CN101565760A - 一种检测牛副流感3型病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒含有：a)RNA抽提液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)引物和TaqMan探针、f)标准阳性DNA模板、g)荧光定量PCR反应液，其特征是引物序列分别为正义引物和反义引物：扩增子大小为129bp，荧光探针序列，探针的5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性DNA模板由已插入牛副流行性感冒3型病毒保守的F蛋白编码区188bp片段的pGEM－T载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释，结果更加准确、可靠、稳定、且重复性好。也可以进行牛流行性感冒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

Description

一种检测牛副流感3型病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及荧光定量PCR试剂盒的用途，该荧光定量PCR试剂盒可高效方便地对牛血液制品和牛血清进行定量检测和质量监控，也可以进行牛副流行性感冒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

背景技术

牛副流行性感冒3型病毒(Bovine parainfluenza virus type 3，PI-3)属副粘病毒科(Paramyxoviridae)呼吸道病毒属(Respirovirus)，是一种分段的负链RNA病毒，病毒粒子的直径为120～180nm，核衣壳呈螺旋对称，含血凝素和神经氨酸酶活性。血清学研究表明，健康牛血清中存在PI-3病毒抗体者较为普遍，因此认为该病毒广泛分布于世界各地。动物因受到不良因素的影响或因有其他微生物协同作用而发病-自亚临床感染到致死性肺炎。该病毒也可使牛发生呼吸道疾病以及肺炎等，曾从公牛精液和母牛生殖道中发现病毒，并可能导致不育。其发病与潜伏给畜牧业、国际贸易出口和食品安全等带来严重的问题。牛副流行性感冒3型病毒的快速检测是控制和消灭该病的前提，但其常规检测方法有一些不足之处，检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：

1.血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光染色、双抗体夹心ELISA和免疫电镜技术等。在这些方法中得到普遍承认且广泛应用的有：补体结合实验、间接血凝试验、琼脂扩散实验、中和实验。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，反应时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。

2.生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高，周期长，浪费生物资源和人力物力。

3.分子生物学诊断技术包括核酸杂交实验、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、负染电镜检测等。核酸杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳等检测方法更适合于对病毒特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂，过程繁多，成本高，不适宜同时进行大批量检测，因而受到很大限制。相比之下，普通RT-PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。样品可以是器官、组织、细胞中的PI-3，并可与不同的流感株相区别，这是免疫学方法无法替代的。但这种传统的定量方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA或RNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA或RNA拷贝数。因此，如何快速、准确测定牛副流行性感冒3型病毒是面临的主要难题之一。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determinedby LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，163：29-38)、病原体的定性(Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detection andClassification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，83：1-10.)和定量检测(Kathy F.J.Tang，Jun Wang，Donald V.Lightner.Quantitation of Taurasyndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assay[J].J.Virol.Methods，115(2004)109-114.；Birgit Liss^*.Improved quantitative real-time RT-PCR forexpression profiling of individual cells[J].Nucleic Acids Res.，2002，Vol.30 No.17e89.；Franck Housseau a，limberly R.Lindsey a，et al.Quantitative real-time RT-PCRas a method for monitoring T lymphocyte reactivity to full-length tyrosinase proteinin vaccinated melanoma patients[J].J.Immunol.Methods 266(2002)87-103.；DesireN，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency VirusType 1 Proviral Load by a TaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，39：1303-1310.；Martell M，Gomez J，Esteban JI，et al.High-ThroughputReal-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37：327-332.；Cordey，S.，Thomas，Y.，Cherpillod，P.，van Belle，S.，Tapparel，C.，Kaiser，L.Simultaneous detection of parainfluenza viruses 1 and 3 byreal-time reverse transcription-polymerase chain reaction[J].J.Virol.Methods，2009，156：166-168.；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCV RNAusing real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95：111-119.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量主要方法，国内目前也已有关于丙肝、乙肝、支原体、爱滋病、结核定量检测的试剂盒上市。

发明内容：

本发明的目的是在于提供了一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高、定量快速准确、检测范围广、稳定性好。

