CN106047866A

CN106047866A - 一种从沙米组织中提取总dna的方法

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Publication number: CN106047866A
Application number: CN201610672721.6A
Authority: CN
Inventors: 燕霞; 钱潮菊; 马小飞; 石勇; 殷恒霞; 潘小番; 尹成亮
Original assignee: Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Current assignee: Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2016-10-26

Abstract

一种从沙米组织中提取总DNA的方法，包括试剂盒设备提取前处理，提取步骤，质量检测；该方法针对现有沙米DNA提取技术的不足，结合beta‑巯基乙醇和天根生化科技(北京)有限公司商用DNA提取试剂盒Plant Genomic DNA Kit，通过优化试验，开发出了针对沙米组织，提取高质量、高产量和无蛋白质和RNA的污染的总DNA的方法；该方法不仅奠定了沙米基因组的开发及抗逆资源的挖掘的基础，并为提取高质量的荒漠植物全基因组DNA提供了范例。

Description

一种从沙米组织中提取总DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种沙生植物沙米DNA的提取方法。

背景技术

土地沙漠化所造成的环境退化与经济贫困已成为人类生存的十大威胁之首。由于沙漠化而造成的水土流失、土地贫瘠，已使不少国家遭致连年饥荒。随着全球气候变化，干旱化程度越来越大，荒漠化面积有扩大趋势。沙漠化及扩张极大地威胁着我国和第三世界的农业和生态安全（Foresight, 2011）。加强生态建设，维护生态安全，是二十一世纪人类面临的共同主题。

沙漠化，自古以来是人类农业生产活动的天敌。但是随着现代科学技术的发展，防止和治理土地荒漠化及生态农业方面的研究迅速开展起来,使得沙漠并非是不毛之地。纵观国内外，在沙漠里种作物，发展农业的例子非常多。目前，以色列处于领先地位。他们克服了农业生产的瓶颈，采取了一系列适合本国国情的措施和政策，在45%国土面积的沙漠上创造了农业的奇迹，为沙漠治理及农业生态化发展提供了宝贵经验。我国具有世界上最大的温带荒漠，面积约为262.2万km²，大约占国土面积的六分之一。如果把中国的沙漠地区变成国家现代化农业生产基地，不仅可以扩展现有拥挤不堪的生活空间，而且可以获得大量农业资源，以至于为改善中国的生态环境乃至全球气候作贡献。

沙漠最大的特点是干旱缺水,因此土壤水分条件常常是植物生长、繁衍的主要限制因素。一般的植物，很难在沙漠地区生长，因此要发展沙漠生态农业，一方面要充分保护和封育现有的植被，使得植被的覆盖面扩大，防止土地的沙漠化，并优化沙漠地区的环境，改善我国干旱区生态-农业系统的稳定性，为沙漠化农业打下良好基础；另一方面，利用沙漠植物耐高温、耐干旱等诸多非生物胁迫特性，挖掘宝贵的抗逆遗传资源，创制和驯化适应极端荒漠环境的饲料、粮食甚至能源植物，这样不仅能够开发和利用沙生植物，而且可以推动沙漠脆弱生态系统的可持续发展。由于沙漠地区植物的开发和利用目前才刚刚开始，创制和驯化工作仍然很艰巨，因此寻找稀有的沙生植物和研究引进培育耐旱新品种，使得农作物延伸扩展到沙漠地区，是利用沙漠土地比较直接快速的方法。依靠高新技术，是治理沙漠化土地的有效途径和必由之路。并在上述研究的基础上，寻找市场需求，以精深加工为途径，开拓沙产业的内涵和外延，提高沙区资源利用率，突出抓好应用高新技术开展的新型产业及现代种植业、养殖业和加工业，形成区域优势突出、资源配置合理、综合效益显著的沙产业发展新格局，增加农牧民收入，促进区域经济可持续发展。这样沙漠地区就可以像其他农业区一样，为人类带来绿色生机和巨大的经济效益。

