例えばＨＳＶの糖タンパクｇＨに対
するマウスモノクローナル抗体（Gampels U. and Minso
n A. , Virology 1986年、156 巻、230 ページ）、ＶＺ
Ｖの糖タンパクｇｐIII に対するモノクローナル抗体
（Keller P.M. et al.,Virology 1987年、 157巻、 526
ページ、およびSugano T. et al.,J. Gen. Virol. 1991
年、72巻、2065ページ) 、サイトメガロウイルスの糖タ
ンパクｇＨに対するモノクローナル抗体（Rasmussen L.
et al.,Transplantation Proc. 1991年、23巻、60ペー
ジ) などの有するウイルスの細胞間感染を抑制する効
果、すなわち細胞間感染拡大抑制活性を加味した値とし
て、従来法による中和抗体価より低い値（高感度な値）
として抗ウイルス活性を知ることができる。
【００２７】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。 実施例１（ウイルス感染価測定における細胞固定法およ
び培養期間の検討） ９６穴培養プレート（Coster,USA) にヒト胎児肺線維芽
細胞（ＨＥＬ細胞）を接種し、単層細胞シートを形成す
るまで、５％ＣＯ2 存在下３７℃で培養した。培養液は
１０％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭ培地（以下、増
殖培地という）を用いた。
説明する。 実施例１（ウイルス感染価測定における細胞固定法およ
び培養期間の検討） ９６穴培養プレート（Coster,USA) にヒト胎児肺線維芽
細胞（ＨＥＬ細胞）を接種し、単層細胞シートを形成す
るまで、５％ＣＯ2 存在下３７℃で培養した。培養液は
１０％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭ培地（以下、増
殖培地という）を用いた。
【００２８】単層細胞シートが形成された後、増殖培地
を吸引除去し、ＨＣＭＶ−Towne 株の懸濁液を各穴５０
μｌ加え、３７℃で１時間反応させ、ウイルスを接種し
た。ウイルス接種後、２％ウシ胎児血清を含むイーグル
ＭＥＭ培地（維持培地）を加え５％ＣＯ2 存在下３７℃
で７日間培養した。３日、５日、７日培養した時点で、
それぞれ、培養液を吸引除去し、感染細胞単層をリン酸
緩衝生理食塩液（Phosphate Buffer Saline 、以下ＰＢ
Ｓと略す）で３回洗浄したのち、１００μｌのアセトン
─メタノール＝１：１混合液、１０％ホルマリン溶液、
０．１％グルタールアルデヒド溶液（細胞固定液）を加
え、１０分間固定した。
を吸引除去し、ＨＣＭＶ−Towne 株の懸濁液を各穴５０
μｌ加え、３７℃で１時間反応させ、ウイルスを接種し
た。ウイルス接種後、２％ウシ胎児血清を含むイーグル
ＭＥＭ培地（維持培地）を加え５％ＣＯ2 存在下３７℃
で７日間培養した。３日、５日、７日培養した時点で、
それぞれ、培養液を吸引除去し、感染細胞単層をリン酸
緩衝生理食塩液（Phosphate Buffer Saline 、以下ＰＢ
Ｓと略す）で３回洗浄したのち、１００μｌのアセトン
─メタノール＝１：１混合液、１０％ホルマリン溶液、
０．１％グルタールアルデヒド溶液（細胞固定液）を加
え、１０分間固定した。
【００２９】感染細胞固定液を吸引除去後ＰＢＳで３回
洗浄し、非特異反応を抑えるため、２００μｌの１％ウ
シ血清アルブミン（Sigma,USA ）を含むＰＢＳ（以下、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳと略す）を加えて１時間以上反応さ
せた。感染細胞を固定した９６穴プレートは１％ＢＳＡ
−ＰＢＳ存在下、４℃で数週間、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ吸
引除去乾燥後、凍結状態（−７０℃程度）で半永久的に
保存できるものであった。ここで感染細胞は、ＨＣＭＶ
の６４〜６６キロダルトンの前初期タンパクに対するヒ
トモノクローナル抗体、Ｃ７のＦ（ａｂ）2 フラグメン
トにＨＲＰを標識した酵素標識抗体Ｃ７−ＨＲＰを用い
た直接染色法によって検出した。
洗浄し、非特異反応を抑えるため、２００μｌの１％ウ
シ血清アルブミン（Sigma,USA ）を含むＰＢＳ（以下、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳと略す）を加えて１時間以上反応さ
せた。感染細胞を固定した９６穴プレートは１％ＢＳＡ
−ＰＢＳ存在下、４℃で数週間、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ吸
引除去乾燥後、凍結状態（−７０℃程度）で半永久的に
保存できるものであった。ここで感染細胞は、ＨＣＭＶ
の６４〜６６キロダルトンの前初期タンパクに対するヒ
トモノクローナル抗体、Ｃ７のＦ（ａｂ）2 フラグメン