本发明的另一个目的是在于提供了一种荧光定量PCR试剂盒在抗牛副流行性感冒3型病毒药物研究中的应用，可对牛血液制品和牛血清进行定量检测和质量监控，也可以进行牛副流行性感冒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒：它包括a)RNA抽提液、b)逆转录反应液、c)RNA酶抑制剂、d)逆转录酶、e)引物和荧光探针(TaqMan)、f)标准阳性DNA模板、g)荧光定量PCR反应液，其特征在于：采用传统的两步法扩增(Two-Step RT-PCR)，即第一步进行逆转录反应，将RNA样品逆转录成cDNA，第二步进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性DNA样品定量检测未知样品。用DNA作为标准品，使得定量反应结果更加稳定可靠，并大大增加了实验的重复性，减少误差。逆转录反应液含有逆转录酶反应液，RNA酶抑制剂，荧光定量反应液含有引物和荧光探针，引物序列分别为正义引物：(FP)5’-TTGGGACAATTGCGATAGGGATAG-3’(SEQ ID NO：1)，反义引物(RT)：5’-CTGCCTTGTTTGTGTCTCTTATAGC-3’(SEQ ID NO：2)，扩增子大小为129bp。荧光探针序列为5′FAM-TTCAGCACAAATCACCGCAGCAGTCGC-TAMRA-3′(SEQ ID NO：3)，探针的5’端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素)，3’端标以荧光淬灭基团TAMRA。标准阳性DNA模板由已插入牛副流行性感冒3型病毒保守的F蛋白编码区188bp片段的pGEM-T载体(购自Promega公司)转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen)，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。所述的逆转录反应液是由5×buffer，10μmol/L的正义引物，逆转录酶，RNA酶抑制剂，10mM dNTPs和无核酸酶的灭菌双蒸水组成；荧光定量PCR反应液由10×buffer、10μM的正义引物和反义引物、10μM的荧光探针和热启动TaqDNA聚合酶、无菌双蒸水组成。

所述的标准阳性模板DNA核苷酸序列为：

ttgggacaattgcgatagggatagccacttcagcacaaatcaccgcagcagtcgctcttgtcgaagctaaaca

ggcaaagtcagacatagaa aaactcaaagaggctataagagacacaaacaaggcag。

在本发明的一个优选方案中，采用传统的两步法扩增(Two-Step RT-PCR)，即第一步进行逆转录反应，将RNA样品逆转录成cDNA，第二步进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性DNA样品定量检测未知样品。用DNA作为标准品，使得定量反应结果更加稳定可靠，并大大增加了实验的重复性，减少误差。在本发明的一个具体方案中，逆转录反应液由正义引物(FP)，逆转录酶，RNA酶抑制剂，5×buffer溶液，10mM dNTPs和无核酸酶的灭菌双蒸水组成；荧光定量PCR反应液由正义引物(FP)，反义引物(RT)，荧光探针(TaqMan)，10×buffer溶液，热启动Taq DNA聚合酶，灭菌双蒸水组成；在本发明的一个具体方案中，逆转录反应液由5×buffer溶液5μl，10μmol/L的正义(FP)引物2.5μl，10mMdNTPs1.5μl，逆转录酶和RNA酶抑制剂各1μl，无核酸酶的灭菌双蒸水9μl组成；荧光定量反应液由10×buffer溶液2.5μl，10μmol/L正义(FP)、反义(RT)引物各3μl，10μmol/L荧光探针0.75μl，dNTPs(10mM)1μl，热启动Taq DNA聚合酶0.25μl，Mg₂SO₄(50mM)0.5μl，灭菌双蒸水9μl组成。其中荧光探针为(SEQID NO：3)所示的核苷酸序列，荧光探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA。

在本发明的一个优选方案中，标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(购自promega公司)载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。实验所用的标准品制备过程为：PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用Omega公司的凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体(购自promega公司)4℃过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR鉴定阳性后送英骏生物工程有限公司测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆菌接种到含氨卞的LB培养基过夜培养，用SDS碱裂解法制备质粒DNA，经Omega公司的凝胶纯化试剂盒纯化后于紫外分光光度计测A₂₆₀定量，并稀释至梯度10⁹-10²拷贝/10μl，-70℃保存。

在本发明提供检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒中，有一条一端标记有荧光报告基团另一端标记有荧光淬灭基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光探测器检测，模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，所以荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对牛副流行性感冒3型病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数，Ct值与起始模数呈线性关系(起始模板数＝10^{(Ct值/斜率+x轴截距)})，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明提供检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒中，针对牛副流行性感冒3型病毒的基因组的靶片段碱基排列的特殊性，将反应体系(引物和探针浓度、Mg²⁺浓度、扩增程序等)优化，并将Q-PCR技术和定量检测系统(包括LigthCycler系统，Roche，ABI Prism系统，PE Applied Biosystems)相结合，将其用于各种来源的牛副流行性感冒3型病毒样品的定量检测。通过优化方案，反复实验，以及与传统检测方法进行比较，建立了定量检测牛副流行性感冒3型病毒的方法，并研制出牛副流行性感冒3型病毒的定量检测试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出100个以下的病毒基因拷贝数，检测范围可以达到八个数量级。

