CN107523604A - 一种细菌粘附细胞的快速检测方法及应用 - Google Patents

一种细菌粘附细胞的快速检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细菌与细胞粘附的快速检测方法及其应用。所述快速检测方法其检测步骤如下：S1.培养细胞，形成单层细胞；S2.培养细菌，并加入荧光染料CFSE标记细菌，标记30min～60min后加入终止剂终止反应；细胞与荧光染料标记后的细菌以数量比1：300～400共培养2.5h～3h，再洗除未粘附的细菌；然后检测细胞的荧光强度，并计算粘附率；其中，细菌为可粘附但不入侵动物细胞的细菌，细胞为能贴壁生长的动物细胞。本发明所述的快速检测方法适用于细菌对宿主细胞粘附率的检测，在体外粘附试验模型的基础上，采用CFSE荧光染料标记细菌，通过检测细胞的荧光强度，即可得知细胞上细菌的粘附率。本方法的检测过程简单、快速，还可实时观察细菌与细胞的粘附状态。

Description

一种细菌粘附细胞的快速检测方法及应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地涉及一种细菌粘附细胞的快速检测方法及应用。
背景技术
粘附是病原菌入侵宿主细胞的先决条件之一。在感染过程中，病原菌通过粘附和定值后，发挥一系列致病作用。在细菌性疫病的防控中，若能阻止细菌与宿主细胞的粘附，便能有效防控该疫病的发生。判断一种药物或添加剂是否能有效减少或阻止细菌的粘附，通常需要建立一种体外细菌粘附试验模型，通过统计细菌在细胞的粘附率来确定该药物对细菌粘附的抑制效果。
传统的细菌粘附检测方法多为涂板检测法。该方法是将细胞种植于细胞培养板中，待细胞贴壁完全后，加入一定数量的细菌与细胞共培养，一定时间后弃掉细胞培养液，无菌PBS洗涤细胞三次，加入细胞裂解液裂解细胞，后稀释裂解完全的细胞，接种在琼脂培养板上进行细菌计数。传统方法的优点是成本较小，但是在检测过程中裂解的细胞在接种培养过程中，容易出现其它细菌的污染，或者菌落计数时因主观因素造成的对菌落数量的多计或漏计，或者细胞裂解时常出现细胞裂解不完全，都可能导致检测结果的不准确。另一方面，细胞裂解后从细菌接种到形成菌落并计数，往往需要2～3天的时间，耗时较长。
因此，提供一种可快速、准确的检测细菌粘附细胞的方法，用以判断一种药物或添加剂是否能有效减少或阻止细菌粘附细胞具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服传统检测方法中过程复杂和耗时长的缺点，提供一种细菌粘附细胞的快速检测方法。
本发明所述的方法是检测细菌对宿主细胞的粘附状况，是细菌-宿主细胞的互作范畴。细菌粘附于宿主细胞具有多种方式，而无论细菌是通过何种方式粘附于细胞上，均可以用本发明所述方法进行检测。本发明的检测方法是在体外粘附试验模型的基础上，采用CFSE荧光染料将细菌进行染色后，在培养板上与细胞共培养一段时间后，再洗除未粘附的细菌并检测细胞的荧光强度，从而计算出该细菌粘附细胞的粘附率。
本发明的另一目的在于提供所述细菌粘附细胞的快速检测方法的应用。
本发明的上述目的是通过如下步骤予以实现的：
本发明所述细菌粘附细胞的快速检测方法包括如下步骤：
S1. 培养细胞，形成单层细胞；
S2. 培养细菌，并加入荧光染料CFSE标记细菌，标记30min～60min后加入终止剂终止反应；
S3. 细胞与荧光染料标记后的细菌以数量比1：300～400共培养2.5h~3.5h，再洗除未粘附的细菌；然后检测细胞的荧光强度，并计算粘附率；
其中，细菌为可粘附但不入侵动物细胞的细菌，细胞为能贴壁生长的动物细胞。
本发明所述方法适用于检测细菌粘附细胞的粘附率，若细菌能侵入细胞，虽然也能检测到荧光强度，但是不属于粘附方式，因此可侵入动物细胞的细菌不适用于本发明所述检测方法。
步骤S2中细菌荧光标记时，若标记时间过短，易导致细菌标记不充分，最终检测的荧光值偏小，检测结果误差大；而荧光标记时间过长，细菌在无营养成分的条件下其活力有所下降，最终使其与细胞的粘附效率降低。
步骤S3中细胞和荧光染料标记后的细菌共培养时，细菌与细胞的数量比太高会影响细胞活力；太低时会使检测结果变异较大，不稳定。共培养的时间较短时，细菌粘附不完全，造成结果偏小；共培养时间太长时，细胞容易出现死亡脱落，造成结果偏小。
优选地，步骤S2中CFSE的浓度为50μM～100μM。
更优选地，步骤S2中CFSE的浓度为50μM。
在荧光染料标记细菌中，CFSE染料的浓度过低，染色不充分，荧光值偏小，检测结果误差增大；而浓度过高，造成CFSE染料的浪费，检测成本增高。
优选地，步骤S2中进行荧光标记的细菌密度为108～109CFU/mL。
在荧光染料标记细菌过程中，细菌的密度过低，会使活化时间延长，影响后期与细胞的粘附率，导致结果偏差较大；而细菌密度过高，细菌整体毒力增强，与细胞共培养时易直接杀死细胞，而无法获得准确的粘附率结果。
优选地，步骤S2中CFSE与细菌菌液体积比为1～2：1。
优选地，步骤S2中细菌荧光标记的时间为30min。
优选地，步骤S2中的终止剂为含40%胎牛血清的完全培养基。
优选地，步骤S3中细胞和细菌共培养的时间为3h。
本发明同时还保护所述快速检测方法在检测药物抑制细菌粘附动物细胞作用中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明的检测方法中省去了细胞裂解的过程，减少了因细胞未完全裂解而产生的误差；省去了菌落计数的过程，减少了因菌落计数产生的误差；同时本发明的检测方法中不需要裂解细胞、第二次菌落培养和菌落计数的过程，直接通过荧光检测即可快速获得检测结果，检测的过程简单、快速，且耗费的时间不到传统方法的一半；此外，因有荧光标记，还可以更直观的实时观察细菌与细胞的粘附状态。
具体的实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例和对比例所用测试物为脱脂豆粉，参照文献“β-伴大豆球蛋白酶解物抑制致病菌粘附Caco-2细胞”中的方法从脱脂豆粉中提取β-伴大豆球蛋白及制备β-伴大豆球蛋白体外消化酶解物，所述参考文献中报道了β-伴大豆球蛋白体外消化酶解物抑制大肠杆菌粘附Caco-2细胞的数据，计算其报道的数据得到其检测的抑制率为4.68%。
