CN103602754A - 一种北冬虫夏草的特异pcr鉴真方法 - Google Patents

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李辉
姚粟
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Abstract

本发明公开了一种北冬虫夏草的特异PCR鉴真方法。其技术方案是以样品的基因组DNA为模板，采用本发明设计的特异PCR引物，进行一次单管特异PCR反应，扩增冬北冬虫夏草的特征性持家基因，实际扩增片断为417bp，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品的真实性。本发明可特异性识别北冬虫夏草，只需DNA提取、PCR扩增和电泳检测三步即可完成对北冬虫夏草及其菌丝体、菌粉和胶囊等不同剂型产品的真实性检测，操作简单、易于掌握、准确性高。

Description

一种北冬虫夏草的特异PCR鉴真方法
技术领域
本发明属于新资源保健食品鉴真领域，具体涉及北冬虫夏草的鉴真方法。
背景技术
北冬虫夏草科学名为蛹虫草（Cordyceps militaris），是一味我国民间传统的名贵中药，其成分和功效与冬虫夏草相似，既能加工成药品保健品，又是餐桌上的佳肴，因此广受消费者喜爱。
作为冬虫夏草替代品，北冬虫夏草具有可人工栽培，产量高，成本低等优点，已形成规模化生产。据统计，我国2012年北冬虫夏草的生产量接近8000吨，市场规模达到近15亿元。然而，目前尚没有专门用于北冬虫夏草真假鉴别和质量控制的标准方法，产品质量难以保证，极大限制了北冬虫夏草产业的升级和规范发展。
因此，在北冬虫夏草生产和流通过程中，亟需一种有效、快速、准确的鉴真方法，以实现对其品质的控制和管理。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于北冬虫夏草鉴真的可靠方法。
为达到上述目的，本发明设计了北冬虫夏草性持家基因的特异PCR引物，通过一次单管PCR反应，扩增北冬虫夏草特征性持家基因，实际扩增片断为417bp。
用于北冬虫夏草鉴真的引物序列如下：
上游引物CICC- Cor -F1：5’- AGCGAAACCCGTCTATCACC -3’
下游引物CICC- Cor -R1：5’- CTTGGGGCCTTCTTCCGAAT -3’。
本发明采用的技术方案如下：
1)        获取样品基因组DNA；
2)        采用上述引物在PCR仪上进行PCR扩增；
PCR扩增反应体系为25μL，其中10×Taq reaction buffer 2.5μL，2条引物（10μmol/L）各1μL，10μmol/L 的dNTP 2μL，2.5U的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 17μL。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，进入循环：95℃ 30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃延伸5min。
3)        PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行检测。
4)        样品的真实性判断
    在紫外灯下查看电泳条带，在417bp处有明亮条带的为北冬虫夏草，无条带者为伪品。
    本发明经过充分的前期试验筛选和优化，得到的引物特异性强，PCR扩增条件简单，采用一次单管特异PCR反应后，通过电泳检测便可鉴别产品真伪，操作简单，成本低，准确度高，具有很好的应用前景。
 
附图说明
图1为北冬虫夏草RPB1基因特异性引物设计示意图，其中有下划线的部分为扩增片段对应的核苷酸序列，有下划线的斜体部分为所设计的引物特异性结合位点。 
图2为PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中的电泳图谱，1-DL2000 Marker，2-北冬虫夏草， 3-冬虫夏草菌粉，4-蝙蝠蛾拟青霉，5-亚香棒虫草，6-阴性对照，7- DL2000 Marker。
 
具体实施案例
下面结合实施案例对本发明进行具体说明，实施案例是为了进一步阐述本发明，而不会给本发明造成任何限制。
实施例一： PCR引物的设计及其对样品的检测
1        北冬虫夏草RPB1基因特异PCR引物的设计
根据GenBank上公开登录的北冬虫夏草RPB1基因序列信息进行引物设计（见附图1）。
参考序列的GenBank登录号为：JN992491。
在13-32处设计上游引物，命名为CICC-Cor-F1。序列为：5’- AGCGAAAC CCGTCTATCACC -3’。
在410-429处设计下游引物，命名为CICC-Cor-R1。序列为：5’- CTTGGGGC CTTCTTCCGAAT -3’。
 
2        样品的检测
2.1 样品的收集
购买市售北冬虫夏草、冬虫夏草菌粉、蝙蝠蛾拟青霉菌粉、亚香棒虫草。
2.2 样品基因组DNA提取
采用改良CTAB法提取基因组DNA，并使用OMEGA公司生产的DNA纯化试剂盒对其进行纯化。
2.3 基因组DNA的多重PCR扩增
PCR扩增反应体系为25μL，其中10×Taq reaction buffer 2.5μL，2条引物（10μmol/L）各1μL，10μmol/L 的dNTP 2μL，2.5U的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 17μL。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，进入循环：95℃ 30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃延伸5min。
2.4 PCR产物检测
    PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，在417bp处出现明亮条带的为北冬虫夏草，无条带为其他样品（详见附图2）。

Claims (6)

1.一种北冬虫夏草的鉴真方法，其特征在于：经过一次简单的特异PCR反应检测北冬虫夏草特征性持家基因。
2.按照权利要求1所述的北冬虫夏草鉴真方法，其特征在于：用于检测北冬虫夏草持家基因的特异PCR引物为：
上游引物CICC- Cor -F1：5’- AGCGAAACCCGTCTATCACC -3’
下游引物CICC- Cor -R1：5’- CTTGGGGCCTTCTTCCGAAT -3’。
3.按照权利要求2所述的北冬虫夏草鉴真方法，其特征在于：PCR扩增反应体系为25μL，其中10×Taq reaction buffer 2.5μL，2条引物（10μmol/L）各1μL，10μmol/L 的dNTP 2μL，2.5U的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 17μL。
4.按照权利要求3所述的北冬虫夏草鉴真方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，进入循环：95℃ 30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃延伸5min。
5.按照权利要求4所述的北冬虫夏草鉴真方法，其特征在于：PCR扩增产物采用2%的琼脂糖凝胶进行检测。
6.按照权利要求5所述的北冬虫夏草鉴真方法，其特征在于：在417bp处有电泳条带的样品为北冬虫夏草。
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