在本发明的另外一个方面，本发明还提供了一种荧光定量PCR试剂盒对牛副流行性感冒3型病毒进行检测的方法，该方法包括下列步骤：

A)用f)标准阳性DNA模板由插入目的片段的pGEM-T(购自promega公司)载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并用紫外分光光度计定量；

B)用a)RNA抽提液从待测标本中提取RNA，然后加b)逆转录反应液，c)RNA酶抑制剂，d)逆转录酶，e)正义引物进行逆转录，C)荧光定量PCR由e)引物和荧光探针(TaqMan)，g)荧光定量PCR反应液，f)标准阳性DNA模板或逆转录反应产物组成，已加入了标准品及待测样品的荧光定量反应液PCR反应体系上机，用荧光定量检测仪进行PCR检测；

D)通过比较待测样品和标准品的循环域值根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。

在本发明中提供的检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒可对各种来源的牛副流行性感冒3型病毒样品进行准确定量检测，并可对牛血液制品和牛血清进行定量检测和质量监控，也可以进行牛副流行性感冒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1.与传统定量方法相比，此实时荧光定量PCR具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，直接对PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始RNA拷贝数，做到了真正意义上的核酸定量。

2.与一步法相比，本实验采用两步法扩增(Two-Step RT-PCR)，用已知浓度的DNA标准品使得定量反应结果更加稳定可靠，并大大增加了实验的重复性，减少误差。

3.检测范围广，在10⁹-10²copies/reaction浓度范围内有极好的线性关系(R＝0.999)，检测范围可以达到八个数量级，已达到国际先进水平，其灵敏度可检测100copies以下，是其它任何方法无法比拟的。

4.适用于各种型号的荧光定量扩增仪，一次实验中三个重复样品相应的变异系数(CV)小于2％，说明其极高的重复性和稳定性。

5.该实时荧光定量PCR利用外标准曲线，是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；F.M.奥斯伯等主编，科学出版社，2005，精编分子生物学实验指南，或按照制造厂商建议的条件。

实施例1牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒组成及其反应条件

A).试剂盒组成：

a)试剂盒组成如下：(10次反应)

RNA提取液A(4ml/管)        RNA提取液B(800μl/管)

逆转录反应液(90μl/管)    逆转录酶(10μl/管)

RNA酶抑制剂(400U/管)

强阳性标准品(100倍稀释定值准品20μl/管，共四管)

PCR反应管(无菌、无RNA酶和DNA酶)    DEPC H₂O(2ml/管)

阴性标准品(50μl/管)        临界阳性标准品(50μl/管)

PCR扩增反应液(220μl/管)    热启动Taq DNA聚合酶(2.75μl/管)

(RNA提取液A为Invitrogen公司产品。b)逆转录反应液，d)逆转录酶(购自Promega公司，g)荧光定量PCR反应液和RNA酶抑制剂(40U/μl)购自TAKARA公司。)

B).逆转录反应液(反应总体积是25μl)：由5×buffer溶液5μl，10μmol/L的正义引物FP(SEQ ID NO：1)2.5μl，10mM dNTPs1.5μl，逆转录酶和RNA酶抑制剂各1μl，无核酸酶的灭菌双蒸水9μl和待测样品5μl组成；荧光定量反应液(反应总体积是25μl)：10×buffer 2.5μl，正义引物FP(SEQ ID NO：1)和反义引物RT(SEQ ID NO：2)各3μl(10μmol/L)，荧光探针0.75μl(10μmol/L)，dNTPs(10mM)1μl，Mg₂SO₄(50mM)0.5μl，热启动Taq DNA聚合酶0.25μl，待测样品的cDNA或标准品，灭菌双蒸水9μl组成。其中荧光探针为(SEQ IDNO：3)所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。

C).反应条件如下：(采用两步法)

cDNA synthesis：70℃        10min

                0℃         2min

                0℃         pause

                42℃        50min

                70℃        10min

PCR：           95℃，2min

                94℃，15s

                60℃，60s

                40cycles

在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对牛副流行性感冒3型病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。

