CN108841999A

CN108841999A - 一种检测口蹄疫o、a型的巣式pcr引物对及其方法

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Publication number: CN108841999A
Application number: CN201810722766.9A
Authority: CN
Inventors: 李守军; 黄灿平; 孙阳阳; 任东兴; 付旭彬; 徐琼; 陈庚; 吕传忠; 陈文娟; 蔡天宁; 高华义
Original assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2018-11-20

Abstract

本发明涉及一种检测口蹄疫O、A型的巢式PCR引物对及其方法，由第一轮PCR特异性引物对及第二轮PCR特异性引物对组成，所述第二轮PCR特异性引物对对第一轮PCR特异性引物对的扩增产物进行PCR扩增；还涉及检测口蹄疫O、A型的巢式PCR引物对在制备检测O、A型口蹄疫试剂中的用途以及所述巢式PCR引物对在区分口蹄疫全病毒灭活疫苗和多肽疫苗的方法中的用途。本发明对口蹄疫的RNA聚合酶基因进行引物设计，敏感性很高，可检测到53个拷贝数/μl；可同时检测到O型和A型口蹄疫，并可通过PCR产物测序进行分型。

Description

一种检测口蹄疫O、A型的巣式PCR引物对及其方法

技术领域

本发明涉及一种用于口蹄疫的检测方法，特别是检测O、A型口蹄疫的巣式PCR引物对及其方法，属于生物技术领域。

背景技术

口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其他动物。其临诊特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，我国流行的口蹄疫主要为O、A、亚洲Ⅰ型。各个血清型的病毒之间不能产生交叉免疫。

临床上，与口蹄疫类似症状的疫病有水疱性口炎、猪水疱病等，很难根据临床症状进行确诊，必须进行实验室诊断才能确诊。目前最常用的实验室诊断方法有病毒的分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应试验(RT-PCR)、荧光定量PCR等。病毒分离试验的时间至少需要7天；常用的RT-PCR，检测的敏感性较低；荧光定量PCR成本较高，需要昂贵的仪器设备。早期诊断和疫苗的有效使用对于口蹄疫的防控具有非常重要的意义，口蹄疫的早期诊断需要快速、准确的检测方法，因此，建立对FMDV快速、灵敏、便捷的检测方法，将为口蹄疫快速有效控制提供坚实的技术支撑。

另外，目前我国猪O型口蹄疫预防用疫苗主要为传统的灭活疫苗和新型的合成肽疫苗。口蹄疫灭活疫苗是利用常规技术制造的以灭活病毒为抗原的一类疫苗，是通过实验筛选的田间毒株作为疫苗种毒，经病毒培养系统大量增值，对获得的病毒灭活处理添加佐剂制成的疫苗。猪口蹄疫O型灭活疫苗主要生产工序为培养细胞、病毒生产、抗原浓缩与纯化、抗原的灭活和乳化。目前应用细胞生产口蹄疫灭活疫苗，其灭活剂BEI只灭活口蹄疫病毒，对培养液中的酶等没有作用，而酶在疫苗存放过程中会逐渐裂解灭活的口蹄疫病毒，使其效力逐步减退。

口蹄疫是一类病原微生物，目前市场上的口蹄疫全病毒灭活疫苗，可能会因为生产车间不严格、灭活不彻底存在散毒的风险，猪口蹄疫O型合成肽疫苗的生产工艺则能够完全克服灭活疫苗存放过程中效力逐步减退和生物安全的缺陷，猪口蹄疫O型合成肽疫苗采用固相多肽合成技术，在体外人工合成口蹄疫病毒主要抗原位点(合成肽)并连接人工T细胞位点，以此作为免疫原与进口佐剂混合配制而成油乳剂疫苗。合成肽疫苗质量具有非常好的稳定性，口蹄疫病毒VP1蛋白的合成及细胞位点的结合系采用全球最先进的合成仪控制，抗原含量精确稳定。合成肽疫苗经过十多年的生产，工艺日趋成熟稳定，相比于灭活疫苗具有很大优势。猪口蹄疫O型灭活疫苗只能产生体液免疫，不能产生细胞免疫，因此免疫期短，1头肉猪从出生到上市需要进行多次免疫接种，其缺点是显而易见的；而猪口蹄疫O型合成肽疫苗具有较高的安全性，由于其合成肽成分较单一，有效抗原浓度高，加之含有能够刺激辅助性T淋巴细胞的短肽，因此免疫效果特别好。

