CN104263719B

CN104263719B - 一种适于pcr扩增的燕麦种子dna大量提取及纯化方法

Info

Publication number: CN104263719B
Application number: CN201410031477.6A
Authority: CN
Inventors: 侯雅君; 潘韵; 陈义昆; 唐明辉; 郑文官; 李永新
Original assignee: SHENZHEN SUNSMILE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN SUNSMILE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-01-23
Also published as: CN104263719A

Abstract

本发明公开了一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法，该方法直接从燕麦种子提取DNA，在提取过程中，利用50ml离心管取材提取DNA；并且CTAB提取缓冲液浓度为3%，较常规方法增加了1%；且提取过程中分别用酚‑氯仿（V:V=1:1）溶液和氯仿‑异戊醇（V:V=24:1）溶液各抽提一次；纯化过程中又用氯仿‑异戊醇（V:V=24:1）溶液纯化抽提一次，成功的提取出了高纯度、高质量的燕麦基因组DNA，省去了种子发芽成苗的周期，所提DNA产量和质量完全满足进一步的PCR分析。并将应用该法提取的DNA样品成功地运用于燕麦SSR分子标记，为进一步开展燕麦分子遗传研究奠定基础。

Description

一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法。

背景技术

燕麦（Avena L.）是世界上重要的农作物之一，在世界禾谷类作物中的种植面积和总产量居第六位，有很高的营养、食用、保健和饲用价值。迄今为止，我国作物种质资源库的燕麦资源共三千余份，利用现代分子生物技术对这些材料展开深入研究是目前亟待开展的课题。

随着现代分子生物学技术在农作物研究领域的深入发展，基于PCR的分子标记技术，在种子纯度鉴定、种子转基因检测、种质资源多样性研究等领域得到了广泛应用，如RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP和SNP等。而在PCR检测过程中，样品 DNA的浓度和纯度是检测成功的关键。

燕麦DNA的提取方法主要有SDS和CTAB法和试剂盒法，试剂盒法成本较高，不适宜用来对大量样品鉴定分析，用SDS法只能提取少量的DNA样品，不能满足现代分子生物学研究中大量组织DNA分析的要求，而CTAB法对燕麦DNA提取的效果要好于SDS，因此，在做AFLP、SSR和ISSR等分子标记时，使用大量的CTAB法提取基因组总DNA是很有必要的。虽然DNA提取方法已被很多研究人员进行优化，但大多数取材都针对叶片进行，取材时需要燕麦生长到一定阶段，耗费周期较长。

发明内容

本发明的目的在于针对上述方法存在的缺点，提出一种成本低，周期短，适于PCR扩增的从燕麦种子大量提取DNA的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。该方法省去了种子发芽成苗的周期，且成本低，产量大，效果好，所提DNA产量和质量完全满足进一步的PCR分析，能够应用于燕麦SSR分子标记，为进一步开展燕麦分子遗传研究奠定基础。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取方法，包括以下步骤:

(1) 选取燕麦干种子于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，将粉末放入第一离心管中；

(2) 向第一离心管中加入经65℃预热的提取缓冲液，充分颠倒混匀；

(3) 将第一离心管置于65℃中进行水浴，水浴1.5小时，水浴其间每10min温和的颠倒混匀一次；

(4) 取出第一离心管，加入等体积的酚-氯仿（酚-氯仿溶液中，酚和氯仿的体积比为1:1）溶液，温和颠倒混匀，离心；

(5) 离心结束后用吸管吸取上清液，装入第二离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇（氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1）溶液，充分颠倒混匀，离心；

(6) 离心结束后将上清液移入第三离心管中，加入预冷的异丙醇，轻轻混匀，低温静置；

(7)勾出DNA到第四离心管中，并用70％的乙醇冲洗2～3次；

(8) 用冷冻干燥机干燥DNA至无乙醇味，再加入1×TE 500μl，RNase 3-5μl，37℃水浴1-2h。

步骤(2)中，所述缓冲液成分为3%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、0.1mol/L 的Tris-HCl (pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、0.02 mol/L EDTA(pH8．0)、1% PVP、1% β-巯基乙醇。