沙米(Agriophyllum squarrosum)，学名沙蓬，是苋科（Amaranthaceae）沙蓬属（Agriophyllum Bieb.）一年生草本植物。沙米生长在移动沙丘上，在适当的雨季能够快速生根发芽，在沙漠的边缘形成大范围植被分布。同时沙米种群的扩大，会对沙漠化土壤具有改良作用，从而提高沙漠边缘的生态稳定性，使得土地逆转，适宜农作物的生长。因此不仅是沙漠生态系统建立过程中的先锋植物，也是沙漠化逆转过程中的首要建群植物。沙米长期生长于极端的沙漠环境中，耐热和抗干旱能力出众，能在贫瘠的沙漠中有非常高的单株产量，产生很高的地上生物量，成为骆驼、山羊和绵羊的优良饲料；其种子营养也很丰富，自古以来就被我国沙区百姓作为饥荒年代的代用粮食，极具潜力被驯化成应对未来全球气候变化的粮食作物，因此容易与农牧业结合，形成健康的产业链；再次，沙米药用价值极高，且是天然的高级营养品。并且其生长周期短，能够快速繁殖育种，容易扩大种植，形成现代种植业和开展新型产业，带来巨大的受益。由于上述沙米的一系列优点，随着2015年联合国粮食农业组织大力倡导寻找能够适应气候变化的野生物种及小作物并完善基因库，沙米的驯化及其遗传资源的挖掘也逐渐提上日程。

虽然沙米不仅在沙漠治理中可发挥重要作用，而且在生态农业及人类健康方面具有巨大经济社会价值；但是由于沙生植物生长在极端干旱的环境中，长期进化出了种种奇特的形态和耐干旱贫瘠、抗日灼、喜透气、耐沙埋、抗沙蚀等一系列生态和生理适应特性，因此很难利用市场上的植物基因组DNA提取试剂盒产品提取沙生植物基因组DNA。就沙米而言，市场上的植物基因组DNA提取试剂盒产品种类繁多，技术方法也较为成熟，基本上能够从新鲜的或硅胶干燥的植物叶片中提取出一般常见植物高质量的植物全基因组DNA。但是，用这些基因组DNA提取试剂盒提取的沙米全基因组DNA都有降解现象，仅能满足一般PCR（Polymerase Chain Reaction，即聚合酶链式反应）扩增的要求，而无法达到要求极为严格的高通量测序的标准，从而限制了沙米基因组的开发及丰富抗逆遗传资源的挖掘。

本发明为了进一步改善沙米全基因组DNA的提取质量，通过一系列优化植物基因组DNA提取试剂盒的试验，快速高效地提取到沙米全基因组DNA。这项发明不仅奠定了沙米基因组的开发及抗逆资源的挖掘的基础，并为提取高质量的荒漠植物全基因组DNA提供了范例。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足之处，提供一种快速稳定地提取沙米总DNA的方法。本发明采用天根生化科技(北京)有限公司商用DNA提取试剂盒 PlantGenomic DNA Kit结合巯基乙醇改善的方法，开发出了一种针对沙米组织，提取DNA的快速稳定的方法；此种方法得到的DNA量及质量非常高，能够成功地应用于下一代的高通量测序等下游技术。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种从沙米组织中提取总DNA的方法，该方法包括试剂盒设备提取前处理，提取步骤，质量检测；其中试剂盒设备提取前处理是：将离心管、药勺和研钵用铝泊纸包裹，高压蒸汽灭菌和干燥；用 70%酒精喷雾清洗离心机、试验台、试管架和移液器，然后用无菌纸巾擦干，反复2-3次，确保实验台及实验所有仪器及设备无污染。

其中提取步骤包括：

1)在Plant Genomic DNA Kit (Tiangen, Beijing, China)缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入17 mL和60 mL的无水乙醇，上下颠倒，充分混匀，备用；

2）在2 ml试管中加入Plant Genomic DNA Kit (Tiangen, Beijing, China) 缓冲液GP1 800 μL,再加入8μL的β-巯基乙醇,盖上盖子,在涡旋振荡器上轻轻振荡,充分混匀,置于65℃水浴锅预热；

3）在千分之一电子天平上称取植物沙米新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分碾磨成粉末；

4）将研磨好的粉末迅速转移到2）中准备好的试管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；

5）在4)中混合样品中加入800μL氯仿，充分混匀，12,000rpm（～13,400×g）离心5分钟；

6）将5）中有氯仿混合溶液的上层水相小心地转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀；

7) 将6）中混匀的液体分两次转入吸附柱CB3中，12,000rpm（～13,400×g）离心30秒,弃掉废液；

8）加500μL缓冲液GD到7）中的吸附柱CB3上，然后12,000rpm（～13,400×g）离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

9）加700μL漂洗液PW到8）中的吸附柱CB3，然后12,000rpm（～13,400×g）离心30秒，倒掉废液，再次将吸附柱CB3放入原收集管中；

10）重复操作步骤9）；

11) 将吸附柱CB3放回原收集管中，12,000rpm（～13,400×g）离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