トにＨＲＰを標識した酵素標識抗体Ｃ７−ＨＲＰを用い
た直接染色法によって検出した。
【００３０】９６穴プレートの１％ＢＳＡ−ＰＢＳを吸
引除去し、Ｃ７−ＨＲＰを濃度０．２５μｇ／ｍｌにな
るように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したものを５０μｌ
ずつ加え、３７℃で１時間反応させた。
引除去し、Ｃ７−ＨＲＰを濃度０．２５μｇ／ｍｌにな
るように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したものを５０μｌ
ずつ加え、３７℃で１時間反応させた。
【００３１】反応終了後、抗体溶液を吸引除去し１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＨＲＰの可溶性発
色基質である過酸化水素と３，３′，５，５′−テトラ
メチルベンジジン（ＴＭＢＺ、同仁化学研究所）の混合
液（１ｍＭＴＭＢＺ、５ｍＭＨ2 Ｏ2 を含む０．１Ｍク
エン酸−リン酸２ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．３、以下
ＴＭＢＺ溶液という）を各穴１００μｌ加え、室温で５
〜６０分間反応させた。
ＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＨＲＰの可溶性発
色基質である過酸化水素と３，３′，５，５′−テトラ
メチルベンジジン（ＴＭＢＺ、同仁化学研究所）の混合
液（１ｍＭＴＭＢＺ、５ｍＭＨ2 Ｏ2 を含む０．１Ｍク
エン酸−リン酸２ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．３、以下
ＴＭＢＺ溶液という）を各穴１００μｌ加え、室温で５
〜６０分間反応させた。
【００３２】ＴＭＢＺ溶液が適度に発色した時点で、Ｔ
ＭＢＺ溶液と同量の１規定濃度の硫酸を加え、反応を停
止させたのち、発色の強さをＥＬＩＳＡリーダー（Mole
cular Devices Corp.,ＣＡ ＵＳＡ）で４５０ｎｍの吸
光度を測定することによって得た。結果を図１の（Ａ）
（Ｂ）（Ｃ）に示す。
ＭＢＺ溶液と同量の１規定濃度の硫酸を加え、反応を停
止させたのち、発色の強さをＥＬＩＳＡリーダー（Mole
cular Devices Corp.,ＣＡ ＵＳＡ）で４５０ｎｍの吸
光度を測定することによって得た。結果を図１の（Ａ）
（Ｂ）（Ｃ）に示す。
【００３３】図１にみるとおり、測定可能なウイルス感
染価は３日間培養において２×１０3 pfu/ml以上、５日
間培養においては４×１０3 pfu/ml以上、７日間培養に
おいては２pfu/ml以上であった。従って、培養期間は検
体、および目的によって３日間〜７日間の間で選ぶのが
望ましい。
染価は３日間培養において２×１０3 pfu/ml以上、５日
間培養においては４×１０3 pfu/ml以上、７日間培養に
おいては２pfu/ml以上であった。従って、培養期間は検
体、および目的によって３日間〜７日間の間で選ぶのが
望ましい。
【００３４】実施例２（ウイルス中和抗体価の測定） 抗体として、抗ＨＣＭＶヒトモノクローナル抗体Ｃ２３
（Masuho et al.,J. Gen. Virol.,1987 年、68巻、1457
ページ) を用い、これを段階希釈した溶液（抗体溶液）
と実施例１で得られた測定可能なウイルス感染価を満足
する範囲の感染力価に調製したＨＣＭＶ−Towne 株溶液
を等量混合し、３７℃で６０分間反応させた。同時に抗
体溶液の代わりにウイルス溶液と維持培地を等量混合し
たもの（以下、感染コントロールという）および抗体溶
液と維持培地を等量混合したもの、または維持培地のみ
の溶液（以下、非感染コントロールという）も同様に反
応させた。
（Masuho et al.,J. Gen. Virol.,1987 年、68巻、1457
ページ) を用い、これを段階希釈した溶液（抗体溶液）
と実施例１で得られた測定可能なウイルス感染価を満足
する範囲の感染力価に調製したＨＣＭＶ−Towne 株溶液
を等量混合し、３７℃で６０分間反応させた。同時に抗
体溶液の代わりにウイルス溶液と維持培地を等量混合し
たもの（以下、感染コントロールという）および抗体溶
液と維持培地を等量混合したもの、または維持培地のみ
の溶液（以下、非感染コントロールという）も同様に反
応させた。
【００３５】反応後のウイルス−抗体混合液を、ＨＣＭ
Ｖ−Towne 株の懸濁液の代わりに用い、実施例１と同様
に、９６穴プートに培養したＨＥＬ細胞単層に接種し、
培養、固定、ＥＬＩＳＡ染色を行った。ＴＭＢＺ溶液の
吸光度は感染コントロールと非感染コントロールの発色
程度がはっきりと区別できる範囲、すなわち０．５〜
４．０の範囲で測定した。
Ｖ−Towne 株の懸濁液の代わりに用い、実施例１と同様
に、９６穴プートに培養したＨＥＬ細胞単層に接種し、
培養、固定、ＥＬＩＳＡ染色を行った。ＴＭＢＺ溶液の