但现阶段存在企业将灭活疫苗掺入多肽疫苗的现象，按农业部要求，这种添加全病毒来增强疫苗效力的方式是违规的，目前急需出台一个质量控制标准，多肽疫苗的与传统的灭活疫苗进行快速有效的区分。

因此，能够快速精确的检测出口蹄疫O、A型在中国有非常大的意义。但目前还没有有效的解决方案。

发明内容

本发明针对目前中国亟需口蹄疫O、A型的检测方法，研究了一种检测O、A型口蹄疫的巣式PCR引物对及其方法。

一种检测口蹄疫O、A型的巢式PCR引物对，由第一轮PCR特异性引物对及第二轮PCR特异性引物对组成，所述第二轮PCR特异性引物对对第一轮PCR特异性引物对的扩增产物进行PCR扩增；

所述第一轮PCR特异性引物对核苷酸序列如下：

上游引物为FMDV-OA-OF 5’-CAGGATGATGATTGGCAGA TTYTGYGCNCARAT-3’(SEQ IDNo.1)，

下游引物为FMDV-OA-OR 5’-AGTCTTCAGGATCCACTCA GCRTTNGGGTGRAA-3’(SEQ IDNo.2)；

所述第二轮PCR特异性引物对核苷酸序列如下：

上游引物为FMDV-OA-IF 5’-GTTT AGCGGTCGGTTGTAACCCT GAYGTYGAYTGGCA-3’(SEQ ID No.3)，

下游引物为FMDV-OA-IR 5’-GTTT GTTAGCATCAAAGGCCGAA TARTCHACRTCCCA-3’(SEQ ID No.4)。

其中，Y表示碱基C或T；N表示碱基A、T、C或G；R表示碱基A或G，H表示碱基A、C或T。

上述巢式PCR引物对可用于制备检测O、A型口蹄疫的试剂。

上述巢式PCR引物对可用于区分全病毒灭活苗和多肽疫苗的方法。

上述检测口蹄疫O、A型的巣式PCR方法，包括以下步骤：

1)提取样品中的RNA，低温保存备用；

2)以一对特异性引物FMDV-OA-OF、FMDV-OA-OR对口蹄疫病毒RNA进行第一轮PCR扩增；

3)以另一对特异性引物FMDV-OA-IF、FMDV-OA-IR对第一轮PCR产物进行第二轮PCR扩增；

4)对扩增产物进行电泳检测，如果存在111bp的特异性条带，则确定所检测的样品中含有口蹄疫核酸。

所述样品为任何生物或环境的样品或口蹄疫疫苗，生物样品包括粘液、唾液、血液或是粪便等，环境样品包括水、污水或土壤等。

上述巢式PCR引物对的制备方法，包括以下步骤：

1)合成DNA片段并连接载体；

2)细菌转化及质粒提取；

3)质粒线性化；

4)用T7体外转录试剂盒进行体外转录；

5)转录产物的纯化；

6)RNA拷贝数的计算；

7)系列稀释RNA；

8)RNA的反转录；

9)配制5×甲酚红PCR上样缓冲液；

10)配制2×PCR Mix；

11)以一对特异性引物FMDV-OA-OF、FMDV-OA-OR对样品进行第一轮PCR扩增；

12)以另一对特异性引物FMDV-OA-IF、FMDV-OA-IR对样品第一轮PCR产物进行第二轮PCR扩增；

13)电泳检测；

14)PCR产物测序验证。

具体实现方式参见实施例1。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明对口蹄疫的RNA聚合酶基因进行引物设计，敏感性很高，可检测到53个拷贝数/μl；