12）将11）中的吸附柱CB3转入一个干净的新离心管中，悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE到吸附膜的中间部位，然后室温放置2-5分钟；之后，12,000rpm（～13,400×g）离心2分钟,将溶液收集到离心管中，并存放在-80℃冰箱。

其中步骤2）中，β-巯基乙醇的终浓度应为1%。

该方法从沙米组织中提取的总DNA，需要质量检测，其中包括以下方法：

1) Nanodrop 检测DNA质量，要求在260 nm 处有完美的DNA峰型，260/230 的值大于2.0；260/280的值在1.8-2.0之间；

2) 琼脂糖电泳检测DNA质量：用移液枪移取2μL于6×loading buffer中，然后排入到预制Gel-red的1.5%琼脂糖胶孔中。设置电压180 V/cm，使用北京六一琼脂糖水平电泳槽DYCP-31BN，电泳15分钟。用BioRad凝胶成像仪检测并照相，结果显示仅有一条清晰可见的条带为合格。

附图说明

图1_a：沙米组织（shami1）Nanodrop检测DNA质量峰图；

图1_b：沙米组织（shami2）Nanodrop检测DNA质量峰图；

图2：本发明方法所提沙米组织DNA琼脂糖电泳图

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明实施例来进一步说明本发明的实施方式，但并不以此来限定本发明。

实施例

提取沙米组织内总DNA方法概述：

发明的内容包括所需试剂盒设备，提取前专有处理过程，提取操作步骤和所提的DNA质量检测四部分。具体实施方案如下：

一、所需试剂和设备

无水乙醇、液氮、β-巯基乙醇、Plant Genomic DNA Kit试剂盒；

离心管、试管架、药勺、研钵、灭菌锅、铝泊纸、无菌纸巾、1000μL移液器、200μL移液器、100μL移液器、50μL移液器、1000μL带过滤器的枪头、200μL带过滤器的枪头、100μL带过滤器的枪头、50μL带过滤器的枪头；

二、提取前专有处理过程

提取前将用到的离心管、药勺和研钵用铝泊纸包裹，高压蒸汽灭菌和干燥；用 70%酒精喷雾清洗离心机、试验台、试管架和移液器，然后用无菌纸巾擦干，反复2-3次，确保实验台及实验所有仪器及设备无污染。

三、提取步骤包括：

1)根据Plant Genomic DNA Kit（Tiangen, Beijing, China）操作手册要求在缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入17 mL和60 mL的无水乙醇，上下颠倒，充分混匀，备用；

2）在2 mL试管中加入Plant Genomic DNA Kit缓冲液GP1 800 μL,再加入8μL的β-巯基乙醇,盖上盖子,在涡旋振荡器上轻轻振荡,充分混匀,置于65℃水浴锅预热；

3）在千分之一电子天平上分别称取两株沙米干重组织约30mg，命名为shami1和shami2，加入液氮充分碾磨成粉末；

4）将研磨好的粉末迅速转移到2）中准备好的试管中，迅速在涡旋振荡器上轻轻振荡,充分混匀,，将离心管放在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次，使其充分裂解；

6）轻轻地将试管从离心机中拿出，置于试管架上。小心地将5)所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，在涡旋振荡器上轻轻振荡,充分混匀;

7) 将6）中混匀的液体分两次转入吸附柱CB3中,然后把吸附柱CB3置于收集管中，放入eppendorf离心机中，12,000rpm（～13,400×g）离心30秒,弃掉废液，将原收集管置于试管架上；

8）向7）中吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，放入eppendorf离心机中，12,000rpm（～13,400×g）离心30秒，倒掉废液，重新将吸附柱CB3放入原收集管中，置于试管架上；

9）向8）中吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，放入eppendorf离心机中，12,000rpm（～13,400×g）离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入原收集管中，置于试管架上；

10）重复操作步骤9）；

11) 将10）吸附柱CB3放回原收集管中，放入eppendorf离心机中，12,000rpm（～13,400×g）离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3至于温室放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，避免残留的乙醇对后续的酶反应实验造成影响；

12）将吸附柱CB3转入一个干净的新离心管中，悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE到吸附膜的中间部位，然后室温放置2-5分钟；之后，12,000rpm（～13,400×g）离心2分钟,将溶液收集到离心管中，并存放在-80℃冰箱。