吸光度は感染コントロールと非感染コントロールの発色
程度がはっきりと区別できる範囲、すなわち０．５〜
４．０の範囲で測定した。
【００３６】測定された吸光度を用いて、以下に示す式
（Ｉ）によって中和価（neutralization％）を算出し
た。 中和価＝〔（感染コントロールの吸光度−抗体希釈液の
吸光度）／（感染コントロールの吸光度−非感染コント
ロールの吸光度）〕×１００・・・・（Ｉ） 縦軸に各抗体希釈液の中和価、横軸に抗体濃度または希
釈倍率をプロットし、中和価の５０％を与える抗体濃度
または希釈倍率をその抗体の中和抗体価、すなわちＥＤ
50値を得た。
（Ｉ）によって中和価（neutralization％）を算出し
た。 中和価＝〔（感染コントロールの吸光度−抗体希釈液の
吸光度）／（感染コントロールの吸光度−非感染コント
ロールの吸光度）〕×１００・・・・（Ｉ） 縦軸に各抗体希釈液の中和価、横軸に抗体濃度または希
釈倍率をプロットし、中和価の５０％を与える抗体濃度
または希釈倍率をその抗体の中和抗体価、すなわちＥＤ
50値を得た。
【００３７】ＨＣＭＶ−Towne 株の４×１０2 pfu/ml、
および２×１０5 pfu/mlのウイルスを用いて７日間培養
した場合の抗ＨＣＭＶヒトモノクローナル抗体Ｃ２３の
中和曲線を図２（Ａ）および（Ｂ）にそれぞれ示す。Ｅ
Ｄ50値は、７日間培養条件下では４×１０2 pfu/mlのウ
イルス溶液を用いるのが感度よく中和抗体価を測定する
のに適当であった。
および２×１０5 pfu/mlのウイルスを用いて７日間培養
した場合の抗ＨＣＭＶヒトモノクローナル抗体Ｃ２３の
中和曲線を図２（Ａ）および（Ｂ）にそれぞれ示す。Ｅ
Ｄ50値は、７日間培養条件下では４×１０2 pfu/mlのウ
イルス溶液を用いるのが感度よく中和抗体価を測定する
のに適当であった。
【００３８】実施例３（ウイルス中和抗体価測定におけ
る従来法との感度の比較） 抗ＨＣＭＶヒトモノクローナル抗体Ｃ２３を用いて、本
発明の方法と従来法である感染プラーク減少法を比較し
た。本発明の方法では、３日間培養、５×１０4 pfu/ml
ＨＣＭＶ−Towne 株を用いた。
る従来法との感度の比較） 抗ＨＣＭＶヒトモノクローナル抗体Ｃ２３を用いて、本
発明の方法と従来法である感染プラーク減少法を比較し
た。本発明の方法では、３日間培養、５×１０4 pfu/ml
ＨＣＭＶ−Towne 株を用いた。
【００３９】従来法は以下のように行った。すなわち、
２×１０3 pfu/mlのＨＣＭＶ−Towne 株と抗体希釈液を
等量混合し、３７℃で１時間反応させた後、３．５ｃｍ
直径の６穴培養プレート（Falcon3046、USA)に形成させ
たＨＥＬ細胞の単層培養に２００μｌずつ接種した。１
時間の吸着の後、１％寒天を含む維持培地を重層し１０
日間培養した。単層培養上に形成されたウイルスプラー
クを１０％ホルマリンで固定後、０．３％メチレンブル
ーで染色し、プラーク数を顕微鏡下で数えた。中和価は
下記式（II) によって算出した。 中和価＝〔（感染コントロールのプラーク数−抗体希釈
液のプラーク数）／（感染コントロールのプラーク数−
非感染コントロールのプラーク数）〕×１００・・・・
・・〔II]
２×１０3 pfu/mlのＨＣＭＶ−Towne 株と抗体希釈液を
等量混合し、３７℃で１時間反応させた後、３．５ｃｍ
直径の６穴培養プレート（Falcon3046、USA)に形成させ
たＨＥＬ細胞の単層培養に２００μｌずつ接種した。１
時間の吸着の後、１％寒天を含む維持培地を重層し１０
日間培養した。単層培養上に形成されたウイルスプラー
クを１０％ホルマリンで固定後、０．３％メチレンブル
ーで染色し、プラーク数を顕微鏡下で数えた。中和価は
下記式（II) によって算出した。 中和価＝〔（感染コントロールのプラーク数−抗体希釈
液のプラーク数）／（感染コントロールのプラーク数−
非感染コントロールのプラーク数）〕×１００・・・・
・・〔II]
【００４０】本発明の方法による中和曲線を図３（Ａ）
に、従来法による中和曲線を図３（Ｂ）に示す。中和抗
体価（ＥＤ50）はそれぞれ０．２８μｇ／ｍｌおよび
０．４９μｇ／ｍｌであった。
に、従来法による中和曲線を図３（Ｂ）に示す。中和抗
体価（ＥＤ50）はそれぞれ０．２８μｇ／ｍｌおよび
０．４９μｇ／ｍｌであった。
【００４１】実施例４（ウイルス中和抗体価測定におけ
る本発明と従来法との相関性） １９人のヒト血清を本発明、および従来法（プラーク減
少法）によって中和抗体価を測定した。縦軸に本発明に
よる中和抗体価（ＥＤ50）、横軸に従来法による中和抗
体価（ＥＤ50）をプロットし、相関性を調べたところ、
相関係数０．８８４で高い相関を示した。このように本
発明はこれまで、期間と労力を必要としていた中和抗体
価測定を迅速に、簡便に、かつ客観的に測定することが
できることを示している。
る本発明と従来法との相関性） １９人のヒト血清を本発明、および従来法（プラーク減
少法）によって中和抗体価を測定した。縦軸に本発明に
