CN115058415A - 一种快速、高质量、通用型基因组dna提取试剂盒及dna提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速、高质量、通用型基因组DNA提取试剂盒及DNA提取方法。本发明用于提取DNA的试剂盒包括溶液A：1‑6%的CTAB、1‑6M的盐酸胍、50‑250mM的pH为8.0的Tris‑HCl、8‑50mM的pH为8.0的EDTA、0.2‑3.0M的NaCl、0.4‑3％的Triton X‑100;溶液B：10‑100mM的NaCl、3‑50mM的pH为8.0的Tris‑HCl、70%‑80%的乙醇；溶液C：TE缓冲液，pH8.0。本发明可以高效提取得到不同类型样品的纯度高且完整性好的DNA。

Description

一种快速、高质量、通用型基因组DNA提取试剂盒及DNA提取 方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，更具体地说，本发明涉及一种可以从植物、动物、微生物、食品或环境样品中分离到纯度高且完整性好的DNA的试剂盒以及相应的提取方法。
背景技术
目前基因组DNA 提取常用方法有：1、CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可分离核酸。适用于多糖多酚的植物组织、真菌等。2、SDS法：SDS（十二烷基硫酸钠）阴离子去垢剂，可促使细胞裂解，使蛋白变性染色体离析。适用于血液、细胞、动物组织、细菌、酵母等。3、试剂盒法，采用CTAB 或者SDS 作为主要裂解液成分，通过优化的缓冲液体系，结合硅胶膜吸附柱或者磁珠达到核酸提取与纯化的目的。据资料，各种裂解缓冲液的主要成分都包含：Tris-HCl（提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏）、EDTA（螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase 活性）、NaCl（提供一个高盐环境，使DNA 充分溶解）。利用CTAB 提取基因组DNA 仍是目前应用最普遍也是最有效的方法，同时试剂盒因其操作方便，配备提取所需的各种试剂及耗材，无需使用者再自行配置，提取所得的核酸产量质量都能达到后续实验要求，所以CTAB 法试剂盒仍是科研工作者使用最广泛的方法。
常规CTAB 法以及SDS 法提取基因组DNA 的操作流程繁琐，耗时长，提取的质量相对较低，并不能完全满足后续分子实验以及二代测序要求。但商品化试剂盒种类繁多，且一款试剂盒不能完全适用于多种样本，不同样本提取的产量质量也不尽相同，提取得到的DNA 里经常有RNA 污染，需要后期再纯化或者在提取步骤中加入RNase A 消化步骤。针对不同样品需要尝试不同的试剂盒，这不仅耗时耗力而且浪费宝贵的实验材料。所以，一种快速、高质量的能适用于各种样品的基因组DNA 提取方法是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有DNA提取中，当样品多糖、多酚、蛋白质含量较高时出现的影响DNA提取效率等问题，提供一种快速、高质量的能适用于各种样品的基因组DNA提取试剂盒以及相应的提取方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种快速、高质量的能适用于各种样品的基因组DNA提取试剂盒，包括：
溶液A： 1-6%（g:ml）的CTAB、1-6M的盐酸胍、50-250mM的pH为8.0的Tris-HCl，8-50mM的pH为8.0的EDTA、0.2-3.0M的NaCl，0.4-3％的Triton X-100；
溶液B：10-100mM的NaCl、3-50mM的pH为8.0的Tris-HCl、70%-80%的乙醇；
溶液C：TE 缓冲液，pH8.0。
作为本发明用于提取DNA的试剂盒的一种改进，所述溶液A中CTAB的浓度为1-3%（g:ml）、盐酸胍的浓度为2-4M、Tris-HCl的浓度为100-120mM，EDTA的浓度为12-25mM、NaCl的浓度为0.5-2.0M、TritonX-100的浓度为0.8-1.2％，溶液B中NaCl的浓度为20-80mM，Tris-HCl的浓度为5-20mM。
作为本发明用于提取DNA的试剂盒的一种改进，所述溶液A中CTAB的浓度为1-3%（g:ml）、盐酸胍的浓度为3M、Tris-HCl的浓度为100-120mM，EDTA的浓度为12-25mM、NaCl的浓度为0.5-2.0M、TritonX-100的浓度为0.8-1.2％，溶液B中NaCl的浓度为20-80mM，Tris-HCl的浓度为5-20mM。
作为本发明用于提取DNA的试剂盒的一种改进，所述DNA为植物样品、动物样品、微生物样品、食品样品和/或环境样品的DNA。
作为本发明用于提取DNA的试剂盒的一种改进，所述DNA为为富含多糖、富含多酚、富含淀粉类和/或富含蛋白质的样品的DNA。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种使用上述试剂盒提取样品DNA的方法，包括如下步骤：
（1）样品准备：粉碎样品；
（2）加入溶液A和氯仿（自备），将样品的细胞膜裂解并去除样品中的水溶性多糖、多酚和蛋白质；
（3）加入溶液B，将步骤（2）所得中间产物进行沉淀与漂洗；
（4）加入溶液C，得到溶于溶液C 的DNA。
作为本发明DNA的提取方法的一种改进，步骤（1）中，所述粉碎样品是在液氮中研磨样品或研磨样品的离心产物。
作为本发明DNA的提取方法的一种改进，步骤（1）所述样品为植物样品、动物样品、微生物样品、食品样品和/或环境样品。
作为本发明DNA的提取方法的一种改进，步骤（1）所述样品为富含多糖、富含多酚、富含淀粉类和/或富含蛋白质的样品。
作为本发明DNA的提取方法的一种改进，所述步骤（2）包括
步骤（2.1）将研磨好的样品或研磨好的样品的离心产物转移50-100mg到预先装有700ul 溶液A的离心管中，迅速颠倒混匀，如果发现裂解液很粘稠，可继续加入 200-300ul溶液A涡旋振荡混匀5-10min，然后65℃水浴20-30min，期间颠倒混匀样品1-5次；