步骤(2)中，所述提取缓冲液的加入量为20-22ml。

步骤(2)至步骤(6)中，所用到的离心管均为50ml离心管。

步骤(4) 和步骤(5)中，所述离心参数为6000-8000rpm，离心时间5-10min。

步骤(6)中，所述异丙醇的加入量为上清液体积的0.6-1倍。

一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法，包括以下步骤：

(1) 取出离心管，加入氯仿-异戊醇（氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1），轻轻混匀，12000 rpm，离心5min；

(2)离心结束后，取上清液于第二离心管，加0.1倍体积（相对于上清液体积）3M醋酸钠，混匀后加入2倍体积（相对于上清液体积）预冷的无水乙醇，轻摇混匀，低温静置；

(3) 用移液器吸头勾出DNA至第三离心管，然后用70%的乙醇冲洗2-3次；

(4) 将第三离心管放入冷冻干燥机中，干燥DNA至无乙醇味，依所提DNA的量加入适量的1×TE溶解，使其终浓度为190-210ng/μL。

与现有技术相比，本发明有益效果：

本发明用燕麦种子提取DNA，省去了种子发芽成苗的周期，通过与叶片提取的DNA比较，结果显示，从干种子提取DNA与叶片中提取的片段大小相同，因此从燕麦干种子中提取DNA是可靠的。且本发明应用改良的CTAB法，利用50ml离心管大量提取燕麦种子DNA，大大提高了DNA的产量。一般情况下，PCR反应对模板的质量和纯度要求并不太高，但燕麦干种子中的蛋白质、糖及RNA含量较高，如果大分子等物质去除不完全，则DNA被这些大分子物质包裹，很难溶于TE中，会严重干扰PCR反应。本发明在提取过程中分别用酚-氯仿（V:V=1:1）溶液和氯仿-异戊醇（V:V=24:1）溶液各抽提一次，纯化过程中又用氯仿-异戊醇（V:V=24:1）溶液纯化抽提一次，并用低浓度的醋酸钠沉淀DNA，促进DNA与多糖和其他次生代谢产物的分离，从而使最后获得的DNA比较纯净，达到PCR反应的条件。因此，本发明提供的方法可用于RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP和SNP等以PCR扩增为基础的分子标记。

说明书附图

图1为采用本发明方法提取燕麦种子DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图；

图2为采用本发明方法提取的燕麦种子DNA的SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。

发明内容

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

以燕麦、莜麦、七吨莜麦、大莜麦、小莜麦、玉麦、白玉麦、燕麦、丽江燕麦、乌堵等10个燕麦品种为实验品种，进行适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取，包括以下步骤:

(1) 分别选取这十种燕麦干种子各30粒于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，将粉末放入50ml离心管中；

(2) 向离心管中加入经65℃预热的提取缓冲液22ml（缓冲液成分为3%CTAB、0.1mol/L 的Tris-HCl (pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、0.02 mol/L EDTA(pH8．0)、1% PVP、1%β-巯基乙醇），充分颠倒混匀；

(3) 将离心管置于65℃中水浴1.5小时，其间每10min温和的颠倒混匀一次；

(4) 取出离心管，每管加入等体积的酚-氯仿（酚-氯仿溶液中，酚和氯仿的体积比为1:1）溶液，温和颠倒混匀，8000rpm离心10min；

(5) 离心结束后用吸管吸取上清液，装入另一50ml离心管，每管加入等体积的氯仿-异戊醇（氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1）溶液，充分颠倒混匀，8000rpm离心10min；

(6)离心结束后将上清液移入另一离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，切勿剧烈震荡，-20℃放置30分钟；

(7) 用玻璃钩勾出DNA到1.5ml离心管中，并用70％的乙醇冲洗2～3次；

(8) 用冷冻干燥机干燥DNA至无乙醇味，加入1×TE 500μL和RNase 5μL，37℃水浴1h。

(1) 取出离心管，每管加入500μL的氯仿-异戊醇（氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1），轻轻混匀，12000 rpm，离心5min；

