CN101948797A

CN101948797A - 巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系及其建立方法和应用

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Publication number: CN101948797A
Application number: CN2010105056185A
Authority: CN
Inventors: 黎云祥; 韩素菊; 权秋梅
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-10-13
Filing date: 2010-10-13
Publication date: 2011-01-19
Also published as: CN102250827A

Abstract

本发明公开了一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系及其建立方法和应用。本发明采用正交试验和单因素试验，研究接种量、激素配比、糖浓度、培养基种类对细胞生长及黄酮含量的影响。利用松脆的胚性愈伤组织，可以很容易的建立起理想的巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系。巫山淫羊藿愈伤组织细胞悬浮培养在B₅基本培养基中并附加1.0mg·l^-12，4-D和0.2mg·l^-1BA，蔗糖浓度30-50g·l^-1，接种量为鲜重2g每30ml，这样建立起的悬浮细胞培养体系能获得高产黄酮。

Description

巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系及其建立方法和应用

技术领域

本发明涉及悬浮细胞培养技术，具体涉及巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系及其建立和应用方法。

背景技术

巫山淫羊藿(E.wushanense)，来源于小檗科(Berberdiaceae)淫羊藿属(Epimedium)的多年生宿根性草本植物。李时珍《本草纲目》中称其有“益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”之功效。现代药理实验研究表明，淫羊藿能增加心脑血管血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，具有抗衰老、抗肿瘤，补肾阳，强筋骨，祛风湿等功效，临床应用十分广阔《国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2000.267.；李晶晶，于世凤，李铁军，等.淫羊藿对口腔各矿化组织破骨细胞性骨吸收的体外实验研究[J].中国口腔医学杂志，2002，37(5)：391，》。其有效成分为淫羊藿甙等黄酮类化合物和多糖等次生代谢产物《郭宝林，肖培根.淫羊藿属植物中的黄酮类成分及其分类学意义.植物分类学报，1999，37(3)：228.》。随着现代中药产业化的进程，现代科学对淫羊藿的深入研究，新的疗效的不断发现，以淫羊藿为主要原料的中成药、民族药产品不断问世，市场对淫羊藿需求量愈来愈大，使其野生资源渐有不能满足需求之虞。国内外淫羊藿细胞悬浮培养及其黄酮含量的研究鲜见报道。

而植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物具有提高产率、缩短周期、调控其生产过程、提高产品质量等显著特点。因此，了解巫山淫羊藿悬浮细胞的生长特征，对其悬浮细胞产次生代谢产物打下基础。

发明内容

本发明目的旨在提供一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系及其建立方法和应用。通过研究巫山淫羊藿悬浮培养条件及其对愈伤组织中黄酮含量的影响，建立巫山淫羊藿细胞悬浮培养的技术体系，以期为巫山淫羊藿野生资源保护及建立高效的淫羊藿黄酮离体生产体系提供技术基础。

为实现上述目的，本发明采用正交试验和单因素试验，研究接种量、激素配比、糖浓度、培养基种类对细胞生长及黄酮含量的影响，而建立了一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系，该体系是以B₅培养基为基本培养基，附加1.0mg·L^-12，4-D，0.2mg·L^-1BA，蔗糖30-50mg·L^-1，调节pH值在5.8，于121℃高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基；其中以蔗糖40mg·L^-1最佳。

利用巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系对巫山淫羊藿愈伤组织细胞悬浮培养的方法步骤为：

1)、从淫羊藿幼嫩叶片诱导得到的愈伤组织，经过继代培养反复筛选后选取生长均一，质地疏松，分散性好的愈伤组织作接种材料；

2)、在愈伤组织接种继代16天后，接种在培养液中进行振荡培养，在120rpm，24±2℃，光照12h·d^-1培养，培养液采用同继代愈伤组织的培养基相同的激素和蔗糖浓度配比，LS培养基+2，4-D2.0mg·L^-1+0.5mg·L^-16-BA+蔗糖(Sugar)30g·L^-1，只是不加琼脂，培养瓶采用100mL的三角瓶；

3)、每瓶中加培养液30mL，初始接种量在1-2g范围内，悬浮培养初期10d天后用120目的不锈钢筛对培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞团及单细胞；

4)、初期每半个月换培养液1次，每次换培养液时先将培养物静置，倒去上层2/3培养液，保留1/3原液，加入2/3新液，从悬浮培养初期半个月继代1次，逐步缩短为一周继代1次，这样通过3-4次继代培养，即可得到只含单细胞或小细胞团的培养物，将这些细胞混匀，得到悬浮培养细胞；