步骤（2.2）加入700ul 氯仿，充分混匀，12000rpm 离心5min，针对多糖物种可重复抽提一次；
步骤（2.3）小心转移离心所得上层水相于吸附柱中，12000rpm 离心30s，弃废液（如果液体过多，可分次离心）。
作为本发明DNA的提取方法的一种改进，所述步骤（3）包括
步骤（3.1）向吸附柱中加入500ul 溶液B，12000rpm 离心30s；
步骤（3.2）重复操作上一步；
步骤（3.3）将吸附柱置于收集管中，12000rpm 离心2min，将吸附柱室温放置5-10分钟，彻底晾干溶液B。
作为本发明DNA的提取方法的一种改进，所述步骤（4）包括
步骤（4.1）将吸附柱转入干净的离心管中，向膜中间部位悬空加入50-100ul 预热的溶液C，室温静置2-5min，12000rpm 离心2min;
步骤 (4.2) 可选的，为增加产量，可将离心所得溶液再次加入吸附柱中，室温静置2min，12000rpm 离心2min。
与现有技术相比，本发明用于提取DNA的试剂盒及相应的DNA提取方法具有如下优点：
1)本发明提供的试剂盒所含裂解液的裂解能力相较于经典配方以及商品化试剂盒提供的裂解液更高，表现为不同样品提取产量较商品化试剂盒要高；
2)本发明提供的试剂盒所含裂解液对多糖样品的耐受能力更强，使得DNA和多糖物质的交联更少，更适合多糖样品DNA的提取；
3)本发明提供的试剂盒所含裂解液能更大限度地溶解DNA核蛋白而降低RNA核蛋白的溶解，使得RNA污染在后续离心过程更彻底地被去除，因此不需要增加RNase A消化就能保证提取得到的DNA里无RNA残留；
4)本发明提供的试剂盒无需再添加结合液或者NaAc、NaCl等中和DNA分子上的负电荷以使DNA聚合沉淀，在保证产量的情况下节约实验步骤；
5)本发明用于提取DNA的试剂盒适用于各种样品，特别适用于富含多糖、多酚和/或淀粉量高的植物，提取得到的DNA不仅浓度高、纯度高，而且完整性也好，可用于高要求的生物学实验和高通量测序；
6)本发明用于提取DNA的试剂盒还可适用于动物和微生物样品的DNA基因组提取，提取得到的DNA不仅浓度高、纯度高，而且完整性也好，可用于高要求的生物学实验和高通量测序；
7）本发明用于提取DNA的试剂盒还可适用于加工过的食品或环境样品，例如酸奶、土壤等，提取得到的DNA不仅浓度高、纯度高，而且完整性也好，可用于高要求的生物学实验和高通量测序。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明用于提取植物DNA的试剂盒及提取方法及其有益效果进行详细说明。
图1实施例2中的茶叶叶片、小麦叶片和木姜叶柯叶片的DNA电泳图，其中，A1、B1、C1表示使用含有1M、3M、5M盐酸胍的试剂提取茶叶叶尖的DNA，A2、B2、C2表示使用含有1M、3M、5M盐酸胍的试剂提取小麦叶片的DNA，A3、B3、C3表示使用含有1M、3M、5M盐酸胍的试剂提取木姜叶柯叶片的DNA，M1、M2、M3表示Mark。
图2实施例3中的桑叶的DNA电泳图，其中，A表示使用本发明试剂盒提取的桑叶DNA，B表示使用市售商业试剂盒提取的桑叶DNA，M表示Mark。
图3实施例4中的滇榆叶片的DNA电泳图，其中，A表示使用本发明试剂盒提取的滇榆叶片DNA，B表示使用市售商业试剂盒提取的滇榆叶片DNA，M表示Mark。
图4实施例5中的柞木叶片的DNA电泳图，其中，A表示使用本发明试剂盒提取的柞木叶片DNA，B表示使用市售商业试剂盒提取的柞木叶片DNA，M表示Mark。
图5实施例6中的齿叶安息香叶片的DNA电泳图，其中，A表示使用本发明试剂盒提取的齿叶安息香叶片DNA，B表示使用市售商业试剂盒提取的齿叶安息香叶片DNA，M表示Mark。
图6实施例7中的酸奶DNA电泳图，其中，A表示使用本发明试剂盒提取的酸奶DNA，B表示使用市售商业试剂盒提取的酸奶DNA，M表示Mark。
图7实施例8中的土壤DNA电泳图，其中，A1和A2表示使用本发明试剂盒提取的土壤DNA，B1和B2表示使用市售商业试剂盒提取的土壤DNA，M表示Mark。
图8实施例9中的昆虫DNA电泳图，其中，A表示使用本发明试剂盒提取的昆虫DNA，B表示使用市售商业试剂盒提取的昆虫DNA，M表示Mark。
图9实施例10中的柳叶DNA电泳图，其中，a表示使用本发明试剂盒提取的DNA，b-d分别表示使用市售商业试剂盒Magen D3018、Magen D3142、天根 DP305提取的DNA，M表示Mark。
图10实施例11中的莴笋叶DNA电泳图，其中，a表示使用本发明试剂盒提取的DNA，b-d分别表示使用市售商业试剂盒Magen D3018、Magen D3142、天根 DP305提取的DNA，M表示Mark。
图11实施例12中的螺肌肉DNA电泳图，其中， a表示使用本发明试剂盒提取的DNA，b-d分别表示使用市售商业试剂盒Magen D3018、Magen D3142、天根 DP305提取的DNA，M表示Mark。
图12实施例13中的酸奶DNA电泳图，其中，a表示使用本发明试剂盒提取的DNA，b-d分别表示使用市售商业试剂盒Magen D3018、Magen D3142、天根 DP305提取的DNA，M表示Mark。
图13实施例14中的土壤DNA电泳图，其中，a表示使用本发明试剂盒提取的DNA，b-d分别表示使用市售商业试剂盒Magen D3018、Magen D3142、天根 DP305提取的DNA，M表示Mark。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
除非另有定义，本申请所使用的所有技术和科技术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管在本申请的实践或测试中可以使用与本申请所述方法和材料类似或等价的任何方法和材料，仍对优选的方法和材料进行了描述。为了使相关人员对本申请的术语有较为清晰的理解，以下对本申请的个别术语进行定义。
动物、植物和微生物是指生物学分类学（taxonomy）领域中所定义的动物、植物和微生物。
