CN111876467A - 病毒保存液、试剂盒以及病毒rna的超灵敏检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒保存液、用于病毒RNA提取的试剂盒以及病毒RNA的超灵敏检测方法。本发明采用含胍盐的溶液保存病毒样本，可以很好地长时间对病毒RNA进行保存，提高了样本中的病毒RNA提取效率。本发明提供的检测方法可以实现病毒RNA的超灵敏检测，对于病毒在人群中的大规模筛查具有重大意义。

Description

病毒保存液、试剂盒以及病毒RNA的超灵敏检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种病毒保存液、试剂盒以及病毒RNA的超灵敏检测方法。
背景技术
病毒RNA容易降解，无法长时间存活。病毒采样后由于不能及时检测，需要对病毒RNA进行处理，就需要放入病毒保存液中进行保存。不然病毒核酸会很快降解就无法检测到核酸了，所以就需要往采样管里加保存液来让病毒的核酸不要那么快被降解。并保证病毒可以运输和保留。
2020年由于新型冠状病毒疫情的发生，导致大量人员需要做核酸检测。如果一个一个的样本检测需要花费大量的时间及精力，不符合实际要求。因此，往往需要将多个新冠病毒样本混合在一起来做核酸检测，这样可以更快对大量样本进行筛查。
传统用于保存病毒样本的保存液体积大，容易对样本进行过度稀释，导致病毒RNA的含量降低，从而降低检测的灵敏度。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种病毒保存液，所述病毒保存液中含有4～6.5M胍盐，0.5-2％N-月桂酰基肌氨酸以及0.2～1M柠檬酸钠。
本发明提供的病毒保存液保存病毒的温度为-20℃～4℃。
本发明提供的病毒保存液可以将采集到的病毒样本有效保存，且在后续提取过程中可以避免保存液被过多的稀释，提高了病毒RNA的提取效率、检测灵敏度。进一步而言，本发明提供的病毒保存液可以实现对病毒样本的长时间保存，对病毒来源的溯源及相关流行病学研究具有重大的意义。
本发明的第二目的是提供一种用于病毒RNA提取的试剂盒，包含本发明提供的病毒保存液。
作为本发明的优选方案，所述试剂盒中还包括：内含过滤柱的离心管，纳米磁珠，结合缓冲液，清洗缓冲液，50～80％乙醇以及洗脱液。
本发明试剂盒中提供的内含过滤柱的离心管可以过滤掉溶液中的杂质，如灰尘、人体组织等，以提高病毒RNA检测率以及灵敏度。作为一种具体实施方式，所述离心管可以选用RBX离心管。
本发明所述结合缓冲液用于促进病毒RNA和纳米磁珠的结合。所述结合缓冲液中优选包含如下组分：无水乙醇或异丙醇。
本发明所述清洗缓冲液用于将非病毒RNA的杂质清洗掉，以提高产物的纯度。本发明所述清洗缓冲液优选包括清洗缓冲液I和清洗缓冲液II，在使用时，所述清洗缓冲液I和清洗缓冲液II应依次使用。其中，所述清洗缓冲液I包含如下组分：1～2M胍盐，50～80％乙醇；所述清洗缓冲液II包含如下组分：50～80％乙醇。
作为本发明的优选方案，所述试剂盒中包括的病毒保存液与结合缓冲液的体积之比为(3～7)：(2.5～3.5)，如5：3。本发明提供的保存液可以以较低的稀释比例与结合缓冲液混合，以避免病毒RNA的损失，从而提高检测的灵敏度。
作为本发明的优选方案，所述试剂盒中包括的纳米磁珠质量与所述结合缓冲液的体积之比为(1.5mg～4mg)：300ul，优选为2mg：300ul。本发明通过大量实践发现，当纳米磁珠与结合缓冲液的用量比在(1.5mg～4mg)：300ul的范围内时，提取效果最好，其中以2mg：300ul这一特定比例的效果最佳。如果纳米磁珠的用量偏小或者偏大，都会导致提取的RNA效果下降。
作为本发明的优选方案，所述试剂盒中包括的病毒保存液、结合缓冲液以及洗脱液的体积之比为(30～70)：(25～35)：(3～7)。现有技术采用的方法中病毒保存液的用量较低，导致检测灵敏度偏低；本发明提供的试剂盒中采用相对较高的病毒保存液体积，匹配特定比例的结合缓冲液和洗脱液，可以实现病毒RNA的超灵敏检测。