5)、将得到的悬浮培养细胞的培养物在培养6d天后，用400目不锈钢筛网过滤收集细胞，然后称量一定数量的细胞接种到分装有30mL液体培养基的100mL三角瓶中到进行培养，的所述液体培养基是以B₅培养基为基本培养基，附加1.0mg·L^-12，4-D，0.2mg·L^-1BA，蔗糖30-50mg·L^-1，调节pH值在5.8，于121℃高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基，每瓶接种继代培养6d后的经400目无菌不锈钢筛网过滤的2g淫羊藿鲜细胞，在120rpm，24±2℃，每天光照12h培养；其中以蔗糖40mg·L^-1最佳；

6)、培养后，每3d取5瓶细胞培养物测定其PCV，再用400目不锈钢筛网过滤，洗涤，称量其鲜重，再60℃烘干至恒重称量得干重。

利用本发明的巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系，接种量为鲜重2g每30mL，该悬浮细胞培养体系能获得高产黄酮。

附图说明

图1巫山淫羊藿悬浮培养细胞生长曲线

图2巫山淫羊藿悬浮培养细胞黄酮含量变化曲线

图3悬浮培养细胞PCV变化曲线

图4悬浮培养细胞培养液中残糖含量变化曲线

图5悬浮培养细胞培养液中NO₃ ^-和NH₄ ⁺含量变化曲线

图6悬浮培养细胞培养液中PO₃ ³⁺含量变化曲线

具体实施方式

实施例1

建立巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系

本发明采用正交试验和单因素试验，研究接种量、激素配比、糖浓度、培养基种类对细胞生长及黄酮含量的影响而建立巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系。

1、材料与方法

1.1材料培养从淫羊藿幼嫩叶片诱导得到的愈伤组织，经过继代培养反复筛选后选取生长均一，质地疏松，分散性好的淡黄色的愈伤组织作接种材料。在愈伤组织接种继代16天后，接种在培养液中进行振荡培养(120rpm)，光照12h·d^-1。培养液采用同继代愈伤组织的培养基相同的激素和蔗糖浓度配比，LS培养基+2，4-D2.0mg·L^-1+0.5mg·L^-16-BA+Sugar30g·L^-1，只是不加琼脂。培养瓶采用100mL的三角瓶。每瓶中加培养液30mL。悬浮培养初期10d天后用120目的不锈钢筛对培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞团及单细胞。在悬浮培养初期，培养物生长很慢，对环境适应能力很差。初期每半个月换液1次，每次换液时先将培养物静置，倒去上层2/3培养液，保留1/3原液，加入2/3新液。从悬浮培养初期半个月继代1次，逐步缩短为一周继代1次。这样通过3-4次继代培养，即可得到只含单细胞或小细胞团的培养物。将这些细胞混匀，得到悬浮培养细胞。

1.2培养方法

将得到的悬浮培养细胞的悬浮培养物在培养6d天后，用400目不锈钢筛网过滤收集细胞。然后在超净工作台上用电子天平称量一定数量的细胞接种到分装有30mL液体培养基的100mL三角瓶中到进行培养。

1.3悬浮培养细胞生长实验参数的测定

以悬浮培养细胞的鲜重和总黄酮含量为生长指标，所得试样为4-5个平行试样的平均值。

细胞鲜重测定：20d天悬浮培养结束，用400目不锈钢筛网过滤收集细胞，用蒸馏水洗去细胞表面的培养液，再用滤纸吸取多余水分，最后称量得到细胞鲜重。

细胞干重测定：把收获的细胞测其鲜重以后，置于60℃的烘箱中过夜烘干至恒重，称量得细胞干重。

细胞增长率＝(收获细胞湿重-接种细胞湿重)/接种细胞湿重×100％。

培养物中总黄酮含量的测定：总黄酮含量采用分光光度法。将悬浮培养细胞收集，洗涤，60℃烘干至恒重，研细，取0.05g粉末至三角瓶中，加入体积浓度85％乙醇10mL浸泡，室温振荡48h。过滤得到总黄酮提取液。取滤液0.5mL于试管中，再加入10mL体积浓度85％乙醇摇匀得到样品液，在269.56nm处测吸光度。根据标准曲线计算相应的样品中总黄酮的含量。用淫羊藿甙标准品以同样方法测得标准曲线为：C＝25.349A-0.2225，R²＝0.9990，其中C为总黄酮含量(ug·mL^-1)。