食品样品意思是指经人工加工过的可食用的动植物源或微生物源样品，与分类学中的动植物和微生物不具有上下位关系。
环境样品意思是指自然环境中获取的含有非单纯的动物、植物或微生物的细胞或组织的样品，或仅含有游离DNA的样品。例如土壤、水、粪便等。这些样品可能含有动物、植物或微生物的细胞或组织，也可能不含有动物、植物或微生物的细胞或组织。环境样品与分类学中的动植物和微生物不具有上下位关系。
以下实施例3-9中使用本发明DNA提取试剂盒,其包括溶液A、溶液B、溶液C、溶液D；溶液A是由2%（g:ml）的CTAB、3M的盐酸胍、100mM的Tris-HCl，20mM的EDTA、1.0M的NaCl、1.0％的Triton X-100组成，溶液A的pH值为8.0。溶液B是由50mM的NaCl、10mM的Tris-HCl和75%的乙醇组成，溶液B的pH值为8.0。溶液C是由10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA组成，溶液C的pH值为8.0。
以下实施例3-6中使用本发明所述试剂盒采用如下操作步骤：
（1）取0.1g植物材料置于研钵中，加入液氮充分研磨成细末；
（2）将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul 溶液A的2.0ml离心管中，迅速颠倒混匀或涡旋混匀15s，然后65℃水浴20min，期间颠倒离心管混匀样品3次；
（3）加入700ul氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；
（4）小心转移离心所得上层水相于吸附柱中，12000rpm 离心30s，弃废液；
（5）向吸附柱中加入500ul 溶液B，12000rpm 离心30s；
（6）重复操作上一步；
（7）将吸附柱置于收集管中，12000rpm 离心2min，将吸附柱室温放置5分钟，彻底晾干残余的溶液B；
（8）将吸附柱转入干净的1.5ml离心管中，向膜中间部位悬空加入50ul溶液C，室温静置2min，12000rpm 离心2min; 可选，为增加产量，可将离心所得溶液再次加入吸附柱中，室温静置2min，12000rpm 离心2min，即得样品DNA样品；
（9）取2 uL电泳检测或进行其他的质量检测。
作为对照，每个实施例均使用市场购买的商业试剂盒进行提取，按照说明书操作，流程如下：
（1）取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。
（2）将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在 65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
（3）加入700ul氯仿，充分混匀，12,000 rpm (~13,400×g) 离心5 min。注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚:氯仿/1:1进行等体积抽提。
（4）小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700ul缓冲液GP2，充分混匀。
（5）将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm (~13,400×g) 离心30 sec，弃掉废液。（吸附柱容积为700µl左右，可分次加入离心。）
（6）向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（7）向吸附柱CB3中 加入600ul漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（8）重复操作步骤（7）。
（9）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱 CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm(~13,400×g )离心2 min，将溶液收集到离心管中。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心2min。
为了验证本发明试剂盒的优点，在实施例10~14中进一步使用3中不同类型的DNA提取试剂盒与本申请提取试剂盒进行DNA提取实验比对。实施例10~14的提取步骤按照各自试剂盒的说明书进行，组织样用量根据实际情况调整。说明书步骤如下：
Magen D3018动物组织DNA提取试剂盒
1. 把1~10mg 组织样品剪成尽量小的碎片，转移至1.5ml 离心管中。
2. 加入200μl Buffer ATL 和20μl Proteinase K，55℃振荡温浴30~60 分钟。若需去除RNA，加入10μl RNase A 至消化液中混匀后，室温静置10 分钟。若消化液比较浑浊或存在未消化物质，10,000 x g 离心3 分钟。转移上清液至新的1.5ml 离心管中。
3. 加入200μl Buffer AL 至样品中，高速涡旋10 秒，70℃温浴10 分钟。
4. 加入200μl 无水乙醇至样品中，高速涡旋10 秒，按第5 步进行操作。
5. 把HiPure DNA Mini Column I 装在2ml 收集管中。转移<750μl 混合液(包括沉淀)至柱子中。10,000 x g 离心1 分钟。
6. (可选:混合液超过750μl) 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。转移剩余混合液(包括沉淀)至柱子中。10,000 x g 离心1 分钟。弃去滤液和收集管。
7. 把柱子装在新的收集管中。加入500μl Buffer GW1(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000x g 离心1 分钟。
8. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入650μl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000 x g 离心1 分钟。
