CN111440890B - 一株野生灵芝w141201的特征核苷酸序列、鉴别引物和鉴别方法 - Google Patents

一株野生灵芝w141201的特征核苷酸序列、鉴别引物和鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株野生灵芝W141201的特征核苷酸序列、鉴别引物和鉴别方法。核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。野生灵芝W141201是本发明人研究团队历时7年对全国各自然保护区的大型真菌资源调查收集并研究后获得的优质野生菌株，利用本发明的特异性扩增引物和鉴定方法可以快速准确鉴定野生灵芝W141201，将为其产业化开发和产权保护奠定基础。

Description

一株野生灵芝W141201的特征核苷酸序列、鉴别引物和鉴别 方法
技术领域
本发明属于利用分子生物学方法检测一种珍稀食药用菌野生优良菌株的技术领域，具体涉及用于鉴定野生灵芝W141201(Ganoderma lingzhi)的特征性核苷酸序列、鉴别引物和鉴别方法。
背景技术
灵芝(赤芝)古称瑞草，又名万年茸，是著名的药用真菌之一，是华夏中草药宝库中的一朵奇葩，千百年来一直被民间视为仙草，被历代医药家视为延年益寿、滋补强健、扶正固本的神奇珍品，经过大量临床研究，灵芝具有调节免疫、防治心血管系统疾病、抗肿瘤、保肝解毒、抗神经衰弱、降血糖等功效。灵芝属(Ganoderma)是由芬兰植物学家P.Karsten于1881年建立的，并以灵芝G.1ucidum(W.Cur.Fr.)Karst.作为本属的代表种。关于中国目前广泛药用的赤芝，其拉丁学名一直存在争议。药典里用的Ganoderma lucidum最早是1907年法国真菌学家在我国贵州采集得灵芝标本后鉴定命名的，沿用迄今。但近年来的研究发现，我国药用的赤芝和灵芝模式种Ganoderma lucidum存在差异，已于2012年被吴声华、戴玉成等分类学家定名为Ganoderma lingzhi。
野生灵芝W141201栽培性状稳定良好，生物转化率高，且多糖、萜类等活性成分含量也显著高于市场上流通的赤芝，具有较好的开发利用价值。因此，快速且准确地鉴别野生灵芝W141201的方法和技术是优质野生灵芝菌株商业化生产的重要技术保障，对其的开发利用具有重要的意义。
DNA是生物遗传信息的载体，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，且具有一定的稳定性，不会受到环境或培养等条件的影响而改变，是该生物物种或个体区别于其它生物物种或个体的重要标志，因而是用来鉴定物种或个体的可靠依据。随着分子生物学技术的快速发展，真菌的快速准确检测鉴定已成为可能。目前常用的分子标记鉴定方法主要有RAPD、AFLP、RFLP、rDNA序列分析和特异性引物的PCR检测等。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对珍稀食药用菌灵芝的野生优良菌株灵芝W141201(Ganoderma lingzhi)的特征性核苷酸序列，特异性鉴别引物，建立该菌株的快速检测鉴别方法。
本发明的第一个目的是提供一种灵芝W141201的特征性核苷酸序列，具体如SEQID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种鉴别灵芝W141201的特异性鉴别引物，其包括：W201-F：5'-CGT CCA ATG TCT CCG TT-3'和W201-R：5'-AGT CCC CTC CTC CTC AC-3'。
本发明的第三个目的是提供一种鉴别灵芝W141201的方法，包括以下步骤：
提取待测菌株的基因组DNA，以上述特异性鉴别引物W201-F和W201-R作为扩增引物，以待测菌株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR产物凝胶电泳查看结果，如果在电泳图上出现大小约385bp的目标条带，则说明样品为灵芝W141201，否则则不是。
优选，所述的PCR，其PCR反应体系是：反应体系为20μl总体积：DNA模板2μl，引物(10μmol/L)2μl×2，2×PCRTaqmix 10μl，ddH2O 4μl，PCR反应条件:94℃ 5min；94℃ 45s，51℃ 30s，72℃ 45s，35cycle；72℃ 5min。
野生灵芝W141201是本发明人研究团队历时7年对全国各自然保护区的大型真菌资源调查收集并研究后获得的优质野生菌株，利用本发明的特异性扩增引物和鉴定方法可以快速准确鉴定野生灵芝W141201，将为其产业化开发和产权保护奠定基础。
本发明的灵芝(Ganoderma lingzhi)W141201于2019年12月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏编号为：GDMCCNO.60937。
附图说明：
图1是24个灵芝菌株的PCR产物的蛋白电泳图；
其中M为marker，1-24分别对应表1中的序号所示的灵芝，即1为灵芝W141201，其他类推。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
本发明旨在针对优质野生灵芝菌株W141201的特征性核苷酸序列，设计特异性鉴别引物，建立该菌株的快速检测鉴别方法。
