CN111100861A - 一种植物dna的快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物DNA的快速提取方法，包括以下步骤：步骤1：将新鲜植物组织研磨成匀浆；步骤2：向匀浆中加入改良裂解液，离心，获取上清液；所述改良裂解液包含以下组分：Tris‑HCl、NaCl溶液、EDTA溶液、PVP、改性活性炭；步骤3：向上清液中加入95％乙醇溶液，离心获取沉淀；步骤4：用75％乙醇溶液进行洗涤沉淀，得到纯品DNA。本发明方法简单易实施，为使用高毒化学试剂，有利于试验人员的身心健康，更重要的是，通过裂解液的改良，可以明显的提高植物DNA的提取质量和纯度，实用性比较强。
Description
技术领域
本发明涉及基因提取技术领域，特别是涉及一种植物DNA快速提取方法。
背景技术
DNA提取是分子生物学试验最基础的试验，也是进行后期基因研究最重要的保证。目前，进行DNA提取常用的方法有CTAB法、试剂盒法、SDS法，但是这些方法在进行植物基因提取的过程中存在步骤多、操作繁琐、操作时间长、使用高毒有害试剂等缺点。而只有提取高质量、高纯度的DNA才能对于限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、遗传多态性分析、基因组学等分子生物学研究打下良好基础。
植物细胞含有细胞壁，含有较多的多糖、多酚等次生代谢产物，并且不同的植物细胞中含有的次生代谢产物的种类及含量差异较大，DNA含量相对较小，会导致在提取过程中一些其他杂质类的物质与DNA粘附或者在繁琐提取过程中导致DNA片段的丢失，进而影响DNA的提取质量和纯度。而如何在现有的提取方法上进行改进，得到一种高效、快捷、毒性低的提取高质量DNA的方法对于解决现有技术问题极为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物DNA的快速提取方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法通过在常规的裂解液的基础上添加适量的PVP以及改良活性碳，可以提高植物匀浆和多糖和多酚物质的溶解性，并将其进行沉淀去除，实现了提取高质量、高纯度的DNA的目的。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种植物DNA的快速提取方法，包括以下步骤：
步骤1：将新鲜植物组织研磨成匀浆；
步骤2：向匀浆中加入改良裂解液，离心，获取上清液；所述改良裂解液包含以下组分：Tris-HCl、NaCl溶液、EDTA溶液、PVP以及改性活性炭；
步骤3：向上清液中加入95％乙醇溶液，离心获取沉淀；
步骤4：用75％乙醇溶液进行洗涤沉淀，得到纯品DNA。
优选的是，步骤1中在液氮环境中进行研磨。
优选的是，步骤2中，Tris-HCl 100moL/L pH8.0，NaCl溶液0.5moL/L，EDTA溶液20moL/L，PVP 0.5％以及改性活性炭0.5-1％。
优选的是，步骤2中所述改良裂解液加入所述匀浆前，先在40-50℃条件下预热15-20min。
优选的是，步骤2中离心方式为：先在20℃、2000-4000rpm离心2-3min，再于20℃、6000-8000rpm离心15-20min。
优选的是，步骤2中匀浆和所述改良裂解液按质量体积比1:15-20混合。
优选的是，所述改性活性碳是由以下方法制备：将活性炭和硝酸溶液按质量体积比1：3-4混合，回流4-5h，再用水洗涤，置于烘箱中干燥得到改性活性炭。
优选的是，所述硝酸的体积分数为10％；回流温度为40-50℃；在110℃烘干处理8-10h。
优选的是，步骤3中离心速度为4000-5000rpm，离心时间15-20min。
优选的是，步骤4中75％的乙醇溶液提前预冷至4℃，再洗涤3-5次，置于-20℃保存。
本发明公开了以下有益效果：
本发明公开了一种植物DNA的快速提取方法，运用常规提取DNA的试剂提植物细胞(比如葡萄、柑橘)中的DNA，细胞中含有较多的多糖、多酚物质，在提取过程中会直接影响DNA的提取质量，而本发明通过采用改良的裂解液，在常规试剂的基础上加入了PVP和改良的活性碳，PVP是一种高分子合成树脂，可溶于水，用于络合多糖和多酚物质，既防止了多酚氧化成醌类，使得DNA褐变，还能同时使得络合的多糖、多酚在离心作用下沉淀去除；而经过改良的活性碳，改变了孔道，尤其是中孔有所增加，同时增加了表面的羧基，使得活性炭亲水性提高，更容易在裂解液中分散，并且在分散的同时可以吸附色素、多酚类物质，进一步减少杂质的含量，防止DNA带有颜色影响后期分子生物学试验的使用。