Buffer GW2 使用前，须用无水乙醇进行稀释。处理DNA 含量低的样品时，重复用650μl Buffer GW2洗涤柱子一次。
9. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。10,000 × g 离心3 分钟。
10. 将柱子装在新的1.5ml 离心管中。加入20~100μl 预热至70ºC Buffer AE 至柱子的膜中央。放置3 分钟，10,000 × g 离心1 分钟。
11. 丢弃DNA 结合柱，把DNA 保存于2~8℃，长期保存需保存于-20℃。
土壤DNA提取试剂盒
1. 土壤的匀浆裂解(根据实际情况选择)
手工涡旋: 在2ml Beads Tube中，加入0.3-0.5g土壤样品， 以及0.8ml BufferSOL、4μl Reagent DX和50μl Buffer SDS。在涡旋仪上最高速度涡旋5-10分钟，按第2步进行操作。
2. (可选)进一步裂解细菌：
对多数微生物：70℃水浴10分钟。对极难破裂的细菌: 90℃水浴10分钟。
部分细菌或真菌带有很厚的细胞壁，如葡萄球属等，这些微生物极难裂解，90℃水浴10分钟可提高其裂解效果，但90℃处理会引起DNA的片断化。推荐先采用70℃水浴来提取DNA，再根据结果调整水浴温度和珠磨时间。处理某些样品时(如富含有机质的底泥)，70℃加热也可能会引起DNA的片段化，此时可省略这一步。DNA的片段化不会影响常规的PCR运用。
3. 13,000 x g 离心1分钟。转移600μl上清液至1.5ml离心管中。
4. 加入150μl Buffer PS至裂解液中，涡旋混匀15秒，冰上静置5~10分钟。
5. 加入150μl Absorber Solution至裂解液中，涡旋混匀15秒。
使用前充分摇匀Absorber Solution，将移液枪头的头部剪去小部分避免枪头的堵塞。由于Absorber Solution在去除腐殖酸的同时，也会吸附少量DNA，处理低腐殖酸样品或非土壤类样品，建议省略这一步，以提高DNA的产量。
粗制DNA的回收：取300μl DNA样品，加入100~200μl Absorber Solution至样品中，涡旋混匀15秒，按第6步进行操作。
6. 13,000 x g离心5分钟。
7. 小心转移上清液至2ml离心管中。加入等倍体积Buffer GDP。颠倒混匀。
举例：若上清液的体积为700μl，则需加入700μl Buffer GDP。
8. 把DNA柱装在收集管中。转移一半混合液至柱子中。13,000 x g离心30-60秒。
9. 倒弃滤液把柱子装回收集管。把剩余混合液转移至柱子中。13,000 × g离心30-60秒。
10. 倒弃流出液，把柱子装回收集管中。加入400μl Buffer GDP至柱子上。13,000x g离心30-60秒。
11. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入600μl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。13,000 x g离心30-60秒。Buffer GW2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。
12. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。再加入600μl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。13,000 x g离心30-60秒。
13. 倒弃流出液，把柱子装回收集管中。13,000 × g离心2分钟。
14. 将柱子装在1.5ml离心管中。加入30-50μl预热至70ºC Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。13,000 × g离心1分钟。
15. 再加入30~50μl预热至70ºC的Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。12,000× g离心1分钟。
16. 丢弃DNA结合柱，把DNA保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
天根 DP305 植物DNA提取试剂盒，
步骤同实施例3-6。
实施例1 DNA提取试剂盒配制
DNA提取试剂盒包括溶液A、溶液B、溶液C、溶液D；
溶液A是由2%（g:ml）的CTAB、3M的盐酸胍、100mM的Tris-HCl，20mM的EDTA、1.0M的NaCl、1.0％的Triton X-100组成，溶液A的pH值为8.0；
溶液B是由50mM的NaCl、10mM的Tris-HCl和75%的乙醇组成，溶液B的pH值为8.0；
溶液C是由10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA组成，溶液C的pH值为8.0。
实施例2盐酸胍浓度优化
为探索盐酸胍的最优浓度，对溶液A中盐酸胍浓度分别设置为1M、3M、5M三个浓度梯度，进行DNA提取实验。溶液B和溶液C组分和浓度与实施例1相同，具体步骤如下：
（1）分别取0.1g左右茶叶叶片、小麦叶片和木姜叶柯叶片置于不同研钵中，加入液氮充分研磨成细末；
（2）将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul 溶液A的2.0ml离心管中，迅速颠倒混匀或涡旋混匀15s，然后65℃水浴20min，期间颠倒离心管混匀样品3次；
（3）加入700ul氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；
（4）小心转移离心所得上层水相于吸附柱中，12000rpm 离心30s，弃废液；
（5）向吸附柱中加入500ul 溶液B，12000rpm 离心30s；
（6）重复操作上一步；