本发明的第三目的是提供所述病毒保存液或所述试剂盒在病毒RNA提取和/或检测中的应用。
作为本发明的优选方案，待提取或检测的病毒样本为人体咽拭子采样所获得的样本。待提取或检测的病毒样本可以是一个单独的样本，也可以是多个样本混合，例如由不超过10组的人体咽拭子采样所获得的样本混合而成。
本发明的第四目的是提供一种病毒RNA的超灵敏检测方法，所述方法利用本发明所述病毒保存液或所述试剂盒进行。
具体而言，所述方法包括如下步骤：将待提取的病毒样本置于所述病毒保存液中保存；对保存的病毒样本进行RNA提取，再进行检测。
作为本发明的优选方案，待提取或检测的病毒样本为人体咽拭子采样所获得的样本。待提取或检测的病毒样本可以是一个单独的样本，也可以是多个样本混合，例如由不超过10组的人体咽拭子采样所获得的样本混合而成。
作为本发明的优选方案，所述方法包括如下步骤：
(1)取保存于所述保存液中的样本溶液，置于内含过滤柱的离心管中离心处理后，取全部滤液；
(2)在步骤(1)所得滤液中加入结合缓冲液，混匀后，加入纳米磁珠；
(3)加热混匀后，用磁铁吸附纳米磁珠，弃上清；
(4)加入清洗缓冲液，混匀后，用磁铁吸附纳米磁珠，弃上清；
(5)加入50～80％乙醇，混匀后，用磁铁吸附纳米磁珠，弃上清；
(6)加入洗脱液，混匀加热后，用磁铁吸附纳米磁珠，将含有病毒RNA的上清液保存备用。
作为本发明的优选方案，所述保存液、结合缓冲液、纳米磁珠和洗脱液的用量比为(300ul～700ul)：(250ul～350ul)：(1.5mg～4mg)：(30ul～70ul)。本发明通过大量实践将上述组分的相对用量优选在上述范围内，可以同时实现快速、高效、准确以及超灵敏的病毒RNA检测。
所述步骤(1)中，当待检测样本为单独的1组人体咽拭子采样所获得的样本时，所述病毒保存液的用量优选为500ul。当待检测样本为多组(不宜超过10组)人体咽拭子采样所获得的样本混合而成时，病毒保存液的用量优选为500ul与样本数的乘积。
所述步骤(1)通过离心过滤可以滤掉溶液中的杂质，以提高病毒RNA检测率。本发明所述离心优选为：以转速5000rpm～13000rpm离心30s～90s。
本发明每使用500ul病毒保存液，优选所述步骤(2)中对应加入300ul结合缓冲液，震荡混匀后，加入纳米磁珠吹打混匀。本发明通过大量实践发现，对于待检测样本为单独的1组人体咽拭子采样所获得的样本而言，当纳米磁珠与结合缓冲液的使用比例在(1.5mg～4mg)：300ul的范围内时，提取效果最好，其中以2mg：300ul这一特定比例的效果最佳。当待检测样本为多组(不宜超过10组)人体咽拭子采样所获得的样本混合而成时，纳米磁珠的用量应略小于上述最佳比例与样本数的乘积，例如取比例范围的下限与样本数的乘积为宜，以避免磁珠用量过多而造成的后续操作不便和提取效率下降。
所述步骤(3)中，加热混匀优选为：在50～60℃加热8～20分钟，期间每隔2～3分钟混匀一次。在上述条件下，可以确保病毒RNA与纳米磁珠充分结合。
所述步骤(4)中，清洗缓冲液清洗可以进行一次或多次，本发明优选采用清洗缓冲液I和清洗缓冲液II依次进行清洗。所述步骤(5)中，对采用清洗缓冲液清洗后的纳米磁珠再采用50～80％乙醇清洗。本发明步骤(4)和(5)的目的是将磁珠上吸附的杂质洗掉，以提高病毒RNA的纯度。本发明每使用500ul病毒保存液，优选步骤(4)和(5)清洗时每个步骤采用的清洗液或乙醇为200ul。步骤(4)和(5)中，每次用磁铁吸附纳米磁珠的时间优选为30s～60s。
所述步骤(6)所述混匀加热为：吹打混匀后，在50～80℃加热5～10分钟。在上述条件下，可以确保病毒RNA从纳米磁珠上被充分洗脱。本发明每使用500ul病毒保存液，优选所述步骤(6)中对应加入50ul洗脱液。本发明提供的方法采用相对较低的洗脱液体积，可以实现病毒RNA的超灵敏检测。
与现有技术相比，本发明提供用于病毒保存的保存液，使采集到的样本能够有效保存，且在后续提取过程中可以避免保存液被过多的稀释，提高了病毒RNA的提取效率、检测灵敏度，可完成各种基因检测及分析实验，如PCR、qPCR等。本发明提供的试剂盒以及检测方法在稀释比例为100的情况下依然能够准确检测，可以实现病毒RNA的超灵敏检测，对于病毒在人群中的大规模筛查具有重大意义。
