CN103289991B - 植物种子dna快速提取试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物种子DNA快速提取试剂盒及其应用，该试剂盒的组成包括：CTAB裂解液，硅基质膜DNA吸附柱，RNA酶，过柱缓冲液，漂洗液1，漂洗液2和洗脱缓冲液；其中，所述过柱缓冲液的成分包括：2.5-7.0M盐酸胍，0.05M Tris-HCl，0.01M EDTA；pH值为4.0-7.0。本发明进一步公开了该试剂盒在快速提取高质量植物种子DNA中的应用。本发明试剂盒能够有效提高植物种子DNA提取的得率和纯度，所提取的DNA完整性好、纯度高、得率高，在降低DNA提取成本的同时，有效提高了植物种子基因组DNA的提取质量和效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA提取试剂盒，尤其涉及植物种子DNA的快速提取试剂盒及其应用，属于植物种子DNA的提取领域。
背景技术
在分子生物学研究中，高质量的DNA的提取是其下游生物学应用的关键。随着分子生物学的发展，多种植物材料的DNA的提取方法已建立，包括：CTAB法、SDS法、PVP法、尿素法或高盐低pH法等。不同植物材料中，蛋白质、多糖、酚类物质的含量差别较大，分离或提纯获得高质量的DNA存在一定的难度。针对不同植物材料的细胞壁和细胞内容物存在的差异，采用适宜的植物DNA的提取方法，才能保证DNA的提取质量。
植物种子中通常含有大量的多糖、蛋白质或脂类物质（黄小丹，张云贵，应铁进.高质量植物基因组的提取［J］.植物生理学通讯，2006,42（2）：311-314），有效去除这些物质是DNA分离过程中最重要也是最难的环节之一。
目前，对植物种子DNA大多采取液氮研磨后用CTAB法、SDS法或高盐低pH法等提取基因组DNA。但是这些提取方法大多存在DNA的得率较低、杂质较多（含有较多的蛋白质、脂类物质、多糖等杂质）的缺陷，有待改进。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种植物种子DNA快速提取试剂盒。
本发明的目的之二是将所述的植物种子DNA快速提取试剂盒应用于提取植物种子DNA。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种植物种子DNA快速提取试剂盒，包括：CTAB裂解液，硅基质膜DNA吸附柱，RNA酶，过柱缓冲液，漂洗液1，漂洗液2和洗脱缓冲液；其中，所述过柱缓冲液的成分包括：2.5-7.0M盐酸胍，0.05M Tris-HCl，0.01M EDTA；其中pH值为4.0-7.0。
本发明通过大量的实验发现，采用硅基质膜DNA吸附柱对DNA粗提液 进行纯化时，虽然能够有效提高DNA的纯度，但是DNA的得率较低，其产量难以满足后续的分子生物学实验需要。
本发明发现，过柱缓冲液中盐酸胍的浓度以及pH值高低对于DNA的得率乃至纯度有非常显著的影响。为了提高DNA的得率和纯度，本发明对过柱缓冲液中盐酸胍的浓度以及pH值进行了优化，以最大限度的改善DNA的得率和纯度。
本发明通过大量的优化实验发现，过柱缓冲液中盐酸胍的浓度在4.0-5.0M的范围内，pH值为5.0-6.0时，不仅具有较高的DNA得率，而且DNA纯度较高；本发明非常惊奇的发现，当盐酸胍的浓度为4.5M，pH值为5.5时，DNA产物的得率相比于其它条件的得率至少高了17个百分点，且DNA产物的纯度也最高；因此，本发明所述的过柱缓冲液中盐酸胍的浓度最优选为4.5M，pH值最优选为5.5。
本发明所述“CTAB裂解液”可以是现有技术中任何一种的CTAB裂解液，包括文献中报道的各种改进的CTAB裂解液；作为参考，所述的“CTAB裂解液”的成分包括：1.4M NaCl，2%CTAB，0.1M Tris-HCl pH8.0，0.02M EDTA。
本发明所述“漂洗液1”或“漂洗液1”可以是现有技术中任何一种用于漂洗硅基质膜DNA吸附柱的漂洗液；优选的，所述“漂洗液1”的成分包括：3M NaAC pH5.2，无水乙醇；其中，NaAc和无水乙醇的体积比为3:7；所述“漂洗液2”的成份成分包括：0.1M Tris-HCl pH7.0，无水乙醇；其中，Tris-HCl和无水乙醇的体积比为3:7。
本发明所述的洗脱缓冲液可以为TE缓冲液或去离子水。
本发明的另一目的是将所植物种子DNA快速提取试剂盒应用于快速提取植物材料DNA，包括：
（1）将植物材料研磨成粉后加入CTAB裂解液和RNA酶进行抽提，得到DNA粗提液；
（2）将DNA粗提液与过柱缓冲液混合，得到混合液；
（3）将混合液上硅基质膜DNA吸附柱，离心；分别用漂洗液1和漂洗液2漂洗吸附柱；
（4）用洗脱缓冲液洗脱吸附柱，收集洗脱液，即得。
其中，所述的植物材料是作物种子；优选为棉花、水稻、玉米或大豆的 种子。
作为参考，本发明试剂盒的组成可参照表1的成分及用量进行组装。
表1试剂盒的组成和用量
本发明试剂盒中所用的各种原料或材料都可以从生物试剂公司购买得到。