2、本发明可同时检测到O型和A型口蹄疫，并可通过PCR产物测序进行分型；

3、由于口蹄疫病毒是单链RNA病毒，自然条件下核苷酸序列容易发生变异，本发明所披露的方法和引物能够在样本中检测任何类型的口蹄疫O、A型病毒。

4、所披露的方法具有高灵敏度，使用了所有已知亚型的口蹄疫O、A型进行引物设计。

5、从核酸角度入手，此巣式PCR能检出目前中国的O、A型流行株，可作为有效区分O、A型全病毒灭活苗和O、A型多肽疫苗的方法。

附图说明

图1.合成的基因片段连接到PGEM-3Z的载体上的质粒图

图2.质粒线性化图

其中：M：Mark 1：线性化的质粒 2：线性化的质粒

图3.第一轮PCR产物凝胶电泳图

其中：1：第一轮PCR稀释10¹⁰的RNA 2：第一轮PCR稀释10¹¹的RNA 3：第一轮PCR稀释10¹²的RNA 4：第一轮PCR阳性对照 M：Mark

图4.第二轮PCR产物凝胶电泳图

其中：M：Mark 1：第二轮PCR稀释108的RNA 2：第二轮PCR稀释109的RNA 3：第二轮PCR稀释1010的RNA 4：第二轮PCR稀释1011的RNA 5：第二轮PCR稀释1012的RNA 6：第二轮PCR阳性对照

图5.PCR产物测序验证结果

图6.猪O型口蹄疫核酸检验图

其中：M：Mark 1：阳性对照 2：猪O型口蹄疫多肽疫苗 3：阴性对照 4：阴性对照 5：猪O型口蹄疫灭活疫苗

图7.牛羊O、A型口蹄疫核酸检验图

其中：M：Mark 1、2:第一轮PCR阴性对照 3、4:第一轮PCR牛羊口蹄疫O、A型疫苗 5、6:第一轮PCR阳性对照 7、8:第二轮PCR阴性对照 9、10:第二轮PCR牛羊口蹄疫O、A型疫苗

11、12:第二轮PCR阳性对照

图8.牛羊O、A型口蹄疫核酸检验PCR产物测序结果图

具体实施方式

以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1：用于口蹄疫病毒O型和A型巣式PCR检测的引物以及检测方法的建立

1、合成DNA片段并连接载体

根据引物的结合位点选取一段600bp的口蹄疫序列，在其3’端加上52bp的转录终止子，并在口蹄疫序列的5’端加上EcoRI酶切位点，在转录终止子3’端加上BamHI酶切位点，应用基因合成技术，合成了一段664bp的基因。如表1所示。

表1基因合成片段

注：下划线部分为酶切位点序列，加粗斜体部分为终止子序列，中间部分为NCBI中的一段口蹄疫序列。

将合成的基因片段通过酶切酶连的方法连接到PGEM-3Z的载体上。最终得到如图1所示的质粒。

2、细菌转化及质粒提取

将重组质粒转化到细菌，并在氨苄抗性培养基(氨苄青霉素工作浓度100μg/mL)中进行培养，37℃培养16h；用天根质粒小提试剂盒进行质粒提取：

1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm(～13,400×g)离心10min。

6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)。

7)可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌(TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等)，这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌(DH5α，TOP10等)，这步可省略。

8)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9)重复操作步骤8)。

10)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

12)最终获得300ul质粒，浓度为314ng/ul，将质粒分装储存在-80℃冰箱。

3、质粒线性化

将提取的质粒用BamHI进行酶切，具体操作方法：

1)按照表2配制反应液：

表2.反应液配制表

所需试剂	质粒DNA
		10×QuickCut Buffer	5μl
DNA	≤1μg(本次试验取3μl)
		QuickCut BamH I	1μl
灭菌水	Up to 50μl