附图说明
图1为实施例3中提取病毒RNA的扩增图谱。
图2为实施例4中两组样本对应的提取病毒RNA的扩增图谱。
图3为实施例5中两组混合样本对应的提取病毒RNA的扩增图谱。
图4为实施例6中含过滤柱的RBX离心管过滤与不过滤后样本对应的提取病毒RNA的扩增图谱。
图5为实施例7中四种不同纳米磁珠用量对应的提取病毒RNA的扩增图谱。
图6为实施例8中四组浓度样本对应的提取病毒RNA的扩增图谱。
图7为实施例9中各组重复样本对应的提取病毒RNA的扩增图谱。
图8为实施例10中三种不同试剂盒对应的提取病毒RNA的扩增图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种病毒保存液，其组成为：6M的胍盐，1％N-月桂酰基肌氨酸以及0.6M柠檬酸钠。
实施例2
本实施例提供了一种用于病毒RNA提取的试剂盒，其中包含若干个提取单元，每个提取单元的组成为：实施例1提供的病毒保存液500ul，纳米磁珠2mg，结合缓冲液300ul，清洗缓冲液I 200ul，清洗缓冲液II 200ul，80％乙醇200ul，洗脱液50ul；其中：
结合缓冲液的组成为：无水乙醇；
清洗缓冲液I的组成为：1.2M胍盐，60％乙醇；
清洗缓冲液II的组成为：70％乙醇；
洗脱液的组成为：超纯水。
实施例3
本实施例提供了一种提取病毒RNA的方法。
1、病毒样本采用如下方法获得：用干净的无菌棉签擦拭口腔粘膜，反复擦拭4次，然后用喷壶将假病毒溶液均匀的喷在棉签上，并将棉签放回装有保存液的保存管中，拧紧瓶盖，-20℃～4℃保存备用。
2、提取病毒RNA的方法具体为：
(1)取采集好的样品500ul于RBX离心管(无外源DNA、RNA污染)中，10000rpm离心1min，取全部滤液；
(2)在步骤(1)所得滤液中加入300ul结合缓冲液，震荡混匀1min，再加入2mg纳米磁珠吹打混匀；
(3)56℃加热10分钟，期间每隔2-3分钟混匀一次，将离心管置于离心机中，高速短时离心，去掉管壁上液体，用磁铁吸附纳米磁珠，弃掉上清；
(4)加入200ul清洗缓冲液Ⅰ，用移液枪吹打混匀纳米磁珠，用磁铁吸附纳米磁珠30秒，弃掉上清；再加入200ul清洗缓冲液Ⅱ，用移液枪吹打混匀纳米磁珠，用磁铁吸附纳米磁珠30秒，弃掉上清；
(5)加入200ul 80％乙醇，用移液枪吹打混匀纳米磁珠，用磁铁吸附纳米磁珠30秒，弃掉上清；
(6)50ul洗脱液，用移液枪吹打混匀纳米磁珠，56℃加热5分钟，用磁铁吸附纳米磁珠，将含有病毒RNA的上清液保存备用。
3、对本实施例提供的病毒RNA进行检测
PCR扩增试剂为宝生物工程(大连)有限公司的Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseHPlus)试剂。
RT-PCR体系配制如表1所示，扩增程序如表2所示。
表1：扩增体系
Figure BDA0002617396400000071
表2：扩增程序
Figure BDA0002617396400000072
Figure BDA0002617396400000081
检测设备为上海宏石医疗科技有限公司的SLAN-96P型检测仪。
实验结果见图1，Ct值为25.00(实验组)。从图1可以看出，该样本为阳性标本，本方法能够成功提取病毒RNA。其中，以水为对照组。
实施例4
本实施例对比了采用两种不同的保存液后提取病毒RNA的方法。
1、病毒样本采用如下方法获得：用干净的无菌棉签擦拭口腔粘膜，反复擦拭3～5次，然后用喷壶将假病毒溶液均匀的喷在棉签上，将棉签平均分成2份，分别记为样本1和样本2。并将棉签放回装有保存液的保存管中，拧紧瓶盖，-20℃～4℃保存备用。样本1用实施例1提供的保存液保存，样本2用对比保存液(逗点生物)保存。