本发明DNA快速提取试剂盒能够有效提高植物种子DNA提取的得率和纯度，所提取的DNA完整性好，纯度高，得率高。本发明试剂盒较之传统的CTAB法，样品用量小且采集不受季节限制，省去了液氮研磨步骤、减少了植物基因组DNA的损失；本发明大大提高植物种子基因组DNA的提取效率，降低了植物种子基因组DNA提取的成本，有效降低植物基因组的分子生物学研究成本。
附图说明
图1采用本发明方法提取的植物种子基因组DNA的0.8%琼脂糖电泳图；其中1、M；2-4、玉米；5-7、水稻；8-10、棉花；11-13、大豆。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例1过柱缓冲液的pH值优化实验
1、实验材料
1.1植物种子：棉花种子、水稻种子、玉米种子、大豆种子。
1.2提取试剂：CTAB裂解液：1.4M NaCl，2%CTAB，0.1M Tris-HCl pH8.0，0.02M EDTA；
过柱缓冲液：配制7种过柱缓冲液，7种过柱缓冲液的组成成分相同：5M盐酸胍，0.05M Tris-HCl，0.01M EDTA；7种过柱缓冲液的pH值分别为4.0，4.5,5.0,5.5,6.0,6.5，7.0。
漂洗液1：3M NaAc pH5.2，无水乙醇；其中，NaAc和无水乙醇的体积比为3:7；
漂洗液2：0.1M Tris-HCl pH7.0，无水乙醇；其中，Tris-HCl和无水乙醇的体积比为3:7；
洗脱缓冲液：TE缓冲液。
硅基质膜DNA吸附柱（购买于明日百傲（北京）科技有限公司）；
2、实验方法
（1）分别称取玉米、水稻、棉花种子粉末各100mg，大豆种子粉末50mg。将植物种子粉末加入2.0ml离心管中，加入700μL65℃预热的裂解液、10μL10mg/mL的RNA酶，65℃水浴30min，期间上下颠倒几次。
（2）加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），上下颠倒充分混匀。
（3）12000rpm离心10min,取上清于新的2.0ml离心管中加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），上下颠倒充分混匀。
（4）12000rp离心10min,取上清于新的2.0ml离心管中。
（5）加入等体积的过柱缓冲液，充分混匀。
（6）取700μL混合液加入到硅基质膜DNA吸附柱中静置2分钟，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液。（可以分次加入离心）
（7）取300μL漂洗液1加入到硅基质膜DNA吸附柱中，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液，将吸附柱放入套管中。
（8）取700μL漂洗液2加入到硅基质膜DNA吸附柱中，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液，将吸附柱放入套管中。
（9）取500μL漂洗液2加入到硅基质膜DNA吸附柱中，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液，将吸附柱放入套管中。
（10）12000rpm离心2min。将硅基质膜DNA吸附柱放于一新的1.5ml离心管中，室温静置直至干燥。
（11）向吸附柱中央加入50-200μL洗脱缓冲液TE或去离子水,室温放置 5min，12000rpm离心2min。为增加基因组DNA的得率，可将所得的DNA溶液再加入到吸附柱中央，室温放置5min，12000rpm离心2min。稀释4倍后，测其OD值并按照以下公式计算DNA浓度和得率：
DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×稀释倍数
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）。
3、实验结果
实验结果见表2-5。
表2过柱缓冲液不同pH值下玉米种子的DNA得率
注：DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×4
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）
表3过柱缓冲液不同pH值下水稻种子的DNA得率
注：DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×1
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）
表4过柱缓冲液不同pH值下棉花种子的DNA得率
注：DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×4
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）
表5过柱缓冲液不同pH值下大豆种子的DNA得率
注：DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×4