D).荧光定量PCR试剂盒检测牛副流行性感冒3型病毒的灵敏度、检测范围及稳定性

取转录的标准品RNA10⁹-10²c/r浓度范围，每个浓度三个重复，加RNA裂解液400μl充分混匀，室温(20-25℃，以下相同)静置10分钟，加80μl氯仿，室温静置3分钟，于4℃12000g/min离心10分钟，上清液转移到另一个离心管，加200μl异丙醇，室温沉淀10分钟，4℃12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml 75％(体积比)乙醇充分吹散，于4℃7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然干燥，加无RNA酶水25μl 60℃10min溶解。

E).取D)步所提RNA 5μl，然后加逆转录反应液5×buffer 5μl，正义引物FP(SEQ ID NO：1)2.5μl(10μmol/L)，10mM dNTPs 1.5μl，RNA酶抑制剂(40U/μl)，逆转录酶1μl，分别加入对应编号的PCR反应管，在PCR仪上进行逆转录实验。反应条件为：70℃10min，0℃2min，42℃50min，70℃10min。荧光定量反应液10×buffer 2.5μl，正义引物FP(SEQ ID NO：1)和反义引物RT(SEQ ID NO：2)各3μl(10μmol/L)，荧光探针0.75μl(10μmol/L)，dNTPs(10mM)1μl，Mg₂SO₄(50mM)0.5μl，热启动Taq DNA聚合酶0.25μl，待测样品的cDNA或标准品，灭菌双蒸水9μl，分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性2min；94℃15s，60℃60s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为518nm。

循环结束后，运用Eppendorf公司的Mastercycler ep Realplex仪器自带的分析软件(Realplex)，读取待检样品拷贝数。结果为：

序列号	名称	类型	阈值(Ct)	设定浓度	变异系数％
						1	A1	Standard	12.12	1000000000	0.14
2	A2	Standard	12.15	1000000000	0.11
						3	A3	Standard	12.14	1000000000	0.02
4	B1	Standard	15.21	100000000	0.07
						5	B2	Standard	15.24	100000000	0.26
6	B3	Standard	15.16	100000000	0.26
						7	C1	Standard	18.82	10000000	0.16
8	C2	Standard	18.84	10000000	0.05
						9	C3	Standard	18.88	10000000	0.16
10	D1	Standard	21.63	1000000	0.21
						11	D2	Standard	21.68	1000000	0.11
12	D3	Standard	21.66	1000000	0.01
						13	E1	Standard	25.23	100000	0.07
14	E2	Standard	25.27	100000	0.09
						15	E3	Standard	25.24	100000	0.03
16	F1	Standard	29.06	10000	0.07
						17	F2	Standard	29.08	10000	0
18	F3	Standard	29.10	10000	0.07
						19	G1	Standard	31.62	1000	0.06
20	G2	Standard	31.55	1000	0.16
						21	G3	Standard	31.64	1000	0.13
22	H1	Standard	34.82	100	0.11
						23	H2	Standard	34.90	100	0.11
24	H3	Standard	34.86	100	0

25

CK-

NTC

-

以上结果表明：该试剂盒检测范围广，在10⁹-10²c/r浓度范围内有极好的线性关系，相关系数R＝0.999其检测范围可以达到九个数量级，其灵敏度可检测100copies以下，且稳定性好，一次实验中三个重复样品相应的变异系数(CV)小于1％，说明其极高的重复性，适用于各种型号的荧光定量扩增仪，是其它任何方法无法比拟的。

实施例2：牛副流行性感冒3型病毒荧光定量PCR试剂盒在奶牛感染牛副流行性感冒3型病毒流行病学调查中的应用

A).试剂盒组成：

a)试剂盒组成如下：(10次反应)

RNA提取液A(5ml/管)    RNA提取液B(5ml/管)

RNA提取液C(10ml/管)

过滤柱A和吸附柱B(无菌、无RNA酶和DNA酶)

逆转录反应液(90μl/管)    反转录酶(10μl/管)

RNA酶抑制剂(400U/管)

强阳性标准品(100倍稀释定值准品20μl/管，共四管)

PCR反应管(无菌、无RNA酶和DNA酶)    DEPC H₂O(2ml/管)

阴性标准品(50μl/管)        临界阳性标准品(50μl/管)

PCR扩增反应液(220μl/管)    热启动Taq DNA聚合酶(2.75μl/管)

(RNA提取液A、B、C和过滤柱吸附柱为天根公司产品。b)逆转录反应液，d)逆转录酶购自Promega公司，g)荧光定量PCR反应液和RNA酶抑制剂(40U/μl)购自TAKARA公司)