所述对比保存液的组成为：Hanks液基础，庆大霉素，真菌抗生素，BSA(V)，冷冻保护剂，生物缓冲剂及氨基酸等；所述Hanks液的配方(g/L)为：KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，NaCl8.0g，NaHCO3 0.35g，NaH2PO4.12H2O 0.132g，葡萄糖1.0g，酚红0.02g，pH值一般为7.2～7.4。
2、分别对样本1和样本2进行RNA提取；其中：
对样本1提取的方法同实施例3；
对样本2提取的方法与实施例3相比，区别仅在于：步骤(1)取对比保存液保存的样品100ul；步骤(2)中加入400ul实施例1所述的保存液和300ul实施例2所述的结合缓冲液。
3、分别对样本1和样本2的病毒RNA进行检测
图2为两组样本对应的提取病毒RNA的扩增图谱。本发明提供的保存液、对比保存液对应的Ct值分别为25.15和28.09。从图2可以看出，本发明提供的保存液要比对比保存液扩增曲线先过阈值，数值要小2.94。说明本发明提供的保存液效果好，可以提高病毒RNA的检出率。
实施例5
本实施例对比了采用两种不同的保存液后提取混合样本病毒RNA的方法。
1、病毒样本采用如下方法获得：用干净的无菌棉签擦拭口腔粘膜，反复擦拭4次，然后用喷壶将假病毒溶液均匀的喷在棉签上，并将棉签放回装有保存液的保存管中，拧紧瓶盖，-20℃～4℃保存备用。共取样5份样本。将A、B、C、D、E每份棉签平均分成2份，编号为A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2。其中，将A1、B1、C1、D1、E1共5份棉签混合在一起，记为样本1，用实施例1提供的保存液保存，A2、B2、C2、D2、E2共5份棉签混合在一起，记为样本2，用实施例4所述对比保存液保存。
2、分别对样本1和样本2进行RNA提取；其中：
对样本1提取的方法同实施例3；
对样本2提取的方法与实施例3相比，区别仅在于相对于每份样本(如A1)而言，步骤(1)取对比保存液保存的样品100ul；步骤(2)中加入400ul实施例1所述的保存液和300ul实施例2所述的结合缓冲液。
3、分别对样本1和样本2的病毒RNA进行检测
图3为两组样本对应的提取病毒RNA的扩增图谱。本发明提供的保存液、对比保存液对应的Ct值分别为29.96、33.03。从图3可以看出，本发明提供的保存液要比对比保存液扩增曲线先过阈值，数值要小3.07。说明本发明提供的保存液效果好，可以提高病毒RNA的检出率。
实施例6
本实施例考察了对保存液保存的样品进行内含过滤柱的RBX离心管过滤与不过滤后的效果比较。
1、将100ul假病毒(浓度为102拷贝/毫升)用喷水壶喷在使用过的冰袋上，用无菌棉签擦拭。并将棉签放回装有保存液的保存管中，拧紧瓶盖，-20℃～4℃保存备用。将采集棉签平均分成2份，编号为①、②。
2、取采集好的样品①500ul于内含过滤柱的RBX离心管(无外源DNA、RNA污染)中，10000rpm离心1min。取采集好的样品②500ul于普通离心管(无外源DNA、RNA污染)中，10000rpm离心1min。取上述离心后的全部溶液于依次加入300ul结合缓冲液，震荡混匀1min，加入20ul纳米磁珠吹打混匀。其余步骤同实施例3。
图4为用RBX离心管离心过滤与不过滤提取病毒RNA的扩增图谱。RBX离心管过滤、不过滤Ct值分别为37.47、No.Ct(No.Ct是指Ct值大于40)。从图4可以看出，用RBX离心管过滤要比不过滤扩增曲线先过阈值，数值要小。说明用RBX离心管过滤掉溶液中杂质，如灰尘、人体组织等，提高病毒RNA检测率，效果会更好。
实施例7
本实施例考察了对不同纳米磁珠使用量的效果比较。
1、用干净的无菌棉签擦拭口腔粘膜，反复擦拭4次，然后用喷壶将假病毒溶液均匀的喷在棉签上，将棉签平均分成4份。并将棉签放回装有保存液的保存管中，拧紧瓶盖，-20℃～4℃保存备用。
2、取采集好的样品500ul于RBX离心管(无外源DNA、RNA污染)中，10000rpm离心1min；取上述离心后的全部溶液于依次加入300ul结合缓冲液，震荡混匀1min，纳米磁珠用量分别为1.5mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg，吹打混匀；其余步骤同实施例3。