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）
从表2-5的实验数据可见，过柱缓冲液pH值为5.0-6.0时，DNA得率较高、质量较好，其中，当过柱缓冲液pH值为5.5时,DNA得率不仅远远高于其它pH的得率（p＜0.05），而且DNA的纯度也最高。因此，为了达到更好的效果，过柱缓冲液pH值优选为5.5。
实验例2过柱缓冲液中盐酸胍浓度的优化实验
1、实验材料
1.1植物种子：棉花种子、水稻种子、玉米种子、大豆种子。
1.2提取试剂：
CTAB裂解液：1.4M NaCl，2%CTAB，0.1M Tris-HCl pH8.0，0.02M EDTA；
过柱缓冲液：配制了10种过柱缓冲液，10种过柱缓冲液除了盐酸胍的浓度不同外，其余组成成分均相同，即：0.05M Tris-HCl，0.01M EDTA；过柱缓冲液的pH值为5.5。10种过柱缓冲液的盐酸胍的浓度分别为2.5M，3.0M，3.5M，4.0M，4.5M，5.0M，5.5M，6.0M，6.5M，7.0M；
漂洗液1：3M NaAc pH5.2，无水乙醇；其中，NaAc和无水乙醇的体积比为3:7；
漂洗液2：0.1M Tris-HCl pH7.0，无水乙醇；其中，Tris-HCl和无水乙醇的体积比为3:7；
洗脱缓冲液：TE缓冲液。
硅基质膜DNA吸附柱（购自明日百傲（北京）科技有限公司）；
2、实验方法
（1）分别称取玉米、水稻、棉花种子粉末各100mg，大豆种子粉末50mg。将植物种子粉末加入2.0ml离心管中，加入700μL65℃预热的裂解液、10μL10mg/mL的RNA酶，65℃水浴30min，期间上下颠倒几次。期间上下颠倒几次。
（2）加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），上下颠倒充分混匀。
（3）12000rpm离心10min,取上清于新的2.0ml离心管中加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），上下颠倒充分混匀。
（4）12000rp离心10min,取上清于新的2.0ml离心管中。
（5）加入等体积的过柱缓冲液，充分混匀。
（6）取700μL混合液加入到硅基质膜DNA吸附柱中静置2分钟，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液。（可以分次加入离心）
（7）取300μL漂洗液1加入到硅基质膜DNA吸附柱中，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液，将吸附柱放入套管中。
（8）取700μL漂洗液2加入到硅基质膜DNA吸附柱中，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液，将吸附柱放入套管中。
（9）取500μL漂洗液2加入到硅基质膜DNA吸附柱中，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液，将吸附柱放入套管中。
（10）12000rpm离心2min。将硅基质膜DNA吸附柱放于一新的1.5ml离心管中，室温静置直至干燥。
（11）向吸附柱中央加入50-200μL洗脱缓冲液TE或去离子水,室温放置5min，12000rpm离心2min。为增加基因组DNA的得率，可将所得的DNA溶液再加入到吸附柱中央，室温放置5min，12000rpm离心2min。稀释4倍后，测其OD值并按照以下公式计算DNA浓度和得率：
DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×稀释倍数
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）。
3、实验结果
实验结果见表6-9。
表6过柱缓冲液不同盐酸胍浓度下玉米种子的DNA得率
注：DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×4
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）
表7过柱缓冲液不同盐酸胍浓度下水稻种子的DNA得率
注：DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×1
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）
表8过柱缓冲液不同盐酸胍浓度下棉花种子的DNA得率
注：DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×4
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）
表9过柱缓冲液不同盐酸胍浓度下大豆种子的DNA得率
注：DNA（ng/μl）浓度=A260×50μg/ml×4
DNA（ng/mg）得率=DNA量（ng）/取材量（mg）