实施例1
本实施例的供试化合物为脱脂豆粉，β-伴大豆球蛋白体外消化酶解物按照上述参考文献制备；所采用的动物细胞为猪肠上皮细胞IPEC-J2，细菌为大肠杆菌（血清型O157：H7）。
（1）细胞的培养：将猪肠上皮细胞IPEC-J2密度调整为1×105个/mL，接种在全黑的96孔细胞培养板中，每孔100μL。置于37℃、5% CO2的培养箱中培养12h形成单层细胞。
（2）细菌的培养及荧光染料标记：
①取1mL培养到对数期的菌液，细菌密度108～109CFU/mL，置于10mL离心管中，3500g条件下离心5min，弃上清，加PBS洗涤2次，弃上清，保留体积为1mL备用；
②称取一定量的CFSE粉末，加DMSO溶解，配制成浓度为50μM的CFSE溶液，取1mL～2mL50μM的CFSE溶液小心加入到①收集细菌的离心管内，轻轻吹打将CFSE溶液与细菌混匀，于37℃、200r/min避光孵育30min。
③终止反应：用4℃预冷的含40%胎牛血清完全培养基洗涤细菌菌液，离心，重悬细菌使密度为107～108CFU/mL。细菌于37℃培养箱孵育10min～15min即可用于后续试验，或4℃避光保存。
（3）细菌与细胞共培养：
共培养前，测试组细胞培养基中加入100μL的β-伴大豆球蛋白体外消化酶解物，空白组加入100μL的PBS溶液，37℃孵育1h。分别将CFSE标记的细菌菌液100μL添加到试验组和空白组，其中细菌与细胞的数量比为300～400：1，然后置于37℃、5% CO2的培养箱中培养3h，弃上清液，无菌PBS洗涤细胞3次，最后在每个孔中加入20μL PBS。然后将全黑96孔细胞培养板放入荧光酶标仪检测端，在485nm和538nm处检测每孔的荧光值。粘附率按照以下公式进行计算：
整个检测过程共耗时18.5h，其中细胞培养耗时12h，细菌荧光染料标记、细菌细胞共培养、检测荧光强度和计算粘附率共耗时6.5h。
将上述所用的全黑96孔板换成黑边底透的96孔细胞培养板即可在荧光显微镜下，490nm激发光处观察并拍照细菌粘附细胞的状态。
实施例2
本实施例采用的原料和方法同实施例1，不同之处在于CFSE溶液与细菌混匀，于37℃、200r/min避光孵育60min；细胞与细菌的共培养时间为2.5h。检测需要的时间与实施例相同。
实施例3
本实施例采用的原料和方法同实施例1，不同之处在于CFSE溶液与细菌混匀，于37℃、200r/min避光孵育45min；细胞与细菌的共培养时间为3.5h。检测需要的时间与实施例相同。
对比例1
参照文献“β-伴大豆球蛋白酶解物抑制致病菌粘附Caco-2细胞”中的方法，测定β-伴大豆球蛋白体外消化酶解物抑制大肠杆菌粘附猪肠上皮细胞IPEC-J2的抑制率。测得空白组粘附菌数的对数值为7.01CFU/mL，测试组粘附菌数的对数值为6.72CFU/mL，通过计算得到其抑制率为4.14%。整个检测过程耗时2天，其中细胞培养耗时12h，细胞裂解至菌落计数共耗时1天。
对比例2
本实施例采用的原料和方法同实施例1，不同之处在于CFSE溶液与细菌混匀，于37℃、200r/min避光孵育20min。
对比例3
本实施例采用的原料和方法同实施例1，不同之处在于细胞与细菌的共培养时间为4.5h。
对比例4
本实施例采用的原料和方法同实施例1，不同之处在于细胞与细菌共培养时其数量比为1:500～600。
实施例1～3和对比例1～4检测到的荧光纸和抑制率结果见表1。
表1 实施例1～3和对比例2～4的荧光纸和抑制率
组别 测试组荧光值 空白组荧光值 抑制率%
实施例1 887.65 927.5 4.29
实施例2 897.21 937.23 4.27
实施例3 875.78 915.23 4.31
对比例1 - - 4.14
对比例2 264 311 15.04
对比例3 425 434 2.07
对比例4 995 1074 7.35
通过表1中的数据可知，采用本发明所述方法的实施例1～3检测的结果与利用传统方法的对比例1检测的结果极为接近，存在较小的差值，这一差值有可能是实验过程中不可避免的误差导致的。由此表明本发明所述检测方法具有可信性。
对比例2与实施例1相比，主要区别在于荧光染料CFSE标记细菌的时间不同，对比例2检测的结果远远大于实施例1～3和对比例1，且空白组的荧光值均明显小于实施例1～3中空白组的荧光值。这表明荧光染料CFSE标记细菌的时间太短时，部分细菌未被荧光染料标记，导致检测结果不准确。
对比例3与实施例1相比，主要区别在于细胞和细菌的共培养时间不同，对比例3检测的结果明显低于实施例1～3和对比例1，且空白组的荧光值均明显低于实施例1～3中空白组的荧光值。这表明细胞在与细菌共培养过程中，若共培养的时间太长，细胞被细菌损伤，从培养板上脱落，洗涤过程中会把脱落的细胞及其粘附的细菌洗掉，从而导致检测到的荧光值偏小，导致检测结果不准确。
对比例4与实施例1相比，主要区别在于细胞和细菌的共培养过程中，细胞与细菌的数量比不同，对比例4检测的结果明显高于实施例1～3和对比例1，且空白组的荧光值均明显高于实施例1～3中空白组的荧光值。这表明细胞在与细菌共培养过程中，若细菌数目过多，则细菌的总体毒力较强，在共培养过程中细胞的状态较差，甚至被细菌损伤，从培养板上脱落，洗涤过程中会把脱落的细胞及其粘附的细菌洗掉，从而导致检测到的荧光值偏小；而因为添加的细菌数量过多，所以空白组的荧光值偏高，两个检测值均不准确，从而导致最终的检测结果不准确。
此外，对比例1中采用的是传统检测方法，其总共耗时2天。其中，细胞裂解至菌落计数耗时1天；而采用本发明检测方法的实施例1～3共平均花费18.5h，其中细胞培养耗时12h，细菌荧光染料标记、细胞与细菌共培养、荧光检测和计算结果共耗时6.5h。本发明的检测方法在保证准确性的前提条件下，检测过程耗费的时间不到传统方法的一半，极大的缩短了检测时间。与传统方法相比，本发明所述的快速检测方法不仅过程简单，而且更加快速。
从以上数据和结果分析表明，只有保证细菌荧光标记的时间、细胞和细菌共培养的时间及共培养过程中其数量比在本发明所述的范围内，才能保证结果的准确性。