图5为不同的磁珠用量提取病毒RNA的扩增图谱。磁珠用量为1.5mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg时Ct值分别为24.45、23.86、25.15、25.79。从图5可以看出，磁珠用量从1.5mg到2.0mg随着磁珠量加大，数值也越小，说明随着磁珠量的加大，提取的RNA效果越好。然而，磁珠用量从2.0mg到4.0mg随着磁珠量加大，数值也越大，说明随着磁珠量加大，提取的RNA效果越差。磁珠用量为2.0mg时扩增曲线最先往上走，数值最小。说明磁珠用量为2.0mg时效果最好。
实施例8
本实施例考察了本发明提供的方法的检测灵敏度。
1、用干净的无菌棉签擦拭口腔粘膜，反复擦拭4次，然后用喷壶将假病毒溶液均匀的喷在棉签上，并将棉签放回装有保存液的保存管中，拧紧瓶盖，-20℃～4℃保存备用。将采集好的样品用保存液倍比稀释成100、101、102、103，共4个样本。
2、提取及检测方法同实施例3。
图6为病毒RNA灵敏度检测提取病毒RNA的扩增图谱。100、101、102、103等4个样本Ct值分别36.28、34.28、30.77、28.08。从图6可以看出，样品浓度为100时Ct值为36.28，结果呈阳性，也可以检测出来，说明本方法RNA病毒检测灵敏度较高。
实施例9
本实施例考察了本发明提供的方法的重复性。
1、用干净的无菌棉签擦拭口腔粘膜，反复擦拭3～5次，然后用喷壶将假病毒溶液均匀的喷在棉签上，并将棉签放回装有保存液的保存管中，拧紧瓶盖，-20℃～4℃保存备用。共取样3份样本。将A、B、C每份棉签平均分成3份，编号为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3。
2、提取及检测方法同实施例3。
图7为针对同一样本多次提取病毒RNA的扩增图谱。A1、A2、A3的结果分别为29.65、29.60、29.54。B1、B2、B3的结果分别为25.98、26.04、26.07。C1、C2、C3的结果分别为27.17、27.27、27.23。从图7可以看出，A1、A2、A3的数值几乎一致，B1、B2、B3的数值几乎一致，C1、C2、C3的数值几乎一致，说明该方法稳定性高，重复性好。
实施例10
本实施例对比了本发明实施例2提供的试剂盒、德国Qiagen公司提供的试剂盒以及天根生化科技(北京)有限公司提供的TIANGEN试剂盒提取病毒RNA的效果。
1、用干净的无菌棉签擦拭口腔粘膜，反复擦拭4次，然后用喷壶将假病毒溶液均匀的喷在棉签上，并将棉签放回装有保存液的保存管中，拧紧瓶盖，-20℃～4℃保存备用。将棉签平均分成3份，分别记为样本1、样本2和样本3。
2、样本1利用实施例2提供的试剂盒，采用实施例3提供的方法提取病毒RNA；样本2利用德国Qiagen公司提供的试剂盒，按照miRNeasy Mini Kit说明书提取病毒RNA；样本3利用天根生化科技(北京)有限公司提供的TIANGEN试剂盒，严格按照说明书提取病毒RNA。
3、RT-PCR体系配制如表1所示，扩增程序如表2所示。
图8是样本1、样本2和样本3分别对应的病毒RNA的扩增图谱。本发明提供的试剂盒、德国Qiagen试剂盒、TIANGEN试剂盒提取病毒RNA的结果分别为27.15、28.50、29.51。从图8可以看出，本方法扩增曲线最先过阈值，数值最小。本发明比德国Qiagen试剂盒Ct值小1.35；本发明比TIANGEN试剂盒Ct值小2.36。可见，本发明提供的试剂盒的提取效果约为德国Qiagen试剂盒的2.5倍，约为TIANGEN试剂盒的5.1倍，灵敏度更高。
实施例11
本实施例验证了实施例1提供的病毒保存液对病毒保存不同时间的效果比较。
1、用干净的无菌棉签擦拭口腔粘膜，反复擦拭4次，然后用喷壶将贝类中A群轮状病毒溶液均匀的喷在棉签上，将棉签平均分成5份。并将棉签放回装有保存液的保存管中，拧紧瓶盖，-20℃分别保存零个月、六个月、一年、三年、五年。
2、提取及检测方法同实施例3。