此外，本发明的提取方法中所使用的裂解液以及其他的纯化试剂，避免了常规方法提取DNA过程中大量使用有毒试剂的情况，同时，由于改良试剂的使用改变了常规试验中采用多次抽提进行多糖、多酚的去除过程，减少DNA片段丢失的可能，也减少了繁琐的操作过程，极大的方便了研究人员的实施操作，提高了工作效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1-3提取的DNA的电泳检测图；M为DL5000 DNA；1，实施例1提取的DNA；2，实施例2提取的DNA；3，实施例3提取的DNA；
图2为实施例1与对比例1-4提取的DNA的电泳检测比对结果；M为DL5000 DNA；1，实施例1提取的DNA；2，对比例1提取的DNA；3，对比例2提取的DNA；4，对比例3提取的DNA；5，对比例4提取的DNA。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
一种植物DNA的快速提取方法，包括以下步骤：
步骤1：将新鲜无病虫害、无杂质的葡萄幼叶，在液氮条件下研磨成匀浆；
步骤2：准备改良裂解液：Tris-HCl 100moL/L pH8.0，NaCl溶液0.5moL/L，EDTA溶液20moL/L，PVP 0.5％以及改性活性炭0.5％，将备好的改良裂解液在40℃条件下水浴预热15min，然后将预热的改良裂解液：葡萄匀浆按体积质量比为15:1混合，置于离心机中设置温度20℃、转速2000rpm，离心2min，调整转速为6000rpm，离心15min，弃沉淀取上清液；
其中，改性活性炭的制备方法为：将改性活性炭和硝酸溶液按质量体积比1：3混合，40℃回流4h，再用水洗涤，置于110℃烘箱中干燥8h，得到改性活性炭；
步骤3：向上清液中按体积比1:1加入95％乙醇溶液，4000rpm离心15min，获取沉淀；
步骤4：将75％的乙醇溶液提前预冷至4℃，再洗涤3次，得到纯品DNA，所述DNA置于-20℃保存。
实施例2
一种植物DNA的快速提取方法，包括以下步骤：
步骤1：将将新鲜无病虫害、无杂质的柑橘幼叶，在液氮条件下研磨成匀浆；
步骤2：准备改良裂解液：Tris-HCl 100moL/L pH8.0，NaCl溶液0.5moL/L，EDTA溶液20moL/L，PVP 0.5％以及改性活性炭0.8％，将备好的改良裂解液在45℃条件下水浴预热18min，然后将预热的改良裂解液：葡萄匀浆按体积质量比为18:1混合，置于离心机中设置温度20℃、转速3000rpm，离心3min，调整转速为7000rpm，离心20min，弃沉淀取上清液；
其中，改性活性炭的制备方法为：将改性活性炭和硝酸溶液按质量体积比1：3.5混合，45℃回流4.5h，再用水洗涤，置于110℃烘箱中干燥9h，得到改性活性炭。
步骤3：向上清液中按体积比1:1.5加入95％乙醇溶液，5000rpm离心20min，获取沉淀；
步骤4：将75％的乙醇溶液提前预冷至4℃，再洗涤4次，得到纯品DNA，所述DNA置于-20℃保存。
实施例3
一种植物DNA的快速提取方法，包括以下步骤：
步骤1：将新鲜无病虫害、无杂质的樱桃幼叶，在液氮条件下研磨成匀浆；
步骤2：准备改良裂解液：Tris-HCl 100moL/L pH8.0，NaCl溶液0.5moL/L，EDTA溶液20moL/L，PVP 0.5％以及改性活性炭1％，将备好的改良裂解液在50℃条件下水浴预热20min，然后将预热的改良裂解液：葡萄匀浆按体积质量比为20:1混合，置于离心机中设置温度20℃、转速4000rpm，离心3min，调整转速为8000rpm，离心20min，弃沉淀取上清液；
其中，改性活性炭的制备方法为：将改性活性炭和硝酸溶液按质量体积比1：4混合，50℃回流5h，再用水洗涤，置于110℃烘箱中干燥10h，得到改性活性炭。
步骤3：向上清液中按体积比1:2加入95％乙醇溶液，5000rpm离心20min，获取沉淀；
步骤4：将75％的乙醇溶液提前预冷至4℃，再洗涤5次，得到纯品DNA，所述DNA置于-20℃保存。
对比例1
与实施例1的区别在于，不添加PVP，其他步骤相同。
对比例2
与实施例1的区别在于，不添加改性活性碳，其他步骤相同。
对比例3
与实施例1的区别在于，不添加PVP和改性活性炭，其他步骤相同。
对比例4
与实施例1的区别在于，将改性活性碳替换成活性炭，其他步骤相同。
对于上述实施例1-3以及对比例1-4提取的植物DNA进行PCR检测。根据GenBank设计叶绿体成熟酶K基因序列的引物F：5’-CGATCAATTCATTCAATATTTG-3’；R：5’-CAAGATCGTGTTCTTTCAGC-3’；