B).奶牛血清中提取病毒过程：取200μl待测的血清样品或加入病毒的阳性血清样品，加入500μl RNA提取液A(使用前加入β-巯基乙醇，终浓度1％(体积比)；上述溶液转移至过滤柱CS，12000rpm离心2min，收集滤液；向滤液中加入1倍体积的70％乙醇，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱B中，12000rpm离心1min，弃废液；吸附柱B中加入350μl RNA提取液B，12000rpm离心1min，弃废液，重复一次；吸附柱B中加入700μl RNA提取液C(使用前加入无水乙醇)，室温放置2min，12000rpm离心1min，重复一次；空离吸附柱，12000rpm离心2min；30μl RNase-free ddH₂O加入吸附柱B，室温(20～25℃)放置2-5min，12000rpm离心2min；得到的RNA用于下游的逆转录实验。

C).逆转录反应液(反应总体积是25μl)：由5×buffer溶液5μl，10μmol/L的正义引物RT(SEQ ID NO：1)2.5μl，10mM dNTPs1.5μl，逆转录酶和RNA酶抑制剂各1μl，无核酸酶的灭菌双蒸水9μl和待测样品5μl组成；荧光定量反应液由10×buffer 2.5μl，正义引物FP(SEQ ID NO：1)和反义引物RT(SEQ ID NO：2)各3μl(10μmol/L)，荧光探针0.75μl(10μmol/L)，dNTPs(10mM)1μl，Mg₂SO₄(50mM)0.5μl，热启动Taq DNA聚合酶0.25μl，待测样品的cDNA或标准品5μl，灭菌双蒸水9μl组成。其中荧光探针为(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。

D).反应条件如下：(采用两步法)

cDNA synthesis：70℃        10min

                0℃         2min

                0℃         pause

                42℃        50min

                70℃        10min

PCR：           95℃，2min

                94℃，15s

                60℃，60s

                40cycles

在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对PI-3的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。

E).奶牛血清中牛副流行性感冒3型病毒的检测

将不同来源的25份奶牛血清按B)所示的处理方法提取病毒RNA，分别进行逆转录和荧光定量PCR反应(按C)，D)步骤中所示进行)，每个样品重复两次，循环结束后，运用Eppendorf公司的Mastercycler ep Realplex仪器自带的分析软件(Realplex)，读取待检样品拷贝数。结果为：

奶牛编号	血清样品编号	PI-3-copies/ml	变异系数％
				5-189	A1	-
5-148	A2	-
				7-134	A3	-
601	A4	-
				2-257	A5	-
6-237	A6	(6.4±0.21)×103	0.05
				2-067	A7	-
6-248	A8	-
				5-188	A9	-
106	A10	-
				2-149	A11	-
5-177	A12	-
				6-312	A13	-
6-256	A14	-
				7-021	A15	-
2-034	A16	-
				6-065	A17	-
2-009	A18	-
				114	A19	-
2-147	A20	-
				6-730	A21	-
03-6116	A22	-
				2-082	A23	-
4-042	A24	-
				6-905	A25	-

以上结果表明，奶牛编号为6-237的牛血清中含有牛副流行性感冒3型病毒，表明奶牛群中存在少量的奶牛携带PI-3，同时证实了牛副流行性感冒3型病毒荧光定量PCR试剂盒能成功应用于PI-3流行病学调查，牛血清以及牛血液制品的

监测，重复性好，CV值均小于1％。

实施例3：牛副流行性感冒3型病毒荧光定量PCR试剂盒在市售牛血清检测中的应用

A).试剂盒组成：

a)试剂盒组成如下：(10次反应)

RNA提取液A(4ml/管)        RNA提取液B(800μl/管)

逆转录反应液(90μl/管)    反转录酶(10μl/管)

RNA酶抑制剂(400U/管)

强阳性标准品(100倍稀释定值准品20μl/管，共四管)

PCR反应管(无菌、无RNA酶和DNA酶)    DEPC H₂O(2ml/管)

阴性标准品(50μl/管)        临界阳性标准品(50μl/管)

PCR扩增反应液(220μl/管)    热启动Taq DNA聚合酶(2.75μl/管)

(RNA提取液A为Invitrogen公司产品。b)逆转录反应液，d)逆转录酶购自Promega公司，g)荧光定量PCR反应液和RNA酶抑制剂(40U/μl)购自TAKARA公司。)