实验样品：灵芝市场流通菌株及野生菌株。具体见下表：
表1实验菌株
Figure GDA0002434643970000031
Figure GDA0002434643970000041
Figure GDA0002434643970000051
实验步骤：
1、灵芝基因组DNA模板的提取：
灵芝接种于PDA平板上，25℃暗培养7-10天，收集菌丝体，研磨成粉后按照Magen(美基生物)的HiPure Fungal DNA KitⅡ真菌DNA提取试剂盒的说明书，进行总DNA提取，获得灵芝的基因组总DNA。
2、设计特异引物对。W201-F：5'-CGT CCA ATG TCT CCG TT-3'和W201-R：5'-AGTCCC CTC CTC CTCAC-3'。
3、特异引物对的验证
以野生灵芝W141201的基因组DNA作为模版，以W201-F和W201-R作为引物，反应体系为50μl总体积：DNA模板5μl，引物(10μmol/L)4μl×2，2×PCRTaqmix 25μl，ddH2O 12μl。PCR反应条件:94℃ 5min；94℃ 45s，51℃ 30s，72℃ 45s，35cycle；72℃ 5min。将PCR产物进行条带回收，送华大基因测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
4、以野生灵芝W141201以及23个灵芝菌株(包括3个野生菌株和20个市场流通菌株)的基因组DNA作为模版，以W201-F和W201-R作为引物，按照上述方法进行20μl体系的PCR扩增，反应体系为20μl总体积：DNA模板2μl，引物(10μmol/L)2μl×2，2×PCR Taqmix 10μl，ddH2O 4μl。PCR反应条件:94℃ 5min；94℃ 45s，51℃ 30s，72℃ 45s，35cycle；72℃5min。将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，由图1可以看出，野生灵芝W141201能够扩增出大小385bp的特异性片段，而其他灵芝种样品均没有扩增到该片段，这表明本发明的核酸分子探针具有极高的特异性，因此可以用于野生灵芝W141201的快速鉴定。因此，当电泳图上出现大小385bp的目标条带时，则说明样品为野生灵芝W141201，无该条带则为其他样品。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、广东粤微食用菌技术有限公司
<120> 一株野生灵芝W141201的特征核苷酸序列、鉴别引物和鉴别方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 385
<212> DNA
<213> 灵芝W141201(Ganoderma lingzhi)
<400> 1
cgtccaatgt ctccgttcac atgacgccgt cagcggacat ttgggttccc ccagacaact 60
tcgagtgagt gcacccgcgc ggctgagggc gttcggcata acagtaacag taacagtaac 120
ttatccagaa tatcggattc cccgcctggc cgactacggc tatggctatg gctgcgaaaa 180
gggattctcg ccgttttcgc gagaatccct tttcggtagc cgagtctggg tccatgccgc 240
tcggcgtctt tcacctcccc ttcccccagc acctatctcc gtcccatccc cttcctttgt 300
gttacaattc agtttgaaaa caacgaatat acgagtacga actttccccg attttttaga 360
ggccataggt gaggaggagg ggact 385

Claims (3)

1.一种鉴别灵芝W141201 GDMCC NO.60937的特异性鉴别引物，其特征在于，包括：W201-F：5'-CGT CCAATGTCTCCGTT-3'和W201-R：5'-AGTCCCCTCCTCCTCAC-3'。
2.一种鉴别灵芝W141201 GDMCC NO.60937的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测菌株的基因组DNA，以权利要求1所述的特异性鉴别引物W201-F和W201-R作为扩增引物，以待测菌株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR产物凝胶电泳查看结果，如果在电泳图上出现大小385bp的目标条带，则说明样品为灵芝W141201，否则则不是。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR，其PCR反应体系是：反应体系为20µL总体积：DNA模板2µL，引物10µmol/L 2µL×2，2×PCR Taqmix 10µL，ddH2O 4µL，PCR反应条件: 94℃ 5min；94℃ 45s，51℃ 30s，72℃ 45s，35cycle；72℃ 5min。
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