CN104472355B - 一种箭叶淫羊藿越冬芽快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种箭叶淫羊藿越冬芽快速繁殖方法，本方法以箭叶淫羊藿越冬芽为外植体，消毒后进行组织培养，诱导分化，生根繁殖。愈伤组织分化出芽的分化率高达88.9%，且后期的增殖培养不需要更换培养基，增殖系数可达5.3。本发明操作简单，繁殖率高，生产成本低，繁殖周期短，适宜于工厂生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培技术领域，具体涉及一种箭叶淫羊藿越冬芽快速繁殖方法。
背景技术
箭叶淫羊藿Epimedium为小檗科箭叶淫羊藿属多年生宿根性草本药用植物，是我国传统补益类中药，已有2000多年的栽培历史，是中国应用最为广泛、最为悠久的中药之一。箭叶淫羊藿的传统繁殖方式为通过地下根茎的无性繁殖及种子繁殖。种子繁殖发芽率低，且生长缓慢。因此生产上大多采用分株繁殖的无性繁殖方式。这些方式均严格受生长季节及气候的限制，造成繁殖系数低，限制了箭叶淫羊藿的产业化和商品化生产。因此采用组织培养法繁殖箭叶淫羊藿，是提高其繁殖率的有效途径，对实现箭叶淫羊藿的规模化生产具有重要意义。
组织培养技术是目前最常用、最有效的无性繁殖方法，该技术利用植物体的器官、组织细胞或原生质体作为外植体，在一定条件下进行培养使之生长分化并发育成完整的植株。随着生物技术的发展，植物组织培养技术日益成熟，目前已在上千园林、园艺及药用植物上广泛应用。目前，组培技术在箭叶淫羊藿生产上应用不多，关于箭叶淫羊藿的组培技术报道较少，现有的箭叶淫羊藿组培技术存在诱导率低，生根困难等难题。
发明内容
本发明的内容在于提供一种箭叶淫羊藿越冬芽快速繁殖方法，本方法是以箭叶淫羊藿越冬芽为材料，进行箭叶淫羊藿组培繁殖，可以在较短时间内，组培繁殖获得大量的无性种苗，该方法高繁殖率、方便、快捷、低成本、适宜大面积推广，为其产业化生产提供了可能。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种箭叶淫羊藿越冬芽快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)外植体消毒：取淫羊藿当年秋季形成的分蘖芽即越冬芽。
2)愈伤组织诱导：芽体消毒后，切去外层苞片，内部初始分化的芽体切成0.5cm×0.5cm小块，置于愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基配方为：MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+3％(质量体积比)蔗糖+0.8％(质量体积比)琼脂，pH值调至6.0。1500～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。20天更换新培养基，培养基保持原配方(MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂)不变，形成愈伤组织。
3)芽的再生培养：将愈伤组织置于芽分化培养基：MS+1.0mg/L BA+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0，进行芽的再生培养。1500～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃，再生出芽。
4)芽的增殖培养：将再生的高2-3cm的植株单棵切下，置于芽的分化培养基MS+1.0mg/L BA+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂的培养基上进行芽增殖培养，pH值调至6.0。1500～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃，形成丛生芽。待芽高2-3cm可再切下，置于芽分化培养基，相同培养条件下继续进行增殖培养，扩繁植株；
5)生根培养：切取丛生芽单个芽体，芽体高2-3cm，置于生根培养基中进行生根培养，生根培养基组成为：MS+0.5g/L活性炭+3％蔗糖+0.8％琼脂，培养基pH值调至6.0。1500～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃，形成白色须根。
所述的越冬芽为箭叶淫羊藿每年秋季至次年初春地下部分形成的分蘖芽。
以上所述的步骤中，步骤1)中外植体消毒的步骤具体为：将越冬芽表面刷洗干净，再于流水下冲洗30min～90min，晾干至芽体表面没有水渍，无菌条件下，将晾干的越冬芽置于灭过菌的广口瓶中，用75％(体积比)的酒精溶液浸泡40s，倒掉酒精，再用0.1％(质量体积比)的升汞溶液浸泡消毒10min～20min，消毒期间不断摇晃广口瓶以保证消毒过程的均匀彻底。然后取出芽体置于另一灭过菌的广口瓶中用无菌水清洗6-8遍，得到接种材料；
以上所述的步骤中，步骤3)中是先将步骤2)中形成的愈伤组织继代三次后再进行芽的再生培养，继代培养基配方为MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0，1500lux～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃，20天继代一次。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明由淫羊藿越冬芽形成的愈伤组织分化出芽，愈伤组织分化出芽的分化率高达88.9％，且后期的增殖培养的培养基配方与分化培养基相同，增殖系数可达5.3。本发明操作简单，繁殖率高，生产成本低，繁殖周期短，适宜于工厂生产应用。以一棵完整的淫羊藿组培苗为例进行增殖培养，40天为一个增殖周期，增殖系数以5.3计算，一年中可扩繁的苗数见下表。