表3：病毒保存不同时间结果比较
保存时间 零个月 六个月 一年 三年 五年
Ct值 25.48 25.42 25.51 26.53 27.02
表3是病毒保存不同时间的结果。从表3可以看出病毒保存零个月、六个月、一年Ct值几乎一致，说明一年内病毒保存完好，病毒基本上没有降解。随着保存时间的延长，Ct值略有增长，但依然可以实现病毒RNA的有效检测。可见，本发明提供的病毒保存液可以实现对病毒RNA样品的长期保存。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液中含有4～6.5M胍盐，0.5-2％N-月桂酰基肌氨酸以及0.2～1M柠檬酸钠。
2.一种用于病毒RNA提取的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的病毒保存液；
优选地，所述试剂盒中还包括：内含过滤柱的离心管，纳米磁珠，结合缓冲液，清洗缓冲液，50～80％乙醇以及洗脱液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液中包含无水乙醇或异丙醇；
和/或，所述清洗缓冲液包括清洗缓冲液I和清洗缓冲液II；其中，所述清洗缓冲液I包含1～2M胍盐以及50～80％乙醇，所述清洗缓冲液II包含50～80％乙醇。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括的病毒保存液与结合缓冲液的体积之比为(3～7)：(2.5～3.5)。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括的纳米磁珠质量与所述结合缓冲液的体积之比为(1.5mg～4mg)：300ul，优选为2mg：300ul。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括的病毒保存液、结合缓冲液以及洗脱液的体积之比为(30～70)：(25～35)：(3～7)。
7.权利要求1所述病毒保存液或权利要求2～6任意一项所述试剂盒在病毒RNA提取和/或检测中的应用；
优选地，待提取或检测的病毒样本为人体咽拭子采样所获得的单独样本，或者多组人体咽拭子采样所获得的样本混合后的混合样本。
8.一种病毒RNA的超灵敏检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述病毒保存液或权利要求2～6任意一项所述试剂盒，包括如下步骤：将待提取的病毒样本置于所述病毒保存液中保存；对保存的病毒样本进行RNA提取，再进行检测；
优选地，待提取或检测的病毒样本为人体咽拭子采样所获得的单独样本，或者多组人体咽拭子采样所获得的样本混合后的混合样本。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取保存于所述保存液中的样本溶液，置于内含过滤柱的离心管中离心处理后，取全部滤液；
(2)在步骤(1)所得滤液中加入结合缓冲液，混匀后，加入纳米磁珠；
(3)加热混匀后，用磁铁吸附纳米磁珠，弃上清；
(4)加入清洗缓冲液，混匀后，用磁铁吸附纳米磁珠，弃上清；
(5)加入50～80％乙醇，混匀后，用磁铁吸附纳米磁珠，弃上清；
(6)加入洗脱液，混匀加热后，用磁铁吸附纳米磁珠，将含有病毒RNA的上清液保存备用；
优选地，所述保存于所述保存液中的样本溶液、结合缓冲液、纳米磁珠和洗脱液的用量比为(300ul～700ul)：(250ul～350ul)：(1.5mg～4mg)：(30ul～70ul)。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述离心为：以转速5000rpm～13000rpm离心30s～90s；
和/或，步骤(3)所述加热混匀为：在50～60℃加热8～20分钟，期间每隔2～3分钟混匀一次；
和/或，步骤(6)所述混匀加热为：吹打混匀后，在50～80℃加热5～10分钟。
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