（7）将吸附柱置于收集管中，12000rpm 离心2min，将吸附柱室温放置5分钟，彻底晾干残余的溶液B。
（8）将吸附柱转入干净的1.5ml离心管中，向膜中间部位悬空加入50ul溶液C，室温静置2min，12000rpm 离心2min; 可选，为增加产量，可将离心所得溶液再次加入吸附柱中，室温静置2min，12000rpm 离心2min，即得桑叶DNA样品。
电泳检测
将使用不同浓度盐酸胍提取的不同物种的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。均取2uLDNA进行电泳检测，可观测到不同物种均在3M盐酸胍条件下提取的DNA条带更亮，表明3M为DNA提取的最优盐酸胍浓度（请参见图1）。
分光光度计检测
表1 DNA分光光度计检测结果
Figure 957648DEST_PATH_IMAGE001
由表1可见，使用不同物种均在3M盐酸胍条件下提取的DNA浓度更高，且不同盐酸胍条件下260/280和260/230的值接近，表明3M为DNA提取的最优盐酸胍浓度。
实施例3 桑叶DNA的提取
使用本发明试剂盒提取桑叶DNA
（1）取0.1g左右桑叶置于研钵中，加入液氮充分研磨成细末；
（2）将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul 溶液A的2.0ml离心管中，迅速颠倒混匀或涡旋混匀15s，然后65℃水浴20min，期间颠倒离心管混匀样品3次；
（3）加入700ul氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；
（4）小心转移离心所得上层水相于吸附柱中，12000rpm 离心30s，弃废液；
（5）向吸附柱中加入500ul 溶液B，12000rpm 离心30s；
（6）重复操作上一步；
（7）将吸附柱置于收集管中，12000rpm 离心2min，将吸附柱室温放置5分钟，彻底晾干残余的溶液B。
（8）将吸附柱转入干净的1.5ml离心管中，向膜中间部位悬空加入50ul溶液C，室温静置2min，12000rpm 离心2min; 可选，为增加产量，可将离心所得溶液再次加入吸附柱中，室温静置2min，12000rpm 离心2min，即得桑叶DNA样品。
使用市场购买的商业试剂盒提取桑叶DNA
（1）取新鲜桑叶约0.1g，加入液氮充分碾磨。
（2）将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700ul 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在 65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
（3）加入700ul氯仿，充分混匀，12,000 rpm (~13,400×g) 离心5 min。注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚:氯仿/1:1进行等体积抽提。
（4）小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700ul缓冲液GP2，充分混匀。
（5）将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm (~13,400×g) 离心30 sec，弃掉废液。（吸附柱容积为700µl左右，可分次加入离心。）
（6）向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（7）向吸附柱CB3中 加入600ul漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（8）重复操作步骤（7）。
（9）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱 CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm(~13,400×g )离心2 min，将溶液收集到离心管中。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心2min。
电泳检测
将使用本发明试剂盒和商业试剂盒提取的桑叶DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。每种方法提取的DNA均取2 uL进行电泳检测，可观测到本发明试剂盒提取的桑叶DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的桑叶DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图2）。
分光光度计检测
表2桑叶DNA分光光度计检测结果
Figure 38736DEST_PATH_IMAGE002
由表2可见，使用本发明试剂盒提取的桑叶DNA的浓度为34.91ng/L，是市售商业试剂盒提取的桑叶DNA浓度的3倍以上。使用本发明试剂盒提取的桑叶DNA的260/280值为1.88，与市售商业试剂盒提取的桑叶DNA 260/280值接近，均在2左右。使用本发明试剂盒提取的桑叶DNA的260/230值为0.83，约是市售商业试剂盒提取的DNA 260/230值的2倍。说明使用本发明试剂盒提取的桑叶的DNA浓度高于市售试剂盒提取的桑叶的DNA浓度。使用本发明试剂盒提取桑叶DNA的碳水化合物（糖类）、盐类含量低于市售试剂盒提取的桑叶DNA的碳水化合物（糖类）、盐类含量。使用两种试剂盒提取的桑叶DNA的蛋白质或酚类物质含量接近。
实施例4 滇榆叶片中DNA的提取
DNA提取
按照实施例3中两种试剂盒提取步骤进行，仅将提取样品换成滇榆叶片。
电泳检测
按照实施例3中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的滇榆叶片DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的滇榆叶片DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图3）。
