CN102807977A - 一种“顽拗”植物基因组dna的提取技术 - Google Patents
一种“顽拗”植物基因组dna的提取技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102807977A CN102807977A CN 201110148173 CN201110148173A CN102807977A CN 102807977 A CN102807977 A CN 102807977A CN 201110148173 CN201110148173 CN 201110148173 CN 201110148173 A CN201110148173 A CN 201110148173A CN 102807977 A CN102807977 A CN 102807977A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- extracting
- polyphenol
- phenol
- isoamyl alcohol
- genome dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
“顽拗”植物基因组DNA的提取技术，属于生物技术领域。本技术利用洗脱液能成功分离出多糖、多酚等次生代谢物质，解决离心上层液粘稠问题；利用酚；氯仿；异戊醇抽提，再用氯仿；异戊醇抽提，可将蛋白质和酚等抽提干净；防止多酚物质氧化成醌类，避免褐变的发生，成功提取“顽拗”植物高质量基因组DNA。主要应用于细胞内含有大量的多糖、多酚、蹂质以及桂皮醛、桂皮酸等次生代谢物的植物材料基因组DNA提取中。
Description
一、技术领域
本发明专利属于生物技术领域，涉及一种“顽拗”植物基因组DNA提取技术，利用该技术可以明显提高基因组DNA质量，主要应用于细胞内含有大量的多糖、多酚、蹂质以及桂皮醛、桂皮酸等次生代谢物的植物材料基因组DNA提取中。
二、背景技术
由于“顽拗”植物如红楠(Machilus thunbergii Sieb.et Zucc.)、华东楠(Machilus leptophyllaHand.-Mazz.)和龙眼(Dimocarpus longan Lour.)等细胞内含有大量的多糖、多酚、蹂质以及桂皮醛、桂皮酸等次生代谢物，不仅能干扰DNA的提取过程，而且使提取的DNA溶液粘稠，样品呈棕褐色，进而不能用作分子生物分析和研究的PCR模板，分子生物学家称其为“顽拗”植物。
目前国内外也已经开展了部分“顽拗”植物基因组DNA提取技术的研究，成功提取了如龙眼、荔枝(Litchi chinensis)和西南桦(Betula alnoides Buch Ham.)等植物的基因组DNA。因为幼叶多糖、多酚等次生代谢物较少，基因组DNA提取较为容易，所以以往研究中所用植物材料多为幼叶，较少利用成熟叶片和硅胶干燥叶片。为了能从“顽拗”植物不同组织材料中提取高质量的基因组DNA，本发明专利以红楠为例，利用红楠幼叶、成熟叶和硅胶干燥叶片，成功提取了红楠高质量基因组DNA，满足了分子生物学试验的需求。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种“顽拗”植物基因组DNA提取技术，方法简单，效果明显，能成功提取不同植物组织材料的基因组DNA。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：由于红楠含有大量的多糖、鞣质、多酚等次生代谢物，在提取过程中经裂解液处理后，细胞破碎，次生代谢物被释放出来，使提取液变得异常粘稠，难以操作，导致提取的DNA质量差，溶解困难。在本发明中用洗脱缓冲液进行洗脱，同时在65℃水浴核裂解后加入7.5M醋酸铵溶液会在很大程度上解决粘稠问题；先用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，将蛋白质和酚抽提干净；由于次生代谢物的存在，常规方法提取会使这些物质与DNA发生不可逆的结合使DNA呈褐色、粘稠，影响DNA质量，因此不能用于PCR扩增和酶切等分子生物学研究。加入PVP(多酚络合物)和β-巯基乙醇(抗氧化剂)能够防止多酚物质氧化成醌类，避免褐变的发生。经过多次试验发现，β-巯基乙醇和PVP现用现配效果最好。
本发明基因组DNA提取技术与传统方法相比，具有显著的特点：
1.利用洗脱液进行洗脱，能成功分离出多糖、多酚等次生代谢物质，解决离心上层液粘稠问题；
2.同时加入PVP和β-巯基乙醇能够防止多酚物质氧化成醌类，避免褐变的发生。
四、附图说明
五、具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明：
1 溶液配制
洗脱缓冲液：100mM Tris-HCI，pH 8.0；1.4M NaCl；20mM EDTA，PH＝8.0；2％β-琉基乙醇(V/V)；2％PVP(W/V)(聚乙烯毗咯烷酮K-40)；β一琉基乙醇和PVP在使用前加入；
2×CTAB提取缓冲液：洗脱缓冲液中加入2％的CTAB(W/V)；
其他试剂参考常规配制方法。
2 提取过程
2.1将0.1g左右撕碎的新鲜叶片或0.05g左右的硅胶干燥叶片放入玛瑙研钵中，加少量石英砂，再倒入少许液氮，待液氮快挥发完时迅速用力研磨，并将磨碎的叶片加入到事先装有1mL洗脱缓冲液的离心管中，颠倒混匀并冰浴5min；