四、DNA质量检测包括：

1）Nanodrop 检测DNA质量，要求在260 nm 处有完美的DNA峰型，260/230 的值大于2.0；260/280的值在1.8-2.0之间；

2）琼脂糖电泳检测DNA质量，要求提取的DNA 琼脂糖胶电泳检测仅有一条带：

4.1 Nanodrop 检测 DNA 质量

Nanodrop 检测DNA质量：设定检测物质为DNA，用移液器移取l μL上述步骤提取的沙米（Agriophyllum squarrosum）组织DNA，在在NanoDrop 2000 仪器上得到两次实验的结果（图1和图2）。结果表明提取的DNA在260 nm 处有完美峰型，且260/230 的值大于2.0，260/280的值在1.8-2.0之间，说明用这种方法提取沙米DNA具有很好的重现性。

4.2 琼脂糖电泳检测DNA质量

琼脂糖电泳检测DNA质量：用移液枪移取2μL于6×loading buffer中，然后排入到预制Gel-red的1.5%琼脂糖胶孔中。设置电压180 V/cm，使用北京六一琼脂糖水平电泳槽DYCP-31BN，电泳15分钟。用BioRad凝胶成像仪检测并照相，结果显示仅有一条清晰可见的条带。

综合NanoDrop 2000 仪和琼脂糖电泳检测结果说明：本方法提取沙米组织的DNA质量高，产量高，无蛋白质的污染。

Claims

1.一种从沙米组织中提取总DNA的方法，该方法包括试剂盒设备提取前处理，提取步骤，质量检测；其特征在于：

所述试剂盒设备提取前处理包括：将离心管、药勺和研钵用铝泊纸包裹，高压蒸汽灭菌和干燥；用 70%酒精喷雾清洗离心机、试验台、试管架和移液器，然后用无菌纸巾擦干，反复2-3次，确保实验台及实验所有仪器及设备无污染；

所述提取步骤包括：

步骤1）在植物基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit，Tiangen, Beijing,China)的缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入17 mL和60 mL的无水乙醇，上下颠倒，充分混匀，备用；

步骤2）在2 ml离心管中加入Plant Genomic DNA Kit (Tiangen, Beijing, China)缓冲液GP1800 μL,再加入8μL的β-巯基乙醇,盖上盖子,在涡旋振荡器上轻轻振荡,充分混匀,置于65℃水浴锅预热；

步骤3）在千分之一电子天平上称取植物沙米新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分碾磨成粉末；

步骤4）将研磨好的粉末迅速转移到步骤2）中准备好的离心管中，迅速颠倒混匀；然后，将离心管放在65℃水浴20分钟；水浴过程中颠倒离心管数次，使得混合样品均匀加热，达到彻底裂解；

步骤5）在步骤4)中混合样品中加入800μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm离心5分钟；

步骤6）将步骤5）中上层水相小心地转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀；弃掉下层含有氯仿混合溶液相；

步骤7) 将步骤6）中混匀的液体分两次转入吸附柱CB3中，12,000 rpm离心30秒,弃掉废液；

步骤8）加500μL缓冲液GD到步骤7）中的吸附柱CB3上，然后12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

步骤9）加700μL 漂洗液PW到步骤8）中的吸附柱CB3，然后12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，再次将吸附柱CB3放入原收集管中；

步骤10）重复操作步骤9）；

步骤11) 将吸附柱CB3放回原收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

步骤12）将步骤11）中的吸附柱CB3转入一个干净的新离心管中，悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE到吸附膜的中间部位，然后室温放置2~5分钟；之后，12,000 rpm离心2分钟,将溶液收集到离心管中，并存放在-80℃冰箱；

所述质量检测包括：

Nanodrop 检测DNA质量：在NanoDrop 2000 仪器设定检测物质为DNA，用移液器移取lμL上述步骤提取的沙米（Agriophyllum squarrosum）组织DNA，结果要求在260 nm 处有完美的DNA峰型，260/230 的值大于2.0；260/280的值在1.8~2.0之间；

琼脂糖电泳检测DNA质量：用移液枪移取2 μL于6×loading buffer中，然后排入到预制Gel-red的1.5%琼脂糖胶孔中；设置电压180 V/cm，使用北京六一琼脂糖水平电泳槽DYCP-31BN，电泳15分钟；用BioRad凝胶成像仪检测并照相，结果显示仅有一条清晰可见的条带为合格。

2.根据权利要求1所述的从沙米组织中提取总DNA的方法，其中步骤2）中，β-巯基乙醇的终浓度为1%。