2)轻轻混匀后瞬时离心。

3)30℃保温5min。

将酶切后的线性化质粒用1％的凝胶进行电泳，得到3380bp的线性化的质粒(参见图2)。

鉴于目的条带是单一的，酶切后用PCR产物回收试剂盒回收线性化质粒：

1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。

3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

4)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW静置2-5min后(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

5)重复步骤4。

6)将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

7)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl双蒸水，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。

8)用Nanodrop 2000测回收后的产物浓度为447.3ng/μl。

4、用T7体外转录试剂盒进行体外转录

将上一步纯化并测量浓度的线性化质粒作为模板，进行体外转录。

1)按表3配制反应体系。

表3.反应体系配置表

Component	Volume
		Template(线性化的质粒)	1ug(本次试验为2μl)
5×T7Transcription Reaction Buffer	4ul
		10Mm NTP Mix	8ul
T7Transcription Enzyme Mix	2ul
		Rnase-free Water	To 20ul(本次试验为4μl)

2)充分混匀后37℃反应2小时。

3)加入1ul DnaseI，37℃反应15分钟后，加入1ul 500mM EDTA(pH 8.0)终止反应(加入EDTA后立即进行后续纯化)。

5、转录产物的纯化

用Qiagen的病毒RNA提取试剂盒进行纯化，其中根据样品的特点，将部分试剂进行更换。

1)移取560ul的异丙醇于1.5ml的离心管中。

2)向上一步1.5ml的离心管中加入140ul的转录产物，吹打混匀。

3)在室温下(15-25℃)孵育10min。

4)取新的小型离心柱放于2ml的收集管中，从上一步的1.5ml离心管中吸取630ul加入到小型离心柱中，8000r离心1min，将小型离心柱放置于新的收集管中，弃掉含有滤液的收集管。

5)重复步骤4。

6)小心打开小型离心柱，向离心管中加入500ul的Buffer AW1。盖上盖子，6000r离心1min。将小型离心柱放置于新的收集管中，弃掉含有滤液的收集管。

7)小心打开小型离心柱，向离心管中加入500ul的Buffer AW2。盖上盖子，14000r离心3min。将小型离心柱放置于新的收集管中，弃掉含有滤液的收集管。

8)空离1min。

9)将小型离心柱放置于1.5ml的离心管中，弃掉含有滤液的收集管。向小型离心柱中加入50ul的双蒸水，在室温静置1min后8000r离心1min。

纯化后的RNA为50ul，用Nanodrop 2000测回收后的产物浓度为530.0ng/ul

6、RNA拷贝数的计算

1)ssRNA的精确分子量(RNA转录本)：

分子量＝(An x 329.2)+(Un x 306.2)+(Cn x 305.2)+(Gn x 345.2)+159^a

An、Un、Cn及Gn分别指多核苷酸中相应核苷酸的数目。

计算得到的分子量在生理pH条件下有效。

^a分子量额外加上“159”是为了将5’端三磷酸基团计算在内。

经计算A、T、C、G的个数分别为：A:165U:144C:140G:151

所以，分子量＝193423g/mol

2)拷贝数计算

用NanoDrop 2000测ssRNA浓度；

7、系列稀释RNA

a)用移液器取纯化过(已计算拷贝数)的RNA 10ul，加入到(注意枪头不能接触液面)90ul的RNase-free water中，吹打20次进行混匀；

b)用移液器取上一步混匀的RNA 50ul，加入到(注意枪头不能接触液面)450ul的RNase-free water中，吹打20次进行混匀；

c)如步骤b所示，依次稀释到14管；

所以，RNA依次被稀释了10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴倍，如表4所示

表4.RNA稀释数据

RNA稀释倍数	RNA拷贝数
		10¹	5.30×10¹¹
10²	5.30×10¹⁰
		10³	5.30×10⁹
10⁴	5.30×10⁸
		10⁵	5.30×10⁷
10⁶	5.30×10⁶
		10⁷	5.30×10⁵
10⁸	5.30×10⁴
		10⁹	5.30×10³
10¹⁰	5.30×10²
		10¹¹	5.30×10¹
10¹²	5.30×100
		10¹³	5.30×10^-1
10¹⁴	5.30×10^-2