2.2将离心管在高速离心机(12000转/分钟)离心15min，并弃去上清液；
2.3加入800μL预热至65℃的提取缓冲液(2×CTA B)于黄口塑料试管中，并把塑料试管置于65℃的水浴锅中1h，期间每过15min试管颠倒摇动一次；
2.4加入150μL 7.5M醋酸铵溶液，混匀，并冰浴30min；
2.5试管于高速离心机(12000转/分钟)离心15min，用移液器吸取700μL上清液至新的离心管中，并加入等体积(700μL)的酚-氯仿-异戊醇混合试剂(体积比25∶24∶1)，混匀，12000转/分钟离心15min；用移液器吸取700μL上清夜转移至新的离心管中(1.5mL)；
2.6加入等体积(700μL)氯仿-异戊醇混合试剂，摇匀，12000转/分钟离心15min，用移液器吸取500μL上清液再次转移至新的离心管中；
2.7加入200μL 5M的氯化钠溶液和600μL(-20℃)预冷的无水乙醇，轻轻混匀，离心管放置于低温冰箱(-20℃以下)1小时以上或者过夜；
2.812000转/分钟离心15min；
2.9弃去上清液，加入500μL 70％乙醇溶液，12000转/分钟离心5min，清晰看到DNA沉淀；
2.10重复步骤2.9一次，再用冰冻的无水乙醇洗一次；
2.11将离心管放在无菌操作台风干约30min；
2.12加入80μL 1×TE，轻轻摇动离心管以溶解DNA沉淀，溶液置于-20℃冰箱中保存。
Claims (5)
1.“顽拗”植物基因组DNA技术，其特征是：用洗脱缓冲液进行洗脱，同时在65℃水浴核裂解后加入7.5M醋酸铵溶液会在很大程度上解决粘稠问题；先用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，将蛋白质和酚抽提干净；同时加入PVP(多酚络合物)和β-巯基乙醇能够防止多酚物质氧化成醌类，避免褐变的发生。β-巯基乙醇和PVP现用现配效果好。
2.根据权利要求1所述的植物基因组DNA提取技术，其特征是：洗脱缓冲液的配制，主要包括100mM Tris-HCI，pH 8.0；1.4M NaCl；20mM EDTA，PH＝8.0；2％β-琉基乙醇(V/V)；2％PVP(W/V)(聚乙烯毗咯烷酮K-40)。
3.根据权利要求1所述的植物基因组DNA提取技术，其特征是：用洗脱缓冲液进行洗脱，同时在65℃水浴核裂解后加入150ul 7.5M醋酸铵溶液会在很大程度上解决粘稠问题。
4.根据权利要求1所述的植物基因组DNA提取技术，其特征是：利用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，将蛋白质和酚抽提干净。
5.根据权利要求1所述的植物基因组DNA提取技术，其特征是：同时加入PVP(多酚络合物)和β-巯基乙醇能够防止多酚物质氧化成醌类，避免褐变的发生。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110148173 CN102807977A (zh) | 2011-05-31 | 2011-05-31 | 一种“顽拗”植物基因组dna的提取技术 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110148173 CN102807977A (zh) | 2011-05-31 | 2011-05-31 | 一种“顽拗”植物基因组dna的提取技术 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102807977A true CN102807977A (zh) | 2012-12-05 |
Family
ID=47231848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110148173 Pending CN102807977A (zh) | 2011-05-31 | 2011-05-31 | 一种“顽拗”植物基因组dna的提取技术 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102807977A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103966201A (zh) * | 2014-05-15 | 2014-08-06 | 中国科学院武汉植物园 | 基于样品高效保鲜的提取水生植物dna的方法 |
| CN104450681A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-03-25 | 丽水市农业科学研究院 | 一种三叶青基因组dna提取纯化的方法 |
| CN107326023A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-11-07 | 河南科技大学 | 一种常绿木本植物基因组dna的提取试剂盒及提取方法 |
| CN111961662A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-11-20 | 江西农业大学 | 一种dna提取液以及芝麻叶片基因组dna的提取方法 |
| CN114015681A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-08 | 深圳市人民医院 | 一种改进的多糖多酚植物ctab的提取方法 |