Claims (9)

1.一种细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于，其检测步骤如下：
S1. 培养细胞，形成单层细胞；
S2. 培养细菌，并加入荧光染料CFSE标记细菌，标记30min～60min后加入终止剂终止反应；
S3. 细胞与荧光染料标记后的细菌以数量比1：300～400共培养2.5h~3.5h，再洗除未粘附的细菌；然后检测细胞的荧光强度，并计算粘附率；
其中，细菌为可粘附但不入侵动物细胞的细菌，细胞为能贴壁生长的动物细胞。
2.根据权利要求1所述的细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于，步骤S2中CFSE的浓度为50μM～100μM。
3.根据权利要求2所述的细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于，步骤S2中CFSE的浓度为50μM。
4.根据权利要求1所述的细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于，步骤S2中进行荧光标记的细菌密度为108～109CFU/mL。
5.根据权利要求1所述的细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于，步骤S2中CFSE与细菌的体积比为1～2：1。
6.根据权利要求1所述的细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于，步骤S2中细菌荧光标记的时间为30min。
7.根据权利要求1所述的细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于，步骤S2中的终止剂为含40%胎牛血清的完全培养基。
8.根据权利要求1所述的细菌粘附细胞的快速检测方法，其特征在于，步骤S3中细胞和细菌共培养的时间为3h。
9.一种权利要求1～8任一所述的快速检测方法在检测药物抑制细菌粘附动物细胞作用中的应用。
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