2、结果

2.1初始接种密度对淫羊藿悬浮培养细胞生长和总黄酮的影响

在超净工作台上用电子天平称量1g、2g、3g悬浮培养细胞接种到添加了2.0mg·L^-12，4-D、0.5mg·L^-1BA、蔗糖30mg·L^-1的30mL的LS培养液中。20d培养结束后收集细胞，测量细胞增长率和总黄酮含量。培养结果如表1所示，接种量对细胞收获后的总黄酮含量影响不大，最后均能达到5.0％左右。但对黄酮产量有一定的影响。悬浮培养中，初始接种量的多少对细胞的生长有很大的影响。由表1可以看出，初始接种量在1-2g(每30mL培养液)范围内，细胞增长率随接种量的增加而增加，在2g时达到最大值，而此时的悬浮细胞培养体系中颗粒均匀，颜色鲜艳，分散性好；如继续增加接种量，细胞鲜重和干重的增殖倍数呈下降趋势，悬浮培养液也变的混浊，镜检时发现许多细胞内含物较少，空细胞很多，且瓶壁上聚集了很多的衰败细胞，所以悬浮细胞系在继代培养过程中，初始接种量以每30mL的液体培养基加入2g左右的培养物为宜。

表1接种量对淫羊藿悬浮培养细胞生长和黄酮合成的影响

2.2激素配比对淫羊藿细胞生长和总黄酮含量的影响

以LS为基本培养基，蔗糖30g·L^-1，以0.01wt％HCL和0.01wt％NaOH调节pH值至5.8，接种量为每瓶2g。2，4-D分别取0，1.0，2.0，3.0(mg·L^-1)，4个水平，6-BA分别取0，0.2，0.4，0.5(mg·L^-1)4个水平。进行2因素4水平16处理的试验。结果如表2所示

表2激素配比对细胞生长的影响

大多数细胞悬浮培养时，激素2，4-D一般有利于细胞的生长。因而巫山淫羊藿细胞悬浮培养时，采用的激素种类同于获得疏松愈伤组织时的激素，即2，4-D和6-BA。

由表2可知，当2，4-D浓度由0mg·L^-1增加到1.0mg·L^-1时，细胞生物量也增加，而BA由0.2mg·L^-1增加到0.5mg·L^-1时，细胞生物量在减少。从T1-T4栏中可看出，2，4-D为主要因素，对细胞生物量的影响较大，而BA对细胞生物量的影响较小。2，4-D在取1.0mg·L^-1时收获细胞生物量最大，而BA在取0.2mg·L^-1时收获的细胞生物量最大。并且，当浓度在1mg·L^-1到2mg·L^-1范围内时悬浮培养细胞的鲜重和干重基本稳定。当高于3mg·L^-1镜检时，细胞内含物减少，空细胞和变形细胞增加，细胞干重下降。故较适合细胞悬浮生长的激素组合为2，4-D1.0mg·L^-1，6-BA0.2mg·L^-1。

2.3培养基中糖浓度对淫羊藿细胞生长和总黄酮含量的影响

在LS培养基中添加不同蔗糖浓度，确定在培养液中的适合浓度。实验结果如表3。

表3不同蔗糖浓度对悬浮细胞培养的影响

注：①Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中数据为重复试验值；②X为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ数据的平均值。

实验结果(表3)显示，当蔗糖浓度在20mg·L^-1-40mg·L^-1范围内，淫羊藿悬浮培养细胞的生长随浓度的升高而升高，当40mg·L^-1时细胞鲜重最大。蔗糖浓度过高在50mg·L^-1时，淫羊藿细胞生长受到抑制。因此，蔗糖浓度以在培养基中添加蔗糖40mg·L^-1为宜，能使淫羊藿细胞生长良好，细胞鲜重和干重均能达到最大值。