试验结果表明，过柱缓冲液的pH值为5.5时,盐酸胍浓度为4.0-5.0M时,DNA得率较高、质量较好，其中，当盐酸胍浓度4.5M时，相比其它盐酸胍浓度，DNA得率最高（p＜0.05），高出其它浓度至少17个百分点，且DNA的质量也最好。
实验例3本发明试剂盒提取植物种子DNA的应用实验
1、实验材料
1.1植物种子：棉花种子、水稻种子、玉米种子、大豆种子。
1.2提取试剂：
CTAB裂解液：1.4M NaCl，2%CTAB，0.1M Tris-HCl pH8.0，0.02M EDTA；
过柱缓冲液：4.5M盐酸胍，0.05M Tris-HCl，0.01M EDTA；过柱缓冲液的pH值为5.5。
漂洗液1：3M NaAC pH5.2，无水乙醇；其中，NaAC和无水乙醇的体积比为3:7；
漂洗液2：0.1M Tris-HCl pH7.0，无水乙醇；其中，Tris-HCl和无水乙醇的体积比为3:7；
洗脱缓冲液：TE缓冲液。
硅基质膜DNA吸附柱（明日百傲（北京）科技有限公司）；
2、实验方法
（1）分别称取玉米、水稻、棉花种子粉末各100mg，大豆种子粉末50mg。植物种子粉末加入2.0ml离心管中，加入700μL65℃预热的裂解液、10μL10mg/mL的RNA酶，65℃水浴30min，期间上下颠倒几次。
（2）加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），上下颠倒充分混匀。
（3）12000rpm离心10min,取上清于新的2.0ml离心管中加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），上下颠倒充分混匀。
（4）12000rp离心10min,取上清于新的2.0ml离心管中。
（5）加入等体积的过柱缓冲液，充分混匀。
（6）取700μL混合液加入到硅基质膜DNA吸附柱中静置2分钟，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液。（可以分次加入离心）
（7）取300μL漂洗液1加入到硅基质膜DNA吸附柱中，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液，将吸附柱放入套管中。
（8）取700μL漂洗液2加入到硅基质膜DNA吸附柱中，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液，将吸附柱放入套管中。
（9）取500μL漂洗液2加入到硅基质膜DNA吸附柱中，10000rpm离心30S，倒掉套管中的废液，将吸附柱放入套管中。
（10）12000rpm离心2min。将硅基质膜DNA吸附柱放于一新的1.5ml离心管中，室温静置直至干燥。
（11）向吸附柱中央加入50-200μL洗脱缓冲液TE或去离子水,室温放置5min，12000rpm离心2min。为增加基因组DNA的得率，可将所得的DNA溶液再加入到吸附柱中央，室温放置5min，12000rpm离心2min。
将分离提取的DNA用0.8%琼脂糖进行检测。
3、实验结果
检测结果见图1。从检测结果可见，本发明试剂盒所提取的4种植物种子的DNA无降解、完整性非常好；DNA的产率高、无多糖、蛋白质、脂类物质或酚类物质污染。
Claims (6)
1.一种植物种子DNA快速提取试剂盒，包括：CTAB裂解液，硅基质膜DNA吸附柱，RNA酶，过柱缓冲液，漂洗液1，漂洗液2和洗脱缓冲液；其特征在于：所述过柱缓冲液的成分包括：4.5M盐酸胍，0.05M Tris-HCl，0.01M EDTA；其pH值为5.5；所述漂洗液1的成份包括：3M NaAc pH 5.2，无水乙醇；其中，NaAc和无水乙醇的体积比为3:7；所述漂洗液2的成份包括：0.1M Tris-HCl pH 7.0，无水乙醇；其中，Tris-HCl和无水乙醇的体积比为3:7；所述的洗脱缓冲液为TE缓冲液或去离子水。
2.按照权利要求1所述的植物种子DNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述CTAB裂解液的成分包括：1.4M NaCl，2％CTAB，0.1M Tris-HCl pH8.0，0.02M EDTA。
3.权利要求1或2所述植物种子DNA快速提取试剂盒在提取植物种子DNA中的用途。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于，包括：
(1)用CTAB裂解液抽提植物种子，得到DNA粗提液；
(2)将DNA粗提液与过柱缓冲液混合，得到混合液；
(3)将混合液上硅基质膜DNA吸附柱，离心；分别用漂洗液1和漂洗液2漂洗吸附柱；
(4)用洗脱缓冲液洗脱吸附柱，收集洗脱液，即得。
5.按照权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述的植物种子是作物种子。
6.按照权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的作物种子为棉花、水稻、玉米或大豆的种子。
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