8、RNA的反转录

用TaKaRa的反转录试剂盒进行反转录，按照操作手册中的步骤进行。

1)反转录体系准备，如表5所示。

表5.反转录体系配制表

试剂	使用量
		Random 6mers(50μM)	1ul
dNTP Mixture(10mM each)	1ul
		模板RNA	8ul
总体积	10ul

2)65℃5分钟加热混合物，然后于冰上放置至少1min。

3)取出PCR管，短暂离心后加入表6所示试剂

表6.试剂配制表

试剂	使用量
		上述变性后反应液(from step 2)	10μl
5×PrimeScript II Buffer	4μl
		RNase Inhibitor(40U/μl)	0.5μl(20U)
PrimeScript IIRTase(200U/μl)	1μl(200U)
		RNase Free dH2O	Up to 20μl

4)缓慢混匀。

5)按下列条件进行反转录反应：

30℃10min

42℃60min

6)95℃5min酶失活后，冰上冷却。

9、配制5×甲酚红PCR上样缓冲液：

5×甲酚红PCR上样缓冲液的组份为0.04％甲酚红，60％蔗糖。甲酚红在60％的蔗糖中很难溶解，需要加热后，再过夜搅拌。可配成500mL，分装到50mL离心管中，存放于4℃。如果是直接用作PCR产物上样缓冲液，最好是过滤一下。如果用来配制如下的2×PCR Mix，可暂不过滤。

10、配制2×PCR Mix：

10×Buffer(Takara) 10mL，dNTP(2.5mM) 8mL，DMSO 5mL，5×甲酚红PCR上样缓冲液 20mL，PCR水 7mL，总体系 50mL；配制好之后，以0.22μM(油性)小滤器过滤，再进行分装，每管1mL冻存于-20℃备用。

11、以一对特异性引物FMDV-OA-OF、FMDV-OA-OR对样品进行第一轮PCR扩增；引物列表如下：

注：

1)其中，Y表示碱基C或T；N表示碱基A、T、C或G；R表示碱基A或G；

2)括号中的数字，是以I(次黄嘌呤)替代N后，这条引物的简并率。

3)引物分别以灭菌的ddH₂O稀释成20μM。简并引物是常规引物使用量的3倍。所述第一轮PCR扩增方法是：在PCR试剂管Ⅰ中的反应液总体积为20μl，包括：2×PCR Mix 10μL，引物OF 1.2μL，引物OR 1.2μL，cDNA 2μL，Ex Taq 0.6μL，H₂O 5μL；离心2～5秒钟混匀，置于PCR仪内扩增反应；反应条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性60秒，44℃退火60秒，72℃延伸60秒，5个循环；然后94℃变性60秒，54℃退火60秒，72℃延伸60秒，30个循环；最后72℃延伸5分钟，得口蹄疫O、A型第一轮PCR产物；