2.4培养基对淫羊藿悬浮细胞生长和总黄酮含量的影响

在超净工作台上，用电子天平称量过滤收集到的2g悬浮培养细胞，接种到附加1.0mg·L^-12，4-D，0.2mg·L^-1BA和40mg·L^-1蔗糖的MS，LS，B₅，1/2MS，N₆的培养液中。培养结果如表4所示，淫羊藿细胞在不同的液体培养基中生长和总黄酮的合成情况不同，在1/2MS培养基中，细胞生长较好，但所得细胞干重却较低，可能是在1/2MS培养基里的细胞含水量多，进而干重偏低；而MS，B₅，N₆培养液的细胞生长基本相同，但在B₅培养基中的细胞干重最大，总黄酮含量也最高，达5.47％，说明B₅培养液有利于黄酮的合成；而在LS培养基中的细胞生长和黄酮含量都较低。所以B₅培养基有利于巫山淫羊藿细胞的生长及总黄酮的合成。而N₆培养基有利于新疆雪莲细胞的生长和总黄酮的合成《朱朝德，张转平，孙全明，等.巫山淫羊藿叶中总黄酮及淫羊藿甙含量的动态变化研究《中国中药杂志，1998，23(1)：21-26.》，可能黄酮的合成需要的培养基种类与培养的物种有关。

表4不同基本培养基对淫羊藿悬浮培养细胞生长和黄酮合成的影响

3悬浮培养体系的建立

细胞悬浮培养的研究是植物细胞生产工业化必经的重要步骤。体细胞胚可以通过悬浮培养获得。和固体培养相比，细胞悬浮培养具有细胞繁殖速度快、能大规模地培养和可提供较大量均匀一致的植物细胞培养的特点。利用松脆型的胚性愈伤组织，可以很容易的建立起理想的悬浮细胞培养体系《李士生，张玉玲.小麦幼穗的组织培养及愈伤组织的分化研究[J].武汉植物学研究，1990，8(4)：349-354》。陈崇顺等认为悬浮培养条件不能改善置于其液体培养基愈伤组织的脆散性《陈崇顺，Robert J.茎脆散型愈伤组织的获取及细胞悬浮体培养的建立[J].植物资源与环境，1994，3(2)：22-26》。所以，要成功建立细胞悬浮培养系统，必须先获得高脆性愈伤组织。获得高脆性愈伤组织常常是由固体培养成功过渡到液体培养的先决条件。

悬浮培养中愈伤组织经过几次继代培养，培养物只含单细胞和少量很少的细胞团。悬浮细胞系的建立过程中，植物细胞生长调节剂是影响细胞状态的重要因素。有人认为，激素受体蛋白存在于细胞质膜上。质膜受激素影响，发生一系列结构与功能(如膜透性)上的改变。随之，细胞的渗透压及细胞质浓度相应发生变化。由于细胞内的种种变化，引起细胞膜和细胞器上的许多酶或酶原失活或活化。酶的变化必然导致细胞的新陈代谢和生长发育随之发生变化。所以激素在悬浮培养中的作用是极重要的。本实验通过观察不同浓度2，4-D对悬浮细胞生长的影响，认为在悬浮细胞培养过程中2，4-D浓度不宜过高，以1.0mg·L^-1为宜并附加0.2mg·L^-1BA，培养的细胞状态为小颗粒状，淡黄色，细胞生长快。对于颜色变浅，细胞内含物减少的高激素悬浮细胞体系，将其转移到较低2，4-D浓度的培养基中继代培养1-2次，悬浮细胞培养体系的状态一般都会恢复；对于悬浮细胞团颗粒变大，生长缓慢的悬浮细胞培养体系，则将其转移到较高2，4-D浓度的培养基继代培养1-3次，也可以建立良好的细胞悬浮体系。

在细胞培养中，随着蔗糖浓度的增加，细胞的增殖倍数呈上升趋势，但超过一定量时细胞增殖倍数呈明显的下降趋势。本实验中观察到蔗糖含量在20-40g·L^-1范围内，随着蔗糖量的增加，细胞的鲜重和干重的增殖倍数都显著增加；40-50g·L^-1范围内，增殖倍数有所下降。