| 天数(d) | 40 | 80 | 120 | 160 | 200 | 240 | 280 | 320 |
| 苗数(棵) | 5.3 | 28 | 149 | 789 | 4182 | 22164 | 117471 | 622597 |
具体实施方式
本发明实施例所使用的试剂，如未特别说明，市售的均为实现本发明。所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
实施例1：
一种箭叶淫羊藿越冬芽快速繁殖方法，其步骤如下：
1)外植体消毒：取淫羊藿当年秋季形成的分蘖芽即越冬芽。将越冬芽表面刷洗干净，再于流水下冲洗30min或60min或90min，晾干至芽体表面没有水渍，无菌条件下，将晾干的越冬芽置于灭过菌的广口瓶中，用75％(体积比)的酒精溶液浸泡40s，倒掉酒精，再用0.1％(质量体积比)的升汞溶液浸泡消毒10min或15min或20min，消毒期间不断摇晃广口瓶以保证消毒过程的均匀彻底。然后取出芽体置于另一灭过菌的广口瓶中用无菌水清洗6-8遍，得到接种材料；
2)愈伤组织诱导：芽体消毒后，切去外层苞片，内部初始分化的芽体切成0.5cm×0.5cm小块，置于配置好的愈伤组织诱导培养基上，培养基配方为：MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0。1500lux或2000lux或2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。20天更换新培养基，培养基保持原配方(MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂)不变，30天开始形成愈伤组织。愈伤组织诱导率计算方式：愈伤组织诱导率＝(形成愈伤组织的外植体数目/总外植体数目)×100％。40天后统计结果显示该配方培养基对箭叶淫羊藿越冬芽愈伤组织的诱导率可达52.3～57.8％；
3)芽的再生培养：将形成的愈伤组织继代三次，继代培养基配方为MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0，1500lux或2000lux或2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。20天继代一次，继代三次后置于芽分化培养基：MS+1.0mg/L BA+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0，进行芽的再生培养。1500lux或2000lux或2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。15天开始就能再生出芽，芽再生率计算方式：芽再生率＝(能形成芽的愈伤组织数目/总的愈伤组织数目)×100％。45天后统计结果显示该配方培养基对箭叶淫羊藿愈伤组织分化出芽的比率达到了79％～88.9％；
4)芽的增殖培养：将再生的高2-3cm的植株单棵切下，置于芽的分化培养基MS+1.0mg/L BA+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂的培养基上进行芽增殖培养，pH值调至6.0。1500lux或2000lux或2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。一个月后，形成丛生芽，增殖系数达4.2～5.3；
5)生根培养：切取丛生芽单个芽体，芽体高2-3cm，置于生根培养基中进行生根培养，生根培养基组成为：MS+0.5g/L活性炭+3％蔗糖+0.8％琼脂，培养基pH值调至6.0。1500lux或2000lux或2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。40天左右形成白色须根。生根率达88.3％～96％，每棵植株生根5-7根。
实施例2：
一种箭叶淫羊藿越冬芽快速繁殖方法，其步骤如下：
1)外植体消毒：取淫羊藿当年秋季形成的分蘖芽为越冬芽。将越冬芽表面刷洗干净，再于流水下冲洗60min，晾干至芽体表面没有水渍，无菌条件下，将晾干的越冬芽置于灭过菌的广口瓶中，用75％(体积比)的酒精溶液浸泡40s，倒掉酒精，再用0.1％(质量体积比)的升汞溶液浸泡消毒15min，消毒期间不断摇晃广口瓶以保证消毒过程的均匀彻底。然后取出芽体置于另一灭过菌的广口瓶中用无菌水清洗6-8遍，得到接种材料；
2)愈伤组织诱导：芽体消毒后，切去外层苞片，内部初始分化的芽体切成0.5cm×0.5cm小块，置于配置好的愈伤组织诱导培养基上，培养基配方为：MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0。2000lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。20天更换新培养基，培养基保持原配方(MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂)不变，30天开始形成愈伤组织。愈伤组织诱导率计算方式：愈伤组织诱导率＝(形成愈伤组织的外植体数目/总外植体数目)×100％。40天后统计结果显示该配方培养基对箭叶淫羊藿越冬芽愈伤组织的诱导率可达57.8％。