B).逆转录反应液(反应总体积是25μl)：由5×buffer溶液5μl，10μmol/L的正义引物FP(SEQ ID NO：1)2.5μl，10mM dNTPs1.5μl，逆转录酶和RNA酶抑制剂各1μl，无核酸酶的灭菌双蒸水9μl和待测样品5μl组成；荧光定量反应液由10×buffer 2.5μl，正义引物FP(SEQ ID NO：1)和反义引物RT(SEQ ID NO：2)各3μl(10μmol/L)，荧光探针0.75μl(10μmol/L)，dNTPs(10mM)1μl，Mg₂SO₄(50mM)0.5μl，热启动Taq DNA聚合酶0.25μl，待测样品的cDNA或标准品5μl，灭菌双蒸水9μl组成。其中荧光探针为(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。

C).反应条件如下：(采用两步法)

cDNA synthesis：70℃           10min

                0℃            2min

                0℃            pause

            42℃        50min

            70℃        10min

PCR：       95℃，2min

            94℃，15s

            60℃，60s

            40cycles

在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对PI-3的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。

D)实验方法

1.细胞培养

1)培养的原代牛肾细胞(Bovine Kidney Cell，BKC)细胞铺制6孔板×4块，2ml/孔，50％汇合度；

2)待检血清用MEM配制为5％(体积比)浓度；

3)细胞贴壁后，更换为待检血清配制的培养基，2ml/孔；

4)同时设阴性和阳性对照，阳性对照加含有PI-3的5％(体积比)FBS MEM；

5)37℃，5％(体积比)CO₂培养箱中培养，并观察是否有CPE的产生。

6)72h后，收集细胞，2000rpm离心5min暂存于-80℃。其余样品同样方法处理。提取细胞的总RNA，作为RT的模板。

2.细胞中总RNA的提取

每个样品加入RNA提取液A 400μl，室温(20-25℃)放置10min，加入RNA提取液B 80μl，剧烈震荡15s，室温(20-25℃)放置2～3min；4℃，12000rpm离心15min，取上清200μl，移入一个新的EP管，再加入异丙醇200μl，室温下静置10min；4℃，12000rpm离心15min；弃上清，沉淀加入75％(体积比)冷乙醇400μl，涡旋，4℃，7500rpm离心5min，弃上清留沉淀，于室温静置5～10min晾干乙醇，加入25μl DEPC水溶解沉淀。

3.逆转录反应和荧光定量PCR反应按B)，C)步骤所示进行(依次进行一次，逆转录后进行荧光定量PCR反应)。

E).实验结果

以上结果表明四个公司全部待检批号的血清均表现为PI-3阴性，而阳性对照细胞中检测出大量的PI-3，表明该试剂盒能用于检测细胞样品中的病毒。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉三利生物技术有限公司

<120>一种检测牛副流感3型病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

<130>一种检测牛副流感3型病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ttgggacaat tgcgataggg atag    24

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ctgccttgtt tgtgtctctt atagc  25

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ttcagcacaa atcaccgcag cagtcgc  27

Claims (5)

1、一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a)RNA抽提液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)引物和TaqMan探针、f)标准阳性DNA模板、g)荧光定量PCR反应液，其特征在于：引物序列分别为正义引物：5’-TTGGGACAATTGCGATAGGGATAG-3’，反义引物：5’-CTGCCTTGTTTGTGTCTCTTATAGC-3’，扩增子大小为129bp，荧光探针序列为：5′FAM-TTCAGCACAAATCACCGCAGCAG-TCGC-TAMRA-3′，探针的5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性DNA模板由已插入牛副流行性感冒3型病毒保守的F蛋白编码区188bp片段的pGEM-T载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。

2、根据权利要求1所述的一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征是：所述的逆转录反应液是由5×buffer、10μmol/L的正义和反义引物、逆转录酶、RNA酶抑制剂、10mM dNTPs和无核酸酶的灭菌双蒸水组成。

3、根据权利要求1所述的一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的荧光定量PCR反应液由10×buffer、10μM的正义引物和反义引物、10μM的荧光探针和热启动Taq DNA聚合酶、无核酸酶的双蒸水组成。

4、根据权利要求1所述的一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征是：所述的标准阳性DNA模板核苷酸序列为：

ttgggacaattgcgatagggatagccacttcagcacaaatcaccgcagcagtcgctcttgtcgaagctaaaca

ggcaaagtcagacatagaa aaactcaaagaggctataagagacacaaacaaggcag

5、权利要求1所述的一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量PCR试剂盒在奶牛感染牛副流行性感冒3型病毒流行病学调查中的应用。