分光光度计检测
表3滇榆叶片DNA分光光度计检测结果
Figure 998733DEST_PATH_IMAGE003
由表3可见，使用本发明试剂盒提取的滇榆叶片DNA的浓度为32.91ng/L，约是市售商业试剂盒提取的滇榆DNA浓度的1.5倍。使用本发明试剂盒提取的滇榆叶片DNA的260/280值为1.86，与市售商业试剂盒提取的滇榆叶片DNA 260/280值接近，均在2左右。使用本发明试剂盒提取的滇榆叶片DNA的260/230值为0.87，约是市售商业试剂盒提取的DNA 260/230值的1.5倍。说明使用本发明试剂盒提取的滇榆叶片的DNA浓度高于市售试剂盒提取的滇榆叶片的DNA浓度。使用本发明试剂盒提取滇榆叶片DNA的碳水化合物（糖类）、盐类含量低于市售试剂盒提取的滇榆叶片DNA的碳水化合物（糖类）、盐类含量。使用两种试剂盒提取的滇榆叶片DNA的蛋白质或酚类物质含量接近。
实施例5柞木叶片中DNA的提取
按照实施例3中两种试剂盒提取步骤进行，仅将提取样品换成柞木叶片。
电泳检测
按照实施例3中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的柞木叶片DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的柞木叶片DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图4）。
分光光度计检测
表4柞木叶片DNA分光光度计检测结果
Figure 557890DEST_PATH_IMAGE004
由表4可见，使用本发明试剂盒提取的柞木叶片DNA的浓度为50.87ng/L，是市售商业试剂盒提取的柞木DNA浓度的5倍多。使用本发明试剂盒提取的柞木叶片DNA的260/280值为1.83，高于市售商业试剂盒提取的柞木叶片DNA 260/280值（1.70）。使用本发明试剂盒提取的柞木叶片DNA的260/230值为1.61，是市售商业试剂盒提取的DNA 260/230值的4倍多。说明使用本发明试剂盒提取的柞木叶片的DNA浓度高于市售试剂盒提取的柞木叶片的DNA浓度。使用本发明试剂盒提取柞木叶片DNA的蛋白质或酚类物质、碳水化合物（糖类）、盐类含量均低于市售试剂盒提取的柞木叶片DNA的蛋白质或酚类物质、碳水化合物（糖类）、盐类含量。
实施例6齿叶安息香叶片中DNA的提取
按照实施例3中两种试剂盒提取步骤进行，仅将提取样品换成齿叶安息香叶片。
电泳检测
按照实施例3中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的齿叶安息香叶片DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的齿叶安息香叶片DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图5）。
分光光度计检测
表5齿叶安息香叶片DNA分光光度计检测结果
Figure 270631DEST_PATH_IMAGE005
由表5可见，使用本发明试剂盒提取的齿叶安息香叶片DNA的浓度为34.71ng/L，约是市售商业试剂盒提取的齿叶安息香DNA浓度的1.5倍。使用本发明试剂盒提取的齿叶安息香叶片DNA的260/280值为1.86，高于市售商业试剂盒提取的齿叶安息香叶片DNA 260/280值（1.50）。使用本发明试剂盒提取的齿叶安息香叶片DNA的260/230值为0.95，是市售商业试剂盒提取的DNA 260/230值的2倍多。说明使用本发明试剂盒提取的齿叶安息香叶片的DNA浓度高于市售试剂盒提取的齿叶安息香叶片的DNA浓度。使用本发明试剂盒提取齿叶安息香叶片DNA的蛋白质或酚类物质、碳水化合物（糖类）、盐类含量均低于市售试剂盒提取的齿叶安息香叶片DNA的蛋白质或酚类物质、碳水化合物（糖类）、盐类含量。
实施例7酸奶中DNA的提取
按照实施例3中两种试剂盒提取步骤进行，仅将提取样品换成0.5g酸奶。
电泳检测
按照实施例2中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的酸奶DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的酸奶DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图6）。
分光光度计检测
表6酸奶DNA分光光度计检测结果
Figure 991463DEST_PATH_IMAGE006
由表6可见，使用本发明试剂盒提取的酸奶DNA的浓度为4.06ng/L，约是市售商业试剂盒提取的酸奶DNA浓度的2倍。使用本发明试剂盒提取的酸奶DNA的260/280值为1.97，优于市售商业试剂盒提取的酸奶DNA 260/280值（4.12）。使用本发明试剂盒提取的酸奶DNA的260/230值为0.98，是市售商业试剂盒提取的DNA 260/230值的10倍左右。说明使用本发明试剂盒提取的酸奶的DNA浓度高于市售试剂盒提取的酸奶的DNA浓度。使用本发明试剂盒提取酸奶DNA的蛋白质、酚类、碳水化合物（糖类）、盐类以及RNA含量均低于市售试剂盒提取的酸奶DNA的蛋白质、酚类物质、碳水化合物（糖类）、盐类以及RNA含量。
实施例8土壤中DNA的提取
按照实施例3中两种试剂盒提取步骤进行，仅将提取样品换成0.5g淤泥土。
电泳检测
按照实施例2中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的土壤DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的土壤中DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图7）。
分光光度计检测
表7土壤DNA分光光度计检测结果
Figure 173176DEST_PATH_IMAGE007