(2)离心结束后，取上清液于另一1.5ml离心管，加0.1倍体积（相对于上清液体积）3M醋酸钠，混匀后加入2倍体积（相对于上清液体积）预冷的无水乙醇，轻摇混匀，-20℃放置30分钟；

(3) 用移液器吸头勾出DNA，然后用70%的乙醇冲洗2-3次；

(4) 将1.5mL离心管放入冷冻干燥机中，干燥DNA至无乙醇味，依所提DNA的量加入适量的1×TE 溶解，使其终浓度为200ng/μL。

DNA质量检测

取部分DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA质量，结果如图1所示。-20℃下保存备用。

SSR扩增反应

采用20 μL反应体系进行PCR扩增，其中，模板DNA(50ng/μL) 1.0 μL，SSR引物(10pmol/μL)1.2 μL，10×PCR buffer(含Mg²⁺ 15 mM) 2.0 μL，dNTP(10 mM each) 0.4 μL，Taq酶(2.5U/μL) 0.4 μL，ddH₂O15.0 μL。SSR反应程序：94℃ 5 min，继之94℃ 30 s→56℃30 s→72℃ 1 min，循环30次，72℃ 7 min，4℃保存（在SSR扩增中，不同引物的退火温度可能不同，设计温度梯度试验，最终决定引物的最佳退火温度）。最后以6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。

结果与分析:

(1) 基因组DNA检测:

经紫外分光光度计检测，提取的DNA的OD260／OD280在1.9-2.1左右。说明提取的DNA纯度较高。

提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1。

(2) PCR扩增效果检测:

采用本发明方法提取的燕麦种子DNA为模板，进行SSR扩增，扩增条带清晰，且10个燕麦品种呈现多态性差异，表明该DNA完全适用于后续PCR分析，结果如图2所示。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法，其特征是，所述提取方法包括以下步骤:

(1)选取燕麦干种子于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，将粉末放入第一离心管中；

(2)向第一离心管中加入经65℃预热的提取缓冲液充分颠倒混匀，提取缓冲液成分为3％CTAB、0.1mol/L pH 8.0的Tris-HCl、1.4mol/L NaCl、0.02mol/L pH8.0的EDTA、1％PVP、1％β-巯基乙醇，提取缓冲液的加入量为20-22ml；

(3)将第一离心管置于65℃中进行水浴，水浴1.5小时，水浴其间每10min温和的颠倒混匀一次；

(4)取出第一离心管，加入等体积的酚-氯仿溶液，酚-氯仿溶液中，酚和氯仿的体积比为1:1，温和颠倒混匀，离心；

(5)离心结束后用吸管吸取上清液，装入第二离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇溶液，氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，充分颠倒混匀，离心；

(6)离心结束后将上清液移入第三离心管中，加入预冷的异丙醇，异丙醇的加入量为上清液体积的0.6-1倍，轻轻混匀，低温静置；

(7)勾出DNA到第四离心管中，并用70％的乙醇冲洗2～3次；

(8)用冷冻干燥机干燥DNA至无乙醇味，再加入1×TE 500μl，RNase 3-5μl，37℃水浴1-2h；

其中，步骤(2)至步骤(6)中，所用到的第一离心管、第二离心管及第三离心管均为50ml离心管；步骤(4)和步骤(5)中的离心条件为6000-8000rpm，离心时间为5-10min；

所述纯化方法包括以下步骤：

(1)取出提取过程中步骤(8)中提取到DNA的第四离心管，加入氯仿-异戊醇，氯仿-异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，轻轻混匀，12000rpm条件下离心5min；

(2)离心结束后，取上清液于第二支离心管，加相对于上清液0.1倍体积的3M醋酸钠，混匀后加入相对于上清液2倍体积的预冷无水乙醇，轻摇混匀，低温静置；

(3)用移液器吸头勾出DNA至第三支离心管，然后用70％的乙醇冲洗2-3次；

(4)将第三支离心管放入冷冻干燥机中，干燥DNA至无乙醇味，依所提DNA的量加入适量的1×TE溶解，使其终浓度为190-210ng/μL。