向太和等认为在细胞悬浮培养过程中《向太和，杨剑波，吴家道，等.水稻、玉米胚性悬浮细胞系的有效建立[J].安徽农业科学，1996，24(4)：1-3》，愈伤组织的密度和更换培养基时新旧培养基的比例对悬浮细胞系的建立影响较大，特别是在悬浮培养初期这些影响更为明显。培养密度过低，细胞生长缓慢；密度过高，愈伤组织易褐化，且悬浮细胞易液泡化。此外，在每次更换培养基时，应保留1/3-2/3体积的原培养液，需要视具体情况而定。对于生长较快的细胞系更换培养液时相对保留一些原培养液，反之亦然。原培养液保留太少，愈伤组织易褐化；原培养液保留太多，愈伤组织呈饥饿状态，生长滞缓。王海波认为《向太和，杨剑波，吴家道，等.水稻、玉米胚性悬浮细胞系的有效建立[J].安徽农业科学，1996，24(4)：1-3》，高密度细胞时易使悬浮细胞老化，或颗粒增大，或衰败黄褐，易使细胞进入停滞状态。对于来自固体的松脆结构的愈伤组织和旺盛生长的细胞系来说，并没有严格的密度最低界限，但密度过低时生长缓慢，容易出现膨大型的细胞。这一观点得到许多研究者的支持。在本实验中通过测定初始接种量对悬浮细胞生长的影响发现，接种量为1.0g每瓶时细胞生长缓慢，接种量超过2g时培养液在继代第10d后培养液就会变混浊，瓶壁上也会沉积一些死细胞。说明只有适宜的细胞密度才有利于悬浮细胞的生长。这与以上研究者的结论基本一致。另外本实验在悬浮培养细胞初期继代时，保留了1/3的原培养液，当悬浮培养细胞系稳定后，继代培养时原培养液的保留量就不会对悬浮细胞生长有太大的影响。

3.2不同种类的液体培养基对淫羊藿悬浮体系建立的影响

不同种类的液体培养基对植物细胞的生长和次生产物的形成有很大的影响。目前，比较适合多种植物的一般营养条件的培养基，有多种配方可供选择，如MS，KC，White，B₅，N₆，LS等，有的研究表明降低培养基中氮源的总浓度能促进黄酮类化合物的合成。本实验结果也表明含低浓度铵的B₅培养基有利于巫山淫羊藿细胞生长及黄酮类化合物的合成。

综上所述，利用松脆的胚性愈伤组织，可以很容易的建立起理想的巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系。悬浮体系保存在B₅基本培养基中并附加1.0mg·L^-12，4-D和0.2mg·L^-1BA，蔗糖浓度40g·L^-1，接种量为2g每30mL，这样建立起的悬浮细胞培养体系能获得高产黄酮。

实施例2

巫山淫羊藿悬浮培养体系细胞的生长试验

仪器：雷磁Phs-25数显pH计，上海精密科学仪器有限公司；LDZX-40BI型立式自动压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HZQ-QX全温振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；GBC 916紫外-可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器有限公司生产)

试剂：淫羊藿甙对照品(购自中国药品生物制品检定所)。

培养体系：培养体系为本实验室利用巫山淫羊藿(贵州药用植物-淫羊藿分类专家何顺志、经西华师范大学秦马永红老师鉴定)幼叶经诱导得到愈伤组织，培养数代后得到的巫山淫羊藿均匀悬浮培养细胞。将悬浮培养物用400目不锈钢筛网过滤，收集细胞。在超净工作台上用电子天平称量2g细胞加入到B₅培养基中培养。

实验方法

生长曲线的绘制

以B₅培养基为基本培养基，附加1.0mg·L^-12，4-D，0.2mg·L^-1BA，蔗糖30mg·L^-1配制成生长培养基，以0.01wt％HCL和0.01wt％NaOH调节pH值在5.8，于120℃20分钟高压灭菌。取30mL培养基装于100mL三角瓶中，每瓶接种继代培养6d后的经400目无菌不锈钢筛网过滤的2g淫羊藿鲜细胞，在120rpm，24±2℃，每天光照12h培养。培养后，每3d取5瓶细胞培养物测定其PCV，再用400目不锈钢筛网过滤，洗涤，称量其鲜重，再60℃烘干至恒重称量得干重。绘制其细胞干湿重生长曲线。

紧实细胞体积(PCV)的测定：

悬浮培养过程中，每3d取其培养物，静置，弃去上清液，将下面沉淀物倒入刻度离心管中，500rpm离心5min，测定紧实细胞体积(PCV)。然后将其摇匀倒入弃去的上清液中。测细胞的湿重和干重作生长曲线。

培养过程中生长参数的测定。取测生长曲线后的滤液，测其滤液中各营养物浓度。

培养液中NO₃ ^-的测定：利用硝酸盐与苯酚二磺酸反应生成一种黄色物质，其最大吸收峰在410nm，用分光光度计进行分析的方法(Wang LJ，Zhang Z.Analytical Chemistry[M].Beijing：Chemistry industry publication.1998，351-353(in Chinese)。根据标准曲线及回归方程计算样品液中硝酸根的含量。