3)芽的再生培养：将形成的愈伤组织继代三次，继代培养基配方为MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0，2000lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃，20天继代一次。继代三次后置于芽分化培养基：MS+1.0mg/L BA+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0，进行芽的再生培养。2000lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。15天开始就能再生出芽，芽再生率计算方式：芽再生率＝(能形成芽的愈伤组织数目/总的愈伤组织数目)×100％。45天后统计结果显示该配方培养基对箭叶淫羊藿愈伤组织分化出芽的比率达到了88.9％。
4)芽的增殖培养：将再生的高2-3cm的植株单棵切下，置于芽的分化培养基MS+1.0mg/L BA+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂的培养基上进行芽增殖培养，pH值调至6.0。2000lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。一个月后，形成丛生芽，增殖系数达5.3；
5)生根培养：切取丛生芽单个芽体，芽体高2-3cm，置于生根培养基中进行生根培养，生根培养基组成为：MS+0.5g/L活性炭+3％蔗糖+0.8％琼脂，培养基pH值调至6.0。2000lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃。40天左右形成白色须根。生根率达96％，每棵植株生根5-7根。
Claims (4)
1.一种箭叶淫羊藿越冬芽快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)外植体消毒：取淫羊藿当年秋季形成的分蘖芽即越冬芽；
2)愈伤组织诱导：芽体消毒后，切去外层苞片，内部初始分化的芽体切成0.5cm×0.5cm小块，置于愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基配方为：MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0；1500～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃；20天更换新培养基，培养基保持原配方不变，形成愈伤组织；
3)芽的再生培养：将愈伤组织置于芽分化培养基：MS+1.0mg/L BA+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0，进行芽的再生培养；1500～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃，再生出芽；
4)芽的增殖培养：将再生的高2-3cm的植株单棵切下，置于芽的分化培养基MS+1.0mg/LBA+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂的培养基上进行芽增殖培养，pH值调至6.0；1500～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃，形成丛生芽；
5)生根培养：切取丛生芽单个芽体，芽体高2-3cm，置于生根培养基中进行生根培养，生根培养基配方为：MS+0.5g/L活性炭+3％蔗糖+0.8％琼脂，培养基pH值调至6.0；1500～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃，形成白色须根。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的越冬芽为箭叶淫羊藿每年秋季至次年初春地下部分形成的分蘖芽。
3.根据权利要求1所述的方法，步骤1)中外植体消毒的步骤具体为：将越冬芽表面刷洗干净，再于流水下冲洗30min～90min，晾干至芽体表面没有水渍，无菌条件下，将晾干的越冬芽置于灭过菌的广口瓶中，用75％的酒精溶液浸泡40s，倒掉酒精，再用0.1％的升汞溶液浸泡消毒10min～20min，消毒期间不断摇晃广口瓶以保证消毒过程的均匀彻底；然后取出芽体置于另一灭过菌的广口瓶中用无菌水清洗6-8遍，得到接种材料。
4.根据权利要求1所述的方法，步骤3)中是先将步骤2)中形成的愈伤组织继代三次后再进行芽的再生培养，继代培养基配方为MS+2.0mg/L BA+4.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH值调至6.0，1500lux～2500lux光照强度下，14h/天的光照进行培养，培养温度24～26℃，20天继代一次。
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