扩增体系：10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP(10mmol/L)0.5μL、模板DNA 10ng、引物各1μL、Taq酶0.1μL，加水补充至20μL；
扩增程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环，4℃保存。
扩增后的DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。如图1所示，成功扩增之后的DNA，经电泳检测发现，实施例1-3采用改良裂解液提取的DNA，条带清晰、无拖尾，说明该裂解液可以很好的去除多糖和多酚物质，提高DNA提取的质量和纯度。
如图2所示，采用相同的植物(葡萄)提取DNA，发现不添加PVP或改性活性炭的裂解液，明显出现了杂质的拖尾条带，并且DNA条带暗，说明提取量及纯度都比较低，含有大量的杂质，受到多糖、多酚等杂质次生代谢产物的影响；而如果同时不添加PVP和改性活性炭，杂质条带明显较宽，并且拖尾严重，说明PVP和改性活性炭对于去除多糖、多酚等次生代谢产物具有重要的作用；此外，采用未改性的活性炭替换改性活性炭，虽然比单独使用PVP、改性活性炭中杂质条带较窄，出现的量相对较少，但是也存在目的DNA条带暗，明显拖尾的现象。以上结论充分，证明本发明只有同时在常规裂解液中加入PVP以及改性活性炭，才能出现清晰、整齐、无降解、完整性好、无多糖、多酚等次生代谢产物杂质污染的DNA条带，可以明显的实现提高植物DNA提取质量和纯度。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种植物DNA的快速提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将新鲜植物组织研磨成匀浆；
步骤2：向匀浆中加入改良裂解液，离心，获取上清液；所述改良裂解液包含以下组分：Tris-HCl、NaCl溶液、EDTA溶液、PVP以及改性活性炭；
步骤3：向上清液中加入95％乙醇溶液，离心获取沉淀；
步骤4：用75％乙醇溶液进行洗涤沉淀，得到纯品DNA。
2.如权利要求1所述的植物DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤1中在液氮环境中进行研磨。
3.如权利要求1所述的植物DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤2中，Tris-HCl100moL/L pH8.0，NaCl溶液0.5moL/L，EDTA溶液20moL/L，PVP 0.5％以及改性活性炭0.5-1％。
4.如权利要求1所述的植物DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤2中所述改良裂解液加入所述匀浆前，先在40-50℃条件下预热15-20min。
5.如权利要求1所述的植物DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤2中离心方式为：先在20℃、2000-4000rpm离心2-3min，再于20℃、6000-8000rpm离心15-20min。
6.如权利要求1所述的植物DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤2中匀浆和所述改良裂解液按质量体积比1:15-20混合。
7.如权利要求1所述的植物DNA的快速提取方法，其特征在于，所述改性活性碳是由以下方法制备：将活性炭和硝酸溶液按质量体积比1：3-4混合，回流4-5h，再用水洗涤，置于烘箱中干燥得到改性活性炭。
8.如权利要求1所述的植物DNA的快速提取方法，其特征在于，所述硝酸的体积分数为10％；回流温度为40-50℃；在110℃烘干处理8-10h。
9.如权利要求1所述的植物DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤3中离心速度为4000-5000rpm，离心时间15-20min。
10.如权利要求1所述的植物DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤4中75％的乙醇溶液提前预冷至4℃，再洗涤3-5次，置于-20℃保存。
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