由表7可见，使用本发明试剂盒提取的土壤DNA的浓度为16.74~22.2ng/L，约是市售商业试剂盒提取的土壤DNA浓度的20倍。使用本发明试剂盒提取的土壤DNA的260/280值为1.52，优于市售商业试剂盒提取的土壤DNA 260/280值（0.94）。使用本发明试剂盒提取的土壤DNA的260/230值为0.87~1.05，是市售商业试剂盒提取的DNA 260/230值的10倍左右。说明使用本发明试剂盒提取的土壤的DNA浓度高于市售试剂盒提取的土壤的DNA浓度。使用本发明试剂盒提取土壤DNA的蛋白质、酚类、碳水化合物（糖类）、盐类以及RNA含量均低于市售试剂盒提取的土壤DNA的蛋白质、酚类物质、碳水化合物（糖类）、盐类以及RNA含量。
实施例9昆虫中DNA的提取
按照实施例3中两种试剂盒提取步骤进行，仅将提取样品换成0.5g草地贪夜蛾组织样。
电泳检测
按照实施例2中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的昆虫DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的昆虫中DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图8）。
分光光度计检测
表8昆虫DNA分光光度计检测结果
Figure 270445DEST_PATH_IMAGE008
由表8可见，使用本发明试剂盒提取的昆虫DNA的浓度为23.02ng/L，约是市售商业试剂盒提取的昆虫DNA浓度的2倍。使用本发明试剂盒提取的昆虫DNA的260/280值为1.78，优于市售商业试剂盒提取的昆虫DNA 260/280值（1.76）。使用本发明试剂盒提取的昆虫DNA的260/230值为1.31，优于市售商业试剂盒提取的DNA 260/230值（0.61）。说明使用本发明试剂盒提取的昆虫的DNA浓度高于市售试剂盒提取的昆虫的DNA浓度。使用本发明试剂盒提取昆虫DNA的蛋白质、酚类、碳水化合物（糖类）、盐类以及RNA含量均低于市售试剂盒提取的昆虫DNA的蛋白质、酚类物质、碳水化合物（糖类）、盐类以及RNA含量。
实施例10柳叶中DNA的提取
提取过程按照本发明试剂盒的操作步骤和商业试剂盒说明书提取步骤进行。样品为0.1g柳叶。
电泳检测
按照实施例3中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的柳叶DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的柳叶中DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图9）。
分光光度计检测
表9柳叶DNA分光光度计检测结果
Figure 103272DEST_PATH_IMAGE009
由表9和图9可见，使用本发明试剂盒提取的柳叶DNA的浓度为50.81ng/L，与市售植物类DNA商业试剂盒提取浓度以及260/280值接近。但本发明试剂盒提取的柳叶DNA的260/230值为2.001，优于市售植物类DNA商业试剂盒提取的DNA 260/230值（0.908）。本发明试剂盒提取的柳叶DNA的完整性也优于市售植物类DNA商业试剂盒提取的DNA。与市售动物类和土壤类试剂盒的提取效果相比，本发明试剂盒提取的柳叶DNA在浓度、OD260/280、OD260/230以及完整性指标上都是最优的。
实施例11莴笋叶中DNA的提取
提取过程按照本发明试剂盒的试剂盒的操作步骤和商业试剂盒说明书提取步骤进行。样品为0.1g莴笋叶。
电泳检测
按照实施例3中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的莴笋叶DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的莴笋叶中DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图10）。
分光光度计检测
表10莴笋叶DNA分光光度计检测结果
Figure 995005DEST_PATH_IMAGE010
由表10和图10可见，使用本发明试剂盒提取的莴笋叶DNA的浓度为56.07ng/L，是市售植物类DNA商业试剂盒提取浓度的2.5倍左右。与市售植物类DNA商业试剂盒提取的DNA260/280和260/230值接近。与市售动物类和土壤类DNA提取试剂盒的提取效果相比，本发明试剂盒提取的莴笋叶DNA在浓度、纯度和完整性指标上优于市售试剂盒提取的莴笋叶DNA或与市售试剂盒相提取的莴笋叶DNA接近。
实施例12螺肌肉中DNA的提取
提取过程按照本发明试剂盒的试剂盒的操作步骤和商业试剂盒说明书提取步骤进行。样品为0.1g螺肌肉组织样。
电泳检测
按照实施例3中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的螺肌肉DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的螺肌中DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图11）。
分光光度计检测
表11螺肌肉DNA分光光度计检测结果
Figure 926664DEST_PATH_IMAGE011
由表11和图11可见，使用本发明试剂盒提取的螺肌肉DNA的浓度为62.39ng/L，优于市售动物类DNA商业试剂盒提取的DNA浓度。与市售植物类和土壤类试剂盒的提取效果相比，本发明试剂盒提取的螺肌肉DNA在浓度、纯度和完整性指标上优于市售试剂盒提取的螺肌肉DNA或与市售试剂盒相提取的螺肌肉DNA接近。
实施例13酸奶中DNA的提取
提取过程按照本发明试剂盒的试剂盒的操作步骤和商业试剂盒说明书提取步骤进行。样品为0.5g酸奶样。
电泳检测
按照实施例2中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的酸奶DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的酸奶中DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图12）。