よる中和抗体価（ＥＤ50）、横軸に従来法による中和抗
体価（ＥＤ50）をプロットし、相関性を調べたところ、
相関係数０．８８４で高い相関を示した。このように本
発明はこれまで、期間と労力を必要としていた中和抗体
価測定を迅速に、簡便に、かつ客観的に測定することが
できることを示している。
【００４２】
【発明の効果】本発明によれば、ウイルス感染価または
中和抗体価を迅速に、簡便に、かつ客観的に測定するこ
とができる。
中和抗体価を迅速に、簡便に、かつ客観的に測定するこ
とができる。
【図１】ウイルス感染価測定における細胞固定法、およ
び培養期間による吸光度の変化を示す。（Ａ）はＨＥＬ
細胞にウイルス接種後、３日目に、（Ｂ）は５日目に、
（Ｃ）は７日目に固定した細胞についての吸光度の変化
を示す。
び培養期間による吸光度の変化を示す。（Ａ）はＨＥＬ
細胞にウイルス接種後、３日目に、（Ｂ）は５日目に、
（Ｃ）は７日目に固定した細胞についての吸光度の変化
を示す。
【図２】本発明の方法により、抗ＨＣＭＶヒトモノクロ
ーナル抗体Ｃ２３のウイルス中和抗体価の測定を行った
中和曲線である。（Ａ）は４×１０2 pfu/mlの、（Ｂ）
は２×１０5 pfu/mlのＨＣＭＶ−Towne 株を用いて７日
間培養した場合の中和曲線である。
ーナル抗体Ｃ２３のウイルス中和抗体価の測定を行った
中和曲線である。（Ａ）は４×１０2 pfu/mlの、（Ｂ）
は２×１０5 pfu/mlのＨＣＭＶ−Towne 株を用いて７日
間培養した場合の中和曲線である。
【図３】ウイルス中和抗体価測定にける従来法と本発明
との感度比較を示した図である。（Ａ）は５×１０4 pf
u/mlのＨＣＭＶ−Towne 株を用いて３日間培養した本発
明の方法による中和曲線を、（Ｂ）は従来法、すなわち
プラーク減少法による中和曲線を示す。
との感度比較を示した図である。（Ａ）は５×１０4 pf
u/mlのＨＣＭＶ−Towne 株を用いて３日間培養した本発
明の方法による中和曲線を、（Ｂ）は従来法、すなわち
プラーク減少法による中和曲線を示す。
【図４】ヒト血清の中和抗体価を本発明および従来法で
測定した場合の相関性を示す図である。
測定した場合の相関性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松本 洋一 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内
Claims (10)
- 【請求項１】 ９６穴プレート上で培養された細胞にウ
イルス検体を接種することによって出現したウイルス感
染細胞を、該ウイルスの前初期抗原もしくは初期抗原を
認識する抗体および可溶性基質を用いる酵素抗体法によ
り染色し、その発色の強さを測定装置により読み取るこ
とを特徴とする検体中のウイルス感染価の測定法。 - 【請求項２】 酵素抗体法が酵素を標識した抗体を用い
る直接酵素抗体法である請求項１記載のウイルス感染価
の測定法。 - 【請求項３】 酵素抗体法が酵素を標識した２次抗体を
用いる間接酵素抗体法である請求項１記載のウイルス感
染価の測定法。 - 【請求項４】 酵素がペルオキシダーゼである請求項２
または３記載のウイルス感染価の測定法。 - 【請求項５】 ウイルスの前初期抗原を認識する抗体が
ヒトサイトメガロウイルスの６４〜６５キロダルトンの
前初期抗原を認識するモノクローナル抗体である請求項
１〜４のいずれか１項記載のウイルス感染価の測定法。 - 【請求項６】 ９６穴プレート上で培養された細胞に検
体とウイルスの混合液を接種することによって出現した
ウイルス感染細胞を、ウイルスの前初期抗原もしくは初
期抗原を認識する抗体および可溶性基質を用いる酵素抗
体法により染色し、その発色の強さを測定装置により読
み取ることを特徴とする検体中の中和抗体価の測定法。 - 【請求項７】 酵素抗体法が酵素を標識した抗体を用い
る直接酵素抗体法である請求項６記載の中和抗体価の測
定法。 - 【請求項８】 酵素抗体法が酵素を標識した２次抗体を
用いる間接酵素抗体法である請求項６記載の中和抗体価
の測定法。 - 【請求項９】 酵素がペルオキシダーゼである請求項７
または８記載の中和抗体価の測定法。 - 【請求項１０】 ウイルスの前初期抗原を認識する抗体
がヒトサイトメガロウイルスの６４−６５キロダルトン
の前初期抗原を認識するモノクローナル抗体である請求
項６〜９のいずれか１項記載の中和抗体価の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2603493A JPH06222062A (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | ウイルス感染価および中和抗体価の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2603493A JPH06222062A (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | ウイルス感染価および中和抗体価の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06222062A true JPH06222062A (ja) | 1994-08-12 |