NO₃ ^-标准曲线方程为：OD_410nm＝0.0194C+0.026(其中C为NO₃ ^-的含量，mg·mL^-1)，此方程的R²＝0.995。

培养液中NO₃ ^-浓度的测定：将培养液过滤，稀释10倍后，取0.05mL，参照标准曲线的测定方法进行，由标准曲线计算培养液中的硝酸根的含量。

靛定酚蓝比色法测定培养液中的NH₄ ⁺浓度：利用培养液NH₄ ⁺在强碱介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性蓝色染料靛定酚蓝，在一定范围内，溶液颜色的深浅与NH₄ ⁺-N浓度成正比的原理，因此，通过测定靛定酚蓝对可见光的特定吸收，即可得到培养液中NH₄ ⁺的浓度(Weather burn MV.Phenol Hypochlorite reaction for determination of ammonia[J]Analynic Chemistry，1967，39(8)：971-974)。根据标准曲线及回归方程计算样品液中NH₄ ⁺的含量。

NH₄ ⁺标准曲线方程为：OD_625nm＝0.2593C-0.0298(其中C为NH₄ ⁺的含量，μg·L^-1)，此方程的R²＝0.9959。

培养液中的NH₄ ⁺浓度的测定：取1ml培养液于50mL容量瓶中，其余操作同标准曲线。根据测得的OD值求得相应的氨离子的浓度。

培养液中PO₄ ^3-的测定：利用培养液中PO₄ ^3-与钼酸盐-钒酸盐试剂发生反应，产生一种黄色物质，其在400nm处有一最大吸收峰的原理，即可得到培养液中PO₄ ^3-的浓度(ChenPS，Oribara TY，Huber W.Micro-determination of p hosphorus[J]Analynic Chemistry，1956，28(11)：1756-1759)。根据标准曲线及回归方程计算样品液中PO₄ ^3-的含量。

PO₄ ^3-标准曲线方程为OD_400nm＝0.0201C-0.0028(其中C为PO₄ ^3-的含量，ug·L^-1)，此方程的R²＝0.9997。

培养液中PO₄ ^3-浓度的测定：取1mL培养液于25mL容量瓶中，其余操作同标准曲线。根据测得的OD_400nm值求得相应的PO₄ ^3-的浓度。

培养液中蔗糖浓度的测定：利用培养液中的糖在高温下与蒽酮试剂发生反应，呈现出黄绿色，在620nm处有最大吸收峰的原理，即可得到培养液中蔗糖的浓度^[7]。根据标准曲线及回归方程计算样品液中蔗糖的含量。

蔗糖标准曲线方程为OD_620nm＝6.3643C+0.0045(其中C为蔗糖的含量，mg·L^-1)，此方程的R²＝0.9992。

培养液中蔗糖含量的测定取2mL培养液于试管中，加入10mL蒽酮溶液，其与步骤操作同标准曲线。

培养物中总黄酮含量的测定：总黄酮含量采用分光光度法。将悬浮培养细胞收集，洗涤，60℃烘干至恒重，研细，取0.05g粉末至三角瓶中，加入85％乙醇10mL浸泡，室温振荡48h。过滤得到总黄酮提取液。取滤液0.5mL于试管中，再加入10mL 85％乙醇摇匀得到样品液，在269.56nm处测吸光度。根据标准曲线计算相应的样品中总黄酮的含量。用淫羊藿甙标准品以同样方法测得标准曲线为：C＝25.349A-0.2225，R²＝0.9990，其中C为总黄酮含量(ug·mL^-1)。

本试验作出了巫山淫羊藿悬浮细胞生长曲线(图1)，巫山淫羊藿悬浮培养细胞黄酮含量变化曲线(图2)，悬浮培养细胞PCV变化曲线(图3)。

由图可见巫山淫羊藿细胞悬浮培养的生长基本呈S型曲线，3-6d为延滞期，指数增长期在6-18d，之后进入稳定期。并且从糖的利用情况也是基本和细胞的生长情况一致，细胞生长最快时，糖利用能力最强，到18d后，悬浮培养液中细胞进入了稳定期，在显微镜下观察细胞团增大。细胞湿重有所下降，干重保持基本不变，但细胞的PCV体积在18-21d时还在增加，这段时间镜检观察空细胞增多，细胞的内含物减少。故细胞虽然体积增加，但细胞的鲜重和干重都基本保持不变，所以细胞的最佳收获期在20d左右。