分光光度计检测
表12酸奶DNA分光光度计检测结果
Figure 562045DEST_PATH_IMAGE012
由表12和图12可见，使用本发明试剂盒提取的酸奶DNA的浓度在浓度、纯度和完整性指标上均优于市售试剂盒提取的酸奶DNA或与市售试剂盒相提取的酸奶DNA接近。
实施例14土壤中DNA的提取
提取过程按照本发明试剂盒的试剂盒的操作步骤和商业试剂盒说明书提取步骤进行。样品为0.5g土壤样。
电泳检测
按照实施例3中DNA电泳方法进行。可观测到本发明试剂盒提取的土壤DNA条带更亮，表明本发明试剂盒提取的土壤中DNA的浓度和完整性均优于商业试剂盒（请参见图13）。
分光光度计检测
表13土壤DNA分光光度计检测结果
Figure 983799DEST_PATH_IMAGE013
由表13和图13可见，使用本发明试剂盒提取的土壤DNA的浓度在浓度、纯度和完整性指标上均优于市售试剂盒提取的土壤DNA或与市售试剂盒相提取的土壤DNA接近。
提取纯度高且完整性好的DNA是进行分子生物学和高通量测序相关实验的前提，但是，从富含多糖、多酚、淀粉或蛋白质类物质的样品中提取DNA仍是棘手的难题，同时使用一款试剂盒满足不同类型样品的提取需求更是难上加难，本发明为一种快速、高质量、通用型基因组DNA 提取试剂盒及DNA 提取方法，将有广阔的市场需求。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (10)

1.一种用于提取DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
溶液A：1-6%的CTAB、1-6M的盐酸胍、50-250mM的pH为8.0的Tris-HCl，8-50mM的pH为8.0的EDTA、0.2-3.0M的NaCl，0.4-3％的Triton X-100；
溶液B：10-100mM的NaCl、3-50mM的pH为8.0的Tris-HCl、70%-80%的乙醇；
溶液C：TE 缓冲液，pH8.0。
2.根据权利要求1所述的用于提取DNA的试剂盒，其特征在于，所述溶液A中CTAB的浓度为1-3%、盐酸胍的浓度为2-4M、Tris-HCl的浓度为100-120mM，EDTA的浓度为12-25mM、NaCl的浓度为0.5-2.0M、TritonX-100的浓度为0.8-1.2％；
溶液B中NaCl的浓度为20-80mM，Tris-HCl的浓度为5-20mM。
3.根据权利要求1或2所述的用于提取DNA的试剂盒，其特征在于，所述DNA为植物样品、动物样品、微生物样品、食品样品和/或环境样品的DNA。
4.根据权利要求3所述的用于提取DNA的试剂盒，其特征在于，所述植物样品为富含多糖、富含多酚和/或富含淀粉类的样品，所述食品样品或环境样品为富含多糖、富含多酚、富含淀粉类和/或富含蛋白质的样品。
5.一种DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法是使用权利要求1所述用于提取DNA的试剂盒进行提取，包括如下步骤：
（1）样品准备：粉碎样品；
（2）加入权利要求1中所述溶液A和氯仿，将样品的细胞膜裂解并去除样品中的多糖、多酚和蛋白质；
（3）加入权利要求1中所述溶液B，将步骤（2）所得中间产物进行沉淀与漂洗；
（4）加入权利要求1中所述溶液C，得到溶于溶液C的DNA。
6.根据权利要求5所述的DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（1）为使用液氮研磨样品或研磨样品的离心产物。
7.根据权利要求6所述的DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（2）包括：
步骤（2.1）将研磨好的样品或研磨好的样品的离心产物转移50-100mg到预先装有700ul 溶液A的离心管中，迅速颠倒混匀，如果发现裂解液很粘稠，可继续加入100-500ul溶液A涡旋振荡混匀5-10min，然后65℃水浴20-30min，期间颠倒混匀样品1-5次；
步骤（2.2）加入700ul 氯仿，充分混匀，12000rpm 离心5min，重复抽提一次；
步骤（2.3）小心转移离心所得上层水相于吸附柱中，12000rpm 离心30s，弃废液。
8.根据权利要求7所述的DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（3）包括：
步骤（3.1）向吸附柱中加入500ul 溶液B，12000rpm 离心30s；
步骤（3.2）重复操作上一步；
步骤（3.3）将吸附柱置于收集管中，12000rpm 离心2min，将吸附柱室温放置5-10分钟，彻底晾干溶液B。
9.根据权利要求7所述的DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤（4）包括：
步骤（4.1）将吸附柱转入干净的离心管中，向膜中间部位悬空加入50-100ul 预热的溶液C，室温静置2-5min，12000rpm 离心2min。
10.根据权利要求5所述的DNA的提取方法，其特征在于，所述样品为富含多糖、富含多酚、富含淀粉类和/或富含蛋白质的样品。
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Plate SJ Walker and KE Vrana, Wake Forest University, Winston-Salem, NC, USA Copyright^ 2000 Academic Press

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Granted publication date: 20221209

Pledgee: Chengdong Branch of Nanjing Bank Co.,Ltd.

Pledgor: Nanjing Jisi Huiyuan Biotechnology Co.,Ltd.

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