-
2011
- 2011-05-31 CN CN 201110148173 patent/CN102807977A/zh active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103966201A (zh) * | 2014-05-15 | 2014-08-06 | 中国科学院武汉植物园 | 基于样品高效保鲜的提取水生植物dna的方法 |
| CN104450681A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-03-25 | 丽水市农业科学研究院 | 一种三叶青基因组dna提取纯化的方法 |
| CN107326023A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-11-07 | 河南科技大学 | 一种常绿木本植物基因组dna的提取试剂盒及提取方法 |
| CN107326023B (zh) * | 2017-07-14 | 2020-10-09 | 河南科技大学 | 一种常绿木本植物基因组dna的提取试剂盒及提取方法 |
| CN111961662A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-11-20 | 江西农业大学 | 一种dna提取液以及芝麻叶片基因组dna的提取方法 |
| CN111961662B (zh) * | 2020-08-31 | 2021-11-02 | 江西农业大学 | 一种dna提取液以及芝麻叶片基因组dna的提取方法 |
| CN114015681A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-08 | 深圳市人民医院 | 一种改进的多糖多酚植物ctab的提取方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Three-liquid-phase extraction of diosgenin and steroidal saponins from fermentation of Dioscorea zingibernsis CH Wright | |
| CN102807977A (zh) | 一种“顽拗”植物基因组dna的提取技术 | |
| CN102942635B (zh) | 一种高细胞凋亡诱导活性枸杞多糖的提取方法 | |
| CN105802957B (zh) | 一种从煤层水样中提取微生物总dna的方法 | |
| CN102286467B (zh) | 一种提取森林土壤和凋落物中微生物总rna的方法 | |
| CN102533737B (zh) | 一种利用硅胶膜从多糖多酚植物中提取总核糖核酸的方法 | |
| CN108410863B (zh) | 一种番石榴叶片基因组dna的高效提取方法 | |
| CN104356184B (zh) | 一种异丙醇-盐双水相体系分离纯化栀子苷的方法 | |
| CN103289991B (zh) | 植物种子dna快速提取试剂盒及其应用 | |
| CN104531679A (zh) | 从干燥杏叶片中提取dna的方法 | |
| CN105441462A (zh) | 一种三七转录因子基因PnERF1及其应用 | |
| Yan et al. | New ionic liquid-based preparative method for diosgenin from Rhizoma dioscoreae nipponicae | |
| Shao et al. | Protective effect of compound K on diabetic rats | |
| CN102093374A (zh) | 一种高效提取喜树碱衍生物的方法 | |
| CN103610762B (zh) | 一种塞北紫堇总生物碱提取物及其提取方法 | |
| CN105130930A (zh) | 一种牛卵母细胞体外成熟培养液及培养方法 | |
| CN102977172A (zh) | 一种提取虫草素的方法 | |
| CN103055048A (zh) | 一种从蔓荆子中提取总黄酮的方法 | |
| CN103333902B (zh) | 一种提高橡胶草花青素含量的方法 | |
| CN106213508A (zh) | 一种人参皂苷的提取方法 | |
| CN107141198B (zh) | 一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法 | |
| CN111039950B (zh) | 一种生物碱化合物及其制备方法和用途 | |
| CN106109668B (zh) | 荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法 | |
| CN103408616A (zh) | 一种鸦胆子苷a的制备方法 | |
| CN103623066B (zh) | 一种用于制备抗癌药物的塞北紫堇总生物碱提取物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121205 |