Family
ID=12182425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2603493A Pending JPH06222062A (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | ウイルス感染価および中和抗体価の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06222062A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2761698A1 (fr) * | 1997-04-04 | 1998-10-09 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Methode de titrage d'une composition virale complexe |
| JP2015518140A (ja) * | 2012-03-27 | 2015-06-25 | ヴァリエーション バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド | 抗サイトメガロウイルス中和抗体の検出方法 |
| KR20180127876A (ko) * | 2017-05-22 | 2018-11-30 | 경희대학교 산학협력단 | 호흡기 세포융합 바이러스의 역가 측정 방법 |
-
1993
- 1993-01-22 JP JP2603493A patent/JPH06222062A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2761698A1 (fr) * | 1997-04-04 | 1998-10-09 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Methode de titrage d'une composition virale complexe |
| WO1998045709A1 (fr) * | 1997-04-04 | 1998-10-15 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Methode de titrage d'une composition virale complexe |
| AU737465B2 (en) * | 1997-04-04 | 2001-08-23 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Method of titring a complex viral composition |
| US6890711B1 (en) | 1997-04-04 | 2005-05-10 | Aventis Pasteur | Titration method for a complex viral composition |
| KR100543344B1 (ko) * | 1997-04-04 | 2006-01-20 | 파스퇴르 메리오 세룸 에 박신 | 복합 바이러스 조성물의 적정방법 |
| JP2015518140A (ja) * | 2012-03-27 | 2015-06-25 | ヴァリエーション バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド | 抗サイトメガロウイルス中和抗体の検出方法 |
| US10006096B2 (en) | 2012-03-27 | 2018-06-26 | Variation Biotechnologies Inc. | Methods for detection of anti-cytomegalovirus neutralizing antibodies |
| US10161010B2 (en) | 2012-03-27 | 2018-12-25 | Variation Biotechnologies Inc. | Methods for detection of anti-cytomegalovirus neutralizing antibodies |
| KR20180127876A (ko) * | 2017-05-22 | 2018-11-30 | 경희대학교 산학협력단 | 호흡기 세포융합 바이러스의 역가 측정 방법 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20010522 |