黄酮的形成积累与细胞生长也有很大关系，在延迟期黄酮含量较低，但在延滞期中间有一个最高值；进入快速生长期后，淫羊藿黄酮含量也逐渐升高，基本与细胞生长呈正向相关；细胞生长进入静止期后淫羊藿黄酮含量开始下降；到达衰亡期时银杏黄酮含量下降到最低值。巫山淫羊藿悬浮培养周期约为21d，经过21d的生物量达到最大值，为107.3mg干重每升；继续培养细胞产黄酮量下降。考虑到淫羊藿细胞增长倍数和黄酮含量两个因素，在实验中选取生长到第20d时收获细胞为宜。

光照对许多植物中黄酮类化合物，如黄酮、黄酮醇和花色素苷的合成，具有诱导作用^[8]。大量研究已证实苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)是植物细胞中黄酮生物合成途径中的第一关键酶。在实验中探索了在相同光照强度下不同光照时间对巫山淫羊藿细胞产黄酮的影响。淫羊藿悬浮细胞在光照和黑暗条件都产黄酮，但光照时间对黄酮合成产量有关，实验结果(表5)表明，光照对悬浮培养细胞及黄酮产量均有影响，光照时间越长黄酮含量越高，产量也越高。12小时即能明显促进黄酮的合成，再延长光照时间却没有明显影响，对黄酮合成也有同样效应。但全天光照反而抑制巫山淫羊藿细胞黄酮合成，黄酮含量降低，但均高于黑暗条件的黄酮含量。这与光照时间对水母雪莲愈伤组织生长和黄酮生物合成的影响是一致的^[9]。光照时间对巫山淫羊藿产黄酮有很大影响，黑暗条件下，细胞合成黄酮量17.2099mg·L^-1。细胞合成黄酮最佳光照时间为12h/d，黄酮合成产量为27.85482mg·L^-1

表5光照对淫羊藿黄酮合成的影响

培养过程中营养组分的含量并不恒定，而是随着培养过程的进行而下降。糖作为细胞代谢过程中碳水化合物的最好来源，对细胞的生长有较大的影响。图4给出了悬浮培养细胞培养液中残糖含量变化曲线。由图可知，蔗糖的消耗利用是较快的。最初蔗糖浓度为40g·L^-1，培养24d后，只剩7.39g·L^-1，蔗糖的平均消耗速度是1.36g·L^-1每天。对数生长期的第6d至第18d蔗糖消耗更快，浓度从34.75g·L^-1降到10.30g·L^-1，平均消耗速度为2.0375g·L^-1每天。蔗糖的这种消耗速度与细胞的生长速度密切相关。培养初期糖的消耗量小，相应细胞处于延迟期，细胞生长速度慢，生长量也缓慢，在对数生长期，蔗糖被大量消耗，细胞生长量也最大。表明碳源是细胞生物量积累的主要能源。

图5给出了悬浮培养细胞培养液中NO₃ ^-和NH₄ ⁺含量变化曲线。氮元素是植物细胞的重要组成元素之一，也是生物碱等次级代谢物的组成元素。细胞生长一个重要指标是NO₃ ^-和NH⁴⁺的代谢变化。在细胞生长初期NH₄ ⁺的消耗比较快，在生长高峰期，NH₄ ⁺的消耗并不随细胞生长的加快而增加。在B₅培养基中，NH₄ ⁺与NO₃ ^-的摩尔比2∶25，N素的总浓度为27mmol·L^-1。在图5中显示，在培养前期，铵盐比硝酸盐的利用速度较快，铵盐的摄入对淫羊藿细胞生长所需的蛋白质的合成十分重要，而硝酸盐的消耗则与黄酮和其它的一些次级代谢产物合成的关键有关。

培养液中PO₃ ³⁺的变化：

植物细胞培养需要各种无机元素，其中磷酸盐的浓度对细胞生长和次级代谢物生长有很大影响。

磷是在细胞生命活动中起重要作用的DNA、RNA、ATP等许多生物活性物质的组成元素，对细胞分裂，繁殖、生长和新陈代谢有重要意义。图6给出了悬浮培养细胞培养液中PO₃ ³⁺含量变化曲线。淫羊藿细胞在第9d时，约有60％的磷被消耗，在第18d时基本消耗完。

本实验中，淫羊藿细胞生长曲线也呈S型，0-5d为延滞期，5-18d为指数生长期，18-24d为静止期，最佳换液时间为20d左右，否则培养基的养分所剩无几，细胞生长量下降，甚至细胞出现退化现象，褐化死亡。不同悬浮培养材料对营养利用时间不同，细胞生长规律也不同。