12、以另一对特异性引物FMDV-OA-IF、FMDV-OA-IR对样品第一轮PCR产物进行第二轮PCR扩增；

注：

1)其中，Y表示碱基C或T；N表示碱基A、T、C或G；R表示碱基A或G；H表示碱基A、C或T。

3)引物分别以灭菌的ddH₂O稀释成20μM。简并引物是常规引物使用量的3倍。

所述第二轮PCR扩增方法是：在PCR试剂管Ⅱ中加入口蹄疫O、A型第一轮PCR产物进行反应，其反应液总体积为20μl，包括：口蹄疫O、A型第一轮PCR产物5.0μl，2×PCR Mix 10μL，引物IF 1.2μL，引物IR 1.2μL，第一轮产物5μL，Ex Taq 0.6μL，H2O 2μL；离心2～5秒钟混匀，置于PCR仪内扩增反应；反应条件为：反应条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性60秒，48℃退火60秒，72℃延伸60秒，5个循环；然后94℃变性60秒，58℃退火60秒，72℃延伸60秒，30个循环；最后72℃延伸5分钟，得口蹄疫O、A型第二轮PCR产物；

13、电泳检测

取第二轮PCR产物5～10μl，与2～6μl 0.25％(质量/体积)溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.8～2％(质量/体积)Goldview的0.7～1％(质量/体积)琼脂糖凝胶在电压80～100V下电泳20～30分钟，于凝胶成像系统中透射紫外灯下拍照检测，结果如下：

第一轮和第二轮PCR产物经凝胶电泳确认后，如图3、图4所示。

第一二轮的结果说明：能检测到稀释了10¹¹的RNA，拷贝数为53。

重复三次试验，均能检测到稀释了10¹¹的RNA，拷贝数为53。

14、PCR产物测序验证

经测序，如图5所示，PCR结果与原始合成的序列100％一致。

实施例2：猪O型口蹄疫核酸检验

将购买的猪O型口蹄疫疫苗进行破乳，用Milipore100超滤柱进行超滤，结果从20ml破乳疫苗浓缩至0.2ml，提取核酸，进行巣式PCR，结果如图6所示，在第一轮PCR中即可检测到。

用猪O型口蹄疫核酸检验，可以用来检测疫苗中的存在的O型和A型口蹄疫抗原。

实施例3：牛羊O、A型口蹄疫核酸检验

将购买的牛羊O、A型口蹄疫疫苗进行破乳，用Milipore100超滤柱进行超滤，结果从20ml破乳疫苗浓缩至0.2ml，提取核酸，用上述巣式PCR进行检验，结果如图7所示。

结果表明，可以扩增出疫苗中的核酸。将第一轮、第二轮PCR产物连接pGEM-T载体，转化DH5α感受态细胞，涂板，分别挑取第一二轮的载体4个阳性转化子进行测序，结果如图8所示。

经NCBI的blast可知，牛羊口蹄疫O、A型疫苗转化子1和2是口蹄疫O型，转化子3和4为口蹄疫A型。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

Claims

1.一种检测口蹄疫O、A型的巢式PCR引物对，其特征在于：由第一轮PCR特异性引物对及第二轮PCR特异性引物对组成，所述第二轮PCR特异性引物对对第一轮PCR特异性引物对的扩增产物进行PCR扩增；

所述第一轮PCR特异性引物对核苷酸序列如下：

上游引物为FMDV-OA-OF 5’-CAGGATGATGATTGGCAGA TTYTGYGCNCARAT-3’，

下游引物为FMDV-OA-OR 5’-AGTCTTCAGGATCCACTCA GCRTTNGGGTGRAA-3’；

所述第二轮PCR特异性引物对核苷酸序列如下：

上游引物为FMDV-OA-IF 5’-GTTT AGCGGTCGGTTGTAACCCT GAYGTYGAYTGGCA-3’，

下游引物为FMDV-OA-IR 5’-GTTT GTTAGCATCAAAGGCCGAA TARTCHACRTCCCA-3’；

2.如权利要求1所述的巢式PCR引物对在制备检测O、A型口蹄疫试剂中的用途。

3.如权利要求1所述的巢式PCR引物对在区分口蹄疫全病毒灭活疫苗和多肽疫苗的方法中的用途。

4.一种检测口蹄疫O、A型的巣式PCR方法，包括以下步骤：