在植物细胞培养中，细胞的生长受培养基中的糖源的制约，蔗糖作为生物代谢过程中的碳源，在培养基中降解成葡萄糖和果糖。高含量的蔗糖常刺激组织培养细胞的生长。在细胞培养中NH₄ ⁺的作用前人已有研究表明，NH₄ ⁺作为生物合成过程中的氮源，NH₄ ⁺被用于蛋白质的合成，而NO₃ ^-与次生代谢过程中的关键酶和一些代谢物的合成有关。在本实验中淫羊藿悬浮细胞选择了B₅作为培养基，能获得高产次生代谢物黄酮。淫羊藿细胞在生长初期铵盐被迅速消耗，硝酸盐消耗比较缓慢。具体两者之间的代谢关系有待进一步研究。

光照条件对黄酮类化合物的合成影响很大。研究发现植物合成黄酮类化合物是对紫外线照射的一种反应，可以保护植物免受紫外线的伤害。紫外线可以引发植物合成黄酮类化合物的基因的转录活性，紫外线照射后，黄酮类化合物迅速合成，并积累于表皮细胞(SchmelzerE，Jahnen W，Hahlbrock K.In situ localization of light-induced chalcone synthase mRNA，chalcone synthase and flavonoid end products in epidermal cells of parsley leaves[J]Proc NatAcad Sci USA，1988，85(9)：2989-2993)。光照可以促进植物细胞黄酮类化合物的合成，巫山淫羊藿黄酮的合成也与光照关系密切，黑暗条件下细胞培养物产黄酮量只是光照的3/5，细胞黄酮含量是光照条件下的4/5。而细胞产黄酮量与光照时间也有一定关系，研究发现12h有利于巫山淫羊藿悬浮细胞黄酮的形成和积累，此时细胞黄酮含量最高5.2％，产量也达到最高。

Claims

1.一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系，其特征是，该体系是以B₅培养基为基本培养基，附加1.0mg·L^-12，4-D，0.2mg·L^-1BA，蔗糖30-50mg·L^-1，调节pH值在5.8，于121℃高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基。

2.如权利要求1所述的巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系，其特征在于：该体系是以B₅培养基为基本培养基，附加1.0mg·L^-12，4-D，0.2mg·L^-1BA，蔗糖40mg·L^-1，调节pH值在5.8，于121℃高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基。

3.如权利要求1或2所述的一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系的建立方法、其特征在于，该悬浮细胞培养体系采用正交试验和单因素试验，研究接种量、激素配比、糖浓度、培养基种类对细胞生长及黄酮含量的影响基础上而建立。

4.一种巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系悬浮培养巫山淫羊藿愈伤组织细胞的方法，其特征在于，方法步骤为：

2)、在愈伤组织接种继代16天后，接种在培养液中进行振荡培养，在120rpm，24±2℃，光照12h·d^-1培养，培养液采用同继代愈伤组织的培养基相同的激素和蔗糖浓度配比，LS培养基+2，4-D2.0mg·L^-1+0.5mg·L^-16-BA+蔗糖30g·L^-1，只是不加琼脂，培养瓶采用100mL的三角瓶；

4)、初期每半个月换培养液1次，每次换培养液时先将培养物静置，倒去上层2/3培养液，保留1/3原液，加入2/3新液，从悬浮培养初期半个月继代1次，逐步缩短为一周继代1次，这样通过3-4次继代培养，即得到只含单细胞或小细胞团的培养物，将这些细胞混匀，得到悬浮培养细胞；

5)、将得到的悬浮培养细胞的培养物在培养6d天后，用400目不锈钢筛网过滤收集细胞，然后称量一定数量的细胞接种到分装有30mL液体培养基的100mL三角瓶中进行培养，所述的液体培养基是以B₅培养基为基本培养基，附加1.0mg·L^-12，4-D，0.2mg·L^-1BA，蔗糖30-50mg·L^-1，调节pH值在5.8，于121℃高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基，每瓶接种继代培养6d后的经400目无菌不锈钢筛网过滤的2g淫羊藿鲜细胞，在120rpm，24±2℃，每天光照12h培养；

5.如权利要求4所述的用巫山淫羊藿悬浮细胞培养体系悬浮培养巫山淫羊藿愈伤组织细胞的方法，其特征在于，步骤5)中所述的液体培养基是以B₅培养基为基本培养基，附加1.0mg·L^-12，4-D，0.2mg·L^-1BA，蔗糖40mg·L^-1，调节pH值在5.8，于121℃高压灭菌15-20分钟配制成的生长培养基。